ES2547015T3 - Modelo de aterosclerosis en cerdos - Google Patents
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Abstract
Un cerdo de tamaño miniatura genéticamente modificado como un modelo para estudiar la aterosclerosis, en el que el modelo de cerdo expresa al menos un fenotipo asociado con la aterosclerosis. y comprende al menos una mutación en el i. gen ApoE endógeno y/o ii. gen receptor del LDL endógeno, en la que dicho fenotipo al menos es hipercolesterolemia.
Description
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célula donante modificados comprenden al menos una mutación, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 mutaciones en el gen ApoE y/o en el gen LDL.
En una realización de la presente invención el cerdo de tamaño miniatura modificado de acuerdo con la presente invención es mutado en el gen ApoE o parte del mismo, en el producto de la transcripción y/o de la traducción o parte del mismo (SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO:2) y/o en el gen LDL o parte del mismo, producto de la transcripción y/o de la traducción o parte del mismo (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4)). Los genes son mutados así que la función del gen es interrumpida. Se comprende que una mutación y/o una función interrumpida del gen dará como resultado una reducción de la cantidad de producto de la transcripción o parte del mismo y/o producto de la traducción o parte del mismo de dicho gen comparada con la cantidad de producto de la transcripción y/o de la traducción del gen en cuestión, en el presente documento el gen ApoE y/o el gen LDL.
Sin embargo, en otra realización el cerdo de tamaño miniatura transgénico es transgénico por una combinación de mutaciones, por ejemplo al menos una mutación en el gen ApoE endógeno porcino y/o al menos una mutación en el gen LDL endógeno porcino.
Las mutaciones introducidas en el gen ApoE endógeno porcino y/o en el gen LDL endógeno porcino o parte del mismo pueden ser introducidas por cualquier procedimiento conocido por la persona experta en la técnica. En una realización, se introduce, al menos, una mutación mediante el noqueado a través de recombinación homóloga. Sin embargo, en otra realización preferida, al menos una mutación está en la forma de una disminución en la cantidad de producto de la transcripción y/o de la traducción o parte del mismo del gen ApoE endógeno y/o del LDL endógeno comparada con la cantidad de producto de la transcripción y/o de la traducción o parte del mismo de un gen ApoE y/o un gen LDL silvestres. Un procedimiento preferido para disminuir la cantidad de ApoE y/o LDL producto de la transcripción y/o de la traducción o parte del mismo es mediante el uso de los ARN pequeños de interferencia (ARNpi) dirigidos contra los productos transcripcionales o partes del mismo del gen ApoE y/o del gen LDL. En una realización preferida, el producto de la transcripción o parte del mismo del gen LDL es dirigido. Dianas no limitantes de los ARN pequeños de interferencia con expresión disminuida de los receptores LDL se muestran en la Tabla 1. Cada una de las dianas se pueden escoger de forma separada, o en cualquier combinación. En una realización preferida la diana es T8. En otra realización la diana preferida es T9.
Tabla 1.
- Dianas de los ANRhc dirigidos al receptor de LDL con expresión disminuida
- Primera base en la secuencia AF065990 del ADNc del cerdo
- Secuencia
- T1
- 763 tgtcaaagcggcgagtgca
- T2
- 889 tcccatatctgcaatgacc
- T3
- 1150 accctggaccgtagtgagt
- T4
- 1308 tgacaccattattggcgaa
- T5
- 1309 gacaccattattggcgaag
- T6
- 1439 agactctcttccaagagaa
- T7
- 1553 tgaacggagtggacgtcta
- T8
- 1814 tcacaggctcggacataca
- T9
- 858 CCAACGAGTGTCTGGACAA
- T10
- 1109 CCTACCTCTTCTTCACCAA
Una o más mutaciones del gen ApoE y/o LDL pueden estar en la zona codificante del gen ApoE y/o LDL, sin embargo, una o más mutaciones del gen ApoE y/o LDL pueden ser también determinadas en al menos una secuencia reguladora del gen ApoE y/o LDL. Por secuencia reguladora se pretende indicar secuencias que regulan
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el proceso de la transcripción y de la traducción, por ejemplo, promotores, potenciadores, secuencias que afectan a la poliadenilación, inicio de la traducción o de la transcripción, y corte y empalme de productos transcripcionales. Los promotores y potenciadores que controlan la transcripción de genes que codifican proteínas están compuestos de múltiples elementos genéticos. La maquinaria celular es capaz de reunir e integrar la información reguladora transmitida por cada elemento, permitiendo que genes diferentes desarrollen distintos, a menudo complejos, patrones de regulación transcripcional. Los genes ApoE y/o LDL pueden, alternativamente, ser mutados en uno o más de sus exones.
En una realización, el gen ApoE endógeno porcino del cerdo de tamaño miniatura, embrión, blastocisto, célula donante y/o feto de la presente invención genéticamente modificados es mutado en uno o más de sus exones, interrumpiendo así la función génica de la ApoE. Por ello, puede ser mutado cualquier exón 1, exón 2, exón 3, o exón 4 del gen ApoE porcino. El exón 1 está situado en el nucleótido 832-857 del gen ApoE porcino, el exón 2 en el nucleótido 1663-1728, el exón 3 en los nucleótidos 2473-2662, el exón 4 en los nucleótidos 3037-3879 del gen ApoE porcino. En una realización preferida, uno o más exones de la ApoE y/o de la LDL es mutado interrumpiendo el exón debido a la inserción de una construcción de nucleótidos por recombinación homóloga y tecnología de noqueado.
Es más, se comprende que el cerdo de tamaño miniatura, embrión, blastocisto, célula donante y/o feto de la presente invención genéticamente modificados comprende el producto de la transcripción o parte del mismo y/o el producto de la traducción o parte del mismo de los genes ApoE y/o LDL porcinos como se ha descrito anteriormente.
En la mayoría de los casos de aterosclerosis, el componente genético es complejo, pero en algunos casos la herencia de la enfermedad es monogénica. Estos casos son principalmente causados por mutaciones en genes que codifican proteínas implicadas en el tráfico de lipoproteínas, y los más graves en humanos son causados por mutaciones que afectan a la lipoproteína mediada por el receptor de LDL (hipercolesterolemia familiar dominante recesiva y autosómica).
Identidad de secuencias
En el presente documento se usan equivalentes y variantes funcionales de forma intercambiable. En una realización preferida de la invención, se proporcionan también variantes del gen del receptor de LDL y/o de la apolipoproteína A. Si son polipéptidos, las variantes se determinan en base a su grado de identidad o su homología con una secuencia predeterminada de aminoácidos, siendo dicha secuencia predeterminada de aminoácidos productos de los genes del receptor de LDL y/o de la apolipoproteína A como se describe en el presente documento, o, si la variante es un fragmento, un fragmento de cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas, respectivamente.
En consecuencia, las variantes tienen, preferiblemente, al menos una identidad de secuencias del 91 %, por ejemplo al menos una identidad de secuencias del 91 %, tal como al menos una identidad de secuencias del 92 %, por ejemplo al menos una identidad de secuencias del 93 %, tal como al menos una identidad de secuencias del 94 %, por ejemplo al menos una identidad de secuencias del 95 %, tal como al menos una identidad de secuencias del 96 %, por ejemplo al menos una identidad de secuencias del 97 %, tal como al menos una identidad de secuencias del 98 %, por ejemplo una identidad de secuencias del 99 % con la secuencia predeterminada.
Las siguientes expresiones se usan para describir las relaciones de las secuencias entre dos o más polinucleótidos: "secuencia predeterminada", "ventana de comparación", "identidad de secuencias", "porcentaje de identidad de secuencias" e "identidad sustancial".
Una "secuencia predeterminada" es una secuencia definida usada como una base para una comparación de secuencias; una secuencia predeterminada puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de un ADN o gen en toda su longitud dada en un listado de secuencias, tal como una secuencia polinucleotídica de los genes del receptor de LDL y/o de la apolipoproteína A como se describe en el presente documento o pueden comprender una secuencia de ADN o de gen completa. Generalmente, un secuencia predeterminada tiene al menos 20 nucleótidos de longitud, frecuentemente al menos 25 nucleótidos de longitud, y a menudo al menos 50 nucleótidos de longitud.
Como dos polinucleótidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una parte de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) pueden comprender además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se llevan a cabo típicamente comparando secuencias de los dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguos en la que una secuencia polinucleotídica puede ser comparada con una secuencia predeterminada de al menos 20 nucleótidos contiguos y en la que la parte de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos comparado con la secuencia predeterminada (que no comprende adiciones ni supresiones ) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.
El alineamiento óptimo de las secuencias para alinear un ventana de comparación puede ser conducido por el
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algoritmo de la homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, por el algoritmo de la homología de alineamiento de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante la investigación del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444, mediante aplicaciones por ordenador de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, dando como resultado el más elevado porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generado por los diversos procedimientos.
La expresión "identidad de secuencias" significa que dos secuencias polinucleotídicas son idénticas (es decir, en una base nucleótido-a-nucleótido) sobre la ventana de comparación. La expresión "porcentaje de identidad de secuencias" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (p. ej., A, T, C, G, U, o I) aparece en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencias. La expresión "identidad sustancial" como se usa en el presente documento indica una característica de una secuencia polinucleotídica, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos una identidad de secuencias del 85 por ciento, preferiblemente, al menos una identidad de secuencias del 90 al 95 por ciento, más normalmente al menos una identidad de secuencias del 99 por ciento comparado con un secuencia predeterminada sobre una ventana de comparación de al menos posiciones de 20 nucleótidos, frecuentemente sobre una ventana de al menos 25-50 nucleótidos, en la que el porcentaje de identidad de secuencias se calcula comparando la secuencia predeterminada con la secuencia polinucleotídica que puede incluir supresiones o adiciones cuyo total es 20 por ciento o menos de la secuencia predeterminada sobre la ventana de comparación. La secuencia predeterminada puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, como un segmento de la secuencia polinucleotídica del gen receptor de LDL y/o apolipoproteína A de longitud completa, ilustrada en el presente documento.
La identidad de secuencias se determina en una realización utilizando fragmentos de secuencia de ApoE porcino o humano, o péptidos de LDL porcino o humano, péptidos PCSK9 porcino o humano que comprenden al menos 25 aminoácidos contiguos y que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, tal como 85 %, por ejemplo 90 %, tal como 95 %, por ejemplo 96 %, tal como 97 %, por ejemplo 98 %, tal como 99 % idéntica a los aminoácidos descritos en el presente documento, en la que la identidad en tanto por ciento se determina con el algoritmo GAP, BESTFIT o FASTA en la Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, utilizando pesos de huecos por defecto.
Sustituciones de aminoácidos conservativas:
Las sustituciones dentro de los grupos de aminoácidos, mostrados más abajo, se consideran sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones entre los diferentes grupos de aminoácidos se consideran sustituciones de aminoácidos no conservativas.
