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ES2544861T3 - Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen Eg5 - Google Patents

Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen Eg5 Download PDF

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ES2544861T3
ES2544861T3 ES07759825.8T ES07759825T ES2544861T3 ES 2544861 T3 ES2544861 T3 ES 2544861T3 ES 07759825 T ES07759825 T ES 07759825T ES 2544861 T3 ES2544861 T3 ES 2544861T3
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cell
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David Bumcrot
Pamela Tan
Hans-Peter Vornlocher
Anke Geick
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Alnylam Pharmaceuticals Inc
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Alnylam Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen Eg5 humano en una célula, en donde dicho ARNbc comprende al menos dos secuencias que son complementarias entre sí y en donde una hebra sentido comprende una primera secuencia y una hebra antisentido comprende una segunda secuencia que comprende una región de complementariedad que es completamente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica Eg5, en donde dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, en donde dicha parte de un ARNm que codifica Eg5 consiste en la secuencia UCGAGAAUCUAAACUAACU, y en donde dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa dicho Eg5, inhibe la expresión de dicho gen Eg5.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen Eg5
Solicitudes relacionadas 5
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional en EE UU No. 60/787.762, presentada el 31 de marzo, 2006 y la solicitud provisional en EE UU No. 60/870.259, presentada el 15 de diciembre, 2006.
Campo de la invención 10
Esta solicitud se refiere a ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), y su uso en mediar interferencia por ARN para inhibir la expresión del gen Eg5 y el uso del ARNbc para tratar procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5, tal como cáncer, solo o en combinación con un ARNbc que se dirige al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). 15
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Antecedentes de la invención
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El mantenimiento de las poblaciones celulares en un organismo está regido por los procesos celulares de división celular y muerte celular programada. En células normales, los sucesos celulares asociados con el inicio y 20 terminación de cada proceso están muy regulados. En enfermedad proliferativa, tal como cáncer, uno o ambos de estos procesos pueden estar alterados. Por ejemplo, una célula cancerosa puede haber perdido su regulación (control de los puntos de control) del ciclo de división celular mediante bien la sobreexpresión de un regulador positivo o la pérdida de un regulador negativo, tal vez por mutación.
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Alternativamente, una célula cancerosa puede haber perdido su capacidad de experimentar muerte celular programada mediante la sobreexpresión de un regulador negativo. Por tanto, hay una necesidad para desarrollar nuevos fármacos quimioterapéuticos que restaurarán los procesos de control de los puntos de control y muerte celular programada a las células cancerosas.
30
Un enfoque para el tratamiento de cánceres humanos es dirigirse a una proteína que es esencial para la progresión del ciclo celular. Para que el ciclo celular prosiga de una fase a la siguiente, se deben completar ciertos sucesos prerrequisitos. Hay puntos de control en el ciclo celular que imponen el orden apropiado de sucesos y fases. Uno de tales puntos de control es el punto de control del huso que se produce durante la fase de metafase de la mitosis. Las moléculas pequeñas que se dirigen a proteínas con funciones esenciales en mitosis pueden promover que el punto 35 de control del huso detenga las células en mitosis. De las moléculas pequeñas que paran las células en mitosis, las que muestran actividad antitumoral en clínica también inducen apoptosis, los cambios morfológicos asociados con la muerte celular programada. Un agente quimioterapéutico eficaz para el tratamiento del cáncer puede por tanto, ser uno que induzca el control de un punto de control y muerte celular programada. Desafortunadamente, hay pocos compuestos disponibles para controlar estos procesos dentro de la célula. La mayoría de los compuestos que se 40 sabe causan parada mitótica y apoptosis actúan como agentes de unión a tubulina. Estos compuestos alteran la inestabilidad dinámica de los microtúbulos e indirectamente alteran la función/estructura del huso mitótico causando de esta manera parada mitótica. Puesto que la mayoría de estos compuestos se dirigen específicamente a la proteína tubulina que es un componente de todos los microtúbulos, también pueden afectar a uno o más de los numerosos procesos celulares normales en los que los microtúbulos desempeñan un papel. Por tanto, también hay 45 una necesidad para moléculas pequeñas que se dirijan más específicamente a proteínas asociadas con células en proliferación.
Eg5 es una de varias proteínas motoras similares a cinesina que están localizadas en el huso mitótico y que se sabe se requieren para la formación y/o función del huso mitótico bipolar. Recientemente, hubo un artículo de una 50 molécula pequeña que altera la bipolaridad del huso mitótico (Mayer, T. U. et. al. 1999. Science 286(5441) 971-4, incorporado en el presente documento mediante referencia). Más específicamente, la molécula pequeña indujo la formación de un huso mitótico anómalo en donde una matriz monoastral de microtúbulos emanaba de un par central de centrosomas, con los cromosomas unidos a los extremos distales de los microtúbulos. La molécula pequeña se llamó “monastrol” por el haz monoastral. Este fenotipo de haz monoastral se había observado previamente en 55 células mitóticas que tenían la proteína motora Eg5 inmunológicamente disminuida. Este fenotipo de haz monoastral distintivo facilitó la identificación de monastrol como un inhibidor potencial de Eg5. En efecto, se mostró además que monastrol inhibe la motilidad dirigida por Eg5 de los microtúbulos en un ensayo in vitro. El inhibidor de Eg5 monastrol no tenía efecto aparente sobre el motor cinesina relacionado o sobre el/los motor(es) responsables del movimiento del aparato de golgi en la célula. Las células que muestran el fenotipo de haz monoastral bien por la 60 disminución inmunológica de Eg5 o inhibición de Eg5 por monastrol se detienen en la fase M del ciclo celular. Sin embargo, la parada mitótica inducida por la disminución inmunológica o inhibición de Eg5 es transitoria (Kapoor, T. M., 2000. J Cell Biol 150(5) 975-80). Tanto el fenotipo de haz monoastral como la parada del ciclo celular en mitosis inducidas por monastrol son reversibles. Las células se recuperan para formar un huso mitótico bipolar normal, para completar la mitosis y seguir a través del ciclo celular y proliferación celular normal. Estos datos sugieren que un 65 inhibidor de molécula pequeña de Eg5 que inducía una parada mitótica transitoria puede no ser eficaz para el
tratamiento de la proliferación de células cancerosas. No obstante, el descubrimiento de que monastrol produce parada mitótica es intrigante y por tanto hay una necesidad para estudiar e identificar adicionalmente compuestos que se pueden usar para modular la proteína motora Eg5 de una manera que fuera eficaz en el tratamiento de cánceres humanos. También hay una necesidad para explorar el uso de estos compuestos con otros agentes antineoplásicos. 5
VEGF (también conocido como factor de permeabilidad vascular, VPF) es una citoquina multifuncional que estimula la angiogénesis, proliferación de células epiteliales, y supervivencia de células endoteliales. VEGF se puede producir por una amplia variedad de tejidos, y su sobreexpresión o expresión anómala puede producir una variedad de trastornos, incluyendo cánceres y trastornos de retina tal como la degeneración macular senil y otros trastornos 10 angiogénicos.
Recientemente, se ha mostrado que moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) bloquean la expresión génica en un mecanismo regulador muy conservado conocido como interferencia por ARN (iARN). El documento WO 99/32619 (Fire et al.) divulga el uso de un ARNbc de al menos 25 nucleótidos de longitud para inhibir la expresión de genes en 15 C. elegans. También se ha mostrado que el ARNbc degrada el ARN diana en otros organismos, incluyendo plantas (véase, por ejemplo, el documento WO 99/53050, Waterhouse et al.; y el documento WO 99/61631, Heifetz et al.), Drosophila (véase, por ejemplo, Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200), y mamíferos (véase, el documento WO 00/44895, Limmer; y el documento DE 101 00 586.5, Kreutzer et al.). Este mecanismo natural se ha convertido ahora en el foco para el desarrollo de una nueva clase de agentes farmacéuticos para tratar trastornos que están 20 causados por la regulación anómala o indeseada de un gen.
A pesar de los avances significativos en el campo de la iARN y avances en el tratamiento de procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5, permanece una necesidad para un agente que pueda silenciar selectiva y eficazmente el gen Eg5 usando el propia maquinaria de iARN de la célula que tiene tanto alta actividad biológica 25 como estabilidad in vivo, y que pueda inhibir eficazmente la expresión de un gen Eg5 diana para su uso en tratar procesos patológicos mediados por la expresión Eg5.
Compendio de la invención
30
La invención se define en las reivindicaciones
La invención se refiere a ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), así como composiciones y métodos in vitro para inhibir la expresión del gen Eg5 en una célula o mamífero usando tal ARNbc, solo o en combinación con un ARNbc que se dirige a VEGF. La invención también proporciona composiciones y métodos para tratar estados patológicos y 35 enfermedades causadas por la expresión del gen Eg5, tal como en cáncer. El ARNbc de la invención comprende una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud, y es totalmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARNm del gen Eg5, dicha parte es como se define en las reivindicaciones.
40
En una forma de realización, la invención proporciona moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión del gen Eg5. El ARNbc comprende al menos dos secuencias que son complementarias entre sí. El ARNbc comprende una hebra sentido que comprende una primera secuencia y una hebra antisentido que comprende una segunda secuencia. La hebra antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que tiene totalmente complementaria a al menos parte de un ARNm que codifica Eg5, y la región de complementariedad es 45 menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud. El ARNbc, al ponerse en contacto con una célula que expresa Eg5, inhibe la expresión del gen Eg5 en al menos el 40%. Dicha parte de un ARNm que codifica Eg5 se define en las reivindicaciones.
Se describen moléculas de ARNbc que pueden estar compuestas de una primera secuencia del ARNbc que se 50 selecciona del grupo que consiste en las secuencias sentido de las tablas 1-3 y la segunda secuencia se selecciona del grupo que consiste en las secuencias antisentido de las tablas 1-3.
Las moléculas de ARNbc de la invención pueden estar compuestas de nucleótidos naturales o pueden estar compuestas de al menos un nucleótido modificado, tal como un nucleótido modificado con 2’-O-metilo, un nucleótido 55 que comprende un grupo 5’-fosforotioato, y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo. Alternativamente, el nucleótido modificado se puede elegir del grupo de: un nucleótido modificado con 2’-desoxi-2’-fluoro, un nucleótido modificado con 2’-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, nucleótido modificado con 2’-amino, nucleótido modificado con 2’-alquilo, nucleótido de morfolino, un fosforamidato, y un nucleótido que comprende una base no natural. Tal secuencia modificada se basa en una primera secuencia de 60 dicho ARNbc y una segunda secuencia como se define en las reivindicaciones.
En otra forma de realización, la invención proporciona una célula que comprende uno de los ARNbc de la invención. La célula generalmente es una célula de mamífero, tal como una célula humana.
65
En otra forma de realización, la invención proporciona una composición farmacéutica para inhibir la expresión del gen Eg5 en un organismo, generalmente un sujeto humano, que comprende uno o más de los ARNbc de la invención y un soporte farmacéuticamente aceptable o vehículo de administración.
En otra forma de realización, la invención proporciona un método in vitro para inhibir la expresión del gen Eg5 en 5 una célula, que comprende los siguientes pasos:
(a) introducir en la célula un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), en donde el ARNbc comprende al menos dos secuencias que con complementarias entre sí. El ARNbc comprende una hebra sentido que comprende una primera secuencia y una hebra antisentido que comprende una segunda secuencia. La hebra 10 antisentido comprende una región de complementariedad que es completamente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica Eg5, en donde la región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud, y en donde el ARNbc, al entrar en contacto con una célula que expresa Eg5, inhibe la expresión del gen Eg5 en al menos el 40%; y en donde dicha parte de un ARNm que codifica Eg5 se define en las reivindicaciones; y 15
(b) mantener la célula producida en el paso (a) durante un tiempo suficiente para obtener degradación del transcrito de ARNm del gen Eg5, inhibiendo de esta manera la expresión del gen Eg5 en la célula.
En otra forma de realización, la invención proporciona el ARNbc definido anteriormente, para su uso en tratar, prevenir o controlar procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5, por ejemplo, cáncer. Se describe la 20 administración a un paciente en necesidad de tal tratamiento, prevención o control de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los ARNbc de la invención.
En otra forma de realización, la invención proporciona vectores para inhibir la expresión del gen Eg5 en una célula, que comprende una secuencia reguladora operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica al 25 menos una hebra de uno de los ARNbc de la invención.
En otra forma de realización, la invención proporciona una célula que comprende un vector para inhibir la expresión del gen Eg5 en una célula. El vector comprende una secuencia reguladora operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una hebra de uno de los ARNbc de la invención. 30
En una forma de realización adicional, la invención proporciona el ARNbc de Eg5 y los usos del mismo como se describe anteriormente en combinación con un segundo ARNbc que se dirige al ARNm de VEGF. Una combinación de un ARNbc que se dirige a Eg5 y un segundo ARNbc que se dirige a VEGF proporciona actividad complementaria y sinérgica para tratar trastornos hiperproliferativos, particularmente carcinoma hepático. 35
Breve descripción de las figuras
No se presentan figuras.
40
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) como se define en las reivindicaciones, así como composiciones y métodos in vitro para inhibir la expresión del gen Eg5 en una célula o mamífero usando el ARNbc. La invención también proporciona composiciones para tratar estados patológicos y enfermedades en un 45 mamífero causadas por la expresión del gen Eg5 usando ARNbc. El ARNbc dirige la degradación específica de secuencia de ARNm a través de un proceso conocido como interferencia por ARN (iARN). La invención proporciona además este ARNbc en combinación con un segundo ARNbc que inhibe la expresión del gen VEGF.
Los ARNbc de la invención comprenden una hebra de ARN (al hebra antisentido) que tiene una región que tiene 50 menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud, y es totalmente complementaria a al menos una parte de un transcrito de ARNm del gen Eg5, dicha parte se ha definido anteriormente. El uso de estos ARNbc permite la degradación dirigida de los ARNm de genes que están implicados en la replicación y o el mantenimiento de células cancerosas en mamíferos. Usando ensayos celulares y animales, los presentes inventores han demostrado que dosis muy bajas de estos ARNbc pueden mediar específica y 55 eficazmente iARN, lo que produce una inhibición significativa de la expresión del gen Eg5. Por tanto, las composiciones de la invención que comprenden estos ARNbc son útiles para tratar procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5, por ejemplo, cáncer, dirigiéndose a un gen implicado en la división mitótica.
La siguiente descripción detallada divulga cómo hacer y usar el ARNbc y las composiciones que contienen el ARNbc 60 para inhibir la expresión del gen Eg5, así como composiciones para tratar enfermedades y trastornos causados por la expresión de Eg5, tal como cáncer, solo o en combinación con un segundo ARNbc que se dirige al gen VEGF. Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden un ARNbc que tienen una hebra antisentido que comprende una región de complementariedad que tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud, y es sustancialmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARN del gen 65
Eg5, junto con un soporte farmacéuticamente aceptable. Como se ha comentado anteriormente, tales composiciones pueden incluir además un segundo ARNbc que se dirige a VEGF.
Según esto, ciertos aspectos de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el ARNbc de la invención junto con un soporte farmacéuticamente aceptable, métodos in vitro de usar las composiciones para 5 inhibir la expresión del gen Eg5, y composiciones farmacéuticas para uso en tratar enfermedades causadas por la expresión del gen Eg5. La invención proporciona además las composiciones farmacéuticas anteriores que contienen además un segundo ARNbc diseñado para inhibir la expresión de VEGF.
I. Definiciones 10
Por conveniencia, el significado de ciertos términos y frases usados en la especificación, ejemplos, y reivindicaciones adjuntas, se proporcionan a continuación. Si hay una discrepancia aparente entre el uso de un término en otras partes de esta especificación y su definición proporcionada en esta sección, la definición en esta sección prevalece. 15
“G”, “C”, “A” y “U” cada una generalmente representa un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina o uracilo como una base, respectivamente. Sin embargo, se entenderá que el término “ribonucleótido” o “nucleótido” también se puede referir a un nucleótido modificado, como se detalla adicionalmente posteriormente, o una fracción de sustitución suplente. El experto en la materia sabe bien que guanina, citosina, adenina y uracilo se pueden sustituir 20 por otras fracciones sin alterar sustancialmente las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleótido que comprende un nucleótido que lleva tal fracción de sustitución. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como su base se puede aparear con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Por tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina, o adenina se pueden sustituir en las secuencias de nucleótidos de la invención por un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. Las secuencias que comprenden tales 25 fracciones de sustitución son formas de realización de la invención.
Como se usa en el presente documento, “Eg5” se refiere al miembro 11 de la familia de cinesina humana, que también se conoce como KIF11, Eg5, HKSP, KNSL1 o TRIP5. La secuencia de Eg5 se puede encontrar como NCBI GeneID: 3832, HGNC ID: HGNC:6388 y RefSeq ID número: NM_004523. 30
Como se usa en el presente documento, “secuencia diana” se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción del gen Eg5, incluyendo ARNm que es un producto del procesamiento de ARN de un producto de transcripción primario. La secuencia diana según la invención se define en las reivindicaciones. 35
Como se usa en el presente documento, VEGF, también conocido como factor de permeabilidad vascular, es un factor de crecimiento angiogénico. VEGF es una glucoproteína homodimérica de 45 kDa que existe en al menos tres isoformas diferentes. Las isoformas de VEGF se expresan en célula endoteliales. El gen de VEGF contiene 8 exones que expresan una isoforma de la proteína de 189 aminoácidos. Una isoforma de 165 aminoácidos carece de 40 los residuos codificados por el exón 6, mientras que una isoforma de 121 aminoácidos carece de los residuos codificados por los exones 6 y 7. VEGF145 es una isoforma predicha que contiene 145 aminoácidos y que carece del exón 7. VEGF puede actuar sobre células endoteliales uniéndose a un receptor tirosina quinasa endotelial, tal como Flt-1 (VEGFR-1) o KDR/flk-1 (VEGFR-2). VEGFR-2 se expresa en células endoteliales y está implicada en diferenciación de células endoteliales y vasculogénesis. Un tercer receptor, VEGFR-3 se ha implicado en 45 linfogénesis.
Las varias isoformas tienen diferentes actividades biológicas e implicaciones clínicas. Por ejemplo, VEGF145 induce angiogénesis y como VEGF189 (pero a diferencia de VEGF165) VEGF145 se une eficazmente a la matriz extracelular por un mecanismo que no depende en sulfatos de heparina asociados a la matriz celular. VEGF muestra 50 actividad como un mitógeno de células endoteliales y quimioatrayente in vitro e induce permeabilidad vascular y angiogénesis in vivo. VEGF se secreta por una amplia variedad de tipos celulares cancerosos y fomenta el crecimiento de tumores induciendo el desarrollo de vasculatura asociada a tumores. Se ha mostrado que la inhibición de la función de VEGF limita tanto el crecimiento de tumores experimentales primarios así como la incidencia de metástasis en ratones inmunosuprimidos. Se describen varios ARNbc dirigidos a VEGF en las 55 solicitudes en tramitación junto a esta en EE UU con número de serie 11/078.073 y 11/340.080, incorporados en el presente documento mediante referencia).
Como se usa en el presente documento, el término “hebra que comprende una secuencia” se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe por la secuencia referida usando la 60 nomenclatura estándar de nucleótidos.
Como se usa en el presente documento, y a menos que se indique de otra manera, el término “complementaria”, cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación a una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de 65 nucleótidos para hibridar y formar una estructura dúplex en ciertas condiciones con un oligonucleótido o
polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, como entenderá el experto en la materia. Tales condiciones pueden, por ejemplo, ser condiciones rigurosas, donde condiciones rigurosas pueden incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas seguido por lavado. Se pueden aplicar otras condiciones, tal como condiciones fisiológicamente relevantes como se pueden encontrar dentro de un organismo. El experto en la materia podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiadas para un ensayo de 5 complementariedad de dos secuencias según la aplicación final de los nucleótidos hibridados.
Esto incluye apareamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende una primera secuencia con el oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos a lo largo la longitud entera de la primera y segunda secuencia de nucleótidos. Tales secuencias se pueden denominar como “completamente 10 complementarias” una respecto a la otra en el presente documento. Sin embargo, donde una primera secuencia se denomina “sustancialmente complementaria” con respecto a un segunda secuencia en el presente documento, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar uno o más, pero generalmente no más de 4, 3 o 2 pares de bases mal apareados tras la hibridación, mientras que retienen la capacidad de hibridar en las condiciones más relevantes a su aplicación final. Sin embargo, donde dos nucleótidos se diseñan para formar, 15 tras la hibridación, una o más proyecciones monocatenarias, tales proyecciones no se deben considerar como malos apareamientos con respecto a la determinación de complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en donde el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementaria al oligonucleótido más corto, se puede aún denominar “completamente complementaria” para los fines de la invención. 20
Secuencias “complementarias”, como se usa en el presente documento, también puede incluir, o estar formadas enteramente de, pares de bases no de Watson-Crick y/o pares de bases formadas de nucleótidos no naturales y modificados, en tanto que los requisitos anteriores con respecto a su capacidad para hibridar se satisfagan.
