ES2552725T3 - Procedimientos y composiciones para detectar el virus BK - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de valoración de la presencia de ácido nucleico del virus BK (BKV) en una muestra, incluyendo el procedimiento determinar la cantidad de ácido nucleico de BKV y determinar si está presente o ausente, incluyendo adicionalmente el procedimiento discriminar entre ácido nucleico de virus BKV y JC, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto dicha muestra con un par cebador diseñado para hibridar en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia diana de SEQ ID NO: 1, 2, 4 o 5, o complementos de la misma, en el que el par cebador incluye un primer cebador que tiene una secuencia que es la misma que o similar a la de una primera porción de la secuencia diana y un segundo cebador que tiene una secuencia que es complementaria de una segunda porción de la secuencia diana, en el que al menos un cebador del par cebador diseñado para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma, en condiciones de hibridación rigurosas se diseña para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 9 o 10, o complementos de la misma, y determinar la cantidad de ácido nucleico del virus BK (BKV) en la muestra midiendo la amplificación de dicha secuencia diana de SEQ ID NO: 1, 2, 4 o 5, o complementos de la misma, en el que dicha amplificación detecta la presencia o ausencia de ácido nucleico de BKV.
Description
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de SDS a 68 ºC durante 15 minutos; o condiciones equivalentes. Las condiciones rigurosas para lavado pueden ser también, p.ej., 0,2xSSC/0,1 % de SDS a 42 ºC. En casos en los que las moléculas de ácido nucleico sean desoxioligonucleótidos (“oligos”), las condiciones rigurosas pueden incluir lavado con 6xSSC/0,05 % de pirofosfato de sodio a 37 ºC (para oligos de 14 bases), a 48 ºC (para oligos de 17 bases), a 55 ºC (para oligos de 20 bases) y a 60 º C (para oligos de 23 bases). Véase Sambrook, Ausubel o Tijssen (citados a continuación) para descripciones detalladas de condiciones de hibridación y lavado y reactivos y tampones equivalentes, p.ej. tampones SCC y reactivos y condiciones equivalentes.
Las condiciones de hibridación rigurosas son condiciones de hibridación que son al menos tan rigurosas como las condiciones representativas anteriores, en que las condiciones se considera que son al menos tan rigurosas si son al menos aproximadamente un 80 % tan rigurosas, típicamente al menos aproximadamente un 90 % tan rigurosas como las condiciones rigurosas específicas anteriores. Son conocidas en la materia otras condiciones de hibridación rigurosas y pueden emplearse también, según sea apropiado.
La “temperatura de fusión” o “Tm” del ADN bicatenario se define como la temperatura a la que la mitad de la estructura helicoidal del ADN se pierde debido al calentamiento u otra disociación del enlace de hidrógeno entre pares de bases, por ejemplo, por tratamiento ácido o alcalino o similar. La Tm de una molécula de ADN depende de su longitud y de su composición de bases. Las moléculas de ADN ricas en pares de bases GC tienen una mayor Tm que aquellas que tienen abundancia de pares de bases AT. Las hebras complementarias separadas de ADN se reasocian o emparejan espontáneamente formando ADN dúplex cuando la temperatura se baja por debajo de la Tm. La tasa más alta de hibridación de ácido nucleico tiene lugar aproximadamente a 25 ºC por debajo de la Tm. La Tm puede estimarse usando la siguiente relación: Tm= 69,3+0,41(% de GC) (Marmur et al. (1962) J. Mol. BioI. 5: 109118).
Como se usa en la presente memoria, una “muestra biológica” hace referencia a una muestra de tejido o fluido aislada de un sujeto, que en el contexto de la invención hace referencia generalmente a muestras sospechosas de contener ácido nucleico y/o partículas víricas de virus BK, pudiendo dichas muestras, después de procesamiento adicional, analizarse en un ensayo in vitro. Las muestras de interés típicas incluyen, pero no está necesariamente limitadas a, secreciones respiratorias (p.ej. muestras obtenidas de fluidos o tejido de los conductos nasales, pulmón y similares), sangre, plasma, suero, células sanguíneas, líquido cefalorraquídeo, materia fecal, orina, lágrimas, saliva, leche, órganos, biopsias y secreciones de los tractos intestinal y respiratorio. La muestras incluyen también muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro incluyendo, pero sin limitación, medios acondicionados resultantes del crecimiento de células y tejidos en medio de cultivo, p.ej. células recombinantes y componentes celulares.
El término “valorar” incluye cualquier forma de medida, e incluye determinar si un elemento está presente o no. Los términos “determinar”, “medir”, “evaluar”, “valorar” y “ensayar” se usan intercambiablemente e incluyen determinaciones cuantitativas y cualitativas. La valoración puede ser relativa o absoluta. “Valorar la presencia de” incluye determinar la cantidad de algo presente y/o determinar si está presente o ausente. Como se usan en la presente memoria, los términos “determinar”, “medir” y “valorar” y “ensayar” se usan intercambiablemente e incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas.
En el contexto de los procedimientos que implican la amplificación basada en ácido nucleico de una secuencia diana, el término “intervalo de referencia” hace referencia a un intervalo de valores de CT (ciclo umbral) de especímenes negativos del virus BK representativos de resultados que se considera que indican que la muestra (p.ej. un espécimen de paciente) es negativa del virus BK.
