ES2549702A1 - Proteína recombinante del receptor de la ferri-piscibactina y su aplicación para la producción de una composición inmunogénica frente a la pasteurelosis - Google Patents

Abstract

Proteína recombinante del receptor de la ferri-piscibactina y su aplicación para la producción de una composición inmunogénica frente a la pasteurelosis. La invención describe el uso de la proteína recombinante rFrpA como antígeno capaz de servir como vacuna eficaz frente a Ptiotobacterium damselae subespecie piscicida, agente causal de la pasteurelosis en peces. La vacuna es capaz de inducir una potente respuesta inmunitaria y confiere una elevada protección frente a la patología, cuando es suministrada vía parenteral.

Description

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DESCRIPCIÓN

Proteína recombinante del receptor de la ferri-piscibactina y su aplicación para la producción de una composición inmunogénica frente a la pasteurelosis

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra dentro de la biología y de la biología molecular, y se refiere a la elaboración de composiciones inmunogénicas que comprenden la proteína del receptor de la ferripiscibactina (FrpA) de Photobacterium damselae subsp. piscicida para el desarrollo de una vacuna frente a la pasteurelosis que afecta a especies de peces de interés comercial de la industria acuícola.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Photobacterium damselae subsp. piscicida (PhDP) es una bacteria gram-negativa conocida previamente como Pasteurella piscicida. PhDP es el agente causal de la pasteurelosis, fotobacteriosis o pseudotuberculosis, una enfermedad devastadora en la acuicultura marina que provoca elevadas mortalidades, posee un amplio rango de hospedadores, afectando a más de 20 especies de peces de interés acuícola, y tiene una amplia distribución global (Romalde, 2002., Int. Microbiol. 5 (1): 3-9; Thyssen et al.,1998. Int. J. Syst. Bacteriol. 48: 1145-1151; Toranzo et al., 2005. Aquaculture. 246 (1-4): 37-61; Barnes et al. 2005., Dev. Biol. (Basel).121: 75-84).

PhDP es un patógeno facultativo intracelular capaz de promover su internalización en las células del hospedador (Acosta et al. 2009., J. Fish Dis. 32(6): 535-541). El hecho de que PhDP sea un parásito intracelular capaz de resistir a la fagocitosis hace que sea un patógeno difícil de detectar por el sistema inmune del hospedador a la vez que dificulta los tratamientos quimioterápicos (Do Vale et al., 2005. Mol. Microbiol. 58(4): 1025-1038).

La pasteurelosis puede cursar de forma aguda, provocando grandes mortalidades, o de modo crónico asintomático. Las infecciones asintomáticas afectan tanto a peces cultivados como a animales salvajes, siendo las poblaciones naturales de peces y moluscos el reservorio natural del patógeno (Serraca et al., 2011. Can. J. Microbiol. 57(5): 437-40). Los peces enfermos suelen perder peso, presentar un oscurecimiento de la piel, necrosis en las branquias y en las vísceras suelen apreciarse granulomas blancos. Los brotes de pasteurelosis se producen en los meses de primavera y verano y se asocian a condiciones de estrés de los peces y a la baja calidad del agua: temperatura alta (> 18°C) y baja salinidad (Magariños et al., 1996. Annu. Rev. Fish Dis. 6(0): 41-64). La enfermedad aparece mayoritariamente durante el estado larvario, provocando mortalidades de hasta el 90%, pero también afecta a peces juveniles en los que ocasiona pérdidas del 50%. Tras los brotes agudos, los animales asintomáticos se convierten en portadores y pueden desarrollar la enfermedad cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables para el patógeno. Además, se ha detectado la presencia de PhDP en fluidos ováricos y huevos provenientes de reproductores sanos, lo que indica una probable transmisión vertical (Romalde et al., 1999. J. Microbiol. Methods. 38 (1-2): 147-154) Todo ello hace que los brotes de pasteurelosis sean un problema recurrente en las plantas de acuicultura debido a su difícil erradicación y control.

Inicialmente, los brotes de pasteurelosis aparecieron mayoritariamente en Japón; sin embargo, en la década de 1990 empezaron a detectarse los primeros brotes en Europa. Aunque las cepas de PhDP muestran características bioquímicas y serológicas muy homogéneas, se sabe que pueden agruparse en dos líneas clonales: una formada por los aislados de origen japonés y la otra formada por los aislados de origen europeo y americano (Magariños et al., 2000. Epidemiol. Infect. 125 (1): 213-219). Las bacterias patógenas tienen una serie de herramientas, denominadas factores de virulencia, que les permiten colonizar y persistir dentro de un hospedador. Los principales factores de virulencia descritos en PhDP son la presencia de una cápsula de polisacáridos y actividades enzimáticas como proteasas, fosfolipasas, lipasas y hemolisinas (Thyssen et al., 2000. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50 (3): 1013-1019; Magariños et al., 1996. Microb. Pathog. 21 (4): 289-297). De todos los factores de virulencia descritos en esta bacteria los más importantes son la producción de la toxina apoptótica AIP56, que le permite resistir la fagocitosis, y la producción y utilización de piscibactina, un potente sideróforo que le permite captar hierro del hospedador (Souto et al., 2012. Eur. J. Org. Chem. 29: 5693-5700; Osorio et al., 2006. Microbiology. 152 (11): 3327-3341). El sistema de la piscibactina está codificado en el plásmido pPHDP70 cuya presencia es una característica común a todos los aislados europeos y además se sabe que constituye un factor de virulencia clave (Osorio et al., 2015. Appl. Environ. Microbiol. Jun19, 19. pii: AEM.01580-15). Dentro de este plásmido el gen más importante a la hora de captar la piscibactina es frpA, ya que codifica el receptor de membrana externa FrpA que permite la internalización del complejo hierro-piscibactina.

