ES2555160B1

ES2555160B1 - Aptámeros específicos de TLR-4 y usos de los mismos

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Publication number: ES2555160B1
Application number: ES201430955A
Authority: ES
Inventors: Ignacio LIZASOAIN HERNÁNDEZ; Víctor Manuel González Muñoz; Gerónimo Fernández Gómez-Chacón; María Ángeles MORO SÁNCHEZ; María Elena Martín Palma; Ana MORAGA YÉBENES
Original assignee: Aptus Biotech S L; Aptus Biotech SL
Current assignee: Aptatargets SL
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2016-10-25
Anticipated expiration: 2034-06-24
Also published as: RU2709718C2; RU2016152094A; DK3161139T3; MA40283A; EP3161139A1; JP2017527260A; BR112016030172A2; AU2015279248A1; BR112016030172B1; US10808252B2; AU2015279248B2; CA2953020A1; US11591603B2; PL3161139T3; US20230279402A1; CN106459980B; ES2825106T3; SI3161139T1; CA2953020C; WO2015197706A1

Abstract

Aptámeros específicos de TLR-4 y usos de los mismos.#La invención se refiere a un aptámero de ácido nucleico con capacidad de unirse específicamente e inhibir a TLR-4, a un complejo que comprende dicho aptámero y un grupo funcional, así como a composiciones farmacéuticas de los mismos. La invención también se refiere a usos y métodos para detectar TLR-4 y a usos y métodos para inhibir TLR-4. Por último, la invención también se refiere a un aptámero para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una patología caracterizada por un aumento de expresión de TLR4 y/o un aumento de activación de TLR-4.

Description

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DESCRIPCION

APTAMEROS ESPEGFICOS DE TLR-4 Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona aptameros de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y usos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Actualmente, se conoce que el Sistema Nervioso Central (SNC) responde, tanto ante las infecciones bacterianas como ante un dano cerebral, con una reaccion inmune innata muy bien organizada. El sistema inmune innato tiene la capacidad de reconocer patrones moleculares altamente conservados, a traves, entre otros, de receptores de membrana de la familia “toll-like” (en ingles Toll-like receptors: TLR).

El TLR4 fue el primer TLR caracterizado en mamiferos. Se han descrito ligandos exogenos para este TLR, como el lipopolisacarido (LPS) de bacterias gram-negativas, el acido lipoteicoico (en ingles, lipoteichoic acid, LTA) de bacterias gram-positivas o la protema F del virus respiratorio sincitial. Ademas, los ligandos endogenos mas importantes son la HMBG1, la HSP-60, de origen endogeno o derivada de Chlamydia pneumoniae, HPS-70, fibronectina, fibrinogeno, acido hialuronico, etc., todas derivadas del dano tisular, celular y/o de los vasos del huesped. El TLR4 esta implicado en gran cantidad de patologias de alta prevalencia, como ictus o enfermedad cerebrovascular, infarto agudo de miocardio, sepsis, ateroesclerosis, esclerosis multiple y artritis reumatoide entre otras.

La implication de la inmunidad innata y, en particular, de los TLRs en multiples patologias, ha supuesto un interes creciente por el desarrollo de agonistas y antagonistas de estos receptores. Asi, se han desarrollado agonistas para el posible tratamiento del cancer, de enfermedades alergicas, de infecciones y como coadyuvantes de vacunas. Por otra parte, antagonistas de TLRs se estan estudiando en sepsis, en ateroesclerosis, en dolor cronico y en colitis; de hecho existen varios antagonistas, eritoran (fase III), ibudilast (Av411; fase II), anticuerpos NI-0101 (fase preclmica) que se estan estudiando en estas patologias.

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En el documento de patente WO 2006/138681 se describe un metodo para inhibir la delecion intrahepatica de celulas T activadas mediante la administracion de un inhibidor de TLR-4, entre los que se mencionan los aptameros espedficos para TLR-4.

Roger y colaboradores (Roger et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:2348-52) describen anticuerpos espedficos para el dominio extracelular de TLR4. Estos anticuerpos confieren proteccion contra la sepsis letal de bacterias Gram negativas en ratones. Tambien se sugiere la utilidad terapeutica de estos anticuerpos anti-TLR-4, dado que el tratamiento es efectivo cuando los anticuerpos son administrados hasta 4 h despues de la exposicion a endotoxina y hasta 13 h despues de la aparicion de la infeccion por Escherichia coli.

Por lo tanto, existe una necesidad en la tecnica de nuevas moleculas con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que sean utiles como agentes terapeuticos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4, y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un complejo que comprende el aptamero de la invencion y un grupo funcional

En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso del aptamero de la invencion o del complejo de la invencion para detectar TLR-4.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso in vitro del aptamero de la invencion o del complejo de la invencion para inhibir TLR-4.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo in vitro para la deteccion de TLR-4 en una muestra que comprende

i) poner en contacto dicha muestra con un aptamero segun la invencion, o un complejo segun la invencion,

ii) separar el aptamero o complejo no unido a TLR-4, y

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iii) detectar la presencia del aptamero o complejo unido al TLR-4 presente en la muestra.

Metodo in vitro para inhibir TLR-4 en una muestra que comprende poner en contacto una muestra que comprende TLR-4 con un aptamero segun la invention, o un complejo segun la invention, en condiciones adecuadas inhibir TLR-4.

Un aptamero de la invencion para su uso en la fabrication de un medicamento para el tratamiento de una patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR4 y/o un aumento de activation de TLR-4.

Una composition farmaceutica que comprende al menos un aptamero segun la invencion o al menos un complejo segun la invencion, opcionalmente en combination con uno o mas soportes, excipientes o solventes farmaceuticamente aceptables.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Reconocimiento de la protema TLR-4 por los aptameros seleccionados mediante ELONA. La protema TLR-4 humana recombinante (6xHIS-TLR-4) fue plaqueada a una concentration de 100 ng/pocillo en placas de microtitulacion de 96 pocillos e incubada a 4°C durante 16 h. Posteriormente, 20 pmoles de cada uno de los aptameros marcados con digoxigenina fueron anadidos a cada pocillo y la placa fue incubada durante 1 h a 37°C. Por ultimo, la placa fue incubada con anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con peroxidasa y revelada usando ABTS. Como control positivo se utilizo un aptamero de ADN frente a Li H2A (Martin et al., 2013, PLoS ONE 8: e78886). Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

Figura 2. Estructuras secundarias de los aptameros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3), y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) predichas utilizando el programa mFold. En los recuadros aparecen las guaninas que podrian formar parte de estructuras G-cuadruplex predichas con el programa QGRS Mapper.

Figura 3. Union de los aptameros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3), y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) a hTLR-4 recombinante (A) y a la protema TLR-4 expresada en celulas (B). Todos los experimentos fueron hechos por triplicado.

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Figura 4. Actividad antagonista de los aptameros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3), y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) sobre celulas HEK-Blue hTLR4.. y el antagonista LPS-RS-UP (2 ng/^l; 20 ng) como controles, y Se aplicaron los aptameros a una concentration de 20 nM (A) o a concentraciones finales de 0.2, 2, 20 y 200 nM (B) o el antagonista control LPS-RS-UP (2 ng/^l; 20 ng). Como control, se utilizo el agonista LPS-EK-UP (0.02 ng/^l). Todos los experimentos fueron hechos por triplicado. Significancia estadistica (*P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001).

Figura 5. Estructuras secundarias de los aptameros TLRApt#1R-T (SEQ ID NO: 1), y TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) predichas utilizando el programa mFold. En los recuadros aparecen las guaninas que podrian formar parte de estructuras G-cuadruplex predichas con el programa QGRS Mapper.

Figura 6. Efecto de la inyeccion intraperitoneal de los aptameros TLRApt#1R y TLRApt#4F en la reduction de la zona infartada en animales de experimentation. Ratones machos adultos C57BL/10ScSn (WT; normal) y C57BL/10ScNJ (KO, carente de TLR4 funcional), fueron sometidos a induction de una isquemia focal cerebral mediante oclusion de la arteria cerebral media con ligadura. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano y 24 horas despues de MCAO, el tamano del infarto se ha evaluado por MRI. Las imagenes resaltadas en T2 (T2WI) han sido adquiridas en un BIOSPEC BMT 47/40 operando a 4.7 T (Bruker- Medical, Ettlingen, Alemania; MRI Unit, Instituto Pluridisciplinar, UCM) y el area danada es cuantificada mediante Image J 1.41 (NIH, Bethesda, Washington). Significancia estadistica (*P<0.05).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Los autores de la presente invencion han seleccionado y caracterizado dos moleculas que, debido a sus secuencias, son capaces de estructurarse tridimensionalmente en unas determinadas condiciones de pH, temperatura y concentraciones salinas, lo que les confiere la capacidad de reconocer de forma espedfica a la protema TLR-4 y modular su actividad. Estas moleculas pueden inhibir la respuesta celular mediada por el receptor TLR-4 in vivo y son capaces de reducir el tamano del infarto en animales de experimentacion, lo que les confiere un potencial papel terapeutico.

Aptamero especifico de TLR-4

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En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4, en lo sucesivo denominado el “aptamero de la invencion”, y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 (CCGGCACGGGACAAGGCGCGGGACGGCGTAGATCAGGTC GACACC) y SEQ ID NO: 2 (GGTGTGCCAATAAACCATATCGCCGCGTTAGCATGTACTCG GTTGGCCCTAAATACGAG) o una variante funcionalmente equivalente de las mismas.

El termino “aptamero”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a cadenas de acido nucleico monocatenarios que adoptan una estructura terciaria espedfica que les permite unirse a dianas moleculares con alta especificidad y afinidad, comparable a la de los anticuerpos monoclonales, a traves de interacciones distintas a las de emparejamiento de bases de Watson-Crick clasicas.

El termino “acido nucleico”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a cualquier tipo de acido nucleico, como ADN y ARN, y a variantes de los mismos, tales como el acido peptidonucleico (APN, o en ingles “peptide nucleic acid’ o PNA), el acido nucleico bloqueado (ANB, o en ingles “locked nucleic acid’ o LNA), asi como combinaciones de los mismos, modificaciones de los mismos, que incluyen nucleotidos modificados, etc. Los terminos "acido nucleico" y "oligonucleotido" y "polinucleotido" se emplean indistintamente en el contexto de la presente invencion. Los acidos nucleicos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producirse usando sistemas de expresion recombinantes y, opcionalmente, purificados, sintetizados qdmicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moleculas sintetizadas qdmicamente, los acidos nucleicos pueden comprender analogos de nucleosidos tales como analogos que tienen bases modificadas qdmicamente o azucares, modificaciones del esqueleto, etc. Una secuencia de acido nucleico se representa en la direccion 5'-3' a menos que se indique lo contrario.

El termino “TLR-4”, en el contexto de la presente invencion, se refiere al receptor de membrana de la familia “toll-like" 4. El receptor TLR-4 tambien puede denominarse como ARMD10, CD284, TLR4 o hTOLL. En humanos, el receptor TLR-4 esta recogido bajo el numero de acceso en GenBank 000206.2 a 27 de mayo de 2014, y que esta codificado por el gen TLR4. Esta formado por 839 aminoacidos, de los cuales los residuos 1-23 constituyen la secuencia senal, los residuos 24-631 constituyen el dominio extracelular, los residuos 632-652 constituyen el dominio transmembrana y los residuos 653-839 constituyen el dominio citoplasmico.

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En una realizacion particular, el aptamero tiene capacidad de unirse espedficamente al dominio extracelular de TLR-4 (aminoacidos 24-631).

La presente invencion contempla una aptamero que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 (CCGGCACGGGACAAGGCGCGGGACGGCGTA GATCAGGTCGACACC) y SEQ ID NO: 2 (GGTGTGCCAATAAACCATATCGCCGCGTTAGC ATGTACTCGGTTGGCCCTAAATACGAG) o una variante funcionalmente equivalente de las mismas.

La presente invencion tambien contempla aptameros de la invencion que esten compuestos por acidos nucleicos como ADN y ARN, asi como por variantes y analogos de acidos nucleicos y combinaciones de los mismos, modificaciones de los mismos, que incluyen, sin limitacion, esqueletos de acido nucleico modificado, enlaces de sustitucion, nucleotidos modificados, y analogos de ribosa o desoxirribosa, nucleotidos modificados, etc. con una capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 de al menos el 50%, al menos el

60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el

90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el

95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o al menos el

100% de la capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 del aptamero de secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Ejemplos no limitativos de variantes y analogos de acidos nucleicos incluyen, sin limitacion, APN, ANB y ATN.

El termino “variante de un acido nucleico” o “analogo de un acido nucleico”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a variantes y analogos de acidos nucleicos que incluyen, sin limitacion, esqueletos de acido nucleico modificado, enlaces de sustitucion, nucleotidos modificados, y analogos de ribosa o desoxirribosa. Por ejemplo, variantes de acidos nucleicos segun la presente invencion pueden comprender estructuras con esqueletos sinteticos analogos del esqueleto tipico fosfodiester. Estos incluyen, sin limitacion, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriester de alquilo, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno(metilimino), 3'-N-carbamato, carbamato de morfolino y acidos nucleicos peptidicos (PNA), enlaces metilfosfonato o alternando metilfosfonato y fosfodiester y bencilfosfonato.