En el contexto de los procedimientos que implican la amplificación basada en ácido nucleico de una secuencia diana, el término “intervalo reseñable” hace referencia a un intervalo de valores de CT generados por especímenes positivos del virus BK que son representativos de resultados que se reseñan como especímenes de paciente positivos del virus BK.
“Especificidad analítica”, como se usa en la presente memoria, hace referencia a la capacidad de un sistema de detección de detectar específicamente el virus diana y no detectar otros virus relacionados, o flora patógena o comensal encontrada en los tipos de espécimen que se están validando. Por ejemplo, “especificidad analítica”, con referencia a ensayos que usan cebadores y una sonda del virus BK, hace referencia a la capacidad de este sistema de detección de amplificar y detectar específicamente el virus diana y no detectar otros virus relacionados, o flora patógena o comensal encontrada en los tipos de espécimen que se están validando.
“Sensibilidad analítica”, en el contexto de los procedimientos que implican la amplificación basada en ácidos nucleicos de una secuencia diana, hace referencia a la cantidad menor mensurable de ADN diana del virus BK que puede detectarse para cada tipo de espécimen validado.
“Precisión” hace referencia a la capacidad de un ensayo de generar reproduciblemente un resultado igual o comparable para una muestra dada.
“Exactitud” hace referencia a la capacidad de un ensayo de detectar correctamente una molécula diana en un panel con anonimato que contiene especímenes tanto positivos como negativos.
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Se observa adicionalmente que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta afirmación se pretende que sirva como base antecedente para el uso de aquella terminología excluyente como “únicamente”, “solo” y similares con relación a la enumeración de los elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación “negativa”.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que está englobado en la invención cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado. Los límites superior e inferior de estos intervalos menores pueden incluirse independientemente en los intervalos menores, y están también englobados en la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluyente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, se incluyen también en la invención los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de estos límites incluidos.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un especialista en la materia a la que pertenece la invención. Aunque puede usarse cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen ahora los procedimientos y materiales preferidos.
Debe observarse que, como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “y” y “el” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a un “cebador oligonucleotídico” incluye una pluralidad de dichos cebadores, y la referencia a “cebador” incluye la referencia a uno o más de los cebadores y equivalentes de los mismos conocidos por los especialistas en la materia, y demás.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de química, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y virología dentro de los conocimientos de un especialista en la materia. Dichas técnicas se explican enteramente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, “Fundamental Virology”, 2ª edición, vol. I y II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.); A. L. Lehninger, “Biochemistry” (Worth Publishers, Inc., edición actual); Sambrook, et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2ª edición, 1989); “Methods In Enzymology” (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); “Oligonucleotide Synthesis” (N. Gait, ed., 1984); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (1984).
La invención se describirá ahora con más detalle.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención está basada en el descubrimiento de regiones de ácido nucleico diana de consenso en el genoma del virus BK (BKV) que incluyen secuencias de ácido nucleico diana (a las que se hace referencia también en la presente memoria como secuencias diana) para la detección de BKV en una muestra, particularmente una muestra biológica, con especificidad y sensibilidad. En particular, la detección de una o más regiones de secuencia de ácido nucleico diana permite la detección de BKV en una muestra, en general, mientras que es también capaz de discriminar entre, por ejemplo, BKV y virus JC (JCV) y/o BKV y SV40. La especificidad y simplicidad de estos ensayos facilita ensayos rápidos, fiables y económicos para la detección de BKV en general. La invención en cuestión encuentra uso en una variedad de diferentes aplicaciones, incluyendo aplicaciones de investigación, médicas, de desarrollo de fármacos y de diagnóstico.
En general, los procedimientos dados a conocer proporcionan la detección de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, mediante la detección de una región de ácido nucleico diana del genoma de BKV. Se describen en la presente memoria cinco de dichas regiones de ácido nucleico diana, denominadas regiones diana I-V como se designan en la Figura 1.
Los procedimientos dados a conocer proporcionan la detección de cualquier aislamiento de BKV en una muestra tal como una muestra biológica. Dichos procedimientos detectan una región de ácido nucleico diana, o fragmento de la misma, usando cebadores y sonda que corresponden a secuencias dentro de la región diana. Se proporcionan en la Tabla 1 cebadores ejemplares en las regiones diana I-V adecuados para uso en los procedimientos. Las sondas adecuadas para uso en la invención incluyen cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando cebadores seleccionados. Se selecciona una sonda adecuada para uso con dicha realización de tal modo que corresponda a una región que comparte una secuencia nucleotídica entre los diferentes aislamientos de BKV para detectar.
Se observa que las secuencias proporcionadas en la presente memoria, y particularmente las secuencias de consenso, se proporcionan como secuencias de ADN. Se entiende que las secuencias de ADN proporcionadas pueden ser monocatenarias o bicatenarias, y como tal la descripción de las secuencias de ADN siguientes se pretende que proporcione también la secuencia complementaria además.
Se describirán ahora con más detalle las composiciones y procedimientos de la invención.
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REGIONES DE ÁCIDO NUCLEICO DIANA
Las regiones de secuencia de ácido nucleico diana se identificaron mediante alineamiento de diversos genomas de aislamiento de BKV. La presente invención proporciona la identificación de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, mediante la detección de una o más regiones de ácido nucleico diana o una porción de las mismas. En general, la detección es mediante amplificación de ácido nucleico, que en algunas realizaciones está seguida por la detección del producto de amplificación usando una sonda de hibridación. Se describen con más detalle a continuación las regiones de ácido nucleico diana.
