ES2552243T3 - Miméticos del lípido A para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria - Google Patents

Abstract

Una composición de mimético del lípido A que comprende CRX547 y CRX527 para su uso en la producción de una respuesta inmunitaria en un ser humano, en la que las citocinas dependientes de TRIF se incrementan y las citocinas dependientes de MyD88 disminuyen en comparación con una composición de mimético del lípido A que comprenda CRX527 en ausencia de CRX547, en la que CRX527 tiene la fórmula:**Fórmula** y CRX547 tiene la fórmula:**Fórmula**

Description

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Ejemplos

Ejemplo 1: Niveles similares de citocinas dependientes de TRIF, pero niveles mucho más bajos de citocinas dependientes de MyD88 mediante la administración del isómero D de un mimético sintético de lípido A (CRX547) con respecto al isómero L (CRX527).

Cuando se comparan los efectos de Re595 LPS DE S. minnesota, CRX-547 y CRX-527 sobre la inducción de citocinas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas frescas, CRX-527 y LPS inducen niveles similares de la citocina TNFα y quimiocinas MIP-1α (Figura 22A). Como alternativa, CRX-547 induce niveles significativamente más bajos de TNFα y MIP-1α, pero niveles comparables de las quimiocinas IP-10 y RANTES (Figura 22B).

La expresión de TNFα y MIP-1α es dependiente de la señalización a través del adaptador de TLR4, MyD88, mientras que la expresión de IP-10 y RANTES son dependientes de la señalización a través del adaptador de TLR4, TRIF/TICAM–1 (Hoebe et al, Kawai et al). Cuando los agonistas se comparan según la inducción del mismo conjunto de citocinas dependientes de MyD88 y dependientes de TRIF en sangre entera humana fresca, monocitos humanos cultivados, macrófagos derivados de monocitos humanos y células dendríticas derivadas de monocitos humanos, se observa un patrón similar de resultados (datos no mostrados).

Ejemplos 2: CRX-547 induce niveles más bajos de IL-12p70 e IL-23 en las células dendríticas derivadas de monocitos

La inducción de citocinas inflamatorias y la maduración de las células dendríticas (DC) contribuyen a la estimulación de una respuesta inmunitaria sólida durante la administración de una vacuna con adyuvante. Por lo tanto, se compara la capacidad de CRX527 y CRX-547 para inducir IL-12p70 humana en las DC. La inducción de IL-12p70 estimula el desarrollo del linaje de células T colaboradoras Th1 y favorece el desarrollo de una respuesta inmunitaria mediada por células (Goriely, Neurath, y Goldman 81-86; Gutcher y Becher 1119-27). Como se ha demostrado que la expresión de IL-12p70 depende de la señalización tanto de MyD88 como de TRIF señalización (Goriely, Neurath, y Goldman 81-86), se puede verificar si la respuesta de las CD al tratamiento con CRX547 podría anularse. Aunque reducida significativamente en comparación con CRX-527 y LPS, CRX-547 puede inducir una respuesta IL-12p70 de las DC derivadas de monocitos humanos (3A).

Como alternativa, la expresión del mediador inflamatorio, IL-23, en las DC es totalmente dependiente de MyD88 (Re y Strominger 37692-99; Goriely, Neurath, y Goldman 81 – 86). Cuando se compara la inducción de IL-23 mediante el tratamiento de las células dendríticas con CRX-527 y CRX-547, se encuentra que la expresión de IL-23 se reduce prácticamente a los niveles basales en las células tratadas con CRX–547 (3B).

Ejemplo 3: Dependencia de MyD88 y TRIF de la inducción de citocinas

Cuando se utiliza la expresión de una construcción mutante negativa dominante para inhibir la señalización a través de MyD88, la inducción de la citocina dependiente de MyD88, TNFα, por CRX-527 se reduce significativamente, y la inducción de la citocina dependiente de TRIF, RANTES, solo se reduce ligeramente, mientras que la inducción por CRX -547 de citocinas dependientes de MyD88 se ve afectada por la destrucción por MyD88 ([066] 4A).

