ES2543086T3 - Cepas de Agrobacterium desarmadas, plásmidos Ri y procedimientos de transformación basados en ellas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir una célula de planta transgénica que comprende las etapas de: a) proporcionar bacterias de una variante de cepa no patógena transgénica de la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB 2659) que es una bacteria patógena de las plantas transmitida por la tierra caracterizada por una secuencia intergénica de ARNr 16S-23S que comprende al menos un motivo de secuencia seleccionado del grupo que consiste en los motivos de secuencia descritos por SEC ID Nº: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en el que dicha variante de cepa es capaz de infectar células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y en el que dicha variante de cepa comprende además una variante de plásmido no patógeno del plásmido Ri pRi2659 y un ADN-T transgénico, y b) co-cultivar una célula de planta con dichas bacterias, y c) aislar o seleccionar células vegetales que comprenden establemente integrado en su genoma dicho ADN-T transgénico, en el que dicha variante de cepa no patógena es capaz de infectar células vegetales, para mediar en la transferencia de ADN-T en células vegetales, y para mediar en la inserción de ADN-T en el genoma de la planta, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y en el que la variante de plásmido no patógeno comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90 % con una secuencia como se describe por SEC ID Nº: 24.

Description

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Por consiguiente, una realización preferida de la invención se refiere a una variante de plásmido no patógeno de pRi2659 o un derivado de la misma, en la que dicha variante de plásmido comprende las secuencias requeridas para la infección y transformación de la célula de planta del pRi2659 patógeno nativo o su derivado, pero carece del ADN-T, preferentemente la región descrita por la secuencia de aproximadamente la base 538 a aproximadamente la base 15519 de la secuencia caracterizada por el nº de acceso de GenBank AJ271050 (SEC ID Nº: 4) o de aproximadamente la base 3644 a aproximadamente la base 18577 de la secuencia caracterizada por SEC ID Nº: 26. Esta secuencia se corresponde con el ADN-T del plásmido Ri pRi2659 patógeno original como se proporciona en la cepa K599 de Agrobacterium patógena (NCPPB 2659). Más preferentemente, dicha variante de plásmido no patógeno es una secuencia que se hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad (por ejemplo, equivalentes a la unión

o hibridación a 68 ºC en una disolución que consiste en 5x SSPE, 1 % de SDS, 5x reactivo de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado en una disolución que comprende 0,1x SSPE y 0,1 % de SDS a 68 ºC) con el plásmido Ri pRi2659 patógeno original como se proporciona en la cepa K599 de Agrobacterium patógena (NCPPB 2659), pero que no se hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad con la secuencia de aproximadamente la base 538 a aproximadamente la base 15519 de la secuencia caracterizada por el nº de acceso de GenBank AJ271050 (SEC ID Nº: 4) o de aproximadamente la base 3644 a aproximadamente la base 18577 de la secuencia caracterizada por SEC ID Nº: 26.

Más preferentemente, el derivado de pRi2659 es un plásmido capaz de mediar en la transferencia de ADN-T de una bacteria transmitida por la tierra en una célula de planta caracterizado adicionalmente por

a) tener una homología de al menos el 90 % con el ADN que codifica el plásmido pRi2659 nativo (como está comprendido en la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB2659) o b) hibridarse bajo condiciones de alta rigurosidad equivalentes a la unión o hibridación a 68 ºC en una disolución que consiste en 5x SSPE, 1 % de SDS, 5x reactivo de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado en una disolución que comprende 0,1x SSPE y 0,1 % de SDS a 68 ºC con el plásmido pRi2659 nativo.

Preferentemente, el ADN-T en dicha variante de cepa no patógena transgénica de la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB 2659) o su derivado está comprendida en un plásmido de vector binario separado del plásmido que proporciona las características requeridas para la infección de la planta (tal como un plásmido Ti o Ri que carece de sus propiedades neoplásicas o inductoras de raíces pilosas). Preferentemente, el ADN-T está flanqueado por al menos la secuencia de límite derecho (más preferentemente por la secuencia de límite derecho e izquierdo). Se prefieren límites de Ti y/o Ri. En una realización preferida, dicho ADN-T transgénico comprende al menos un casete de expresión para conferir a dicha planta un rasgo agronómicamente valioso. En otra realización preferida, dicho ADN-T comprende además al menos un gen marcador, que permite la selección y/o identificación de plantas, células vegetales o tejidos transformados.

Se ha demostrado que los límites de ADN-T del plásmido pRI2659 son especialmente eficaces en la transferencia de ADN-T y así en la generación de plantas transgénicas (especialmente plantas de soja transgénicas). Así, otra realización de la invención se refiere a ADN-T transgénico flanqueado por al menos un límite de ADN-T del plásmido pRi2659 de Agrobacterium rhizogenes, no comprendiendo dicho ADN-T transgénico secuencias que causen un fenotipo de raíces pilosas. Preferentemente, al menos una de dichas secuencias de límite se describe por SEC ID Nº: 18 ó 19. Más preferentemente, dicho ADN-T transgénico comprende al menos un casete de expresión para conferir a dicha planta un rasgo agronómicamente valioso o al menos un gen marcador, que permite la selección y/o identificación de plantas, células vegetales o tejidos transformados. Otro objeto de la invención se refiere a un vector transgénico que comprende dicho ADN-T transgénico de la invención.

Otras realizaciones de la invención se refieren a células u organismos no humanos que comprenden una secuencia de nucleótidos, una variante de plásmido no patógeno o un ADN-T transgénico de la invención. Preferentemente, dichas células u organismos no humanos están seleccionados del grupo que consiste en bacterias, levaduras, plantas, mamíferos e insectos. En una realización preferida, dicha célula u organismo es una bacteria transmitida por la tierra del género Rhizobiaceae. En otra realización preferida, dicha célula u organismo es célula de planta u organismo de planta, más preferentemente seleccionada del grupo de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas.

Otros objetivos, ventajas y características de la presente invención serán evidentes de la siguiente memoria descriptiva.

Descripción de los dibujos

Fig. 1A Dendrograma que demuestra la relación de cepas de Agrobacteria como se ha determinado por RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar) (Figura 2 de Llob 2003). Para la descripción de las diversas cepas véase la Tabla 1 a continuación. La cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB 2659) bajo estas condiciones se agrupa en un grupo distinto de cultivares separado de las cepas de “Agrobacterium tumefaciens” tradicionales tales como C58 o Ach5, pero también de otras cepas de “Agrobacterium rhizogenes” tales como NCPPB 8196 o ATCC 15834. Fig. 1B Dendrograma que demuestra la relación de cepas de Agrobacterium como se ha determinado por comparación de ARNr 16S. Las secuencias se compilan usado el programa Clustal W (Saitou 1987). Las cepas se describen por el nº de acceso de GenBank de sus ARNr 16S respectivos. Se evalúan las siguientes cepas:

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Especie

Nº de acceso Nombre alternativo / Nombre en el dendrograma (si es diferente del nº de acceso de GenBank)

A. tumefaciens

AB114201

A. tumefaciens

AF388033 Cepa 52

A. tumefaciens

AF388030 Cepa 42

A. tumefaciens

AY306228 NCPPB 4042

A. tumefaciens

AY306224 CSL 3276

A. tumefaciens

AY306223 CSL 3139

A. tumefaciens

AY306222

A. tumefaciens

D14500

A. tumefaciens

AJ389902 NCPPB 1641

A. tumefaciens

AJ012209 C58

A. tumefaciens

S56774 C58

A. tumefaciens

AB102735

A. tumefaciens

AB102734

A. tumefaciens

AB102733

A. tumefaciens

AB102732

A. spp.

AY174112 JS71

A. spp.

D14506

A. spp.

D14504

A. rhizogenes

D14501

A. rhizogenes

X67232

A. rhizogenes

X67224

A. vitis

D14502

A. vitis

D12795

A. vitis

X67225

R. vitis

AB118158

R. vitis

AB114418

A. vitis

AJ389912

A. vitis

AJ389911

A. rubi

D14503

A. rubi

X67228

A. rubi

D12787

A. larrymoorei

Z30542 Cepa de Ficus

R. leguminosarum

D14513

R. galegae

D11343

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(continuación)

Especie

Nº de acceso Nombre alternativo / Nombre en el dendrograma (si es diferente del nº de acceso de GenBank)

S. meliloti

D14509

S. fredii

D14516

R. tropici

D11344

A. rhizogenes

K599 BPS 599

A. tumefaciens

AGL0 BPS 600

A. tumefaciens

AGL1 BPS 601

A. tumefaciens

MP90 BPS 602

A. tumefaciens

LBA4404 BPS 603

Fig. 1C Dendrograma que demuestra la relación de cepas de Agrobacterium como se ha determinado por la comparación de secuencias de aminoácidos de virD2. Las secuencias se compilan usando el programa Clustal W (Saitou 1987). Las cepas se describen por el nº de acceso de GenBank de sus proteínas virD2 respectivas. Se evalúan las siguientes cepas:

Especie

Nº de acceso Nombre alternativo / Nombre en el dendrograma (si es diferente del nº de acceso de GenBank)

Agrobacterium K599

Ri2659 = K599

A. tumefaciens

AAL57024 TiAB2/73

A. tumefaciens

AD3250

A. tumefaciens

B25063 TiA6

A. tumefaciens

B37763 TiC58

A. rhizogenes

CAA31351 A4b

A. tumefaciens

NP 053396 TiSAKURA

A. tumefaciens

NP 059814 Ti15955

A. rhizogenes

NP 066749 Ri1724

A. tumefaciens

NP 396503 TiC58 Cereon

A. tumefaciens

NP 536300 TiC58 UW

Bradyrhizobium japonicum USDA 110

NP 766684

Bordetella bronchiseptica RB50

NP 887044

A. rhizogenes

P13462 RiA4

Streptococcus pneumoniae TIGR4

ZP 00402780

Bordetella bronchiseptica RB50

ZP 00613251

Azotobacter vinelandii OP

ZP 00416447

Fig. 2: Mapa de restricción física de la región de ADN-T del plásmido pRi2659 de Agrobacterium. Las flechas indican las regiones de límite derecho e izquierdo (de: Combard 1987).