P, A, G, S, T (neutra, débilmente hidrófoba)
Q, N, E, D, B, Z (hidrófila, aminoácido)
H, K, R (hidrófila, básica)
F, Y, W (hidrófoba, aromática)
L, I, V, M (hidrófoba)
C (formación de entrelazamientos)
Mediante la expresión "productos de la transcripción o de la traducción" se pretende indicar en el presente documento productos de la transcripción del gen, tal como un transcrito de ARN, por ejemplo un transcrito de ARN sin proceso de corte y empalme, un transcrito de ARNm y dichos productos de corte y empalme del transcrito de ARNm, y productos de la traducción del gen, tal como polipéptido o polipéptidos traducidos de cualquiera de los transcritos de ARNm del gen y varios productos del procesado posterior a la traducción de dichos polipéptidos, tal como los productos del procesado proteolítico posterior a la traducción del polipéptido o polipéptidos o productos de varias modificaciones posteriores a la traducción de dicho polipéptido o polipéptidos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "producto de la transcripción del gen" se refiere a una molécula de ARN premensajero, pre-ARNm, que contiene la misma información de secuencia (si bien, los nucleótidos U reemplazan a los nucleótidos T) que el gen, o la molécula de ARN mensajero maduro, ARNm, que era producida debido a corte y empalme del pre-RNAm, y es un molde para la traducción de información genética del gen en una proteína.
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Fenotipos
Son muchos los fenotipos asociados con la aterosclerosis. Se comprende que el modelo de cerdo de tamaño miniatura de la presente invención expresa al menos un fenotipo asociado con la aterosclerosis, tal como tres, por ejemplo cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 fenotipos asociados con la aterosclerosis. Ejemplos no limitantes de dichos fenotipos son hipercolesterolemia, acumulación de grasa, colesterol y otras sustancias en las paredes de las arterias, formación de placa, estenosis, obstrucción del flujo sanguíneo, ruptura de la placa, infarto, y/o claudicación.
Al menos un fenotipo asociado con la aterosclerosis es la hipercolesterolemia. La hipercolesterolemia es un aumento en la cantidad de colesterol comparado con un nivel estándar en el cerdo de tamaño miniatura observado antes del comienzo de un aumento en la cantidad de colesterol o comparado con un nivel estándar determinado de una población de cerdos. La cantidad de colesterol se mide, preferiblemente, en el plasma de los cerdos. Un aumento en colesterol en plasma es al menos 10 % comparado con un nivel estándar, tal como al menos 15 %, por ejemplo 20 %, tal como 25 %, por ejemplo 30 %, tal como al menos 35 %, por ejemplo al menos 40 %, tal como al menos 45 %, por ejemplo al menos 50 %, tal como al menos 55 %, por ejemplo al menos 60 %, tal como al menos 65 %, por ejemplo al menos 70 %, tal como al menos 75 %, por ejemplo al menos 80 %, tal como al menos 85 %, por ejemplo al menos 90 %, tal como al menos 95 %, por ejemplo al menos 100 %, tal como al menos 110 %, por ejemplo al menos 120 %, tal como al menos 150 %, por ejemplo al menos 175 %, tal como al menos 200 %, por ejemplo al menos 250 %, tal como al menos 300 %, por ejemplo al menos 350 %, tal como al menos 400 %, por ejemplo al menos 450 %, tal como al menos 500 comparados con un nivel estándar.
Por ello, un aumento de un 10 % en hipercolesterolemia en un cerdo que tiene un nivel estándar de 2 mmol/l corresponde a una cantidad de colesterol de 2,2 mmol/l.
Los fenotipos asociados con la aterosclerosis comprenden la acumulación de grasa, colesterol y otras sustancias en las paredes de las arterias y forman placas. Finalmente, los depósitos de placa pueden hacer las arterias menos flexibles. El endurecimiento de la arteria puede dar como resultado un disminución en el flujo sanguíneo (estenosis) e incluso la obstrucción del flujo sanguíneo. Como consecuencia, un insuficiente suministro de sangre a los órganos. La arteria puede compensar el estrechamiento de la arteria mediante el alargamiento de la arteria que si es excesivo lleva a la formación de una aneurisma. Si disminuye el flujo sanguíneo en las arterias que llevan al corazón, puede aparecer dolor torácico. También pueden romperse placas (ruptura de placa), dando lugar a piezas de material que se mueven a través de la arteria, dando lugar a la formación de un trombo que ralentizará o detendrá el flujo sanguíneo, llevando a la muerte de los tejidos afectados por la detención del flujo sanguíneo, también conocido como infarto. Esta es una causa común del ataque al corazón y del accidente cerebrovascular. Alrededor de los depósitos de placa también pueden formarse coágulos de sangre. Los coágulos bloquean el flujo sanguíneo. Si el coágulo llega al corazón, a los pulmones o al cerebro, puede causar un accidente cerebrovascular, un ataque al corazón o un embolismo pulmonar.
También, la claudicación debida a insuficiente suministro de sangre a las piernas, típicamente debido a una combinación tanto de estenosis como de aneurisma de segmentos estrechados por coágulos es una realización de los fenotipos asociados con la aterosclerosis. Otro fenotipo de cerdo de tamaño miniatura genéticamente modificado es la hipercolesterolemia en la que se observan sistemáticamente altos niveles de lipoproteína de baja densidad (LDL) comparado con los niveles normales, que conducen a la aterosclerosis prematura de las arterias coronarias. Típicamente en los hombres afectados, el ataque al corazón ocurre en sus 40 a 50. En humanos, la hipercolesterolemia está a menudo en la forma de hipercolesterolemia familiar que es principalmente debido a mutaciones en genes que codifican proteínas implicadas en el tráfico de las lipoproteínas, causado por mutaciones nulas del homozigoto en el receptor de LDL.
Existe un número de pruebas que ayudan en la diagnosis de la aterosclerosis que son conocidas por la persona experta en la técnica tal como una prueba de esfuerzo cardíaco que es una prueba médica realizada para evaluar la circulación de la sangre arterial hacia el miocardio (músculo del corazón) durante el ejercicio físico, comparado con la circulación de la sangre en reposo. También se usa ultrasonido de baja intensidad para detectar la velocidad del flujo sanguíneo en las arterias conocido como estudio Doppler, arteriografía por resonancia magnética, escaneo CT, arteriografía utilizando rayos X y para diagnosticar la aterosclerosis se usan colorante especial para ver dentro de las arterias, ultrasonido intravascular y/o escaneo dúplex ultrasónico.
Procedimientos para producir un modelo de cerdo de tamaño miniatura para estudiar la aterosclerosis
La presente invención proporciona procedimientos mejorados para la clonación de cerdos por transferencia nuclear que se refiere a la introducción de un complemento completo de ADN nuclear de una célula a una célula enucleada. El cerdo de tamaño miniatura genéticamente modificado de la presente invención puede ser obtenido utilizando cualquier técnica en la que se transfiera material genético modificado, producto de la transcripción y/o de la traducción o parte del mismo desde en la célula donante hasta una célula anfitriona, tal como un ovocito enucleado. Existe un número de técnicas tal como la introducción de material genético desde una célula somática genéticamente modificada hasta un ovocito enucleado, por ejemplo, mediante microinyección o por transferencia nuclear
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importancia en el éxito de los métodos de transferencia nuclear. Los ovocitos inmaduros (profase I) de los ovarios de cerdo son a menudo recolectados por aspiración. Con el fin de emplear técnicas tal como ingeniería genética, transferencia nuclear y clonación, los ovocitos recolectados de este tipo son preferiblemente, madurados in vitro antes de que las células ovocito puedan ser usadas como células receptoras para la transferencia nuclear.
Preferiblemente, la clonación con éxito del embrión de cerdo utiliza el ovocito en el estadio de la metafase II como ovocito receptor porque se cree que en este estadio de maduración el ovocito puede ser o está suficientemente activado para tratar el núcleo introducido como si fuera un esperma fertilizante. Sin embargo, la presente invención se refiere a cualquier estadio de maduración del ovocito que sea adecuado para llevar a cabo la transferencia nuclear de la célula somática, embriones, blastocistos y/o cerdos transgénicos obtenibles por el procedimiento de transferencia nuclear de célula somática de la presente invención.
La maduración in vitro de ovocitos normalmente tiene lugar en un medio de maduración hasta que el ovocito ha alcanzado la etapa de metafase II o ha extruido el primer cuerpo polar. El tiempo que emplea un ovocito inmaduro en alcanzar la maduración se denomina período de maduración.
En una realización preferida de la presente invención, el ovocito es de una cerda adulta o de una cerda joven, preferiblemente, de una cerda adulta.
El donante (célula somática o núcleo de célula somática) y el receptor (citoplasto) involucrados en el procedimiento de transferencia nuclear de la célula de acuerdo con la presente invención es un cerdo. Así mismo, los embriones reconstruidos pueden ser implantados en un cerdo de acuerdo con la presente invención. Los diferentes cerdos adecuados como donante, receptor o madre adoptiva se describen en otra parte en el presente documento.
El cerdo donante de acuerdo con la presente invención puede ser hembra o macho. La edad del cerdo de tamaño miniatura puede ser cualquier edad tal como adulto o, por ejemplo, feto.
Embrión
De acuerdo con la presente invención, un embrión reconstruido (es decir, un embrión de una sola célula) contiene el material genético de la célula donante. Posteriormente, el embrión reconstruido se divide progresivamente en un embrión multicelular después del comienzo de la mitosis. In vitro, el comienzo de la mitosis es típicamente inducido por activación como se describe en el presente documento.
En la presente invención, el término "embrión" se refiere también a los embriones reconstruidos que son embriones formados después del proceso de transferencia nuclear después del comienzo de la mitosis por activación. Los embriones reconstruidos se cultivan in vitro.
Cuando el embrión contiene aproximadamente 12-16 células se denomina "mórula". Posteriormente, el embrión se divide adicionalmente y se forman muchas células, y una cavidad cística llena de fluido dentro de su centro, la cavidad blastocele. En este estadio, el embrión se denomina "blastocisto". El estadio de desarrollo del ovocito "fertilizado" en el momento es fácil de implantar; formado a partir de la mórula y consiste en una masa celular interna, una cavidad interna y una capa externa de células denominadas células del trofoectodermo.
El blastocisto de acuerdo con la presente invención puede ser implantado en el útero de un mamífero anfitrión y continúa creciendo hasta feto y después hasta animal.
En los procedimientos proporcionados en el presente documento para obtener un mamífero no humano genéticamente modificado o transgénico, para la clonación de un mamífero no humano, para el cultivo de un embrión reconstruido, y/o para la criopreservación de un embrión de cerdo, el embrión puede ser cultivado in vitro. El embrión puede, por ejemplo, ser cultivado en cultivo secuencial. Se comprenderá que el embrión puede ser un embrión normal o un embrión reconstruido como los definidos en otra parte en el presente documento.
La presente invención se refiere, por ello, a un embrión porcino modificado, blastocisto y/o feto derivados del modelo de cerdo de tamaño miniatura genéticamente modificado como se divulga en el presente documento y/o el embrión porcino modificado comprende al menos un gen ApoE humano modificado o parte del mismo y/o el gen LDL humano y/o el gen ApoE porcino y/o el gen LDL porcino.
Se comprende que el embrión porcino modificado, blastocisto y/o feto derivados del modelo de cerdo de tamaño miniatura modificado para estudiar la aterosclerosis, que expresa al menos un fenotipo asociado con la aterosclerosis pueden haber sido el resultado del cruce de, por ejemplo, un cerdo transgénico para al menos una mutación de la ApoE y un cerdo transgénico para al menos una mutación de la LDL.