La primera estrategia utilizada para combatir la enfermedad se basó en el uso de antibióticos, pero la aparición de cepas resistentes y multiresistentes provocó que esta estrategia fuese rápidamente

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ineficiente. Además, la persistencia de estas sustancias en el pez y el impacto que provocan al medioambiente hace que su utilización sea cada vez más restrictiva. En las últimas décadas los esfuerzos para controlar la enfermedad se han centrado en el desarrollo de vacunas efectivas. Son numerosas las vacunas desarrolladas frente a PhDP y entre ellas podemos encontrar de diversos tipos y formulaciones. Sin embargo, los niveles de protección en el pez no suelen ser satisfactorios. Las vacunas convencionales, llamadas bacterinas, están compuestas por cultivos de la bacteria inactivados por calor, formol u otros métodos. Además este tipo de vacunas pueden ser enriquecidas con antígenos solubles como lipopolisacáridos (LPS), proteínas de membrana externa (OMP), componentes de la cápsula (CPS)

o productos extracelulares (ECPs). De las numerosas vacunas disponibles la ICTHIOVAC-PD (vacuna DI21) comercializada por Hipra (España), es la que ha mostrado mayores grados de protección (protección en lubina ≥ 60%) (Magariños et al., 1994. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 14 (4): 120-122). Se trata de una bacterina enriquecida con ECPs que se viene utilizando desde mediados de los años noventa.

El desarrollo de las técnicas de biología molecular ha permitido utilizar nuevas estrategias para la formulación de vacunas. En los últimos años se han publicado trabajos en los que se opta por la utilización como antígeno de proteínas recombinantes purificadas a partir de cultivos de E. coli que, formuladas junto a otros componentes como sustancias adyuvantes o nano y microsistemas de vectorización, están obteniendo resultados prometedores, postulándose como candidatos potenciales para desarrollar nuevas vacunas para distintas especies de peces (Andreoni et al., 2013. Vaccine. 31 (5): 820-826; Ho L-P et al., 2011. Fish Shellfish Immunol. 30 (1): 412-419; Ho L-P et al., 2014. J. Fish Dis. 37 (1): 51-56; Zhao et al. 2014. Vaccine 32: 327-337).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La estrategia basada en el uso de antibióticos a gran escala para el tratamiento de la pasteurelosis ha dado lugar a la aparición de cepas resistentes y multiresistentes que han hecho que su uso sea ineficiente. Además, la persistencia de los quimioterápicos en el pez y el impacto que provocan al medioambiente hace que su utilización sea cada vez más restrictiva. El desarrollo de la biología molecular ha permitido, en los últimos años, la formulación de vacunas basadas en el uso de proteínas recombinantes en el papel de antígeno. En la presente invención se describe por primera vez el uso de la proteína recombinante rFrpA de PhDP para el control de la pasteurelosis en peces.

Dado que las proteínas más inmunogénicas son las que forman parte de su superficie celular (Scarselli et al., 2005. Trends Biotechnol. 23(2): 84-91), creemos que la utilización del receptor de membrana externa FrpA, necesario para la internalización de piscibactina, actuará como un antígeno eficaz capaz de activar el sistema inmune específico del pez. Para ello, en la presente invención se ha clonado el gen frpA de PhDP en E. coli permitiendo la producción y purificación de la proteína recombinante FrpA (rFrpA). La presente invención muestra la formulación de un preparado inmunogénico a base de rFrpA y un adyuvante oleoso como el de Freund para obtener una vacuna frente a la pasteurelosis. La optimización de un protocolo de vacunación y los experimentos de infección experimental en lenguado (Solea senegalensis y Solea solea) indican que la inmunización con la proteína recombinante rFrpA induce la producción de anticuerpos específicos frente al receptor de la piscibactina, FrpA, confiriendo además una protección satisfactoria frente a PhDP.

Así, un primer aspecto de la invención se refiere a una proteína de PhDP, la FrpA, caracterizada por la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, a la proteína recombinante rFrpA, a polipéptidos con, al menos, un 80% de porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 2 y a fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas de FrpA. Cualquiera de estas proteínas o polipéptidos puede incluirse en una composición inmunogénica que permite la producción de una vacuna frente a PhDP. El uso de la vacuna así elaborada logra tasas de protección en peces iguales o superiores al 80% frente a peces no vacunados.

En esta memoria descriptiva se entiende como propiedades antigénicas la capacidad de una sustancia de ser reconocida por el sistema inmune de un organismo como un elemento extraño y generar una respuesta inmune específica que desemboca en la producción de anticuerpos contra dicha sustancia.