Las variantes de un acido nucleico tambien pueden contener uno o mas enlaces "de sustitucion", como se entiende generalmente en la tecnica. Algunos de estos enlaces de sustitucion son apolares y contribuyen a la proporcionar al aptamero de una capacidad de

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difundirse a traves de las membranas. Estos enlaces "de sustitucion" se definen aqu como enlaces alternativos convencionales tales como fosforotioato o fosforamidato, y se sintetizan como se describe en la literatura comunmente disponible. Grupos de union alternativos incluyen, de manera no limitativa, realizaciones en las que un resto de formula P(O)S, ("tioato") , P(S)S ("ditioato"), P(O)NR'2, P(O)R', P(O)OR6, CO, o CONR'2, en donde R' es H (o una sal) o un grupo alquilo de 1-12 atomos de C y R6 es un grupo alquilo de 1-9 atomos de C, que se unen a los nucleotidos adyacentes a traves de -S- o de -O-. Enlaces ditioato se describen en la solicitud US 248517. La presente invention tambien contempla el uso de enlaces de sustitucion que incluyen enlaces internucleotidicos no basados en fosforo tales como 3'-tioformacetal, (-S-CH2-O-), formacetal (-O-CH2-O-) y enlaces internucleotidicos 3'- amina (-NH-CH2-CH2-) descritos en las solicitudes US 690786 y US 763130. Se pueden utilizar uno o mas enlaces de sustitucion en los aptameros de la invencion con el fin de facilitar aun mas la union a TLR-4 o para aumentar la estabilidad de los aptameros frente a nucleasas, asi como para conferir capacidad de permeation. No todos los enlaces dentro del mismo aptamero tienen que ser identicos y, por tanto, la presente invencion contempla aptameros con todos los enlaces identicos asi como aptameros con una variation en la composition de sus enlaces.

Asimismo, las variantes acidos nucleicos segun la presente invencion tambien pueden contener formas analogas de ribosa o desoxirribosa que son bien conocidas en la tecnica, incluyendo sin limitation azucares sustituidos en 2’ tales como 2'-O-metil-ribosa, 2'-fluoro- ribosa o 2'-azido-ribosa, analogos carbodclicos de azucares, azucares a-anomericos, azucares epimericos tales como arabinosa, xilosas o lixoses, azucares de piranosa, azucares de furanosa y sedoheptulosas. Los acidos nucleicos tambien pueden contener acido nucleico de treosa (ANT, o en ingles “threose nucleic acid” o TNA, tambien referido como oligonucleotidos alfa-treofuranosilos) (Vease, por ejemplo, Schong et al., Science 2000 17 de noviembre de 290 (5495): 1347-1351). En particular, la sustitucion en la position 2' del residuo de furanosa es particularmente importante con respecto a la mejora de la estabilidad nucleasa.

El termino “nucleotido”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a los monomeros que conforman los acidos nucleicos. Los nucleotidos estan formados por una pentosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato, y estan unidos mediante enlaces fosfodiester. Los nucleotidos que forman parte de ADN y ARN se diferencian en la pentosa, siento esta desoxirribosa y ribosa respectivamente. Las bases nitrogenadas, a su vez, se dividen en bases nitrogenadas purinicas, que son la adenina (A) y la guanina (G), y en bases

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nitrogenadas pirimidmicas, que son la timina (T), la citosina (C) y el uracilo (U). La timina unicamente aparece en el ADN, mientras que el uracilo unicamente en el ARN. La presente invention contempla el uso de nucleotidos modificados en el aptamero de la invention. El termino “nucleotido modificado”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a analogos conocidos de nucleotidos naturales, con propiedades de union similares o mejoradas. Formas analogas de purinas y pirimidinas son bien conocidas en la tecnica, e incluyen, sin limitation, aziridinilcitosina, 4-acetilcitosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5- carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, inosina, N6- isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6- metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N-6-isopenteniladenina, ester metflico de acido uracilo-5-oxiacetico, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2- tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, acido uracilo-5-oxiacetico, y 2,6-diaminopurina. Ademas de los nucleotidos modificados anteriores, residuos de nucleotidos que carezcan de una purina o una pirimidina tambien se pueden incluir en la presente invencion.

Ademas de las variantes anteriores, las variantes de acido nucleico comprendidas en la invencion tambien incluyen APN, ANB y cadenas 5’-5’ o 3’-3’. El termino “acido peptidonucleico” o “APN” o “PNA”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un oligonucleotido cuyo esqueleto se compone de unidades repetitivas de N-(2-aminoetil)- glicina unidas por enlaces peptidicos, en donde las diferentes bases nitrogenadas estan unidas a la cadena principal por un enlace de metileno (-CH2-) y un grupo carbonilo (-(C=O)- ). El termino “acido nucleico bloqueado” o “ANB” o “LNA”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un nucleotido modificado de ARN cuyo resto de ribosa esta modificado con un enlace adicional que conecta el oxigeno en 2’ con el carbono en 4’, bloqueando la ribosa en la conformation 3'-endo. El termino “cadena 5’-5’” o “cadena 3’-3’”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a oligonucleotidos en los cuales el nucleotido del extremos 3’ o 5’, respectivamente, esta invertido.

Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino “variante funcionalmente equivalente” se refiere a aptameros con secuencias sustancialmente similares a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 que mantienen su capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4. Una variante funcionalmente equivalente del aptamero de la invencion puede ser una secuencia de acido nucleico derivado de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 que comprende la adicion, sustitucion o modificacion de uno o mas nucleotidos. A modo de ilustracion,

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variantes funcionalmente equivalentes del aptamero de la invencion incluyen secuencias que comprenden la adicion de 1 nucleotido, 2 nucleotidos, 3 nucleotidos, 4 nucleotidos, 5 nucleotidos, 10 nucleotidos, 15 nucleotidos, 20 nucleotidos, 25 nucleotidos, 30 nucleotidos, 35 nucleotidos, 40 nucleotidos, 45 nucleotidos, 50 nucleotidos, 60 nucleotidos, 70 nucleotidos, 80 nucleotidos, 90 nucleotidos, 100 nucleotidos, 150 nucleotidos, 200 nucleotidos, al menos 500 nucleotidos, al menos 1000 nucleotidos o mas en el extremo 5’ de la secuencia SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 2 y/o que comprenden la adicion de 1 nucleotido, 2 nucleotidos, 3 nucleotidos, 4 nucleotidos, 5 nucleotidos, 10 nucleotidos, 15 nucleotidos, 20 nucleotidos, 25 nucleotidos, 30 nucleotidos, 35 nucleotidos, 40 nucleotidos, 45 nucleotidos, 50 nucleotidos, 60 nucleotidos, 70 nucleotidos, 80 nucleotidos, 90 nucleotidos, 100 nucleotidos, 150 nucleotidos, 200 nucleotidos, al menos 500 nucleotidos, al menos 1000 nucleotidos o mas en el extremo 3’ de la secuencia SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 2, y que mantienen una capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o al menos el 100% de su capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4.

La presente invencion tambien incluye aptameros que comprenden secuencias de nucleotidos con una identidad de secuencia de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99% con las secuencias SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 2 y que mantienen una capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o al menos el 100% de su capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4.

El termino "identidad”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a la relacion de similitud global entre moleculas de acido nucleico, la cual se expresa en forma de un porcentaje de identidad. El calculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de acidos nucleicos se puede realizar mediante la alineacion de las dos secuencias para propositos de comparacion optima, y es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos y la longitud de cada hueco, que debe ser introducida para la alineacion optima de las dos secuencias. La comparacion de

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secuencias y la determination del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede llevar a cabo utilizando un algoritmo matematico como el incorporado en el programa LALIGN (Goujon et al., 2010, Nucleic Acids Res 38(Web Server issue):W695-9).

El termino “union espetifica” o “union espetifica a TLR-4”, en el contexto de la presente invention, se refiere a la asociacion fisica no covalente entre dos moleculas, el aptamero de la invencion y el receptor TLR-4. La union entre el aptamero de la invencion y el receptor TLR-4 se considera especifica si la fuerza de la union entre ambos es al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 75 veces o al menos 100 veces superior a la fuerza de la union entre el aptamero de la invencion y una molecula irrelevante. La union entre el aptamero de la invencion y el receptor TLR-4 tambien se considera especifica si la constante de equilibrio de disociacion Kd es 10-3 M o menor, 10-4M o menor, 10-5M o menor, 10-6M o menor, 10-7M o menor, 10-8 M o menor, 10-9 M o menor, 10-10 M o menor, 10-11 M o menor, o 10-12 M o menor bajo las condiciones empleadas, por ejemplo, en condiciones fisiologicas, condiciones de cultivo de una celula o condiciones que permiten la supervivencia celular.

La capacidad del aptamero de la invencion de unirse espedficamente a TLR-4 puede ser determinada mediante una variedad de ensayos que estan disponibles en la tecnica. Preferiblemente, la capacidad de union especifica a TLR-4 del aptamero de la invencion se determina mediante ensayos de union in vitro, tales como el ensayo de oligonucleotido ligado a enzimas (en ingles “Enzyme-Linked OligoNucleotide Assay’, ELONA), el ensayo por absorcion por aptamero ligado a enzimas (en ingles “Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay’, ELASA), precipitation y PCR cuantitativa (qPCR), o por tecnicas de fluorescencia tales como aptahistoquimica, aptacitoquimica, microscopia de fluorescencia o citometria de flujo. Asimismo, tanto la capacidad de union especifica a TLR-4 como la afinidad del aptamero por TLR-4 puede determinarse por tecnicas ampliamente conocidas por el experto en la materia, tales como el ensayo de cambio de movilidad en gel (en ingles “gel mobility shift assay’), resonancia de plasmon superficial (en ingles “surface plasmon resonance”, SPR), electroforesis capilar cinetica y el ensayo de union de fluorescencia. Brevemente, el ensayo de union de fluorescencia consiste en la incubation de bolas magneticas recubiertas de TLR-4 con diferentes concentraciones (por ejemplo, de 0 a 100 nM) del aptamero de la invencion marcado (por ejemplo, con carboxifluorescema, FAM), y la posterior elucion y detection de los aptameros unidos; las constantes de disociacion (Kd) se calculan por analisis de ajuste no lineal.

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El termino “inhibition de TLR-4”, en el contexto de la presente invention, se refiere al bloqueo o disminucion de la actividad de TLR-4, es decir, la transduction de la senal mediada por el receptor TLR-4. Se considera que la actividad de TLR-4 esta inhibida por un agente inhibidor o antagonista cuando su actividad es de al menos el 95%, al menos el 90%, al menos el 85%, al menos el 80%, al menos el 75%, al menos el 70%, al menos el 65%, al menos el 60%, al menos el 55%, al menos el 50%, al menos el 45%, al menos el 40%, al menos el 35%, al menos el 30%, al menos el 25%, al menos el 20%, al menos el 15%, al menos el 10%, al menos el 5%, al menos el 1%, o menor de la actividad de TLR-4 en presencia de su agonista natural LPS.

La capacidad del aptamero de la invencion de inhibir a TLR-4 puede ser determinada mediante una variedad de ensayos que estan disponibles en la tecnica. Preferiblemente, la capacidad de inhibir a TLR-4 del aptamero de la invencion se determina mediante ensayos in vitro con celulas que expresan TLR-4 recombinante y un gen reportero cuya expresion esta asociada a la activation de TLR-4 recombinante. El experto en la materia reconocera que existen multiples variantes de este metodo, dependiendo de la celula y el gen recombinante empleados. Un ejemplo de este ensayo esta recogido en los Ejemplos de la presente invencion (section “Materiales y metodos” y Ejemplo 2). Otras tecnicas disponibles incluyen la determination de los niveles de citoquinas inflamatorias, como IL-1, IL-8, TNF- alfa e IL-12, liberadas por celulas que expresan TLR-4.

En una realization particular, el aptamero de la invencion consiste en de entre 30 y 200 nucleotidos, preferiblemente entre 35 y 150 nucleotidos, mas preferiblemente entre -40 y 100 nucleotidos, aun mas preferiblemente entre 45 y 80 nucleotidos.

En otra realizacion particular, el aptamero de la invencion comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 (GTTGCTCGTATTTAGGGCCACCG GCACGGGACAAGGCGCGGGACGGCGTAGATCAGGTCGACACCAGTCTTCATCCGC) y SEQ ID NO: 4 (GCGGATGAAGACTGGTGTGCCAATAAACCATATCGCCGCGTTAGCATGT ACTCGGTTGGCCCTAAATACGAGCAAC). La secuencia SEQ ID NO: 3 es una variante funcionalmente equivalente de SEQ ID NO: 1 y la secuencia SEQ ID NO: 4 es una variante funcionalmente equivalente de SEQ ID NO: 2.

En una realizacion particular, el acido nucleico es ADN. En otra realizacion particular, el acido nucleico es ARN. En otra realizacion particular, el acido nucleico es APN. En otra

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realizacion particular, el acido nucleico es ANB. En otra realizacion particular, el acido nucleico es ATN.

En otra realizacion particular, el TLR-4 es un TLR-4 seleccionado del grupo formado por raton, rata, conejo, cerdo, gato, perro, caballo, primate, y ser humano. En una realizacion preferida, el TLR-4 es un TLR-4 humano.