25
Los términos “complementaria”, “completamente complementaria” y “sustancialmente complementaria” en el presente documento se pueden usar con respecto a la coincidencia de bases entre la hebra sentido y la hebra antisentido de un ARNbc, como se entenderá del contexto de su uso.
Como se usa en el presente documento, un polinucleótido que es “sustancialmente complementario a al menos 30 parte de’ un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo, que codifica Eg5). Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a al menos una parte de un ARNm de Eg5 si la secuencia es sustancialmente complementaria a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica Eg5.
35
El término “ARN bicatenario” o “ARNbc”, como se usa en el presente documento, se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico, que tienen una estructura de dúplex que comprende dos hebras de ácido nucleico antiparalelas y sustancialmente complementarias, como se ha definido anteriormente. Las dos hebras que forman la estructura de dúplex pueden ser porciones diferentes de una molécula de ARN más larga, o pueden ser moléculas de ARN separadas. Donde las dos hebras son parte de una molécula más larga, y por tanto están conectadas por 40 una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3’ de una hebra y el extremo 5’ de la otra hebra respectiva formando una estructura de dúplex, la cadena de ARN que conecta se denomina un “bucle en horquilla”. Donde las dos hebras están conectadas covalentemente por medios diferentes de una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3’ de una hebra y el extremo 5’ de la otra hebra respectiva que forman la estructura de dúplex, la estructura conectora se denomina un “enlazador”. Las hebras de ARN pueden tener el mismo número o 45 uno diferente de nucleótidos. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos en la hebra más corta del ARNbc menos cualquier proyección que esté presente en el dúplex. Además de la estructura de dúplex, un ARNbc puede comprender una o más proyecciones de nucleótidos.
Como se usa en el presente documento, una “proyección de nucleótidos” se refiere al nucleótido o nucleótidos no 50 apareado(s) que sobresalen de la estructura de dúplex de un ARNbc cuando un extremo 3’ de una hebra del ARNbc se extiende más allá del extremo 5’ de la otra hebra, o viceversa. “Romo” o “extremo romo” significa que no nucleótidos no apareados en ese extremo del ARNbc, es decir, sin proyecciones de nucleótidos. Un ARNbc “de extremos romos” es un ARNbc que es bicatenario a lo largo su longitud entera, es decir, sin proyecciones de nucleótidos en ningún extremo de la molécula. 55
El término “hebra antisentido” se refiere a la hebra de un ARNbc que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia diana. Como se usa en el presente documento, el término “región de complementariedad” se refiere a la región en la hebra antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo, una secuencia diana, como se define en el presente documento. Donde la región de 60 complementariedad no es completamente complementaria a la secuencia diana, los malos apareamientos se toleran más en las regiones terminales y, si están presentes, están generalmente en una región o regiones terminal(es), por ejemplo, a 6, 5, 4, 3 o 2 nucleótidos del extremo 5’ y/o 3’.
El término “hebra sentido”, como se usa en el presente documento, se refiere a la hebra de un ARNbc que incluye 65 una región que es sustancialmente complementaria a una región de la hebra antisentido.
“Introducir en una célula”, cuando se refiere a un ARNbc, significa facilitar la captación o absorción en la célula, como entienden los expertos en la materia. La absorción o captación de ARNbc se puede producir mediante procesos celulares de difusión sin ayuda o activos, o por agentes o dispositivos auxiliares. El significado de este término no está limitado a células in vitro; un ARNbc también se puede “introducir en una célula”, en donde la célula 5 es parte de un organismo vivo. En tales casos, la introducción en la célula incluirá la administración al organismo. Por ejemplo, para la administración in vivo, se puede inyectar el ARNbc en un sitio tisular o administrar por vía sistémica. La introducción in vitro en una célula incluye métodos conocidos en la técnica tal como electroporación y lipofección.
10
Los términos “silenciar” e “inhibir la expresión de”, en cuanto se refieren al gen Eg5, en el presente documento se refiere a la supresión al menos parcial de la expresión del gen Eg5, manifestada por una reducción de la cantidad de ARNm transcrito del gen Eg5 que se puede aislar de una primera célula o grupo de células en las que el gen Eg5 se transcribe y que se ha o han tratado de modo que la expresión del gen Eh5 se inhibe, comparado con una segunda célula o grupos de células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células pero que no se ha o han 15 tratado así (células control). El grado de inhibición habitualmente se expresa en términos de
Alternativamente, el grado de inhibición se puede dar en términos de una reducción de un parámetro que está 20 funcionalmente unido a la transcripción del gen Eg5, por ejemplo, la cantidad de proteína codificada por el gen Eg5 que se secreta por una célula, o el número de células que muestran un cierto fenotipo, por ejemplo, apoptosis. En principio, el silenciamiento del gen Eg5 se puede determinar en cualquier célula que expresa la diana, sea constitutivamente o por ingeniería genómica, y por cualquier ensayo apropiado. Sin embargo, cuando se necesita una referencia para determinar si un ARNbc determinado inhibe la expresión del gen Eg5 en un cierto grado y por 25 tanto está abarcado por la presente invención, el ensayo proporcionado en los ejemplos posteriormente sirve como tal referencia.
Por ejemplo, en ciertos casos, la expresión del gen Eg5 (o gen VEGF) se suprime en al menos aproximadamente el 20%, el 25%, el 35% o el 50% por la administración del oligonucleótido bicatenario de la invención. El gen Eg5 se 30 puede suprimir en al menos aproximadamente el 60%, el 70% o el 80% por la administración del oligonucleótido bicatenario de la invención. En algunas formas de realización, el gen Eg5 se suprime en al menos aproximadamente el 85%, el 90% o el 95% por la administración del oligonucleótido bicatenario de la invención. Las tablas 1-3 proporcionan valores para la inhibición de la expresión usando varias moléculas de ARNbc de Eg5 en varias concentraciones. 35
Como se usa en el presente documento en el contexto de la expresión de Eg5, los términos “tratar”, “tratamiento”, y similares, se refieren al alivio de o paliación de procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5. En el contexto de la presente invención en tanto que se refiere a cualquiera de las otras afecciones enumeradas en el presente documento posteriormente (diferentes que los procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5), los 40 términos “tratar”, “tratamiento”, y similares, significan aliviar o paliar al menos un síntoma asociado con tal afección, o ralentizar o invertir la progresión de la afección, tal como la ralentización y progresión de carcinoma hepático.
Como se usa en el presente documento, las frases “cantidad terapéuticamente eficaz” y “cantidad profilácticamente eficaz” se refieren a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento, prevención o control de 45 procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5 o un síntoma evidente de procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5 (solo o en combinación con la expresión de VEGF). La cantidad específica que es terapéuticamente eficaz la puede determinar fácilmente el médico habitual, y puede variar dependiendo de factores conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, el tipo de procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5, los antecedentes y la edad del paciente, el estadio de los procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5, y 50 la administración de otros agentes anti-procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5.
Como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un ARNbc y un soporte farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, “cantidad farmacológicamente eficaz”, “cantidad terapéuticamente eficaz” o simplemente “cantidad 55 eficaz” se refiere a esa cantidad de un ARN eficaz para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo pretendido. Por ejemplo, si un tratamiento clínico dado se considera eficaz cuando al menos una reducción del 25% en un parámetro medible asociado con una enfermedad o trastorno, una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco para el tratamiento de esa enfermedad o trastorno es la cantidad necesaria para efectuar al menos una reducción del 25% en ese parámetro. 60
El término “soporte farmacéuticamente aceptable” se refiere a un soporte para la administración de un agente terapéutico. Tales soportes incluyen, pero no están limitados a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. El término específicamente excluye medio de cultivo celular.
Para fármacos administrados por vía oral, los soportes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a excipientes farmacéuticamente aceptables tal como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y conservantes. Los diluyentes inertes incluyen carbonato de sodio y calcio, fosfato de sodio y calcio, y lactosa, mientras que almidón de maíz y ácido algínico son agentes disgregantes adecuados. Los agentes aglutinantes pueden incluir almidón y 5 gelatina, mientras que el agente lubricante, si está presente, generalmente será estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, los comprimidos se pueden recubrir con un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorción en el aparato digestivo.
Como se usa en el presente documento, una “célula transformada” es una célula en la que se ha introducido un 10 vector a partir del cual se puede expresar una molécula de ARNbc.
II. Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc)
En una forma de realización, la invención proporciona moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) como se 15 definen en las reivindicaciones para inhibir la expresión del gen Eg5 (solo o en combinación con un segundo ARNbc para inhibir la expresión de VEGF) en una célula o mamífero, en donde el ARNbc comprende una hebra antisentido que comprende una región de complementariedad que es complementaria a al menos una parte de un ARNm formado en la expresión del gen Eg5, y en donde la región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud, y en donde dicho ARNbc, tras el contacto con una célula 20 que expresa dicho gen Eg5, inhibe la expresión de dicho gen Eg5 en al menos el 40%. El ARNbc comprende dos hebras de ARN que son lo suficientemente complementarias para hibridar para formar una estructura dúplex. Una hebra del ARNbc (la hebra antisentido) comprende una región de complementariedad que es completamente complementaria a la secuencia diana anteriormente definida, derivada de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión del gen Eg5, la otra hebra (la hebra sentido) comprende una región que es complementaria a la 25 hebra antisentido, de modo que la dos hebras hibridan y forman una estructura dúplex cuando se combinan en condiciones adecuadas. Generalmente, la estructura dúplex tiene entre 15 y 30, más generalmente entre 18 y 25, aún más generalmente entre 19 y 24 y lo más generalmente entre 19 y 21 pares de bases de longitud. Similarmente, la región de complementariedad de la secuencia diana tiene entre 15 y 30, más generalmente entre 18 y 25, aún más generalmente entre 19 y 24 y lo más generalmente entre 19 y 21 nucleótidos de longitud. El ARNbc de la 30 invención puede comprender además una o más proyección(es) de nucleótidos monocatenaria(s). El ARNbc se puede sintetizar por métodos estándar conocidos en la técnica como se comenta posteriormente, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado, tal como los que están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc. En una forma de realización preferida, el gen Eg5 es el gen Eg5 humano. En formas de realización específicas, la primera secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 135 y la 35 segunda secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 136. Agentes antisentido alternativos que se dirigen a algún otro sitio en la secuencia diana proporcionados en las tablas 1-3 se pueden determinar fácilmente usando la secuencia diana y la secuencias que flanquea Eg5. En formas de realización que usan un segundo ARNbc que se dirige a VEGF, tales agentes se ejemplifican en los ejemplos y en las solicitudes en EE UU en tramitación junto a esta con números de serie: 11/078.073 y 11/340.080. 40
También se describe un ARNbc que comprende al menos dos secuencias de nucleótidos seleccionadas de los grupos de secuencias proporcionadas en las tablas 1-3. Una de las dos secuencias es complementaria a la otra de las dos secuencias, siendo una de las secuencias sustancialmente complementaria a una secuencia de un ARNm generado en la expresión del gen Eg5. Como tal, el ARNbc comprenderá dos oligonucleótidos, en donde un 45 oligonucleótido se describe como la hebra sentido en las tablas 1-3 y el segundo oligonucleótido se describe como la hebra antisentido en las tablas 1-3.
El experto en la materia sabe bien que los ARNbc que comprenden una estructura dúplex de entre 20 y 23, pero específicamente 21, pares de bases se han considerado como particularmente eficaces en inducir interferencia por 50 ARN (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Sin embargo, otros han encontrado que ARNbc más cortos o más largos también pueden ser eficaces. En las formas de realización descritas anteriormente, en virtud de la naturaleza de las secuencias de oligonucleótidos proporcionadas en las tablas 1-3, los ARNbc de la invención pueden comprender al menos una hebra de una longitud de mínimamente 21 nt. Se puede esperar razonablemente que ARNbc más cortos que comprenden una de las secuencias de las tablas 1-3 menos solo unos pocos nucleótidos en 55 uno o ambos extremos sean similarmente eficaces comparados con los ARNbc descritos anteriormente. Por tanto, ARNbc que comprenden una secuencia parcial de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más nucleótidos contiguos de una de las secuencias de las tablas 1-3, y que se diferencian en su capacidad para inhibir la expresión del gen Eg5 en un ensayo de FACS como se describe en el presente documento posteriormente en no más del 5, 10, 15, 20, 25, o 30% de inhibición de un ARNbc que comprende la secuencia completa, están contemplados por la invención. 60 ARNbc adicionales que cortan en la secuencia diana proporcionada en las tablas 1-3 se pueden hacer fácilmente usando la secuencia Eg5 y la secuencia diana proporcionada.
Además, los agentes de iARN proporcionados en las tablas 1-3 identifican un sitio en el ARNm de Eg5 que es susceptible a corte basado en iARN. Se describen además agentes de iARN que se dirigen dentro de la secuencia 65 diana por uno de los agentes de la presente invención. Como se usa en el presente documento se dice que un
segundo agente de iARN se dirige a la secuencia de un primer agente de iARN si el segundo agente de iARN corta el mensajero en cualquier lugar en el ARNm que es complementario a la hebra antisentido del primer agente de iARN. Tal segundo agente generalmente consistirá en al menos 15 nucleótidos contiguos de una de las secuencias proporcionadas en las tablas 1-3 acoplado a secuencias de nucleótidos adicionales tomadas de la región contigua a la secuencia seleccionada en el gen Eg5. Por ejemplo, los últimos 15 nucleótidos de SEQ ID NO: 1 combinados con 5 los siguientes 6 nucleótidos del gen diana Eg5 produce un agente monocatenario de 21 nucleótidos que se basa en una de las secuencias proporcionadas en las tablas 1-3.
Se describe un ARNbc que contiene uno o más malos apareamientos respecto a la secuencia diana. Tal ARNbc de la invención puede contener no más de 3 malos apareamientos. Si la hebra antisentido del ARNbc contiene malos 10 apareamientos respecto a la secuencia diana, es preferible que el área de mal apareamiento no esté localizada en el centro de la región de complementariedad. Si la hebra antisentido del ARNbc contiene malos apareamientos respecto a la secuencia diana, es preferible que el mal apareamiento se restrinja a 5 nucleótidos desde cualquier extremo, por ejemplo, 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótido desde bien el extremo 5’ o 3’ de la región de complementariedad. Por ejemplo, para una hebra de ARNbc de 23 nucleótidos que es complementaria a una región del gen Eg5, el ARNbc 15 generalmente no contiene ningún mal apareamiento en los 13 nucleótidos centrales. Los métodos descritos en la invención se pueden usar para determinar si un ARNbc que contiene un mal apareamiento a una secuencia diana es eficaz en inhibir la expresión del gen Eg5. La consideración de la eficacia de los ARNbc con malos apareamientos en inhibir la expresión del gen Eg5 es importante, especialmente si la región particular de complementariedad en el gen Eg5 se sabe que tiene variación de secuencia polimórfica en la población. 20
En una forma de realización, al menos un extremo del ARNbc tiene una proyección de nucleótidos monocatenaria de 1 a 4, generalmente 1 o 2 nucleótidos. Los ARNbc que tienen al menos una proyección de nucleótidos tienen inesperadamente propiedades inhibitorias superiores que sus homólogos de extremos romos. Además, los presentes inventores han descubierto que la presencia de solo una proyección de nucleótidos refuerza la actividad 25 de interferencia del ARNbc, sin afectar a su estabilidad global. El ARNbc que tiene solo una proyección se ha demostrado particularmente estable y eficaz in vivo, así como en una variedad de células, medios de cultivo de células, sangre y suero. Generalmente, la proyección monocatenaria está localizada en el extremo 3’ terminal de la hebra antisentido o, alternativamente, en el extremo 3’ terminal de la hebra sentido. El ARNbc también puede tener un extremo romo, generalmente localizado en el extremo 5’ de la hebra antisentido. Tales ARNbc tienen estabilidad 30 y actividad inhibitoria mejoradas, permitiendo de esta manera la administración de dosis bajas, es decir, menos de 5 mg/kg de peso corporal del receptor al día. Generalmente, la hebra antisentido del ARNbc tiene una proyección de nucleótidos en el extremo 3’, y el extremo 5’ es romo. En otra forma de realización, uno o más nucleótidos en la proyección se sustituyen con un nucleósido tiofosfato.
35
En aun otra forma de realización, el ARNbc se modifica químicamente para mejorar la estabilidad. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden sintetizar y/o modificar por métodos bien establecidos en la técnica, tal como los descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE UU, que se incorpora al presente documento mediante referencia. Los ejemplos específicos de compuestos de ARNbc preferidos útiles en esta invención incluyen ARNbc que contienen esqueletos modificados o 40 enlaces internucleosídicos no naturales. Como se define en esta especificación, los ARNbc que tienen esqueletos modificados incluyen los que retienen un átomo de fósforo en el esqueleto y los que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto. Para los fines de esta especificación, y como algunas veces se hace referencia en la técnica, los ARNbc modificados que no tienen un átomo de fósforo en su esqueleto también se puede considerar que son oligonucleósidos. 45
Los esqueletos de ARNbc modificados preferidos incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, foforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil u otros alquil fosfonatos, incluyendo 3’-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fofinatos, fosforamidatos, incluyendo 3’-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, y boranofosfatos que 50 tienen enlaces 3’-5’ normales, análogos unidos por 2’-5’ de estos, y los que tienen polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósido están unidas de 3’-5’ a 5’-3’ o de 2’-5’ a 5’-2’. También se incluyen varias sales, sales mixtas y formas de ácido libre.
Las patentes en EE UU representativas que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores 55 incluyen, pero no están limitadas a, las patentes en EE UU Nos. 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; y 5.625.050.
60
Los esqueletos de ARNbc modificados preferidos que no incluyen un átomo de fósforo en los mismos incluyen esqueletos que se forman por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, heteroátomos mixtos y enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen los que tienen enlaces morfolino (formados en parte de la porción de azúcar de un nucleósido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos de 65 formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alqueno;
esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidracino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mezcladas.
Las patentes en EE UU representativas que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no están limitadas a, las patentes en EE UU Nos. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.
En otros miméticos de ARNbc preferidos, tanto el azúcar como el enlace internucleosídico, es decir, el esqueleto, de las unidades de nucleósido se sustituyen con grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para la 10 hibridación con un compuesto diana de ácido nucleico adecuado. Uno de tales compuestos oligoméricos, un mimético de ARNbc que se ha mostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se denomina ácido peptidonucleico (APN). En compuestos APN, el esqueleto de azúcar de un ARNbc se sustituye por un esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida del esqueleto. Las patentes en EE UU 15 representativas que enseñan la preparación de compuestos APN incluyen, pero no están limitadas a, las patentes en EE UU Nos. 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Se pueden encontrar enseñanzas adicionales de compuestos APN en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Las formas de realización más preferidas de la invención son ARNbc con esqueletos de fosforotioato y 20 oligonucleósidos con esqueletos de heteroátomos, y en particular --CH2--NH--CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2-- [conocido como un esqueleto metilen (metilimino) o MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- y --N(CH3)--CH2--CH2-- [en donde el esqueleto fosfodiéster nativo está representado como --O--P--O--CH2--] de la anteriormente referenciada patente en EE UU No. 5.489.677, y los esqueleto amida de la anteriormente referenciada patente en EE UU No. 5.602.240. También son preferidos ARNbc que tienen estructuras de esqueleto de morfolino 25 de la anteriormente referenciada patente en EE UU No. 5.034.506.
Los ARNbc modificados también pueden contener una o más fracciones de azúcar modificado. Los ARNbc preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2’: OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo o alquinilo pueden ser alquilo de C1 a C10 o alquenilo 30 y alquinilo de C2 a C10 sustituido o sin sustituir. Particularmente preferidos son O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros ARNbc preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2’: alquilo inferior de C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo 35 sustituido, un grupo que corta ARN, un grupo indicador, un intercalante, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ARNbc, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un ARNbc, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2’-metoxietoxi (2’-O--CH2CH2OCH3, también conocido como 2’-O-(2-metoxietil) o 2’-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxi-alcoxi. Una modificación preferida adicional incluye 2’-dimetilaminooxietoxi, es decir, 40 un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2’-DMAOE, como se describe en los ejemplos posteriormente, y 2’-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2’-O-dimetilaminoetoxietilo o 2’-DMAEOE), es decir, 2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2, también descrito en los ejemplos posteriormente.
