ES2543341T3 - Métodos y composiciones para modular la actividad de células tumorales - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a un sitio entre los aminoácidos 421 a 443 de una porción C-terminal de una subunidad β de clusterina humana para uso en el tratamiento de cáncer mediante la modulación de la actividad de células de carcinoma, que comprende inhibir transiciones epiteliales a mesenquimatosas en las células de carcinoma.

Description

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este enfoque experimental). Para demostrar la competición por la unión a clusterina, se incubó entonces un Ab (denominado Ab2 en este enfoque) con clusterina antes de la inyección del complejo sobre la superficie de mAb1 (Fig. 11). Se confirmó que los cinco mAbs neutralizantes compitieron entre sí por la unión a clusterina, y con los anticuerpos anti-péptidos C18, pAb#10 y B5. Esto confirma que los cinco mAbs neutralizantes interactúan con los epítopos peptídicos solapantes de pAb#10, pAbC18 y mAb B5.

Se secuenciaron las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) hipervariables de los doce Abs monoclonales. Las Igs de cadena ligera y de cadena pesada de mamífero contienen regiones conservadas adyacentes a las CDRs, y el uso de conjuntos de cebadores oligonucleotídicos apropiadamente diseñados permitió que se amplificasen específicamente las CDRs usando PCR (Fig.12). Estos productos se secuenciaron entonces directamente (SEC ID NO 8-30; véase la Figura 13).

Alineando las secuencias de las CDR de cuatro de los cinco anticuerpos monoclonales neutralizantes (11E2, 21B12, 20E11, 16C11), fue posible determinar una secuencia de consenso para CDR1 y CDR2 de VH de estos anticuerpos anti-clusterina (véase la Figura 14). Se determinaron las siguientes secuencias de consenso: CDR-1: G-Y-S/T-F-T-X-Y-X (SEC ID NO.: 6) y CDR-2: I-N/D-P/T-Y/E-X-G-X-P/T (SEC ID NO.: 7).

Los anticuerpos o péptidos que interactúan con el epítopo de clusterina definido aquí se pueden aplicar como agentes terapéuticos, es decir, pueden actuar como una sustancia terapéutica por derecho propio debido a su capacidad intrínseca para neutralizar la actividad promotora de EMT de clusterina. Adicionalmente, estos anticuerpos y péptidos se pueden usar como una sustancia terapéutica debido a su capacidad para dirigir toxinas, genes suicidas u otros agentes con actividad antitumoral a la vecindad de células tumorales a través de su interacción con clusterina segregada.

Las pequeñas moléculas que interactúan con el epítopo de clusterina definido aquí también pueden actuar como sustancias terapéuticas bloqueando la actividad promotora de EMT de la clusterina. Estos anticuerpos, péptidos y pequeñas moléculas que ejercen su actividad terapéutica interactuando con este epítopo de clusterina pueden mostrar menos toxicidad o efectos secundarios en comparación con otros agentes que eliminan todas las actividades de clusterina, es decir, agentes antisentido o RNAi, puesto que, aunque la actividad de EMT de clusterina se neutraliza cuando se bloquea este epítopo, las otras actividades de la clusterina siguen intactas.

Otras aplicaciones de los anticuerpos y péptidos que interactúan con el epítopo de clusterina definido aquí pueden ser como 1) sustancias de diagnóstico no formadoras de imagen, es decir, pueden detectar clusterina como un biomarcador en fluidos corporales accesibles o en muestras de tejidos/tumores para aplicaciones de diagnóstico y de pronóstico en cáncer, y 2) sustancias de diagnóstico formadoras de imagen, es decir, se pueden usar para dirigir agentes de contraste hacia tumores para la formación de imágenes in vivo debido a su interacción con clusterina segregada.

Se espera que los anticuerpos que comprenden las secuencias pesada y ligera identificados aquí, los anticuerpos que comprenden las CDRs (regiones determinantes de la complementariedad) identificados aquí (Figura 13) y los anticuerpos que comprenden las secuencias de consenso (Figura 14) sean útiles para los fines mencionados anteriormente.