Citoplasto
Un ovocito o un parte de un ovocito del que se ha retirado el núcleo.
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Célula donante
Mediante la expresión "célula donante" de la presente invención se pretende indicar célula somática y/o células derivadas de la línea germinal.
Mediante le expresión "célula somática" de la presente invención se pretende indicar cualquier célula (cuerpo) de un animal en cualquier estadio del desarrollo. Por ejemplo, las células somáticas pueden provenir de tejido fetal o adulto. Células somáticas especialmente preferidas son las de origen fetal. Sin embargo, también pueden usarse células de una línea germinal. De acuerdo con la presente invención una célula donante es una célula somática. En otra realización de la presente invención, la célula donante es una célula derivada de una línea de células germinales.
En una realización preferida de la presente invención, la célula donante alberga propiedades genéticas deseadas. Sin embargo, la célula donante puede albergar propiedades genéticas deseadas que han sido adquiridas por manipulación genética como se describe en otra parte en el presente documento.
Las células somáticas se seleccionan del grupo constituido por células epiteliales, células neuronales, células epidérmicas, queratinocitos, células hematopoyéticas, melanocitos, condrocitos, linfocitos (linfocitos B y T), eritrocitos, macrófagos, monocitos, células mononucleares, fibroblastos, células musculares cardíacas, y otras células musculares.
Estas pueden obtenerse de diferentes órganos, p. ej., piel, pulmón, páncreas, hígado, estómago, intestino, corazón, órganos reproductores, vejilla, riñón, uretra y otros órganos urinarios.
Los cerdos de tamaño miniatura a partir de los cuales se pueden derivar las células somáticas se describen en otra parte en el presente documento. Una realización preferida de la invención es el empleo de células somáticas que provienen de la misma especie que el ovocito receptor (citoplasto).
Preferiblemente, las células somáticas son células fibroblastos ya que pueden obtenerse tanto de los fetos en desarrollo como de los animales adultos en grandes cantidades. Los fibroblastos pueden además reproducirse fácilmente in vitro. Lo más preferiblemente, las células somáticas son fibroblastos de origen fetal cultivados in vitro.
En una realización preferida, las células somáticas son modificadas genéticamente. Todavía en una realización más preferida de la presente invención, las células somáticas son, preferiblemente, de origen fetal o, por ejemplo, de adultos.
La presente invención se refiere, por ello, a una célula donante porcina modificada derivada del modelo de cerdo de tamaño miniatura genéticamente modificado como se divulga en el presente documento y/o el embrión porcino modificado comprende al menos un gen ApoE humano modificado y/o el gen LDL humano y/o el gen ApoE porcino y/o el gen LDL porcino, producto de la transcripción y/o de la traducción o parte del mismo.
Se comprende que la célula donante porcina modificada del modelo de cerdo de tamaño miniatura modificado para estudiar la aterosclerosis, que expresa al menos un fenotipo asociado con la aterosclerosis puede haber sido el resultado del cruce de, por ejemplo, un cerdo transgénico para al menos una mutación de la ApoE y un cerdo transgénico para al menos una mutación de la LDL.
Tipo de modificación genética
Las células donantes pueden ser modificadas genéticamente por cualquier procedimiento estándar conocido en la técnica. La modificación genética puede ser un modificación del ADN genómico por supresión, inserción, duplicación y/u otras formas de mutación, incluida la mutación puntual. La modificación puede hacerse en secuencias codificantes y/o en secuencias no codificantes. Las construcciones de ADN para la inserción pueden albergar un gen de interés y/o secuencias reguladoras tal como promotores, aisladores, potenciadores, represores o sitios de entrada al ribosoma.
En algunas realizaciones, en el genoma sólo se introduce una modificación genética. En otras realizaciones, sin embargo, el genoma puede ser modificado en más de un sitio. Técnicas adecuadas para modificación genética de células de mamífero, tal como fibroblastos, incluyen técnicas tal como adición génica por recombinación no homóloga, sustitución génica por recombinación homóloga y corrección génica. Esto puede incluir el empleo de inserción retroviral, transferencia de transposón y/o técnicas cromosómicas artificiales. La recombinación ADN no homólogo puede, p. ej., llevarse a cabo como se describe en Kragh et al. (2004) Reprod. Fert. Dev. 16:290 o en Kragh et al. (2004) Reprod. Fert. Dev. 16:315, la transferencia del gen basado en el transposón puede llevarse a cabo como se describe en Izsvak et al.(1997) célula 91:501. La sustitución génica por recombinación homóloga puede, p. ej., implicar las técnicas descritas por Uranow et al. (2005) Nature 435:646. Las técnicas para la edición génica se han descrito en Andersen et al. (2002) J. Mol. Med. 80:770, Liu et al (2002) Gene Ther. 9:118 y Sørensen et al.(2005) J. Mol. Med. 83:39.
En una realización preferida, la célula donante es genéticamente modificada por integración aleatoria, recombinación
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la zona pelúcida no se elimina completamente.
De acuerdo con una realización especialmente preferida de la presente invención, la parte parcialmente digerida de la zona pelúcida se caracteriza porque la zona pelúcida es todavía visible y por el hecho de que el ovocito no ha llegado a deformarse.
La digestión parcial puede lograrse por exposición a una proteasa. En otra realización de la presente invención, la digestión parcial puede realizarse mediante el uso de una pronasa. En otra realización más, la digestión parcial puede lograrse por un combinación de una proteasa y una pronasa.
En una realización preferida, la concentración de pronasa está en el intervalo de 0,1 mg/ml a 10 mg/ml, tal como 0,5 mg/ml a 10 mg/ml, por ejemplo 1 mg/ml a 10 mg/ml, tal como 1,5 mg/ml a 10 mg/ml, por ejemplo 2 mg/ml a 10 mg/ml, tal como 2,5 mg/ml a 10 mg/ml, por ejemplo 2,75 mg/ml a 10 mg/ml, tal como 3 mg/ml a 10 mg/ml, por ejemplo 3,25 mg/ml a 10 mg/ml, tal como 3,3 mg/ml a 10 mg/ml, por ejemplo 3,5 mg/ml a 10 mg/ml.
Una realización preferida es una concentración de pronasa en el intervalo de 2 mg/ml a 5 mg/ml, tal como 2,25 mg/ml a 5 mg/ml, por ejemplo 2,5 mg/ml a 5 mg/ml, tal como 2,75 mg/ml a 5 mg/ml, por ejemplo 2,8 mg/ml a 5 mg/ml, tal como 2,9 mg/ml a 5 mg/ml, por ejemplo 3 mg/ml a 5 mg/ml, tal como 3,1 mg/ml a 5 mg/ml, por ejemplo 3,2 mg/ml a 5 mg/ml, tal como 3,3 mg/ml a 5 mg/ml.
Una realización particular de la presente invención es una concentración de pronasa en el intervalo de 1 mg/ml a 4 mg/ml, por ejemplo 1 mg/ml a 3,9 mg/ml, tal como 1 mg/ml a 3,8 mg/ml, por ejemplo 1 mg/ml a 3,7 mg/ml, tal como 1 mg/ml a 3,6 mg/ml, por ejemplo 1 mg/ml a 3,5 mg/ml, tal como 1 mg/ml a 3,4 mg/ml, por ejemplo 1 mg/ml a 3,3 mg/ml.
En una realización preferida, la concentración de pronasa está en el intervalo de 2,5 mg/ml a 3,5 mg/ml, tal como 2,75 mg/ml a 3,5 mg/ml, por ejemplo 3 mg/ml a 3,5 mg/ml. En una realización especial la concentración de pronasa es de 3,3 mg/ml.
Es evidente para la persona experta que la pronasa debe estar disuelta en un medio apropiado, un medio preferido de acuerdo con la presente invención es T33 (medio de TCM 199 tamponado con Hepes que contiene 33 % de suero bovino (como se describió anteriormente -Vajta, et al., 2003).
El tiempo de incubación del ovocito en la solución de pronasa está en el intervalo de 1 segundo a 30 segundos, tal como 2 segundos a 30 segundos, por ejemplo 3 segundos a 30 segundos, tal como 4 segundos a 30 segundos, tal como 5 segundos a 30 segundos.
En otra realización de la presente invención, el tiempo de incubación está en el intervalo de 2 segundos a 15 segundos, tal como 2 segundos a 14 segundos, por ejemplo 2 segundos a 13 segundos, tal como 2 segundos a 12 segundos, por ejemplo 2 segundos a 11 segundos, tal como 2 segundos a 10 segundos, por ejemplo 2 segundos a 9 segundos, tal como 2 segundos a 8 segundos, por ejemplo 2 segundos a 7 segundos, tal como 2 segundos a 6 segundos, por ejemplo 2 segundos a 5 segundos.
En una realización particular de la presente invención, el tiempo de incubación está en el intervalo de 3 segundos a 10 segundos, tal como 3 segundos a 9 segundos, por ejemplo 4 segundos a 10 segundos, tal como 3 segundos a 8 segundos, por ejemplo 4 segundos a 9 segundos, tal como 3 segundos a 7 segundos, por ejemplo 4 segundos a 8 segundos, tal como 3 segundos a 6 segundos, por ejemplo 4 segundos a 7 segundos, tal como 3 segundos a 5 segundos, por ejemplo 4 segundos a 6 segundos, tal como 4 segundos a 5 segundos. Un tiempo de incubación especialmente preferido es el de 5 segundos.
En una realización preferida de la presente invención, el ovocito es tratado durante 5 segundos en una solución de pronasa de 3,3 mg/ml a 39 °C.
Embrión reconstruido
Mediante la expresión "embrión reconstruido" se pretende indicar la célula que se forma por la inserción de la célula donante o del núcleo de la célula donante en el ovocito enucleado que corresponde a un zigoto (durante la fertilización normal). Sin embargo, la expresión "embrión reconstruido" es también denominada "célula reconstituida". En la presente invención, la célula donante es una célula somática. Sin embargo, la célula donante puede derivarse también de una célula de una línea germinal.
Fusión
La transferencia de una célula donante o de un núcleo rodeado por una membrana desde una célula donante hasta, al menos, el citoplasto se realiza, de acuerdo con la presente invención, por fusión. En las situaciones descritas a continuación la expresión "célula donante" se refiere también a un núcleo de una célula donante rodeado por una membrana. La fusión puede lograrse por varios procedimientos.
La fusión puede ser entre una célula donante y al menos un citoplasto, tal como entre una célula donante y al menos
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Día 3, tal como desde el Día 0 hasta el Día 2.
La concentración de piruvato puede variar desde 0,05 a 1 mM, tal como 0,1 a 1 mM, por ejemplo 0,125 a 1 mM, tal como 0,15 a 1 mM. Sin embargo, la concentración de piruvato sódico puede también variar desde 0,05 mM a 0,9 mM, tal como 0,05 a 0,8 mM, por ejemplo 0,05 a 0,7 mM, tal como 0,05 a 0,6 mM, por ejemplo 0,05 a 0,5 mM, tal como 0,05 a 0,4 mM, por ejemplo 0,05 a 0,3 mM, tal como 0,05 a 0,2 mM. Preferiblemente, la concentración varía entre 0,05 y 0,17 mM. Una concentración preferida de lactato sódico es 0,17 mM.