La produccion del aptamero de la invencion puede llevarse a cabo siguiendo metodos convencionales en la tecnica. Ejemplos no limitativos de tecnicas de produccion de aptameros incluyen tecnicas enzimaticas, tales como la transcripcion, sistemas de expresion recombinantes y smtesis qdmica de fase solida estandar (o de fase de solucion), disponibles comercialmente. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de que el aptamero de la invencion comprenda variantes de acidos nucleicos como las descritas anteriormente, analogos de nucleotidos tales como analogos que tienen bases o azucares modificados qdmicamente, modificaciones del esqueleto, etc., el aptamero de la invencion se producira mediante smtesis qdmica. Alternativamente, la expresion recombinante sera la tecnica preferida para la produccion de aptameros cuando estos tengan una longitud de 200 nucleotidos o mayor. Los aptameros producidos por cualquiera de las tecnicas anteriores pueden, opcionalmente, ser purificados por metodos bien conocidos en la tecnica.

Complejo de la invencion

Como el experto en la materia podra apreciar, las caracteristicas de pequeno tamano, estabilidad y facil produccion del aptamero de la invencion, hacen que este pueda presentarse unido a una segunda molecula. Esto es particularmente ventajoso cuando la segunda molecula es un grupo funcional. El resultado de la union del aptamero de la invencion y un grupo funcional es un complejo que exhibe la combinacion de funciones de ambos, es decir, un complejo con la capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y con la actividad asociada al grupo funcional.

Por tanto, en otro aspecto, la presente invencion se refiere a un complejo, en lo sucesivo denominado el “complejo de la invencion”, que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional.

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El termino “aptamero” ha sido descrito en detalle en relacion con las Definiciones y el Aptamero espedfico de TLR-4 (supra) y sus definiciones y particularidades aplican igualmente en el contexto del complejo de la invencion.

El termino “grupo funcional”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a moleculas aptas para ejercer al menos una funcion. Dicha funcion incluye, sin limitacion, la capacidad de unirse espedficamente a TLR-4 o a otros receptores TLR, la capacidad de inhibir a TLR- 4 o a otros receptores TLR, la capacidad de ser detectable, tanto directa como indirectamente, la capacidad de inducir muerte celular, etc. Como el experto en la materia entendera, un grupo funcional puede tener asociadas una o multiples funciones. Ejemplos no limitativos de grupos funcionales incluyen reactivos detectables y farmacos. Estos grupos funcionales pueden ser actuar como agentes de imagen, farmacos, etc.

Por lo tanto, en una realizacion particular, el grupo funcional se selecciona de entre un reactivo detectable y un farmaco.

En otra realizacion particular, el grupo funcional es un reactivo detectable. El termino “reactivo detectable”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a reactivos con capacidad de ser detectables directa o indirectamente. Ejemplos de reactivos detectables indicados para la presente invencion incluyen, sin limitacion, radionuclidos, fluoroforos, protemas y haptenos.

En una realizacion preferida, el reactivo detectable es un radionuclido. A este efecto, radionuclidos apropiados tienen utilidad en tecnicas de diagnostico por imagen, como tecnicas de radioinmunodiagnostico y tomografia de emision de positrones (PET). Ejemplos no limitativos de radionuclidos incluyen isotopos de emision gamma, tales como 99mTc, 123I y 111In, que pueden ser empleados en radioscintigrafia usando camaras gamma o gamma cameras o tomografia por emision de foton unico computarizada, asi como emisores de positrones, tales como 18F, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I, 213Bi y 211At, que pueden emplearse en PET, o emisores beta, tales como 131I, 90Y, 99mTc, 177Lu y 67Cu”. El experto en la materia apreciara que los radionuclidos tambien pueden emplearse con fines terapeuticos.

En otra realizacion preferida, el reactivo detectable es un fluoroforo. El termino “fluoroforo”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un compuesto quimico fluorescente que puede emitir luz despues de ser excitado por una luz de longitud de onda diferente. Fluoroforos adecuados en la presente invencion incluyen, sin limitacion, Cy3, Cy2, Cy5, la

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familia de marcadores fluorescentes Alexa Fluor® (Molecular Probes, Inc.), carboxifluorescema (FAM) e isotiocianato de fluorescema (FITC).

En otra realizacion preferida, el reactivo detectable es una protema. El termino “protema”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a macromoleculas consistentes en una o mas cadenas de aminoacidos. Las protemas son responsables de llevar a cabo un grupo diverso de funciones celulares basandose en su habilidad de unir otras moleculas de manera espedfica. Las protemas se pueden unir a otras protemas asi como a pequenas moleculas sustrato. Ejemplos no limitativos de protemas adecuadas para los propositos de la presente invencion incluyen, sin limitacion, enzimas, protemas fluorescentes, protemas luminiscentes y antigenos.

En una realizacion aun mas preferida, la protema es una enzima. El termino “enzima”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a una protema que funciona como un catalizador altamente selectivo, acelerando tanto la velocidad como la especificidad de la reaccion metabolica para la cual es espedfica. Ejemplos no limitativos de enzimas adecuadas para la invencion incluyen, sin limitacion, la peroxidasa de rabano (en ingles “horseradish peroxydase”, HRP) y la fosfatasa alcalina. Como el experto en la materia apreciara, las enzimas adecuadas para su uso en la presente invencion son detectables indirectamente gracias a su capacidad de catalizar la modificar un sustrato en un compuesto detectable por colorimetria, quimioluminiscencia o fluorimetria. Ejemplos de sustratos adecuados incluyen, sin limitacion, p-Nitrofenil fostato (PNPP), acido 2,2'-azinobis[3- etilbenzotiazolin-6-sulfonico] (ABTS), o-fenilenediamina (OPD), y 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB).

Las protemas bioluminiscentes o fotoprotemas son un caso particular de enzimas oxidativas que son capaces de llevar a cabo una reaccion qdmica de sus grupos prosteticos espedficos, resultando en una emision de luz sin necesidad de una excitacion previa. Ejemplos no limitativos de protemas bioluminiscentes incluyen la luciferasa de luciernaga, la luciferasa de Renilla y la acuorina.

En otra realizacion aun mas preferida, la protema es una protema fluorescente. El termino “proteina fluorescente”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a una protema con capacidad emitir luz cuando se excita a una longitud de onda adecuada para su excitacion. Ejemplos no limitativos de protemas fluorescentes que pueden ser utilizadas en el complejo de la invencion incluyen, sin limitacion, GFP, GFPuv, BFP, CFP, YFP, EBFP2,

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mCerulean, mCerulean3, mVenus, mTurquoise, T-Sapphire, citrine, amFP486, zFP506, zFP538, drFP, DsRed, mCherry, dTomato, mTFPI, TagRFP-T, mKO2, mRuby, mKate, mAmetrine, REACh, R-ficoeritrina (R-PE) y Aloficocianina (APC).

En otra realizacion aun mas preferida, la protema es una protema luminiscente. El termino “protema luminiscente”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a una protema capaz de emitir luz cuando se excita a una longitud de onda adecuada para su excitacion. Ejemplos no limitativos de protemas fluorescentes que pueden ser utilizadas en el complejo de la invencion incluyen, sin limitation, las protemas recogidas en la Tabla 1, junto con sus longitudes de onda de excitation y emision correspondientes.

En otra realizacion aun mas preferida, la protema es un antigeno. El termino “antigeno”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a una molecula que induce una respuesta inmune en el cuerpo. Por tanto, un antigeno puede ser empleado para generar un anticuerpo que lo reconozca y se una espedficamente a el. Ejemplos no limitativos de antigenos incluyen, entre otros, antigenos tumorales, tales como el antigeno carcinoembrionario (CEA), HER2, el antigeno espedfico de prostata (PSA) y el activador tisular del plasminogeno y sus variantes recombinantes como Activase®, asi como antigenos bacterianos, alergenos, etc. Como el experto en la materia apreciara, los antigenos adecuados para su uso en la presente invencion son detectables indirectamente gracias a su capacidad de ser reconocidos espedficamente por un anticuerpo.

En otra realizacion preferida, el reactivo detectable es un hapteno. El termino “hapteno”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un grupo de compuestos qdmicos de pequeno tamano molecular (< 10,000 Da) que son antigenicos pero incapaces de inducir por si mismos una reaction inmunitaria espedfica. El acoplamiento quimico de un hapteno a una protema inmunogena grande, llamada portador, genera un conjugado hapteno-portador inmunogeno que si es capaz de inducir una reaccion inmunitaria espedfica. Ejemplos no limitativos de vitaminas incluyen biotina (vitamina B7), digoxigenina, dinitrofenol (DNP) y nitro-iodofenol (NIP). En una realizacion mas preferida, la vitamina es biotina. El termino “biotina”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a una vitamina estable al calor, soluble en agua y alcohol, tambien denominada vitamina H y vitamina B7, caracterizada por unirse espedficamente a avidina con la afinidad mas alta descrita hasta la fecha de Kd = 10" 15 M. Como el experto en la materia apreciara, la biotina es detectable indirectamente gracias a su capacidad de ser reconocida espedficamente por la avidina o variantes de la misma como estreptavidina y neutravidina.

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En otra realization particular, el grupo funcional es un farmaco. El termino “farmaco”, en el contexto de la presente invention, se refiere a una sustancia quimica empleada en el tratamiento, cura o prevention de una enfermedad o condition, como una patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activation de TLR- 4. El termino “pato^a caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4” se describe en detalle en el contexto de los usos medicos de la invencion y su definition y particularidades se incluyen aqu por referencia.

El experto en la materia sabra inmediatamente cuales son los agentes estan indicados para el tratamiento de una enfermedad en particular. Casi todos los agentes que se indican para el tratamiento de una patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4 pueden estar comprendidos en el complejo de la invencion, aunque los agentes antagonistas de TLR-4 y los agentes anti-inflamatorios son particularmente preferidos. Aunque se pueden utilizar numerosos tipos de farmacos en el contexto de la invencion, en una realizacion preferida, la presente invencion contempla que el farmaco se seleccione del grupo que incluye, sin limitation, antagonistas de TLR-4, tales como naloxona, naltrexona, LPS, idulilast, propentofilina, amitriptilina, quetotifeno, ciclobenzaprina, mianserina e imipramina; antiagregantes plaquetarios, tales como aspirina y clopidogrel; anti-coagulantes, tales como heparina, acenocumarol, warfarina, dabigatran y rivaroxaban; y antioxidantes, tales como edaravona. Si bien ya se ha mencionado en el contexto de los reactivos detectables, el activador tisular del plasminogeno y sus variantes recombinantes pueden ser igualmente considerados como un farmaco por su action trombolrtica.

La presente invencion contempla que el farmaco sea un acido nucleico. Asi, en una realizacion preferida el farmaco es un acido nucleico. Acidos nucleicos aptos como farmacos en el contexto del complejo de la invencion incluyen ARN antisentido, ADN antisentido y ARN pequenos de interferencia, que posean la capacidad de silenciar la expresion de genes implicados en una patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4, que incluyen, sin limitacion, los genes NFKB1, RIPK3, IFNB1, LY96 (MD-2), IRF3, TLR3, TIRAP (Mal), TICAM1 (TRIF), RIPK1, TRAF6, CD14, TRAM, IKBKG (IKK-gamma), IFNA1 y TLR4. El termino “ARN antisentido”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un ARN monocatenario cuya secuencia de nucleotidos es complementaria para un ARN mensajero diana, interfiriendo por ello con la expresion del gen respectivo. El termino “ADN antisentido”, en el contexto de la presente invencion, se

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refiere a un ADN monocatenario cuya secuencia de nucleotidos es complementaria para un ARN mensajero diana, interfiriendo o silenciando por ello con la expresion del gen respectivo. El termino “ARN pequeno de interferencia” o “ARNip” o “siRNA (del ingles small interfering RNA”), en el contexto de la presente invention, se refiere a un ARN bicatenario con una longitud de 20 a 25 nucleotidos que es altamente espedfico para la secuencia de nucleotidos de su ARN mensajero diana, interfiriendo por ello con la expresion del gen respectivo.

La presente invencion contempla que el farmaco sea un peptido. Asi, en una realization preferida el farmaco es un peptido El termino “peptido”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a una cadena corta de aminoacidos unidos por enlaces peptidicos. El peptido comprendera al menos 2 aminoacidos, al menos 3 aminoacidos, al menos 4 aminoacidos, al menos 5 aminoacidos, al menos 10 aminoacidos, al menos 15 aminoacidos, al menos 20 aminoacidos, al menos 30 aminoacidos acidos, al menos 40 aminoacidos, al menos 50 aminoacidos, al menos 60 aminoacidos, o al menos 70 aminoacidos. Adecuados para los fines de esta invencion son, entre otros, peptidos con capacidad de unirse a una diana y de inducir o inhibir la senalizacion celular. El termino “peptido de union a diana”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un peptido que comprende una region de union a la diana. El termino “peptido de senalizacion”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un peptido con la capacidad de provocar la senalizacion celular, tales como peptidos agonistas de los receptores de celulas. Las secuencias de aminoacidos adecuados para la union de moleculas diana incluyen secuencias de consenso de reconocimiento molecular bien conocido en la tecnica.