La propia clusterina, o sus porciones que contienen el epítopo reconocido por los anticuerpos y péptidos explicados anteriormente, se puede usar como una vacuna. Preferiblemente, la clusterina se debería de combinar con un vehículo adecuado. La clusterina o porciones de clusterina que contienen el epítopo también se pueden usar en la generación de vacunas. De forma similar, también serán útiles las secuencia de aminoácidos que tienen al menos 90% de identidad con SEC ID NO. 4 o el epítopo de clusterina identificado aquí, puesto que probablemente tengan funcionalidad similar a las secuencias específicas identificadas aquí.

Cultivo celular, anticuerpos y reactivos

Las células BRI-JM01 se aislaron y caracterizaron como se describió (Lenferink et al., Breast Cancer Res., 6, R51430 (2004)). Las células se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO2, y se cultivaron en DF/5% de FBS (mezcla 1:1 de F12 de Ham y Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con 5% de suero fetal bovino (FBS) y antibióticos/antimicóticos (ambos de Wisent Inc.)).

TGF-1 recombinante humana y anticuerpo neutralizante de TGF- pan-específico 1D11 se reconstituyeron según las instrucciones del fabricante (R&D Systems). La clusterina de suero humano purificada fue proporcionada amablemente por Dr MR Wilson (Wilson y Easterbrook-Smith, 1992). La clusterina recombinante humana purificada se produjo en células HEK-293 (sistema de expresión general descrito en Durocher et al, 2002). Los anticuerpos contra las siguientes proteínas se adquirieron y se usaron en las diluciones v/v indicadas: E-cadherina (E-cad, clon anti-uvomorulina Decma-1; Sigma), Zona Occludens-1 (ZO-1; Chemicon), anticuerpos policlonales creados contra el término C de la cadena  de clusterina humana (clu; RDI y Santa Cruz), y caveolina-1 (cav-1; Santa Cruz). Los anticuerpos conjugados a peroxidasa de rábano picante (HRP) se obtuvieron de Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., y los anticuerpos marcados con Alexa-488 y la faloidina marcada con Rojo Texas se adquirieron de Molecular Probes. Todos los experimentos se llevaron a cabo con monocapas 75-80% confluentes de células

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BRI-JM01 en DF/5%. Cuando se indicó, las células se trataron durante 24 h o 48 h con TGF-1 o clusterina purificada a una concentración final de 100 pM o 200 nM, respectivamente.

Aislamiento y marcaje de ARN

Monocapas de células BRI-JM01 se hicieron crecer en ausencia o presencia de TGF-1 durante 30 min., 1, 2, 4, 6, 12 ó 24 h. ARNm poliA+ se extrajo (4 x cápsulas de 150 mm por punto de tiempo) usando el kit FastTrack™ 2.0 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El ARN se aisló y se marcó según Schade et al., 2004.

Hibridación y análisis de datos

Las micromatrices de ADNc (15.264 ESTs de ratón de secuencias verificadas; NIA 15K Mouse cDNA Clone Set of the National Institute of Aging, National Institutes of Health, USA, http://lgsun.grc.nia.nih.gov/cDNA/15k.html) se obtuvieron de la University Health Network Microarray Center en Toronto, Ontario Canadá (http://www.microarrays.ca/). Los portaobjetos se hibridaron con ADNc marcado con Cy3 o Cy5 como se describió (Enjalbert et al., 2003), se escanearon usando un ScanArray 5000 (Perkin Elmer v2.11) a una resolución de 10 micrómetros, y los archivos TIFF de 16 bits se cuantificaron usando software QuantArray (Perkin Elmer, v3.0). La normalización y análisis de los datos de micromatrices se llevaron a cabo como se describió (Enjalbert et al., 2003).