En esta memoria descriptiva se entiende por porcentaje de identidad de la secuencia aminoacídica el porcentaje de coincidencias de los mismos aminoácidos entre las dos secuencias alineadas, a lo largo de la longitud completa de ambas secuencias. Además, los polipéptidos con, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO:2 así como, los fragmentos inmunogénicos a los que se refiere la presente memoria son aquellos que mantienen las características antigénicas de la proteína FrpA.

En esta memoria descriptiva se entiende como fragmento inmunogénico un péptido capaz de activar el sistema inmune específico del pez generando anticuerpos frente a pasteurelosis.

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La invención también se refiere al gen que codifica la proteína FrpA de PhDP, caracterizado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1 y a secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 70% o aquellas que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas.

En esta memoria descriptiva se entiende por porcentaje de identidad de la secuencia nucleotídica el porcentaje de coincidencias de los mismos nucleótidos entre dos secuencias alineadas, a lo largo de toda la longitud de ambas secuencias.

Otro aspecto de la invención se refiere a la secuencia nucleotídica del gen frpA, o secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia, o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas, clonadas en un vector recombinante que, asimismo, es susceptible de incluirse en células o microorganismos hospedadores en los que se expresan las secuencias nucleotídicas descritas.

Otro aspecto de la invención se refiere a un organismo transgénico no humano que contiene, insertado en su genoma, una secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1, secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 70%, secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas o vectores que comprenden cualquiera de las anteriores secuencias.

La invención también se refiere a una composición inmunogénica que incluye: la proteína FrpA, la proteína recombinante rFrpA, polipéptidos con, al menos, un 80% de identidad con la proteína FrpA o fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas; la molécula nucleotídica del gen de FrpA, secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas; vectores recombinantes que comprenden cualquiera de estas secuencias nucleotídicas o células, microorganismos u organismos transgénicos no humanos portadores de vectores que incluyen la molécula nucleotídica del gen de FrpA, secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia nucleotídica o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas.

Esta composición inmunogénica se puede utilizar en la elaboración de una vacuna o preparación farmacéutica con actividad inmunizadora para su administración a peces con el fin de conferirles protección frente a la pasteurelosis, enfermedad causada por la infección por PhDP. Además, la composición inmunogénica comprende un adyuvante, el adyuvante de Freund, para mejorar la respuesta inmune y puede comprender también un micro o nanosistema como sistema de vectorización.

En esta memoria descriptiva se entiende como microsistema de vectorización a un sistema constituido por partículas que presentan unas dimensiones microescalares y que puede ser utilizado para modificar y/o controlar la distribución de la composición inmunogénica a nivel tisular, celular o subcelular.

En esta memoria descriptiva se entiende como nanosistema de vectorización a un sistema constituido por partículas que presentan unas dimensiones nanoescalares y que puede ser utilizado para modificar y/o controlar la distribución de la composición inmunogénica a nivel tisular, celular o subcelular.

La vacuna elaborada con la composición inmunogénica que incluye la proteína recombinante rFrpA y adyuvante de Freund alcanza valores de protección satisfactorios, igualando la protección alcanzada por la vacuna comercializada por la casa comercial Hipra, a lo que suma además otros beneficios como el hecho de evitar problemas asociados a la bioseguridad ya que, no es necesario el cultivo a gran escala del patógeno del que proviene la proteína y el uso de una proteína recombinante que no supone ningún riesgo para la salud animal ni para el medio ambiente.

La invención también se refiere a un procedimiento para la producción de proteína recombinante (rFrpA) o polipéptidos con, al menos, un 80% de porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 2 o fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas de la proteína, que comprende el cultivo de una célula o microorganismo hospedador transfectado o transformado con la secuencia nucleotídica del gen frpA, o secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos que mantienen las propiedades antigénicas de la proteína clonadas en un vector, cultivado en condiciones que promueven la expresión para la posterior recuperación del polipéptido.

En esta memoria descriptiva se entiende como condiciones que promueven la expresión de un gen como aquellas condiciones de medio de cultivo, temperatura, pH y tiempo de incubación necesarias para que se

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pueda obtener la correcta expresión de dicho gen obteniéndose la proteína madura correctamente plegada.

La invención también se refiere a un procedimiento para la replicación del gen que codifica la proteína FrpA de PhDP, caracterizado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1, secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 80%, o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas de la proteína FrpA que comprende el cultivo de una célula o microorganismo hospedador transfectado o transformado con un vector recombinante que a su vez comprende el gen que codifica la proteína FrpA de PhDP, caracterizado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1, secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 80% o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas de la proteína FrpA cultivado en condiciones que promueven la replicación para la posterior recuperación del gen.

Se entiende como condiciones que promueven la replicación aquellas condiciones de temperatura, pH, medio de cultivo y tiempo necesarias para que se pueda obtener la replicación del vector utilizado para clonar la proteína recombinante.

Por otro lado, la invención también se refiere al procedimiento para elaborar una composición inmunogénica o preparación farmacéutica con actividad inmunizadora en peces que comprende la formulación de, al menos, uno de los siguientes productos: la proteína FrpA, caracterizada por SEQ ID NO:2, la proteína recombinante rFrpA, polipéptidos con, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO:2

o fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas; el gen que codifica la proteína FrpA de PhDP, caracterizado por SEQ ID NO:1 , secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO:1 de, al menos, el 70% o secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas; un vector recombinante que incluye una de estas secuencias nucleotídicas; una célula o microorganismo transfectado o transformado con un vector recombinante como el descrito aquí; un organismo transgénico no humano que comprende insertado en su genoma una secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1, secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 70%, secuencias que codifican fragmentos inmunogénicos de la proteína FrpA que mantienen las propiedades antigénicas o vectores que comprenden cualquiera de las anteriores secuencias; un adyuvante; un microsistema o nanosistema de vectorización.