La union entre un aptamero de la invencion y un grupo funcional para generar el complejo de la invencion puede llevarse a cabo mediante tecnicas de conjugation ampliamente conocidas por el experto en la materia. El resultado es una union covalente entre el aptamero de la invencion y el grupo funcional. La conjugacion puede implicar la union de aminas primarias de los extremos 3’ o 5’ del aptamero de la invencion al grupo funcional durante la smtesis qtimica del aptamero. Alternativamente, la conjugacion puede efectuarse mediante reacciones convencionales de reaction cruzada (en ingles “cross-linking”), que tienen la ventaja de la reactividad qtimica mucho mayor de etiquetas de alquil-amina primarias frente a las aminas de arilo de los propios nucleotidos. Los metodos de conjugacion son bien conocidos en la tecnica y se basan en el uso de reactivos de reticulation (en ingles “cross-linking reagents”). Los reactivos de reticulation contienen al menos dos grupos reactivos, que se dirigen a grupos tales como aminas primarias,

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sulfhidrilos, aldeddos, carboxilos, hidroxilos, azidas y asi sucesivamente, en la molecula a ser conjugada. Los agentes de reticulacion difieren en la especificidad qdmica, la longitud del brazo espaciador, composicion brazo espaciador, brazo espaciador de escision, y la estructura. Por ejemplo, la conjugacion de complejos segun la invencion puede llevarse a cabo directamente o a traves de un resto enlazador, a traves de uno o mas grupos no funcionales en el aptamero y/o el grupo funcional, tales como grupos amina, carboxilo, fenilo, tiol o hidroxilo. Se puede lograr enlaces mas selectivos mediante el uso de un enlazador heterobifuncional. Enlazadores convencionales pueden ser utilizados, tales como diisiocyanates, diisotiocianatos, bis (hidroxisuccinimida) esteres, carbodiimidas, esteres de maleimida-hidroxisuccinimida, glutaraldeddo y similares, o hidrazinas e hidrazidas, tales como 4-(4-N-maleimidofenil)hidrazida de acido butrnco (MPBH).

Otra aproximacion consiste en el marcaje de los aptameros durante la smtesis por PCR mediante el empleo de cebadores marcados, por ejemplo, con un fluoroforo. Para ello, existen diversas casas comerciales disponibles para el experto en la materia.

Adicionalmente, en la realizacion particular en la que el grupo funcional sea un radionuclido, la union entre un aptamero segun la invencion y el radionuclido puede llevarse a cabo mediante coordinacion qdmica, en donde los atomos del aptamero implicados en la union donan electrones al radionuclido. Las reacciones de coordinacion son ampliamente conocidas en la tecnica y dependeran del radionuclido y el grupo reactivo implicado en el aptamero.

Usos in vitro de la invencion

A. Usos in vitro para detectar TLR-4

La presente invencion tambien contempla usos in vitro de un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas, y de un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional, para detectar TLR-4.

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Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invencion se refiere a un uso in vitro de un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas para detectar TLR- 4.

Asi, la capacidad de un aptamero segun la invencion de unirse espedficamente a TLR-4 puede ser explotada para la deteccion indirecta de TLR-4 a traves del aptamero segun la invencion. Para este proposito, el experto en la materia reconocera que es necesaria una posterior deteccion de dicho aptamero. Las tecnicas de deteccion de aptameros son ampliamente conocidas en la tecnica e incluyen, por ejemplo, el empleo de anticuerpos o de sondas espedficas frente al aptamero. De esta manera, una vez que el aptamero segun la invencion esta unido a TLR-4, se aplicaria un anticuerpo o sonda espedfica para el aptamero, que a su vez pueden estar marcados con un reactivo detectable, o que pueden ser detectados de manera indirecta mediante un anticuerpo o sonda secundaria. La tecnica empleada para detectar TLR-4 dependera entonces del tipo de reactivo detectable, pudiendo ser tecnicas basadas, por ejemplo, en fluorimetria, colorimetria o radiactividad.

El termino “sonda” o “sonda de hibridacion”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un fragmento de ADN o ARN de longitud variable, generalmente entre 10 y 1000 bases de longitud, que se utiliza para detectar la presencia de acidos nucleicos de cadena sencilla (ADN o ARN) que son complementarios a la secuencia en la sonda. La sonda se hibrida al acido nucleico de cadena sencilla diana, cuya secuencia de bases permite el emparejamiento de bases debido a la complementariedad entre la sonda y el acido nucleico diana. Para detectar la hibridacion de la sonda a su secuencia diana, la sonda esta marcada con un reactivo detectable, tales como un radionuclido, un fluoroforo o digoxigenina, entre otros.

La deteccion de TLR-4 con el aptamero de la invencion se puede llevar a cabo mediante ensayos de union in vitro, tales como el ensayo de oligonucleotido ligado a enzimas (en ingles “Enzyme-Linked OligoNucleotide Assay’, ELONA), el ensayo por absorcion por aptamero ligado a enzimas (en ingles “Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay’, ELASA), precipitacion y PCR cuantitativa (qPCR), ensayo de cambio de movilidad en gel (en ingles “gel mobility shift assay’), Western Blotting, resonancia de plasmon superficial (en ingles “surface plasmon resonance”, SPR), electroforesis capilar cinetica, el ensayo de union de

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fluorescencia, aptahistoqdmica, aptacitoqdmica, microscop^a de fluorescencia o citometria de flujo.

En otra realizacion particular de los usos in vitro de la invencion, la deteccion de TLR-4 se realiza mediante un metodo seleccionado del grupo que consiste en ELONA, aptacitoqdmica, aptahistoqdmica y citometria de flujo.

El termino "ELONA" o “ensayo de oligonucleotido ligado a enzimas” (en ingles “Enzyme- Linked OligoNucleotide Assay’), en el contexto de la presente invencion, se refiere a una tecnica analoga al inmunoensayo por absorcion ligado a enzimas (en ingles “Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay’, ELISA), en donde el anticuerpo que se emplea para detectar la molecula de interes, en este caso TLR-4, se intercambia por un aptamero de deteccion espedfico para dicha molecula. El ensayo ELISA esta basado en el uso de anrigenos o anticuerpo marcados, por ejemplo con enzimas, de manera que los complejos formados entre el anrigeno diana y el anticuerpo marcado son complejos enzimaticamente activos. Puesto que uno de los componentes, en este caso el anrigeno, esta inmovilizado en un soporte, los complejos anrigeno:anticuerpo estan inmovilizados al soporte y, por tanto, pueden ser detectados mediante la adicion de un sustrato espedfico de la enzima. En el caso de ELONA, el aptamero de deteccion puede estar unido covalentemente a una enzima, o puede en si ser detectado por un anticuerpo secundario espedfico del aptamero que este conjugado a una enzima. Dicha enzima cataliza la transformacion de un sustrato espedfico para producir una serial visible. Esta tecnica se puede modificar para intercambiar la enzima por otro reactivo detectable, como puede ser un fluoroforo. En el presente documento se emplean los terminos ELONA y ELASA, o ensayo por absorcion por aptamero ligado a enzimas (en ingles “Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay’), indistintamente. En una realizacion preferida la deteccion de TLR-4 se realiza mediante ELONA.

De manera analoga, los terminos "aptacitoquimica" y "aptahistoquimica", en el contexto de la presente invencion, se refieren a tecnicas analogas a la inmunocitoqdmica e inmunohistoqdmica para la deteccion de TLR-4 sobre celulas y cortes histologicos, respectivamente, en donde el anticuerpo que se emplea para detectar la molecula de interes, en este caso TLR-4, se intercambia por un aptamero espedfico para dicha molecula. El aptamero de deteccion puede estar unido covalentemente a una enzima, o puede en si ser detectado por un anticuerpo secundario espedfico del aptamero que este conjugado a una enzima. Dicha enzima cataliza la transformacion de un sustrato espedfico para producir una serial visible. Esta tecnica se puede modificar para intercambiar la enzima

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por otro reactivo detectable, como puede ser un fluoroforo. En una realizacion preferida la deteccion de TLR-4 se realiza mediante aptacitoqdmica. En otra realizacion preferida la deteccion de TLR-4 se realiza mediante aptahistoqdmica.

Alternativamente, el experto en la materia reconocera que estas tecnicas (ELONA, aptacitoqdmica, aptahistoqdmica) se pueden adaptar para intercambiar el anticuerpo de deteccion por una sonda espedfica del aptamero.

El termino "citometria de flujo", en el contexto de la presente invencion, se refiere a una tecnica de analisis celular que implica medir las caracteristicas de dispersion de luz y fluorescencia que poseen las celulas conforme se las hace pasar a traves de un rayo de luz. Ademas de la dispersion de la luz, si previamente a su analisis se coloca a las celulas en presencia de aptameros marcados con moleculas fluorescentes, se pueden evaluar que celulas poseen los antigenos complementarios a los aptameros usados. La deteccion de fluorescencia se realiza con citofluorimetros de flujo (los conocidos como "citometros" o "FACS" (en ingles "Fluorescence-Activated Cell Sorter'). Esta tecnica, al igual que las anteriores, se desarrollo inicialmente para su uso con anticuerpos marcados fluorescentemente pero se puede adaptar facilmente para su uso con el aptamero de la invencion.

Como el experto en la materia apreciara, un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un reactivo detectable es particularmente ventajoso para detectar TLR-4, puesto que dicho reactivo detectable posibilita la deteccion del aptamero comprendido en el complejo cuando esta unido a TLR-4. La tecnica empleada para detectar TLR-4 dependera del tipo de reactivo detectable, pudiendo ser tecnicas basadas, por ejemplo, en fluorimetria, colorimetria o radiactividad.

Asi, en otro aspecto, la presente invencion se refiere un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional para detectar TLR-4.

En una realizacion particular, el grupo funcional es un reactivo detectable.

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Los terminos "aptamero”, "TLR-4”, "complejo”, "grupo funcional”, "reactivo detectable”, "ELONA”, "aptacitoqdmica”, "aptahistoqdmica” y "citometria de flujo” han sido descritos en detalle anteriormente y sus definiciones y particularidades se incluyen aqu por referencia.

Dado que las tecnicas de ELISA, inmunocitoqdmica, inmunohistoqdmica y citometria de flujo son bien conocidas en la tecnica, el experto en la materia podra realizar las adaptaciones necesarias para intercambiar el anticuerpo por el aptamero o complejo segun la invencion sin necesidad de realizar una experimentation indebida.

B. Usos in vitro para inhibir TLR-4

Tal y como se ha descrito con anterioridad, un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas puede inhibir la actividad de TLR-4, reduciendo los niveles de citoquinas pro-inflamatorias liberadas como resultado de su activation. La presente invencion tambien contempla usos in vitro de un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas, y de un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional, para inhibir TLR-4.

Por tanto, en otro aspecto, la presente invencion se refiere a un uso in vitro de un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas para inhibir TLR-4.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un uso in vitro de un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e

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inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional, para inhibir TLR-4.

Metodos in vitro de la invencion

A. Metodos in vitro para la deteccion de TLR-4

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo in vitro para la deteccion de TLR-4 en una muestra, en adelante “el primer metodo in vitro de deteccion de TLR-4 de la invencion” que comprende

i) poner en contacto dicha muestra con un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas,

ii) separar el aptamero no unido a TLR-4, y

iii) detectar la presencia del aptamero unido al TLR-4 presente en la muestra.

En una primera etapa, el primer metodo in vitro de deteccion de la invencion comprende poner en contacto dicha muestra con un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas.

Los terminos “aptamero” y “TLR-4” han sido descritos en detalle anteriormente y sus definiciones y particularidades se incluyen aqu por referencia.

El termino "muestra" o “muestra biologica”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un cultivo celular o al material biologico aislado de un sujeto. La muestra biologica puede contener cualquier material biologico adecuado para detectar el biomarcador deseado y puede comprender celulas y/o material no celular del sujeto. La muestra se puede aislar de cualquier tejido adecuado o fluido biologico tal como, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, liquido cefalorraqddeo (LCR), corazon, cerebro. Las muestras utilizadas para la deteccion de TLR-4 son preferiblemente fluidos biologicos. .

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De manera alternativa, las muestras son muestras de biofluidos. Los terminos "fluido biologico" y "biofluido" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a fluidos acuosos de origen biologico. El biofluido se puede obtener de cualquier localization (tales como sangre, plasma, suero, orina, bilis, liquido cefalorraqwdeo, humor vrtreo o acuoso, o cualquier secretion corporal), un exudado (como el liquido obtenido de un absceso o cualquier otro sitio de infection o inflamacion), o el liquido obtenido de una articulation (tal como una articulation normal o una articulation afectada por una enfermedad como la artritis reumatoide). Los biofluidos utilizados para la detection de TLR-4 son preferiblemente muestras de sangre, plasma, suero o liquido cefalorraqwdeo.

