ES2555486T3

ES2555486T3 - Anticuerpos monoclonales que tienen propiedades de neutralización cruzada de homosubtipo contra los virus de la influenza A del subtipo H1

Info

Publication number: ES2555486T3
Application number: ES09754293.0T
Authority: ES
Inventors: Roberto Burioni; Massimo Clementi
Original assignee: Pomona Ricerca SRL
Current assignee: Pomona Ricerca SRL
Priority date: 2008-05-27
Filing date: 2009-05-27
Publication date: 2016-01-04
Anticipated expiration: 2029-05-27
Also published as: EA022855B1; ITTO20080398A1; ES2555486T5; CA2725627A1; CN102124028A; US9243054B2; CN102124028B; EP2294084B2; EP2294084B1; EP2294084A1; AU2009252758B2; EA201071365A1; BRPI0912285A2; US20110076265A1; SG191610A1; ZA201009273B; CA2725627C; KR20110020865A; JP2011524161A; JP5792060B2

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra el virus de la influenza A, que reconoce a la hemaglutinina como antígeno, caracterizado porque tiene una actividad neutralizante contra una pluralidad de aislados del virus de la influenza A del subtipo H1, en donde dicha pluralidad de aislados del virus de la influenza A del subtipo H1 comprende por lo menos un aislado derivado de humano y un aislado derivado de animal.

Description

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-título de anticuerpo mayor de 1:1000 contra aislados del virus del subtipo H1N1, responsable de las epidemias anuales durante los cinco años previos al estudio;

5 -título de neutralización detectable (CI50 > = 1:20) contra dos aislados humanos del virus A del subtipo H1N1 de referencia (A/Puerto Rico/8/34; A/Malaya/302/54).

-sin vacunación previa contra la influenza;

10 -de acuerdo en recibir vacunación contra la influenza.

En el momento de la vacunación y aproximadamente 3 semanas después de la vacunación se extrajeron aproximadamente 20 ml de sangre de cada paciente en tubos de ensayo heparinizados.

15 Cultivo de los aislados del virus de referencia

Como línea celular se usaron células MDCK (células de riñón canino de Madin-Darby) (ATCC® No. CCL-34TM), propagadas en medio de Eagle modificado (MEM) (GIBCO), suplementado con 10% de suero bovino fetal desactivado (FBS) (tratado a 56°C durante 30 minutos) (EuroClone), 50 µg/ml de penicilina, 100 µg/ml de 20 estreptomicina (GIBCO) y 2 mM de L-glutamina (EuroClone). En cuanto al aislado porcino de campo SW1 (caracterizado de forma inequívoca por la secuencia de la región HA2, anexa a la solicitud de patente), se usaron células NSK (células de riñón de cerdo recién nacido) (Istituto Zooprofilattico di Brescia), que se trataron de forma similar. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2 y se pasaron en una relación de 1:3 dos veces a la semana. Para los experimentos descritos en esta solicitud de patente se usaron los siguientes aislados 25 del virus de influenza del subtipo H1N1: cepa A/Puerto Rico/8/34 (ATCC® No. VR-1469TM); cepa A/Wilson-Smith/33 (ATCC® No. VR-1520), y cepa A/Malaya/302/54 (ATCC® No. VR-98). Con respecto al subtipo H1N1 también se usó un aislado derivado de cerdo (SW1), caracterizado sobre la base de la secuencia de la porción HA2 de hemaglutinina (SEQ ID NO: 5). También se usaron otros tres aislados de virus de referencia, dos que pertenecen al tipo A subtipo H3N2 (A/Port Chalmers/1/73 -ATCC® No. VR-810 y A/Aichi/2/68 -ATCC® No. VR-547), y uno que 30 pertenece al subtipo B (B/Lee/40 -ATCC® No. VR-101). Para el crecimiento del virus se usó el medio de cultivo MEM suplementado con 1 µg/ml de tripsina libre de suero (SIGMA). Las reservas de virus se obtuvieron del sobrenadante del cultivo como virus extracelulares. Brevemente, después de infectar las células, la monocapa se observó diariamente para monitorear la aparición de un efecto citopático. El sobrenadante se recogió generalmente 4 días después de la infección; se centrifugó a 1000 RCF (fuerza centrífuga relativa) durante 10 minutos para

35 eliminar los desechos celulares, y el producto se filtró con filtros de 0.22 µm (MILLIPORE). Después, el sobrenadante se dividió en alícuotas y se guardó a -80 °C como virus libres de células.