Como alterativa, cuando la expresión de TRIF se destruye utilizando procedimientos similares, la inducción de citocinas dependiente de TRIF tanto por CRX547 como CRX527 se reduce en un grado similar ([066] B

Las especificidades de señalización por MyD88 / RIF de los AGP, CRX-527 y CRX-547 también se pueden diferenciar por la dependencia de la endocitosis. Recientemente, dos grupos separados (Kagan y col., 361 – 68; Tanimura y col., 94 – 99) han informado de que la señalización dependiente de MyD88 aguas abajo de TLR4 se inicia a partir de la membrana celular, mientras que señalización dependiente de TRIF –aguas abajo de TLR4 se inicia a partir del endosoma/lisosoma lisosoma después de la internalización del complejo receptor TLR4. Kagan y col., usaron el inhibidor de la endocitosis, Dynasore, para de mostrar que se había inhibido la inducción de citocinas dependiente de TRIF, pero no la dependiente de MyD88. Por lo tanto, Dynasore se utiliza como se muestra a continuación para comparar la dependencia de MyD88 y TRIF de la inducción de citocinas / quimiocinas por CRX527 y CRX-547.

La inhibición de la endocitosis con Dynasore inhibe la inducción de RANTES dependiente de TRIF tanto por CRX527 como por CRX-547 en macrófagos humanos derivados de PBMC (05), mientras que la inducción de MIP–1α dependiente de MyD88 aumenta ligeramente en relación con las células no tratadas. Estos resultados sugieren que la inducción de citocinas dependiente de TRIF por CRX-527 y CRX-547, aguas abajo de TLR4, se produce mediante mecanismos de señalización similares tras la endocitosis.

Ejemplo 4: CRX-547 induce niveles significativamente más bajos de translocación nuclear de NFkB y la actividad transcripcional, pero niveles iguales o superiores de translocación nuclear de IRF-3 en comparación con CRX527.

Expresión de muchas citocinas inflamatorias, incluyendo TNFα e IL-1β, es dependiente de la activación y la translocación nuclear de NFkB. La señalización tanto dependiente de MyD88 como dependiente de TRIF aguas

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inhibir la inducción de TNFα está en el mismo intervalo (CIC50CRX–527: 48 ± 30 nM/CI50LPS: 18 ± 12) como las concentraciones fijas de CRX527 Y LPS (100 nM), lo que sugiere que CRX547 compite con CRX527 y LPS por la unión al complejo de TLR4.

Para determinar si CRX-547 es capaz de antagonizar la translocación nuclear de NFkB en las células tratadas con CRX-527 constante, las células MM6 se estimulan durante 20 minutos, 35 minutos y 2 horas con dosis crecientes de CRX-547 (Figura 12). Cuando se añaden AGP al mismo tiempo, CRX-547 antagoniza la translocación nuclear de NFkB inducida por CRX-527 a las dosis más altas. Cuando CRX-547 es constante y enriquecido con CRX-527 en el ensayo, la estimulación de CRX-527 es capaz de superar el efecto máximo de la translocación nuclear de NFkB con solo CRX-547. Estos datos sugieren que CRX-547 y CRX-527 compiten por la unión en el complejo receptor TLR4, lo que conduce a la inhibición de la señalización dependiente de MyD88.

Ejemplo 6: Análogos de CRX–547 con agonismo aparente sesgado con TRIF de TLR4 humano.

Con el fin de evaluar los análogos de la familia de AGP, los compuestos se analizan para determinar patrones similares de inducción de citocinas / quimiocinas. Los pares de isómeros L y D de los AGP serilo, CRX-527 y CRX547, con cadenas acilo secundarias con enlaces éster se comparan con los análogos de serilo que tienen cadenas de acilo secundarias unidas por éter, compuestos de 1ay 1b, (compuestos mostrados en 1), una potencial modificación potenciadora de la estabilidad potencial de los principales AGP candidatos. Curiosamente, para 1b, la modificación de la molécula para que tenga cadenas de acilo secundarias unidas por enlaces éter en lugar de éster restablece una eficacia considerable en el isómero D con respecto al isómero L para la inducción de la señalización dependiente de MyD88 (3). La base mecanicista para este rescate de la eficacia de MyD88 por los isómeros D unidos por enlaces éter no se conoce.