Otras modificaciones preferidas incluyen 2’-metoxi (2’-OCH3), 2’-aminopropoxi (2’-OCH2CH2CH2NH2) y 2’-fluoro (2’-45 F). También se pueden hacer modificaciones similares en otras porciones del ARNbc, particularmente en la posición 3’ del azúcar en el nucleótido 3’ terminal o en los ARNbc unidos por 2’-5’ y la posición 5’ del nucleótido 5’ terminal. Los ARNbc también pueden tener miméticos de azúcar tal como fracciones ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranilo. Las patentes en EE UU representativas que ensañan la preparación de tales estructuras de azúcar modificado incluyen, pero no están limitadas a, las patentes en EE UU No. 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 50 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920.
Los ARNbc también pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (con frecuencia denominadas en la técnica simplemente “base”). Como se usa en el presente documento, nucleobases “sin modificar” o “naturales” 55 incluye las bases de purina adenina (A) y guanina (G) y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tal como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-60 tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-daazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Nucleobases adicionales incluyen las divulgadas en la patente en EE UU No. 3.687.808, las divulgadas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 65 1990, las divulgadas por Englisch et al., Angewandte Chemie, Edición Internacional, 1991, 30, 613, y las divulgadas
por Sanghvi, Y S., capítulo 15, DsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la invención. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 grados C (Sanghvi, 5 Y. S., Crooke, S. T. y Lebleu, B., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y son actualmente sustituciones de bases preferidas, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar 2’-O-metoxietilo.
Las patentes en EE UU representativas que enseñan la preparación de ciertas de las nucleobases modificadas 10 indicadas anteriormente así como otras nucleobases modificadas incluyen, pero no están limitadas a, la anteriormente indicada patente en EE UU No. 3.687.808, así como las patentes en EE UU Nos. 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941, y la patente en EE UU no. 5.750.692.
15
Otra modificación de los ARNbc de la invención implica unir químicamente al ARNbc una o más fracciones o conjugados que aumentan la actividad, distribución celular o captación celular del ARNbc. Tales fracciones incluyen, pero no están limitadas a fracciones lipídicas tal como una fracción de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 199, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994 4 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, beril-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., 20 Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-Hfosfonato de trietil-amonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una 25 poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un fracción de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o una fracción octadecilamina o hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
30
Las patentes en EE UU representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de ARNbc incluyen, pero no están limitas a, las patentes en EE UU Nos. 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717. 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 35 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241. 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.
No es necesario para todas las posiciones en un compuesto determinado estar uniformemente modificadas, y de 40 hecho más de una de las modificaciones anteriormente mencionadas se puede incorporar en un único compuesto o incluso en único nucleósido en un ARNbc. La presente invención también incluye compuestos de ARNbc que son compuestos quiméricos. Compuestos de ARNbc “quiméricos” o “quimeras”, en el contexto de esta invención, son compuestos de ARNbc, particularmente ARNbc, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una hecha de al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de ARNbc. 45 Estos ARNbc típicamente contienen al menos una región en donde el ARNbc está modificado de modo que confiere al ARNbc resistencia aumentada a la degradación por nucleasas, captación celular aumentada y/o afinidad de unión aumentada por el ácido nucleico diana. Una región adicional del ARNbc puede servir como una sustancia para enzimas capaces de cortar híbridos ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que corta la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. La activación de la RNasa H, por tanto, produce el corte 50 de ARN diana, aumentando mucho de esta manera la eficacia de la inhibición por ARNbc de la expresión génica. Por consiguiente, con frecuencia se pueden obtener resultados similares con ARNbc más cortos cuando se usan ARNbc quiméricos comparados con desoxiARNbc de fosforotioato que hibridan con la misma región diana. El corte del ARN diana se puede detectar rutinariamente por electroforesis en gel y, si es necesario, métodos de hibridación de ácidos nucleicos asociados conocidos en la técnica. 55
En ciertos casos, el ARNbc se puede modificar por un grupo no ligando. Se han conjugado un número de moléculas no ligando a ARNbc para aumentar la actividad, distribución celular o captación celular del ARNbc, y los procedimientos para realizar tales conjugaciones están disponibles en la bibliografía científica. Tales fracciones no ligando han incluido fracciones lipídicas, tal como una fracción de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 60 USA, 199, 86, 6553), ácido cólico (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4: 1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660: 306; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10: 1111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259: 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75: 49), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-65 glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil-amonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995,
36: 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14: 969), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651), un fracción de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229), o una fracción octadecilamina o hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923). Las patentes en EE UU representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de ARNbc se han enumerado 5 anteriormente. Los protocolos de conjugación típicos implican la síntesis de ARNbc que llevan un enlazador amino en una o más posiciones de la secuencia. El grupo amino se hace reaccionar después con la molécula que se conjuga usando reactivos de acoplamiento o activación adecuados. La reacción de conjugación se puede realizar bien con el ARNbc aún unido al soporte sólido o después de cortar el ARNbc en fase solución. La purificación de conjugado de ARNbc por HPLC típicamente da el conjugado puro. 10
Agentes de iARN codificados por vector
El ARNbc de la invención también se puede expresar de vectores víricos recombinantes intracelularmente in vivo. Los vectores víricos recombinantes de la invención comprenden secuencias que codifican el ARNbc de la invención 15 y cualquier promotor adecuado para expresar las secuencias del ARNbc. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, las secuencias del promotor de ARN pol III U6 o H1 y el promotor del citomegalovirus. La selección de otros promotores adecuados está dentro de la capacidad en la técnica. Los vectores víricos recombinantes de la invención también pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresión del ARNbc en un tejido particular o en una medio intracelular particular. El uso de vectores víricos recombinantes para administrar ARNbc de la 20 invención a células in vivo se comenta en más detalle posteriormente.
El ARNbc de la invención se puede expresar de un vector vírico recombinante bien como dos moléculas separadas complementarias de ARN, o como una única molécula de ARN con dos regiones complementarias.
25
Se puede usar cualquier vector vírico capaz de aceptar las secuencias codificantes de la(s) molécula(s) de ARNbc que se van a expresar, por ejemplo, vectores derivados de adenovirus (AV), virus adenoasociados (AAV); retrovirus (por ejemplo, lentivirus (LV), rhabdovirus, virus de la leucemia murina); virus del herpes, y similares. El tropismo de los vectores víricos se puede modificar pseudotipando los vectores con proteínas de la envuelta u otros antígenos de superficie de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de cápside vírica, según sea apropiado. 30
Por ejemplo, los vectores lentivíricos de la invención se pueden pseudotipar con proteínas de superficie del virus de la estomatitis vesicular (VSV), rabia, Ébola, Mokola, y similares. Se puede hacer que los vectores AAV de la invención se dirijan a diferentes células manipulando los vectores para expresar diferentes serotipos de proteínas de la cápside. Por ejemplo, un vector AAV que expresa una cápside de serotipo 2 en un genoma de serotipo 2 se llama 35 AAV 2/2. Este gen de la cápside de serotipo 2 en el vector AAV 2/2 se puede sustituir por un gen de cápside de serotipo 5 para producir un vector AAV 2/5. Las técnicas para construir vectores AAV que expresan diferentes serotipos de proteínas de la cápside están en las capacidades en la técnica; véase, por ejemplo, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801, cuya divulgación entera se incorpora al presente documento mediante referencia.
40
La selección de vectores víricos recombinantes adecuados para su uso en la invención, métodos para insertar secuencias de ácidos nucleicos para expresar el ARNbc en el vector, y métodos de administrar el vector vírico a las células de interés están en las capacidades en la técnica. Véase, por ejemplo, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; y Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406, cuyas divulgaciones enteras se 45 incorporan al presente documento mediante referencia.
Los vectores víricos preferidos son los derivados de AV y AAV. En una forma de realización particularmente preferida, el ARNbc de la invención se expresa como dos moléculas separadas, complementarias de ARN monocatenario de un vector AAV recombinante que comprende, por ejemplo el promotor de ARN U6 o H1, o el 50 promotor del citomegalovirus (CMV).
Un vector AV adecuado para expresar el ARNbc de la invención, un método para construir el vector AV recombinante y un método para administrar el vector en células diana, se describen en Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010. 55
Los vectores AAV adecuados para expresar el ARNbc de la invención, métodos para construir el vector AV recombinante y métodos para administrar los vectores en células diana, se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; patente en EE UU No. 5.252.479; patente en EE UU No. 5.139.941; solicitud de patente internacional No. WO 60 94/13788; y solicitud de patente internacional No. WO 93/24641, cuyas divulgaciones enteras se incorporan al presente documento mediante referencia.
III. Composiciones farmacéuticas que comprenden ARNbc
65
En una forma de realización, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un ARNbc, como se describe en el presente documento, y un soporte farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica que comprende el ARNbc es útil para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad del gen Eg5, tal como procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5. Tales composiciones farmacéuticas se formulan basadas en el modo de administración. Un ejemplo es composiciones que se formulan 5 para la administración sistémica a través de administración parenteral.
En otra forma de realización, tales composiciones comprenderán además un segundo ARNbc que inhibe la expresión de VEGF. Se describen ARNbc dirigidos a VEGF en los ejemplos y las solicitudes en EE UU en tramitación junto a esta con número de serie: 11/078.073 y 11/340.080. 10
Las composiciones farmacéuticas de la invención se van a administrar en dosis suficientes para inhibir la expresión del gen Eg5 (y la expresión de VEGF cuando un segundo ARNbc se incluye). En general, una dosis adecuada de ARNbc estará en el intervalo de 0,01 a 5,0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día, generalmente en el intervalo de 1 microgramo a 1 mg por kilogramo de peso corporal al día. La composición 15 farmacéutica se puede administrar una vez al día o el ARNbc se puede administrar como dos, tres o más subdosis a intervalos apropiados a lo largo del día o incluso usando infusión continua o administración mediante una formulación de liberación controlada. En ese caso, el ARNbc contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente menor para alcanzar la dosis diaria total. La forma farmacéutica también puede estar compuesta para administrar durante varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida 20 convencional que proporciona liberación sostenida del ARNbc durante un periodo de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida se conocen bien en la técnica y son particularmente útiles para la administración de agentes en un sitio particular, tal como se podría usar con los agentes de la presente invención. En esta forma de realización, la forma farmacéutica contiene un múltiplo correspondiente de la dosis diaria.
25
El experto en la materia apreciará que ciertos factores pueden influir la dosis y cadencia requeridas para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero no limitados a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un tratamiento único o una serie de tratamientos. Se pueden hacer estimaciones de dosis eficaces y semividas in vivo para los ARNbc individuales 30 abarcados por la invención usando metodologías convencionales o en base de pruebas in vivo usando un modelo animal apropiado, como se describe en otra parte en el presente documento.
Los avances en genética en ratones han generado un número de modelos de ratón para el estudio de varias enfermedades humanas, tal como procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5. Tales modelos se usan 35 para el ensayo in vivo de ARNbc, así como para determinar una dosis terapéuticamente eficaz.
La presente invención también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los compuestos de ARNbc de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en un número de maneras dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y según el área que se va a tratar. La 40 administración puede ser tópica, pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo intratecal o intraventricular.
45
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables soportes farmacéuticos convencionales, acuosos, polvo o bases oleaginosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles condones, guantes recubiertos y similares. Las formulaciones tópicas preferidas incluyen esas en las que los ARNbc de la invención están en mezcla con un agente de administración 50 tópica tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Los lípidos y liposomas preferidos incluyen neutros (por ejemplo, dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidil colina DMPC, distearoilfosfatidil colina) negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) y catiónicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA). Los ARNbc de la invención pueden estar encapsulados en liposomas o pueden formar complejos con ellos, en particular con 55 liposomas catiónicos. Alternativamente, los ARNbc pueden estar en complejos con lípidos, en particular lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres preferidos incluyen, pero no están limitados a, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido laurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1- dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un éster de alquilo de C1-10 (por ejemplo, 60 isopropilmiristato IPM), monoglicérido, diglicérido o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Se describen formulaciones tópicas en detalle en la solicitud de patente en EE UU número de serie 09/315.298 presentada el 20 de mayo, 1999.
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración oral incluyen polvos o gránulos, 65 microparticulados, nanoparticulados, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas
de gel, saquitos, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes saborizantes, diluyentes, emulsionantes, ayudas de dispersión o aglutinantes. Las formulaciones orales preferidas son esas en las que los ARNbc de la invención se administran junto con uno o más potenciadores de penetración tensioactivos y quelantes. Los tensioactivos preferidos incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Los ácidos/sales biliares preferidos incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA) y ácido 5 ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidrofusidato de sodio y gluicodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos preferidos incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido laurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-10 ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un monoglicérido, un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos (por ejemplo, sodio). También son preferidas combinaciones de potenciadores de penetración, por ejemplos ácidos /sales grasos en combinación con ácidos /sales biliares. Una combinación particularmente preferida es la sal sódica de ácido laurico, ácido cáprico y UDCA. Los potenciadores de penetración adicionales incluyen polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-20-cetil éter. Los ARNbc de la invención se pueden administrar por vía oral, 15 en forma granular incluyendo partículas secas rociadas, o en complejo para formar micro o nanopartículas. Los agentes de acomplejar ARNbc incluyen poliaminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivadas con DEAE, pululanos, celulosas y almidones. Los agentes de acomplejamiento particularmente preferidos incluyen quitosano, N-trimetilquitosano, poli-L-lisina, polihistidina, 20 poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por ejemplo, p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(isohexilcinaoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAE-dextrano, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(D,L-ácido láctico), poli(DL-ácido láctico-co-glicólico (PLGA), alginato, y polietilenglicol (PEG). Las formulaciones orales para ARNbc y su preparación se describen en detalle en la 25 solicitud en EE UU número de serie 08/886.829 (presentada el 1 de julio, 1997), número de serie 09/108.673 (presentada el 1 de julio, 1998), número de serie 09/256.515 (presentada el 23 de febrero, 1999), número de serie 09/082.624 (presentada el 231 de mayo, 1998) y número de serie 09/315.298 (presentada el 20 de mayo, 1999).
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal, intraventricular o intrahepática pueden 30 incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tal como, pero no limitados a, potenciadores de penetración, compuestos soporte y otros soportes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, soluciones, 35 emulsiones, y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar de una variedad de componentes que incluyen, pero no están limitados a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. Particularmente preferidas son formulaciones que se dirigen al hígado cuando se tratan trastornos hepáticos tal como carcinoma hepático.
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Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que se pueden presentar convenientemente en formas farmacéuticas unitarias, se pueden preparar según técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen el paso de asociar los principios activos con el/los soporte(s) o excipiente(s) farmacéuticamente aceptable(s). En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme y estrechamente los principios activos con soportes líquidos o soportes sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, 45 dando forma al producto.
Las composiciones de la presente invención se pueden formular en cualquiera de muchas posibles formas farmacéuticas tal como, pero no limitadas a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular como 50 suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
Emulsiones 55
Las composiciones de la presente invención se pueden preparar y formular como emulsiones. Las emulsiones son típicamente sistemas heterogéneos de un líquido dispersado en otro en forma de gotitas que habitualmente superan 0,1 .mu.m de diámetro (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y 60 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Volumen 1, p. 245; Block en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 2, p. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Las emulsiones con frecuencia son sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles mezcladas estrechamente y dispersadas una en otra. En general, las emulsiones pueden ser bien de la variedad de agua en aceite o de aceite 65 en agua. Cuando una fase acuosa se divide finamente en y se dispersa como gotitas diminutas en una fase
oleaginosa voluminosa, la composición resultante se llama una emulsión de agua en aceite. Alternativamente, cuando la fase oleaginosa se divide finamente en y dispersa como gotitas diminutas en una fase acuosa voluminosa, la composición resultante se llama una emulsión de aceite en agua. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas, y el fármaco activo que puede como una solución bien en la fase acuosa, la fase oleaginosa o él mismo como una fase separada. También pueden estar presentes excipientes 5 farmacéuticos, tal como emulsionantes, estabilizantes, tintes, y antioxidantes en emulsiones según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que están compuestas de más de dos fases tal como, por ejemplo, en el caso de emulsiones de aceite en agua en aceite y agua en aceite en agua. Tales formulaciones complejas con frecuencia proporcionan ciertas ventajas que las emulsiones binarias sencillas no. Las emulsiones múltiples en las que gotitas de aceite individuales de una emulsión de aceite en agua encierran 10 pequeñas gotitas de agua constituyen una emulsión de agua en aceite en agua. Asimismo un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizadas en una fase continua oleaginosa proporciona una emulsión de aceite en agua en aceite.
Las emulsiones se caracterizan por poca o ninguna estabilidad termodinámica. Con frecuencia, la fase dispersa o 15 discontinua de la emulsión está bien dispersa en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma por medio de emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido o un sólido, como es el caso de la bases de pomadas estilo emulsión y cremas. Otros medios de estabilizar emulsiones suponen el uso de emulsionantes que se pueden incorporar en cualquier fase de la emulsión. Los emulsionantes se pueden clasificar en sentido general en cuatro categorías: tensioactivos sintéticos, emulsionantes 20 naturales, bases de absorción y sólidos finamente dispersados (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199).
Los tensioactivos sintéticos, también conocidos como agentes activos de superficie, han encontrado amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y se han revisado en la bibliografía (Rieger, en Pharmaceutical 25 Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, volumen 1, p. 199). Los tensioactivos son típicamente anfifílicos y comprenden una porción hidrofílica y una hidrofóbica. La proporción de la naturaleza hidrofílica respecto a la hidrofóbica del tensioactivo se ha denominado el equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una herramienta valiosa en categorizar y seleccionar tensioactivos en la 30 preparación de formulaciones. Los tensioactivos se pueden clasificar en diferentes clases basado en la naturaleza del grupo hidrofílico: no iónico, aniónico, catiónico y anfótero (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 285).
Los emulsionantes naturales usados en formulaciones en emulsión incluyen lanolina, cera de abeja, fosfátidos, 35 lecitina y goma arábiga. Las bases de absorción poseen propiedades hidrofílicas de modo que pueden absorber agua para formar emulsiones de agua en aceite y aun retienen sus consistencias semisólidas, tal como lanolina anhidra y vaselina hidrofílica. Los sólidos finamente divididos también se han usado como buenos emulsionantes especialmente en combinación con tensioactivos y en preparaciones viscosas. Estos incluyen sólidos inorgánicos polares, tal como hidróxidos de metales pesados, arcillas que no se hinchan tal como bentonita, atapulgita, hectorita, 40 caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de magnesio y aluminio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tal como carbono o triestearato de glicerilo.
También se incluyen una gran variedad de materiales no emulsionantes en las formulaciones en emulsión y contribuyen a las propiedades de emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes 45 grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrofílicos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199).
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Los coloides hidrofílicos o hidrocoloides incluyen gomas naturales y polímeros sintéticos tal como polisacáridos (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, carragenano, goma guar, goma karaya y traganto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa), y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa, y polímeros de carboxivinilo). Estos se dispersan o hinchan en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan las emulsiones al formar películas interfaciales fuertes alrededor de las gotitas de la fase 55 dispersada y al aumentar la viscosidad de la fase externa.
Puesto que las emulsiones con frecuencia contienen un número de ingredientes tal como hidratos de carbono, proteínas, esteroles y fosfátidos que puede apoyar fácilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones con frecuencia incorporan conservantes. Los conservantes comúnmente usados incluidos en las formulaciones en 60 emulsión incluyen metilparabeno, propilparabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, y ácido bórico. También se añaden comúnmente antioxidantes a las formulaciones en emulsión para prevenir el deterioro de la formulación. Los antioxidantes usados pueden ser captadores de radicales libres tal como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, o agentes reductores tal como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio y antioxidantes sinérgicos tal como ácido cítrico, ácido tartárico, y 65 lecitina.
