ES2544747T3 - Disolución acuosa para conservación de células - Google Patents
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Abstract
Una disolución acuosa para conservación de células, que comprende las siguientes composiciones (a) a (e) y que tiene un pH de 6,5 a 9,0: (a) 5,0 a 12,0 % p/v de un crioprotector; (b) 3,0 a 5,0 % p/v de un azúcar; (c) 0,1 a 1,0 % p/v de un espesante; (d) 0,01 a 1,0 % p/v de un ajustador de pH y (e) una cantidad apropiada de agua; estando la disolución acuosa exenta de componentes de origen animal naturales.
Description
E06832864
06-08-2015
[Tabla 1]
- Componente
- Disolución acuosa para conservación de células (g/l) Comparación
- A
- B C D E F G H I J K L M
- Espesante
- CMC 5 - - 5 - - 5
- CMC-Na
- - 5 - - 5 - -
- Polímero de ácido orgánico
- - - 5 - - 5
- Crioprotec tor
- DMSO 100 - 100 - 100 - 100 - 100 - 100 - 100
- Propilenglicol
- - 100 - 100 - 100 - 100 - 100 - 100 -
- Azúcares, ajustadore s de pH
- Tampón de fosfato - 1,576 -
- BSS
- Glucosa 30 30
- Bicarbonato de sodio
- 0,8 0,8
- HEPES
- 0,36 0,36
- Medio mínimo esencial
- RPMI1640 - 1,576
- Agua
- Agua destilada Cantidad adecuada
Ensayo de realización y ensayo de especificación de disolución acuosa para conservación de células.
1. Ensayo de realización.
5 La realización de una disolución acuosa para conservación de células fue investigada midiendo la tasa de supervivencia de células en conservación.
Se recogieron células X63Ag8-6.5.3 (mieloma de ratón) precultivadas en un medio de cultivo RPMI1640 al que se añadió FBS al 10 % v/v por centrifugación y se añadió después 1 ml a cada una de las disoluciones acuosas para conservación de células C, I y M a fin de que se suspendieran las células en la disolución a 5x105 a 5x106 células/ml,
10 seguido por dispensación de la disolución a criotubos de volumen 2 ml (fabricada por Nunc Co., Ltd.). Inmediatamente después de eso, se congelaron rápidamente los criotubos a -80°C y después se conservaron durante 7 días (n = 3).
2. Ensayo de especificación.
Se investigó el pH y la presión osmótica de cada una de las disoluciones acuosas para conservación de células 15 preparadas como se describió anteriormente.
Además, los resultados del ensayo de realización y el ensayo de especificación para las disoluciones acuosas respectivas para conservación de células se mostraron en la Tabla 2 (n=3). Como se muestra la Tabla 2, las dos
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[Tabla 6]
- Componentes
- Disolución acuosa para conservación de células (g/l)
- N
- O C P Q R
- Espesante
- CMC-Na 5
- Crioprotector
- DMSO 100
- Azúcares, ajustadores de pH
- Tampón de fosfato 1,576
- BSS
- Glucosa 10 20 30 40 50 70
- Bicarbonato de sodio
- 0,8
- HEPES
- 0,36
- Agua
- Agua destilada Cantidad adecuada
- Ensayo de realización
- Tasa de supervivencia (%) 15,0 18,0 95,0 93,0 82,0 20,0
Ejemplo 4
Investigación de concentración de crioprotector.
5 Se prepararon disoluciones de conservación de células C y S a X usando los respectivos componentes preparados en 1 del Ejemplo 1 descrito anteriormente a fin de que se pudieran obtener sus composiciones descritas en la Tabla
7. Además, de una manera similar al Ejemplo 1 descrito anteriormente, el ensayo de realización y el ensayo de especificación de cada disolución acuosa para conservación de células se llevó a cabo usando células SK-007 o células Jurkat. Los resultados de los ensayos se mostraron en la Tabla 7.
10 Como se muestra en la Tabla 7, las disoluciones de conservación acuosas conteniendo cada una 3 % p/v o menos de DMSO o 15 % p/v de DMSO como un crioprotector mostraron cada una una tasa de supervivencia baja para cualquiera de las células. Por el contrario, las disoluciones de conservación acuosas conteniendo cada una al menos 5 a 12 % p/v de DMSO mostraron una tasa de supervivencia de 80% o más.
Células SK-007 o células Jurkat.
15 SK-007: células de leucemia mieloide humana (células de leucemia de células B).
Jurkat: células de leucemia de células T humanas.