El aptamero segun la invention se aplica sobre la muestra en un tampon adecuado para permitir la union del aptamero a las moleculas de TLR-4 que puedan estar presentes en la muestra. Ejemplos no limitativos de tampones adecuados para permitir la union del aptamero de la invencion y TLR-4 incluyen PBS, TBS, tampon fosfato y tampon citrato. Preferiblemente, estos tampones contienen 1mM MgCl2. La cantidad de aptamero necesaria para detectar las moleculas de TLR-4 presentes en la muestra dependera tanto del tamano de la muestra como de la cantidad de TLR-4 presente en la misma, y se podra determinar facilmente por procedimientos de optimization que son habituales en la tecnica. De manera orientativa, la concentration de aptamero es de al menos 1 fM, al menos 10 fM, al menos 100 fM, al menos 1 pM, al menos 10 pM, al menos 100 pM, al menos 1 nM, al menos 10 nM, al menos 100 nM, al menos 1 ^M, al menos 10 ^M, al menos 100 ^M o mas. Preferiblemente, la concentracion de aptamero es de entre 100 fM y 1 ^M, mas preferiblemente entre 1 pM y 100 nM, aun mas preferiblemente entre 100 pM y 1 nM.

El aptamero se incuba con la muestra a una temperatura adecuada y durante un tiempo suficiente para permitir la union del aptamero a las moleculas de TLR-4 que puedan estar presentes en la muestra. La temperatura es, preferiblemente, entre 20°C y 37°C. De manera orientativa, el aptamero se incubara con la muestra durante al menos 5 min, al menos 10 min, al menos 15 min, al menos, 20 min, al menos 30 min, al menos 60 min, al menos 120 min o mas.

Una vez que el aptamero se ha unido a las moleculas de TLR-4 que puedan estar presentes en la muestra, en una segunda etapa la muestra se lava para eliminar las moleculas de aptamero que no se hayan unido a TLR-4.

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En una tercera etapa se detecta la presencia del aptamero unido al TLR-4 presente en la muestra. Puesto que el aptamero de la invencion no es en si mismo una molecula detectable, la etapa de deteccion es una etapa de deteccion indirecta a traves de una segunda molecula detectable que se une espedficamente al aptamero. La deteccion del aptamero unido a TLR-4 puede llevarse a cabo con practicamente cualquier anticuerpo o reactivo conocido que se una con alta afinidad al aptamero de la invencion. No obstante, es preferible el uso de un anticuerpo espedfico frente al aptamero, por ejemplo, suero policlonal, sobrenadantes de hibridoma, anticuerpos monoclonales o humanizados y fragmentos de los mismos. Dicho anticuerpo espedfico del aptamero esta convenientemente marcado con un reactivo detectable. El termino "reactivo detectable” ha sido descrito en detalle anteriormente y su definicion y particularidades se incluyen aqu por referencia. Dicho reactivo se puede detectar por medio de fluorimetria o colorimetria utilizando aparatos adecuados para el tipo de reactivos y el tipo de muestra, que son conocidos para el experto en la materia. A modo de ejemplo, la muestra con el aptamero unido a las moleculas de TLR-4 presentes se incuba con un anticuerpo espedfico del aptamero esta conjugado con una enzima, en condiciones similares a las condiciones de incubacion con el aptamero, y los complejos TLR-4-aptamero-anticuerpo se detectan con la adicion de un sustrato que es convertido por la enzima a un producto detectable, por ejemplo, por medio de fluorimetria en un microscopio de fluorescencia o por colorimetria en un espectrofotometro. Alternativamente, la deteccion se puede realizar de manera analoga mediante el empleo de una sonda espedfica del aptamero marcada convenientemente con un reactivo detectable.

El experto en la materia reconocera que el primer metodo in vitro de la invencion puede llevarse a cabo como parte de tecnicas de deteccion tales como ELONA, ELASA, precipitacion y qPCR, ensayo de cambio de movilidad en gel, Western Blotting, resonancia de plasmon superficial, electroforesis capilar cinetica, ensayo de union de fluorescencia, aptahistoqdmica, aptacitoqdmica, microscopia de fluorescencia o citometria de flujo.

Alternativamente, el aptamero segun la invencion puede estar unido a un grupo funcional formando parte de un complejo segun la invencion. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo in vitro para la deteccion de TLR-4 en una muestra, en adelante “el segundo metodo in vitro de deteccion de TLR-4 de la invencion”, que comprende

i) poner en contacto dicha muestra con un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1

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y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional,

ii) separar el aptamero o complejo no unido a TLR-4, y

iii) detectar la presencia del complejo unido al TLR-4 presente en la muestra.

Los terminos "aptamero”, "TLR-4” y "muestra" han sido descritos en detalle anteriormente y sus definiciones y particularidades se incluyen aqu por referencia. De igual forma, las particularidades de la primera y segunda etapas del primer metodo in vitro de detection de la invention aplican tambien al segundo metodo in vitro de deteccion de la invention y se incluyen igualmente por referencia.

La tercera etapa del segundo metodo in vitro de deteccion de la invencion comprende detectar la presencia del complejo de la invencion unido al TLR-4 presente en la muestra. La deteccion del complejo segun la invencion puede llevarse a cabo con practicamente cualquier anticuerpo o reactivo conocido que se una con alta afinidad al aptamero de la invencion o al grupo funcional. La deteccion del aptamero de la invencion se ha descrito en detalle en el contexto del primer metodo in vitro de deteccion de la invencion. De igual manera, en relation con el grupo funcional, la deteccion tambien puede llevarse a cabo con practicamente cualquier anticuerpo o reactivo conocido que se una con alta afinidad a dicho grupo funcional. Por esta razon, es particularmente conveniente para el segundo metodo in vitro de deteccion de la invencion que el grupo funcional sea un reactivo detectable.

En una realization particular el grupo funcional es un reactivo detectable seleccionado del grupo formado por radionuclidos, fluoroforos, protemas y haptenos.

Los terminos "radionuclido”, "fluoroforo”, "protema detectable" y "hapteno" han sido descritos en detalle anteriormente y sus definiciones y particularidades se incluyen aqu por referencia.

Como apreciara el experto en la materia, los reactivos detectables contemplados por la presente invencion se pueden dividir entre los reactivos que son directamente detectables por si mismos, como los radionuclidos o los fluoroforos, y los reactivos que son indirectamente detectables, tales como las protemas o los haptenos.

En una realizacion preferida, el reactivo detectable es un radionuclido y la deteccion se realiza por deteccion de la radiacion emitida por el radionuclido. Dicha radiacion dependera

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del tipo de radionuclido, pudiendo ser una emision de partmulas a, partmulas p o emision de tipo y. A este efecto, son ampliamente conocidas las tecnicas de deteccion adecuadas para los diferentes radionuclidos. A modo de ejemplo, la emision emitida por 123I puede ser detectada por una camara gamma.

En otra realizacion preferida, el reactivo detectable es un fluoroforo y la deteccion se realiza por deteccion de la fluorescencia emitida por el fluoroforo. El empleo de un fluoroforo requiere la excitacion previa del mismo con una longitud de onda dentro de su espectro de excitacion, lo cual provoca una emision a una longitud de onda diferente. Las longitudes de onda de excitacion y de emision de los fluoroforos contemplados en la presente invencion forman parte del estado de la tecnica. La fluorescencia emitida puede detectarse, por ejemplo, por tecnicas de fluorimetria empleando un espectrofotometro de fluorescencia o un microscopio de fluorescencia.

En otra realizacion preferida, el reactivo detectable es una protema. Esta se podra detectar dependiendo del tipo de protema utilizada. Por ejemplo:

- una enzima requiere la adicion de su sustrato espedfico que sera detectable por colorimetria, quimioluminiscencia o fluorimetria;

- una protema fluorescente, al igual que un fluoroforo, requiere la excitacion a una longitud de onda adecuada para ser detectable por fluorimetria (por ejemplo, las longitudes de onda recogidas en la Tabla 1);

- un antigeno o un hapteno requiere un anticuerpo u otra molecula que lo reconozca espedficamente. Para poder ser detectado, dicho anticuerpo o molecula espedfica para el antigeno/hapteno necesita estar marcado, por ejemplo, con una enzima, y la deteccion dependera del tipo de marcaje.

El experto en la materia reconocera que el segundo metodo in vitro de la invencion puede llevarse a cabo como parte de tecnicas de deteccion tales como ELONA, ELASA, precipitacion y qPCR, ensayo de cambio de movilidad en gel, Western Blotting, resonancia de plasmon superficial, electroforesis capilar cinetica, ensayo de union de fluorescencia, aptahistoqdmica, aptacitoqdmica, microscopia de fluorescencia o citometria de flujo.

En una realizacion particular, la deteccion de TLR-4 se realiza por medio de fluorescencia.

B. Metodos in vitro para la inhibicion de TLR-4

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En otro aspecto, la presente invention se refiere a un metodo in vitro para inhibir TLR-4 en una muestra, en adelante “el primer metodo in vitro de inhibition de TLR-4 de la invencion”, que comprende poner en contacto una muestra que comprende TLR-4 con un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas, en condiciones adecuadas inhibir TLR- 4.

Los terminos “aptamero”, “TLR-4”, “inhibicion de TLR-4” y "muestra" han sido descritos en detalle anteriormente y sus definiciones y particularidades se incluyen aqu por referencia.

En una realization particular, el TLR-4 de la muestra esta comprendido en celulas vivas.

El primer metodo in vitro de inhibicion de TLR-4 de la invencion comprende poner en contacto una muestra que comprende TLR-4 con un aptamero de acuerdo con la invencion en condiciones adecuadas inhibir TLR-4. Para ello, el aptamero se aplica de la invencion sobre la muestra y se debe unir a TLR-4.

El termino “condiciones adecuadas inhibir TLR-4”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a las condiciones de incubation que permiten la union del aptamero de invencion a TLR-4 y su posterior inhibicion. Estas condiciones incluyen la composition del tampon en el que se aplica el aptamero de la invencion sobre la muestra, la cantidad de aptamero, el tiempo de incubacion y la temperatura de incubacion. Ejemplos no limitativos de tampones adecuados para permitir la union del aptamero de la invencion a TLR-4 y su inhibicion incluyen PBS, TBS, tampon fosfato y tampon citrato. Preferiblemente, estos tampones contienen 1mM MgCl2. La cantidad de aptamero necesaria para detectar las moleculas de TLR-4 presentes en la muestra dependera tanto del tamano de la muestra como de la cantidad de TLR-4 presente en la misma, y se podra determinar facilmente por procedimientos de optimization que son habituales en la tecnica. De manera orientativa, la concentration de aptamero es de al menos 1 fM, al menos 10 fM, al menos 100 fM, al menos 1 pM, al menos 10 pM, al menos 100 pM, al menos 1 nM, al menos 10 nM, al menos 100 nM, al menos 1 ^M, al menos 10 ^M, al menos 100 ^M o mas. Preferiblemente, la concentracion de aptamero es de entre 100 fM y 1 ^M, mas preferiblemente entre 1 pM y 100 nM, aun mas preferiblemente entre 100 pM y 1 nM.

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El aptamero se incuba con la muestra a una temperatura adecuada y durante un tiempo suficiente para permitir la union del aptamero a las moleculas de TLR-4 que puedan estar presentes en la muestra. La temperatura es, preferiblemente, entre 20°C y 37°C, mas preferiblemente 37°C. De manera orientativa, el aptamero se incubara con la muestra durante al menos 5 min, al menos 10 min, al menos 15 min, al menos, 20 min, al menos 30 min, al menos 60 min, al menos 120 min o mas.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo in vitro para inhibir TLR-4 en una muestra, en adelante “el segundo metodo in vitro de inhibicion de TLR-4 de la invencion”, que comprende poner en contacto una muestra que comprende TLR-4 con un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional en condiciones adecuadas inhibir TLR-4.

Los terminos “aptamero”, “TLR-4”, “inhibicion de TLR-4”, "muestra" y “condiciones adecuadas inhibir TLR-4” han sido descritos en detalle anteriormente y sus definiciones y particularidades se incluyen aqu por referencia.

Usos medicos de la invencion

Los autores de la presente invencion han demostrado que el aptamero de la invencion es capaz de bloquear o inhibir el volumen de infarto producido en un modelo de ictus inducido en animales de experimentacion, como se describe en el Ejemplo 4. Por lo tanto, la capacidad del aptamero de la invencion de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 hace que este tenga una utilidad terapeutica. Es aparente que el efecto terapeutico obtenido con el aptamero de la invencion puede ser complementado con un grupo funcional con actividad terapeutica, tal y como se ha descrito en el contexto del complejo de la invencion En consecuencia, la presente invencion contempla los usos medicos del aptamero de la invencion y del complejo de la invencion

A. Usos medicos del aptamero de la invencion

En otro aspecto, la presente invencion se refiere un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia

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seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas para su uso en medicina.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas para su uso en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento una patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4.

Alternativamente, se puede expresar como el uso de un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas para su uso en el tratamiento de una patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR- 4.

Alternativamente, se puede expresar como metodo in vivo de tratamiento de una patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR- 4 en un sujeto, que comprende la administracion a dicho sujeto de una cantidad terapeuticamente efectiva de un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas a dicho sujeto.

De acuerdo con la invencion, un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas se une espedficamente a TLR-4 en la superficie de un celula diana. Al contactar el aptamero de la invencion a TLR-4 inhibe su actividad, resultando en una reduccion o interrupcion en la liberacion de citoquinas pro-inflamatorias tales como IL-1, IL- 8, TNF-alfa e IL-12.