10 Fig. 3 Expresión transitoria de GUS en soja (5 días) de explantes de meristemos axilares de hojas después de 2 días de co-cultivo con tanto AGL1 (pBPSMM192b) (I) como SHA016 (pBPSMM192b) (II). SHA016/pBPSMM192b es

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una cepa de variante de K599 de Agrobacterium transgénica desarmada. AGL1/pBPSMM192b es una cepa de control. Las cepas SHA001 y SHA016 de Agrobacterium son cepas funcionalmente equivalentes de la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB 2659) (pRi2659Δtet), es decir, que comprenden el plásmido pRi2659Δtet desarmado. Fig. 4 Expresión estable de GUS en soja 35 días después de la infección usando explantes de meristemos axilares de hojas infectadas con SHA001 de Agrobacterium (pBPSEW008) (I, II, III: ejemplos para diversos explantes). SHA001 (pBPSEW008) es una cepa de variante de K599 de Agrobacterium transgénica desarmada (pRi2659Δtet). Fig. 5 Plántulas de tomate transgénicas (A) usando SHA001 recombinante que contiene pBPSMM192b y expresión de GUS en las hojas transgénicas (B). SHA001 (pBPSMM192b) es una cepa de variante de K599 de Agrobacterium transgénica desarmada (pRi2659Δtet). Fig. 6 Hibridación Southern de K599 marcada con tetraciclina desarmada (pRi2659Δtet). La pérdida de una banda de hibridación en eventos de doble cruce, cuando se sonda con límite derecho, indica la deleción de la región de ADN-T de pRi2659 (Southern inferior). La banda de hibridación en Southern superior indica la presencia de ADN flanqueante fuera de la deleción de ADN-T. FD = hibridación con sonda del flanco derecho FI = hibridación con sonda del flanco izquierdo WT = no mutante S = clon resultante de un cruce simple con respecto a la recombinación que produce una inserción que comprende tanto ADN-T no mutante como ADN-T de deleción CS = clon simple confirmado resultante del cruce simple con respecto al patrón de banda que coincide con el tamaño de banda calculado (producto intermedio) D = clon resultante del cruce doble con respecto a la recombinación que produce la deleción de ADN-T prevista (producto final previsto) Fig. 7 Ensayo de raíz pilosa en cotiledones de soja

[a] La infección con K599 desarmada no produce raíces pilosas.

[b] La infección con K599 no mutante produce raíces pilosas.

Fig. 8 Expresión transitoria de GUS en células vegetales (para la descripción de la construcción véanse los ejemplos más adelante).

A: Transformación de embriones de maíz. SHA001 es una cepa de variante de K599 de Agrobacterium desarmada. LBA4404 es una cepa de control.

B: Transformación de otros tejidos de plantas con SHA001 en combinación con diversos vectores binarios (indicados debajo de las figuras; descripción véanse los ejemplos). I: Nodos axilares de soja en planta de semillero; II: Callo organogénico de soja; III: Cotiledones de tomate

Fig. 9: Arabidopsis transgénica T1 estable seleccionada con AHAS. La transformación se llevó a cabo con cepas MP90 de Agrobacterium (cepa 1 de control), cepa K599 de Agrobacterium no mutante (cepa 2 de control) y cepa K599 de Agrobacterium desarmada (SHA001), comprendiendo cada una tanto plásmido binario pBPSEW008 como pBPSMM192b, respectivamente. Fig. 10: Tinción de GUS de Arabidopsis transgénica T1 estable. Arabidopsis transgénica T1 estable seleccionada con AHAS. La transformación se llevó a cabo con cepas MP90 de Agrobacterium (cepa 1 de control), cepa K599 de Agrobacterium no mutante (cepa 2 de control) y cepa K599 de Agrobacterium desarmada (SHA001), comprendiendo cada una tanto plásmido binario pBPSEW008 como pBPSMM192b, respectivamente. Fig. 11: Mapa de la región de ADN-T del plásmido pRi2659 que incluye regiones flanqueantes derecha e izquierda. Fig. 12: Diagrama de flujo que detalla las etapas usadas para construir los casetes de deleción usados para desarmar la cepa K599. Fig. 13:

A: Mapas de plásmidos del vector pBPSMM192b y pBPSMM232

B: Mapa de plásmidos del vector pBPSEW008

Fig. 14: A-E: Alineamiento de diversas regiones de secuencias intergénicas de ARNr 16S-23S de bacterias transmitidas por la tierra. K599: Cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB 2659) AE008980: C58 de Agrobacterium tumefaciens AE009348: C58 de Agrobacterium tumefaciens AE008265: C58 de Agrobacterium tumefaciens AE007948: C58 de Agrobacterium tumefaciens AE009201: C58 de Agrobacterium tumefaciens U45329: Agrobacterium vitis. NCPPB3554 AE102735: Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter) MAFF301001. La cepa C58 de Agrobacterium tiene 4 operones de ARNr. Éstos son los parientes conocidos más cercanos a la secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de K599. Otra secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de otras cepas de Agrobacterium tiene baja homología y no

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replicantes, polímeros infecciosos de ADN o ARN y ADN o ARN que realiza una función principalmente estructural. “Secuencia de ácidos nucleicos” también se refiere a una lista consecutiva de abreviaturas, letras, caracteres o palabras, que representan nucleótidos. En una realización, un ácido nucleico puede ser una “sonda” que es un ácido nucleico relativamente corto, normalmente menos de 100 nucleótidos de longitud. Frecuentemente, una sonda de ácido nucleico tiene de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud a aproximadamente 10 nucleótidos de longitud. Una “región diana” de un ácido nucleico es una porción de un ácido nucleico que se identifica que es de interés. Una “región codificante” de un ácido nucleico es la porción del ácido nucleico que se transcribe y traduce de un modo específico de secuencia para producir un polipéptido o proteína particular cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Se dice que la región codificante codifica un polipéptido o proteína tal.

El término “secuencia de nucleótidos de interés” se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos, cuya manipulación puede considerarse deseable por cualquier motivo (por ejemplo, confieren cualidades mejoradas), por un experto habitual en la materia. Tales secuencias de nucleótidos incluyen, pero no se limitan a, secuencias codificantes de genes estructurales (por ejemplo, genes indicadores, genes de marcadores de selección, genes de resistencia a fármacos, factores de crecimiento, etc.) y secuencias reguladoras no codificantes que no codifican un ARNm o producto de proteína (por ejemplo, secuencia promotora, secuencia de poliadenilación, secuencia de terminación, secuencia potenciadora, etc.). Una secuencia de ácidos nucleicos de interés puede codificar preferentemente un rasgo agronómicamente valioso. El término “antisentido” se entiende que significa un ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a una secuencia diana, por ejemplo, una secuencia de ARN mensajero (ARNm), el bloqueo de cuya expresión se busca iniciar por hibridación con la secuencia diana.

El término “sentido” se entiende que significa un ácido nucleico que tiene una secuencia que es homóloga o idéntica a una secuencia diana, por ejemplo, una secuencia que se une a un factor de transcripción de proteínas y que participa en la expresión de un gen dado. Según una realización preferida, el ácido nucleico comprende un gen de interés y elementos que permiten la expresión de dicho gen de interés.

El término “gen” se refiere a una región codificante operativamente unida a secuencias reguladoras apropiadas que pueden regular de alguna manera la expresión del polipéptido. Un gen incluye regiones reguladoras sin traducir de ADN (por ejemplo, promotores, potenciadores, represores, etc.) que preceden (en la dirección 5') y que siguen (en la dirección 3') a la región codificante (marco de lectura abierto, ORF) además de, si procede, secuencias intercaladas (es decir, intrones) entre regiones codificantes individuales (es decir, exones). El término “gen estructural”, como se usa en el presente documento, pretende significar una secuencia de ADN que se transcribe en ARNm, que entonces se traduce en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.

El término “genoma” o “ADN genómico” es con referencia a la información genética heredable de un organismo huésped. Dicho ADN genómico comprende el ADN del núcleo (también denominado ADN cromosómico), pero también el ADN de los plástidos (por ejemplo, cloroplastos) y otros orgánulos celulares (por ejemplo, mitocondrias). Preferentemente, los términos genoma o ADN genómico es con referencia al ADN cromosómico del núcleo.

El término “ADN cromosómico” o “secuencia de ADN cromosómico” debe entenderse como el ADN genómico del núcleo celular independiente del estado del ciclo celular. Por tanto, el ADN cromosómico podría organizarse en cromosomas o cromátidas, podría condensarse o desenrollarse. Una inserción en el ADN cromosómico puede demostrarse y analizarse por diversos procedimientos conocidos en la técnica como, por ejemplo, análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), análisis de transferencia Southern, hibridación in situ por fluorescencia (FISH) y PCR in situ.

Como se usa en el presente documento, el término “región codificante”, cuando se usa en referencia a un gen estructural, se refiere a las secuencias de nucleótidos que codifican los aminoácidos encontrados en el polipéptido naciente como resultado de la traducción de una molécula de ARNm. La región codificante está limitada, en eucariotas, en el extremo 5' por el triplete de nucleótidos “ATG” que codifica la metionina iniciadora y en el extremo 3' por uno de los tres tripletes, que especifican codones de terminación (es decir, TAA, TAG, TGA). Además de contener intrones, formas genómicas de un gen también pueden incluir secuencias localizadas en tanto el extremo 5' como 3' de las secuencias que están presentes en el transcrito de ARN. Estas secuencias se denominan secuencias

o regiones “flanqueantes” (estas secuencias flanqueantes se localizan 5' o 3' con respecto a las secuencias no traducidas presentes en el transcrito de ARNm). La región flanqueante de 5' puede contener secuencias reguladoras tales como promotores y potenciadores, que controlan o influyen en la transcripción del gen. La región flanqueante de 3' puede contener secuencias, que dirigen la terminación de la transcripción, después de la escisión y poliadenilación transcripcional.

Como se usa en el presente documento, el término “secuencia de aminoácidos” se refiere a una lista de abreviaturas, letras, caracteres o palabras que representan residuos de aminoácidos. Los aminoácidos pueden denominarse en el presente documento por tanto sus símbolos de tres letras como por los símbolos de una letra comúnmente conocidos recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Asimismo, los nucleótidos pueden denominarse por sus códigos de una letra comúnmente aceptados.

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condición de hibridación de interés si esta otra condición de hibridación también produce la hibridación de la primera secuencia de ácidos nucleicos con las otras secuencias de ácidos nucleicos que tienen del 80% al 90 % de homología con la primera secuencia de ácidos nucleicos.