La concentración de lactato puede variar desde 0,5 mM a 10 mM, tal como 0,75 a 10 mM, por ejemplo 1 a 10 mM, tal como 1,5 a 10 mM, tal como 1,75 a 10 mM, por ejemplo 2 a 10 mM, tal como 2,5 a 10 mM. Sin embargo, la concentración de lactato sódico puede también variar desde 0,5 mM a 9 mM, tal como 0,5 a 8 mM, por ejemplo 0,5 a 7 mM, tal como 0,5 a 6 mM, por ejemplo 0,5 a 5 mM, tal como 0,5 a 4 mM, por ejemplo 0,5 a 3 mM. Preferiblemente, la concentración varía entre 1 y 5 mM, tal como 2 a 4 mM, por ejemplo 2 a 3 mM. Una concentración preferida de lactato sódico es 2,73 mM.
Después del medio de incubación inicial sin glucosa la glucosa sustituye de nuevo a piruvato y lactato. Los embriones se pueden cultivar en el medio que contiene glucosa desde el Día 4 hasta el Día 3, preferiblemente desde el Día 3 hasta el Día 7. La concentración de glucosa puede variar desde 1 a 10 mM, tal como 2 a 10 mM, por ejemplo 3 a 10 mM, tal como 4 a 10 mM, por ejemplo 5 a 10 mM. Sin embargo la concentración de glucosa puede variar también desde 1 a 9 mM, tal como 2 a 8 mM, por ejemplo 3 a 7 mM, tal como 4-6 mM. Una concentración preferida de glucosa de acuerdo con la presente invención es de 5,5 mM de glucosa.
Donación de órganos o tejidos
En una realización, los animales de la invención pueden usarse como una fuente de donación de órganos o tejidos para humanos u otros animales, bien animales de la misma especie o bien animal de otras especies. La transferencia entre especies normalmente se denomina xenotransplante. Órganos completos que pueden ser transplantados incluyen corazón, riñón, hígado, páncreas o pulmón. Alternativamente, partes de órganos, tal como tejidos de órganos específicos pueden ser transplantados o transferidos a humanos u otros animales. En una realización adicional más, una célula individual o una población de células individuales de un animal de la invención pueden ser transferidas a un ser humano u otro animal con fines terapéuticos.
Criopreservación
El término "criopreservación" como se usa en el presente documento puede referirse a la vitrificación de un ovocito, citoplasto, una célula, embrión, o cerdo de la invención. Las temperaturas empleadas en la criopreservación son preferiblemente, inferiores a -80 grados C, y más preferiblemente, de temperaturas inferiores a -196 grados C. Los ovocitos, células y embriones de la invención pueden ser criopreservados durante un período indefinido de tiempo. Se sabe que los materiales biológicos pueden ser criopreservados durante más de cincuenta años.
Está dentro del alcance de la presente invención qué embriones pueden ser criopreservados antes de transferir a un cerdo anfitrión cuando se emplean procedimientos para obtener un mamífero no humano a través de ingeniería genética o transgénico. Tal criopreservación antes de la transferencia puede estar en el estadio de blastocito del desarrollo del embrión. La vitrificación es una forma de criopreservación donde las células vivas son enfriadas rápidamente de manera que el fluido de la célula no se conforma en hielo. Por ello, la vitrificación se refiere al proceso de enfriamiento en el que células o tejidos totales son preservados por enfriamiento a bajas temperaturas bajo cero, tal como (típicamente) -80 ºC o -196 ºC
En particular, la invención se refiere a la vitrificación de un ovocito, sin embargo, la invención también se refiere a la vitrificación de embriones, preferiblemente, embriones en el estadio de blastocito. En una realización, el embrión es cultivado hasta el estadio de blastocisto antes de la vitrificación. Especialmente, están abarcados por la presente invención los embriones de cerdo. También están abarcados por la presente invención los citoplastos vitrificados, ya que son células.
Todavía otro aspecto de la invención se refiere a la criopreservación de un embrión de cerdo derivado por un procedimiento de transferencia nuclear de la célula como se describe en el presente documento que comprende una etapa de vitrificar un embrión de cerdo. Un aspecto adicional de la invención se refiere a embriones de cerdo obtenidos u obtenibles por los procedimientos proporcionados en el presente documento.
Mitocondria
Las células del tejido de los mamíferos no humanos y/o de los embriones no humanos genéticamente modificados obtenibles por la presente invención pueden albergar mitocondria de diferentes fuentes maternas. En una realización preferida, los mamíferos no humanos y/o los embriones no humanos pueden albergar mitocondria de sólo una fuente materna. Sin embargo, en otra realización preferida los mamíferos no humanos y/o los embriones no humanos pueden albergar mitocondria de al menos dos fuentes maternas, tal como tres fuentes maternas, por ejemplo cuatro fuentes maternas, tal como cinco fuentes maternas, por ejemplo seis fuentes maternas, tal como siete fuentes maternas, por ejemplo ocho fuentes maternas, tal como nueve fuentes maternas, por ejemplo diez
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fuentes maternas. La probabilidad de tener un número específico de fuentes maternas puede calcularse basado en los tipos de mitocondria observados.
Evaluación del tratamiento y procedimientos de diagnosis
La presente invención ofrece un procedimiento para cribar la eficacia de una composición farmacéutica, en la que el procedimiento comprende las etapas de i) proporcionar el modelo de cerdo de tamaño miniatura de la presente invención, ii) expresar en dicho modelo de cerdo de tamaño miniatura el determinante genético y utilizar dicho fenotipo para dicha enfermedad, iii) administrar al modelo de cerdo de tamaño miniatura una composición farmacéutica cuya eficacia va a ser evaluada, y v) evaluar el efecto, en su caso, de la composición farmacéutica sobre el genotipo utilizado por el determinante genético cuando se expresa en el modelo de cerdo de tamaño miniatura. En una realización preferida, los ensayos preclínicos de fármacos que tienen como diana la estabilidad de la placa y la trombosis superpuesta está dentro del alcance de la presente invención.
Es más, dentro del alcance de la presente invención está un procedimiento para evaluar la respuesta de un tratamiento terapéutico de la aterosclerosis, en el que el procedimiento comprende las etapas de i) proporcionar el modelo de cerdo de tamaño miniatura de la presente invención, ii) tratar dicho modelo de cerdo de tamaño miniatura con una composición farmacéutica que utilice un efecto sobre dicho fenotipo, y iii) evaluar el efecto observado. Basado en la evaluación se puede recomendar el tratamiento basado en los efectos observados.
Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento de un ser humano que padece aterosclerosis, en el que el procedimiento comprende las etapas iniciales de i) proporcionar el modelo de cerdo de tamaño miniatura de la presente invención, ii) expresar en dicho modelo de cerdo de tamaño miniatura el determinante genético y utilizar dicho fenotipo para dicha enfermedad, iii) administrar a dicho modelo de cerdo de tamaño miniatura una composición farmacéutica cuya eficacia va a ser evaluada, y iv) evaluar el efecto observado, y v) tratar dicho ser humano que padece aterosclerosis basada en los efectos observados en el modelo de cerdo de tamaño miniatura. En una realización preferida, el tratamiento comprende tratar un ser humano que padece de hipercolesterolemia familiar.
Se comprende por tanto que el modelo de cerdo de tamaño miniatura de acuerdo con la presente invención pueden también recibir medicamentos para enfermedades distintas de la aterosclerosis con el fin de probar el efecto combinado de un fármaco para aterosclerosis y otro fármacos administrados al cerdo de tamaño miniatura.
Es más, el modelo de cerdo de tamaño miniatura de la presente invención también permite el desarrollo de tecnología de bioimágenes para la diagnosis de la aterosclerosis. Por ello, la presente invención ofrece un procedimiento para evaluar una tecnología de bioimágenes para la diagnosis de la aterosclerosis, en el que el procedimiento comprende las etapas de i) proporcionar el modelo de cerdo de tamaño miniatura de la presente invención, ii) expresar en dicho modelo de cerdo de tamaño miniatura el determinante genético y utilizar dicho fenotipo para dicha enfermedad, iii) obtención de bioimágenes del modelo de cerdo de tamaño miniatura, y iv) evaluar el resultado, en su caso, de la tecnología de bioimágenes del genotipo utilizado por el determinante genético cuando se expresa en el modelo de cerdo de tamaño miniatura.
El cerdo de tamaño miniatura genéticamente modificado de la presente invención puede emplearse también para mejorar las terapias basadas en catéteres.
Ejemplos
Metabolismo de la lipoproteína en los cerdos
El metabolismo de la lipoproteína en cerdos está razonablemente bien descrita. La distribución y composición de lipoproteínas en plasma en el cerdo son similares a las de los humanos, y la LDL es la principal lipoproteína que transporta colesterol en ambas especies12. Como los humanos, todas las partículas VLDL secretadas por el hígado contienen la forma larga no corregida de apoB100 más que la forma apoB48 truncada, que es dominante en los ratones13.
Las lipoproteínas que contienen apolipoproteína B son aclaradas por captación hepática mediante 1) el receptor de LDL que enlaza con apolipoproteína E en las partículas IDL y con apolipoproteína B100 en las partículas LDL14, y 2) la proteína relacionada con el receptor de LDL (LRP) que enlaza con apolipoproteína E en los restantes15 quilomicrones que contienen apoB48. La importancia relativa de estas vías de paso varía entre especies. En los ratones, la deficiencia de apolipoproteína E tienen un fenotipo aterosclerótico más grave que la deficiencia del receptor de LDL, mientras que lo opuesto es cierto en humanos. El impacto de la deficiencia de apoE y de receptor de LDL en el metabolismo de los lípidos en cerdos no se conoce.
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Ejemplo 1
Producción de cerdos noqueados ApoE
Cerdo noqueado en ApoE por recombinación homóloga
Se ha secuenciado11,16 el gen apolipoproteína E del cerdo de tamaño miniatura (GeneBank acceso nº U70240). Una
5 construcción de vector dirigido que contiene el gen y la secuencia codificante aguas abajo se crean con un casete de gen con resistencia a la neomicina sin promotor insertado en uno de los exones para interrumpir la función génica. El vector dirigido es linealizado y transfectado en fibroblastos fetales Yucatán, aislados de biopsias de orejas de Yucatán recién nacidos. Los plásmidos que codifican nucleasas con dedos de cinc construidas para reconocer y cortar un sitio en la secuencia genómica dirigida pueden usarse para aumentar la eficiencia de la recombinación
10 homóloga. Los fibroblastos se cultivan en presencia de G418. Los clones resistentes son cribados para recombinación homóloga por PCR. Los cerdos de tamaño miniatura Yucatán con uno o ambos alelos apoE noqueados son creados a partir de células recombinantes mediante clonación "artesanal".