El termino "aptamero” ha sido descrito en detalle en relacion con las Definiciones y el Aptamero espedfico de TLR-4 (supra) y sus definiciones y particularidades aplican igualmente en el contexto del complejo de la invencion.

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El termino "tratamiento" o “terapia”, en el contexto de la presente invention, se refiere a la intervention clmica en un intento de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de, o mejorar uno o mas smtomas de la patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activation de TLR-4, o con el fin de prolongar la supervivencia de un paciente mas alla de lo esperado en la ausencia de tal tratamiento.

El termino "celula diana", en el contexto de la presente invencion, se refiere a la celula particular que expresa TLR-4, que incluye, entre otras, celulas del linaje mieloide como monocitos, macrofagos, celulas de microglia, granulocitos y celulas dendriticas inmaduras, asi como celulas de otros linajes tales como neuronas, etc. En una realization particular, la celula diana es un monocito o un macrofago. En otra realizacion particular, la celula diana es una celula de microglia. En otra realizacion particular, la celula diana es un granulocito. En otra realizacion particular, la celula diana es una celula dendritica inmadura. En otra realizacion particular, la celula diana es una neurona.

En una realizacion particular, la celula diana es una celula de mamifero. En otra realizacion preferida, la celula de mamifero es una celula humana.

El termino "sujeto" o "individuo" se refiere a un miembro de una especie de mamifero, e incluye, pero no se limita a animales domesticos, y los primates incluidos los seres humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano, hombre o mujer, de cualquier edad o raza.

El termino “una cantidad terapeuticamente efectiva”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a la cantidad del aptamero de la invencion que se requiere para alcanzar una prevention, curacion, retraso, reduction de la gravedad de, o mejora de uno o mas smtomas apreciables de la patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4.

El termino “patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a una patologia en la que las celulas que expresan TLR-4 muestran un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4 con respecto a condiciones fisiologicas normales o de referencia o valores de referencia, y en la que dichas celulas estan directa o indirectamente implicadas independientemente de que TLR-4 sea o no el responsable de la enfermedad.

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Dado que la activacion de TLR-4 produce una cascada de senalizacion que da como resultado la liberation de citoquinas inflamatorias como IL-1, IL-8, TNF-alfa e IL-12, provocando inflamacion y dano celular, la patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4 puede estar caracterizada, ademas, por tener un componente inflamatorio.

En una realization particular, dicha patolog^a caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4 se selecciona del grupo formado, entre otros, por ictus, infarto agudo de miocardio, sepsis, aterosclerosis, esclerosis multiple, artritis reumatoide y drogadiccion.

En una realizacion preferida, dicha patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4 es ictus. El termino “ictus” o “enfermedad cerebrovascular” o “infarto cerebral” o “apoplena”, en el contexto de la presente invention, se refiere a una patologia caracterizada por un deficit neurologico ocasionado por una disminucion importante del flujo sangumeo cerebral, de forma anormalmente brusca (ictus isquemico) o bien, por la hemorragia originada por la rotura de un vaso cerebral (ictus hemorragico). En el ictus isquemico se pierde la irrigation sangumea debido a la interruption subita e inmediata del flujo sangumeo, lo que genera la aparicion de una zona infartada debido a la oclusion de alguna de las arterias que irrigan la masa encefalica, ya sea por acumulacion de fibrina o de calcio o por alguna anormalidad en los eritrocitos, pero generalmente es por ateroesclerosis o bien por un embolo (embolia cerebral) que procede de otra localization, fundamentalmente el corazon u otras arterias. En el ictus hemorragico, se produce la rotura de un vaso sangumeo encefalico que, por una parte, priva de riego al area cerebral dependiente de esa arteria, pero por otra parte la sangre extravasada ejerce compresion sobre las estructuras cerebrales, incluidos otros vasos sangumeos, lo que aumenta el area afectada.

En una realizacion preferida, dicha patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4 es infarto agudo de miocardio. El termino “infarto agudo de miocardio” o “infarto” o “ataque al corazon”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a una patologia caracterizada por un riego sangumeo insuficiente, con dano tisular, en una parte del corazon, producido por una obstruction en una de las arterias coronarias. La isquemia o suministro deficiente de oxigeno que resulta de tal obstruccion produce la angina de pecho, que si se recanaliza precozmente no produce muerte del tejido

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cardiaco, mientras que si se mantiene esta anoxia se produce la lesion del miocardio y finalmente la necrosis, es decir, el infarto.

En una realization preferida, dicha pato^a caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activation de TLR-4 es sepsis. El termino “sepsis” o “septicemia”, en el contexto de la presente invention, se refiere al smdrome de respuesta inflamatoria sistemica (SRIS) provocado por una infection, generalmente grave. Esta reaction del organismo se produce como respuesta a la presencia de microorganismos patogenos en cualquier tejido o fluido del organismo, y esta causada por la action del propio sistema inmune, que libera sustancias pro-inflamatorias que ponen en marcha el SRIS. Se caracteriza por la presencia de al menos dos de los siguientes criterios: fiebre, hipertermia, taquipnea, taquicardia y leucocitosis.

En una realizacion preferida, dicha patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4 es aterosclerosis. El termino “aterosclerosis”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un smdrome o patologia caracterizado por el deposito e infiltration de sustancias lipidicas en las paredes de las arterias de mediano y grueso calibre. Las celulas de la pared arterial interpretan este deposito como una invasion y activan a los monocitos circulantes sistema inmune, que penetran en la pared de la arteria, se transforman en macrofagos y comienzan a fagocitar partmulas de LDL generando un proceso inflamatorio. La inflamacion provoca a su vez la multiplication y migration de las celulas musculares lisas de la pared, que van produciendo estrechamientos de la luz arterial. Los engrosamientos concretos son denominados placa de ateroma. Es la forma mas comun de arteriosclerosis. Las enfermedades que forman el smdrome de ateroesclerosis y que se caracterizan por afectacion de las arterias por placas de ateroma y en consecuencia obstruction al flujo sangumeo o isquemia son, dependiendo de la arteria del organo afectado:

- Cardiopatia isquemica, con su maximo representante el infarto agudo de miocardio, en el corazon.

- Enfermedad cerebrovascular, en forma de ictus o trombosis cerebral o hemorragia cerebral, en el sistema nervioso central.

- Claudication intermitente, con su maxima gravedad de isquemia arterial aguda de miembros inferiores.

- Disfuncion erectil: Es la principal causa de impotencia en personas mayores de 40 anos.

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- Colitis isquemica, es un area de inflamacion (irritacion e hinchazon) causada por interferencia con el flujo sangumeo al colon (intestino grueso), en las arterias de los intestinos.

- Aneurisma de aorta, con su maxima gravedad en la diseccion de aorta.

En una realization preferida, dicha pato^a caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activation de TLR-4 es esclerosis multiple. El termino “esclerosis multiple”, en el contexto de la presente invention, se refiere a una patologia caracterizada por la aparicion de lesiones desmielinizantes, neurodegenerativas y cronicas del sistema nervioso central. Actualmente se desconocen las causas que la producen aunque se ha demostrado la implication de diversos mecanismos autoinmunes. En pacientes de esclerosis multiple, los linfocitos cruzan la barrera hematoencefalica para atacar a la mielina, mientras que aparece un proceso inflamatorio facilitado por macrofagos y celulas de neuroglia.

En una realizacion preferida, dicha patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4 es artritis reumatoide. El termino “artritis reumatoide”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a una patologia inflamatoria sistemica autoinmune, caracterizada por provocar una sinovitis persistente de las articulaciones, produciendo su destruction progresiva generando distintos grados de deformidad e incapacidad funcional. El proceso se inicia con la intervention de factores humorales y celulares, particularmente linfocitos T CD4, que generan moleculas mediadoras de la inflamacion, atraen y activan celulas de la sangre periferica, produciendo proliferation y activacion de los sinoviocitos, invadiendo y destruyendo el cartflago articular, el hueso subcondral, tendones y ligamentos.

En una realizacion preferida, dicha patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4 es una drogadiccion. El termino “drogadiccion” o “drogodependencia” o “farmacodependencia”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a un trastorno o patologia causada por el frecuente uso de sustancias adictivas llamadas drogas o farmacos. Segun el CIE-10 (Organization Mundial de la Salud, 2005) para poder ser diagnosticada como tal, la drogodependencia ha de presentar tres o mas de los siguientes criterios, que hacen referencia tanto a aspectos relacionados con la dependencia fisica como con la psicologica, en un periodo de 12 meses:

- fuerte deseo de consumir la sustancia (en ingles craving),

- dificultades para controlar dicho consumo,

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- smdrome de abstinencia al interrumpir o reducir el consumo,

- tolerancia,

- abandono progresivo de intereses ajenos al consumo de la sustancia,

- inversion cada vez mayor de tiempo en actividades relacionadas con la obtencion de la sustancia o con la recuperacion de sus efectos,

- persistencia en el uso de la sustancia a pesar de percibir de forma clara sus efectos perjudiciales.

Para la administracion a un sujeto de un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas, dicho aptamero se formulara en una composicion farmaceutica adecuada. Los detalles de dicha composicion farmaceutica se discuten a continuacion.

B. Usos medicos del complejo de la invencion

Los complejos de acuerdo a la presente invencion que comprenden un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional de acuerdo a la invencion pueden comprender, como grupo funcional, un farmaco adecuado para el tratamiento de una patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4. De esta forma se logra por tanto el doble objetivo de (i) inhibir la actividad de TLR-4 y (ii) dirigir el farmaco de manera espedfica a su lugar de accion.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invencion se refiere a un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional para su uso en medicina.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional para

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su uso en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una patolog^a caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR- 4.

Alternativamente, se puede expresar como el uso de un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional para su uso en el tratamiento de una patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4.

Alternativamente, se puede expresar como metodo de tratamiento de una patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR- 4 en un sujeto, que comprende la administracion a dicho sujeto de una cantidad terapeuticamente efectiva de un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional a dicho sujeto.

De acuerdo con la invencion, un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un farmaco se une espedficamente a TLR-4 en la superficie de un celula diana. Al contactar el aptamero de la invencion a TLR-4 inhibe su actividad, resultando en una reduccion o interrupcion en la liberacion de citoquinas pro- inflamatorias tales como IL-1, IL-8, TNF-alfa e IL-12, y el farmaco ejerce su funcion sobre la celula o sobre el entorno donde se encuentra dicha celula.

Los terminos "aptamero”, "complejo”, "grupo funcional”, "farmaco”, "tratamiento”, "cantidad terapeuticamente efectiva”, "sujeto”, "celula diana” y "patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4” han sido descritos en detalle anteriormente y sus definiciones y particularidades se incluyen aqu por referencia.

Farmacos adecuados que pueden ser usados como grupos funcionales en los complejos

formados con un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e

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inhibir a TLR-4 incluyen, sin limitacion, antagonistas de TLR-4, tales como naloxona, naltrexona, LPS, idulilast, propentofilina, amitriptilina, quetotifeno, ciclobenzaprina, mianserina e imipramina; antiagregantes plaquetarios, tales como aspirina y clopidogrel; anti-coagulantes, tales como heparina, acenocumarol, warfarina, dabigatran y rivaroxaban; y antioxidantes, tales como edaravona; el activador tisular del plasminogeno y sus variantes recombinantes; acidos nucleicos que posean la capacidad de silenciar la expresion de genes implicados en una patolog^a caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4, tales como ARN antisentido, ADN antisentido y ARN pequenos de interferencia; peptidos, tales como peptidos de senalizacion y peptidos de union a diana.

Composiciones farmaceuticas

Para la administracion a un sujeto en necesidad del mismo de un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas, o un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional, dichos aptameros y complejos se pueden formular en composiciones farmaceuticas adecuadas.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica, en adelante “la primera composicion farmaceutica de la invencion”, que comprende al menos un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas.

En una realizacion particular, la primera composicion farmaceutica de la invencion comprende ademas uno o mas soportes, excipientes, o solventes farmaceuticamente aceptables.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica, en adelante “la segunda composicion farmaceutica de la invencion”, que comprende al menos un complejo que comprende un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse

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espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas y un grupo funcional.

En una realizacion particular, la segunda composicion farmaceutica de la invencion comprende ademas uno o mas soportes, excipientes, o solventes farmaceuticamente aceptables.

Las composiciones farmaceuticas proporcionadas por la presente invencion pueden administrarse a un sujeto para el tratamiento de una patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4.

Los terminos "aptamero”, “complejo”, "grupo funcional”, "farmaco”, "tratamiento”, "sujeto” y "patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4” han sido descritos en detalle anteriormente y sus definiciones y particularidades se incluyen aqu por referencia.

El termino "soporte farmaceuticamente aceptable” o "excipiente farmaceuticamente aceptable" o "solvente farmaceuticamente aceptable", en el contexto de la presente invencion, pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes retardantes de la absorcion e isotonicos, y similares, compatibles con la administracion farmaceutica. El uso de tales soportes y vedculos en sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier soporte convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones de la invencion. Los vedculos aceptables, excipientes, o estabilizadores aceptables no son toxicos para el sujeto a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, butilo o alcohol bendlico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol, y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 aminoacidos); protemas, tales como albumina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polimeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos, y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como

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sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sales tales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de Zn-protema); y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEENtm, PLURONICStm o polietilenglicol (PEG).