Se apreciará que, puesto que el BKV contiene un genoma de ADN bicatenario del que se genera ARN durante la replicación vírica, los cebadores y sondas descritos en la presente memoria engloban aquellos que tienen la secuencia de ácido nucleico descrita en la presente memoria, así como los cebadores y sondas que tienen el complemento de dichas secuencias de ácido nucleico.
Además, se entenderá que los pares cebadores útiles en la invención incluyen un primer cebador que tiene una secuencia que es la misma que o similar a la de la secuencia de BKV proporcionada en la presente memoria, y un segundo cebador que tiene una secuencia que es complementaria de la secuencia de BKV proporcionada en la presente memoria, proporcionando la amplificación de una región de ácido nucleico diana de BKV descrita en la presente memoria o un fragmento de la misma (p.ej., el primer cebador es un cebador “de codificación” y el segundo cebador es un cebador “inverso”). Se entenderá adicionalmente que los pares cebadores útiles en la invención incluyen también un primer cebador que tiene una secuencia que es complementaria de la de la secuencia de BKV proporcionada en la presente memoria, y un segundo cebador que es el mismo que o similar a la secuencia de BKV proporcionada en la presente memoria, proporcionando la amplificación de una región de ácido nucleico diana de BKV descrita en la presente memoria o un fragmento de la misma (p.ej., el primer cebador es un cebador “inverso” y el segundo cebador es un cebador “de codificación”).
Se entenderá también que la secuencia de ácido nucleico de las sondas descritas en la presente memoria puede ser la misma que o similar a la secuencia de BKV proporcionada o un complemento de la misma. Además, los cebadores descritos en la presente memoria pueden usarse también como sondas, p.ej., para detectar un producto de amplificación.
Región diana I (BK1)
En una realización, la invención proporciona la detección de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, mediante la detección de una región de secuencia de ácido nucleico diana I (Figura 1, región diana I) (a la que se hace también referencia como BK1), posición de alineamiento 435-585 basada en la numeración del nº de acceso a GenBank AY628224) como sigue:
- o un complemento de la misma, o un fragmento de la misma, en la que el extremo 5’ y 3’ del ácido nucleico está contenido en la SEQ ID NO:01. Esta secuencia conservada en el genoma de BKV se muestra en el alineamiento de la FIG. 1. En una realización de particular interés, la región diana es una subsecuencia de la región diana I, tal como
- o un complemento de la misma o un fragmento de la misma.
Las secuencias de ácido nucleico ejemplares adecuadas para el diseño de cebadores para amplificación de un ácido nucleico de región diana I, y adecuadas para uso en los procedimientos de la invención, se indican por el tipo de letra subrayado en la Figura 1. Las secuencias adecuadas para cebadores para la amplificación del ácido nucleico de la región diana I corresponden a los nucleótidos 1-26 y 94-119 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:01, o un complemento de la misma.
Las sondas adecuadas para uso en la invención pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. Las
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secuencias adecuadas para uso como sonda para la detección del ácido nucleico de la región diana I corresponden a los nucleótidos 57-90 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:01, o un complemento de la misma.
En una realización, la detección del ácido nucleico de la región diana I implica la producción de un producto de amplificación de al menos 151, al menos 145, al menos 140, al menos 135, al menos 130, al menos 125, al menos 120, al menos 115, al menos 110, al menos 105, al menos 100, al menos 95, al menos 90, al menos 85, al menos 80, al menos 75, al menos 70, al menos 65, al menos 60, al menos 55, al menos 50, al menos 45, al menos 40, al menos 35, al menos 30, al menos 28, al menos 26, al menos 24, al menos 22 o al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO:01.
Los procedimientos de la invención pueden implicar la detección del ácido nucleico de la región diana I sola o en combinación con la detección de una o más de las regiones diana II-V como se describen en la presente memoria. Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden implicar la detección de la región diana I (BK1) y la región diana II (BK2); la región diana I (BK1) y la región diana III (BK3); la región diana I (BK1) y la región diana IV (BK4); la región diana I (BK1) y la región diana V (BK5); la región diana I (BK1), la región diana II (BK2) y la región diana III (BK3); la región diana I (BK1), la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5); la región diana I (BK1), la región diana III (BK3) y la región diana V (BK5) y similares. Se entenderá que se contempla por los presentes procedimientos la detección de todas las combinaciones de regiones diana I-V.
Se discuten con más detalle a continuación cebadores y sondas ejemplares.
Región diana II (BK2)
En una realización, la invención proporciona la detección de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, mediante la detección de la región de secuencia de ácido nucleico diana II (Figura 1, región diana II (a la que se hace referencia también como BK2), posición de alineamiento 1418-1545 basada en la numeración del nº de acceso a GenBank AY628224) como sigue:
- o un complemento de la misma, o un fragmento de la misma, en la que el extremo 5’ y 3’ del ácido nucleico está contenido en la SEQ ID NO:02. Esta secuencia conservada como se encuentra en el genoma BKV se ilustra en el alineamiento de la FIG. 1 En una realización de particular interés, la región diana es una subsecuencia de la región diana II, tal como
- o un complemento de la misma o un fragmento de la misma.