Cada una de las células se cultivó en un medio de cultivo RPMI1640 al que se añadió suero fetal bovino al 10% en las condiciones de CO2 al 5% a 37 °C.
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[Tabla 7]
- Componente
- Disolución acuosa para conservación de células (g/l)
- S
- T U V C W X
- Espesante
- CMC-Na 5
- Crioprotector
- DMSO 30 50 70 90 100 120 150
- Azúcares, ajustadores de pH
- Tampón de fosfato 1,576
- BSS
- Glucosa 30
- Bicarbonato de sodio
- 0,8
- HEPES
- 0,36
- Agua
- Agua destilada Cantidad adecuada
- Ensayo de realización
- Tasa de supervive ncia (%) células SK-007 15,0 80,0 82,0 85,0 95,0 91,0 63,0
- células Jurkat
- 26,0 86,0 90,0 84,0 95,0 88,0 58,0
- Ensayo de especificació n
- pH 7,64 7,65 7,73 7,78 7,74 7,77 7,8
- Presión osmótica(mOsm)
- 740 1.080 1.523 1.956 2.274 2.698 3.564
Ejemplo 5
Investigación de concentración de espesante
5 Se prepararon disoluciones de conservación de células Y a AC usando los respectivos componentes preparados en 1 del Ejemplo 1 descrito anteriormente a fin de que se pudieran obtener sus composiciones descritas en la Tabla 8. Además, de una manera similar al Ejemplo 1 descrito anteriormente, el ensayo de realización y el ensayo de especificación de cada disolución acuosa para conservación de células se llevó a cabo usando células SK-007 o células Jurkat. Los resultados de los ensayos se mostraron en la Tabla 8.
10 Como se muestra en la Tabla 8, las disoluciones de conservación acuosas que contenían 0,1 % p/v a 1,0 % p/v de un polímero de ácido orgánico como espesante mostraron una tasa de supervivencia de 90% o más para cualquiera de las células.
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[Tabla 8]
- Componente
- Disolución acuosa para conservación de células (g/l)
- Y
- Z AA AB AC
- Espesante
- Polímero de ácido orgánico 1,0 2,5 5,0 7,5 10,0
- Crioprotector
- DMSO 100
- Azúcares, ajustadores de pH
- Tampón de fosfato 1,576
- BSS
- Glucosa 30
- Bicarbonato de sodio
- 0,8
- HEPES
- 0,36
- Agua
- Agua destilada Cantidad adecuada
- Ensayo de realización
- Tasa de supervivenc ia (%) células SK-007 97,0 100,0 99,0 98,0 98,0
- células Jurkat
- 94,0 99,0 97,0 96,0 95,0
- Ensayo de especificación
- pH 7,97 7,99 8,02 8,1 8,08
- Presión osmótica (mOsm)
- 2.098 2.119 2.124 2.123 2.172
Ejemplo 6
Ensayo de realización de disolución acuosa para conservación de células.
5 La realización de una disolución acuosa para conservación de células se evaluó por investigación de la tasa de supervivencia, la capacidad de proliferación y la capacidad de diferenciación de las células en la conservación.
1. Investigación de la tasa de supervivencia de las células.
Se evaluó la realización de cada una de las disoluciones acuosas para conservación de células M, I y K con respecto
a la tasa de supervivencia de las células en la conservación. Se añadieron células madre mesenquimales 10 procedentes de sangre umbilical humana cultivadas con antelación en un medio de cultivo IMDM enriquecido con
FBS al 10% v/v en las condiciones de CO2 al 5% a 37°C con 1 ml cada una de las disoluciones acuosas para
conservación de células M, I y K a fin de que las células se suspendieran en la disolución a 2x105 células/ml, seguido
por dispensación del resultante en criotubos de 2 ml de volumen (fabricados por Nunc Co., Ltd.). Inmediatamente
después de eso, se congelaron rápidamente los criotubos a -80°C, se conservaron durante 4 días y después se 15 conservaron a -196°C (tanque de nitrógeno líquido) durante 72 días (n = 3).
Se descongelaron los tubos congelados que contenían células a 37 °C en un baño de agua, se lavaron dos veces
con una mezcla de 9 ml de IMDM y1 ml de FBS. Se recogieron las células por centrifugación y se contó el número
de células. Como se representa en la FIG. 1a, la disolución acuosa para conservación de células I y K mostró cada
una una tasa de supervivencia similar de las células como aquélla en el caso de conservación en la disolución 20 acuosa para conservación de células M. Las tasas de supervivencia de células en las respectivas disoluciones
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