Tambien se pueden incorporar en la composition farmaceutica proporcionada por la presente invention compuestos activos suplementarios. Por lo tanto, en una realization particular, la composicion farmaceutica proporcionada por la presente invencion puede tambien contener mas de un compuesto activo segun sea necesario para la indication particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no afectan de manera adversa entre si. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar ademas un agente quimioterapeutico, una citoquina, un agente analgesico, un agente anti- inflamatorio o un agente inmunosupresor. La cantidad eficaz de dichos otros agentes activos depende, entre otras cosas, de la cantidad terapeutica de los aptameros o de los complejos que estan presentes en la composicion farmaceutica, la naturaleza y la gravedad de la patologia a tratar, el sujeto, etc.

En una forma de realizacion, el aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4 y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas, o el complejo de la invencion, se formulan con veticulos que protegeran dichos productos frente a una elimination rapida del cuerpo, tales como una formulation de liberacion controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polimeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhidridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, y acido polilactico. Los metodos para la preparation de tales formulaciones seran evidentes para los expertos en la tecnica. Estos se pueden preparar de acuerdo con metodos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en EE.UU. 4522, 811.

Las composiciones farmaceuticas proporcionadas por la presente invencion pueden ser administradas a un sujeto mediante cualquier ruta de administration adecuada, como por ejemplo por via parenteral.

El termino "parenteral", en el contexto de la presente invencion, incluye la administracion intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, o subcutanea. La forma intravenosa de administracion parenteral es generalmente preferida.

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Ademas, las composiciones farmaceuticas proporcionadas por la presente invention se pueden administrar de forma adecuada por infusion de pulsos, por ejemplo, con dosis decrecientes del aptamero o del complejo de la invencion. Preferiblemente, la dosificacion se proporciona mediante inyecciones, mas preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutaneas, dependiendo en parte de si la administration es breve o cronica.

En otra realization particular, las composiciones farmaceuticas proporcionadas por la presente invencion se pueden adaptar para la administracion parenteral con la adicion de soluciones esteriles, suspensiones o productos liofilizados en la forma de dosificacion adecuada. Las composiciones farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas esteriles o dispersiones o polvos esteriles para la preparation de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Para la administracion intravenosa, los vehiculos adecuados incluyen solution salina fisiologica, agua bacteriostatica CremophorEM (BASF, Parsippany, NJ) o tampon fosfato salino (PBS). En todos los casos, la composition debe ser esteril y fluida para facilitar la inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabrication y almacenamiento y debe conservarse frente a la action contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehiculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, un poliol farmaceuticamente aceptable como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol liquido, y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de particula requerido en el caso de dispersion y por el uso de tensioactivos. La prevention de la accion de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir en la composicion agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, y cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y/o gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles pueden prepararse incorporando la cantidad requerida del compuesto activo (por ejemplo, un aptamero o complejo de la invencion) en un disolvente apropiado con uno o una combination de los ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtration. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehiculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los

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enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparation de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son el secado al vatio y el secado por congelation que produce un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solution previamente filtrada esteril del mismo.

En una realization particular, dicha composition farmaceutica se administra a traves de v^a intravenosa. Excipientes adecuados pueden ser utilizados, tales como agentes de carga, agentes tamponantes o tensioactivos. Las formulaciones mencionadas se prepararan usando metodos estandar tales como los descritos o contemplados en las farmacopeas espanola y estadounidense y textos de referencia similares.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmaceuticas, a saber, las composiciones parenterales, en forma de unidad de dosificacion para facilitar la administration y uniformidad de dosificacion. Forma de unidad de dosificacion como se usa en el presente documento se refiere a unidades fisicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo (un aptamero o complejo de la invention) calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehiculo farmaceutico requerido. La especificacion para las formas unitarias de dosificacion de la invencion estan dictadas por y dependen directamente de las caracteristicas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico particular a conseguir, y las limitaciones inherentes en la tecnica de composicion de tal compuesto activo para el tratamiento de sujetos.

Los compuestos activos (aptamero o complejo de la invencion) se administraran tipicamente una o mas veces al dia, por ejemplo 1, 2, 3 o 4 veces diarias, con dosis diarias totales tipicas en el intervalo de 0,0001 a 1,000 mg/kg de peso corporal/dia, preferiblemente de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal/dia, mas preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal/dia. Las composiciones farmaceuticas se pueden formular con el fin de contener la cantidad deseada, tal como una cantidad terapeuticamente eficaz del aptamero o complejo de la invencion.

Las composiciones farmaceuticas proporcionadas por la presente invencion se pueden incluir en un recipiente, envase, o dispensador junto con instrucciones para su administracion.

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La invention se describe a continuation por medio de los siguientes ejemplos que son meramente ilustrativos y de ninguna manera limitantes para el alcance de la invencion.

EJEMPLOS

Materiales y metodos

Libreria de aptameros

Los inventores utilizaron la libreria de aptameros RND40 para llevar a cabo la selection de aptameros espedficos frente a TLR-4, suministrada por IBA GmbH (Goettingen, Alemania). La libreria inicial RND40 esta teoricamente constituida por 1024 oligonucleotidos de ADN de cadena sencilla (ssADN) con secuencia fijas en los extremos, de 18 nucleotidos cada una donde hibridan los cebadores respectivos para su amplification por PCR, y una region central de 40 bases de secuencia aleatoria. En las selecciones realizadas se han utilizado 1013 oligonucleotidos de esta libreria.

6HIS-hTLR-4 recombinante

La protema correspondiente al dominio extracelular de la protema TLR-4 humana, aminoacidos 24-631, se genero de manera recombinante fusionada a una etiqueta de 6 histidinas en el extremo C-terminal, mediante expresion en baculovirus.

Celulas

Las celulas HEK293T y HEK293T/TLR-4 se obtuvieron de Invivogen (San Diego, California, USA).

Seleccion con celulas HEK-293T-TLR4 / HEK-293T.

Para cada ronda de seleccion, se sembraron 8-10 x 105 celulas HEK-293T por triplicado en pocillos de placa P6, 24 h antes del ensayo de seleccion y se incubaron a 37°C, 5% CO2. A continuacion, se anadio 1 nmol de aptameros de la libreria RND40 (o de la poblacion aislada en la ronda de seleccion anterior) en 100 ^l PBS, previamente desnaturalizados a 95°C durante 10 min seguidos de una incubation a 4°C durante 10 min, se anadio 300 ^l de medio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) suplementado con 10% suero bovino fetal, 100 U/ml penicilina, 100 ^g/ml estreptomicina y 25 ^g/ml amfotericina y se aplicaron sobre las celulas. Tras 1 h de incubacion a 37°C, 5% CO2, se retiro el medio de cultivo con los aptameros no unidos, se lavaron las celulas 2 veces con PBS y se recuperaron en 500 ^l de PBS mediante centrifugation a 1500 rpm. Las celulas se centrifugaron para retirar el

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sobrenadante y se los aptameros pegados a las celulas fueron amplificados por PCR.para preparar suficiente cantidad para la siguiente ronda de selection.

La contra-seleccion sobre celulas HEK-293T de la libreria de aptameros RND40 se realizo en la preparation previa de la poblacion RND40 inicial y cada 3 rondas de seleccion, con la poblacion aislada de la ronda de seleccion anterior. Para ello, se sembraron 8-10 x 105 celulas HEK-293T por triplicado en pocillos de placa P6, 24 h antes del ensayo de seleccion y se incubaron a 37°C, 5% CO2. A continuation, se anadio 1 nmol de aptameros de la libreria RND40 (o de la poblacion aislada en la ronda de seleccion anterior) en 100 ^l PBS, previamente desnaturalizados a 95°C durante 10 min seguidos de una incubation a 4°C durante 10 min, se anadio 300 ^l de medio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) suplementado con 10% suero bovino fetal, 100 U/ml penicilina, 100 ^g/ml estreptomicina y 25 ^g/ml amfotericina y se aplicaron sobre las celulas. Tras 1 h de incubacion a 37°C, 5% CO2, se retiro el medio de cultivo con los aptameros no unidos para ser utilizados en rondas de seleccion sobre TLR-4.

Seleccion con proteina soluble hTLR-4

Para cada ronda de seleccion, se utiliza la libreria RND40 enriquecida en una ronda de seleccion anterior. Se incubo 1 nmol de aptameros con 7 ^g de 6xHIS-hTLR-4 (en una relation de 10 moleculas de aptamero por 1 molecula hTLR-4), en buffer de aptameros aptameros (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 5 mM KCl), a 37°C durante 1 h con agitation. Posteriormente, se anadio la resina NTA-Ni (QIAGEN, Alemania) y se incubo a 4°C durante 1 h para capturar la proteina. Tras 3 lavados con buffer de aptameros, se amplificaron las secuencias unidas por PCR para preparar suficiente cantidad para la siguiente ronda de seleccion.

La contraseleccion se realiza en las mismas condiciones que la seleccion pero en ausencia de proteina TLR-4 unida a la resina.

Amplification de los aptameros seleccionados.

Los aptameros seleccionados fueron resuspendidos en un volumen de 20 ^l de agua destilada y se amplificaron mediante PCR usando los cebadores, que se corresponderan con las secuencias SEQ ID NO: 5 (GCGGATGAAGACTGGTGT) y SEQ ID NO: 6 (GTTGCTCGTATTTAGGGC) en las condiciones de 0.8 ^M/cebador SEQ ID NO: 5, 0.8 ^M/cebador SEQ ID NO: 6, 200 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 10 U Taq polimerasa (Biotools,

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Espana) en un volumen final de 200 ^l siguiendo el siguiente programa de amplificacion:2 min a 95°C; 15 ciclos de 30 s a 95°C, 30 s a 56°C y 30 s a 72°C; y finalmente 5 min a 72°C.

ELONA

Se determino si los aptameros seleccionados reconodan la protema TLR-4. Para ello, se anadieron 100 ng/pocillo de 6xHIS-TLR-4 recombinante a una placa de microtitulacion de 96 pocillos y se incubaron a 4°C durante 16 h. Posteriormente, aptameros individuales marcados con digoxigenina en su extremo 5', fueron diluidos a una concentration 5 ^g/mL y luego desnaturalizados durante 10 min a 95°C y enfriados durante 10 min en hielo. Despues, 20 pmoles de cada uno de los aptameros en 100 ^l (200 nM) de tampon de aptameros fueron anadidos a cada pocillo y la placa fue incubada durante 1 h a 37°C. Por ultimo, la placa fue incubada con anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con peroxidasa y revelada usando ABTS. Como control positivo se utilizo un aptamero de ADN frente a Li H2A (Martin et al., 2013, PLoS ONE 8: e78886).

Ensayos de union de los aptameros a hTLR-4 recombinante

Con objeto de analizar la capacidad de cada uno de los aptameros identificados de unirse a hTLR-4, se realizaron experimentos en los que hTLR-4 fue unido a una resina Ni-NTA previamente equilibrada, a traves de la etiqueta de histidinas. A continuation, los complejos resina:protema conteniendo 1 pmol de TLR4 fueron incubados con 1 pmol de los aptameros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3), TLRApt#2F, TLRApt#3R y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) previamente estructurados mediante desnaturalizacion termica a 95°C durante 10 min y posterior renaturalizacion a 4°C durante 10 min. Despues de incubar durante 10 min a 37°C, se lavaron los complejos y se recuperaron los aptameros con 150 mM imidazol disuelto en PBS con 1 mM MgCl2. Los valores de aptamero unido a hTLR-4 se determinaron mediante PCR cuantitativa (qPCR) usando los cebadores con las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 en un termociclador IQ5 (BioRad).

Ensayos de union de los aptameros a TLR-4 expresado en celulas

Con objeto de analizar la capacidad de los aptameros identificados de unirse a la protema TLR-4 expresada en celulas HEK-293, se anadieron 20 pmoles de cada uno de los aptameros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3), TLRApt#2F, TLRApt#3R y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) sobre un cultivo de celulas HEK-293-TLR4 sembradas a 20,000 celulas/pocillo en placas de microtitulacion de 96 pocillos a una densidad de 2 x 104 cel/pocillo, 2 dias antes del inicio del ensayo. Despues de incubar durante 30 min a 37°C, 5% CO2, las celulas se lavaron, se

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recuperaron los aptameros con 150 mM imidazol disuelto en PBS con 1 mM MgCl2, y se llevo a cabo qPCR para determinar los valores de Ct.

Ensayos de actividad frente al receptor hTLR-4.