Cuando se usa en referencia a la hibridación de ácidos nucleicos, la materia sabe bien que pueden emplearse numerosas condiciones equivalentes que comprenden tanto condiciones de baja como de alta rigurosidad; se consideran factores tales como la longitud y la naturaleza (ADN, ARN, composición de bases) de la sonda y naturaleza de la diana (ADN, ARN, composición de bases, presentes en disolución o inmovilizadas, etc.) y la concentración de las sales y otros componentes (por ejemplo, la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano, polietilenglicol) y la disolución de hibridación puede variarse para generar condiciones de tanto hibridación de baja como de alta rigurosidad diferentes de, pero equivalentes a, las condiciones enumeradas anteriormente. Aquellos expertos en la materia saben que, aunque pueden preferirse mayores rigurosidades para reducir o eliminar la unión no específica, pueden preferirse menores rigurosidades para detectar un mayor número de secuencias de ácidos nucleicos que tienen diferentes homologías.

“Transgén”, “transgénico” o “recombinante” se refiere a un polinucleótido manipulado por el hombre o una copia o complemento de un polinucleótido manipulado por el hombre. Por ejemplo, un casete de expresión transgénico que comprende un promotor operativamente ligado a un segundo polinucleótido puede incluir un promotor que es heterólogo al segundo polinucleótido como resultado de la manipulación por el hombre (por ejemplo, por procedimientos descritos en Sambrook 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, volúmenes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)) de un ácido nucleico aislado que comprende el casete de expresión. En otro ejemplo, un casete de expresión recombinante puede comprender polinucleótidos combinados de tal forma que sea extremadamente poco probable que los polinucleótidos se encuentren en la naturaleza. Por ejemplo, sitios de restricción o secuencias de vectores plasmídicos manipuladas por el hombre pueden flanquearse o separarse de un promotor del segundo polinucleótido. Un experto reconocerá que los polinucleótidos pueden manipularse de muchas formas y no se limitan a los ejemplos anteriores.

El término “transgénico” o “recombinante”, como se usa en el presente documento (por ejemplo, con respecto a una célula de planta o planta), pretende referirse a células y/o plantas que contienen un transgén, o cuyo genoma ha sido alterado por la introducción de un transgén, o que tienen genes exógenos o secuencias de ADN incorporadas, que incluyen, pero no se limitan a, genes o secuencias de ADN que quizás no están normalmente presentes, genes normalmente no transcritos y traducidos (“expresados”) en un tipo de célula dado, o cualquier otro gen o secuencia de ADN que se desee introducir en la célula no transformada y/o planta, tal como genes que normalmente pueden estar presentes en la célula no transformada y/o planta, pero que se desea que tenga expresión alterada. Preferentemente, el término “recombinante”, con respecto a los ácidos nucleicos como se usa en el presente documento, significa que el ácido nucleico está covalentemente unido y es adyacente a un ácido nucleico con el que no es adyacente en su entorno natural. Pueden producirse células, tejidos y plantas transgénicos por varios procedimientos que incluyen la introducción de un “transgén” que comprende ácido nucleico (normalmente ADN) en una célula diana o integración del transgén en un cromosoma de una célula diana a modo de intervención humana, tal como por los procedimientos descritos en el presente documento.

El término “transgén”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier secuencia de ácidos nucleicos que se introduce en el genoma de una célula por manipulaciones experimentales. Un transgén puede ser una “secuencia de ADN endógena”, o una “secuencia de ADN heteróloga” (es decir, “ADN extraño”). El término “secuencia de ADN endógena” se refiere a una secuencia de nucleótidos que se encuentra naturalmente en la célula en la que se introduce, mientras que no contenga ninguna modificación (por ejemplo, una mutación puntual, la presencia de un gen marcador de selección, etc.) con respecto a la secuencia que se produce naturalmente.

El término “transgén” o “transgénico” con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos (o un organismo, construcción de expresión o vector que comprende dichas secuencias de ácidos nucleicos) se refiere a todas aquellas construcciones que se originan por manipulaciones experimentales en las que tanto

a) dichas secuencias de ácidos nucleicos, o

b) una secuencia de control genético operativamente asociada a dichas secuencias de ácidos nucleicos a), por ejemplo, un promotor, como

c) (a) y (b)

no está localizada en su entorno genético natural o se ha modificado por manipulaciones experimentales, siendo un ejemplo de una modificación una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. Entorno genético natural se refiere al locus cromosómico natural en el organismo de origen, o a la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el entorno genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos se retiene preferentemente, al menos en parte. El entorno flanquea la secuencia de ácidos nucleicos al menos en un lado y tiene una secuencia de al menos 50 pb, preferentemente al menos 500 pb, especialmente preferentemente al menos 1.000 pb, muy especialmente preferentemente al menos 5.000 pb, de longitud. Una construcción de expresión que se produce naturalmente, por ejemplo, la combinación que se produce

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naturalmente de un promotor con el gen correspondiente, se vuelve una construcción de expresión transgénica cuando se modifica por procedimientos “artificiales” sintéticos no naturales tales como, por ejemplo, mutagenización. Tales procedimientos se han descrito (documentos US 5.565.350; WO 00/15815).

Los términos “secuencia de ácidos nucleicos heteróloga” o “ADN heterólogo” se usan indistintamente para referirse a una secuencia de nucleótidos, que se liga a, o se manipula para ligarse a, una secuencia de ácidos nucleicos con la que no está ligada en la naturaleza, o con la que se liga en una localización diferente en la naturaleza. El ADN heterólogo no es endógeno para la célula en la que se introduce, pero ha sido obtenido a partir de otra célula. El ADN heterólogo también incluye una secuencia de ADN endógena, que contiene alguna modificación. Generalmente, aunque no necesariamente, el ADN heterólogo codifica ARN y proteínas que normalmente no se producen por la célula en la que se expresa. Ejemplos de ADN heterólogo incluyen genes indicadores, secuencias reguladoras de la transcripción y traducción, proteínas de marcador de selección (por ejemplo, proteínas que confieren resistencia a fármacos), etc. Preferentemente, el término “transgénico” o “recombinante” con respecto a una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor de la invención) significa que dicha secuencia reguladora está covalentemente unida y es adyacente a un ácido nucleico al que no es adyacente en su entorno natural.

El término “gen extraño” se refiere a cualquier ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de genes) que se introduce en el genoma de una célula por manipulaciones experimentales y puede incluir secuencias de genes encontradas en esa célula mientras que el gen introducido contiene alguna modificación (por ejemplo, una mutación puntual, la presencia de un gen marcador de selección, etc.) con respecto al gen que se produce naturalmente.

Polipéptidos o proteínas “recombinantes” se refieren a polipéptidos o proteínas producidos por técnicas de ADN recombinante, es decir, producidos a partir de células transformadas por una construcción de ADN recombinante exógena que codifica el polipéptido o proteína deseada. Los ácidos nucleicos recombinantes y polipéptido también pueden comprender moléculas, que como tales no existen en la naturaleza, pero están modificadas, cambiadas, mutadas o manipuladas de otro modo por el hombre. Preferentemente, un “polipéptido recombinante” es un polipéptido que no se produce naturalmente que se diferencia en la secuencia de un polipéptido que se produce naturalmente por al menos un residuo de aminoácido. Procedimientos preferidos para producir dicho polipéptido recombinante y/o ácido nucleico pueden comprender mutagénesis dirigida o no dirigida, barajado de ADN u otros procedimientos de recombinación recursiva.

El término “organismo genéticamente modificado” u “OGM” se refiere a cualquier organismo que comprenda ADN de transgén. Organismos a modo de ejemplo incluyen plantas, animales y microorganismos.

El término “célula” o “célula de planta”, como se usa en el presente documento, se refiere a una célula individual. El término “células” se refiere a una población de células. La población puede ser una población pura que comprende un tipo de célula. Asimismo, la población puede comprender más de un tipo de célula. En la presente invención, no hay límite al número de tipos de células que una población de células puede comprender. Las células pueden estar sincronizadas o no sincronizadas. Una célula de planta dentro del significado de la presente invención puede estar aislada (por ejemplo, en cultivo en suspensión) o estar comprendida en un tejido de planta, órgano de planta o planta en cualquier etapa de desarrollo.

El término “órgano”, con respecto a una planta (u “órgano de planta”), significa partes de una planta y puede incluir (pero no debe limitarse a), por ejemplo, raíces, frutos, brotes, tallo, hojas, anteras, sépalos, pétalos, polen, semillas, etc.

El término “tejido”, con respecto a una planta (o “tejido de planta”), significa la disposición de múltiples células vegetales que incluyen tejidos de plantas diferenciados y no diferenciados. Los tejidos de planta pueden constituir parte de un órgano de planta (por ejemplo, la epidermis de una hoja de planta), pero también pueden constituir tejidos tumorales (por ejemplo, tejido de callo) y diversos tipos de células en cultivo (por ejemplo, células individuales, protoplastos, embriones, callos, cuerpos similares a protocormos, etc.). El tejido de planta puede estar en planta, en cultivo de órgano, cultivo de tejido o cultivo celular.

El término “planta”, como se usa en el presente documento, se refiere a una pluralidad de células vegetales, que se diferencian en gran medida en una estructura que está presente en cualquier etapa de desarrollo de una planta. Tales estructuras incluyen uno o más órganos de planta que incluyen, pero no se limitan a, fruto, brote, tallo, hoja, pétalo de flor, etc. Preferentemente, el término “planta” incluye plantas enteras, órganos/estructuras vegetativas del brote (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estámenes, carpelos, anteras y óvulos), semillas (incluyendo embrión, endospermo y envuelta de la semilla) y frutos (el ovario maduro), tejidos de planta (por ejemplo, tejido vascular, tejido fundamental y similares) y células (por ejemplo, células guarda, óvulos, tricomas y similares) y progenie de la misma. La clase de plantas que pueden usarse en el procedimiento de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores e inferiores aceptadas para las técnicas de transformación, que incluyen angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), gimnospermas, helechos y algas multicelulares. Incluye plantas de una variedad de niveles de ploidia, que incluyen aneuploide, poliploide, diploide, haploide y hemicigótica. Incluido dentro del alcance de la invención están todos los géneros y especies de plantas superiores e inferiores del reino de las plantas. Además, están incluidas las plantas maduras, semilla, brotes y plantas de semillero, y partes, material de propagación (por

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ejemplo, semillas y fruto) y cultivos, por ejemplo, cultivos celulares, derivados de las mismas. Se prefieren plantas y materiales de planta de las siguientes familias de plantas: Amaranthaceae, Brassicaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Tetragoniaceae.