La aplicación de formulaciones en emulsión a través de rutas dermatológica, oral y parenteral y los métodos para su fabricación se han revisado en la bibliografía (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199). Las formulaciones en emulsión para la administración oral se han usado mucho debido a la facilidad de formulación, así como la eficacia desde un punto de 5 vista de absorción y biodisponibilidad (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Volumen 1, p. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199). Los laxantes basados en aceite de vaselina, las vitaminas liposolubles y preparaciones nutritivas con alta grasa están entre los materiales que se han administrado comúnmente por vía oral como emulsiones de aceite en agua. 10
Las composiciones de ARNbc y ácidos nucleicos se pueden formular como microemulsiones. Una microemulsión se puede definir como un sistema de agua, aceite y anfífilo que es una solución líquida única ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Volumen 1, p. 245). Típicamente las microemulsiones son sistemas que se 15 preparan dispersando primero un aceite en una solución acuosa de tensioactivo y después añadiendo una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol de cadena de longitud intermedia para formar un sistema transparente. Por tanto, las microemulsiones también se han descrito como dispersiones termodinámicamente estables, isotrópicamente transparentes de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan por películas interfaciales de moléculas tensioactivas (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and 20 Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 185-215). Las microemulsiones comúnmente se preparan a través de una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensioactivo, cotensioactivo y electrolito. Si la microemulsión es del tipo agua en aceite o aceite en agua depende de las propiedades del aceite y el tensioactivo usados y de la estructura y empaquetamiento geométrico de las cabezas polares y colas hidrocarbonadas de las moléculas de tensioactivo (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 25 Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
El enfoque fenomenológico que utiliza diagramas de fase se ha estudiado extensamente y ha dado un conocimiento exhaustivo, al experto en la materia, de cómo formular microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245; Block, en 30 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 335). Comparadas con las emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de gotitas termodinámicamente estables que se forman espontáneamente.
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Los tensioactivos usados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no están limitados a, tensioactivos iónicos, tensioactivos no iónicos, Brij 96, éteres de polioxietileno oileilo, ésteres de ácidos grasos y poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequilolato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solos o en combinación con 40 cotensioactivos. El cotensioactivo, habitualmente un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1-propanol y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial penetrando en la película del tensioactivo y consecuentemente creando una película desordenada debido al espacio vacío generado entre las moléculas de tensioactivo. Sin embargo, las microemulsiones se pueden preparar sin el uso de cotensioactivos y en la técnica se conocen sistemas de microemulsión autoemulsionantes sin alcohol. La fase acuosa puede ser típicamente, pero no está limitada a, agua, 45 una solución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles, y derivados de etilenglicol. La fase oleaginosa puede incluir, pero no está limitada a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos grasos, mono, di y triglicéridos de cadena media (C8-C12), ésteres de ácidos grasos y glicerilo polioxietilados, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos de C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de silicona. 50
Las microemulsiones son particularmente de interés desde el punto de vista de la solubilización del fármaco y absorción aumentada de fármacos. Se ha propuesto que las microemulsiones basadas en lípidos (tanto de aceite en agua como de agua en aceite) aumentan la biodisponibilidad oral de fármacos, incluyendo péptidos (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). 55 Las microemulsiones proporcionan ventajas de solubilización de fármaco mejorada, protección del fármaco de hidrólisis enzimática, posible aumento de la absorción de fármaco debido a alteraciones inducidas por tensioactivos en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración oral sobre formas farmacéuticas sólidas, potencia clínica mejorada, y toxicidad disminuida (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Con frecuencia las microemulsiones se 60 forman espontáneamente cuando sus componentes se juntan a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajosos cuando se formulan fármacos, péptidos o ARNbc termolábiles. Las microemulsiones también han sido eficaces en la administración transdérmica de componentes activos tanto en aplicaciones cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones y formulaciones en microemulsión de la presente invención faciliten la absorción sistémica aumentada de ARNbc y ácidos nucleicos del aparato digestivo, así como 65 que mejoren la captación celular local de los ARNbc y ácidos nucleicos.
Las microemulsiones de la presente invención también pueden contener componentes y aditivos adicionales tal como monoestearato sorbitano (Grill 3), Labrasol y potenciadores de penetración para mejorar las propiedades de la formulación y para aumentar la absorción de los ARNbc y ácidos nucleicos de la presente invención. Los potenciadores de penetración usados en las microemulsiones de la presente invención se pueden clasificar como 5 que pertenecen a uno de cinco categorías amplias --tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de estas clases se ha comentado anteriormente.
Liposomas 10
Hay muchas estructuras de tensioactivos organizadas además de las microemulsiones que se han estudiado y usado para la formulación de fármacos. Estas incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas, tal como liposomas, han atraído gran interés debido a su especificidad y la duración de acción que ofrecen desde el punto de vista de la administración del fármaco. Como se usa en la presente invención, el término “liposoma” 15 significa una vesícula compuesta de lípidos anfifílicos organizados en una bicapa o bicapas esférica(s).
Los liposomas son vesículas unilamelares y multilamelares que tienen una membrana formada de un material lipofílico y un interior acuoso. La parte acuosa contiene la composición que se va a administrar. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de poder fusionarse a la pared celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no pueden 20 fusionarse tan eficazmente con la pared celular, son captados por macrófagos in vivo.
Para cruzar intactos la piel de mamíferos, las vesículas lipídicas deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro menor de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Por tanto, es deseable usar un liposoma que sea muy deformable y capaz de pasar a través de tales poros finos. 25
Las ventajas adicionales de los liposomas incluyen; los liposomas obtenidos de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar una amplia gama de fármacos solubles en agua y lípidos; los liposomas pueden proteger fármacos encapsulados en sus compartimentos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, 30 Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245). Consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas con la carga de superficie del lípido, el tamaño de la vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.
Los liposomas son útiles para la transferencia y administración de principios activos al sitio de acción. Puesto que la membrana liposómica es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando se aplican liposomas a un 35 tejido, los liposomas empiezan a fusionarse con las membranas celulares y según progresa la fusión del liposoma y la célula, los contenidos liposómicos se vacían en la célula donde el agente activo puede actuar.
Las formulaciones liposómicas han sido el foco de investigación extensa como el modo de administración para muchos fármacos. Hay evidencia creciente de que para la administración tópica, los liposomas presentan varias 40 ventajas sobre otras formulaciones. Tales ventajas incluyen efectos secundarios reducidos relacionados con la alta absorción sistémica del fármaco administrado, acumulación aumentada del fármaco administrado en la diana deseada, y la capacidad de administrar una amplia variedad de fármacos, tanto hidrofílicos como hidrofóbicos, en la piel.
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Varios artículos han detallado la capacidad de los liposomas de administrar agentes incluyendo ADN de alto peso molecular a la piel. Se han administrado compuestos incluyendo analgésicos, anticuerpos, hormonas y ADN de alto peso molecular a la piel. La mayoría de las aplicaciones produjeron el direccionamiento a la epidermis superior.
Los liposomas están en dos clases amplias. Los liposomas catiónicos son liposomas cargados positivamente que 50 interaccionan con las moléculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable. El complejo ADN/liposoma cargado positivamente se une a la superficie celular cargada negativamente y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido en el endosoma, los liposomas se rompen, liberando sus contenidos en el citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
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Los liposomas que son sensibles al pH o están cargados negativamente, atrapan ADN más que formar complejos con él. Puesto que tanto el ADN como el lípido están cargados similarmente, se produce repulsión más que la formación de complejo. No obstante, algo de ADN se atrapa en el interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH se han usado para administrar ADN que codifica el gen de la timidina quinasa a monocapas de células en cultivo. La expresión del gen exógeno se detectó en las células diana (Zhou et al., Journal of Controlled 60 Release, 1992, 19, 269-274).
Un tipo principal de composición de liposoma incluye fosfolípidos diferentes de fosfatidilcolina de origen natural. Las composiciones de liposomas neutros, por ejemplo, se pueden formar de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas aniónicos generalmente se forman de dimiristoil 65 fosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente de dioleil
fosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composiciones liposómicas se forma de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de soja, y PC de huevo. Otro tipo se forma de mezclas de fosfolípidos y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Varios estudios han evaluado la administración tópica de formulaciones de fármacos en liposomas a la piel. La aplicación de liposomas que contienen interferón a la piel de hámsteres produjo una reducción de las llagas de 5 herpes en la piel mientras que la administración de interferón a través de otros medios (por ejemplo, como una solución o como una emulsión) fueron ineficaces (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Además, un estudio adicional probó la eficacia de interferón administrado como parte de una formulación liposómica respecto a la administración de interferón usando un sistema acuoso, y concluyó que la formulación liposómica era superior a la administración acuosa (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265). 10
Los sistemas liposómicos no iónicos también se han examinado para determinar su utilidad en la administración de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Se usaron formulaciones liposómicas no iónicas que comprenden Novasoma.TM. I (dilaurato de glicerilo/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) y Novasoma.TM. II (diestearato de glicerilo/colesterol/polioxietileno-15 10-estearil éter) para administrar ciclosporina A en la dermis de piel de ratón. Los resultados indicaron que tales sistemas liposómicos no iónicos eran eficaces en facilitar el depósito de ciclosporina A en diferentes capas de la piel (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Liposomas también incluye liposomas “estéricamente estabilizados”, un término que, como se usa en el presente 20 documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan en liposomas, producen vidas de circulación aumentadas relativas a los liposomas que carecen de tales lípidos especializados. Los ejemplos de liposomas estéricamente estabilizados son esos en los que parte de la porción de lípidos que forman la vesícula del liposoma (A) comprende uno o más glucolípidos, tal como monosialogangliósido G.sub.M1, o (B) está derivado con uno o más polímeros hidrofílicos, tal como una fracción de polietilenglicol (PEG). 25 Mientras que no se quiere estar unido por ninguna teoría particular, se piensa en la técnica que, al menos para liposomas estéricamente estabilizados que contienen gangliósidos, esfingomielina o lípidos derivados con PEG, la semivida d circulación aumentada de estos liposomas estéricamente estabilizados deriva de una captación reducida en las células del sistema reticuloendotelial (SER) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765). 30
Varios liposomas que comprenden uno o más glucolípidos se conocen en la técnica. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) describieron la capacidad de monosialogangliósido G.sub.M1, sulfato de galactocerebrósido y fosfatidilinositol para mejorar las semividas en sangre de liposomas. Estos resultados fueron explicados por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). La patente en EE UU No. 4.837.028 y 35 el documento WO 88/04924, ambas a Allen et al., divulgan liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido G.sub.M1 o un éster sulfato de galactocerebrósido. La patente en EE UU No. 5.543.152 (Webb et al) divulga liposomas que comprenden esfingomielina. Se divulgan liposomas que comprenden 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina en el documento WO 97/13499 (Lim et al).
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En la técnica se conocen muchos liposomas que comprenden lípidos derivados con uno o más polímeros hidrofílicos, y métodos de preparación de los mismos. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describieron liposomas que comprenden un detergente no iónico 2C.sub.1215G, que contienen una fracción PEG. Illum et at (FEBS Lett., 1984, 167, 79) indicaron que el recubrimiento hidrofílico de partículas de poliestireno con glicoles poliméricos produce semividas en sangre significativamente aumentadas. Los fosfolípidos sintéticos 45 modificados por la unión de grupos carboxílico de polialquilenglicoles (por ejemplo, PEG) se describen por Sears (patentes en EE UU Nos. 4.426.330 y 4.534.899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) describieron experimentos que demuestran que liposomas que comprenden fosfatidiletanolamina (PE) derivada con PEG o estearato de PEG tienen aumentos significativos en las semividas de circulación en la sangre. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extendieron tales observaciones a otros fosfolípidos derivados con 50 PEG, por ejemplo, DSPE-PEG, formados de la combinación de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG. Los liposomas que tienen fracciones PEG covalentemente unidas en su superficie externa se describen en la patente europea No. EP 0 445 131 B1 y el documento WO 90/04384 a Fisher. Se describen composiciones de liposomas que contienen del 1-20 por ciento molar de PE derivada con PEG, y métodos de uso de los mismos, por Woodle et al. (patentes en EE UU Nos. 5.013.556 y 5.356.633) y Martin et al (patente en EE UU No. 5.213.804 y patente 55 europea No. EP 0 496 813 B1). Se divulgan liposomas que comprenden un número de otros conjugados lípido-polímero en el documento WO 91/05545 y la patente en EE UU No. 5.225.212 (ambas a Martin et al.) y en el documento WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Se describen liposomas que comprenden lípidos ceramidas modificados con PEG en el documento WO 96/10391 (Choi et al.). La patente en EE UU No. 5.540.935 (Miyazaki et al.) y la patente en EE UU No. 5.556.948 (Tagawa et al.) describen liposomas que contienen PEG que se pueden derivar 60 adicionalmente con fracciones funcionales en sus superficies.
Se conocen en la técnica un número limitado de liposomas que comprenden ácidos nucleicos. El documento WO 96/40062 a Thierry et al., divulga métodos para encapsular ácidos nucleicos de alto peso molecular en liposomas. La patente en EE UU No. 5.264.221 a Tagawa et al., divulga liposomas unidos a proteínas y afirma que el contenido de 65 tales liposomas puede incluir un ARN ARNbc. La patente en EE UU No. 5.665.710 a Rahman et al., describe ciertos
métodos de encapsular oligodesoxinucleótidos en liposomas. El documento WO 97/04787 a Love et al., divulga liposomas que comprenden ARNbc, ARNbc dirigidos al gen raf.
Los transfersomas son aún otro tipo de liposomas, y son agregados de lípidos muy deformables que son candidatos atractivos para vehículos administradores de fármacos. Los transfersomas se pueden describir como gotitas de 5 lípidos que son tan altamente deformables que pueden penetrar fácilmente a través de poros que son menores que la gotita. Los transfersomas son adaptables al medio en que se usan, por ejemplo, son autooptimizantes (adaptativos a la forma de los poros de la piel), autorreparantes, frecuentemente alcanzan sus dianas sin fragmentarse y con frecuencia se autocargan. Para hacer transfersomas es posible añadir activadores del borde de superficie, habitualmente tensioactivos, a una composición liposómica estándar. Los transfersomas se han usado 10 para administrar seroalbúmina a la piel. Se ha mostrado que la administración mediada por transfersomas de seroalbúmina es tan eficaz como la inyección subcutánea de una solución que contiene seroalbúmina.
Los tensioactivos encuentran amplia aplicación en formulaciones tal como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y liposomas. La manera más común de clasificar y ordenar las propiedades de muchos tipos diferentes de 15 tensioactivos, tanto naturales como sintéticos, es mediante el uso del equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB). La naturaleza del grupo hidrofílico (también conocido como la “cabeza”) proporciona el medio más útil para categorizar los diferentes tensioactivos usados en formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, p. 285).
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Si la molécula de tensioactivo no se ioniza, se clasifica como tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos encuentran amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y son utilizables en un amplio intervalo de valores de pH. En general sus valores HLB varían desde 2 hasta aproximadamente 18 dependiendo de su estructura. Los tensioactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos tal como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres sorbitanos, ésteres de sacarosa y ésteres 25 etoxilados. Las alcanolamidas y éteres no iónicos tal como etoxilatos de alcohol graso, alcohol propoxilados, y polímeros en bloque etoxilados/propoxilados también se incluyen en esta clase. Los tensioactivos de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de tensioactivos no iónicos.
Si la molécula de tensioactivo lleva una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensioactivo se 30 clasifica como aniónico. Los tensioactivos aniónicos incluyen carboxilatos tal como jabones, lactilatos de acilo, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tal como sulfatos de alquilo y sulfatos de alquilo etoxilados, sulfonatos tal como sulfonatos de alquilbenceno, isetionatos de acilo, tauratos de acilo y sulfosuccinatos, y fosfonatos. Los miembros más importantes de la clase de tensioactivos aniónicos son los sulfatos de alquilo y los jabones. 35
Si la molécula de tensioactivo lleva una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como catiónico. Los tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más usados de esta clase.
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Si la molécula de tensioactivo tiene la capacidad para llevar bien una carga positiva o negativa, el tensioactivo se clasifica como anfótero. Los tensioactivos anfóteros incluyen derivados de ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfátidos.
El uso de tensioactivos en productos, formulaciones y emulsiones de fármacos se ha revisado (Rieger, en 45 Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, p. 285).
Potenciadores de penetración
En una forma de realización, la presente invención emplea varios potenciadores de penetración para realizar la 50 administración eficaz de ácidos nucleicos, particularmente ARNbc, a la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presente en solución tanto en las formas ionizada como no ionizada. Sin embargo, habitualmente solo los fármacos solubles en lípidos o lipofílicos cruzan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso fármacos no lipofílicos pueden cruzar las membranas celulares si la membrana que se va a cruzar se trata con un potenciador de penetración. Además de ayudar a la difusión de fármacos no lipofílicos a través de membranas 55 celulares, los potenciadores de penetración también aumentan la permeabilidad de fármacos lipofílicos.
Los potenciadores de penetración se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco categorías amplias, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Cada una de las clases mencionadas 60 anteriormente de potenciadores de penetración se describe a continuación en mayor detalle.
Tensioactivos: En relación con la presente invención, tensioactivos (o “agentes activos de superficie”) son entidades químicas que, cuando se disuelven en una solución acuosa, reducen la tensión de superficie de la solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro líquido, con el resultado de que la absorción de los ARNbc a través 65 de la mucosa aumenta. Además de sales biliares y ácidos grasos, estos potenciadores de penetración incluyen, por
ejemplo, lauril sulfato de sodio, polioxietileno-9-lauril éter y polioxietileno-20 cetil éter) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); y emulsiones perfluoroquímicas tal como FC-43 Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Ácidos grasos: Varios ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de penetración incluyen, por 5 ejemplo, ácido oleico, ácido laurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-didecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres alquílicos de C.sub.1-10 de los mismos (por ejemplo, metilo, isopropilo y t-butilo), y mono- y di-glicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., 10 Critical Reviews in Therapeutic Drug Carryier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Sales biliares: El papel fisiológico de la bilis incluye facilitar la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas liposolubles (Brunton, Capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9ª Ed., 15 Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, Nueva York, 1996, pp. 934-935). Varias sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan como potenciadores de penetración. Por tanto, el término “sales biliares” incluye cualquiera de los componentes naturales de la bilis así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares de la invención incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o sus sal de sodio farmacéuticamente aceptable, colato de sodio), ácido dehidrocólico (dehidracolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de 20 sodio), ácido glicólico (glicolato de sodio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio), ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sodio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio y polioxietileno-9-lauril éter (POE) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39 En: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed., 25 Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Agentes quelantes: Los agentes quelantes, usados en relación con la presente invención, se pueden definir como 30 compuestos que eliminan iones metálicos de la solución formando complejos con ellos, con el resultado de que la absorción de los ARNbc a través de la mucosa aumenta. Con respecto a su uso como potenciadores de penetración en la presente invención, los agentes quelantes tienen la ventaja añadida de que también sirven como inhibidores de DNasa, ya que la mayoría del ADN nucleasas caracterizadas requieren un ion metálico divalente para la catálisis y por tanto son inhibidas por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Los agentes quelantes 35 de la invención incluyen pero no están limitados a etilendiaminotetraacetato de sodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilato), derivados N-acilo de colágeno, derivados laureth-9 y N-aminoacilo de beta-dicetonas (enaminas) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51). 40
No tensioactivos no quelantes: Como se usa en el presente documento, los compuestos potenciadores de penetración no tensioactivos no quelantes se pueden definir como compuestos que demuestran actividad insignificante como agentes quelantes o como tensioactivos pero que no obstante potencian la absorción de los ARNbc a través de la mucosa alimentaria (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 45 1-33). Esta clase de potenciadores de penetración incluye, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil- y 1-alquenilazacicloalcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tal como diclofenaco sódico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
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También se pueden añadir agentes que potencian la captación de los ARNbc a nivel celular a las composiciones farmacéuticas y otras de la presente invención. Por ejemplo, lípidos catiónicos, tal como lipofectina (Junichi et al., patente en EE UU No. 5.705.188), derivados catiónicos de glicerol, y moléculas policatiónicas, tal como polilisina (Lollo et al., solicitud PCT WO 97/30731), también se sabe que aumentan la captación celular de ARNbc.
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Se pueden utilizar otros agentes para aumentar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, incluyendo glicoles tal como etilenglicol y propilenglicol, pirroles tal como 2-pirrol, azonas, y terpenos tal como limoneno y mentona.