Para realizar estos ensayos, se utilizaron celulas HEK-Blue hTLR4 (Invivogen, ref. hkb- htlr4), que expresan el receptor TLR-4 humano, junto con las protemas MD2 y CD14, las cuales se activan por la union de su agonista, lipopolisacarido de Escherichia coli K12 (LPS- EK). Para detectar la activacion de TLR-4, esta lmea celular contiene un gen reportero SEAP (fosfatasa alcalina embrionaria secretada, en ingles “secreted embrionic alkaline phosphatase”) que esta controlado por el promotor NF-kB, de modo que se expresa en respuesta a esta via de senalizacion NF-kB, inducida por TLR-4. La enzima SEAP es secretada al medio de cultivo, y al anadir y metabolizar su sustrato comercial QUANTI- Blue™ (Invivogen, San Diego, California, USA) provoca un cambio de color del medio de rojo a azul. Por otra parte, la molecula agonista control LPS-EK UP (lipopolysaccharide de E. coli K12 Ultra Puro) y el antagonista LPS-RS UP (Lipopolysaccharide de R. sphaeroides Ultra Puro) se disuelven en 1mM MgCl2 en PBS esteril a concentraciones de 0.02 ng/^L y 2 ng/^L, respectivamente. Los aptameros se preparan a concentraciones de 0.1, 1, 10 y 100 ng/^L en 1mM Cl2Mg en PBS esteril, se desnaturalizan a 95°C durante 10 min y se estructuraron a 4°C durante 10 min.

Para el ensayo, se sembraron celulas HEK-Blue hTLR4 en placas de microtitulacion de 96 pocillos a una densidad de 2 x 104 cel/pocillo, 3 dias antes del inicio del ensayo en un volumen total de 200 ^l de medio DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal, 100 U/ml penicilina, 100 ^g/ml estreptomicina y 25 ^g/ml amfotericina. A continuation, se anadieron 20 ^l del agonista control LPS-EK-UP (0.02 ng/^l). Tras 1 h de incubation a 37°C, se anadieron 10 ^l/pocillo de cada concentration de aptameros (Concentraciones finales de 0.2, 2, 20 y 200 nM o el antagonista control LPS-RS-UP (2 ng/^l; 20 ng). La activacion del receptor hTLR4 se midio 24 h despues utilizando 20 ^l del medio de cultivo al que se anaden 100 ^l de disolucion Quanty-Blue a temperatura ambiente. El cambio de color del medio se mide por absorbancia a 630 nm.

Modelo animal de ictus

Se utilizaron ratones machos adultos C57BL que pesaban 28 a 30 g. C57BL/10ScNJ (antiguo nombre C57BL/10ScCr), y los ratones C57BL/10ScSn fueron adquiridos de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Me, USA). La cepa murina C57BL/10ScNJ no expresa TLR4 funcional por deletion del gen TLR4, y la cepa C57BL/10ScSn no expresa ninguna

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mutacion en el gen TLR4 y es empleada como grupo control. Se utilizaron 4 ratones deficientes en TLR4 por grupo (C57BL/10ScNJ) y 4 ratones control por grupo (C57BL/10ScSn). Todos los protocolos experimentales se ajustaron a las directrices del Comite de Bienestar Animal de la Universidad Complutense (siguiendo las directivas europeas 86/609/CEE y 32/2007/CE). Los animales se han alojado en condiciones normales de temperatura, humedad y ciclos de luz/oscuridad de 12 horas con libre acceso a comida y agua.

La induction de la isquemia focal cerebral se ha llevado a cabo mediante la oclusion de la arteria cerebral media (en ingles “median cerebral arterial occlusion”, MCAO) segun las ensenanzas de Caso et al., 2007 (Caso et al., 2007, Circulation 115:1599-608). Brevemente, se induce una isquemia cerebral focal permanente por ligadura de la arteria carotida comun (ACC) y oclusion de la arteria cerebral media distal ipsilateral (ACM). Para la ligadura de la ACC, se hace una incision ventral-cervical parta aislar dicha arteria y ocluirla de forma permanente con ligadura. Para la oclusion de la ACM, se hace una incision a 1 cm de la lmea perpendicular que une el cantus lateral del ojo izquierdo y el canal auditivo externo y se retira el musculo temporal. Se hace un trepano para exponer la ACM que se ocluye por ligadura. Despues de la cirugia, el cierre de las incisiones y la desinfeccion, los animales son devueltos a sus jaulas con acceso libre de agua y comida. Durante la cirugia se controlan las constantes del animal.

El dano cerebral se evaluo mediante imagen por Resonancia Magnetica. Brevemente, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y 24 horas despues de MCAO, el tamano del infarto se ha evaluado por MRI. Las imagenes resaltadas en T2 (T2WI) han sido adquiridas en un BIOSPEC BMT 47/40 operando a 4.7 T (Bruker-Medical, Ettlingen, Germany; MRI Unit, Instituto Pluridisciplinar, UCM).

EJEMPLO 1: Selection de aptameros especlficos frente a TLR-4

Los inventores utilizaron la libreria de aptameros RND40 para llevar a cabo la seleccion de aptameros espedficos frente a TLR-4 suministrada por IBA GmbH (Goettingen, Alemania). La libreria inicial RND40 esta constituida por oligonucleotidos (ssADN) con secuencia fijas en los extremos, de 18 nucleotidos cada una donde hibridan los cebadores respectivos para su amplification por PCR, y una region central de 40 bases de secuencia aleatoria.

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La libreria inicial RND40 de 1013 aptameros fue enriquecida en aptameros espedficos frente a hTLR-4. Como paso previo a la selection con TLR-4, se realizo un proceso de "contra- seleccion” de la libreria frente a la superficie o matriz donde se presenta la molecula diana (resina magnetica, celulas de la misma lmea que la que expresa la protema diana, etc.).

EJEMPLO 2: Caracterizacion de los aptameros seleccionados

Se identificaron los aptameros seleccionados despues de 6 rondas de seleccion siguiendo las siguientes estrategias:

a) Mediante donation de la poblacion de aptameros en un plasmido con objeto de obtener aptameros individuales, y posterior secuenciacion Sanger.

b) Mediante secuenciacion masiva de la poblacion de aptameros obtenida, identificandose los aptameros que aparecen mas repetidos.

Las secuencias mas representadas se sintetizaron quimicamente por IBA GmbH (Goettingen, Alemania) y se estudio la afinidad y la actividad de cada uno de los aptameros en ensayos de union a protema recombinante hTLR-4 o a celulas HEK-293-TLR-4, mediante ELONA, ensayos de union de los aptameros a la protema TLR-4 recombinante y a TLR-4 expresado en celulas, ensayos de actividad frente al receptor hTLR-4

Los resultados de los ensayos de ELONA (Fig. 1) ponen de manifiesto que los aptameros que se unen de forma mas eficiente a la protema hTLR-4 recombinante son los aptameros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4). Mediante el mismo tipo de ensayo, se identificaron los aptameros TLRApt#2F y TLRApt#3R. En la Figura 2 se muestran las secuencias y estructuras secundarias mas probables de los aptameros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) seleccionados, obtenidas utilizando el software mFold (Zuker M., 2003, Nucleic Acids Res 31:3406-15).

La capacidad de union de los aptameros a hTLR-4 se determino mediante incubation de los aptameros con una resina de Ni-NTA con hTLR-4 unido, recuperation y posterior amplification por qPCR de los aptameros unidos. Los resultados obtenidos muestran que todos los aptameros seleccionados son capaces de unirse a la protema hTLR-4 recombinante (Fig. 3A). En estos experimentos, un valor de Ct menor indica una mayor cantidad de aptamero unido a hTLR-4.

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Con objeto de analizar la capacidad de los aptameros identificados de unirse a la protema TLR4 expresada en celulas HEK-293, 20 pmol (500 ng) de los aptameros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3), TLRApt#2F, TLRApt#3R y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) se anaden a un cultivo de celulas HEK-293-TLR4. Despues de incubar durante 30 min, a 37°C, 5% CO2, se lavan las celulas, se recuperan y se hace qPCR con objeto de calcular los valores de Ct. En estos experimentos, un valor de Ct menor indica una mayor cantidad de aptamero unido a las celulas. Los resultados obtenidos muestran que los aptameros seleccionados TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) (Fig. 3B) son los que se unen con mayor afinidad.

Posteriormente, se efectuaron ensayos de actividad frente al receptor hTLR-4 para determinar si los aptameros seleccionados son capaces de afectar positiva (actividad agonista) o negativamente (actividad antagonista) la actividad del receptor TLR-4. Los resultados muestran que los aptameros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3), TLRApt#2F, TLRApt#3R y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) y tienen actividad antagonista in vitro (Fig. 4A).

A la vista de estos resultados, se realizaron curvas dosis-respuesta con objeto de determinar la concentration de cada aptamero a la que se obtiene el maximo efecto antagonista. A partir de los resultados obtenidos (Fig. 4B) se puede concluir que las concentraciones a las que se observa el mejor efecto son 20 nM para TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) y 200 nM para TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4). Significancia estadistica: *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001.

EJEMPLO 3: Optimization de los aptameros antagonistas de TLR-4 para incrementar su actividad y estabilidad en modelos animales

Los aptameros que han mostrado capacidad de inhibir el receptor TLR-4 han sido modificados mediante la elimination de regiones concretas de su secuencia, con objeto de aumentar su estabilidad y/o resistencia a nucleasas. Para ello, se ha realizado un estudio de la estructura secundaria de los diferentes aptameros utilizando el programa mFold (Zuker M., 2003, citado at supra) y se ha analizado la capacidad de los aptameros de formar estructuras G-quadruplex mediante el programa QGRS Mapper (Kikin et al., 2006, Nucleic Acids Res 34:W676-W682). De esta manera, se disenaron y sintetizaron los aptameros TLRApt#1R-T (SEQ ID NO: 1) y TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2), correspondientes a los identificados en las primeras selecciones (Fig. 5).

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EJEMPLO 4: Efecto de los aptameros antagonistas de TLR-4 en un modelo animal de ictus

Se estudio la capacidad de los nuevos aptameros optimizados para bloquear la respuesta inflamatoria producida tras un episodio de ictus en un modelo animal de ictus, evaluando la capacidad de los aptameros espedficos de TLR-4 para disminuir la lesion cerebral.

Para ello, se utilizaron ratones macho adultos deficientes en TLR-4 (C57BL/10ScNJ) y ratones control que expresan TLR-4 (C57BL/10ScSn), en los que se indujo isquemia focal cerebral mediante la oclusion de la arteria cerebral media (MCAO). Los resultados obtenidos en los ratones que expresan de forma normal el TLR4 (ratones control) demuestran que los aptameros producen una disminucion de tamano de la zona infartada que, en el caso del aptamero TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) es estadisticamente significativa. Por otra parte, los resultados obtenidos en ratones deficientes en TLR-4 muestran que no existe efecto del aptamero TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) sobre el que se obtiene cuando los ratones se tratan con el vedculo (Fig. 6). Este dato indica claramente que el efecto del aptamero TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) se produce a traves de TLR-4.

Conclusiones

- Se han seleccionado los aptameros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) frente al dominio extracelular del receptor TLR-4, que reconocen el receptor TLR-4 humano, tanto en su forma recombinante soluble (in vitro), como integrado en la membrana de celulas HEK293 (in vivo).

- Los aptameros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) muestran un efecto antagonista del receptor TLR-4.

- Se han obtenido aptameros truncados TLRApt#1R-T (SEQ ID NO: 1) y TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) que mantienen la actividad antagonista de los aptameros originales TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) y TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4), respectivamente.

- El aptamero TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) es capaz de reducir la zona infartada en un modelo animal de ictus.

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REIVINDICACIONES

1. Un aptamero de acido nucleico con capacidad de unirse espedficamente e inhibir a TLR-4, y que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas.
2. Aptamero segun la reivindicacion 1, en donde la secuencia se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
3. Aptamero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el acido nucleico es ADN.
4. Aptamero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el TLR-4 es un TLR- 4 humano.
5. Un complejo que comprende el aptamero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un grupo funcional.
6. Complejo segun la reivindicacion 5, en donde el grupo funcional es un reactivo detectable.
7. Uso in vitro de un aptamero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un complejo segun cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6 para detectar TLR-4.
8. Uso segun la reivindicacion 7, en donde la deteccion de TLR-4 se realiza mediante un metodo seleccionado del grupo que consiste en ELONA, aptacitoqdmica, aptahistoqdmica y citometria de flujo.
9. Uso in vitro de un aptamero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un complejo segun cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6 para inhibir TLR-4.
10. Metodo in vitro para la deteccion de TLR-4 en una muestra que comprende

i) poner en contacto dicha muestra con un aptamero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un complejo segun cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, y

ii) separar el aptamero o complejo no unido a TLR-4,

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iii) detectar la presencia del aptamero o complejo unido al TLR-4 presente en la muestra.
11. Metodo segun la reivindicacion 10, en donde la deteccion se realiza por medio de fluorescencia.
12. Metodo in vitro para inhibir TLR-4 en una muestra que comprende poner en contacto una muestra que comprende TLR-4 con un aptamero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un complejo segun cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en condiciones adecuadas inhibir TLR-4.
13. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde la muestra es una muestra biologica de un sujeto.
14. Metodo segun la reivindicacion 13, en donde el sujeto es un humano.
15. Un aptamero segun las reivindicaciones 1 a 4 o un complejo segun cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6 para su uso en la fabrication de un medicamento para el tratamiento de una patologia caracterizada por un aumento de expresion de TLR-4 y/o un aumento de activacion de TLR-4.
16. Aptamero o complejo para su uso segun la reivindicacion 15, en donde la patologia caracterizada por un aumento de expresion y/o un aumento de activation de TLR-4 es ictus.
17. Una composition farmaceutica que comprende al menos un aptamero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o al menos un complejo segun cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, opcionalmente en combination con uno o mas soportes, excipientes o solventes farmaceuticamente aceptables.