Las plantas anuales, perennes, monocotiledóneas y dicotiledóneas son organismos huésped preferidos para la generación de plantas transgénicas. El uso del sistema de recombinación, o procedimiento según la invención, es además ventajoso en todas las plantas ornamentales, árboles forestales, frutales u ornamentales, flores, flores cortadas, arbustos o césped. Dicha planta puede incluir, pero no debe limitarse a, briofitas tales como, por ejemplo, Hepaticae (hepáticas) y Musci (musgos); pteridofitas tales como helechos, cola de caballo y licopodios; gimnospermas tales como coníferas, cicadáceas, Ginkgo y Gnetales; algas tales como Clorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (diatomeas) y Euglenophyceae.

Plantas para los fines de la invención pueden comprender las familias de Rosaceae tales como rosa, Ericaceae tales como rododendros y azaleas, Euphorbiaceae tales como poinsetias y crotón, Caryophillaceae tales como claveles, Solanaceae tales como petunias, Gesneriaceae tal como violeta africana, Balsaminaceae tal como mimosa, Orchidaceae tal como orquídeas, Iridaceae tal como gladiolos, iris, fresias y crocus, Compositae tales como caléndula, Geraniaceae tales como geranios, Liliaceae tal como Drachaena, Moraceae tal como ficus, Araceae tal como filodendro y muchas otras.

Las plantas transgénicas según la invención se seleccionan además en particular de entre plantas de cultivo dicotiledóneas tales como, por ejemplo, de las familias de las Leguminosae tales como guisante, alfalfa y soja; la familia de las Umbelliferae, particularmente el género Daucus (muy particularmente las especies carota (zanahoria)) y Apium (muy particularmente las especies graveolens var. dulce (apio)) y muchas otras; la familia de las Solanaceae, particularmente el género Lycopersicon, muy particularmente las especies esculentum (tomate) y el género Solanum, muy particularmente las especies tuberosum (patata) y melongena (berenjena), tabaco y muchas otras; y el género Capsicum, muy particularmente las especies annum (pimienta) y muchas otras; la familia de las Leguminosae, particularmente el género Glycine, muy particularmente las especies max (soja) y muchas otras; y la familia de las Cruciferae, particularmente el género Brassica, muy particularmente las especies napus (colza oleaginosa), campestris (remolacha), oleracea cv Tastie (col), oleracea cv Snowball Y (coliflor) y oleracea cv Emperor (brócoli); y el género Arabidopsis, muy particularmente las especies thaliana y muchas otras; la familia de las Compositae, particularmente el género Lactuca, muy particularmente las especies sativa (lechuga) y muchas otras.

Las plantas transgénicas según la invención se seleccionan en particular de entre plantas de cultivo monocotiledóneas, tales como, por ejemplo, cereales tales como trigo, cebada, sorgo y mijo, centeno, tritical, maíz, arroz o avena, y caña de azúcar. Adicionalmente se prefieren árboles tales como manzano, peral, membrillero, ciruelo, cerezo, melocotonero, nectarino, albaricoquero, papayo, mango, y otras especies leñosas que incluyen árboles coníferos y caducifolios tales como chopo, pino, secuoya, cedro, roble, etc. Son especialmente preferidos Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, colza oleaginosa, soja, grano (maíz), trigo, linaza, patata y tagetes.

La “eficiencia de transformación” o “frecuencia de transformación”, como se usa en el presente documento, puede medirse por el número de células transformadas (u organismos transgénicos cultivados a partir de células transformadas individuales) que se recuperan bajo condiciones experimentales estándar (es decir, estandarizadas o normalizadas con respecto a la cantidad de células puestas en contacto con ADN extraño, cantidad de ADN administrado, tipo y condiciones de administración de ADN, condiciones generales de cultivo, etc.). Por ejemplo, cuando se usan pecíolos aislados como material de partida para la transformación, la frecuencia de transformación puede expresarse como el número de brotes transgénicos (o líneas de plantas fértiles resultantes) obtenidos por pecíolo transformado.

El término “expresión” se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural en ARNm y, opcionalmente, la posterior traducción de ARNm en uno o más polipéptidos.

El término “casete de expresión” o “construcción de expresión”, como se usa en el presente documento, pretende significar la combinación de cualquier secuencia de ácidos nucleicos que va a expresarse en enlace operable con una secuencia promotora y, opcionalmente, elementos adicionales (como, por ejemplo, secuencias terminadoras y/o de poliadenilación) que facilitan la expresión de dichas secuencias de ácidos nucleicos.

El término “promotor”, “elemento promotor” o “secuencia promotora”, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ADN que cuando se liga a una secuencia de nucleótidos de interés puede controlar la transcripción de la secuencia de nucleótidos de interés en ARNm. Un promotor está normalmente localizado, aunque no necesariamente, 5' (es decir, en la dirección 5') de una secuencia de nucleótidos de interés (por ejemplo, proximal al sitio de iniciación de la transcripción de un gen estructural) cuya transcripción en ARNm controla, y proporciona un sitio para la unión específica por ARN polimerasa y otros factores de transcripción para la iniciación de la transcripción. Una secuencia de polinucleótidos es “heteróloga a” un organismo o una segunda secuencia de polinucleótidos si se origina a partir de una especie extraña, o, si es de la misma especie, se modifica a partir de su

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rica en prolina de trigo (documento WO 91/13991), un promotor del gen ptxA de Pisum sativum, y otras regiones de iniciación de la transcripción de diversos genes de plantas conocidas para aquellos expertos en la materia.

Por supuesto, los promotores pueden regular la expresión todo el tiempo en solo uno o algunos tejidos. Alternativamente, un promotor puede regular la expresión en todos los tejidos, pero solo en un momento de tiempo del desarrollo específico. Como se observa anteriormente, el promotor de la escisión (es decir, un promotor que está asociado al polinucleótido que escinde ADN específico de secuencia) es generalmente no constitutivo, pero en su lugar es activo durante solo parte del ciclo de vida o al menos un tejido del organismo transgénico. Puede usarse un promotor que dirija la expresión de un gen de interés en un tejido específico o esté de otro modo bajo control medioambiental o de desarrollo más preciso. Ejemplos de condiciones medioambientales que pueden afectar la transcripción por promotores inducibles incluyen ataque por patógenos, condiciones anaerobias, etileno o la presencia de luz. Promotores bajo el control del desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción solo en ciertos tejidos u órganos, tales como hojas, raíces, fruto, semillas o flores, o partes de los mismos. La operación de un promotor puede también variar dependiendo de su localización en el genoma. Así, un promotor inducible puede ser completamente o parcialmente constitutivo en ciertas localizaciones. Ejemplos de promotores de plantas específicos de tejido bajo el control del desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción solo en ciertos tejidos, tales como fruto, semillas, flores, anteras, ovario, polen, el meristemo, flores, hojas, tallos, raíces y semillas. El promotor ES específico de tejido del tomate es particularmente útil para dirigir la expresión génica de manera que un producto génico deseado se localice en frutos (véanse, por ejemplo, Lincoln 1988; Deikman 1988, 1992). Otros promotores específicos de semilla adecuados incluyen aquellos derivados de los siguientes genes: MAC1 de maíz (Sheridan 1996), Cat3 de maíz (GenBank nº L05934, Abler 1993), el gen que codifica oleosina 18kD de maíz (GenBank nº J05212, Lee 1994) viviparous-1 de Arabidopsis (nº de acceso de Genbank U93215), el gen que codifica oleosina de Arabidopsis (nº de acceso de Genbank Z17657), Atmycl de Arabidopsis (Urao 1996), la familia de genes de la proteína de almacenamiento de semillas 2S de Arabidopsis (Conceicao 1994), el gen que codifica oleosina 20kD de Brassica napus (GenBank nº M63985), napina de Brassica napus (GenBank nº J02798, Josefsson 1987), la familia del gen de napina (por ejemplo, de Brassica napus; Sjodahl 1995), documento US 5.608.152; Stalberg 1996), el gen que codifica la proteína de almacenamiento de semillas 2S de Brassica napus (Dasgupta 1993), los genes que codifican oleosina A (nº de acceso de Genbank U09118) y oleosina B (GenBank nº U09119) de soja, el gen que codifica la proteína rica en azufre de bajo peso molecular de soja (Choi 1995), el gen faseolina (documento US 5.504.200, Bustos 1989; Murai 1983; Sengupta-Gopalan 1985), el gen de albúmina 2S (Joseffson 1987), el gen de legumina (Shirsa 1989), el gen USP (proteína de semilla desconocida) (Baumlein 1991), el gen de la proteína de unión a sacarosa (documento WO 00/26388), el gen B4 de legumina (LeB4; Baumlein 1991a,b; 1992; Fiedler 1995), el gen de oleosina de Arabidopsis (documento WO 98/45461), el gen Bce4 de Brassica (documento WO 91/13980), genes que codifican la “glutenina de alto peso molecular” (HMWG), gliadina, enzima de ramificación, ADP-glucosa piro-fosfatasa (AGPasa) o almidón sintasa. Otros promotores preferidos son aquellos que permiten la expresión específica de semillas en monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz y similares. Promotores que pueden emplearse ventajosamente son un promotor del gen lpt2 o lpt1 (documentos WO 95/15389, WO 95/23230) o los promotores descritos en el documento WO 99/16890 (promotores del gen hordeína, el gen glutelina, el gen orizina, el gen prolamina, el gen gliadina, el gen zeína, el gen kasirina o el gen secalina). Adicionalmente se prefiere un promotor específico de hojas e inducido por la luz tal como aquel de cab o Rubisco (Simpson 1985; Timko 1985); un promotor específico de anteras tal como aquel de LAT52 (Twell 1989b); un promotor específico de polen tal como aquel de Zml3 (Guerrero 1993); y un promotor preferido de microsporas tal como aquel de apg (Twell 1993). Otros promotores adecuados son, por ejemplo, promotores específicos para tubérculos, raíces de almacenamiento o raíces tales como, por ejemplo, el promotor de patatina de clase I (B33), el promotor inhibidor de la catepsina D de patata, el promotor de la almidón sintasa (GBSS1) o el promotor de esporamina, y promotores específicos de frutos tales como, por ejemplo, el promotor específico del fruto de la tomatera (documento EP-A 409 625).

Promotores que son además adecuados son aquellos que garantizan la expresión específica de hojas. Promotores que pueden mencionarse son el promotor de FBPasa citosólica de la patata (documento WO 98/18940), el promotor SSU (subunidad pequeña) de Rubisco (ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa) o el promotor ST-LSI de la patata (Stockhaus 1989). Otros promotores preferidos son aquellos que gobiernan la expresión en semillas y embriones de plantas.