Soportes 60
Ciertas composiciones de la presente invención también incorporan compuestos soporte en la formulación. Como se usa en el presente documento, “compuesto soporte” o “soporte” se puede referir a un ácido nucleico, o análogo del mismo, que es inerte (es decir, no posee actividad biológica por sí) pero se reconoce como un ácido nucleico por procesos in vivo que reduce la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo, 65 degradando el ácido nucleico biológicamente activo o fomentando su eliminación de la circulación. La
coadministración de un ácido nucleico y un compuesto soporte, típicamente con un exceso de la última sustancia, puede producir una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñón u otras reservas extracirculatorias, presumiblemente debido a la competición entre el compuesto soporte y el ácido nucleico para un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARNbc parcialmente fosforotioato en tejido hepático se puede reducir cuando se coadministra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-5 acetamido-4’-isotiocinao-estilbeno-2,2’-disulfónico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
Excipientes
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En contraste a un compuesto soporte, un “soporte farmacéutico” o “excipiente” es un solvente, agente de suspensión farmacéuticamente aceptable o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para administrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, con la manera de administración planeada en mente, para que proporcione la masa, consistencia, etc., deseadas cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica determinada. Los soportes 15 farmacéuticos típicos incluyen, pero no están limitados a, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.), rellenos (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, 20 acetato de sodio, etc.), disgregantes (por ejemplo, almidón, glicolato sódico de almidón, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio).
También se pueden usar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionan perjudicialmente con ácidos nucleicos para formular las 25 composiciones de la presente invención. Los soportes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Las formulaciones para la administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no 30 estériles, soluciones no acuosas en solventes comunes tal como alcoholes, o soluciones de ácidos nucleicos en bases oleaginosas líquidas o sólidas. Las soluciones también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Se pueden usar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionan perjudicialmente con ácidos nucleicos.
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Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no están limitados a, agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Otros componentes 40
Las composiciones de la presente invención pueden contener además otros componentes adjuntos encontrados convencionalmente en composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en la técnica. Por tanto, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos, compatibles adicionales tal como, por ejemplo, antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener 45 materiales adicionales útiles en formular físicamente varias formas farmacéuticas de las composiciones de la presente invención, tal como tintes, agentes saborizantes, conservantes, antioxidantes, opacifantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, tales materiales, cuando se añaden, no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, 50 conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interaccionan perjudicialmente con el/los ácido(s) nucleico(s) de la formulación.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión incluyendo, 55 por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
Ciertas formas de realización de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos antisentido y (b) uno u otros más agentes quimioterapéuticos que funcionan por un mecanismo no 60 antisentido. Los ejemplos de tales agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no están limitados a, daunorubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, esorubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinósido, bis-cloroetilnitrosurea, busulfán, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrógeno, 65 melfalán, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-
hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etopósido (VP-16), trimetrexato, irinotecano, topotecano, gemcitabina, tenipósido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Véase, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15ª Ed. 1987, pp. 1206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, N.J. Cuando se usan con los compuestos de la invención, tales agentes quimioterapéuticos se pueden usar individualmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido), secuencialmente (por 5 ejemplo, 5-FU y oligonucleótido durante un periodo de tiempo seguido por MTX y oligonucleótido), o en combinación con uno u otros más de tales agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, 5-FU, MTX y oligonucleótido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleótido). También se pueden combinar fármacos antiinflamatorios, incluyendo pero no limitados a fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticoesteroides, y fármacos antivirales, incluyendo pero no limitados a ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, en las composiciones de la invención. Véase, en general, The 10 Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15ª Ed., pp. 1206-1228, Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J. páginas 2499-2506 y 46-49, respectivamente). Otros agentes quimioterapéuticos no antisentido también están dentro del ámbito de esta invención. Se pueden usar dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente.
Se pueden determinar la toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos por procedimientos farmacéuticos 15 estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como el cociente DL50/DE50. Los compuestos que muestran altos índices terapéuticos son preferidos.
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Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosis para uso en seres humanos. La dosis de las composiciones de la invención está generalmente en un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar en este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar 25 inicialmente de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentraciones circulantes en plasma del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto polipeptídico de una secuencia diana (por ejemplo, alcanzar una concentración disminuida del polipéptido) que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza una inhibición semimáxima de los síntomas) determinada en cultivo celular. Tal información se puede usar para determinar de forma más precisa las 30 dosis útiles en seres humanos. Se pueden medir los niveles en plasma, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.
Además de su administración individualmente o como una pluralidad, como se ha comentado anteriormente, los ARNbc de la invención se pueden administrar en combinación con otros agentes conocidos eficaces en el 35 tratamiento de procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5. En cualquier caso, el médico puede ajustar la cantidad y ritmo de la administración de ARNbc en base a los resultados observados usando medidas estándar de eficacia conocidas en la técnica o descritas en el presente documento.
Métodos para tratar enfermedades causadas por la expresión del gen Eg5 40
Se describe el uso de un ARNbc o una composición farmacéutica preparada a partir del mismo para el tratamiento de cáncer, por ejemplo, para inhibir el crecimiento tumoral y la metástasis tumoral. Por ejemplo, el ARNbc o una composición farmacéutica preparada a partir del mismo se puede usar para el tratamiento de tumores sólidos, como cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cerebral, cáncer abdominal, cáncer de colon, 45 cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer gastrointestinal, glioma, cáncer de hígado, cáncer de lengua, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, retinoblastoma, tumor de Wilm, mieloma múltiple y para el tratamiento de cáncer de piel, como melanoma, para el tratamiento de linfomas y cáncer de sangre. Se describe además el uso de ARNbc según la invención o una composición farmacéutica preparada a partir del mismo para inhibir la expresión de eg5 y/o para inhibir la acumulación de líquido ascítico y 50 derrame pleural en diferentes tipos de cáncer, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cerebral, cáncer abdominal, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer gastrointestinal, glioma, cáncer de hígado, cáncer de lengua, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, retinoblastoma, tumor de Wilm, mieloma múltiple, cáncer de piel, melanoma, linfomas y cáncer de sangre. Debido al efecto inhibitorio sobre la expresión de eg5, un ARNbc según la invención o 55 una composición farmacéutica preparada a partir del mismo puede aumentar la calidad de vida.
También se describe el uso de un ARNbc o una composición farmacéutica preparada a partir del mismo, por ejemplo, para tratar cáncer o para prevenir metástasis tumoral, en combinación con otros fármacos y/o otros métodos terapéuticos, por ejemplo, con fármacos conocidos y/o métodos farmacéuticos conocidos, tal como, por 60 ejemplo, los que se emplean actualmente para tratar cáncer y/o para prevenir metástasis tumoral. Se da preferencia a una combinación con terapia de radiación y agentes quimioterapéuticos, tal como cisplatino, ciclofosfamida, 5-fluorouracilo, adriamicina, daunorubicina o tamoxifeno. Otras formas de realización incluyen el uso de un segundo ARNbc usado para inhibir la expresión de VEGF.
65
También se describe un agente de iARN específico, en combinación con otro agente quimioterapéutico anticanceroso, tal como cualquier agente quimioterapéutico convencional, u otro ARNbc usado para inhibir la expresión de VEGF. La combinación de un agente de unión específico con tales otros agentes puede potenciar el protocolo quimioterapéutico. Numerosos protocolos quimioterapéuticos se presentarán ellos mismos en la mente del médico experto como que pueden incorporarse en el método de la invención. Cualquier agente quimioterapéutico se 5 puede usar incluyendo agentes alquilantes, antimetabolitos, hormonas y antagonistas, radioisótopos, así como productos naturales. Por ejemplo, el compuesto de la invención se puede administrar con antibióticos tal como doxorubicina y otros análogos de antraciclina, mostazas de nitrógeno tal como ciclofosfamida, análogos de pirimidina tal como 5-fluorouracilo, cisplatino, hidroxiurea, taxol y sus derivados naturales y sintéticos, y similares. Como otro ejemplo, en el caso de tumores mixtos, tal como adenocarcinoma de la mama, donde los tumores incluyen células 10 dependientes de gonadotropina e independientes de gonadotropina, el compuesto se puede administrar junto con leuprolida o goserelina (análogos peptídicos sintéticos de LH-RH). Otros protocolos antineoplásicos incluyen el uso de un compuesto tetraciclina con otra modalidad de tratamiento, por ejemplo, cirugía, radiación, etc., también denominado en el presente documento “modalidades neoplásicas adjuntas”. Por tanto, el método de la invención se puede emplear con tales pautas convencionales con el beneficio de reducir los efectos secundarios y aumentar la 15 eficacia.
Métodos para inhibir la expresión del gen Eg5
Además se describe un método para inhibir la expresión del gen Eg5 en un mamífero. El método comprende 20 administrar una composición de la invención al mamífero de modo que la expresión del gen diana Eg5 se silencia. Debido a su alta especificidad, los ARNbc de la invención específicamente se dirigen a ARN (primarios o procesados) del gen diana Eg5. Las composiciones y métodos para inhibir la expresión de estos genes Eg5 usando ARNbc se puede realizar como se describe en otro lugar en el presente documento.
25
Tal método puede comprender administrar una composición que comprende un ARNbc, en donde el ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos una parte de un transcrito de ARN del gen Eg5 del mamífero que se va a tratar. Cuando el organismo que se va a tratar es un mamífero tal como un ser humano, la composición se puede administrar por cualquier medio conocido en la técnica incluyendo, pero no limitado a vías oral o parenteral, incluyendo administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, a 30 vías respiratorias (aerosol), nasal, rectal, y tópica (incluyendo yugal y sublingual). Las composiciones se pueden administrar por infusión o inyección intravenosa.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende el experto en la materia a la que pertenece la invención. Aunque se 35 pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la invención, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, controlará. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solo y no se pretende que sean limitantes.
40
Ejemplos
Desplazamiento génico del gen Eg5
Conjunto de cribado inicial 45
Se llevó a cabo diseño de ARNip para identificar ARNip que se dirigen a Eg5 (también conocido como KIF11, HSKP, KNSL1 y TRIP5). Se usaron secuencias de ARNm humanas para Eg5, RfeSeq ID número: NM_004523.
Se diseñaron dúplex de ARNip con reacción cruzada para EG5 humano y de ratón. Se sintetizaron veinticuatro 50 dúplex para el cribado (Tabla 1).
Conjunto de cribado expandido
Se definió un segundo conjunto de cribado con 266 ARNip que se dirigen a EG5 humano, así como su ortólogo de 55 mono rhesus (tabla 2). Se seleccionó un conjunto de cribado expandido con 328 ARNip que se dirigen a EG5 humano, sin necesitar de acertar ningún ARNm de EG5 de otras especies (tabla 3).
Las secuencias para los ARNm de EG% humana y una parcial de rhesus se descargaron de la base de datos de nucleótidos del NCBI y la secuencia humana además se usó como secuencia de referencia (EG5 humana: 60 NM_004523.2, 4908 pb, y EG5 de rhesus: XM_001087644.1, 878 pb (solo la parte 5’ de EG5 humana).
Para la identificación de secuencias de EG5 de rhesus adicionales se realizó una búsqueda mega blast con la secuencia humana en NCBI contra el genoma de referencia de rhesus. La secuencia de rhesus descargada y las regiones acertadas y los ciertos de blast se ensamblaron a una secuencia consenso de rhesus con una identidad de 65 ~92% a EG5 humana sobre la longitud total.
Se extrajeron todos los posibles candidatos 19 meros de la secuencia de ARNm humana, produciendo el conjunto de sitios diana candidatos correspondientes a 4890 (hebra sentido) secuencias de ARNip de EG5 que reaccionan con humano.
5
La reactividad cruzada humano-rhesus como prerrequisito para la selección in silico de los ARNip para un cribado inicial clasificó este conjunto de candidatos. Para determinar los ARNip reactivos con rhesus, se buscó la presencia de cada sitio diana de ARNip candidato en la secuencia de rhesus ensamblada. Además, la especificidad pronosticada del ARNip como criterio para la selección de fuera del conjunto de ARNip de reacción cruzada humano-rhesus, se manifestó por direccionamiento a secuencias de ARNm de EG5 humanas, pero no otros ARNm 10 humanos.
La especificidad de un ARNip se puede expresar a través de su potencial para dirigirse a otros genes, que se denominan “genes inespecíficos”.
15
Para pronosticar el potencial inespecífico de un ARNip, se hicieron las siguientes suposiciones:
1) el potencial inespecífico de una hebra se puede deducir del número y distribución de los malos apareamientos a un gen inespecífico
2) el inespecífico más relevante, es decir, el gen pronosticado que tiene la mayor probabilidad de ser 20 silenciado debido a la tolerancia de malos apareamientos, determina el potencial inespecífico de la hebra
3) las posiciones 2 a 9 (contando de 5’ a 3’) de una hebra (región semilla) pueden contribuir más al potencial inespecífico que el resto de la secuencia (es decir la región no semilla y de sitio de corte)
4) las posiciones 10 y 11 (contando de 5’ a 3’) de una hebra (región del sitio de corte) pueden contribuir más al potencial inespecífico que la región no semilla (es decir posiciones 12 a 18, contando de 5’ a 3’) 25
5) las posiciones 1 y 19 de cada hebra no son relevantes para las interacciones inespecíficas
6) el potencial inespecífico se puede expresar por la puntuación inespecífica del inespecífico más relevante, calculado basado en el número y posición de malos apareamientos de la hebra con la región más homóloga en el gen inespecífico considerando las suposiciones 3 a 5
7) el potencial inespecífico de la hebra antisentido y sentido será relevante, mientras el fracaso potencial de la 30 actividad de la hebra sentido por modificaciones internas introducidas es probable.
Los ARNip con bajo potencial inespecífico se definieron como preferibles y se supuso que eran más específicos.
Para identificar ARNip específicos a EG5 humano, se hizo una búsqueda en todos los otros transcritos humanos, 35 que se consideraron todos potenciales inespecíficos, para regiones diana potenciales para secuencias de hebra sentido 19meros con reactividad cruzada humana-rhesus así como hebras antisentido complementarias. Para esto, se usó el algoritmo fastA para determinar la región de acierto más homóloga en cada secuencia de la base de datos RefSeq humana, que se asume representa el transcriptoma humano exhaustivo.
40
Para clasificar todos los inespecíficos potenciales según las suposiciones 3 a 5, y mediante esto identificar el gen inespecífico más relevante y su puntuación inespecífica, se analizaron los ficheros de salida de fastA adicionalmente con un perl script.
El guión extrajo las siguientes propiedades inespecíficas para cada secuencia de entrada 19mera y cada gen 45 inespecífico para calcular la puntuación inespecífica:
Número de malos apareamientos en la región no semilla
Número de malos apareamientos en la región semilla 50
Número de malos apareamientos en la región del sitio de corte
La puntuación inespecífica se calculó considerando las suposiciones 3 a 5 como sigue:
55
Puntuación inespecífica = número de malos apareamientos semilla * 10
+ número de malos apareamientos en sitio de corte * 1,2
+ número de malos apareamientos en no semilla * 1 60
El gen inespecífico más relevante para cada secuencia 19mera se definió como el gen con la menor puntuación inespecífica. Según esto, la menor puntuación inespecífica se definió como representativa para el potencial inespecífico de una hebra.
65
Para el conjunto de cribado en la tabla 2, se eligió una puntuación inespecífica de 3 o más para la hebra antisentido y 2 o más para la hebra sentido como prerrequisito para las selección de los ARNip, mientras que todas las secuencias que contenían 4 o más G consecutivas (secuencias poli-G) se excluyeron. Se seleccionaron 266 secuencias con reactividad cruzada humana-rhesus que pasaban el criterio de especificidad basado en este criterio de valoración (véase la tabla 2). 5
Para la definición del conjunto de cribado expandido la reactividad cruzada a rhesus se pasó por alto, se volvió a calcular la especificidad pronosticada basada en la base de datos RefSeq humana nuevamente disponible y se seleccionaron solo esos 328 ARNip sin poli-G con puntuación inespecífica de 2,2 o más para la hebra antisentido y sentido (véase la tabla 3). 10
Para las tablas: Clave: A, G, C, U - ribonucleótidos: T - desoxitimidina: u, c - 2’-O-metil nucleótidos: s - enlace fosforotioato
Síntesis de ARNbc 15
Fuente de reactivos
Donde la fuente de un reactivo no se da específicamente en el presente documento, tal reactivo se puede obtener de cualquier suministrador de reactivos para biología molecular en una calidad/pureza estándar para aplicación en 20 biología molecular.
Síntesis de ARNip
Se produjeron los ARN monocatenarios por síntesis en fase sólida en una escala de 1 μmol usando un sintetizador 25 Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemania) y vidrio de poro controlado (CPG, 500 Å, Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania) como soporte sólido. Se generaron ARN y ARN que contenía 2’-O-metil nucleótidos por síntesis en fase sólida empleando las correspondientes fosforamiditas y 2’-O-metilfosforamiditas, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania). Estos bloques estructurales se incorporaron en sitios seleccionados en la secuencia de la cadena de oligonucleótidos usando química de 30 fosforamidita de nucleósidos estándar tal como se describe en Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE UU. Se introdujeron enlaces fosforotioato por sustitución de la solución oxidante de yodo con una solución del reactivo de Beaucage (Chruachem Ltd, Glasgow, RU) en acetonitrilo (1%). Se obtuvieron reactivos secundarios adicionales de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemania). 35
La desprotección y purificación de los oligonucleótidos crudos por HPLC de intercambio aniónico se llevó a cabo según procedimientos establecidos. Se determinaron rendimientos y concentraciones por absorción UV de una solución del ARN respectivo a una longitud de onda de 260 nm usando un fotómetro espectral (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleißheim, Alemania). Se generó ARN bicatenario mezclando una solución equimolar de 40 hebras complementarias en tampón de hibridación (fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8; cloruro de sodio 100 mM), se calentó en un baño de agua a 85-90ºC durante 3 minutos y se enfrió a temperatura ambiente durante un periodo de 3-4 horas. La solución de ARN hibridada se almacenó a -20ºC hasta su uso.
Para la síntesis de ARNip conjugados a 3’-colesterol (en el presente documento denominado -Col-3’), se usó un 45 soporte sólido apropiadamente modificado para la síntesis del ARN. El soporte sólido modificado se preparó como sigue:
Dietil-2-azabutano-1,4-dicarboxilato AA
50
Una solución acuosa 4,7 M de hidróxido de sodio (50 ml) se añadió en un solución agitada, helada de clorhidrato de glicinato de etilo (32,19 g, 0,23 mol) en agua (50 ml). A continuación, se añadió acrilato de etilo (23,1 g, 0,23 mol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta que la terminación de la reacción se determinó por TLC. Después 55 de 19 h la solución se repartió con diclorometano (3 x 100 ml). La fase orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y evaporó. El residuo se destiló para dar AA (28,8 g, 61%).
Éster etílico del ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonil-amino)-hexanoil]-amino}-propiónico AB
60
Se disolvió ácido Fmoc-6-amino-hexanoico (9,12 g, 25,83 mmol) en diclorometano (50 ml) y se enfrió con hielo. Se añadió diisopropilcarbodiimida (3,25 g, 3,99 ml, 25,83 mmol) a la solución a 0ºC. Después se siguió por la adición de dietil-2-azabutano-1,4-dicarboxilato (5 g, 24,6 mmol) y dimetilaminopiridina (0,305 g, 2,5 mmol). La solución se llevó 5 a temperatura ambiente y se agitó además durante 6 h. La terminación de la reacción se determinó por TLC. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se añadió acetato de etilo para precipitar diisopropilurea. La suspensión se filtró. El filtrado se lavó con ácido clorhídrico acuoso al 5%, bicarbonato de sodio al 5% y agua. La fase orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para dar el producto crudo que se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 50%/hexanos) para dar 11,87 g (88%) de AB. 10
Éster etílico del ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiónico AC
15
Se disolvió éster etílico del ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-hexanoil]-amino}-propiónico AB (11,5 g, 21,3 mmol) en piperidina al 20% en dimetilformamida a 0ºC. La solución se siguió agitando durante 1 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío, se añadió agua al residuo, y el producto se extrajo con acetato de etilo. El producto crudo se purificó por conversión a su sal clorhidrato.
20
Éster etílico del ácido 3-({6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-etoxicarbonilmetil-amino)propiónico AD
25
La sal clorhidrato del éster etílico del ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiónico AC (4,7 g, 14,8 mmol) se absorbió en diclorometano. La suspensión se enfrió a 0ºC en hielo. A la suspensión se añadió diisopropiletilamina (3,87 g, 5,2 ml, 30 mmol). A la solución resultante se añadió clorformiato de colesterilo (6,675 g, 14,8 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con ácido clorhídrico al 10%. El producto se purificó por cromatografía rápida (10,3 g, 92%). 30
Éster etílico del ácido 3-({6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-4-oxo-pirrolidina-3-carboxílico AE
Se hizo una papilla con t-butóxido de potasio (1,1 g, 9,8 mmol) en 30 ml de tolueno anhidro. La mezcla se enfrió a 0ºC en hielo y se añadieron 5 g (6,6 mmol) de diéster AD lentamente con agitación en 20 minutos. La temperatura se mantuvo por debajo de 5ºC durante la adición. La agitación siguió durante 30 min a 0ºC y se añadió 1 ml de ácido 5 acético glacial, inmediatamente seguido por 4 g de NaH2PO4·H2O en 40 ml de agua. La mezcla resultante se extrajo dos veces con 100 ml de diclorometano cada una y los extractos orgánicos combinados se lavaron dos veces con 10 ml de tampón fosfato cada vez, se secaron, y evaporaron a sequedad. El residuo se disolvió en 60 ml de tolueno, se enfrió a 0ºC y se extrajo con tres porciones de 50 ml de tampón carbonato pH 9,5 frío. Los extractos acuosos se ajustaron a pH 3 con ácido fosfórico, y se extrajeron con cinco porciones de 40 ml de cloroformo que se combinaron, 10 secaron y evaporaron a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columna usando acetato de etilo al 25%/hexano para dar 1,9 de b-cetoéster (39%).