Selección de anticuerpos monoclonales contra el virus de la influenza de linfocitos B de sangre periférica

40 La producción de anticuerpos monoclonales de los pacientes se hizo usando un método de transformación por infección con el virus de Epstein-Barr (EBV), descrito previamente por Cole et al, 1984 Cancer Research 22:27502753. El sobrenadante de los diferentes clones obtenidos se analizó por medio de ELISA para determinar la presencia de anticuerpos. Luego, los clones capaces de producir anticuerpos de IgG en el sobrenadante que son capaces de reaccionar en la ELISA contra los lisados celulares infectados con los tres aislados humanos

45 anteriormente mencionados y el aislado porcino SW1 del subtipo H1N1, pero no contra los infectados con los dos aislados del subtipo H3N2 y con el aislado B, fueron seleccionados para una caracterización subsiguiente. En particular, las células MDCK se infectaron con los aislados anteriormente mencionados, a una multiplicidad de infección alta. Aproximadamente 48 horas después de la infección, las células se despegaron del matraz y se lavaron dos veces en PBS. Después, las pellas celulares se suspendieron en 300 µl de solución de lisis (100 mM de

50 NaCl, 100 mM de Tris, pH 8, y 0.5% de Triton-X), y se guardaron en hielo durante 20 minutos. Los desechos celulares se centrifugaron a 10000 g durante 5 minutos y el sobrenadante se guardó a -20 °C como un extracto de proteína. En cuanto a la preparación del antígeno de control, las células no infectadas se trataron de la misma forma. La concentración de proteína del sobrenadante se determinó por duplicado usando el kit de prueba de proteína BCATM (Pierce). Brevemente, la dosis de proteína de la muestra se determinó tomando como referencia una curva

55 patrón obtenida por medio de una serie de diluciones de albúmina de suero bovina (BSA) de concentración conocida. La absorbancia de cada muestra se midió en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm. Los lisados así obtenidos se usaron entonces (300 ng por pocillo) para cubrir una placa de ELISA (COSTAR) que se incubó a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, la placa se lavó con agua destilada y se bloqueó con PBS /BSA 1% (Sigma) durante 45 minutos a 37 °C. Después se agregaron a cada pocillo 40 µl del sobrenadante de cada clon, y se

60 incubó 1 hora a 37 °C. Después de 5 lavados (WASHER ETI-SYSTEM, DiaSorin) con PBS /0.5% de Tween 20 (Sigma), se agregaron a cada pocillo 40 µl de anti-Fc humano conjugado con peroxidasa (1:4000 en PBS /1% de BSA, Sigma), y la placa se incubó 1 hora a 37 °C. Después de 5 lavados más con PBS /0.5% de Tween 20, se agregaron a cada pocillo 40 µl del substrato de peroxidasa TMB (Pierce). Aproximadamente 15 minutos después se bloqueó la actividad enzimática agregando 40 µl de H2SO4, y la señal se midió en un espectrofotómetro a 450 nm.

65 En particular, se encontró que un clon (denominado cINF49) es capaz de producir anticuerpos que pueden

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reconocer de manera específica todos los lisados obtenidos de las células infectadas con los diferentes aislados del subtipo H1N1, incluso el aislado animal. En cambio, no hubo señal detectable en los cultivos infectados con los dos virus del subtipo H3N2 ni en los infectados con el aislado B.