Ejemplo 7: Análisis de transferencia de tipo fosfo-western de monocitos primarios humanos estimulados con CRX– 527 o CRX–547 y las células MM6 estimuladas con CRX–527 o CRX–547

La degradación de la serina / treonina quinasa, IRAK-1, se produce aguas abajo de la señalización de TLR4 dependiente de MyD88 (Hatao y col., 260 – 64; Neumann y col., 1089 – 94), mientras que la señalización de TLR4 dependiente de TRIF tiene como resultado la activación de IRF-3 (Yamamoto y col., 6668 – 72; Yamamoto y col., 640 – 43). Aquí, los monocitos primarios humanos son estimulados con CRX-547 o CRX-527 durante los tiempos indicados, y los lisados celulares se analizan mediante transferencia de tipo Western para los niveles de la cinasa activada por la vía de MyD88, IRAK-1, y el factor de transcripción activado por la vía TRIF, IRF-3 (fosfo-IRF-3 e IRF3 total). Los niveles de acción β se utilizan como control de carga. Los monocitos estimulados por CRX–527 muestran una rápida disminución de IRAK-1, mientras que las células estimuladas por CRX-547 muestran una degradación retardada y reducida de esta proteína (4).

El papel de las moléculas de señalización MAPK en la señalización de MyD88 frente TRIF después de la ligación de TLR4 es complicado porque p38 está implicada en ambas vías, sin embargo un papel para la fosforilación de p38 como un indicador de la vía de TRIF se indica en la literatura. La fosforilación de p38 se reduce en los macrófagos de ratones TRIF -/ -después de la estimulación con LPS mientras que los macrófagos TRIF + / + macrófagos muestran una fosforilación sostenida de p38, lo que sugiere que TRIF puede desempeñar un papel en el mantenimiento del estado de fosforilación de p38 después de la unión a TLR4 (Thomas y col., 31119 – 30). Para determinar si el estado de fosforilación de p38 es diferente después de la estimulación con CRX-527 frente CRX547, el análisis de transferencia de tipo Western se realiza en lisados de células MM6. La estimulación con CRX-527 tiene resultado un ligero aumento en el estado de fosforilación de p38 en comparación con CRX-547, aunque muestran una cinética similar de la activación (Figura 15).

Las vías de MAPK y los factores de transcripción aguas abajo están regulados de forma diferencial por agonistas de TLR. La degradación de IRAK4 e IκBα es indicativa de MyD88 después la señalización de TLR4 (Hatao y col., 260 – 64; Neumann y col., 1089 – 94), mientras que la señalización de TLR4 mediada por TRIF tiene como resultado la activación de IRF-3 (Yamamoto y col., 6668 – 72; Yamamoto y col., 640 – 43). Las células MM6 se estimulan con CRX-547 o CRX-527 (10 ng / ml) durante el tiempo indicado. Los lisados celulares se recogen y se realiza análisis de transferencia de tipo Western de las proteínas de la vía de señalización de MyD88, fosfo–IκBα, IRAK4, y las proteínas de la vía TRIF, fosfo-p38, IRF3 total y fosfo-IRF3 se realiza utilizando βactina como el control de carga. Las células MM6 estimuladas con CRX–527 tienen una rápida disminución del IκBα e IRAK–4 totales, mientras que las células estimuladas CRX–547 tienen una degradación retardada y menor de ambas proteínas de señalización inducidas por MyD88. En términos de las proteínas de señalización mediadas por TRIF, fósforo-p38, IRF3 p38 total y fósforo IRF3 se observa poca o ninguna diferencia entre estos dos AGP.

Ejemplo 8 Evaluación de la señalización dependiente de MyD88 y TRIF en ratones.