Las secuencias de ácido nucleico adecuadas para el diseño de cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de la región II de secuencia diana, y adecuadas para uso en los procedimientos de la invención, se indican por el tipo de letra subrayado en la Figura 1. Las secuencias adecuadas para cebadores para la amplificación del ácido nucleico de la región diana II corresponden a los nucleótidos 33-50 y 82-104 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:02, o un complemento de la misma.
Las sondas adecuadas para uso en la invención pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. Las secuencias adecuadas para uso como sonda para la detección del ácido nucleico de la región diana II corresponden a los nucleótidos 52-80 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:02, o un complemento de la misma.
En una realización, la detección del ácido nucleico de la región diana II implica la producción de un producto de amplificación de al menos 128, al menos 120, al menos 110, al menos 100, al menos 90, al menos 80, al menos 75, al menos 70, al menos 65, al menos 60, al menos 55, al menos 50, al menos al menos 45, 40, al menos 35, al menos 30, al menos 28, al menos 26, al menos 24, al menos 22, al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO:02.
Los procedimientos de la invención pueden implicar la detección del ácido nucleico de la región diana II sola o en combinación con la detección de una o más de las regiones diana I y III-V como se describen en la presente memoria. Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden implicar la detección de la región diana II (BK2) y la región diana I (BK1); la región diana II (BK2) y la región diana III (BK3); la región diana II (BK2) y la región diana IV (BK4); la región diana II (BK2) y la región diana V (BK5); la región diana I (BK1), la región diana II (BK2) y la región
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diana III (BK3); la región diana II (BK2), la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5); o la región diana II (BK2), la región diana III (BK3) y la región diana V (BK5) y similares. Se entenderá que está contemplada por los presentes procedimientos la detección de todas las combinaciones de regiones diana I-V.
Se discuten con más detalle a continuación cebadores y sondas ejemplares.
Región diana III (BK3)
Se da a conocer también como útil para la detección de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, la detección de la secuencia de ácido nucleico de la región diana III (Figura 1, región diana III (a la que se hace referencia también como BK3), posición de alineamiento 4097-4560 basada en la numeración del nº de acceso a GenBank AY628224) como sigue:
- o un complemento de la misma, o un fragmento de la misma, en la que el extremo 5’ y 3’ del ácido nucleico está contenido en la SEQ ID NO:03. Esta secuencia conservada en el genoma BKV se muestra en el alineamiento de los tres genomas de la FIG. 1. Preferiblemente, la región diana es una subsecuencia de la región diana III, tal como
- o un complemento de la misma o un fragmento de la misma.
Las secuencias de ácido nucleico ejemplares adecuadas para el diseño de cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de la región III están indicadas por el tipo de letra subrayado en la Figura 1. Las secuencias adecuadas para cebadores para la amplificación del ácido nucleico de la región diana III corresponden a los nucleótidos 280-306 y 355-380 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:03, o un complemento de la misma.
Las sondas pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. Las secuencias adecuadas para uso como sonda para la detección del ácido nucleico de la región diana III corresponden a los nucleótidos 330-354 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:03, o un complemento de la misma.
Se da a conocer que la detección del ácido nucleico de la región diana III implica la producción de un producto de amplificación de al menos 464, al menos 425, al menos 400, al menos 375, al menos 350, al menos 325, al menos 300, al menos 275, al menos 250, al menos 225, al menos 200, al menos 175, al menos 150, al menos 125, al menos 120, al menos 115, al menos 110, al menos 100, al menos 95, al menos 90, al menos 85, al menos 80, al menos 75, al menos 70, al menos 65, al menos 60, al menos 55, al menos 50, al menos 45, al menos 40, al menos 35, al menos 30, al menos 28, al menos 26, al menos 24, al menos 22 o al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO:03.
Los procedimientos pueden implicar la detección de ácido nucleico de la región diana III en combinación con la detección de una o más de las regiones I-II y IV-V como se describen en la presente memoria. Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden implicar la detección de la región diana III (BK3) y la región diana IV (BK4); la región diana III (BK3) y la región diana V (BK5); la región diana III (BK3) y la región diana I (BK1); la región diana III (BK3) y la región diana II (BK2); la región diana I (BK1), la región diana II (BK2) y la región diana III (BK3); la región diana III (BK3), la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5); o la región diana III (BK3), la región diana I (BK1) y la región diana V (BK5) y similares. Se entenderá que está contemplada por los presentes procedimientos la detección de todas las combinaciones de las regiones diana I-V.
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Se discuten con más detalle a continuación cebadores y sondas ejemplares.
Región diana IV (BK4)
En otra realización, la invención proporciona la detección de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, mediante la detección de una secuencia de ácido nucleico de la región diana IV (Figura 1, región diana IV (a la que se hace referencia también como BK4), posición de alineamiento 612-864 basada en la numeración del nº de acceso a GenBank AY628224) como sigue:
- o un complemento de la misma, o un fragmento de la misma, en la que el extremo 5’ y 3’ del ácido nucleico está contenido en la SEQ ID NO:04. Esta secuencia conservada en el genoma de BKV se muestra en el alineamiento de los tres genomas de la FIG. 1 En una realización de particular interés, la región diana es una subsecuencia de la región diana IV, tal como
- o un complemento de la misma o un fragmento de la misma.
Las secuencias de ácido nucleico ejemplares adecuadas para el diseño de cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de la región diana IV, y adecuadas para uso en los procedimientos de la invención, se indican por el tipo de letra subrayado en la Figura 1. Las secuencias adecuadas para cebadores para la amplificación del ácido nucleico de la región diana IV corresponden a los nucleótidos 1-19 y 76-95 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:04, o un complemento de la misma.