Éster 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a] fenantren-3-ílico del ácido [6-(3-hidroxi-4-hidroximetil-pirrolidin-1-il)-6-oxo-hexil]carbámico AF 15
Se añadió metanol (2 ml) gota agota durante un periodo de 1 h a una mezcla a reflujo del b-cetoéster AE (1,5 g, 2,2 20 mmol) y borohidruro de sodio (0,226 g, 6 mmol) en tetrahidrofurano (10 ml). Se siguió agitando a temperatura de reflujo durante 1 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió HCl 1 N (12,5 ml), la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 40 ml). La fase de acetato de etilo combinada se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío para dar el producto que se purificó por cromatografía en columna (MeOH al 10%/CHCl3) (89%).
25
Éster 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a] fenantren-3-ílico del ácido (6-{3-[bis(4-metoxi-fenil)-fenil-metoximetil]-4-hidroxi-pirrolidin-1-il}-6-oxo-carbámico AG
Se secó el diol AF (1,25 g, 1,994 mmol) evaporando con piridina (2 x 5 ml) al vacío. Se añadieron piridina anhidra (10 ml) y cloruro de 4,4’-dimetoxitritilo (0,724 g, 2,13 mmol) con agitación. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se extinguió mediante la adición de metanol. La mezcla de reacción se 5 concentró al vacío y se añadió diclorometano (50 ml) al residuo. La fase orgánica se lavó con bicarbonato de sodio acuoso 1 M. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y concentró. La piridina residual se eliminó evaporando con tolueno. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna (MeOH al 2%/cloroformo, Rf = 0,5 en MeOH al 5%/CHCl3) (1,75 g, 95%).
10
Éster mono-(4-[bis-(4-metoxi-fenil)-fenil-metoximetil]-1-{6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-pirrolidin-3-ílico) del ácido succínico AH
15
El compuesto AG (1,0 g, 1,05 mmol) se mezcló con anhídrido succínico (0,150 g, 1,5 mmol) y DMAP (0,073 g, 0,6 mmol) y se secó al vacío a 40ºC durante la noche. La mezcla se disolvió en diclorometano anhidro (3 ml), se añadió trietilamina (0,318 g, 0,440 ml, 3,15 mmol) y la solución se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de argón durante 16 h. Después se diluyó con diclorometano (40 ml) y se lavó con ácido cítrico acuoso helado (al 5% en peso, 20 30 ml) y agua (2 x 20 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a sequedad. El residuo se usó como tal para el siguiente paso.
CPG modificado con colesterol AI
25
El succinato AH (0,254 g, 0,242 mmol) se disolvió en una mezcla de diclorometano/acetonitrilo (3:2, 3 ml). A esa solución se añadieron sucesivamente DMAP (0,0296 g, 0,242 mmol) en acetonitrilo (1,25 ml) y 2,2’-ditio-bis(5-nitropiridina) (0,075 g, 0,242 mmol) en acetonitrilo/dicloroetano (3:1, 1,25 ml). A la solución resultante se añadió 5 trifenilfosfina (0,064 g, 0,242 mmol) en acetonitrilo (0,6 ml). La mezcla de reacción se volvió de color naranja brillante. La solución se agitó brevemente usando un agitador con movimiento de muñeca (5 min). Se añadió alquilamina de cadena larga-CPG (LCAA-CPG) (1,5 g, 61 mM). La suspensión se agitó durante 2 horas. El CPG se filtró a través de un embudo sinterizado y se lavó con acetonitrilo, diclorometano y éter sucesivamente. Los grupos amino sin reaccionar se enmascararon usando anhídrido acético/piridina. La carga alcanzada del CPG se midió 10 tomando medidas de UV (37 mM/g).
La síntesis de los ARNip que llevan un grupo bisdecilamida del ácido 5’-12-dodecanoico (en el presente documento denominado “5’-C32-“) o un grupo derivado de 5’-colesterilo (en el presente documento denominado “-5’-Col-“) se realizó como se describe en el documento WO 2004/065061, excepto que, para el derivado colesterilo, el paso de 15 oxidación se realizó usando el reactivo de Beaucage para introducir un enlace fosforotioato en el extremo 5’ de oligómero de ácido nucleico.
Las secuencias de ácidos nucleicos se representan a continuación usando nomenclatura estándar, y específicamente las abreviaturas de la tabla 4. 20
Tabla 4: Abreviaturas de monómeros de nucleótidos usados en la representación de ácidos nucleicos. Se entenderá que estos monómeros, cuando están presentes en un oligonucleótido, es mutuamente unidos por enlaces 5’-3’-fosfodiéster.
25
Abreviaturasª
Nucleótido(s)
A, a
2’-desoxi-adenosina-5’-fosfato, adenosina-5’-fosfato
C, c
2’-desoxi-citidina-5’-fosfato, citidina-5’-fosfato
G, g
2’-desoxi-guanosina-5’-fosfato, guanosina-5’-fosfato
T, t
2’-desoxi-timidina-5’-fosfato, timidina-5’-fosfato
U, u
2’-desoxi-uridina-5’-fosfato, uridina-5’-fosfato
N, n
cualquier 2’-desoxinucleótido/nucleótido (G, A, C o T, g, a, c o u)
Am
2’-O-metiladenosina-5’-fosfato
Cm
2’-O-metilcitidina-5’-fosfato
Gm
2’-O-metilguanosina-5’-fosfato
Tm
2’-O-metiltimidina-5’-fosfato
Um
2’-O-metiluridina-5’-fosfato
Af
2’-fluoro-2’-desoxi-adenosina-5’-fosfato
Cf
2’-fluoro-2’-desoxi-citidina-5’-fosfato
Gf
2’-fluoro-2’-desoxi-guanosina-5’-fosfato
Tf
2’-fluoro-2’-desoxi-timidina-5’-fosfato
Uf
2’-fluoro-2’-desoxi-uridina-5’-fosfato
A, C, G, T, U, a, c, g, t, u
subrayado: nucleósido-5’-fosforotioato
am, cm, gm, tm, um
subrayado: 2-O-metil-nucleósido-5’-fosforotioato
ª Las letras mayúsculas representan 2’-desoxirribonucleótidos (ADN), las letras minúsculas representan ribonucleótidos (ARN).
Vectores de expresión de ARNbc
30
En otro aspecto de la invención, moléculas de ARNbc específicas para Eg5 que modulan la actividad de la expresión del gen Eg5 se expresan de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (véase, por ejemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillem, A., et al., publicación PCT Internacional No. WO 00/22113, Conrad, publicación PCT internacional No. WO 00/22114, y Conrad, patente en EE UU No. 6.054.299). Estos transgenes se
pueden introducir como una construcción lineal, una plásmido circular, o un vector vírico, que se puede incorporar y heredar como un transgén integrado en el genoma del huésped. El transgén también se puede construir para permitir que se herede como un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
5
Las hebras individuales de un ARNbc se pueden transcribir por promotores en dos vectores de expresión separados y cotransfectar en una célula diana. Alternativamente, cada hebra individual del ARNbc se puede transcribir por promotores que están localizados ambos en el mismo plásmido de expresión. En una forma de realización preferida, un ARNbc se expresa como una repetición invertida unida por una secuencia de polinucleótido enlazador de modo que el ARNbc tenga una estructura de tallo y bucle. 10
Los vectores de expresión de ARNbc recombinante generalmente son plásmidos de ADN o vectores víricos. Los vectores víricos que expresan ARNbc se pueden construir basados en, pero no limitados a, virus adenoasociados (para una revisión, véase Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. lmmunol. (1992) 158:97-129)); adenovirus (véase, por ejemplo, Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434), y Rosenfeld et 15 al. (1992), Cell 68:143-155)); o alfavirus así como otros conocidos en la técnica. Los retrovirus se han usado para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentes, incluyendo, células epiteliales, in vitro y/o in vivo (véase, por ejemplo, Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, 20 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; patente en EE UU No. 4.868.116; patente en EE UU No. 4.980.286; solicitud PCT WO 89/07136; solicitud PCT WO 89/02468; solicitud PCT WO 89/05345; y solicitud PCT WO 92/07573). Los vectores retrovíricos recombinantes capaces de transducir y 25 expresar genes insertados en el genoma de una célula se pueden producir transfectando el genoma retrovírico recombinante en líneas celulares empaquetadoras adecuadas tal como PA317 y Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349). Los vectores adenovíricos recombinantes se pueden usar para infectar una amplia variedad de células y tejidos en huéspedes susceptibles (por ejemplo, rata, hámster, perro, y chimpancé) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769), y también tienen 30 la ventaja de no requerir células mitóticamente activas para la infección.
El promotor que dirige la expresión del ARNbc en un plásmido de ADN o vector vírico de la invención puede ser un promotor eucariota de ARN polimerasa I (por ejemplo, promotor de ARN ribosómico), ARN polimerasa II (por ejemplo, promotor temprano de CMV o promotor de actina o promotor de ARNnp U1) o en general de ARN 35 polimerasa III (por ejemplo promotor de ARNnp U6 o ARN 7SK) o un promotor procariota, por ejemplo, el promotor de T7, siempre que el plásmido de expresión también codifique la ARN polimerasa de T7 requerida para la transcripción del promotor de T7. El promotor también puede dirigir la expresión del transgén al páncreas (véase, por ejemplo, la secuencia reguladora de insulina para páncreas (Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)). 40
Además, la expresión del transgén se puede regular de forma precisa, por ejemplo, usando una secuencia reguladora y sistemas de expresión inducibles tal como una secuencia reguladora que es sensible a ciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo, niveles circulantes de glucosa, u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Tales sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión del transgén en células 45 o en mamíferos incluyen la regulación por ecdisona, por estrógenos, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización, e isopropil-beta-D1-tiogalactopiranósido (EPTG). Un experto en la materia podría elegir la secuencia reguladora/promotora apropiada basado en el uso pretendido del transgén de ARNbc.
Generalmente, los vectores recombinantes capaces de expresar moléculas de ARNbc se administran como se 50 describe posteriormente, y persisten en las células diana. Alternativamente, se pueden usar vectores víricos que proporcionan expresión transitoria de las moléculas de ARNbc. Tales vectores se pueden administrar repetidamente según sea necesario. Una vez expresados, los ARNbc se unen al ARN diana y modulan su función o expresión. La administración de vectores que expresan ARNbc puede ser sistémica, tal como mediante administración intravenosa o intramuscular, por administración a células diana explantadas del paciente seguido por reintroducción en el 55 paciente, o por cualquier otro medio que permita la introducción en una célula diana deseada.
Los plásmido de ADN de expresión de ARNbc típicamente se transfectan en células diana como un complejo con soportes de lípidos catiónicos (por ejemplo, Oligofectamina) o soportes no basados en lípidos catiónicos (por ejemplo, Transit-TKO™). La invención también contempla múltiples transfecciones con lípidos para silenciamientos 60 mediados por ARNbc que se dirigen a diferentes regiones de un único gen Eg5 o múltiples genes Eg5 durante un periodo de una semana o más. La introducción con éxito de los vectores de la invención en células huéspedes se puede seguir usando varios métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria se puede señalizar con un indicador, tal como un marcador fluorescente, tal como la proteína fluorescente verde (GFP). La transfección estable de células ex vivo se puede asegurar usando marcadores que proporcionan a las células transfectadas una 65
resistencia a factores medioambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tal como resistencia a higromicina B.
Las moléculas de ARNbc específicas de Eg5 también se pueden insertar en vectores y usar como vectores de terapia génica para pacientes humanos. Los vectores de terapia génica se pueden administrar a un sujeto mediante, 5 por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (véase la patente en EE UU No. 5.328.470) o por inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057).La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se embebe el vehículo de administración génica. Alternativamente, donde el vector de administración génica completo se puede producir intacto de células 10 recombinantes, por ejemplo, vectores retrovíricos, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de administración génica.
Cribado in vitro de ARNip de Eg5 a través de proliferación celular
15
Como se ha mostrado que el silenciamiento de Eg5 produce parada mitótica (Weil, D, et al [2002] Biotechniques 33: 1244-8), se usó un ensayo de viabilidad celular para el cribado de la actividad del ARNip. Se sembraron células HeLa (14000 por pocillo [cribados 1 y 3] o 10000 por pocillo [cribado 2])) en placas de 96 pocillos y se transfectaron simultáneamente con Lipofectamina 2000 (Invitrogen) a una concentración final de ARNip en el pocillo de 30 nM y a concentraciones finales de 50 nM (1er cribado) y 25 nM (2º cribado). Se probó un subconjunto de dúplex a 25 nM en 20 un tercer cribado (tabla 5).
Setenta y dos horas después de la transfección, se ensayó la proliferación celular la adición de reactivo WST-1 (Roche) al medio de cultivo, y posterior medida de absorbancia a 450 nm. El valor de absorbancia para células control (sin transfectar) se consideró el 100 por cien, y las absorbancias para los pocillos transfectados con ARNip 25 se compararon al valor control. Se realizaron ensayos en sextuplicado para cada uno de los tres cribados. Un subconjunto de ARNip se probó además en un intervalo de concentraciones de ARNip. Los ensayos se realizaron en células HeLa (14000 por pocillo; el método igual que anteriormente, tabla 5).
Absorbancia relativa a 450 nm
Cribado I Cribado II Cribado III
Dúplex
media de media de media de
AL-DP-6226
20 10 28 11 43 9
AL-DP-6227
66 27 96 41 108 33
AL-DP-6228
56 28 76 22 78 18
AL-DP-6229
17 3 31 9 48 13
AL-DP-6230
48 8 75 11 73 7
AL-DP-6231
8 1 21 4 41 10
AL-DP-6232
16 2 37 7 52 14
AL-DP-6233
31 9 37 6 49 12
AL-DP-6234
103 40 141 29 164 45
AL-DP-6235
107 34 140 27 195 75
AL-DP-6236
48 12 54 12 56 12
AL-DP-6237
73 14 108 18 154 37
AL-DP-6238
64 9 103 10 105 24
AL-DP-6239
9 1 20 4 31 11
AL-DP-6240
99 7 139 16 194 43
AL-DP-6241
43 9 54 12 66 19
AL-DP-6242
6 1 15 7 36 8
AL-DP-6243
7 2 19 5 33 13
AL-DP-6244
7 2 19 3 37 13
AL-DP-6245
25 4 45 10 58 9
AL-DP-6246
34 8 65 10 66 13
AL-DP-6247
53 6 78 14 105 20
AL-DP-6248
7 0 22 7 39 12
AL-DP-6249
36 8 48 13 61 7
Tabla 5 30
Los nueve dúplex de ARNip que mostraron mayor inhibición de crecimiento en la tabla 5 se volvieron a ensayar en un intervalo de concentraciones de ARNip en células HeLa. Las concentraciones de ARNip ensayadas fueron 100 nM, 33,3 nM, 11,1 nM, 3,70 nM, 1,23 nM, 0,41 nM, 0,14 nM y 0,046 nM. Los ensayos se realizaron en sextuplicado, y se calculó la concentración de cada ARNip que produjo inhibición del cincuenta por ciento de la proliferación 35 celular (CI50). Este análisis de dosis y respuesta se realizó entre dos y cuatro veces para cada dúplex. Se dan los valores CI50 medios en la tabla 6.
Dúplex
CI50 media
AL-DP-6226
15,5
AL-DP-6229
3,4
AL-DP-6231
4,2
AL-DP-6232
17,5
AL-DP-6239
4,4
AL-DP-6242
5,2
AL-DP-6243
2,6
AL-DP-6244
8,3
AL-DP-6248
1,9
Tabla 6
Cribado in vitro de ARNip de Eg5 a través de proliferación celular
5
Directamente antes de la transfección, se sembraron células Hela S3 (número de la ATCC: CCL-2.2, LCG Promochem GmbH, Wesel, Alemania) a 1,5 x 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania) en 75 μl de medio de crecimiento (Ham F12, suero de ternera fetal al 10%, penicilina 100 u/estreptomicina 100 μg/ml, todo de Biochrom AG, Berlín, Alemania). Las transfecciones se realizaron en cuadruplicados. Para cada pocillo se mezclaron 0,5 μl de Lipofectamina2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, 10 Alemania) con 12 μl de Opti-MEM (Invitrogen) y se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. Para que la concentración del ARNip fuera 50 nM en los 100 μl del volumen de transfección, se mezclaron 1 μl de ARNip 5 μM con 11,5 μl de Opti-MEM por pocillo, se combinaron con la mezcla Lipofectamina2000-Opti-MEM y de nuevo se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los complejos ARNip-Lipofectamina2000 se aplicaron completamente (25 μl de cada uno por pocillo) a las células y las células se incubaron durante 24 h a 37ºC y CO2 al 15 5% en un incubador humidificado (Heraeus GmbH, Alemania). Se hizo el cribado de dosis única una vez a 50 nM y 25 nM, respectivamente.
Las células se recogieron aplicando 50 μl de mezcla de lisis (contenido del kit QuantiGene bDNA de Genospectra, Fremont, EE UU) a cada pocillo que contenía 100 μl de medio de cultivo y se lisaron a 53ºC durante 30 min. 20 Después de ello, se incubaron 50 μl de los lisados con conjuntos de sondas específicas para Eg5 humano y GADPH humana y se siguió según el protocolo del fabricante para QuantiGene. Al final se midió la quimioluminiscencia en un Victor2-Light (Perkin Elmer, Wiesbaden, Alemania) como ULR (unidades de luz relativas) y los valores obtenidos con el conjunto de sondas de hEg5 se normalizaron a los valores de GADPH respectivos para cada pocillo. Los valores obtenidos con ARNip dirigidos contra Eg5 se refirieron al valor obtenido con un ARNip inespecífico (dirigido contra 25 HCV) que se ajustó al 100% (tablas 1, 2 y 3).
Los ARNip eficaces del cribado se caracterizaron adicionalmente por curvas de dosis y respuesta. Se realizaron las transfecciones de las curvas de dosis y respuesta a las siguientes concentraciones: 100 nM, 16,7 nM, 2,8 nM, 0,46 nM, 77 picoM, 12,8 picoM, 2,1 picoM, 0,35 picoM, 59,5 fM, 9,9 fM y control (sin ARNip) y se diluyeron con Opti-MEM 30 a una concentración final de 12,5 μl según el protocolo anterior. El análisis de datos se realizó usando el software complemento de Microsoft Excel XL-fit 4.2 (IDBS, Guildford, Surrey, RU) y aplicando el modelo de dosis y respuesta número 205 (tablas 1, 2 y 3).
El ARNip inicial AD12115 se analizó además aplicando el ensayo de proliferación WST de Roche (como se ha 35 descrito previamente).
Un subconjunto de 34 dúplex de la tabla 2 que mostraron la mayor actividad se ensayó por transfección en células HeLa a concentraciones finales que variaban desde 100 nM a 10 fM. Las transfecciones se realizaron en cuadruplicado para cada dúplex. Se calculó la concentración que daba el 20% (CI20), 50% (CI50), y el 80%(CI80) de 40 reducción del ARNm de KSP para cada dúplex (tabla 7).