5 Preparación de fragmentos Fab del clon cINF49

Los genes que codifican las cadenas de Fab49 se clonaron en un vector de expresión procariótico. Esto permite evitar problemas debido a la inestabilidad de los clones de células productoras de anticuerpo, para caracterizar mejor los genes codificadores desde un punto de vista molecular, para tener disponibles moléculas que son indudablemente monoclonales, así como también mayores cantidades del anticuerpo mismo.

El ARN mensajero (ARNm) se extrajo del clon cINF49 cultivado y se transcribió inversamente usando un oligo-dT de acuerdo con los métodos conocidos per se. Los ADNc’s que codifican la cadena ligera y el fragmento Fd (esto es, la porción variable de cadena pesada y la parte de la porción constante presente dentro del fragmento Fab), fueron

15 entonces amplificados mediante los métodos descritos (CSH Press, “Phage display manual”, ed. D.R. Burton, p. A1.6). Luego, los ADNc’s así obtenidos se clonaron en un vector de expresión conocido per se denominado RBCaf (Burioni et al, J. Imm. Meth, 1988). Brevemente, el gen (ADN amplificado) que codifica la porción Fd de cadena pesada se digirió con las enzimas de restricción XhoI y SpeI (Roche) durante 1.5 horas a 37 °C, y subsiguientemente se insertó en el sitio de clonación del vector para cadenas pesadas, a su vez digeridas con las mismas enzimas. En cambio, la cadena ligera (ADN amplificado) se digirió con las enzimas SacI y XbaI (Roche) y se clonó en el vector digerido similarmente.

La construcción recombinante así obtenida se usó para electrotransformación en la cepa XL1Blue de E. coli (hecha competente mediante lavados fríos en glicerol), de acuerdo con los protocolos estandarizados para el uso de

25 cubetas de 0.2 cm (Voltaje: 2500 V; Capacitancia: 25 µF; Resistencia: 200 �). En paralelo, se analizaron las secuencias de ADN de la parte variable de cadena ligera y la parte variable de cadena pesada. Las secuencias son las provistas en el listado de secuencias. El análisis molecular del patrón mutacional mostró una imagen atribuible a procesos de mutación somática inducidos por antígeno.

Análisis de ELISA del Fab49 obtenido por clonación en RBCaf

Se analizaron 40 clones bacterianos recombinantes transformados con la construcción Fab49 por medio de ELISA, usando lisados crudos obtenidos sometiendo los cultivos a choque de calor. En particular, clones de bacterias transformadas con la construcción se inocularon en 10 ml de medio SB que contenía ampicilina y tetraciclina a 35 concentraciones de 50 µg/ml y 10 µg/ml, respectivamente, y se desarrollaron bajo agitación a 37 °C hasta alcanzar una DO 600 = 1. Subsiguientemente se les agregó un inductor específico (IPTG – isopropil-β-D-tiogalactopiranósido) a una concentración final de 1 mM, y el cultivo se dejó agitando a 30 °C durante la noche. Las células se lisaron por choque de calor (3 rondas de congelación/descongelación, a -80 °C y 37 °C, respectivamente), y después se centrifugaron para separar los desechos celulares del sobrenadante que contiene el Fab. Los Fab’s solubles obtenidos se analizaron por medio de ELISA. Se cubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc) con lisados de células infectadas con los aislados de virus anteriormente mencionados. Los lisados obtenidos de células no infectadas se usaron como control negativo. Las placas de ELISA cubiertas con 300 ng de los lisados obtenidos como se describe se dejaron entonces a 4 °C durante la noche. El siguiente día, después de quitar el antígeno no unido, las placas se lavaron 5 veces con PBS y los sitios de unión inespecífica se bloquearon con albúmina al 3% en 45 PBS durante 1 hora a 37 °C. Después de quitar la solución bloqueadora, se les agregaron los sobrenadantes de los cultivos celulares tratados como se describe arriba y que contienen los Fab’s solubles. Esto fue seguido por un paso de incubación a 37 °C durante 2 horas. Después de 10 ciclos de lavado con PBS /0.05% de Tween 20, se agregaron 40 µl de una dilución 1:700 de un preparado policlonal de inmunoglobulinas anti-Fab humano de cabra conjugadas con peroxidasa de rábano (Sigma) en PBS /1% de BSA. Después de 1 hora de incubación a 37 °C y una serie adicional de 10 lavados, se agregó el substrato (OPD-o-fenilendiamina) a los pocillos. Después, las placas se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La reacción se desactivó con ácido sulfúrico 1N y la densidad óptica se determinó por lectura espectrofotométrica a 450 nm. Todos los clones probados mostraron una reactividad específica contra cada lisado obtenido de las células infectadas con los virus del subtipo H1N1. Así, se seleccionó un clon bacteriano transformado con el vector de expresión que contiene los genes para el fragmento Fd