1. Clonación de construcciones dirigidas
Un fragmento de 1,6 kb que contiene el extremo 5' del gen ApoE, un fragmento de 3,2 kb que contiene el gen ApoE
15 completo, y un fragmento de 6,1 kb que contiene el extremo 3' del gen ApoE fueron todos amplificados mediante PCR utilizando ADN genómico extraído a partir de fibroblastos aislados de cerdos de tamaño miniatura Yucatán recién nacidos como molde (véase a continuación). Después de subclonar y secuenciar, las partes de los productos de la PCR resultantes se usaron para la clonación adicional en el vector pKO Scrambler NTKV-1903 (Stratagen) dirigido que comprende un gen con resistencia a la neomicina.
20 Fragmento de 1,6 kb de ApoE (extremo 5' de ApoE) -los cebadores usados para amplificación están subrayados:
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Fragmento de 6,1 kb de ApoE (extremo 3' de ApoE) -los cebadores usados para amplificación están subrayados:
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2. Transfección y cribado de células porcinas dirigidas
Los fibroblastos porcinos de cerdos de tamaño miniatura Yucatán recién nacidos o fetales se cultivan a partir de biopsias de la oreja. Las células son cultivadas para una confluencia del 50 % en un matraz de 75 cm2 (TPP, Suiza), 5 tripsinizado y resuspendido en 40 ml de medio (DMEM, Lonza, Suiza). Un cuarto (10 ml) se sembró posteriormente en una cápsula Petri de 10 cm2. Las células son transfectadas con 6 ug de vector de ADN en reactivo de transfección FuGENE 6 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Roche Applied Science). Las células son cultivadas bajo selección con geneticina (Gibco Invitrogen) (1 mg/ml) durante 8 días, se aislaron las colonias de células resistentes a la neomicina, y cada colonia se transfirió a un pocillo de 1,9 cm2 (placa de 24 pocillos, TPP, 10 Suiza) y se cultivaron hasta una confluencia del 80 %. Cada colonia es transferida a un pocillo de 9,4 cm2 (placa de 6 pocillos, TPP, Suiza), se cultivaron hasta una confluencia del 80 %, y 1/3 de las células se usa para aislamiento de ARN mientras que 2/3 de las células se transfieren a un matraz de 25 cm2, se cultivaron hasta una confluencia del 80 % y se almacenaron a -135 °C en DMEM conteniendo 10 % de DMSO hasta su uso posterior en la clonación
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artesanal.
El cribado de eventos dirigidos específicos del locus se realiza por PCR y Transferencia Southern utilizando ADN genómico extraído de clones resistentes a la neomicina como molde. Para esta PCR, se usa un cebador directo situado aguas arriba del 5' de la región de homología del ApoE y un cebador inverso situado dentro del gen
5 resistente a la neomicina, o un cebador directo situado dentro del gen resistente a la neomicina y un cebador inverso situado aguas abajo del 3' para el brazo de homología del ApoE.
La transferencia Southern es realizada para verificar los eventos dirigidos específicos del locus. El ADN genómico era digerido y las transferencias se sondearon con una sonda de ADN situada fuera de la zona de homología de la ApoE.
10 Los fibroblastos porcinos noqueados en ApoE transgénicos resultantes fueron usados posteriormente para transferencia nuclear de la célula somática (SCNT) por clonación artesanal.
Ejemplo 2
Cerdo noqueado en ApoE creado por recombinación homóloga mediada con AAV
1. Clonación de construcciones dirigidas
15 Parte del intrón 2 (brazo izquierdo de la homología) y del intrón 3 (brazo derecho de la homología) de la ApoE se ampilficaron por PCR y se usó junto con un fragmento extraido en gel del vector pNeDaKO-Neo (que contiene un gen resistente a la neomicina) en una PCR de 3 fusiones como se describe por Kohli et al. (Nucleic Acids Research 2004, vol. 32, nº 1).
El producto resultante de la PCR que comprende las secuencias del gen ApoE que flanquean el exón 3 y un gen
20 resistente a la neomicina se clonó en el vector pAAV-MCS (Stratagen) del virus adeno-asociado (AAV). El empaquetamiento de esta construcción dirigida (véase más adelante) y la posterior producción de lisado vírico para la infección de células porcinas se realizaron como se describe por Kohli et al. (2004).
Construcción dirigida AAV-MCS/ApoE KO -secuencia (4.055 pb)
(región sombreada = Neo-secuencia de pNeDaKO-Neo, regiones no sombreadas = secuencias del gen ApoE, las 25 secuencias del cebador están subrayadas)
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2. Transducción y cribado de células porcinas dirigidas
La transducción de fibroblastos porcinos de cerdos de tamaño miniatura Yucatán recién nacidos o fetales se realizó en matraces de 75 cm2 como se describe por Kohli et al. (2004). En resumen, las células fueron infectadas con el
5 virus durante 2-3 horas y, posteriormente, se dejaron en cultivo durante 48 horas. Las células fueron recolectadas por tripsinización a las 48 horas después de transducción y se sembraron en placas de 96 pocillos con medios que contenían geneticina para seleccionar las células dirigidas y se dejaron en cultivo durante 2-3 semanas.
El cribado inicial para eventos dirigidos específicos del locus se realizó por PCR utilizando ADN genómico extraído de clones resistentes a la neomicina como molde. Para esta PCR, se usó un cebador directo situado fuera del brazo
10 izquierdo de la homología del ApoE y un cebador inverso situado dentro del gen resistente a la neomicina, o un cebador directo situado dentro del gen resistente a la neomicina y un cebador inverso situado fuera del brazo derecho de la homología del ApoE.
La transferencia Southern se realizó para verificar los eventos dirigidos específicos al locus. El ADN genómico era digerido y las transferencias se sondearon con una sonda de ADN aguas arriba para el brazo izquierdo de la
15 homología de ApoE o aguas abajo para el brazo derecho de la homología de ApoE.
Los fibroblastos porcinos noqueados ApoE transgénicos resultantes fueron usados posteriormente para transferencia nuclear de la célula somática (SCNT) por clonación artesanal.
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Ejemplo 3
Cerdo noqueado en el receptor de LDL por recombinación homóloga
Se ha secuenciado parte de la secuencia codificante del receptor de LDL del cerdo de tamaño miniatura (GeneBank acceso nº AF065990). Un vector dirigido que contiene parte de la secuencia génica se crea con un casete de gen resistente a la neomicina sin promotor insertado en uno de los exones para interrumpir la función génica. El vector dirigido es linealizado y transfectado en fibroblastos fetales de Yucatán. Los fibroblastos se cultivan en presencia de G418. Los clones resistentes son cribados para recombinación homóloga por PCR. Los cerdos de tamaño miniatura Yucatán con el noqueado de uno o ambos alelos apoE son creados a partir de células recombinantes mediante clonación "artesanal".
Ejemplo 4
Cerdo de expresión disminuida en el receptor de LDL por interferencia de ARN
Se ha secuenciado parte de la secuencia codificante del receptor LDL del cerdo de tamaño miniatura (GeneBank acceso nº AF065990). Las dianas eficientes para interferencia de ARN se determinarán empíricamente por expresión transitoria de vectores que contienen 1) una secuencia de ARN de horquilla corta expresada bajo un promotor U6 o H1 que dirige una secuencia del nucleótido 19 en el ARNm del receptor de LDL.
Para la expresión estable del ARN de horquilla corta, se construye un vector basado en transposón o retroviral con 1) una secuencia de ARN de horquilla corta expresada bajo un promotor U6 o H1 dirigido a una secuencia del nucleótido 19 en el ARNm del receptor de LDL, 2) un casete de gen resistente a la puromicina, y 3) dos secuencias aisladoras de flanqueo. El vector dirigido basado en transposón es cotransfectado con plásmido que expresa transposasa en cultivos de fibroblastos fetales Yucatán. El vector retroviral es transducido en cultivos de fibroblastos fetales Yucatán. Los fibroblastos se cultivan en presencia de puromicina. Los clones resistentes son cribados para una eficiente regulación reductora del ARNm del receptor de LDL y de la proteína. Los cerdos de tamaño miniatura Yucatán de expresión disminuida del receptor de LDL son creados a partir de células transgénicas por clonación "artesanal".
Identificación de los ARNhc eficaces
En este ejemplo, se crea un modelo de la aterosclerosis de tamaño humano por desarrollo de cerdos de tamaño miniatura Yucatán de ingeniería genética en los que las moléculas efectoras de ARN dirigidas contra el receptor LDL endógeno inducen una depuración defectuosa de la lipoproteína y de la hipercolesterolemia.
Diez plásmidos que expresan ARNhc dirigidos a diferentes secuencias del nucleótido 19 en el ARNm del receptor de LDL del cerdo de tamaño miniatura Yucatán y un pSUPER.retro.puro de control que expresa un ARNhc irrelevante se creó en el pSUPER.retro.puro (Oligoengine) utilizando las recomendaciones del fabricante.
Tabla 2.
- Dianas para ARNhc dirigido al receptor LDL con expresión disminuida
- Primera base en la secuencia AF065990 de ADNc de cerdo
- Secuencia
- T1
- 763 tgtcaaagcggcgagtgca
- T2
- 889 tcccatatctgcaatgacc
- T3
- 1150 accctggaccgtagtgagt
- T4
- 1308 tgacaccattattggcgaa
- T5
- 1309 gacaccattattggcgaag
- T6
- 1439 agactctcttccaagagaa
- T7
- 1553 tgaacggagtggacgtcta
- T8
- 1814 tcacaggctcggacataca
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plásmido bacteriano que pueden tener un efecto perjudicial en la actividad del locus a lo largo del tiempo. En una segunda etapa de modificación este vector puede servir como una diana para la inserción de uno o más casetes de expresión génica en un locus bien caracterizado.
Construcción del vector
El vector basado en el trasposón SB usado en este estudio era derivado del vector pSBT/SV40-GFIP.IoxP. Este vector contiene, dentro del contexto de un transposón SB, un casete bicistrónico FRTeGFP-IRES-puro (GFIP) flanqueado aguas arriba por un codón de iniciación ATG y aguas abajo por una secuencia poli(A). Además, el vector contiene un sitio de reconocimiento para la recombinasa Cre (loxP) situado entre la repetición invertida superior del vector y el promotor SV40 que controla la expresión del casete FRTeGFP-IRES-puro.