La composición inmunogénica de la invención permite la obtención de un grado de protección elevado en peces, evitando el cultivo y manipulación del patógeno y evitando los problemas asociados a la utilización de vacunas poco caracterizadas procedentes de extractos brutos de la bacteria que puedan contener otros componentes no deseados como endotoxinas, exotoxinas, enzimas hidrolíticos, etc.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Gel agarosa 1%. A. Amplificación del gen frpA a partir de DNA genómico de Photobacterium damselae subsp. piscicida DI21. 1) marcador de peso molecular. 2) amplificación sin DNA genómico. 3) amplificación con DNA genómico. B. Amplificación del gen frpA tras ser clonado en pBAD. 1) marcador de peso molecular. 2) amplificación sin DNA plasmídico. 3) amplificación con el vector original derivado de pBAD (Guzman et al., 1995. J. Bacteriol. 177 (14): 4121-4130) (Nótese que este vector contenía la secuencia codificadora de otra proteína en el lugar a ocupar por FrpA; Vila Sanjurjo et al, sin publicar). 4) amplificación de pBAD-10His-FrpA. C. Amplificación del gen frpA que contiene pelB y 10 His tras ser clonado en pBAD 1) Amplificación sin DNA plasmídico. 2) Amplificación de pBAD-10His-FrpA.

Figura 2. Análisis de la expresión de rFrpA. M corresponde al marcador de peso molecular. Las fracciones celulares insolubles (pellet) obtenidas después de la lisis por sonicado y posterior centrifugación fueron separadas en un gel de poliacrilamida 8%-SDS. 1) Proteínas presentes sin inducción. 2) proteínas después de la inducción con arabinosa 0.2%. La flecha indica la proteína recombinante.

Figura 3. Las fracciones obtenidas en el proceso de purificación de rFrpA usando una resina de afinidad de níquel fueron analizadas en un gel de poliacrilamida 10%-SDS. M corresponde al marcador de peso molecular. 1) Fracción membranas totales de las células después de la solubilización con sarkosyl 1.5%. 2) Fracción membranas externas de las células después de la solubilización con elugent 5%. 3) Fracción no retenida en la columna de afinidad de níquel. 4-6) Fracciones de lavado de la columna con tampón Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 0.05 M, elugent 0.25% e imidazol 30 mM. 9-12) Fracciones de elución de la proteína con tampón Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 0.05 M, elugent 0.25% y imidazol 500 mM. 13) FrpA concentrada obtenida después de combinar las fracciones de la columna.

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Figura 4. A Digestión de rFrpA con tripsina. La reacción se llevó a cabo con 4 μg/mL de tripsina durante 15 min a temperatura ambiente. Los fragmentos obtenidos fueron analizados en un gel de poliacrilamida 10%-SDS. M corresponde al marcador de peso molecular. 1) Fragmentos de rFrpA nativa 2) Fragmentos de rFrpA desnaturalizada por calentamiento a 100°C durante 10 min en presencia de SDS. B. Espectro de dicroísmo circular de rFrpA.

Figura 5. Protocolo experimental de vacunación e infección experimental realizado para determinar el nivel de protección. También se muestran los días en los que se obtuvieron muestras de suero para cuantificar la producción de anticuerpos.

Figura 6. Nivel de anticuerpos en sangre frente a PhDP presente en el suero de los grupos de peces inmunizados con 100 µl de: PBS, PBS con adyuvante de Freund (en proporción 1:1), bacterina o vacuna rFrpA.

Figura 7. Supervivencia acumulada en los cuatro grupos de peces inmunizados con vacuna rFrpA, bacterina, PBS y Freund o PBS. Los resultados se muestran como el porcentaje de supervivencia acumulada en cada grupo de peces.

MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se ilustra adecuadamente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.

Ejemplo 1. Expresión de la proteína recombinante de FrpA (rFrpA) en E. coli

En este ejemplo se ilustra la metodología utilizada para la producción de la proteína recombinante rFrpA en E. coli BL1 CodonPlus. Para ello se construyó un plásmido recombinante al clonar el gen frpA, que codifica para la proteína FrpA, en el plásmido pBAD (Guzman et al., 1995. J. Bacteriol. 177 (14): 41214130). La utilización del pBAD como vector de clonación permite que la expresión de frpA se active al añadir arabinosa al medio de cultivo. La construcción se realizó mediante “overlap extension PCR cloning” (Bryksin et al., 2010, 48: 463-465). El gen frpA se amplificó mediante PCR a partir del ADN de PhDP usando polimerasa Phusion (Thermo Scientific) y los cebadores mencionados en la tabla No. 1. Para asegurar la correcta localización de rFrpA en la membrana externa de E. coli, se sustituyó el péptido señal nativo de FrpA, correspondiente a los primeros 26 aminoácidos del extremo N-terminal, por PelB de Erwinia carotovora caracterizado por SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4. Adicionalmente se incluyó una secuencia que codifica la síntesis de 10 histidinas útil durante la purificación de rFrpA mediante resina de afinidad de níquel (de aquí en adelante nos referiremos al constructo como: pelB-10His-FrpA). La construcción fue transformada en E. coli BL21 CodonPlus. Tabla 1. Cebadores usados para la amplificación del gen frpA y para su inserción en el plásmido pBAD.