55 de cadena ligera y cadena pesada de Fab49. El clon bacteriano seleccionado se denominó INF49.

Purificación del Fab49 y evaluación del mismo por ELISA sobre lisados de células infectadas

El Fab producido del clon INF49 (a partir de aquí denominado indistintamente el “clon” o el “Fab”), se purificó por inmunoafinidad en columnas compuestas de una resina de sepharose que contenía la proteína G (~ 2 mg/ml), a la que se enlazó covalentemente un preparado policlonal de anticuerpos de cabra capaces de unirse a los Fab’s humanos (PIERCE, Illinois). Brevemente, una colonia del clon INF49 se inoculó en 10 ml de medio SB que contenía ampicilina y tetraciclina a las concentraciones de 50 µg/ml y 10 µg/ml, respectivamente. El cultivo, que se desarrolló durante la noche a 37 °C, se sub-inoculó en un matraz con 500 ml de SB añadidos, a la misma concentración de 65 antibiótico que antes. Las células, inducidas subsiguientemente por IPTG 1 mM, se dejaron agitando durante la noche a 30 °C. El cultivo se centrifugó a 5000 rpm durante 25 minutos y la pella resuspendida en PBS se sometió a

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sonicación. Fue necesaria una centrifugación adicional a 18,000 rpm durante 25 minutos para quitar los desechos celulares. El sobrenadante se filtró y luego se pasó lentamente a través de la columna de sepharose anteriormente descrita. Posteriormente, la resina se lavó con 10 volúmenes de PBS y finalmente los Fab’s unidos se eluyeron con una solución ácida (amortiguador de elución – H2O/HCl, pH 2.2). Las diversas fracciones recolectadas se 5 neutralizaron con una solución adecuada (Tris 1 M, pH 9) y se concentraron por ultrafiltración (Centricon, Millipore). La pureza del Fab purificado se determinó corriendo una alícuota sobre un gel de poliacrilamida al 12% /dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). Finalmente, diluciones en secuencia del Fab purificado se analizaron por medio de ELISA como se describe. En cada placa se incluyeron como control negativo preparados de Fab’s monoclonales dirigidos contra la glicoproteína E2 de VHC. Los resultados de este experimento confirmaron los

10 obtenidos previamente con los lisados bacterianos, confirmando la reactividad específica del clon hacia las células infectadas con los virus del subtipo H1N1.

Determinación de inmunofluorescencia del Fab49 obtenido por clonación en RBCAF

15 Para confirmar los datos obtenidos por ELISA, también se analizó el Fab49 mediante una prueba de inmunofluorescencia. Brevemente, las células de los cultivos infectados con todos los virus de referencia mencionados se tripsinizaron y, después de dos lavados en PBS, se contaron bajo un microscopio con un hematocitómetro. De esta manera, la suspensión celular se usó para preparar portaobjetos por centrifugación en una citocentrífuga (Cytospin4, Shandon Southern Products) a 90 g durante 3 minutos. Los portaobjetos así preparados

20 contenían, cada uno, un total de 2 x 105 células. Se prepararon portaobjetos de control de forma similar con células no infectadas. Las células se fijaron y se permeabilizaron a temperatura ambiente con una solución de metanolacetona (usada a una temperatura de -20 °C) durante 10 minutos. Después de 3 lavados en PBS, las células se incubaron con Fab49 (100 µg/ml) a 37 °C durante 30 minutos en una cámara húmeda, y subsiguientemente se lavaron tres veces en PBS. Después, las células se incubaron a 37 °C durante 30 minutos en la cámara húmeda en