Construcción del vector pSBT/SV40-GFIP.loxP
El vector pSBT/RSV-GFIP contiene la terminal invertida del transposón de ADN SB que flanquea un casete de gen bicistrónico de FRT-GFP.IRES.puro controlado por un promotor derivado del virus del sarcoma de Rous (RSV). La secuencia eGFP se amplificó a partir de peGFP.N1 (Clontech) utilizando un cebador directo que contenía la secuencia de FRT de 48-pb. Para analizar la funcionalidad FRT-GFP, la fusión FRT-eGFP se insertó en un vector de expresión que contenía el promotor SV40. El fragmento PCR que contiene el gen de fusión eGFP etiquetado FRT era digerido con Mlul y Xmal e insertado en pSBT/RSV-hAAT digerido con Mlul/Xmal (pT/hAAT en ref. (8), obtenido de Mark Kay, Stanford University, EE.UU.), generando un vector transposón con la expresión de eGFP controlada por el RSV (pSBT/RSV-eGFP). Un casete IRES-puro era amplificado por la PCR de pecoenv-IRES-puro (proporcionado por Finn Skou Pedersen, University of Aarhus, Dinamarca), digerido con Xmal, e insertado en pSBT/RSV-eGFP digerido con Xmal, generando pSBT/RSV-GFIP (véase la Fig 6). Se generaron versiones alternativas de este vector que contenían el promotor SV40 (pSBT/SV40-GFIP) y el promotor derivado del gen de la ubiquitina humana (pSBT/Ubi-GFIP). Además, insertando un sitio diana de recombinación Cre (loxP) en el sitio Mlul situado entre la repetición invertida izquierda del transposón y el promotor SV40 de pSBT/SV40-GFIP, se creó el vector pSBT/SV40-GFIP.loxP. El plásmido pcADN5/FRT donante, que contenía un gen de fusión FRT-hygro sin un codón de iniciación, se obtenía de Invitrogen. El plásmido codificante de Flp, pCMV-Flp, se obtuvo de A. Francis Stewart, University of California San Francisco, EE.UU.). Este plásmido codifica la variante de Flp potenciada designada Flpx9 (11). Un vector SB que contiene dos copias del elemento (12, 13) aislador derivado del sitio 4 (cHS4) hipersensible de la ADNasa de pollo de 1,2-kb se generaba insertando secuencias de cHS4 amplificadas por PCR y un ligador intercalado en pSBT/PGK-puro (obtenido de Mark Kay, Stanford University, EE.UU.) digerido por NotI/SpeI. El casete PGK-puro fue retroclonado en la construcción utilizando sitios de restricción situados en el ligador, generando pSBT/cHS4.PGK-puro.cHS4
Para uso adicional en los cerdos se insertó un sitio (loxP-257) de reconocimiento Cre alternativo en un único sitio AscI que se creó por mutagénesis en una posición situada entre la secuencia poli(A) y la repetición invertida inferior del vector. Este vector se designó pSBT/loxP.SV40-GFIP.loxP257. La presencia de dos sitios de recombinación Cre permite el intercambio de casete mediada con recombinasa Cre después de inserción del plásmido basado en Flp, facilitando de ese modo, si se necesita, la eliminación de secuencias de plásmido y genes de selección.
Transposición de SB en fibroblastos primarios de cerdo
Los vectores transposón de SB, bien SBT/PGK-puro o bien el transposón diana SBT/loxP.RSV-GFIP.loxP257, se insertaron en el genoma del fibroblasto del cerdo mediante la cotransfección (utilizando Fugene-6 de Roche) de 1,5 µg pSBT/lox.RSV-GFIP.loxP257 (o pSBT/PGK-puro) con 1,5 µg de pCMV-SB (o 1,5 µg de pCMV-mSB como un control negativo ). El pCMV-SB (derechos de concesión por Perry Hackett, University of Minnesota, Minnesota, EE.UU.) codifica la transposasa Sleeping Beauty reconstruida de elementos transponibles de ADN fósil de pescado salmoide. El pCMV-SB, pCMV-mSB, y la variante hiperactiva pCMV-HSB3 se obtuvieron de Mark Kay, Stanford University, EE.UU. Clones de células marcadas con SB aparecieron como resultado de seleccionar células transfectadas con puromicina (0,5 µg/ml). Las colonias se fijaron y tiñeron en azul de metileno en metanol y posteriormente se contabilizaron.
Transposición de SB sólido en fibroblastos primarios de cerdo
La SB se transpone eficientemente en la mayoría de las células de mamíferos pero con mayor eficacia en células humanas que en células de murino. La transposición de vectores de la SB no se ha analizado nunca en células porcinas, y los autores de la invención han probado inicialmente la actividad en fibroblastos primarios del cerdo. Los autores de la invención han utilizado un trasposón estándar que codifica un gen con resistencia a la puromicina (SBT/PGK-puro) y encontraron niveles decentes de transposición, dando como resultado aproximadamente 75 colonias resistentes al fármaco en cultivos de fibroblastos cotransfectados con pSBT/PGK-puro y pCMV-SB (Fig. 7). Menos de 3 colonias aparecieron después de la transfección con pSBT/PGK-puro y pCMV-mSB, codificando el último una versión inactiva de la transposasa. Curiosamente, se obtuvo una media de casi 140 colonias utilizando la variante HSB3 de transposasa hiperactiva, que indica que HSB3 también en células porcinas intermedian mayores niveles de la transposición comparados con la transposasa SB original.
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anteriormente, con un cuidadoso cambio del medio en Día 2 sin retirar los embriones de los WOW. La tasa de blastocisto se registró en Día 7. Para determinar los números de células totales, los blastocistos fueron fijados y montados en una lámina de vidrio de microscopio en glicerol que contenía 20 µg/µl de fluorocromo Hoechst 33342. Después de tinción durante 24 horas, los embriones se observaron bajo un microscopio invertido Diaphot 200 con un accesorio epifluorescente y filtro de UV-2A (Nikon, Tokio, Japón).
10.1
Diferencias en capacidad de desarrollo entre ovocitos derivados de cerdas adultas (2,5 años, 170 kg de peso) y de ovocitos derivados de cerdas jóvenes (5,56 meses, 75 kg de peso) se investigaron a través de la PA de ZF y de ZI después de 44 h de maduración in vitro. Se investigaron cuatro grupos combinados en 3 réplicas idénticas: (1) ovocitos ZF de cerdas adultas (2) ovocitos ZI de cerdas adultas (3) ovocitos ZF de cerdas jóvenes (4) ovocitos ZI de cerdas jóvenes. Para activación de la ZF, se aplicó un único pulso de CC de 0,85 kV/cm durante 80 µs, mientras un único pulso de 1,25 kV/cm se empleó para activar ovocitos ZI. Después de 7 días de cultivo como se ha descrito anteriormente, se determinó el porcentaje de blastocistos por embrión activado.
Se investigó la capacidad de desarrollo in vitro de ovocitos partenogenéticamente activados derivados bien de cerdas adultas o de cerdas jóvenes. Como se muestra en la Tabla 3, las tasas de blastocisto de ovocitos de cerdas partenogenéticamente activados fueron significativamente superiores que los de cerdas jóvenes, después de la PA tanto de ZF como de ZI.
Tabla 3
- Desarrollo del blastocisto de ovocitos de cerdas adultas o de cerdas jóvenes el Día 7 partenogenéticamente activados
- Zona Libre
- Zona Intacta
- Nº de ovocitos activados
- Nº de blastocistos (%)* Nº de ovocitos activados Nº de blastocistos (%)*
- Cer da
- 103 43 (42 ± 4)a 110 61 (55 ± 6)c
- Cer da jove n
- 85 17 (20 ± 2)b 137 36 (26 ± 5)d
- a,b,c Los diferentes superíndices indican diferencias significativas (p < 0,05). c,d Los diferentes superíndices indican diferencias significativas (p < 0,05). * Porcentaje (Media ± S.E.M) de embriones desarrollados frente a blastocistos.
La diferencia en la capacidad de desarrollo de ovocitos entre cerdas adultas y cerdas jóvenes se ha examinado en la producción in vitro (IVP) y en los embriones de la transferencia nuclear de la célula somática (SCNT) de forma separada, dando como resultado una conclusión similar como en la publicación anterior de otros grupos de investigación (Sherrer, et al., 2004; Hyun, et al., 2003), es decir, que los embriones de ovocitos derivados de cerdas adultas son superiores a los ovocitos derivados de cerdas jóvenes en apoyar el desarrollo del blastocisto. Aunque las cerdas jóvenes empleadas en el estudio de los autores de la invención estaban al borde de la madurez, la diferencia entre proporciones de blastocisto en Día 7 después de la PA era significativa, demostrando la superior capacidad de desarrollo de los ovocitos de cerdas adultas.
10.2
La factibilidad de la HMC porcina modificada se investigó en 6 réplicas idénticas, con IVF y en paralelo con la PA de la ZF como controles. Los ovocitos de cerda adulta (de acuerdo con el Ejemplo 1), más competentes, se usaron en el Ejemplo 2. Siete días después de la reconstrucción y/o de la activación, se determinó el número de blastocistos por embrión reconstruido y el número total de células de blastocistos seleccionados aleatoriamente.
Más del 90 % de fragmentos de ovocito derivados de ovocitos morfológicamente intactos pudieron ser recuperados por HMC después de la trisección. De media, pudieron reconstruirse 37 embriones de 100 ovocitos maduros. La capacidad de desarrollo de todas las fuentes de embriones porcinos se muestra en la Tabla 4. En Día 7, el desarrollo de los embriones reconstruidos en el estadio de blastocisto era de 17 ±4 % con un número medio de
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(media ± S.E.M), que es significativamente mayor (p<0,01) para HMC que la de TC realizada en paralelo en el laboratorio de los autores de la invención (Tabla 9) y también la mayor de la que se haya informado nunca en la clonación del cerdo.
Tabla 9
- Desarrollo de embriones in vitro producidos a partir de clonación artesanal y clonación tradicional
- Grupo
- Donante de célula somática Nº de embriones reconstruidos Tasa de la división (%) Tasa de blastocisto (%)
- HMC
- LW1-2 643 83,7 ± 4,90 a 50,06 ± 2,80 a
- TC
- LW2 831 74,86 ± 13,16 b 28,98 ± 2,84 b
- a, b, Los valores de superíndices diferentes dentro de las columnas son significativamente diferentes (p < 0,05). *: media ± S.E.M.
5
Blastocistos mixtos producidos a partir tanto de HMC como TC se transfirieron quirúrgicamente a 11 cerdas adultas sincronizadas de forma natural en Día 4 o 5 del ciclo estral. Seis (55 %) receptoras fueron diagnosticadas de embarazo mediante ultrasonografía, 2 abortados y en el momento de escribir esto 2 habían parido 3 y 10 lechones, respectivamente. Un tamaño de camada de 10 lechones clonados es, de acuerdo con los autores de la invención, el
10 mayor tamaño de camada logrado hasta ahora en la clonación del cerdo. Todos están sanos y se comportan normalmente excepto uno que muestra una flexión rígida de la unión distal de una pata delantera. %).
De forma preliminar, los resultados sugieren que cuando se transfirieron embriones de etapas similares, las receptoras en Día 4 del ciclo estral soportaron el establecimiento del embarazo mejor que los del Día 5 (Tabla 10).
Tabla 10. Desarrollo in vivo de embriones porcinos clonados
- Embriones transferidos
- Nº de lechones nacidos
- Número del receptor
- Embrión HMC Embrión TC Etapas del embrión (Día) Ciclo del receptor (Día) Estado del embarazo Lechones a partir de HMC Nº Lechones a partir de TC Duración de la gestación (Día)
- 1327
- 22 10 D5,6,7 4 Y 2 1 116
- 1539
- 36 10 D7 4 Y 8 2 115
- 1309
- 30 28 D5,6 4 Y
- 1553
- 45 44 D5,6 4 Y
- 1668
- 48 18 D5,6 5 Y, abortado
- 1428
- 78 22 D5,6 5 Y, abortado
- 1725
- 44 4 D5,6,7 5 N - - -
- 1643
- 22 11 D5,6,7 4 N - - -
- 1520
- 30 26 D5,6 4 N - - -
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ApoE de Sus scrofa
- LOCUS
- SSU70240 4267 pb ADN lineal MAM 10-AGO-1998
- DEFINICIÓN
- Gen apolipoproteina E (Apo-E) de Sus scrofa, CDS completa.