Otros promotores adecuados son, por ejemplo, promotores específicos de la maduración del fruto tales como, por ejemplo, los promotores específicos de la maduración del fruto de la tomatera (documento WO 94/21794), promotores específicos de flores tales como, por ejemplo, el promotor de la fitoeno sintasa (documento WO 92/16635) o un promotor del gen P1-rr (documento WO 98/22593), o puede usarse ventajosamente otro promotor específico de nodos como se describe en el documento EP-A 249676. Un promotor también puede ser un promotor específico de médula, tal como un promotor aislado de un gen TrpA de planta como se describe en el documento WO 93/07278. Se describe, entre otros, un promotor regulado por el desarrollo (Baerson 1993).

Un casete de expresión también puede contener un promotor químicamente inducible (artículo de revisión: Gatz 1997), por medio del cual la expresión del gen exógeno en la planta puede controlarse en un momento particular en el tiempo. Asimismo, pueden usarse promotores tales como, por ejemplo, el promotor de PRP1 (Ward 1993), un promotor inducible por ácido salicílico (documento WO 95/19443), un promotor inducible por bencenosulfonamida (documento EP 0 388 186), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz 1991, 1992), un promotor inducible por ácido

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abscísico (documento EP 0 335 528) o un promotor inducible por etanol-ciclohexanona (documento WO 93/21334). También es adecuado un promotor del gen de la isoforma II de glutatión-S transferasa (GST-II-27) que puede activarse por protectores exógenamente aplicados tales como, por ejemplo, N,N-dialil-2,2-dicloroacetamida (documento WO 93/01294) y que es operable en un gran número de tejidos de tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Adicionalmente, promotores inducibles a modo de ejemplo que pueden utilizarse en la presente invención incluyen aquellos del sistema de ACE1 que responde a cobre (Mett 1993); o el promotor In2 de maíz que responde a protectores de herbicidas de bencenosulfonamida (Hershey 1991; Gatz 1994). Puede utilizarse un promotor que responde a un agente inductor al que las plantas normalmente no responden. Un promotor inducible a modo de ejemplo es un promotor inducible por un gen de hormona esteroidea, cuya actividad transcripcional se induce por una hormona glucocorticosteroidea (Schena 1991). Otros promotores preferidos son promotores inducidos por estrés biótico o abiótico, tales como, por ejemplo, el promotor inducible por patógenos del gen PRP1 (Ward 1993), el promotor hsp80 inducible por calor del tomate (documento US 5.187.267), el promotor de alfaamilasa inducible por el frío de patata (documento WO 96/12814) o el promotor pinII inducido por herida (documento EP-A1 0 375 091).

Los promotores también pueden englobar otros promotores, elementos promotores o promotores mínimos que pueden modificar las características específicas de la expresión. Así, por ejemplo, la expresión específica de tejido puede tener lugar además, en función de ciertos factores de estrés, debido a secuencias de control genético. Tales elementos se describen, por ejemplo, para estrés por agua, ácido abscísico (Lam 1991) y estrés por calor (Schoffl 1989).

El término “enlace operable” u “operativamente ligado” debe entenderse como que significa, por ejemplo, la disposición secuencial de un elemento regulador (por ejemplo, un promotor) con una secuencia de ácidos nucleicos que va a expresarse y, si es apropiado, elementos reguladores adicionales (tal como, por ejemplo, un terminador) de tal forma que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir su función prevista para permitir, modificar, facilitar o influir de otro modo en la expresión de dichas secuencias de ácidos nucleicos. La expresión puede producirse, dependiendo de la disposición de las secuencias de ácidos nucleicos, en relación con el ARN sentido o antisentido. Para este fin, no se requiere necesariamente el enlace directo en el sentido químico. Las secuencias de control genético tales como, por ejemplo, secuencias potenciadoras, también pueden ejercer su función sobre la secuencia diana de posiciones que están más alejadas, o de hecho de otras moléculas de ADN. Disposiciones preferidas son aquellas en las que la secuencia de ácidos nucleicos que va a expresarse recombinantemente está posicionada más allá de la secuencia que actúa de promotor, de manera que las dos secuencias estén asociadas covalentemente entre sí. La distancia entre la secuencia promotora y la secuencia de ácidos nucleicos que va a expresarse recombinantemente es preferentemente inferior a 200 pares de bases, especialmente preferentemente inferior a 100 pares de bases, muy especialmente preferentemente inferior a 50 pares de bases. Pueden generarse enlace operable, y una construcción de expresión, por medio de técnicas de recombinación y clonación usuales como se ha descrito (por ejemplo, en Maniatis 1989; Silhavy 1984; Ausubel 1987; Gelvin 1990). Sin embargo, secuencias adicionales que, por ejemplo, actúan de conector con sitios de escisión específicos para enzimas de restricción, o como péptido señal, también pueden posicionarse entre las dos secuencias. La inserción de secuencias también puede conducir a la expresión de proteínas de fusión. Preferentemente, la construcción de expresión, que consiste en un enlace de promotor y secuencia de ácidos nucleicos que va a expresarse, puede existir en una forma integrada en vector e insertarse en un genoma de planta, por ejemplo, por transformación.

El término “transformación”, como se usa en el presente documento, se refiere a la introducción de material genético (por ejemplo, un transgén) en una célula. La transformación de una célula puede ser estable o transitoria. El término “transformación transitoria” o “transitoriamente transformado” se refiere a la introducción de uno o más transgenes en una célula en ausencia de integración del transgén en el genoma de la célula huésped. La transformación transitoria puede detectarse por, por ejemplo, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) que detecta la presencia de un polipéptido codificado por uno o más de los transgenes. Alternativamente, la transformación transitoria puede detectarse detectando la actividad de la proteína (por ejemplo, β-glucuronidasa) codificada por el transgén (por ejemplo, el gen uid A) como se demuestra en el presente documento [por ejemplo, ensayo histoquímico de la actividad enzimática de GUS por tinción con X-gluc que da un precipitado azul en presencia de la enzima GUS; y un ensayo quimioluminiscente de la actividad enzimática de GUS usando el kit GUS-Light (Tropix)]. El término “transformante transitorio” se refiere a una célula que ha incorporado transitoriamente uno o más transgenes. A diferencia, el término “transformación estable” o “establemente transformado” se refiere a la introducción e integración de uno o más transgenes en el genoma de una célula, preferentemente produciendo integración cromosómica y heredabilidad estable mediante meiosis. La transformación estable de una célula puede detectarse por hibridación por transferencia Southern de ADN genómico de la célula con secuencias de ácidos nucleicos que pueden unirse a uno o más de los transgenes. Alternativamente, la transformación estable de una célula puede también detectarse por la reacción en cadena de la polimerasa de ADN genómico de la célula para amplificar secuencias de transgenes. El término “transformante estable” se refiere a una célula que ha integrado establemente uno o más transgenes en el ADN genómico. Así, un transformante estable se distingue de un transformante transitorio en que, mientras que el ADN genómico del transformante estable contiene uno o más transgenes, el ADN genómico del transformante transitorio no contiene un transgén. La transformación también incluye la introducción de material genético en células vegetales en forma de vectores virales de planta que implican replicación epicromosómica y expresión génica que puede presentar propiedades variables con respecto a la estabilidad

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amplificado al azar); tomado de Llob 2003; Figura 2) y 1B (basado en secuenciación de ARNr 16S). Tabla 1: Cepas de Agrobacterium (de Llob 2003: Tabla 1)

Referencia de cepa

Origen Biovariedad Tipo de opina Huésped

A281 (=C58 con plásmido pTiBo542)

1 Agropina

Ach5

EE.UU. 1 Octopina Prunus sp.

ATCC 15834

EE.UU. A. rizhogenes ND No conocido

B6

EE.UU. 1 ND No conocido

CFBP 42

Francia 1 ND Tomate

CFBP 1903 (C58)

EE.UU. 1 Nopalina Prunus cerasus

IVIA 014

Zaragoza, España 2 Nopalina Melocotón

IVIA 66R

Sevilla, España 2 ND Rosa

IVIA 251-1

Badajoz, España 1 Nopalina Almendra

IVIA 251-21

Badajoz, España 2 Nopalina Cereza

IVIA 25 1-22

Badajoz, España 1 Nopalina Cereza

IVIA 254-1

Valencia, España ND Desconocido Melocotón

IVIA 254-2

Valencia, España 2 Nopalina Melocotón

IVIA 260-67

Badajoz, España 2 Nopalina Álamo

IVIA 282-64

Tenerife, España 2 Nopalina Rosa

IVIA 325-4

Tarragona, España 1 Nopalina Melocotón x almendra

IVIA 325-7

Tarragona, España 2 Nopalina Melocotón x almendra

IVIA 339-26

Orense, España 3 ND Uva de vino

IVIA 347-4

Valencia, España I Nopalina Melocotón

IVIA 354-35

Valencia, España 2 Nopalina Almendra

IVIA 360-54

Navarra, España 1 ND Uva de vino

IVIA 388-30

Zaragoza, España 2 Nopalina Almendra

IVIA 436-46

Zaragoza, España 1 Nopalina/manopina Melocotón x almendra

IVIA 545-45

Castellón, España 2 Nopalina Membrillo

IVIA 576-80

Cuenca, España 1 Nopalina Mimbre

IVIA 678-2

Valencia, España 1 ND Melocotón x almendra

IVIA 796-6

Valencia, España 2 ND Melocotón x almendra

IVIA 1,102

Valencia, España 1 Crisopina Crisantemo

IVIA 1853-2

Zaragoza, España 2 ND Melocotón

172-17T**

Orense, España I Octopina Uva de vino

225-226P

Orense, España 1 Octopina Uva de vino

194-459Y

Orense, España 3 Octopina Uva de vino

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Referencia de cepa

Origen Biovariedad Tipo de opina Huésped

K84

Australia A. radiobacter Nopalina/octopina Tierra

NCIB 8196

Desconocido A. rhizogenes ND No conocido

NCPPB 1649

Sudáfrica 2 ND Rosa

NCPPB 2437

EE.UU. 1 ND No conocido

NCPPB 2659 (K599)

RU A. rhizogenes Cucumopina Pepino

NCPPB 3554

Australia 3 ND Uva de vino

ATCC: American Type Culture Collection, EE.UU.; CFRP: Collection Francaise des Bacteries Phytopatogenes, Francia; IVIA: Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, España; NCIB: National Collection of Industrial Bacteria, RU: NCPPB: National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, RU; ND: No determinado.