Cebador (oligonucleótido)

Secuencia 5´→3´

Fwd-frpA-pBAD Caracterizado por SEQ ID NO:5

CCCGTTTTTTTGGGCTAACAGGAGGAATTAACCATGTACAGGAACAGTTTC TCGCTCTCTCC

Rev-frpA-pBAD Caracterizado por SEQ ID NO:6

CGAATTCCAATGACAACTCCGTCTTCCTTACCACTCTAGCTTCATATTCACA CCC

F-pBAD-pelB Caracterizado por SEQ ID NO:7

GGGCTAACAGGAGGAATTAACCAUGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTG CTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCC

pelB-His-FrpA-R Caracterizado por SEQ ID NO:8

CCGTAACTTCTGGATTATGTTCATCATGATGATGATGGTGGTGGTGATGGT GATGGG CCATCGCCGGCTGGGCAGC

Tras clonar la secuencia pelB-10His-FrpA en E. coli, se optimizaron las condiciones de expresión de rFrpA, para ello se probaron diferentes condiciones de cultivo variando la concentración de arabinosa,

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temperatura y el tiempo de incubación. Finalmente, las mayores cantidades de rFrpA se obtuvieron con cultivos de E. coli BL21 CodonPlus incubados a 28°C durante 38 h suplementando el medio de cultivo con un 0.2% de arabinosa.

Para comprobar la correcta expresión de rFrpA se prepararon dos cultivos de E. coli BL21 CodonPlus con el plásmido pelB-10His-frpA, uno de los cultivos se dejó crecer sin inducir y el otro cultivo se indujo con arabinosa 0.2% durante 3 h. A continuación se centrifugaron los cultivos y las células se resuspendieron en tampón Tris-HCl 20 mM, NaCl 0.5 M, KCl 0.1 M y se lisaron por sonicación, obteniéndose dos fracciones, el sobrenadante y el pellet, este último se resuspendió en tampón Tris-HCl 50 mM, Urea 6 M. Estas fracciones se cargaron en geles de poliacrilamida al 8%. En la figura 2 se puede observar como al adicionar el inductor, aparece una banda alrededor de 75 KDa. Dicha banda fue analizada empleando la técnica de huella peptídica y fragmentación (MS y MS/MS) mediante MALDI-TOF/TOF. Los péptidos obtenidos permitieron comprobar la presencia de rFrpA.

Ejemplo 2. Purificación de la proteína rFrpA y estudio de su estructura terciaria

Para la preparación de la vacuna se optó por trabajar con la proteína purificada a partir de las membranas externas de E. coli que expresasen la proteína rFrpA. En el ejemplo anterior hemos visto que rFrpA puede ser sobreexpresada correctamente en E. coli BL21 CodonPlus. En este ejemplo se ilustra la producción y purificación de rFrpA a media escala utilizando para ello cromatografía de afinidad, y se demuestra que rFrpA conserva la estructura tridimensional nativa de la proteína FrpA de PhDP.

De una placa de E. coli BL21 CodonPlus que porta la construcción pelB-10His-FrpA se inició un cultivo bacteriano de 100 mL de LB suplementado con 200 µg/mL de ampicilina y 50 µg/mL de cloranfenicol que se incubó durante una noche a 28°C en agitación a 180 rpm. A la mañana siguiente se usaron 60 mL de preinóculo para iniciar un cultivo de 6 L del mismo medio. Este cultivo se incubó a 28°C con agitación durante aproximadamente 90 min, momento en el que se indujo la expresión de rFrpA al añadir al medio de cultivo 0.2% de arabinosa. El cultivo se dejó crecer a 28°C con agitación durante 38 h. Posteriormente, se obtuvo el pellet celular mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 min. Siguiendo esta metodología se obtuvo un pellet de 24.7 g que se conservó a -80º C hasta su procesamiento.

El pellet obtenido de la inducción con arabinosa se resuspendió en tampón Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 50 mM, conteniendo lisozima (Alfa Aesar), DNasa RQ1 RNase-Free (PROMEGA) e inhibidor de proteasas (SIGMA ALDRICH). Las células bacterianas se lisaron por sonicación y el lisado se centrifugó a 4500 rpm durante 10 min a 4°C para retirar los restos celulares. El sobrenadante se centrifugó a 33000 g durante 1 h a 4°C, para obtener las membranas totales. Posteriormente, las membranas totales se resuspendieron en agua y se adicionó sarkosyl (lauroil-sarcosinato sódico, SIGMA ALDRICH) al 3%. Estas membranas se solubilizaron durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. Una vez disueltas las membranas internas se obtuvieron las membranas externas por centrifugación a 30000 g durante 1 h a 4°C.