Las sondas adecuadas para uso en la invención pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. Las secuencias adecuadas para uso como sonda para la detección del ácido nucleico de la región diana IV corresponden a los nucleótidos 36-62 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:04, o un complemento de la misma.
En una realización, la detección del ácido nucleico de la región diana IV implica la producción de un producto de amplificación de al menos 253, al menos 250, al menos 225, al menos 200, al menos 175, al menos 150, al menos 125, al menos 120, al menos 115, al menos 100, al menos 95, al menos 90, al menos 85, al menos 80, al menos 75, al menos 70, al menos 65, al menos 60, al menos 55, al menos 50, al menos 45, al menos 40, al menos 35, al menos 30, al menos 28, al menos 26, al menos 24, al menos 22 o al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO:04.
Los procedimientos de la invención pueden implicar la detección de ácido nucleico de la región diana IV sola o en combinación con la detección de una o más de las regiones diana I-III y V como se describen en la presente memoria. Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden implicar la detección de la región diana IV (BK4) y la región diana I (BK1); la región diana IV (BK4) y la región diana II (BK2); la región diana IV (BK4) y la región diana III (BK3); la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5); la región diana I (BK1), la región diana II (BK2) y la región diana IV (BK4); la región diana III (BK3), la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5); o la región diana I (BK1), la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5) y similares. Se entenderá que se contemplan por los presentes procedimientos todas las combinaciones de las regiones diana I-V.
Se discuten con más detalle a continuación cebadores y sondas ejemplares.
Región diana V
En otra realización, la invención proporciona la detección de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, mediante la detección de una secuencia de ácido nucleico de la región diana V (Figura 1, región diana V (a la que se
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diseñan las sondas para tener una secuencia complementaria de una secuencia flanqueada por la secuencia o secuencias complementarias de uno o más cebadores usados para la amplificación.
Los cebadores y sondas para uso en los ensayos de la presente memoria se diseñan basándose en la secuencia dada a conocer en la presente memoria y se sintetizan fácilmente por técnicas estándares, p.ej. síntesis en fase sólida mediante la química de fosforamidita, como se da a conocer en las patentes de EE.UU. nº 4.458.066 y 4.415.732, incorporadas a la presente memoria como referencia; Beaucage et al. (1992) Tetrahedron 48: 2223-2311 y Applied Biosystems User Bulletin nº 13 (1 de abril de 1987). Otros procedimientos de síntesis química incluyen, por ejemplo, el procedimiento de fosfotriéster descrito por Narang et al., Meth. EnzymoI. (1979) 68: 90 y el procedimiento de fosfodiéster dado a conocer por Brown et al., Meth. EnzymoI. (1979) 68: 109. Pueden incorporarse a sondas poli(A) o poli(C), u otras extensiones de nucleótidos no complementarios, usando estos mismos procedimientos. Las extensiones de óxido de hexaetileno pueden acoplarse con sondas mediante procedimientos conocidos en la materia. Cload et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 6324-6326; patente de EE.UU. nº 4.914.210 de Levenson et al.; Durand et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 6353-6359 y Hom et al. (1986) Tet. Lett. 27: 4705-4708.
Típicamente, las secuencias cebadoras están en el intervalo de entre 10-75 nucleótidos de longitud, tal como 10 a 70, 12 a 65, 15 a 60, 20 a 55, 25 a 50, 30 a 45 y similares. Más típicamente, los cebadores están en el intervalo de entre 18 y 40, 19 y 35, 20 y 30, 21 y 29, 22 y 28, 23 y 27, 24-25 nucleótidos de largo, y cualquier longitud entre los intervalos indicados. Son de particular interés los cebadores de aproximadamente 20 a 22 nucleótidos de longitud.
La sonda típica está en el intervalo de entre 10-50 nucleótidos de largo, tal como 10 a 50, 12 a 45, 15 a 40, 20 a 35, 25 a 30 y similares. Más típicamente, las sondas están en el intervalo de entre 18 y 40,19 y 35, 20 y 30, 21 y 29, 22 y 28, 23 y 27, 24-25 nucleótidos de largo, y cualquier longitud entre los intervalos indicados. Son de particular interés las sondas de aproximadamente 20 a 22 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, los procedimientos en cuestión proporcionan la detección de cualquier genotipo de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica. En dichas realizaciones, los procedimientos en cuestión detectan una región diana de ácido nucleico, o fragmento de la misma, usando cebadores y sonda que corresponden a secuencias dentro de la región diana. Los cebadores ejemplares dentro de las regiones diana I-V adecuadas para uso en los procedimientos de la invención se indican por el tipo de letra en negrita en la FIG. 1. Las sondas adecuadas para uso en la invención pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. Se selecciona una sonda adecuada para uso con dicha realización de tal modo que corresponda a una región que comparte secuencia nucleotídica entre los diferentes genotipos de BKV para detectar.