- ACCESO
- U70240
- VERSIÓN
- U70240.1 GI:2388608
- PALABRAS CLAVE
- .
- FUENTE
- Sus scrofa (cerdo)
- ORGANISMO
- Sus scrofa
- Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; mamíferoia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Suina;Suidae; Sus.
E08715609
10-09-2015 E08715609
- REFERENCIA
- 1 (bases 1 a 4267)
- AUTORES
- Ramsoondar, J.J., Rucker, E.B., Vasquez, J.C., Gallagher, D.S., Grimm, D.R., Lunney, J.K., Schook, L.B. y Piedrahita, J.A.
- TÍTULO
- Isolation and genetic characterization of the porcine apoliprotein E gene.
- PUBLICACIÓN
- Anim. Genet. 29 (1), 43-47 (1998)
- PUB. MED.
- 9682450
- REFERENCIA
- 2 (bases 1 a 4267)
- AUTORES
- Ramsoondar, J.J. y Piedrahita, J.A.
- TÍTULO
- Presentación Directa
- PUBLICACIÓN
- Presentado (10-SEP-1996) VAPH, Texas A&M University, College Station, TX 77843, EE.UU.
- CARACTERÍSTICAS
- Lugar/Calificadores
- fuente
- 1..4267
- /organismo="Sus scrofa"
- /tipo_de_molécula="ADN genómico"
- /xref_de_bd="taxón:9823"
- gen
- 832..3879
- /gen="Apo-E"
- ARNm
- unión(832..857, 1686..1728, 2473..2662, 3037..879)
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- exón
- 832..857
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- /número=1
- intrón
- 858..1662
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- exón
- 1663..1728
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10-09-2015
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- CDS
- unión (1686..1728, 2473..2662, 3037..3757)
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- /nota="lipoproteína en plasma"
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- /producto="apolipoproteína-E"
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- intrón
- 1729..2472
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- /número=2
- exón
- 2473..2662
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- /número=3
- intrón
- 2663..3036
- /gen="Apo-E"
- /número=3
- exón
- 3037..3879
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E08715609
10-09-2015 E08715609
- ACCESO
- U70240
- VERSIÓN
- U70240.1 GI:2388608
- PALABRAS CLAVE
- .
- FUENTE
- Sus scrofa (cerdo)
- ORGANISMO
- Sus scrofa
- Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; mamíferoia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Suina;Suidae; Sus.
- REFERENCIA
- 1 (bases 1 a 4267)
- AUTORES
- Ramsoondar, J.J., Rucker, E.B., Vasquez, J.C., Gallagher, D.S., Grimm, D.R., Lunney, J.K., Schook, L.B. y Piedrahita, J.A.
- TÍTULO
- Isolation and genetic characterization of the porcine apoliprotein E gene
- PUBLICACIÓN
- Anim. Genet. 29 (1), 43-47 (1998)
- PUB. MED.
- 9682450
- REFERENCIA
- 2 (bases 1 a 4267)
- AUTORES
- Ramsoondar, J.J. y Piedrahita, J.A.
- TÍTULO
- Presentación Directa
- PUBLICACIÓN
- Presentado (10-SEP-1996) VAPH, Texas A&M University, College Station, TX 77843, EE.UU.
- CARACTERÍSTICAS
- Lugar/Calificadores
- fuente
- 1..4267
- /organismo="Sus scrofa"
- /tipo_de_molécula="ADN genómico"
- /xref_de_bd="taxón:9823"
- gen
- 832..3879
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- 1663..1728
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- 1729..2472
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- /número=2
- exón
- 2473..2662
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- intrón
- 2663..3036
10-09-2015
- /gen="Apo-E"
- /número=3
- exón
- 3037..3879
- /gen="Apo-E"
- /número=4
Homo sapiens
- LOCUS
- AF261279 5491 pb ADN lineal PRI 27-OCT-2000
- DEFINICIÓN
- Gen apolipoproteína-E de homo sapiens, CDS completo.
- ACCESO
- AF261279
- VERSIÓN
- AF261279.1 GI:11034800
- PALABRAS CLAVE
- .
- FUENTE
- Homo sapiens (humano)
- ORGANISMO
- Homo sapiens
- Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; mamíferoia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini; Catarrhini; Hominidae; Homo.
- REFERENCIA
- 1 (bases 1 a 5491)
- AUTORES
- Nickerson, D.A., Taylor, S.L., Fullerton, S.M., Weiss, K.M., Clark, A.G., Stengard, J.H., Salomaa, V., Boerwinkle, E. y Sing, C.F.
- TÍTULO
- Sequence diversity and large-scale typing of SNPs in the human apoliprotein E gene
- PUBLICACIÓN
- Genome Res. 10 (10), 1532-1545 (2000)
- PUB. MED.
- 11042151
- REFERENCIA
- 2 (bases 1 a 5491)
- AUTORES
- Nickerson, D.A.
- TÍTULO
- Presentación Directa
- PUBLICACIÓN
- Presentado (27-ABR-2000) en el Department of Molecular Biotechnology, University of Washington, Box 357730, Seattle, WA 98195, EE.UU.
- CARACTERÍSTICAS
- Lugar/Calificadores
E08715609
10-09-2015 E08715609
- fuente
- 1..5491
- /organismo="Homo sapiens"
- /tipo_de_molécula="ADN genómico"
- /xref_de_bd="taxón:9606"
- /cromosoma="19"
- /mapa="19q13.2"
- región de repetición
- <3.>108
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- 73
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10-09-2015 E08715609
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- 471
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- satélite
- <638.>718
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- /tipo_de_rpt= tándem
- variación
- 832
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- /reemplazar="t"
- ARNm
- unión (1060..1094, 1855..1920, 3013..3205, 3786..4645)
- /producto="apolipoproteína-E"
- variación
- 1163
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- variación
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10-09-2015 E08715609
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- variación
- 1575
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- CDS
- unión (1878..1920, 3013..3205, 3786..4503)
- /nota="APOE"
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- /id_de_proteína= "AAG27089.1"
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- 1998
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- <2124.>2435
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- región_de_repetici
- <2569.>2848
10-09-2015 E08715609
- ón
- /nota="putativo"
- /familia_de_rpt="Alu"
- /tipo_de_rpt= dispersado
- variación
- 2907
- /frecuencia="0,01"
- /reemplazar="g"
- variación
- 3106
- /frecuencia="0,01"
- /reemplazar="c"
- región_de_repetici ón
- <3472.>3588
- /nota="putativo"
- /familia_de_rpt="Alu"
- /tipo_de_rpt= dispersado
- variación
- 3673
- /frecuencia="0,01"
- /reemplazar="g"
- variación
- 3701^3702
- /frecuencia="0,01"
- /reemplazar="ct"
- variación
- 3937
- /frecuencia="0,14"
- /reemplazar="c"
- variación
- 4036
- /frecuencia="0,01"
- /reemplazar="t"
10-09-2015
- variación
- 4075
- /frecuencia="0,07"
- /reemplazar="t"
- región_de_repetici ón
- <4755.>5056
- /nota="putativo"
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- región_de_repetici ón
- <5065.>5476
- /nota="putativo"
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- /tipo_de_rpt= dispersado
- variación
- 5229^5230
- /frecuencia="0,03"
- /reemplazar="gg"
- variación
- 5229
- /frecuencia="0,07"
- /reemplazar="t"
- variación
- 5229^5230
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- variación
- 5230
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- /reemplazar=""
- variación
- 5361
- /frecuencia="0,06"
- /reemplazar="c"
E08715609
10-09-2015
- LOCUS
- NM_000041 1223 pb ARNm lineal PRI 18-FEB-2007
- DEFINICIÓN
- Apolipoproteína E (APOE) de Homo sapiens, ARNm.
- ACCESO
- NM_000041
- VERSIÓN
- NM_000041.2 GI:48762938
- PALABRAS CLAVE
- .
- FUENTE
- Homo sapiens (humano)
- ORGANISMO
- Homo sapiens
- Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
- mamíferoia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;
- Catarrhini; Hominidae; Homo.
- REFERENCIA
- 1 (bases 1 a 1223)
- AUTORES
- Mullick, A.E., Powers, A.F., Kota, R.S., Tetali, S.D., Eiserich, J.P. y Rutledge, J.C.
- TÍTULO
- Apoliprotein E3-and nitric oxide-dependent modulation of endothelial cell inflammatory responses
- PUBLICACIÓN
- Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (2), 339-345 (2007)
- PUB. MED.
- 17138935
- OBSERVACIONES
- GeneRIF: los datos sugieren un papel de la apoE3 en la pared vascular para equilibrar el estado redox intracelular en células endoteliales dañadas a través de vías de paso NO dependientes
- REFERENCIA
- 2 (bases 1 a 1223)
- AUTORES
- Gupta, V., Narayanaswami, V., Budamagunta, M.S., Yamamato,T., Voss, J.C. y Ryan, R.O.
- TÍTULO
- Lipid-induced extension of apoliprotein E helix 4 correlates with low density lipoprotein receptor binding ability
- PUBLICACIÓN
- J. Biol. Chem. 281 (51), 39294-39299 (2006)
- PUB. MED.
- 17079229
- OBSERVACIONES
- GeneRIF: análisis de las propiedades de apoE de reconocimiento del LDLR
- REFERENCIA
- 3 (bases 1 a 1223)
- AUTORES
- Pei, W.D., Zhang, Y.H., Sun, Y.H., Gu, Y.C., Wang, Y.F., Zhang, C.Y.,
- Zhang, J., Liu, L.S., Hui, R.T., Liu, Y.Q. y Yang, Y.J.
- TÍTULO
- Apolipoprotein E polymorphism influences lipid phenotypes in
- Chinese families with familial combined hyperlipidemia
- PUBLICACIÓN
- Circ. J. 70 (12), 1606-1610 (2006)
- PUB. MED.
- 17127808
- OBSERVACIONES
- GeneRIF: El polimorfismo de ApoE parece estar asociado con la varianza del fenotipo de la lipoproteína en familias chinas con hiperlipidemia combinada familiar.
- REFERENCIA
- 4 (bases 1 a 1223)
- AUTORES
- Olarte, L., Schupf, N., Lee, J.H., Tang, M.X., Santana, V., Williamson, J., Maramreddy, P., Tycko, B. y Mayeux, R.
- TÍTULO
- Apoliprotein E epsilon4 and age at onset of sporadic and familial
- Alzheimer disease in Caribbean Hispanics
- PUBLICACIÓN
- Arch. Neurol. 63 (11), 1586-1590 (2006)
- PUB. MED.
- 17101827
- OBSERVACIONES
- GeneRIF: Individuos con historia familiar de EA y el
- APOE
- alelo épsilon4, factores adicionales genéticos o medioambientales pueden
- acelerar el comienzo de la demencia.
- REFERENCIA
- 5 (bases 1 a 1223)
- AUTORES
- Christidis, D.S., Liberopoulos, E.N., Kakafika, A.I., Miltiadous, G.A.,
- Cariolou, M., Ganotakis, E.S., Mikhailidis, D.P. y Elisaf, M.S.