Análisis de transferencia northern y de RT-PCR semicuantitativa (SQ-RT-PCR)

Para SQ-RT-PCR, se amplificaron 3-5 g de ARN total en una reacción de RT-PCR de primera hebra de 20 l usando 50 U de SuperScript II (Invitrogen) según las directrices del fabricante con modificaciones. Las muestras se preincubaron (2 min., 42ºC) antes de añadir SuperScript II, y se omitió el tratamiento de RNaseOUT. Las muestras se incubaron (90 min., 42ºC) y después se enfriaron en hielo. Se añadieron dos l de reacción de primera hebra a la mezcla de PCR (2,5 U de Taq polimerasa (New England Biolabs), 10 M de cebadores directos/inversos) en un volumen final de 50 l, que se calentó (2 min., 94ºC) antes de la amplificación mediante PCR. En la Tabla 1 se dan los cebadores para la generación de las sondas usadas para transferencia northern y SQ-RT-PCR.

Análisis de transferencia western

Células BRI-JM01 que crecieron en cápsulas de 35 mm se trataron con TGF-1 (24 h). Las células se lisaron en SDS al 2% caliente. Cincuenta g de proteína total o 30 l de medio acondicionado se resolvió mediante SDS-PAGE (10%), en condiciones reductoras. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa, y las membranas se incubaron con anticuerpos primarios (clu, cav-1; 1/500) en TBS-T (Tris-HCl 20 mM (pH 7,6), NaCl 137 mM, Tween 20 al 0,1% (v/v)) que contiene 5% de leche desnatada (toda la noche, 4ºC). Las membranas se lavaron con TBS-T, se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP (1/20.000) en TBS-T + 5% de leche (1 h), y se lavaron con TBS-T. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron usando quimioluminiscencia mejorada (ECL; Perkin Elmer).

Microscopía de inmunofluorescencia

Células BRI-JM01 se sembraron en portaobjetos de cámaras de vidrio (Lab-Tek) y se trataron con clusterina purificada o TGF-1 preincubada (30 min.) con o sin anticuerpo anti-clu (8 g/ml) o 1D11 (100 nM). El medio acondicionado, obtenido de células BRI-JM01 no tratadas y tratadas con TGF-1 (24 h), se preincubó (30 min.) con estos anticuerpos antes de la incubación con células BRI-JM01 no tratadas. Tras 24 h de exposición, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% (10 min.), se enjuagaron dos veces (PBS), se permeabilizaron (2 min., Triton X100 al 0,2% en PBS), se enjuagaron nuevamente, y los sitios no específicos se bloquearon con FBS al 10% en PBS (40 min.). Las células fijadas con paraformaldehído se incubaron entonces (1 h) con anticuerpo primario (E-cad, 1/200; ZO-1, 1/100; clu, cav-1; 1/50) en PBS/FBS al 10%, se enjuagaron (4 x en PBS), y finalmente se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados fluorescentemente (Molecular Probes). Simultáneamente, filamentos de Factina se marcaron con faloidina marcada con Rojo Texas (1/100), y los núcleos se contratiñeron con 0,4 g/ml de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma). Los portaobjetos se enjuagaron (PBS) y se montaron usando Prolong antifade (Molecular Probes). Las imágenes fluorescentes se capturaron usando una cámara digital con CCD Coolsnap de Princeton Instrument montada en un microscopio Leitz Aristoplan, y se analizaron usando el software Eclipse (Empix Imaging Inc.) y Photoshop (Adobe).

Ensayos de proliferación celular

Células BRI-JM01 (2,5 x 104 células/pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos. Al día siguiente, el medio se repuso y se añadió a las células clusterina purificada, TGF-1, o TGF-1 preincubada durante 30 min. con anticuerpo 1D11 (100 nM) o anticuerpo anti-clu (8 g/ml). Después de 24 h, las células se marcaron mediante pulsos con 0,5 Ci/ml de [3H]timidina (Amersham), se enjuagaron (PBS, 4ºC), se tripsinizaron, y la incorporación de [3H]timidina se evaluó mediante recuento por centelleo líquido.