Contrariamente a los resultados para las células primarias humanas, CRX-547 induce niveles similares de citocinas dependientes de MyD88 en suero de ratón después de la administración i.v. en ratones BALB / c. Para asegurarse de que esta respuesta no es específica de los ratones BALB / c, se realiza una prueba similar de inducción de citocinas en suero en ratones C57BL / 6. La cinética (inducción a 2 o 6 horas después de la inyección) y la magnitud de la inducción de citocinas son similares para CRX-527 y CRX-547 para las citocinas / quimiocinas dependientes

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de MyD88 (TNFα, IL-10) y dependientes de TRIF (RANTES, IP-10, MIG), aunque la inducción relativa por CRX-547 es ligeramente menor para ciertas citocinas que la observada en ratones BALB / c (no mostrado). También de interés, la inducción de las citocinas dependientes de MyD88 analizada es consistentemente superior a las 2 horas que a las 6 horas de la inyección, mientras que la inducción de citocinas dependientes de TRIF es superior a lAs 6 horas para cada uno de los agonistas, lo que sugiere diferentes cinéticas para la inducción de citocinas a través de las dos vías. Este fenómeno podría explicarse por un requisito para la inducción temprana DE IFNβ y la actividad autocrina / paracrina observada anteriormente para la inducción de muchas citocinas dependientes de TRIF (Perry y col., 407 – 22), O por un retraso en la señalización dependiente de TRIF debido al requisito de la endocitosis (Kagan y col., 361 – 68).

Varios ejemplos de pruebas para la inducción de citocinas/quimiocinas dependientes de MyD88-y TRIF por los AGP de isómeros L y D in vitro (véanse los Ejemplos 12 a 14 a continuación). En cada caso, incluyendo la inducción de citocinas en PBMC murinos, la inducción de citocinas en la línea de células de macrófagos murinos, RAW264. 7 y la inducción de la actividad de NFkB en células HEK293 transfectadas con muTLR4/muMD2, los isómeros D de los AGP serilo no muestran el mismo sesgo de señalización de TRIF como se demuestra en los sistemas humanos divulgados en el presente documento.

Ejemplo 9 Base de receptor para especificad de especies (murinos frente a seres humanos) de la señalización de CRX–547

Se observan diferentes patrones de señalización para dos isómeros de AGP, con CRX-547, el isómero D de CRX527, señalizando de un modo sesgado por TRID mientras que las señales de CRX-527 a través de las vías dependientes tanto de MyD88 como de TRIF. En los estudios iniciales, la señalización sesgada con TRIF de CRX547 parecía ser dependiente de la especie, ya que se observó en las células humanas, pero no murinas. Para abordar esta diferencia aparente, los inventores utilizaron células HEK293 transfectadas con TLR4, MD-2-, y CD-14 y combinaciones de los mismos para probar los requisitos receptor / correceptor y la especificidad de especie del receptor para la señalización de AGP.

Se muestra que las células HEK293 transfectadas con huTLR4, huMD-2, y huCD14 y estimuladas con CRX-547 inducen menos actividad indicadora de NFkB que CRX-527 y LPS, mientras que los niveles de actividad inducida por CRX-547 en células HEK293 transfectadas con muTLR4, muMD-2, y muCD14 eran más similares a CRX-527 y LPS. Este análisis sugiere una preferencia por un complejo receptor TLR4 murino para la inducción de la señalización por CR-X547. Con el fin de determinar si el propio TLR4 u otro componente del receptor accesorio son responsable de esta especificidad de especie, el análisis se amplía para incluir a las células HEK293 que expresan combinaciones de los componentes del receptor TLR4 humanos y murinos.

Como se muestra en 8, cuando las células HEK293 se transfectan con una combinación de TLR4 humano y MD-2 murino, sigue habiendo una gran diferencia relativa en la inducción de la actividad del promotor entre CRX-527 y CRX-547, lo que sugiere que esta disparidad se debe a una divergencia en la interacción de CRX-527 y CRX-547 con TLR4 humano. Cuando las células HEK293 se transfectan con una combinación de TLR4 murino y MD-2 humano, CRX-527 y CRX-547 indujeron niveles similares de actividad del promotor, lo que sugiere de nuevo que la diferencia en la actividad puede provenir de una divergencia en la interacción en la interfaz AGP / TLR4 . Estos resultados son diferentes del efecto de las modificaciones en la longitud de la cadena de acilo y la composición que causó diferencias en la interacción de la molécula con MD-2 vista por Muroi y col. (Muroi, M y Tanamoto, K. (2006).