Las membranas externas obtenidas por centrifugación como se mencionó previamente, se resuspendieron en elugent 5% (CALBIOCHEM) y se dejaron una noche a 4°C con agitación. Para retirar las impurezas no solubles se centrifugó a 33.000 g durante 1 h a 4°C. La fracción soluble de las membranas se combinó con tampón de equilibrio (Tris-Hcl 10 mM pH 8.0, NaCl 0.05 M, elugent 0.25% y imidazol 10 mM). La purificación de rFrpA se hizo usando columnas de afinidad de níquel de 1 mL (Thermo Scientific™ HisPur™ Ni-NTA). La separación en la columna se realizó siguiendo las recomendaciones del fabricante, utilizando como tampón de lavado Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 0.05 M, elugent 0.25% e imidazol 30 mM, y como tampón de elución Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 0.05 M, elugent 0.25% e imidazol 500 mM. Las fracciones obtenidas se analizaron por SDS-PAGE y las fracciones que contenían la proteína fueron combinadas, concentradas y cambiadas a tampón PBS con elugent 0.25% usando células con agitación Amicon.

Por otra parte, para que rFrpA genere una respuesta inmune efectiva frente a PhDP es indispensable el correcto plegamiento de rFrpA en la membrana externa de E. coli. Para estudiar la estructura tridimensional de rFrpA se realizaron dos pruebas: digestión con tripsina y análisis de dicroísmo circular. Reacción con tripsina: 10 μL de disolución de proteína (2.55 mg/mL) se trataron con 4 μg/mL de tripsina (Sigma Aldrich) durante 15 min a temperatura ambiente. Los resultados de la digestión se visualizaron en un gel de poliacrilamida al 10%, una muestra de rFrpA obtenida de las membranas externas y una fracción de la muestra anterior sometida a desnaturalización con SDS 0.1% a 100°C. A diferencia de la rFrpA desnaturalizada, para la que se observan una gran cantidad de bandas debido a la presencia de sitios de corte expuestos durante la desnaturalización, los productos de digestión de la rFrpA nativa presentan menos bandas, debido a la protección de gran parte de estos sitios en la proteína intacta. (Figura 4A).

Para terminar de comprobar que rFrpA estaba en su forma nativa se hizo el espectro de dicroísmo circular. El espectro obtenido para rFrpA coincide con los espectros de proteínas de la familia de receptores de sideróforos que han sido estudiados previamente. El espectro de rFrpA presenta un mínimo

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35

45

55

en 219 nm que confirma la presencia de láminas β en su estructura secundaria (Figura 4b). [Microbes and Infection 2006, 8: 2145-2153].

Ejemplo 3. Experimento de inmunización con rFrpA y producción de anticuerpos frente a PhDP

En este ejemplo se ilustra el experimento llevado a cabo para comprobar la capacidad inmunogénica de rFrpA en peces cultivados. Para ello se realizó una experiencia de inmunización de lenguados a los que se les monitorizó la producción de anticuerpos frente a PhDP.

El protocolo de inmunización utilizado se ilustra en la figura 5. Se utilizaron un total de 250 lenguados de 10 g de peso que fueron distribuidos al azar en 5 grupos de 50 peces. Un grupo de 50 peces actuó como testigo del experimento, los restantes 4 grupos fueron sometidos a diferentes tratamientos al ser inmunizados con 100 µL de: (1) una solución inmunogénica que contenía la proteína rFrpA. A cada pez se le suministró 30 µg de rFrpA resuspendida en una solución de PBS con 0.25% de elugent y adyuvante de Freund en una proporción 1:1 (2) una bacterina (vacuna tradicional) obtenida al inactivar un cultivo de PhDP con un 0.1% de formol, este cultivo inactivado se ajustó con PBS a una DO600 = 1, (3) adyuvante de Freund. A este grupo de peces se les suministró una solución de PBS y adyuvante de Freund en una proporción 1:1 y por último, (4) el grupo control sin vacunar tratado con solución salina. El método elegido para suministrar los tratamientos fueron dos inmunizaciones por inyección intraperitoneal que se suministraron los días 0 y 30 siguiendo el protocolo expuesto en la Figura 4.

Para cuantificar la respuesta inmune generada en el pez, los días 0, 30 y 60 se obtuvieron muestras de suero. Con los sueros se realizó un inmunoenzimoensayo ELISA tipo sándwich, o de captura de antígeno, utilizando como antígeno células inactivadas de PhDP y como anticuerpo una IgM anti-Gurami capaz de reconocer específicamente los anticuerpos del lenguado. En la figura 6 se muestran los niveles de anticuerpos frente a PhDP presentes en los sueros de los peces de cada tratamiento. Los resultados se expresan como un porcentaje siendo el 100% el nivel de anticuerpos de los peces inmunizados con bacterina el día 60 ya que este fue el valor máximo. En los peces control, tratados con PBS, la presencia de anticuerpos frente a PhDP es testimonial y apenas alcanza el 5%. En el grupo de peces inmunizados con adyuvante de Freund se observa una producción significativa de anticuerpos. El adyuvante de Freund consiste en una suspensión oleosa de Mycobacterium tuberculosis por lo que creemos que se está produciendo un reconocimiento cruzado entre los anticuerpos frente a Mycobacterium y PhDP. En los peces inmunizados con bacterina se observa una producción de anticuerpos intensa y rápida, como se muestra en la figura 6 la producción ya es máxima desde la primera inmunización. En el grupo de peces inmunizados con rFrpA vemos que la producción de anticuerpos es gradual, de apenas el 7%, tras la primera inmunización, que sin embargo aumenta al 20% tras la segunda inmunización. Aunque los niveles de anticuerpos son estadísticamente superiores en el grupo de peces inoculados con bacterina, la presencia de anticuerpos frente a PhDP en el suero de los lenguados inmunizados con rFrpA demuestra que rFrpA es una proteína inmunogénica capaz de inducir una respuesta inmune específica en el lenguado. Tal y como se refleja en la bibliografía, cuando se realizan inmunizaciones con vacunas recombinantes, es necesario realizar una segunda inmunización o dosis de refuerzo, esta necesidad se refleja en el grupo de peces tratados con rFrpA, en el que sólo se detecta una producción significativa de anticuerpos tras la segunda inmunización.