El término plásmido Ti, como se usa en el presente documento, es con referencia a un plásmido que es replicable en Agrobacterium y está en su forma “armada” natural que media en agallas de la corona en plantas infectadas con Agrobacterium. La infección de una célula de planta con una forma “armada” natural de un plásmido Ti de Agrobacterium produce generalmente la producción de opinas (por ejemplo, nopalina, agropina, octopina, etc.) por la célula infectada. Así, las cepas de Agrobacterium que producen la producción de nopalina (por ejemplo, cepa LBA4301, C58, A208) se denominan Agrobacteria “tipo nopalina”; cepas de Agrobacterium que producen la producción de octopina (por ejemplo, cepa LBA4404, Ach5, B6) se denominan Agrobacteria “tipo octopina”; y cepas de Agrobacterium que producen la producción de agropina (por ejemplo, cepa EHA105, EHA101, A281) se denominan Agrobacteria “tipo agropina”. Un plásmido Ti desarmado se entiende como un plásmido Ti que carece de su agalla de la corona que media en las propiedades, pero que de otro modo proporciona las funciones para la infección de la planta. Preferentemente, la región de ADN-T de dicho plásmido “desarmado” se modificó de una forma que, además de las secuencias de límite, las secuencias de Ti internas no funcionales pudieran transferirse al genoma de la planta. En una realización preferida, cuando se usa con un sistema de vector binario, la región de ADN-T entera (que incluye el límite de ADN-T) está delecionada.

El término plásmido Ri, como se usa en el presente documento, es con referencia a un plásmido, que es replicable en Agrobacterium y está en su forma “armada” natural que media en la enfermedad de las raíces pilosas de las plantas infectadas por Agrobacterium. La infección de una célula de planta con una forma “armada” natural de un plásmido Ri de Agrobacterium generalmente produce la producción de opinas (derivados de aminoazúcares específicos producidos en células vegetales transformadas tales como, por ejemplo, agropina, cucumopina, octopina, mikimopina, etc.) por la célula infectada. Las cepas de Agrobacterium rhizogenes se distinguen tradicionalmente en subclases de la misma forma que las cepas de A. tumefaciens. Las cepas más comunes son cepas de tipo agropina (por ejemplo, caracterizadas por el plásmido Ri pRi-A4), cepas de tipo manopina (por ejemplo, caracterizadas por el plásmido Ri pRi8196) y cepas de tipo cucumopina (por ejemplo, caracterizadas por el plásmido Ri pRi2659). Algunas otras cepas son del tipo mikimopina (por ejemplo, caracterizadas por el plásmido Ri pRi1724). La mikimopina y la cucumopina son estereoisómeros, pero no se encontró homología entre los plásmidos pRi al nivel de nucleótido (Suzuki 2001). Un plásmido Ri desarmado se entiende como un plásmido Ri que carece de sus propiedades que median en la enfermedad de las raíces pilosas, pero que de otro modo proporcionan las funciones para la infección de la planta. Preferentemente, la región de ADN-T de dicho plásmido Ri “desarmado” se modificó de una forma que, además de las secuencias de límite, las secuencias Ri internas no funcionales pudieran transferirse al genoma de la planta. En una realización preferida, cuando se usa con un sistema de vector binario, la región de ADN-T entera (que incluyen los límites de ADN-T) está delecionada.

Aunque los plásmidos Ti y Ri varían considerablemente entre cepas, todos llevan genes vir similares.

El término “secuencia intergénica de ARNr 16S-23S”, como se usa en el presente documento, pretende significar la región de ADN genómico localizada entre las secuencias que codifican el ARNr 16S y el ARNr 23S. Dicha secuencia intergénica puede solaparse con las secuencias que codifican el ARNr 16S y el ARNr 23S.

Descripción detallada de la invención

La presente invención usa variantes de cepas “desarmadas” de la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB 2659) para la administración de ADN-T en células de plantas. En el presente documento más delante no se emplea la clasificación previa de la cepa K599 como una cepa de “A. rhizogenes”, debido a que además del fenotipo inductor de raíces pilosas (que es un resultado del plásmido Ri, pero no del genoma bacteriano), la cepa parece estar solo remotamente relacionada con otras cepas de A. rhizogenes basadas en un análisis de comparación de secuencias de ADNr ribosómico. Así, se considera que la cepa es un espécimen único que tampoco es inequívocamente un tipo

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de cepa de A. tumefaciens o de A. rhizogenes.

Una primera realización de la invención se refiere a un procedimiento para producir una célula de planta transgénica que comprende las etapas de:

a) proporcionar bacterias de una variante de cepa no patógena transgénica de la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB 2659) o de un derivado de dicha cepa, en el que dicha variante de cepa es capaz de infectar células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y en el que dicha variante de cepa comprende además un ADN-T transgénico, y

b) co-cultivar una célula de planta con dichas bacterias, y

c) aislar o seleccionar células vegetales que comprenden establemente integrado en su genoma dicho ADN-T transgénico.

Otra realización de la invención se refiere a un procedimiento para producir una planta transgénica que comprende las etapas de:

a) proporcionar bacterias de una variante de cepa no patógena transgénica de la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB 2659) o de un derivado de dicha cepa, en el que dicha variante de cepa es capaz de infectar células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y en el que dicha variante de cepa comprende además un ADN-T transgénico, y

b) co-cultivar una planta, célula de planta o tejido de planta con dichas bacterias, y

c) aislar o seleccionar y -opcionalmente -regenerar plantas que comprenden establemente integrado en su genoma dicho ADN-T transgénico.

El procedimiento de la invención tiene una o más de las siguientes ventajas con respecto al estado de la técnica:

a) Es muy eficaz para la transformación de especies de plantas resistentes a la transformación mediada por las cepas de Agrobacterium tumefaciens conocidas en la técnica, especialmente sojas y árboles como álamo y castaño. Sorprendentemente, el derivado desarmado de Agrobacterium rhizogenes K599 (pRi2659A y pRi2659Δtet, respectivamente) proporcionado en el presente documento demuestra una alta tasa de infección para soja y proporciona una mejora con respecto a cepas convencionales de Agrobacterium para la transformación de plantas. b) Debido a sus vigorosas propiedades infecciosas, puede emplearse en una concentración mucho menor que Agrobacterium tumefaciens. Esto permite elegir como diana tejidos que son muy sensibles al co-cultivo de Agrobacterium tumefaciens normal (tales como, por ejemplo, cigotos o embriones inmaduros de plantas como trigo). c) Adicionalmente, el límite de ADN-T del plásmido pRi2659 se usa para crear un nuevo vector binario. Estas secuencias de límite ofrecen una ventaja con respecto a la secuencia de límite convencionalmente usada, especialmente en combinación con la variante de cepa desarmada K599 de Agrobacterium rhizogenes (pRi2659Δ). d) Finalmente, el procedimiento de la invención es compatible con otros sistemas de transformación de plantas basados en Agrobacterium.

Los procedimientos de la invención pueden usarse para transformar prácticamente todo tipo de plantas. Plantas preferidas se han enumerado anteriormente en la sección DEFINICIÓN GENERAL. Se prefieren célula de planta, tejido de planta o planta derivada de una planta seleccionada del grupo de plantas monocotiledóneas, plantas dicotiledóneas y plantas gimnospermas. Más preferentemente, la planta es de un género seleccionado del grupo que consiste en Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, Solanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triticale, Secale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthus y Nicotiana.

En una realización preferida de la invención, el ADN-T transgénico comprende al menos un casete de expresión para conferir a dicha planta un rasgo agronómicamente valioso o al menos un gen marcador, que permite la selección y/o identificación de plantas, células vegetales o tejidos transformados. Genes marcadores preferidos se describen en el presente documento más adelante.

1. La cepa K599 de Agrobacterium “desarmada” (NCPPB2659)

Otra realización de la invención está relacionada con una variante de cepa no patógena de la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB 2659) o de un derivado de dicha cepa (denominada en lo sucesivo variante de cepa “desarmada”), en el que dicha variante de cepa es capaz de infectar células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas.

El término “derivado”, cuando se refiere a la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB2659), pretende significar una bacteria patógena de las plantas transmitida por la tierra, caracterizada por una secuencia intergénica de ARNr 16S

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2. El plásmido pRi2659 “desarmado”

La secuencia aislada de la versión desarmada del plásmido pRI2659 se proporciona en el presente documento. Esta secuencia y la información de secuencia es útil en su totalidad, pero también en parte. El plásmido está expresando numerosas proteínas (véase la Tabla 4), de las cuales varias son novedosas con respecto a la materia y lo más probable es que participen en el superior rendimiento de transformación del plásmido pRI2659. La secuencia e información de secuencias también permiten diversos usos que incluyen, pero no se limitan a

a) elevado entendimiento del superior rendimiento del plásmido, b) utilización de características aisladas (por ejemplo, proteínas) del plásmido para potenciar el rendimiento de otros procedimientos de transformación de plantas (por ejemplo, basados en transformaciones estándar basadas en Agrobacterium tumefaciens), y c) cambios dirigidos y optimización de dicho plásmido.

Así, una realización preferida de la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada seleccionada del grupo de secuencias descrito por

a) secuencias que comprenden una secuencia descrita por SEC ID Nº: 24, o una secuencia de al menos 100 nucleótidos consecutivos (preferentemente al menos 250 ó 500 nucleótidos consecutivos, más preferentemente al menos 1000 ó 2500 nucleótidos consecutivos, incluso más preferentemente al menos 5000 ó 10000 nucleótidos consecutivos, lo más preferentemente todos los nucleótidos consecutivos) de la secuencia descrita por SEC ID Nº: 24, y b) secuencias que tienen una identidad de secuencias de al menos el 90 % (preferentemente al menos el 92 % o el 95 %, más preferentemente al menos 97% o el 98 %, lo más preferentemente al menos el 99 %) con una secuencia como se describe por SEC ID Nº: 24 o una secuencia de al menos 1000 nucleótidos consecutivos (preferentemente al menos 2000 ó 4000 nucleótidos consecutivos, más preferentemente al menos 5000 ó 10000 nucleótidos consecutivos, incluso más preferentemente al menos 20000 ó 50000 nucleótidos consecutivos, lo más preferentemente todos los nucleótidos consecutivos) de la secuencia descrita por SEC ID Nº: 24, y, c) secuencias que se hibridan en condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 68 ºC en una disolución que consiste en 5x SSPE, 1 % de SDS, 5x reactivo de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado en una disolución que comprende 0,1x SSPE y 0,1 % de SDS a 68 ºC con una sonda que consiste en al menos 100 nucleótidos consecutivos (preferentemente al menos 250 ó 500 nucleótidos consecutivos, más preferentemente al menos 1000 ó 2500 nucleótidos consecutivos, incluso más preferentemente al menos 5000 ó 10000 nucleótidos consecutivos, lo más preferentemente todos los nucleótidos consecutivos) de una secuencia como se describe por SEC ID Nº: 24 o la secuencia complementaria a la misma.