J. Biol. Chem. 281. p5484 – 5491).

Cabe señalar que los niveles de actividad son mucho más bajos en general para los complejos quiméricos (huTLR4 / muMD2, muTLR4 / huTLR4) que cuando complejos con componentes de receptor afín están presentes (huTLR4 / huMD2, muTLR4 / muMD2), lo que sugiere que estas quimeras entre especies no funcionan de manera óptima en este sistema. Se requieren más análisis bioquímicos para dilucidar residuos específicos que contribuyen a la especificidad de especie supuesta de CRX-547.

Ejemplo 10 Estudio de toxicología en conejos con los AGP candidatos principales por vía i.m.

La toxicidad de CRX-527, 524, 547 y el compuesto 1 se evalúa en conejos que reciben AGP solo por la vía intramuscular (i.m.). Grupos de tres conejos son vacunados con 1 ml de AGP, diluido o MPL control, por vía i.m. los días 0, 7 y 14. Se evalúan dos dosis de AGP: altas (25 µg) y bajas (5 µg). Se vigila en todos los animales el peso corporal, la temperatura, el estado clínico y la puntuación de Draize. Se sacrifica a los animales una semana después de la administración final. La sangre se recoge antes del tratamiento, dos días después de la 2ª vacunación y tras el sacrificio para analizar la hematología y la bioquímica clínica. Se realiza histopatología de los puntos de inyección y los órganos principales.

Todos los animales demuestran aumento de peso a lo largo del curso del estudio con la excepción del grupo de MPL entre las vacunas 2ª y 3ª (Figura 19). Se observan variaciones de temperatura después de la vacunación de ~ ± 1 ° C, incluido el grupo control de vehículo (Figura 20). Todas las temperaturas están dentro del intervalo normal para los conejos. Se observa una reacción mínima en el lugar de la inyección mediante puntuación de Draize para todos los grupos, incluidos los controles del vehículo; y la reacción disminuye con el aumento de número de vacunaciones

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(Figura 21). La anatomía patológica macroscópica de decoloración blanca de los músculos a lo largo de trayecto de la aguja y en el sitio de la inyección se observa en todos los grupos de dosis de adyuvante altos con la posible excepción de CRX-524; también se ve patología en los grupos tratados con CRX-527 y el compuesto 1, pero no con -524 -547 a dosis bajas.

El análisis de hematología revela una tendencia de granulocitosis en conejos a los que se han administrados dosis bajas y altas CRX-527 y dosis bajas de CRX-524 y el compuesto 1 el día 9 (2 días después de la 2ª) que se resuelve para el día 21 (7 días después de la 3 ª). Se sabe que los AGP atraen neutrófilos. No se observan tendencias en los valores de química clínica después de la vacunación.

La inflamación en el sitio de inyección, que consiste principalmente en miositis de basófilos y macrófagos, es el único hallazgo no incidental en todos los grupos de tratamiento con la excepción de CRX-547 a dosis bajas, en el que no se observa ninguna patología muscular(Figura 2225). Miositis muestra más consistente y más grande para la dosis alta de CRX-527. La miositis también es más consistente con los sitios de inyección de las dos inyecciones más recientes que indican la naturaleza transitoria de la respuesta inflamatoria (datos no mostrados).

La impresión general es que CRX-547 es mínimamente tóxico solo a dosis altas única y CRX-524, -527 y el compuesto 1 son ligeramente tóxicos con una potencia baja (n = 3 conejos / grupo). Los hallazgos patológicos son transitorios.