Los procedimientos dados a conocer pueden proporcionar la detección y discriminación entre diferentes genotipos en una muestra, tal como una muestra biológica. Los procedimientos dados a conocer pueden detectar un ácido nucleico de región diana, o fragmento del mismo, usando cebadores y sonda que corresponden a secuencias dentro de la región diana. Los cebadores ejemplares dentro de las regiones diana I-V adecuados para uso en los procedimientos se indican por tipo de letra en negrita en la Figura 1. Las sondas adecuadas para uso en la invención pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. La secuencia de la sonda se selecciona de tal modo que corresponda a una región que difiere en secuencia en uno o más nucleótidos entre los diferentes genotipos de BKV para detectar.
Se describe en la Tabla 1 las secuencias de ácido nucleico ejemplares de los genotipos de BKV que son adecuadas para uso como cebadores y sondas en los ensayos de la presente invención. La numeración de secuencia presentada en la Tabla 1 es la numeración del número de acceso a GenBank AY628224 en la FIG. 1.
Tabla 1: Secuencias de cebador y sonda ejemplares para la detección de las regiones diana I-V de ácido nucleico de BKV (secuencia proporcionada basándose en la secuencia del genoma de BKV; numeración de secuencia basada en la numeración del nº de acceso a GenBank AY628224 de la FIG. 1)
SEC ID NO.: Inicio Fin Longitud Secuencia 5’ a 3’
Región diana I (BK1) (correspondiente a los nucleótidos 435-585 de AY628224)
Región diana II (BK2) (correspondiente a los nucleótidos 1418-1545 de AY628224)
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SEC ID NO.: Inicio Fin Longitud Secuencia 5’ a 3’ Región diana III (BK3) (correspondiente a los nucleótidos 4097-4560 de AY628224)
Región diana IV (BK4) (correspondiente a los nucleótidos 612-864 de AY628224)
Región diana V (BK5) (correspondiente a los nucleótidos 2810-2895 de AY628224)
“F” hace referencia a cebador de codificación, “R” hace referencia a cebador inverso y “P” hace referencia a sonda
Las sondas pueden acoplarse con marcadores para detección. Hay varios procedimientos y composiciones conocidos para derivatizar oligonucleótidos con funcionalidades reactivas que permiten la adición de un marcador. Por ejemplo, están disponibles varios enfoques biotinilación de sondas, de modo que puedan fijarse marcadores radiactivos, fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimáticos o electrónicos densos por avidina. Véanse, p.ej. Broken et al., Nucl. Acids Res. (1978) 5: 363-384, que da a conocer el uso de marcadores de ferritina-avidina-biotina; y Chollet et al. Nucl. Acids Res. (1985) 13: 1529-1541, que da a conocer la biotinilación de los extremos 5’ de oligonucleótidos mediante un brazo ligador de aminoalquilfosforamida. Están también disponibles varios procedimientos para sintetizar oligonucleótidos derivatizados con amino que se marcan fácilmente por compuestos fluorescentes o de otros tipos derivatizados con grupos reactivos con amino, tales como isotiocianato, Nhidroxisuccinimida o similares, véase, p.ej. Connolly (1987) Nucl. Acids Res. 15: 3131-3139, Gibson et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 6455-6467 y la patente de EE.UU. nº 4.605.735 de Miyoshi et al. Están también disponibles procedimientos para sintetizar oligonucleótidos derivatizados con sulfhidrilo que pueden hacerse reaccionar con marcadores específicos de tiol, véanse, p.ej. la patente de EE.UU. nº 4.757.141 de Fung et al., Connolly et al. (1985) Nuc. Acids Res. 13: 4485-4502 y Spoat et al. (1987) NucI. Acids Res. 15: 4837-4848. Se proporciona una revisión integral de las metodologías para marcar fragmentos de ADN en Matthews et al., Anal. Biochem. (1988) 169: 1-25.
Por ejemplo, las sondas pueden marcarse fluorescentemente ligando una molécula fluorescente al extremo no ligante de la sonda. Pueden encontrarse orientaciones sobre la selección de marcadores fluorescentes apropiados en Smith et al., Meth. EnzymoI. (1987) 155: 260-301; Karger et al., NucI. Acids Res. (1991) 19: 4955-4962 y Haugland (1989) “Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals” (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.). Los marcadores fluorescentes preferidos incluyen fluoresceína y derivados de la misma, tales como los dados a conocer en la patente de EE.UU. nº 4.318.846 y Lee et al., Cytometry (1989) 10: 151-164 y 6-FAM, JOE, TAMRA, ROX, HEX-1, HEX-2, ZOE, TET-1 o NAN-2 y similares.
Adicionalmente, las sondas pueden marcarse con un éster de acridinio (EA). Las tecnologías actuales permiten que el marcador de EA se disponga en cualquier localización dentro de la sonda. Véanse, p.ej., Nelson et al. (1995) "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence in Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing”, Kricka L. J. (ed) Academic Press, San Diego, Calif.; Nelson et al. (1994) "Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR in The Polymerase Chain Reaction”, Mullis et al. (eds.) Birkhauser, Boston, Mass.; Weeks et al., Clin. Chem. (1983) 29: 1474-1479; Berry et al., Clin. Chem. (1988) 34: 2087-2090. Puede fijarse directamente una molécula de EA a la sonda usando la química de brazo ligador no basado en nucleótidos, que permite la disposición del marcador en cualquier localización dentro de la sonda. Véanse, p.ej., las patentes de EE.UU. nº 5.585.481 y
5.185.439.