25 la oscuridad con un Fab de cabra conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Sigma), diluido 1:200 en azul de Evans. Los portaobjetos se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia (Olympus). Como control positivo se usó un anticuerpo monoclonal de ratón comercial (Argene) específico para la proteína M1 del virus de la influenza. Como control negativo se usó un anticuerpo dirigido contra la glicoproteína E2 del virus de la hepatitis C (e509; Burioni et al, Hepatology, 1998). El Fab mostró, por inmunofluorescencia, una reactividad específica para todas las

30 células infectadas con los aislados humanos del subtipo H1N1, es, el aislado A/Puerto Rico/8/34, el aislado A/Wilson-Smith/33 y el aislado A/Malaya/302/54. Se obtuvo un resultado similar con las células infectadas con el aislado porcino SW1 usado en el estudio. El patrón de fluorescencia mostrado fue claramente un patrón de tipo citoplasma. En cambio, no se observó fluorescencia en las células no infectadas, ni en las células infectadas con el virus del subtipo H3N2, ni en las infectadas con el aislado de tipo B, ni con el anticuerpo de control negativo.

35 Prueba de neutralización

Para caracterizar la actividad biológica in vitro del clon seleccionado, se diseñó una prueba de neutralización para algunos de los aislados virales de referencia usados en el estudio. Brevemente, se sembraron células MDCK (NSK 40 en el caso del aislado porcino SW1) en MEM /10% de FBS en una placa de 96 pocillos (2x104 células/pocillo). Se prepararon diluciones en serie (de 10-1 a 10-8) de las reservas del virus, obtenidas como se describe arriba, en un medio de mantenimiento (MEM con 2% de FBS). Cada dilución se repitió seis veces. Cuando las células cultivadas se hicieron confluentes, el medio de crecimiento se retiró y se agregaron a cada pocillo 100 µl de cada dilución del virus. Después de 1 hora a 37 °C, los inóculos se retiraron y se pusieron en cada pocillo 200 µl de medio MEM con 1

45 µg/ml de tripsina. El título viral, expresado como TCID50 (la dosis que infecta el 50% del cultivo celular) se calculó aplicando la fórmula de Reed-Muench:

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50 A la luz de los datos obtenidos, la reserva del virus se diluyó a fin de usar una multiplicidad de infección (M.O.I.) de aproximadamente 0.01 (1 partícula de virus por 100 células) en el experimento de neutralización. En la prueba de neutralización real, las células se sembraron en una placa de 24 pocillos, cada pocillo conteniendo un portaobjetos estéril. El experimento de neutralización se hizo en células 80%-90% confluentes, esto es, aproximadamente 48 horas después de la siembra de las mismas. Después se prepararon diluciones del Fab49 purificado a fin de obtener

55 concentraciones finales de 1 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml y 20 µg/ml. Se prepararon diluciones correspondientes del anticuerpo anti-VHC e509 como control negativo. Entonces el Fab se incubó a las diversas concentraciones con el mismo volumen de reserva de virus diluida (M.O.I. 0.01), a 37 °C durante 1 hora. Subsiguientemente, a los pocillos que contenían las células se les agregaron 250 µl de la mezcla de virus-Fab. Se hizo un control positivo de infección agregando el medio de cultivo solo a la reserva del virus. La placa se incubó a 37 °C durante 1 hora para permitir la

60 adsorción del virus no neutralizado. Después, el inóculo se retiró y las células se lavaron dos veces con PBS. A cada pocillo se le agregaron 1.5 ml de medio libre de suero con 1 µg/ml de tripsina. Después de 6 horas de incubación a 37 °C, la monocapa celular se lavó con PBS y se fijó con una solución fría de metanol-acetona (proporción 1:2, almacenada a -20 °C), durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células fijas se lavaron y se incubaron con

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