Ejemplo 11 Expresión de los genes de citocinas en respuesta al tratamiento con CRX–527 y CRX–547

Para comparar CRX-527 y CRX-547 en la inducción de la secreción de citocinas / quimiocinas en las células humanas y para aclarar aún más los mecanismos de señalización responsables de las diferencias observadas, se evalúa la expresión génica inducida por CRX-527 y CRX-547 utilizando la tecnología de micromatrices. Los experimentos iniciales incluyen el análisis de evolución temporal de la inducción de genes de citocinas dependiente de MyD88-y TRIF mediante qPCR. Este análisis sugiere que la inducción de los genes de citocinas/quimiocinas dependientes de MyD88-y TRIF son detectables mediante 1-2 horas después 2/del tratamiento para ambos agonistas, se elevan a niveles sólidos a las 3 horas del tratamiento, y disminuyen a niveles casi basales a las 6 horas del tratamiento (datos no mostrados). La inducción de los genes de citocinas / quimiocinas dependientes de MyD88-y TRIF tiende a ser más alta a las 3 horas del tratamiento, lo que sugiere que una diferencia cinética sustancial entre la inducción dependiente de MyD88– y de TRIF no funciona a nivel de la expresión génica. Una excepción del patrón cinético es la inducción de IFNβ, que ya está al nivel más alto después de 1 hora de tratamiento con CRX-547 o CRX-527 y disminuye posteriormente.

CRX-527 no sólo induce una mayor expresión de genes de citocinas / quimiocinas dependiente de MyD88, pero mayor expresión de los genes de citocinas / quimiocinas dependiente de TRIF que CRX-547 en este análisis. Este fenómeno no se correlaciona con el patrón observado para la secreción proteica de citocinas / quimiocinas, en el que la secreción de citocinas / quimiocinas dependiente de TRIF es similar para los dos agonistas. Estos datos pueden sugerir que otros factores afectan a los niveles de secreción de citocinas / quimiocinas dependiente de TRIF inducida por CRX-527 y CRX-547. Una posibilidad es que el tratamiento con CRX-547 induce una mayor estabilidad del ARNm del gen dependiente de TRIF que CRX-527. Aunque los niveles de estos genes se han reducido casi al nivel basal a las 6 horas del tratamiento (datos no mostrados), los inventores todavía no han analizado los niveles de ARNm entre 3 y 6 horas.

Sistemas murinos in vitro

Ejemplo 12 Inducción de citocinas in vitro

Como se ha mencionado anteriormente, se sugiere menos sesgo por TRIF por CRX-547 en los experimentos de inducción de citocinas con PBMC murinos, estudios con una línea celular murina (RAW264. 7) y de transfección en HEK293 (datos no mostrados). Otras comparaciones de citocinas inducidas por CRX–547 y CRX–527 en células RAW264.7 usando un intervalo de análisis y análisis de un par de isómeros L y D adicionales, se proporcionan los compuestos 1a y 1b, con cadenas de acilos grasos unidas por enlaces éter en lugar de enlaces éster (Figura 1). Además, para obtener una mayor comprensión del mecanismo del fenómeno de la especificidad de especie, se comparan la inducción de señalización por CRX-547 en células transfectadas con los complejos receptores TLR4 humano / murino quiméricos. Dicha actividad antagonista / agonista de TLR4 específica de especia también se ha notificado para el lípido IVa, un precursor del lípido A de E. coli con solo 4 cadenas de acilo primarias (Muroi, Ohnishi, y Tanamoto 3546 – 50; Muroi y Tanamoto 5484 – 91), y esta actividad se atribuyó a las diferencias en la estructura del receptor accesorio TLR4 MD-2 en ratones.

Para determinar si las PBMC de sangre de ratón tienen perfiles similares de las citocinas de MyD88 después del tratamiento con CRX-527 o CRX-547, la sangre disponible comercialmente de ratones BALB / c se analiza con CRX527 o CRX-547. (Figura 24), los niveles parecen ser similares entre los dos grupos analizados.

Para comparar mejor y confirmar la similitud de potencia entre los isómeros L y D en las células murinas, las células RAW264. 7 (macrófagos) se estimulan durante un intervalo de dosis más amplio con CRX-527, CRX-547, los compuestos 1a y 1b, y los sobrenadantes se analizan para determinar la producción dependiente de MyD88 (TNFα)

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