Concentraciones dadas en pM
CI20 CI50 CI80
Nombre del dúplex
1er cribado 2º cribado 1er cribado 2º cribado 1er cribado 2º cribado
AD12077
1,19 0,80 6,14 10,16 38,63 76,16
AD12078
25,43 25,43 156,18 156,18 ND ND
AD12085
9,08 1,24 40,57 8,52 257,68 81,26
AD12095
1,03 0,97 9,84 4,94 90,31 60,47
AD12113
4,00 5,94 17,18 28,14 490,83 441,30
AD12115
0,60 0,41 3,79 3,39 23,45 23,45
AD12125
31,21 22,02 184,28 166,15 896,85 1008,11
AD12134
2,59 5,51 17,87 22,00 116,36 107,03
AD12149
0,72 0,50 4,51 3,91 30,29 40,89
AD12151
0,53 6,84 4,27 10,72 22,88 43,01
AD12152
155,45 7,56 867,36 66,69 13165,27 ND
AD12157
0,30 26,23 14,60 92,08 14399,22 693,31
AD12166
0,20 0,93 3,71 3,86 46,28 20,59
AD12180
28,85 28,85 101,06 101,06 847,21 847,21
AD12185
2,60 0,42 15,55 13,91 109,80 120,63
AD12194
2,08 1,11 5,37 5,09 53,03 30,92
AD12211
5,27 4,52 11,37 18,93 26,74 191,07
AD12257
4,56 5,20 21,68 22,75 124,69 135,82
AD12280
2,37 4,53 6,89 20,23 64,80 104,82
AD12281
8,81 8,65 19,68 42,89 119,01 356,08
AD12282
7,71 456,42 20,09 558,00 ND ND
AD12285
ND 1,28 57,30 7,31 261,79 42,53
AD12292
40,23 12,00 929,11 109,10 ND ND
AD12252
0,02 18,63 6,35 68,24 138,09 404,91
AD12275
25,76 25,04 123,89 133,10 1054,54 776,25
AD12266
4,85 7,80 10,00 32,94 41,67 162,65
AD12267
1,39 1,21 12,00 4,67 283,03 51,12
AD12264
0,92 2,07 8,56 15,12 56,36 196,78
AD12268
2,29 3,67 22,16 25,64 258,27 150,84
AD12279
1,11 28,54 23,19 96,87 327,28 607,27
AD12256
7,20 33,52 46,49 138,04 775,54 1076,76
AD12259
2,16 8,31 8,96 40,12 50,05 219,42
AD12276
19,49 6,14 89,60 59,60 672,51 736,72
AD12321
4,67 4,91 24,88 19,43 139,50 89,49
(ND - no determinado)
Tabla 7
Silenciamiento de Eg5/KSP en hígado en ratas jóvenes después de administración embolada única de ARNip 5 formulado con LNP01
Desde el nacimiento hasta aproximadamente 23 días de edad, la expresión de Eg5/KSP se puede detectar en el hígado de rata en crecimiento. Se evaluó el silenciamiento dirigido con un ARNip de Eg5/KSP formulado en ratas jóvenes. 10
Dúplex de KSP probado
Dúplex ID
Diana Sentido Antisentido
AD6248
KSP AccGAAGuGuuGuuuGuccTsT (SEQ ID NO:1238 ) GGAcAAAcAAcACUUCGGUTsT (SEQ ID NO:1239)
Métodos 15
Dosificación de los animales. Se administraron a ratas Sprague-Dawley jóvenes, machos (19 días de edad) dosis únicas de ARNip formulado con lipidoide (“LNP01”) a través de inyección en la vena de la cola. Grupos de diez animales recibieron dosis de 10 miligramos por kilogramo (mg/kg) de peso corporal bien de AD6248 o un ARNip inespecífico. Nivel de dosis se refiere a la cantidad de dúplex de ARNip administrada en la formulación. Un tercer 20 grupo recibió solución salina tamponada con fosfato. Los animales se sacrificaron dos días después de la administración del ARNip. Los hígados se disecaron, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se pulverizaron en polvos.
Medidas de ARNm. Se midieron los niveles del ARNm de Eg5/KSP en hígados de todos los grupos de tratamiento. 25 Se homogenizaron muestras de cada polvo de hígado (aproximadamente diez miligramos) en tampón de lisis de tejido que contenía proteinasa K. Se midieron niveles del ARNm de Eg5/KSP y GADPH en triplicado para cada muestra usando el ensayo de ADN ramificado Quantigene (GenoSpectra). Se normalizaron los valores medios para Eg5/KSP respecto a los valores medios de GADPH para cada muestra. Se determinaron medias de grupo y se normalizaron respecto al grupo de PBS para cada experimento. 30
Análisis estadístico. Se determinó la significancia por ANOVA seguido por la prueba de Tukey post-hoc.
Resultados
35
Resumen de datos
Se dan los valores medios (± desviación estándar) para el ARNm de Eg5/KSP. Se muestra la significación estadística (valor de p) frente al grupo de PBS (ns, no significativo [p>0,05]).
Experimento 1
5
VEGF/GADPH valor de p
PBS
1,0±0,47
AD6248 10 mg/ml
0,47±0,12 <0,001
inespecífico 10 mg/ml
1,0±0,26 ns
Se obtuvo una reducción estadísticamente significativa en el ARNm de Eg5/KSP en hígado después del tratamiento con AD6248 formulado a una dosis de 10 mg/kg.
Silenciamiento de VEGF de hígado de rata después de infusión intravenosa de dúplex de ARNip formulados 10 con LNP01
Se administró una formulación “lipidoide” que comprendía una mezcla equimolar de dos ARNip a ratas. Un ARNip (AD3133) se dirigía hacia VEGF. El otro (AD12115) se dirigía hacia Eg5/KSP. Puesto que la expresión de Eg5/KSP es casi indetectable en el hígado de rata adulta, solo se midieron niveles de VEGF después del tratamiento con 15 ARNip.
Dúplex de ARNip administrados
Dúplex ID
Diana Sentido Antisentido
AD12115
Eg5/KSP ucGAGAAucuAAAcuAAcuTsT (SEQ ID NO:1240) AGUuAGUUuAGAUUCUCGATsT (SEQ ID NO: 1241)
AD3133
VEGF GcAcAuAGGAGAGAuGAGCUsU (SEQ ID NO:1242) AAGCUcAUCUCUCCuAuGuGCusG (SEQ ID NO.1243)
20
Clave: A, G, C, U - ribonucleótidos; c, u - 2’-O-Me-ribonucleótidos; s - fosforotioato.
Métodos
Dosificación de los animales. Se administró a ratas Sprague-Dawley hembras, adultas ARNip formulados con 25 lipidoide (“LNP01”) mediante una infusión de dos horas en la vena femoral. Grupos de cuatro animales revieron dosis de 5, 10 y 15 miligramos por kilogramo (mg/kg) de peso corporal de ARNip formulado. Nivel de dosis se refiere a la cantidad de dúplex de ARNip administrada en la formulación. Un cuarto grupo recibió solución salina tamponada con fosfato. Los animales se sacrificaron 72 horas después del final de la infusión del ARNip. Los hígados se disecaron, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se pulverizaron en polvos. 30
Procedimiento de formulación
Se usaron el lipidoide ND98·4HCl (MW 1487) (Fórmula 1), colesterol (Sigma-Aldrich), y PEG-ceramida (Avanti Polar Lipids) para preparar nanopartículas de lípido-ARNip. Se prepararon soluciones madre de cada uno en etanol: 35 ND98, 133 mg/ml; colesterol, 25 mg/ml; PEG-ceramida C16, 100 mg/ml. Las soluciones madre de ND98, colesterol y PEG-ceramida C16 se combinaron después en una proporción molar 42:48:10. La solución de lípidos combinados se mezclo rápidamente con ARNip acuoso (en acetato de sodio pH 5) de modo que la concentración final de etanol fue 35-45% y la concentración final de acetato fue 100-300 mM. Las nanopartículas lípido-ARNip se formaron espontáneamente al mezclar. Dependiendo de la distribución del tamaño de partícula deseada, la mezcla de 40 nanopartículas resultante en algunos casos se extruyó a través de una membrana de policarbonato (límite de 100 nm) usando un extrusor térmico (Lipex Extruder, Northern Lipids, Inc). En otros casos, el paso se extrusión se omitió. La eliminación del etanol y el intercambio simultáneo de tampón se logró bien por diálisis o filtración de flujo tangencial. El tampón se intercambió a solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,2.
45
ND98 Isómero 1
Fórmula 1
Caracterización de las formulaciones
Las formulaciones preparadas bien por el método estándar o sin extrusión se caracterizan de una manera similar. Las formulaciones se caracterizan primero por inspección visual. Deben ser soluciones translúcidas blanquecinas sin 5 agregados o sedimento. El tamaño de partícula y la distribución del tamaño de partícula de las nanopartículas de lípidos se miden por dispersión de luz dinámica usando un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EE UU). Las partículas deben tener 20-300 nm, e idealmente, 40-100 nm de tamaño. La distribución del tamaño de partícula debe ser unimodal. La concentración de ARNip total en la formulación, así como la fracción atrapada, se estima usando un ensayo de exclusión de colorante. Una muestra del ARNip formulado se incuba con el colorante que se une a 10 ARN Ribogreen (Molecular Probes) en presencia o ausencia de un tensioactivo que altera la formulación, Triton X-100 al 0,5%. El ARNip total en la formulación se determina por la señal de la muestra que contiene el tensioactivo, relativo a una curva estándar. Se determina la fracción atrapada restando el contenido de ARNip “libre” (medido por la señal en ausencia de tensioactivo) del contenido total de ARNip. El porcentaje de ARNip atrapado es típicamente >85%. 15
Medidas de ARNm. Se homogenizaron muestras de cada polvo de hígado (aproximadamente diez miligramos) en tampón de lisis de tejido que contenía proteinasa K. Se midieron niveles del ARNm de VEGF y GADPH en triplicado para cada muestra usando el ensayo de ADN ramificado Quantigene (GenoSpectra). Se normalizaron los valores medios para VEGF respecto a los valores medios de GADPH para cada muestra. Se determinaron medias de grupo 20 y se normalizaron respecto al grupo de PBS para cada experimento.
Medidas de proteína. Se homogenizaron muestras de cada polvo de hígado (aproximadamente 60 miligramos) en 1 ml de tampón RIPA. Se determinaron las concentraciones totales de proteína usando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce). Se usaron muestras de proteína total de cada animal para determinar los niveles de proteína VEGF 25 usando un ensayo ELISA de VEGF (R&D systems). Se determinaron medias de grupo y se normalizaron respecto al grupo de PBS para cada experimento.
Análisis estadístico. Se determinó la significancia por ANOVA seguido por la prueba de Tukey post-hoc.
30
Resultados
Resumen de datos
Se muestran los valores medios (± desviación estándar) para el ARNm (VEGF/GADPH) y proteína (VEGF rel.) para 35 cada grupo de tratamiento. Se muestra la significación estadística (valor de p) frente al grupo de PBS para cada experimento
VEGF/GADPH valor de p VEGF rel valor de p
PBS
1,0±0,17 1,0±0,17
5 mg/kg
0,74±0,12 <0,05 0,23±0,03 <0,001
10 mg/kg
0,65±0,12 <0,005 0,22±0,03 <0,001
15 mg/kg
0,49±0,17 <0,001 0,20±0,04 <0,001
Se midieron reducciones estadísticamente significativas en el ARNm y proteína de VEGF en hígado en los tres 40 niveles de dosis de ARNip.
TABLA 1
TABLA 2
TABLA 2
TABLA 2
TABLA 2
TABLA 2
TABLA 2
TABLA 2
TABLA 3
TABLA 3
TABLA 3
TABLA 3
TABLA 3
TABLA 3
<110> Alnylam Pharmaceuticals, Inc.
<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA INHIBIR LA EXPRESIÓN DEL GEN Eg5
<130> P3076 EP 5
<140> EP 07 75 9825.8
<141> 30-03-2007
<150> US 60/787.762 10
<151> 31-03-2006
<150> US 60/870.259
<151> 15-12-2006
15
<160> 2
<170> PatentIn versión 3.1
<210> 135 20
<211> 21
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220> 25
<223> ARNip con reacción cruzada a Eg5 humano y de mono rhesus
<220>
<223> el ácido nucleico 5’-terminal es un nucleósido, es decir, base + azúcar, pero carece de 5’-fosfato
30
<220>
<221> base modificada
<222> 1, 2, 8, 9, 10, 14, 15, 18, 19
<223> /base_mod = “2’-O-metil base correspondiente”
35
<220>
<221> base modificada
<222> 21
<223> /base_mod = “5’-tio timidina”
40
<220>
<221> base modificada
<222> 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 16, 17
<223> /base_mod = “2’-hidroxi base correspondiente”
45
<400> 135
<210> 136
<211> 21 50
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> ARNip con reacción cruzada a Eg5 humano y de mono rhesus 55
<220>
<223> el ácido nucleico 5’-terminal es un nucleósido, es decir, base + azúcar, pero carece de 5’-fosfato
<220> 60
<221> base modificada
<222> 4, 9
<223> /base_mod = “2’-O-metil base correspondiente”
<220> 65
<221> base modificada
<222> 21
<223> /base_mod = “5’-tio timidina”
<220> 5
<221> base modificada
<222> 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base_mod = “2’-hidroxi base correspondiente”
<400> 136 10

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen Eg5 humano en una célula, en donde dicho ARNbc comprende al menos dos secuencias que son complementarias entre sí y en donde una hebra sentido comprende una primera secuencia y una hebra antisentido comprende una segunda secuencia 5 que comprende una región de complementariedad que es completamente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica Eg5, en donde dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, en donde dicha parte de un ARNm que codifica Eg5 consiste en la secuencia UCGAGAAUCUAAACUAACU, y en donde dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa dicho Eg5, inhibe la expresión de dicho gen Eg5. 10
  2. 2. El ARNbc de la reivindicación 1, en donde dicha primera secuencia es la secuencia de SEQID NO: 135 y dicha segunda secuencia es la secuencia de SEQ ID NO: 136.
  3. 3. El ARNbc de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado. 15
  4. 4. El ARNbc de la reivindicación 3, en donde dicho nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido modificado con 2’-O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5’-fosforotioato, un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico, un nucleótido modificado con 2’-desoxi-2’-fluoro, un nucleótido modificado con 2’-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un 20 nucleótido modificado con 2’-amino, un nucleótido modificado con 2’-alquilo, nucleótido de morfolino, un fosforamidato, y un nucleótido que comprende una base no natural.
  5. 5. Una célula in vitro que comprende el ARNbc de la reivindicación 1.
    25
  6. 6. Una composición farmacéutica para inhibir la expresión del gen Eg5 que comprende el ARNbc de la reivindicación 1 o 2.
  7. 7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, que comprende además un ARNbc que inhibe la expresión del gen VEGF. 30
  8. 8. Un método in vitro para inhibir la expresión del gen Eg5 en una célula, comprendiendo el método:
    (a) introducir en la célula el ARNbc de la reivindicación 2; y
    (b) mantener la célula producida en el paso (a) durante un tiempo suficiente para obtener la 35 degradación del transcrito de ARNm del gen Eg5,
    inhibiendo de esta manera la expresión del gen Eg5 en la célula.
  9. 9. El método de la reivindicación 8 en donde un segundo ARNbc que inhibe la expresión de VEGF se introduce 40 en dicha célula.
  10. 10. Un ARNbc de la reivindicación 1 o 2 para tratar, prevenir o controlar procesos patológicos mediados por la expresión de Eg5.
    45
  11. 11. El ARNbc de la reivindicación 10, en donde se va a administrar un segundo ARNbc que inhibe la expresión de VEGF.
  12. 12. Un vector para inhibir la expresión del gen Eg5 en una célula, comprendiendo dicho vector una secuencia reguladora operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una hebra de un 50 ARNbc, en donde una de las hebras de dicho ARNbc es completamente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica Eg5, en donde dicho ARNbc tiene menos de 30 pares de bases de longitud, en donde dicha parte de un ARNm que codifica Eg5 consiste en la secuencia UCGAGAAUCUAAACUAACU, y en donde dicho ARNbc, tras el contacto con una célula que expresa dicho Eg5, inhibe la expresión de dicho gen Eg5 al menos en un 40%. 55
  13. 13. Una célula in vitro que comprende el vector de la reivindicación 12.
  14. 14. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, el método de la reivindicación 9, o el ARNbc de la reivindicación 11, en la medida en que dichas reivindicaciones se refieren a la reivindicación 2, en donde el 60 ARNbc que inhibe la expresión de VEGF consiste en una hebra sentido y una antisentido, consistiendo dicha hebra sentido en la secuencia GcAcAuAGGAGAGAuGAGCUsU, consistiendo dicha hebra antisentido en la secuencia AAGCUcAUCUCUCCuAuGuGCusG, en donde A, G, C y U representan ribonucleótidos; c y u representan 2’-O-metil ribonucleótidos; y s representa fosforotioato.
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Families Citing this family (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US9879266B2 (en) 2002-11-14 2018-01-30 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US9839649B2 (en) 2002-11-14 2017-12-12 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US10011836B2 (en) 2002-11-14 2018-07-03 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US7480382B2 (en) * 2003-09-30 2009-01-20 Microsoft Corporation Image file container
EP2365077B1 (en) 2004-03-12 2013-05-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA agents targeting VEGF
NZ586217A (en) 2004-09-24 2011-12-22 Alnylam Pharmaceuticals Inc RNAI modulation of APOB and uses thereof
US7790878B2 (en) * 2004-10-22 2010-09-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi modulation of RSV, PIV and other respiratory viruses and uses thereof
NZ556097A (en) * 2005-01-07 2009-12-24 Alnylam Pharmaceuticals Inc Rnai modulation of RSV and therapeutic uses thereof
US20060217324A1 (en) * 2005-01-24 2006-09-28 Juergen Soutschek RNAi modulation of the Nogo-L or Nogo-R gene and uses thereof
AU2006261732B2 (en) * 2005-06-27 2011-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi modulation of HIF-1 and theraputic uses thereof
US20070044161A1 (en) * 2005-07-21 2007-02-22 Juergen Soutschek RNAi modulation of the Rho-A gene in research models
US7320965B2 (en) 2005-10-28 2008-01-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of Huntingtin gene
ATE510545T1 (de) 2005-11-09 2011-06-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur hemmung der expression von faktor v leiden mutationsgen
US8288354B2 (en) * 2005-12-28 2012-10-16 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding RNA transcripts as drug targets
US8229398B2 (en) * 2006-01-30 2012-07-24 Qualcomm Incorporated GSM authentication in a CDMA network
JP2009531433A (ja) * 2006-03-24 2009-09-03 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト ＨＰＶ感染処置のためのｄｓＲＮＡ組成物および方法
EA014886B1 (ru) * 2006-03-31 2011-02-28 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА Eg5
US7691824B2 (en) 2006-04-28 2010-04-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the JC virus
KR101320916B1 (ko) 2006-05-11 2013-10-23 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｐｃｓｋ9 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
CA2653451C (en) * 2006-05-22 2015-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of ikk-b gene
US8598333B2 (en) * 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
WO2008036933A2 (en) 2006-09-21 2008-03-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the hamp gene
EP3042959A1 (en) 2007-01-16 2016-07-13 The University of Queensland Method of inducing an immune response
PE20090064A1 (es) * 2007-03-26 2009-03-02 Novartis Ag Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende
EP2147102B1 (en) 2007-03-29 2014-01-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola
US7871985B2 (en) 2007-12-10 2011-01-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of factor VII gene
US20090238772A1 (en) 2007-12-13 2009-09-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of rsv infection
EP2250266A2 (en) 2008-02-12 2010-11-17 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of cd45 gene
CN105267233B (zh) * 2008-03-05 2019-07-26 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制Eg5和VEGF基因表达的组合物和方法
WO2009129465A2 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of xbp-1 gene
WO2010006342A2 (en) 2008-07-11 2010-01-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of gsk-3 genes
CA2739170A1 (en) 2008-09-25 2010-04-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of serum amyloid a gene
MX339820B (es) * 2008-10-03 2016-06-13 Curna Inc Compuestos oligonucleottidos designados para inhibir el transcrito antisentido natrual apra apolipoproteina-a1.