Si se usa un soporte sólido en el ensayo (p.ej. para capturar amplicones del ácido nucleico diana usando una sonda), la sonda oligonucleotídica puede fijarse al soporte sólido de una variedad de maneras. Por ejemplo, la sonda puede fijarse al soporte sólido mediante fijación del nucleótido 3’ o 5’ terminal de la sonda al soporte sólido. Más preferiblemente, la sonda se fija al soporte sólido por un ligador que sirve para distanciar la sonda del soporte sólido. El ligador es habitualmente de al menos 15-30 átomos de longitud, más preferiblemente de al menos 15-50 átomos de longitud. La longitud necesaria del ligador dependerá del soporte sólido particular usado. Por ejemplo, un ligador de 6 átomos es generalmente suficiente cuando se usa poliestireno de alta reticulación como soporte sólido.
Son conocidos una amplia variedad de ligadores en la materia que pueden usarse para fijar la sonda oligonucleotídica al soporte sólido. El ligador puede estar formado por cualquier compuesto que no interfiera
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Cuando la molécula de EA está fijada covalentemente a una sonda de ácido nucleico, la hidrólisis es rápida en condiciones débilmente alcalinas. Cuando la sonda marcada con EA es exactamente complementaria del ácido nucleico diana, la velocidad de hidrólisis de EA se reduce en gran medida. Por tanto, la sonda marcada con EA hibridada y no hibridada puede detectarse directamente en solución, sin necesidad de separación física.
El EPH consiste generalmente en las siguientes etapas: (a) la sonda marcada con EA hibrida con el ácido nucleico diana en solución durante aproximadamente 15 a aproximadamente 30 minutos. Se añade entonces una solución alcalina débil y se hidroliza el EA acoplado con la sonda no hibridada. Esta reacción lleva aproximadamente 5 a 10 minutos. Se detecta el EA asociado a híbrido restante como medida de la cantidad de diana presente. Esta etapa lleva aproximadamente 2 a 5 s. Preferiblemente, la etapa de hidrólisis diferencial se realiza a la misma temperatura que la etapa de hibridación, típicamente a 50 a 70 ºC. Como alternativa, puede realizarse una segunda etapa de hidrólisis diferencial a temperatura ambiente. Esto permite usar pH elevados, por ejemplo en el intervalo de 10-11, que procuran mayores diferencias en la velocidad de hidrólisis entre la sonda marcada con EA hibridada y no hibridada. El EPH se describe con detalle, p.ej. en las patentes de EE.UU. nº 6.004.745, 5.948.899 y 5.283.174.
Las moléculas oligonucleotídicas pueden usarse también en amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (ABSAN). Este procedimiento es un proceso enzimático dirigido por promotor que induce la amplificación in vitro continua, homogénea e isotérmica de un ácido nucleico específico proporcionando copias de ARN del ácido nucleico. Los reactivos para realizar la ASBAN incluyen un primer cebador de ADN con una cola 5’ que comprende un promotor, un segundo cebador de ADN, transcriptasa inversa, ARNasa H, ARN polimerasa T7, NTP y dNTP. Usando la ABSAN, se generan grandes cantidades de ARN monocatenario a partir de ADN o ADN monocatenario o ADN bicatenario. Cuando se va a amplificar ARN, el ARNmc sirve como molde para la síntesis de una primera hebra de ADN por elongación de un primer cebador que contiene un sitio de reconocimiento de ARN polimerasa. Esta hebra de ADN sirve a su vez como molde para la síntesis de una segunda hebra de ADN complementaria por elongación de un segundo cebador, dando como resultado un sitio promotor de ARN polimerasa activo bicatenario, y la segunda hebra de ADN sirve como molde para la síntesis de grandes cantidades del primer molde, el ARNmc, con la ayuda de una ARN polimerasa. La técnica NASBA es conocida en la materia y se describe, p.ej., en la patente europea 329.822, solicitud de patente internacional nº WO 91102814 y las patentes de EE.UU. nº 6.063.603,
5.554.517 y 5.409.818.
Las secuencias de BKV descritas en la presente memoria son también útiles en las técnicas de hibridación y amplificación de ácido nucleico que utilizan moléculas de ADN ramificadas. En un ensayo de hibridación de ácido nucleico básico, el ácido nucleico analito monocatenario hibrida con una sonda de ácido nucleico monocatenaria marcada y se detectan los dúplex marcados resultantes. Se han desarrollado variaciones de este esquema básico para facilitar la separación de los dúplex para detectar materiales ajenos y/o para amplificar la señal que se detecta. Un procedimiento de amplificación de la señal usa multímeros de amplificación que son polinucleótidos con un primer segmento que hibrida específicamente con el ácido nucleico analito o una hebra del ácido nucleico unido al analito, e iteraciones de un segundo segmento que hibrida específicamente con una sonda marcada. La amplificación es teóricamente proporcional al número de iteraciones del segundo segmento. Los multímeros pueden ser lineales o ramificados. Son útiles en estas técnicas dos tipos generales de multímeros ramificados: bifurcados y filiformes. Los procedimientos para preparar y usar moléculas de ácido nucleico ramificadas son conocidos y se describen, p.ej., en la patente de EE.UU. nº 5.849.481.