Ensayos de movilidad celular

Se sembraron células (2 x 104 células/pocillo) en placas de 12 pocillos revestidas con tinta según Al-Moustafa et al.

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Inmunoprecipitación

Se incubaron 50 ó 100 ng de los diversos anticuerpos monoclonales o de la preparación de anticuerpo policlonal (C18) con 20 l de proteína G (1:1 en PBS) toda la noche a 4ºC. Después, se añadieron 500 ng de clusterina recombinante humana, y la muestra se incubó durante otras 2 h a 4ºC. Los inmunocomplejos se lavaron 3 veces con 1 ml de tampón (NaCl 150 nM, Tris 50 mM pH 8,0, NP-40 al 0,55%, fluoruro de sodio 50 mM), y se añadieron 20 l de tampón de muestra reductor. Las muestras se hirvieron durante 5 min. antes de cargarlas en un SDS-PAGE al 12%. Las proteínas separadas se transfirieron entonces a nitrocelulosa, y las membranas se sondaron con anticuerpos anti-clusterina como se describió.

Secuenciación de la región variable del anticuerpo monoclonal

Se aisló ARN total a partir de los 12 hibridomas, y se preparó ADNc de primera hebra con transcriptasa inversa y el cebador de la región constante de Ig-3, seguido de la amplificación con el cebador de Ig-5’ apropiado. Los conjuntos de cebadores usados conjuntamente con KOD Hot Start DNA Polymerase amplifican específicamente las regiones variables de los ADNc de cadena ligera y pesada. Los productos de la PCR se pueden clonar directamente con el kit de clonación de Novagen pSTBlue-1 Perfectly Blunt™, o se trataron con el Single dA™ Tailing Kit y se clonaron en el vector pSTBlue-1 AccepTor™. Para detalles, véase la Figura 13.

Tabla 1: Conjuntos de cebadores usados para la validación de algunos de los 328 genes modulados por TGF- en las células BRI-JM01

Gen Nº de Inverso Directo tamaño (pb) GeneBank

Eef1a1 AW556381 CTGGCTTCACTGCTCAGGT TGGCCAATTGAGACAAACAG 457

Clusterina

AU041878 TGGTGAAAGCTGTTTGACTCTG AAGGCGGCTTTTATTGGATT 355

Integrina 6

AW556992 ATGTGCCATTGTTGCTTTGA CAAGCGATGAGCACTTTTGT 517

Caveolina-1

AU016590 GTGCAGGAAGGAGAGAATGG GCACACCAAGGAGATTGACC 247

Ptpn13

AW548343 CCTGCAATGGTTCTTGGTTT GGGAAAATCGATGTTGGAGA 300

14-3-3

AA410123 GGGCTGTTGGCTATCTCGTA AGAGACCGAGCTCAGAGGTG 297

La inclusión de una referencia no es ni una admisión ni una sugerencia de que es relevante para la patentabilidad de lo descrito aquí Bailey et al., Biochemistry. 2001; 40:11828-40 Dunker et al., J Mol Graph Model. 2001; 19 (1):26-59 Li et al., Genome Inform. Ser. Workshop Genome Inform. 1999; 10: 30-Jones, J. Mol. Biol. 1999; 287: 797-815 Lupas, Meth. in Enzym. 1996; 266: 513-525 Rost, Meth. in Enzym. 1996; 266: 525-539 Singh et al., Curr Opin Drug Discov Devel. 2004: 437-445 Al-Moustafa et al., Biotechniques, 1999: 60-62 Durocher et al., Nucleic Acids Res 2002: E9 Enjalbert et al., Mol Biol Cell. 2003: 1460-1467 Schade et al., Mol Biol Cell 2004: 5492-5502 Wilson y Easterbrook-Smith, Biochim Biophys Acta 1992: 319-326

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