EP2344638A1 (en) 2008-10-06 2011-07-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of an rna from west nile virus
HUE026604T2 (hu) 2008-10-20 2016-06-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Transztiretin-expresszió gátlására szolgáló készítmények és eljárások
KR101866152B1 (ko) 2008-12-04 2018-06-08 큐알엔에이, 인크. 종양 억제 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 종양 억제 유전자 관련된 질환의 치료
CN102317458B (zh) 2008-12-04 2018-01-02 库尔纳公司 通过红细胞生成素(epo)天然反义转录物的抑制对epo相关疾病的治疗
ES2600781T3 (es) * 2008-12-04 2017-02-10 Curna, Inc. Tratamiento para enfermedades relacionadas con el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) mediante la inhibición de transcritos antisentido naturales de vegf
AU2009324534B2 (en) 2008-12-10 2015-07-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. GNAQ targeted dsRNA compositions and methods for inhibiting expression
EP3009150B1 (en) 2009-02-12 2019-11-13 CuRNA, Inc. Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf
CA2754043A1 (en) * 2009-03-12 2010-09-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes
WO2010107733A2 (en) 2009-03-16 2010-09-23 Curna, Inc. Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (nrf2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf2
WO2010107740A2 (en) 2009-03-17 2010-09-23 Curna, Inc. Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1
EP2427552B1 (en) 2009-05-06 2016-11-16 CuRNA, Inc. Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp
CN103223177B (zh) 2009-05-06 2016-08-10 库尔纳公司 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病
EP2427554B1 (en) 2009-05-08 2016-11-16 CuRNA, Inc. Treatment of dystrophin family related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dmd family
CA2762524A1 (en) * 2009-05-18 2011-01-13 Ensysce Biosciences, Inc. Carbon nanotubes complexed with multiple bioactive agents and methods related thereto
EP2432881B1 (en) 2009-05-18 2017-11-15 CuRNA, Inc. Treatment of reprogramming factor related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a reprogramming factor
US8895527B2 (en) 2009-05-22 2014-11-25 Curna, Inc. Treatment of transcription factor E3 (TFE3) and insulin receptor substrate 2(IRS2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to TFE3
JP5960049B2 (ja) 2009-05-28 2016-08-02 クルナ・インコーポレーテッド 抗ウイルス遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制による抗ウイルス遺伝子関連疾患の治療
WO2010141511A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
EA201270019A1 (ru) 2009-06-15 2012-06-29 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Двуцепочечная рнк, включенная в липидный состав и мишенью которой является ген pcsk9
CN102695797B (zh) 2009-06-16 2018-05-25 库尔纳公司 通过抑制针对胶原基因的天然反义转录物来治疗胶原基因相关的疾病
US8951981B2 (en) 2009-06-16 2015-02-10 Curna, Inc. Treatment of paraoxonase 1 (PON1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to PON1
CA2765889A1 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Opko Curna, Llc Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (tnfr2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to tnfr2
CA2765815A1 (en) 2009-06-26 2010-12-29 Opko Curna, Llc Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene
KR101801407B1 (ko) 2009-07-24 2017-11-24 큐알엔에이, 인크. 시르투인 (ｓｉｒｔ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 시르투인 관련된 질환의 치료
JP6128848B2 (ja) 2009-08-05 2017-05-17 クルナ・インコーポレーテッド インスリン遺伝子（ｉｎｓ）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるインスリン遺伝子（ｉｎｓ）関連疾患の治療
WO2011017548A1 (en) * 2009-08-05 2011-02-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes
CA2770104C (en) 2009-08-11 2019-03-19 Opko Curna, Llc Treatment of adiponectin (adipoq) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an adiponectin (adipoq)
EP2464336A4 (en) 2009-08-14 2013-11-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS FORMULATED IN LIPIDS AND METHODS OF INHIBITING THE EXPRESSION OF EBOLA VIRUS GENE
WO2011022606A2 (en) 2009-08-21 2011-02-24 Curna, Inc. Treatment of 'c terminus of hsp70-interacting protein' (chip) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to chip
CN102482671B (zh) 2009-08-25 2017-12-01 库尔纳公司 通过抑制‘含有iq模体的gtp酶激活蛋白’(iqgap)的天然反义转录物而治疗iqgap相关疾病
CN107519133A (zh) * 2009-09-15 2017-12-29 阿尔尼拉姆医药品有限公司 脂质配制的组合物及抑制Eg5和VEGF基因的表达的方法
US9187746B2 (en) 2009-09-22 2015-11-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dual targeting siRNA agents
US20120295952A1 (en) 2009-09-25 2012-11-22 Curna, Inc. Treatment of filaggrin (flg) related diseases by modulation of flg expression and activity
EP2496238A4 (en) 2009-11-03 2013-10-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc FORMULATED LIPID COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING TRANSTHYRETIN EXPRESSION (TTR)
RU2639550C2 (ru) 2009-12-16 2017-12-21 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с сайт-1 мембраносвязанной пептидазой транскрипционных факторов (mbtps1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к mbtps1
US8940708B2 (en) 2009-12-23 2015-01-27 Curna, Inc. Treatment of hepatocyte growth factor (HGF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to HGF
CN102781480B (zh) 2009-12-23 2018-07-27 库尔纳公司 通过抑制解偶联蛋白2(ucp2)的天然反义转录物而治疗ucp2相关疾病
EP2519633B1 (en) 2009-12-29 2017-10-25 CuRNA, Inc. Treatment of nuclear respiratory factor 1 (nrf1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf1
JP5982288B2 (ja) 2009-12-29 2016-08-31 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 腫瘍タンパク質６３（ｐ６３）に対する天然アンチセンス転写物の阻害による腫瘍タンパク質６３関連疾患の治療
EP2519632B1 (en) 2009-12-31 2018-04-11 CuRNA, Inc. Treatment of insulin receptor substrate 2 (irs2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to irs2 and transcription factor e3 (tfe3)
RU2611187C2 (ru) 2010-01-04 2017-02-21 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с интерферон-регуляторным фактором 8 (irf8), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к irf8
EP2521785B1 (en) 2010-01-06 2022-03-09 CuRNA, Inc. Inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene for use in a treatment of pancreatic developmental gene related diseases
KR101854926B1 (ko) 2010-01-11 2018-05-04 큐알엔에이, 인크. 성 호르몬 결합 글로불린 (ｓｈｂｇ)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 성 호르몬 결합 글로불린 (ｓｈｂｇ) 관련된 질환의 치료
CA2786568A1 (en) 2010-01-25 2011-07-28 Curna, Inc. Treatment of rnase h1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to rnase h1
JP5976548B2 (ja) 2010-02-22 2016-08-23 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｐｙｃｒ１に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ１（ｐｙｃｒ１）関連疾患の治療
CA2795145C (en) 2010-04-02 2019-01-22 Curna, Inc. Treatment of colony-stimulating factor 3 (csf3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to csf3
CN102858979B (zh) 2010-04-09 2018-01-26 库尔纳公司 通过抑制成纤维细胞生长因子21(fgf21)的天然反义转录物而治疗fgf21相关疾病
KR20130101442A (ko) 2010-05-03 2013-09-13 큐알엔에이, 인크. 시르투인 (sirt)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 시르투인 (sirt) 관련된 질환의 치료
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
DK2576783T3 (en) 2010-05-26 2018-03-12 Curna Inc TREATMENT OF ATONAL HOMOLOGY 1- (ATOH1) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPTS AT ATOH1
EP2576784B1 (en) 2010-05-26 2017-11-15 CuRNA, Inc. Treatment of methionine sulfoxide reductase a (msra) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to msra
US20130210733A1 (en) 2010-06-17 2013-08-15 Cytokinetics, Inc. Methods of treating lung disease
JP6023705B2 (ja) 2010-06-23 2016-11-09 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド ナトリウムチャネル、電位依存性、αサブユニット（ＳＣＮＡ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるＳＣＮＡ関連疾患の治療
EP2593547B1 (en) 2010-07-14 2017-11-15 CuRNA, Inc. Treatment of discs large homolog (dlg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlg
CN105061534A (zh) 2010-09-22 2015-11-18 艾丽奥斯生物制药有限公司 取代的核苷酸类似物
JP5830329B2 (ja) * 2010-09-28 2015-12-09 国立大学法人 岡山大学 腎障害の新規マーカー
KR101886457B1 (ko) 2010-10-06 2018-08-07 큐알엔에이, 인크. 시알리다아제 4 (neu4)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 neu4 관련된 질환의 치료
CN103180445B (zh) 2010-10-22 2018-02-16 库尔纳公司 通过抑制α‑L‑艾杜糖醛酸酶(IDUA)的天然反义转录物而治疗IDUA相关疾病
CN110123830A (zh) 2010-11-09 2019-08-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制Eg5和VEGF基因的表达的脂质配制的组合物和方法
US10000752B2 (en) 2010-11-18 2018-06-19 Curna, Inc. Antagonat compositions and methods of use
CA2818824A1 (en) 2010-11-23 2012-05-31 Joseph Collard Treatment of nanog related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nanog
TWI658830B (zh) * 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
RU2620980C2 (ru) 2011-06-09 2017-05-30 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn
EP3388068A1 (en) 2011-06-21 2018-10-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Composition and methods for inhibition of expression of protein c (proc) genes
US9228188B2 (en) 2011-06-21 2016-01-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and method for inhibiting hepcidin antimicrobial peptide (HAMP) or HAMP-related gene expression
MX344807B (es) * 2011-06-21 2017-01-09 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibicion de genes para alipoproteina c-iii (apoc3).
WO2013010690A1 (en) * 2011-07-18 2013-01-24 Devgen Nv Down regulating gene expression in insect pests
JP6125505B2 (ja) 2011-09-06 2017-05-10 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 小分子による電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット関連疾患の治療
MX391815B (es) 2011-11-18 2025-03-21 Alnylam Pharmaceuticals Inc AGENTES DE iARN, COMPOSICIONES Y METODOS DE LOS MISMOS PARA USARSE EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS CON TRANSTITERINA (TTR).
HK1203075A1 (en) 2011-12-22 2015-10-16 艾丽奥斯生物制药有限公司 Substituted phosphorothioate nucleotide analogs
TR201815503T4 (tr) 2012-03-15 2018-11-21 Curna Inc Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (bknf) ile ilişkili hastalıkların doğal antisens transkriptinin bknf'ye inhibisyonu ile muamelesi.
EP2828277A1 (en) 2012-03-21 2015-01-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Solid forms of a thiophosphoramidate nucleotide prodrug
WO2013142157A1 (en) 2012-03-22 2013-09-26 Alios Biopharma, Inc. Pharmaceutical combinations comprising a thionucleotide analog
WO2014089313A1 (en) 2012-12-05 2014-06-12 Alnylam Pharmaceuticals PCSK9 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2014182661A2 (en) 2013-05-06 2014-11-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Dosages and methods for delivering lipid formulated nucleic acid molecules
WO2016033326A2 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating transthyretin (ttr) mediated amyloidosis
JOP20200115A1 (ar) 2014-10-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات وطرق لتثبيط التعبير الجيني عن hao1 (حمض أوكسيداز هيدروكسيلي 1 (أوكسيداز جليكولات))
CA2968114A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof
CN104450706B (zh) * 2014-12-10 2017-04-05 中山大学 利用rna干扰技术诱导凡纳滨对虾血淋巴细胞发生upr的方法
KR20240074895A (ko) 2015-07-31 2024-05-28 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴(TTR) iRNA 조성물 및 TTR-관련 질병을 치료하거나, 예방하기 위한 그의 사용 방법
WO2017035278A1 (en) 2015-08-24 2017-03-02 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotide nanoparticles for the modulation of gene expression and uses thereof
CN114939124A (zh) 2015-08-25 2022-08-26 阿尔尼拉姆医药品有限公司 治疗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin(pcsk9)基因相关障碍的方法和组合物
US11613754B2 (en) * 2017-02-20 2023-03-28 Northwestern University Toxic RNAi active seed sequences for killing cancer cells
EP3651775A4 (en) 2017-07-13 2021-04-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. METHOD FOR INHIBITION OF HAO1 (HYDROXYIC ACID OXIDASE-1 (GLYCOLATE OXIDASE) GENE EXPRESSION
AU2018336806B2 (en) 2017-09-19 2025-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (TTR) mediated amyloidosis
KR20190069245A (ko) 2017-12-11 2019-06-19 대한민국(전북기계공업고등학교장) 원적외선으로 사람을 인식하고, 가변저항 값으로 사람의 위치정보를 정하여 자동으로 돌아가는 인체감지센서 테이블
KR20220140593A (ko) * 2020-02-10 2022-10-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Vegf-a 발현을 사일런싱하기 위한 조성물 및 방법
KR20230107625A (ko) 2020-11-13 2023-07-17 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 응고 인자 V(F5) iRNA 조성물 및 이의 사용 방법
KR20240042004A (ko) 2021-08-03 2024-04-01 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴(TTR) iRNA 조성물 및 이의 사용 방법

Family Cites Families (227)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US513030A (en) 1894-01-16 Machine for waxing or coating paper
US564562A (en) 1896-07-21 Joseph p
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
WO1987000201A1 (en) 1985-07-05 1987-01-15 Whitehead Institute For Biomedical Research Epithelial cells expressing foreign genetic material
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
ATE113059T1 (de) 1987-06-24 1994-11-15 Florey Howard Inst Nukleosid-derivate.
EP0378576B1 (en) 1987-09-11 1995-01-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Transduced fibroblasts and uses therefor
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
EP0391960B1 (en) 1987-12-11 1994-08-17 Whitehead Institute For Biomedical Research Genetic modification of endothelial cells
EP0732397A3 (en) 1988-02-05 1996-10-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Modified hepatocytes and uses therefor
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
GB8824593D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Liposomes
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
AU658562B2 (en) 1989-10-24 1995-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5665710A (en) 1990-04-30 1997-09-09 Georgetown University Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
DE69126530T2 (de) 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
KR100211552B1 (ko) 1990-08-03 1999-08-02 디. 꼬쉬 유전자 발현 억제용 화합물 및 방법
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
US5596086A (en) 1990-09-20 1997-01-21 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages having one nitrogen and two carbon atoms
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
AU649074B2 (en) 1990-10-12 1994-05-12 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Modified ribozymes
WO1992007573A1 (en) 1990-10-31 1992-05-14 Somatix Therapy Corporation Genetic modification of endothelial cells
CA2095212A1 (en) 1990-11-08 1992-05-09 Sudhir Agrawal Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
DE4216134A1 (de) * 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
CA2135646A1 (en) 1992-05-11 1993-11-25 Kenneth G. Draper Method and reagent for inhibiting viral replication
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
EP0786522A2 (en) 1992-07-17 1997-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecules for treatment of stenotic conditions
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5672659A (en) * 1993-01-06 1997-09-30 Kinerton Limited Ionic molecular conjugates of biodegradable polyesters and bioactive polypeptides
JPH08505872A (ja) * 1993-01-22 1996-06-25 ユニバーシティ・リサーチ・コーポレイション 治療剤の局所化
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
RU2143903C1 (ru) 1993-02-19 2000-01-10 Ниппон Синяку Ко., Лтд. Фармацевтическая композиция, содержащая сополимер нуклеиновой кислоты
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
DK0691968T3 (da) 1993-03-30 1998-02-23 Sanofi Sa Acykliske nukleosid-analoge og oligonukleotidsekvenser indeholdende disse
JPH08508491A (ja) 1993-03-31 1996-09-10 スターリング ウインスロップ インコーポレイティド ホスホジエステル結合をアミド結合に置き換えたオリゴヌクレオチド
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5540935A (en) 1993-12-06 1996-07-30 Nof Corporation Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5902880A (en) 1994-08-19 1999-05-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) * 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
WO1996000286A1 (en) * 1994-06-27 1996-01-04 Toagosei Co., Ltd. Antisense nucleic acid compound
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US6146886A (en) * 1994-08-19 2000-11-14 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5595760A (en) * 1994-09-02 1997-01-21 Delab Sustained release of peptides from pharmaceutical compositions
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5753613A (en) 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
US5716824A (en) * 1995-04-20 1998-02-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-alkylthioalkyl and 2-C-alkylthioalkyl-containing enzymatic nucleic acids (ribozymes)
US5756122A (en) 1995-06-07 1998-05-26 Georgetown University Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells
CA2227989A1 (en) 1995-08-01 1997-02-13 Karen Ophelia Hamilton Liposomal oligonucleotide compositions
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
WO1997026270A2 (en) 1996-01-16 1997-07-24 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of methoxy nucleosides and enzymatic nucleic acid molecules
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US6395713B1 (en) * 1997-07-23 2002-05-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Compositions for the delivery of negatively charged molecules
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
DE69943389D1 (de) 1998-04-08 2011-06-09 Commw Scient Ind Res Org Verfahren und mittel zum erhalt von veränderten phänotypen
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
MXPA01003643A (es) 1998-10-09 2003-07-21 Ingene Inc Produccion de adnss in vivo.
AU6430599A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Cytogenix, Inc. Enzymatic synthesis of ssdna
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
CA2365625A1 (en) 1999-03-10 2000-09-14 Phogen Limited Delivery of substances to cells
DE19935303A1 (de) * 1999-07-28 2001-02-08 Aventis Pharma Gmbh Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
WO2003070918A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
US20040259247A1 (en) 2000-12-01 2004-12-23 Thomas Tuschl Rna interference mediating small rna molecules
EP1386004A4 (en) 2001-04-05 2005-02-16 Ribozyme Pharm Inc MODULATION OF GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH INFLAMMATORY PROLIFERATION AND GROWTH OF NEURITIES BY METHODS INVOLVING NUCLEIC ACID
WO2003070910A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated INHIBITION OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) AND VEGF RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20030170891A1 (en) 2001-06-06 2003-09-11 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20040209832A1 (en) * 2001-11-30 2004-10-21 Mcswiggen James RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7981863B2 (en) * 2001-09-19 2011-07-19 Neuronova Ab Treatment of Parkinson's disease with PDGF
US7199107B2 (en) * 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
NO315435B1 (no) 2002-06-21 2003-09-01 Hydralift Asa Kompenseringsanordning
CN1156336C (zh) 2002-07-12 2004-07-07 清华大学 柔性基底材料表面负载二氧化钛薄膜光催化剂的制备方法
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
BR0313079A (pt) 2002-07-29 2005-08-16 Gates Corp Correia
US7036793B2 (en) 2002-07-31 2006-05-02 Brass-Craft Manufacturing Company Stop valve
US7956176B2 (en) 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US20040115201A1 (en) * 2002-09-25 2004-06-17 Paz Einat Mitotic kinesin-like protein-1, MKLP1, and uses thereof
JP2004159653A (ja) * 2002-10-24 2004-06-10 Sankyo Co Ltd 癌遺伝子及びその用途
US8025587B2 (en) 2008-05-16 2011-09-27 Taylor Made Golf Company, Inc. Golf club
DK2284266T3 (da) 2002-11-14 2014-01-13 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53
WO2004064737A2 (en) 2003-01-17 2004-08-05 Alnylam Pharmaceuticals Therapeutics compositions
DE10302421A1 (de) 2003-01-21 2004-07-29 Ribopharma Ag Doppelsträngige Ribonukleinsäure mit verbesserter Wirksamkeit
AU2004210975B2 (en) * 2003-02-10 2008-04-10 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein named 158P1D7 useful in the treatment and detection of bladder and other cancers
EP2216407B1 (en) 2003-03-07 2016-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
EP1608735A4 (en) 2003-04-03 2008-11-05 Alnylam Pharmaceuticals RNAI CONJUGATES
CA2522637C (en) 2003-04-17 2014-01-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified irna agents
JP4991288B2 (ja) 2003-04-17 2012-08-01 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 二本鎖ｉＲＮＡ剤、および二本鎖ｉＲＮＡ剤の対合の安定性を調節する方法。
CA2522994C (en) * 2003-04-30 2012-09-25 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 109p1d4 useful in treatment and detection of cancer
EP1626735B1 (en) 2003-05-09 2014-11-19 Transfert Plus Compound for treating cancer caused by cells expressing melanotransferrin at their surface
WO2005004794A2 (en) * 2003-06-09 2005-01-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Method of treating neurodegenerative disease
EP2336317B1 (en) * 2003-06-13 2019-09-11 Alnylam Europe AG Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism
EP1670955A2 (en) 2003-09-22 2006-06-21 Rosetta Inpharmatics LLC. Synthetic lethal screen using rna interference
EP2365077B1 (en) * 2004-03-12 2013-05-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA agents targeting VEGF
JP2008537551A (ja) 2005-03-31 2008-09-18 カランド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２の阻害剤およびその使用
EA014886B1 (ru) 2006-03-31 2011-02-28 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА Eg5
US8598333B2 (en) * 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
US20080213350A1 (en) 2007-02-20 2008-09-04 Texas Tech University System Encapsulation of nucleic acids in liposomes
US7858592B2 (en) 2007-02-26 2010-12-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Interfering RNAs against the promoter region of P53
JP5697988B2 (ja) 2007-12-27 2015-04-08 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 干渉ｒｎａを使用したポロ様キナーゼ発現のサイレンシング方法
CN105267233B (zh) 2008-03-05 2019-07-26 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制Eg5和VEGF基因表达的组合物和方法
CA2754043A1 (en) 2009-03-12 2010-09-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
US10867398B2 (en) 2017-11-21 2020-12-15 Reliance Core Consulting LLC Methods, systems, apparatuses and devices for facilitating motion analysis in an environment

Also Published As

Publication number Publication date
EP2527354A1 (en) 2012-11-28
EP2008274A4 (en) 2009-10-28
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