Kits
Se proporcionan también kits como se definen en las reivindicaciones. Los reactivos de ensayo anteriormente descritos, incluyendo cebadores, sondas, soporte sólido con sondas unidas, así como otros reactivos de detección, pueden proporcionarse en kits, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios para realizar los ensayos como se describen anteriormente. El kit contendrá normalmente en envases separados la combinación de cebadores y sondas (ya unidos a una matriz sólida o separados con los reactivos para unirlos a la matriz), formulaciones de control (positivo y/o negativo), reactivos marcados cuando el formato de ensayo requiera los mismos y reactivos generadores de señal (p.ej. sustrato enzimático) si el marcador no genera una señal directamente. Se incluirán habitualmente en el kit instrucciones (p.ej. escritas, en cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo. El kit puede contener también, dependiendo del ensayo particular usado, otros reactivos y materiales envasados (concretamente, tampones de lavado y similares). Pueden realizarse ensayos estándares, tales como los descritos anteriormente, usando estos kits.
Las instrucciones se registran generalmente en un medio de registro adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden imprimirse sobre un sustrato tal como papel o plástico, etc. Como tales, las instrucciones pueden estar presentes en los kit como un prospecto de envase, en el etiquetado del envase del kit o componentes de mismo (p.ej., asociadas al envoltorio o subenvoltorio), etc. En otras realizaciones, las instrucciones están presentes como un archivo de datos de almacenamiento electrónico presente en un medio almacenamiento en soporte informático adecuado, p.ej. CD-ROM, disquete, etc., incluyendo el mismo medio en que se presenta el programa.
En aún otras realizaciones, las instrucciones no están presentes por sí mismas en el kit, sino que se proporcionan medios para obtener las instrucciones de una fuente remota, p.ej. a través de internet. Es un ejemplo de esta
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JCV. Un análisis cuidadoso de estos alineamientos permitía la selección de secuencias oligonucleotídicas con secuencias que cubren todas las variantes de BKV pero que discriminan las secuencias de cualquier otro género estrechamente relacionado, permitiendo así la amplificación específica de género y la detección e identificación ubicua de BKV. Las secuencias de los cebadores y sonda para la región diana BK4 son como siguen:
SEQ ID NO: Secuencia 5’ a 3’
Región diana IV (BK4)
Para la confirmación de la detección específica de BKV, se secuenciaron y analizaron los productos de amplificación de PCR de especímenes de BKV. Se alinearon bien las secuencias del producto de amplificación con la secuencia de BKV, y ninguna de las secuencias del producto de amplificación se identificó como secuencia de JCV o de ningún otro género. Se muestran en la Fig. 2 los resultados del ensayo. Las concentraciones de molde oscilaban de 50 copias por reacción a 50.000 por reacción, y se efectuó el ensayo por duplicado. Para el ensayo de BK4: pendiente= -3,21, punto de corte= 41,466 y R2= 0,999.
Se ensayó la sensibilidad analítica del cebador y sonda oligonucleotídicos mediante titulación de una serie de concentración conocida de ADN y se calculó usando el análisis de curva patrón. Se demostró que la sensibilidad analítica del ensayo alcanzaba 5 copias o menos por tubo de reacción. Ajustada al procedimiento de preparación de muestra y protocolo de ajuste de volumen, esta sensibilidad analítica es equivalente a aproximadamente 200 copias por ml de especímenes clínicos líquidos.
Se ensayó el conjunto de cebador/sonda en un panel de 333 muestras clínicas anteriormente probadas. El panel incluía 47 muestras conocidas positivas de BKV (detectado) y 286 conocidas negativas de BKV (no detectado). El conjunto de cebador/sonda oligonucleotídicos detectaba las 47 muestras positivas. Además, de las 284 muestras negativas, detectaba 34 como positivas de BKV. Para validar este resultado positivo “errado”, se secuenciaron 28. Los 28 productos de amplificación secuenciados se identificaron como BKV. Las 6 muestras restantes no pudieron secuenciarse debido a un volumen de muestra insuficiente. Globalmente, se detectaron al menos un 10 % de muestras clínicamente negativas como positivas de BKV mediante la nueva estrategia de cebador/sonda y se validaron por secuenciación como verdaderos positivos. La incapacidad de detectar dicho porcentaje de verdaderos positivos podría estar causada por el desapareamiento de cebador/sonda en los sitios de variación o la baja eficacia de la PCR o ambos.
EJEMPLO 6
IDENTIFICACIÓN DE LA REGIÓN DIANA V ("BK5")
La comparación de las secuencias de ácido nucleico entre todas las secuencias de ácido nucleico de BKV recién completadas y las secuencias de ácido nucleico de BKV publicadas permitía la selección de la región diana BK4. La región diana BK4 comprende los nucleótidos 2810 a 2895 de nº de acceso a GenBank AY628224. La secuencia de ácido nucleico de la secuencia diana BK5 es:
La estrategia usada para diseñar los cebadores y sondas de amplificación basada en ácido nucleico estaba basada en el análisis de múltiples alineamientos de secuencia de todas las secuencias de BKV y secuencias de virus estrechamente relacionados. Este análisis se diseñó para incluir todas las variantes de BKV. Este análisis se diseñó también para excluir cualquier secuencia estrechamente relacionada, pero no de BK, tal como una secuencia de JCV. Un análisis cuidadoso de estos alineamientos permitía la selección de secuencias oligonucleotídicas con secuencias que cubren todas las variantes de BKV pero que discriminan las secuencias de cualquier otro género estrechamente relacionado, permitiendo así la amplificación específica de género y la detección e identificación ubicua de BKV. Las secuencias de los cebadores y sonda para la región diana BK5 son como siguen:
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