Otra realización de la invención está relacionada con una variante de plásmido (“desarmado”) no patógeno de pRi2659 (el plásmido Ri natural en la cepa K599 de Agrobacterium; NCPPB 2659) o un derivado del mismo, proporcionando dicha variante de plásmido las funciones requeridas para la infección y transformación de la célula de planta, pero que carece de secuencias que provocan el fenotipo de raíces pilosas (denominada en lo sucesivo variante de plásmido “desarmado”). Preferentemente, dicha variante de plásmido no patógeno comprende las secuencias requeridas para la infección y transformación de la célula de planta del pRi2659 patógeno nativo o su derivado, pero carece de secuencias del ADN-T que media en el fenotipo de raíces pilosas.

Preferentemente, la variante de plásmido no patógeno de pRi2659 o de su derivado no comprende elementos (tales como, por ejemplo, elementos de ADN-T) que puedan transferirse al genoma de la planta. Esto es especialmente ventajoso cuando se combinan con un ADN-T transgénico que comprende un vector binario. Hay diversos medios para proporcionar una variante de plásmido “desarmado” tal. A modo de ejemplo, esto puede realizarse:

1.

Haciendo disfuncionales los límites del ADN-T (por ejemplo, por mutagénesis) o

2.

Delecionando el ADN-T entero del plásmido Ri, o

3.

Cribando para deleción natural o mutante no patógeno, o

4.

Mutagénesis de deleción (por ejemplo, empleando acetosiringona) induciendo mellas de ADN y escisión del ADN-T, o

5.

Mutagénesis de transposones y cribado de mutantes no patógenos o

6.

Deleción dirigida y específica de genes relevantes usando, por ejemplo, estrategia de sustitución génica. Reemplazando las copias no mutantes de genes entre el LD y el LI con una sustitución delecionada, pueden escindirse exactamente solo los genes que necesitan ser delecionados.

En una realización especialmente preferida de la invención, dicha variante de plásmido no patógeno comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo de secuencias descrito por

a) secuencias que comprenden una secuencia descrita por SEC ID Nº: 24, o una secuencia de al menos 100 nucleótidos consecutivos (preferentemente al menos 250 ó 500 nucleótidos consecutivos, más preferentemente al menos 1000 ó 2500 nucleótidos consecutivos, incluso más preferentemente al menos 5000 ó 10000 nucleótidos consecutivos, lo más preferentemente todos los nucleótidos consecutivos) de la secuencia descrita por SEC ID Nº: 24, y

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aproximadamente la base 15.519 de SEC ID Nº: 4 o de aproximadamente la base 3644 a aproximadamente la base 18577 de SEC ID Nº: 26.

Preferentemente, el ADN-T entero se deleciona del plásmido Ri (más preferentemente que incluye el límite derecho e izquierdo entero). Se prefiere la deleción del ADN-T entero que incluye el LD y el LI enteros del plásmido Ri (por ejemplo, pRi2659), ya que en los casos anteriores de plásmidos Ti desarmados en los que una porción de cualquier límite se dejó interaccionar sobre el plásmido Ti hubo la posibilidad de integración de ADN más allá de este límite y a partir del plásmido binario. El procedimiento empleado en la realización preferida de la presente invención elimina la posibilidad de integración de ADN externo. Por consiguiente, una realización preferida de la invención se refiere a una variante de plásmido no patógeno de pRi2659 o un derivado de la misma, en el que dicha variante de plásmido comprende las secuencias requeridas para la infección y transformación de la célula de planta del pRi2659 patógeno nativo o su derivado, pero carece del ADN-T, preferentemente la región descrita por la secuencia de aproximadamente la base 538 a aproximadamente la base 15.519 de la secuencia caracterizada por el nº de acceso de GenBank AJ271050 (SEC ID Nº: 4) o de aproximadamente la base 3644 a aproximadamente la base 18577 de la secuencia caracterizada por SEC ID Nº: 26. Esta secuencia se corresponde con el ADN-T del plásmido Ri pRi2659 patógeno original como se proporciona en la cepa K599 de Agrobacterium patógena (NCPPB 2659). Más preferentemente, dicha variante de plásmido no patógeno es una secuencia que se hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad (por ejemplo, equivalentes a la unión o hibridación a 68 ºC en una disolución que consiste en 5x SSPE, 1 % de SDS, 5x reactivo de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado en una disolución que comprende 0,1x SSPE y 0,1 % de SDS a 68 ºC) con el plásmido Ri pRi2659 patógeno (nativo) original como se proporciona en la cepa K599 de Agrobacterium patógena (NCPPB 2659), pero que no se hibrida bajo dicho condiciones de alta rigurosidad con la secuencia de aproximadamente la base 538 a aproximadamente la base 15.519 de la secuencia caracterizada por el nº de acceso de GenBank AJ271050 (SEC ID Nº: 4) o de aproximadamente la base 3644 a aproximadamente la base 18577 de la secuencia caracterizada por SEC ID Nº: 26.

Más preferentemente, el derivado de pRi2659 es un plásmido capaz de mediar en la transferencia de ADN-T de una bacteria transmitida por la tierra en una célula de planta caracterizado adicionalmente por

a) tener una identidad de secuencias de al menos el 90 % (preferentemente al menos el 91 % o el 92 %, más preferentemente al menos el 95 % o el 98 %, lo más preferentemente al menos el 99 %) con el ADN que codifica el plásmido pRi2659 nativo (como está comprendido en la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB2659) o b) hibridarse bajo condiciones de alta rigurosidad (por ejemplo, equivalentes a la unión o hibridación a 68 ºC en una disolución que consiste en 5x SSPE, 1 % de SDS, 5x reactivo de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado en una disolución que comprende 0,1x SSPE y 0,1 % de SDS a 68 ºC) con el plásmido pRi2659 nativo (como se describe por SEC ID Nº: 111).

En una realización preferida, la variante de plásmido no patógeno de la invención se hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad con el plásmido Ri pRi2659 patógeno nativo entero de la cepa K599 de Agrobacterium patógena (NCPPB 2659), pero no se hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad con la secuencia de aproximadamente la base 538 a aproximadamente la base 15.519 de la secuencia caracterizada por SEC ID Nº: 4 o de aproximadamente la base 3644 a aproximadamente la base 18577 de la secuencia caracterizada por SEC ID Nº: 26.

El término “derivado”, cuando se refiere a pRi2659, pretende significar un plásmido capaz de mediar en la transferencia de ADN-T de una bacteria transmitida por la tierra en una célula de planta caracterizado adicionalmente por

a) tener una identidad de secuencias de al menos el 90 %, más preferentemente al menos el 95 %, lo más preferentemente al menos el 98 %, con el ADN que codifica el plásmido pRi2659 nativo (como está comprendido en la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB2659) o b) hibridarse bajo condiciones de alta rigurosidad (como se ha definido anteriormente) con el plásmido pRi2659 nativo.

Más preferentemente, tal derivado de pRi2659 en su forma patógena natural está mediando en el fenotipo de tipo cucumopina de la síntesis de opinas.

3. El ADN-T transgénico

Preferentemente, el ADN-T en dicha variante de cepa no patógena transgénica de la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB 2659) o su derivado está comprendido en un plásmido de vector binario separado del plásmido proporcionar las características requeridas para la infección de la planta (tal como un plásmido Ti o Ri que carece de sus propiedades neoplásicas o inductoras de raíces pilosas). Así, otra realización de la invención se refiere a un ADN-T transgénico flanqueado por al menos un límite de ADN-T del plásmido pRi2659 de Agrobacterium rhizogenes, no comprendiendo dicho ADN-T transgénico secuencias que provoquen un fenotipo de raíces pilosas.

Preferentemente, el ADN-T está flanqueado por al menos la secuencia de límite derecho (más preferentemente por la secuencia de límite derecho e izquierdo). Se prefieren límites Ti y/o Ri. El límite de ADN-T son repeticiones de aproximadamente 25 pb, bien definidas como se describe en la materia (Zupan 2000). Por la acción combinada de los llamados genes vir (parte de los plásmidos Ti o Ri originales), los límites median en la transferencia de ADN-T.

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En una realización preferida, dicho ADN-T transgénico comprende al menos un casete de expresión para conferir a dicha planta un rasgo agronómicamente valioso. En otra realización preferida, dicho ADN-T comprende además al menos un gen marcador, que permite la selección y/o identificación de plantas, células vegetales o tejidos transformados.

Se ha demostrado que los límites de ADN-T del plásmido pRI2659 son especialmente eficaces en la transferencia de ADN-T y así en generar plantas transgénicas (especialmente plantas de soja transgénicas). Así, preferentemente, el ADN-T comprende los límites de ADN-T del plásmido pRi2659 (por ejemplo, incorporados en un vector binario). El límite derecho tiene 16 repeticiones de una secuencia de 8 pb que es funcionalmente equivalente a una multiplicación (Hansen 1992). Estas secuencias de límite ofrecen una ventaja con respecto a la secuencia de límite convencionalmente usada. Especialmente se prefiere una combinación de la variante de cepa desarmada o derivado de la cepa K599 de Agrobacterium (BCPPB2659) con un ADN-T transgénico que comprende los límites de un plásmido Ri, más preferentemente el plásmido pRi2659, combinación que contribuye a una alta eficiencia de transformación, por ejemplo, para soja. Especialmente se prefieren las secuencias de límite derecho que comprenden una secuencia descrita por SEC ID Nº: 18 que representa la base 538 a 561 de SEC ID Nº: 4 (región de ADN-T de pRi2659):

5'-tggcaggata tattgtggtg taaa-3' (SEC ID Nº: 18)

Especialmente se prefieren las secuencias de límite derecho que comprenden una secuencia descrita por SEC ID Nº: 19 que representa la base 15.496 a 15.519 de SEC ID Nº: 4 (región de ADN-T de pRi2659):

5'-tgacaggata tatccccttg tcta-3' (SEC ID Nº: 19)

Así, otra realización de la invención se refiere a un vector plasmídico que comprende un ADN-T transgénico flanqueado por al menos un límite de ADN-T del plásmido pRi2659 de Agrobacterium rhizogenes. Preferentemente, estos límites se describen por SEC ID Nº: 18 ó 19. Más preferentemente, el plásmido comprende el límite derecho que comprende una secuencia como se describe por SEC ID Nº: 19. Lo más preferentemente, el plásmido comprende ambas secuencias de límite, que comprenden una secuencia como se describe por SEC ID Nº: 18 y 19, respectivamente. Preferentemente, dicho plásmido no comprende secuencias que provoquen un fenotipo de raíces pilosas, más preferentemente dicho plásmido no comprende secuencias codificantes de proteínas de ADN-T internas, lo más preferentemente dicho plásmido no comprende secuencias de ADN-T sustancialmente internas. El término “interno” en este contexto significa el ADN flanqueado por (pero que excluye los límites del ADN-T). Los límites del ADN-T se entienden como las secuencias que comprenden al menos las secuencias como se describen por SEC ID Nº: 18 y 19, respectivamente. El término “sustancialmente” pretende significar que pueden incluirse algunas secuencias internas que no están ligadas a un fenotipo patógeno, preferentemente estas secuencias no tienen más de 200 pares de bases, preferentemente no más de 100 pares de bases, lo más preferentemente no más de 50 pares de bases, y son preferentemente directamente consecutivas a las secuencias de límite.