- TÍTULO
- The effect of apoliprotein E polymorphism on the response to
- lipid-lowering treatment with atorvastatin or fenofibrate
- PUBLICACIÓN
- J. Cardiovasc. Pharmacol. Ther. 11 (3), 211-221 (2006)
- PUB. MED.
- 17056835
- OBSERVACIONES
- GeneRIF: Había una clara asociación entre el polimorfismo de apolipoproteína E en respuesta a la disminución de lípidos por tratamiento con atorvastatina y fenofibrato en pacientes con diferentes tipos de dislipidemia.
- REFERENCIA
- 6 (bases 1 a 1223)
- AUTORES
- Lohse, P., Brewer, H.B. III, Meng, M.S., Skarlatos, S.I., LaRosa, J.C. y Brewer, H.B. Jr.
- TÍTULO
- Familial apoliprotein E deficiency and type III hyperlipoproteinemia due to a premature stop codon in the apoliprotein E gene
- PUBLICACIÓN
- J. Lipid Res. 33 (11), 1583-1590 (1992)
- PUB. MED.
- 1361196
- REFERENCIA
- 7 (bases 1 a 1223)
- AUTORES
- Moriyama, K., Sasaki, J., Matsunaga, A., Arakawa, F., Takada, Y., Araki, K., Kaneko, S. y Arakawa, K.
- TÍTULO
- Apoliprotein E1 Lys-146----Glu with type III hyperlipoproteinemia
- PUBLICACIÓN
- Biochim. Biophys. Acta 1128 (1), 58-64 (1992)
- PUB. MED.
- 1356443
- REFERENCIA
- 8 (bases 1 a 1223)
- AUTORES
- Feussner, G., Funke, H., Weng, W., Assmann, G., Lackner, K.J. y
- Ziegler, R.
- TÍTULO
- Severe type III hyperlipoproteinemia associated with unusual apoliproteína E1 fenotipo and epsilon 1/'null' genotype
- PUBLICACIÓN
- Eur. J. Clin. Invest. 22 (9), 599-608 (1992)
- PUB. MED.
- 1360898
- REFERENCIA
- 9 (bases 1 a 1223)
- AUTORES
- Schuler, G., Hambrecht, R., Schlierf, G., Niebauer, J., Hauer, K.,
- Neumann, J., Hoberg, E., Drinkmann, A., Bacher, F., Grunze, M. et al.
- TÍTULO
- Regular physical exercesie and low-fat diet. Effects on progression of coronary artery disease
- PUBLICACIÓN
- Circulation 86 (1), 1-11 (1992)
- PUB. MED.
- 1617762
- REFERENCIA
- 10 (bases 1 a 1223)
- AUTORES
- Utermann, G., Pruin, N. y Steinmetz, A.
- TÍTULO
- Polymorphism of apolipoprotein E. III. Effect of a single polymorphic gene locus on plasma lipid levels in man
- PUBLICACIÓN
- Clin. Genet. 15 (1), 63-72 (1979)
- PUB. MED.
- 759055
- COMENTARIO
- SEC. REF. REVISADA: Este registro ha sido comisariado por el equipo del NCBI. La secuencia de referencia se derivaba de BU848796.1 y BC003557.1.
- El 16 de junio de 2004 esta versión de la secuencia sustituyó la gi:4557324.
- Resumen: Restos de quilomicrón y restos de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL)
- son rápidamente eliminados de la circulación por
- endocitosis mediada por receptor en el hígado. La apolipoproteína E, una apoproteína principal del quilomicrón, enlaza con un receptor específico en las células hepáticas y en células periféricas. La ApoE es esencial para el catabolismo normal de constituyentes de la lipoproteína ricos en triglicéridos.
- El gen ApoE es cartografiado en el cromosoma 19 en una agrupación con APOC1 y APOC2.
- Los defectos en la apolipoproteína E dan como resultado disbetalipoproteinemia familiar, o hiperlipoproteinemia tipo III (HLP III), en las que un aumento de colesterol y triglicéridos en el plasma son la
- consecuencia de la depuración defectuosa de los restos de quilomicrón y de VLDL.
- Nota de la Publicación: Este registro de Sec. de Ref. incluye un subconjunto de las publicaciones que están disponibles para este gen. Por favor véase el registro Entrez Gene para acceder a publicaciones adicionales. EXHAUSTIVIDAD: completo en el extremo 3'.
CARACTERÍSTICAS
- CARACTERÍSTICAS
- Lugar/Calificadores
- fuente
- 1..1223
- /organismo="Homo sapiens"
- /tipo_de_molécula="ARNm"
- /xref_de_bd="taxón:9606"
- /cromosoma="19"
- /mapa="19q13.2"
- gen
- 1..1223
- /gen="APOE"
- /nota="apolipoproteína E; sinónimos: AD2, MGC1571,
- apoproteína"
- /xref_de_bd="genID:348"
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- /xref_de_bd="MIM:107741"
- CDS
- 84..1037
- /gen="APOE"
- /componente_en_la_OG="quilomicrón; citoplasma [pmid 9622609];
- zona extracelular [pmid 9622609] [pmid 14718574]"
- /función_en_la_OG="actividad antioxidante [pmid 14587032];
- enlace del receptor de la apolipoproteína E [pmid 12729008];
- enlace beta-amiloide [pmid 11305869]; enlace de heparina
- [pmid 12729008]; actividad de transportador de lípidos; enlace fosfolípido
- [pmid 40667131; enlace de la proteina tau [pmid 9622609]"
- /proceso_de_la_OG="homeostasis de colesterol [pmid 9622609];
- circulación [pmid 14506116]; organización citoesquelética y
- biogénesis [pmid 9622609]; inducción de la apoptosis [transporte pmid
- 12753088]; transporte intracelular [pmid 9622609];
- aprendizaje y/o memoria [pmid 9622609]; regulación lípida de axón
- [pmid 9622609]; metabolismo de la lipoproteína [pmid 12729008];
- tetramerización de la proteína [pmid 4066713]; extensión sináptica
- [pmid 9622609]; regulación de la elasticidad neuronal
- [pmid 9622609]; respuesta a la especie oxígeno reactivo
- [pmid 117439991; transmisión sináptica, colinérgica [pmid 9622609]"
- /nota="enfermedad de Alzheimer tipo 2 (asociada a APOE*E4, aparición tardía)
- ; apolipoproteína E3"
- /inicio_de_codón=1
- /producto="precursor del apolipoproteína E"
- /id_de_proteína= "NP_000032.1"
- /xref_de_bd=".GI:4557325"
- /xref_de_bd="CCDS:CCDS12647.1"
- /xref_de_bd="Id_del_gen:348"
- /xref_de_bd="HGNC:613"
- /xref_de_bd="HPRD:00135"
- /xref_de_bd="MIM:107741"
- imagen38
- péptido_señal
- 84..137
- /gen="APOE"
- péptido_maduro
- 138..1034
- /gen="APOE"
- /producto="apolipoproteína E"
- STS
- 249..356
- /gen="APOE"
- /nombre_estándar="PMC99927P2"
- /xref_de_bd="UniSTS:273705"
- STS
- 342..640
- /gen="APOE"
- /nombre_estándar="GDB:171177"
- /xref_de_bd="UniSTS:154776"
- STS
- 375..640
- /gen="APOE"
- /nombre_estándar="GDB:181693"
- /xref_de_bd="UniSTS:155329"
- STS
- 404..631
- /gen="APOE"
- /nombre_estándar="GDB:169570"
- /xref_de_bd="UniSTS:154765"
- STS
- 407..632
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- /nombre_estándar="GDB:438097"
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- STS
- 408..678
- /gen="APOE"
- /nombre_estándar="GDB:196979"
- /xref_de_bd="UniSTS:155901"
- STS
- 417..746
- /gen="APOE"
- /nombre_estándar="GDB:177380"
- /xref_de_bd="UniSTS:154875"
- STS
- 417..634
- /gen="APOE"
- /nombre_estándar="PMC117303P1"
- /xref_de_bd="UniSTS:270328"
- STS
- 609..752
- /gen="APOE"
- /nombre_estándar="STS-N29699"
- /xref_de_bd="UniSTS:34644"
- STS
- 736..936
- /gen="APOE"
- /nombre_estándar="PMC310963P4"
- /xref_de_bd="UniSTS:272827"
- STS
- 823..954
- /gen="APOE"
- /nombre_estándar="RH11470"
- /xref_de_bd="UniSTS:72925"
- STS
- 919.1049
- /gen="APOE"
- /nombre_estándar="STS-K00396"
- /xref_de_bd="UniSTS:64138"
- señal_poliA
- 1155..1160
- /gen="APOE"
- sitio_poliA
- 1180
- /gen="APOE"
ORIGEN
SEQ ID Nº: 3 Secuencia ADNc del receptor de LDL
- Sus scrofa
- ARNm del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR), alelo LDLR-N, sec. codif. parcial.
- ACCESO
- AF065990
- VERSIÓN
- AF065990.1 GI:3153894
- PALABRAS CLAVE
- .
- FUENTE
- Sus scrofa (cerdo)
- ORGANISMO
- Sus scrofa
- Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
- mamíferoia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Suina; Suidae;
- Sus.
- REFERENCIA
- 1 (bases 1 a 2403)
- AUTORES
- Hasler-Rapacz, J., Ellegren, H., Fridolfsson, A.K., Kirkpatrick, B.,
- Kirk, S., Andersson, L. y Rapacz, J.
- TÍTULO
- Identification of a mutation in the low density lipoprotein
- Sus scrofa
- ARNm del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR), alelo LDLR-N, sec. codif. parcial.
- receptor gene associated with recessive familial hypercholesterolemia in swine
- PUBLICACIÓN
- Am. J. Med. Genet. 76 (5), 379-386 (1998)
- PUB. MED.
- 9556295
- REFERENCIA
- 2 (bases 1 a 2403)
- AUTORES
- Hasler-Rapacz, J., Ellegren, H., Fridolfsson, A.K., Kirkpatrick, B.,
- Kirk, S., Andersson, L. y Rapacz, J.
- TÍTULO
- Presentación Directa
- PUBLICACIÓN
- Presentado (16-MAY-1998) en Genetics & Animal Science, University of
- Wisconsin, 1675 Observatory Drive, Madison, WI 53706, EE.UU.
- CARACTERÍSTICAS
- Lugar/Calificadores
- fuente
- 1..2403
- /organismo="Sus scrofa"
- /tipo_de_molécula="ARNm"
- /xref_de_bd="taxón:9823"
- /cromosoma="2"
- /mapa="2q; cerca del centrómero"
- /tipo_de_tejido="hígado"
- gen
- <1.>2403
- /gen="LDLR"
- /alelo="N (normal)"
- CDS
- <1.>2403
- /gen="LDLR"
- /alelo="N (normal)"
- /nota="receptor de LDL; normolipidémico"
- /inicio_de_codón=1
- Sus scrofa
- ARNm del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR), alelo LDLR-N, sec. codif. parcial.
- /producto="recetor de lipoproteína de baja densidad"
- /id_de_proteína= "AAC17444.1"
- /xref_de_bd="GI:3153895"
Claims (1)
-
imagen1
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|---|---|---|---|
| DK200700348 | 2007-03-07 | ||
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