Ejemplo 4. Determinación de la protección conferida frente a PhDP por la rFrpA

Para determinar el nivel de protección conferida por la vacuna recombinante rFrpA frente a PhDP se realizó una infección experimental inoculando a los lenguados una dosis de PhDP capaz de producir un 100% mortalidad en un plazo de 7 a 10 días. En este experimento también se comparó el nivel de protección de la vacuna rFrpA con el conferido por una bacterina clásica utilizada en la industria acuícola.

Tras haber suministrado los diferentes tratamientos por medio de dos inmunizaciones, el día 60, se les inoculó a los lenguados 100 µL de una suspensión de PBS con 107 células mL-1 de PhDP. A partir de este momento se registró la mortalidad acumulada en cada grupo de peces (tratamiento). Tras la infección se retiraron peces muertos entre los días 64 y 71, momento a partir del cual se estabilizaron las curvas de supervivencia. La figura 7 muestra la dinámica de supervivencia registrada entre los días 61 y 75. Como se puede ver en la Figura 7, existen diferencias significativas entre los grupos de animales vacunados (grupo 1 y 2) y los grupos control (grupo 3 y 4) (p < 0.001). En los peces inoculados con PBS, o grupo control, se observa una rápida mortalidad que alcanza el día 68 al 100% de los peces. En el grupo de peces tratados con adyuvante se observa una reducción significativa de la mortalidad respecto al grupo control, consiguiendo contener la mortalidad en un 55%. Los grupos donde se observa un mayor nivel de supervivencia, y por tanto de protección frente a la pasteurelosis, son los grupos tratados con la vacuna recombinante rFrpA y con la bacterina. El índice de supervivencia se situó en el 74% y 80% respectivamente. Las diferencias no son significativas por lo que se puede considerar que la protección conseguida con la vacuna recombinante es equivalente a la conseguida con la bacterina, pero con las ventajas comentadas anteriormente que aporta el uso de una proteína purificada.

imagen8

Los resultados obtenidos en el experimento de inmunización indican que la inmunización de los lenguados de 10 g de peso con 30 µg de proteína recombinante rFrpA es suficiente para conferir un nivel de protección satisfactorio, lo que hace que la utilización de la proteína de membrana externa FrpA se postule como una opción prometedora a la hora de combatir la pasteurelosis.

5

Ejemplo 5. Formulación de la vacuna recombinante rFrpA y protocolo de inmunización.

En este ejemplo se realiza una descripción detallada de la composición de la solución inmunogénica a base de la proteína recombinante FrpA (rFrpA). La vacuna recombinante rFrpA consiste en una solución de 600 µg/ml de rFrpA en tampón fosfato salino (PBS; pH 7.4) con un 0.25 % de elugent que se mezcla 10 en una proporción 1:1 con adyuvante de Freund. Para la correcta inmunización de los peces la vacuna recombinante debe ser suministrada por medio de dos inmunizaciones. La inmunización consistirá en la inyección intraperitoneal de un volumen de 100 µl de la solución inmunogénica, por tanto cada pez será inmunizado con 30 µg de rFrpA. En la primera inmunización el adyuvante utilizado será el completo de Freund (SIGMA-ALDRICH), mientras que en la segunda inmunización (dosis de refuerzo) se utilizará el 15 adyuvante incompleto de Freund (SIGMA-ALDRICH). Las dos inmunizaciones deben estar espaciadas por un periodo de 30 días. Dado que la respuesta protectora en el pez es dependiente de la edad y la especie, podría ser conveniente ajustar la cantidad de proteína recombinante inyectada a las circunstancias específicas de cada vacunación. La presente invención no pretende limitar la cantidad de proteína suministrada, y aunque en los ejemplos 3 y 4 se ha acreditado que la inmunización de lenguados

20 de 10 g de peso con 30 µg de proteína recombinante es suficiente para generar un grado de protección satisfactorio, la composición inmunogénica podría contener hasta 300 µg de proteína recombinante sin provocar efectos nocivos en los animales.

25

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40

Claims (19)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1. Molécula aislada de ácidos nucleicos, caracterizada por una secuencia nucleotídica SEC ID NO:1

   o con, al menos, un 70% de identidad con SEQ ID NO:1, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína FrpA de Photobacterium damselae subsp. piscicida
   

   5 caracterizada por SEQ ID NO:2, o un polipéptido con, al menos, un 80% de identidad con SEQ
   ID NO:2 que mantiene las propiedades antigénicas de FrpA o un fragmento inmunogénico que mantiene las propiedades antigénicas de FrpA.
2. 2. Molécula aminoacídica aislada que comprende la secuencia aminoacídica de FrpA de

   10 Photobacterium damselae subsp. piscicida, caracterizada por la SEC ID NO:2, o la proteína
   recombinante rFrpA, o una secuencia con, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO:2 que mantiene las propiedades antigénicas de FrpA o un fragmento inmunogénico que mantiene las propiedades antigénicas de FrpA.

   15 3. Vector recombinante caracterizado porque comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1.

3. 4. Célula o microorganismo que comprende un vector recombinante según reivindicación 3.

   20 5. Organismo transgénico no humano que comprende, insertado en su genoma, una secuencia nucleotídica según reivindicación 1 o un vector según reivindicación 3.

4. 6. Composición inmunogénica caracterizada porque comprende un elemento seleccionado de la

   lista que consiste en: 25 a. Molécula aislada de ácidos nucleicos según reivindicación 1

   b.

   Molécula aminoacídica aislada según reivindicación 2;

   c.

   Vector recombinante según reivindicación 3 ;

   d.

   Célula o microorganismo hospedador según reivindicación 4;

   e. Organismo transgénico no humano según reivindicación 5; 30 o cualquiera de sus combinaciones y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. 7. Composición inmunogénica según la reivindicación 6 donde el vehículo farmacéuticamente aceptable es un adyuvante.

   35 8. Composición inmunogénica según la reivindicación 7 en dónde el adyuvante se selecciona de la lista que consiste en: aceite mineral, adyuvante de Freund completo (FCA), adyuvante de Freund incompleto (FIA), alginatos, beta-glucanos, CpG, flagelina, fosfito de aluminio y potasio, hidroxido de aluminio, interleuquinas, levamisol, liposomas, microesferas biodegradables, Montanide ISA, Mycobacterium bovis, Mycobacterium butyricum, Mycobacterium chenolae,

   40 nanopartículas PLGA, paredes celulares de micobacteria, polisacáridos bacterianos (LPS), quimiocinas, quitosano, saponinas, sorbitan sesquioleato, vitamina C, vitamina E, o cualquier combinación de los mismos.
6. 9. Composición inmunogénica según reivindicación 8 en la que el adyuvante es el adyuvante de 45 Freund.
7. 10. Composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, que comprende un nanosistema como sistema de vectorización.

   50 11. Composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, que comprende un microsistema como sistema de vectorización
8. 12. Anticuerpo obtenible tras la inmunización de un animal con la composición inmunogénica según reivindicaciones 6 a 11.

   55

9. 13.

   Anticuerpos según la reivindicación 14, donde el animal empleado para la inmunización es un pez.

10. 14.

    Uso como medicamento de los anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15.

    60

11. 15.

    Uso de la composición inmunogénica, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en la elaboración de un medicamento.

12. 16.

    Uso según la reivindicación 15, donde le medicamento es una vacuna

13. 17.

    Uso según la reivindicación 16, donde la vacuna es para peces.

14. 18.

    Uso de la composición inmunogénica, según reivindicación 17, donde los peces se seleccionan de la lista que consiste en: Dicentrarchus labrax, Epinephelus akaara, Macropodus opercularis,

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    10

    imagen2

    5 Morone americanus, Morone saxatilis, Mullus spp., Pagrus pagrus, Pictiblennius yatabei, Rachycentron canadum, Seriola quinqueradiata, Solea senegalensi, Solea solea, Sparus aurata.

15. 19.

    Uso de la composición inmunogénica, según reivindicación 18, donde los peces son Solea senegalensis y Solea solea.

16. 20.

    Procedimiento para la producción de una molécula aminoacídica, según reivindicación 2, caracterizado porque comprende el cultivo de una célula o microorganismo hospedador, según reivindicación 4, y la recuperación de la molécula aminoacídica del extracto celular o del sobrenadante.

17. 21.

    Procedimiento para la producción de una molécula aminoacídica, según reivindicación 2, caracterizado porque comprende el cultivo de un organismo transgénico no humano, según reivindicación 5, y la recuperación de la molécula aminoacídica.

    10

    15

    20 22. Procedimiento para la producción de una molécula nucleotídica, según reivindicación 1, caracterizado porque comprende el cultivo de una célula o microorganismo hospedador, según reivindicación 4, y la recuperación de la molécula nucleotídica a partir del extracto celular o del sobrenadante.

    25 23. Procedimiento para la producción de una molécula nucleotídica, según reivindicación 1, caracterizado porque comprende el cultivo de un organismo transgénico no humano, según reivindicación 5, y la recuperación de la molécula nucleotídica.
18. 24. Procedimiento para la elaboración de una composición inmunogénica según reivindicaciones 6 a

    30 11, que comprende un procedimiento según reivindicaciones 20 o 23, y la adición de un vehículo farmacéuticamente aceptable.
19. 25. Un kit para uso en la inducción de una respuesta inmune en peces, que comprende una

    composición inmunogénica o vacunal según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 y 35 opcionalmente instrucciones relacionadas con la administración.

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