El ADN-T que va a incorporarse en el genoma de la planta por medio de la variante de cepa no patógena puede proporcionarse en diversas formas. El ADN-T puede proporcionarse como una construcción de ADN, preferentemente integrada en plásmidos específicos, tanto en un vector lanzadera, o intermedio, como en un vector binario. Puede producirse suministro, por ejemplo (pero no se limita a) por los siguientes medios:

a) El ADN-T puede incorporarse en el ADN cromosómico de la variante de cepa no patógena. b) El ADN-T puede incorporarse en el ADN de plásmido Ri desarmado comprendido en la variante de cepa no patógena. c) El ADN-T puede estar comprendido en la variante de cepa no patógena en forma de plásmido separado del plásmido Ri desarmado.

Preferentemente, el ADN-T en dicha variante de cepa no patógena está comprendido en un plásmido de vector binario separado del plásmido Ri desarmado.

En otra realización preferida, dicho ADN-T comprende además al menos un gen marcador, que permite la selección y/o identificación de plantas, células vegetales o tejidos transformados.

Otras realizaciones de la invención se refieren a células u organismos no humanos que comprenden una secuencia de nucleótidos, una variante de plásmido no patógeno o un ADN-T transgénico de la invención. Preferentemente, dichas células u organismos no humanos están seleccionados del grupo que consiste en bacterias, levaduras, plantas, mamíferos e insectos. En una realización preferida, dicha célula u organismo es una bacteria transmitida por la tierra del género Rhizobiaceae. En otra realización preferida, dicha célula u organismo es célula de planta u organismo de planta, más preferentemente seleccionada del grupo de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Las más preferidas son plantas seleccionadas del grupo que consiste en soja, grano (maíz), trigo, semilla de colza (canola), tagetes, patata, arroz, cebada y tomate.

Otra realización de la presente invención se refiere a un vector transgénico que comprende un ADN-T transgénico de la invención. Preferentemente, el ADN-T se proporciona en forma de un vector binario. En los llamados “sistemas de vector binario”, el ADN-T está físicamente separado de los otros elementos funcionales del plásmido Ri (por

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ejemplo, los genes vir), incorporándose en un vector lanzadera, que permitió manipulación más fácil (para la descripción de sistemas binarios basados en plásmidos Ti véanse los documentos EP-A 120 516; US 4.940.838). Estos vectores binarios comprenden (además del ADN-T desarmado con sus secuencias de límite), secuencias procariotas para la replicación tanto en Agrobacterium como E. coli. En el presente caso, la cepa de Agrobacterium rhizogenes desarmada empleada para la transformación comprende, además de su plásmido Ri desarmado, una de las células de Agrobacterium transformadas (generalmente fuera del ADN-T), un marcador para la selección de células vegetales transformadas y la secuencia de ácidos nucleicos de interés que va a transferirse (las posteriormente dos generalmente comprendidas dentro del ADN-T). El plásmido binario puede transferirse a la cepa de Agrobacterium rhizogenes desarmada, por ejemplo, por electroporación u otros procedimientos de transformación (Mozo 1991). Los vectores binarios son capaces de replicación tanto en E. coli como en Agrobacterium. Pueden transformarse directamente en Agrobacteria (por ejemplo, como se describe en Holsters 1978). Agrobacterium, que actúa de organismo huésped en este caso, debe ya contener un plásmido con la región vir. La última se requiere para transferir el ADN-T a la célula de planta. Un Agrobacterium así transformado puede usarse para transformar células vegetales. Un marcador de selección que permite la selección de Agrobacteria transformadas es, por ejemplo, el gen nptI o nptII que confiere resistencia contra kanamicina, o el gen aadA que confiere resistencia contra estreptomicina, espectinomicina. Diversos marcadores (genes marcadores de selección e indicadores) son adecuados para la identificación y/o selección de células vegetales, tejidos o plantas transformadas (véase más adelante para detalles). Se conocen en la técnica descripciones de sistemas de vector de Agrobacterium y procedimientos para la transformación mediada por Agrobacterium (Miki 1993; Gruber 1993; Moloney 1989). Se conocen diversos vectores binarios, algunos de los cuales están comercialmente disponibles tales como, por ejemplo, pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. EE.UU.). Todos los vectores adecuados para la transformación basados en Agrobacterium tumefaciens pueden también emplearse para el procedimiento de la invención. Vectores binarios comunes se basan en plásmidos de “amplia variedad de huéspedes” como pRK252 (Bevan 1984) o pTJS75 (Watson 1985) derivados del plásmido RK2 tipo P. La mayoría de estos vectores se derivan de pBIN19 (Bevan 1984). Se conocen diversos vectores binarios, algunos de los cuales están comercialmente disponibles tales como, por ejemplo, pBI101.2 o pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. EE.UU.). Se mejoraron vectores adicionales con respecto al tamaño y manipulación (por ejemplo, pPZP; Hajdukiewicz 1994). Sistemas de vector mejorados se describen también en el documento WO 02/00900. Un vector binario o cualquier otro vector puede modificarse por técnicas de recombinación de ADN comunes, multiplicarse en E. coli e introducirse en Agrobacterium por, por ejemplo, electroporación u otras técnicas de transformación (Mozo 1991).

Así, otra realización de la invención se refirió a una célula u organismo no humano que comprende una variante de plásmido no patógeno de la invención (como se ha especificado anteriormente) o un ADN-T transgénico o vector que comprende dicho ADN-T de la invención. Preferentemente, dicha célula u organismo no humano está seleccionado del grupo que consiste en bacterias, levaduras, plantas, mamíferos e insectos. Más preferentemente, dicha célula u organismo no humano es una bacteria transmitida por la tierra del género Rhizobiaceae. Especialmente se prefieren bacterias transmitidas por la tierra tales como Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium medicae, Sinorhizobium fredii, Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium sp. BR816, Rhizobium sp. N33, Rhizobium sp. GRH2, Sinorhizobium saheli, Sinorhizobium terangae, Rhizobium leguminosarum biovar trifolii, Rhizobium leguminosarum biovar viciae, Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli, Rhizobium tropici, Rhizobium etli, Rhizobium galegae, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense, Rhizobium mongolense, Rhizobium lupini, Mesorhizobium loti, Mesorhizobium huakuii, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium mediterraneum, Mesorhizobium tianshanense, Bradyrhizobium elkanni, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium liaoningense, Azorhizobium caulinodans, Allobacterium undicola, Phyllobacterium myrsinacearum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium vitis y Agrobacterium rubi.

En una realización preferida de la invención, el ADN-T que va a integrarse en el genoma de la planta por medio de la cepa de Agrobacterium rhizogenes desarmada de la invención, que comprende al menos un casete de expresión para conferir a dicha planta un rasgo agronómicamente valioso. En otra realización preferida, dicho ADN-T comprende además al menos un gen marcador, que permite la selección y/o identificación de plantas, células vegetales o tejidos transformados. Así, el ADN-T insertado en el genoma de la planta diana comprende al menos un casete de expresión que puede, por ejemplo, facilitar la expresión del gen marcador de selección, genes de rasgo, ARN antisentido o ARN bicatenario. Preferentemente, dichos casetes de expresión comprenden una secuencia promotora funcional en células vegetales operativamente ligada a una secuencia de ácidos nucleicos que, tras la expresión, confiere un fenotipo ventajoso a la planta así transformada. El experto en la materia conoce numerosas secuencias que pueden utilizarse en este contexto, por ejemplo, para aumentar la calidad del alimento y pienso, para producir productos químicos, productos químicos finos o productos farmacéuticos (por ejemplo, vitaminas, aceites, hidratos de carbono; Dunwell 2000), conferir resistencia a herbicidas, o conferir esterilidad masculina. Además, puede potenciarse el crecimiento, rendimiento y resistencia contra factores de estés abiótico y biótico (como, por ejemplo, hongos, virus o insectos). Pueden conferirse propiedades ventajosas tanto expresando en exceso proteínas como disminuyendo la expresión de proteínas endógenas, por ejemplo, expresando un ARN antisentido (Sheehy 1988; documento US 4.801.340; Mol 1990) o bicatenario correspondiente (Matzke 2000; Fire 1998; Waterhouse 1998; documentos WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364).

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Para la expresión en plantas se prefieren promotores específicos de planta. El término “promotor específico de planta” se entiende que significa, en principio, cualquier promotor que puede gobernar la expresión de genes, en particular genes extraños, en plantas o partes de plantas, células vegetales, tejidos de plantas o cultivos de plantas. En este contexto, la expresión puede ser, por ejemplo, constitutiva, inducible o dependiente del desarrollo (como se define y especifica anteriormente).

El componente genético y/o el casete de expresión pueden comprender adicionalmente secuencias de control genético, además de un promotor. El término “secuencias de control genético” debe entenderse en el sentido más amplio y se refiere a todas aquellas secuencias que afectan la preparación o función de la construcción de ADN para la invención o un casete de expresión comprendido en ella. Por ejemplo, las secuencias de control genético modifican la transcripción y traducción en organismos procariotas o eucariotas. Preferentemente, los casetes de expresión según la invención engloban un promotor funcional en plantas en la dirección 5' de la secuencia de ácidos nucleicos en cuestión que va a expresarse recombinantemente, y en la dirección 3' una secuencia terminadora como secuencia de control genético adicional y, si es apropiado, elementos reguladores habituales adicionales, en cada caso asociados operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos que va a expresarse recombinantemente.

Las secuencias de control genético se describen, por ejemplo, en “Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)” o “Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, eds.: Glick y Thompson, Capítulo 7, 89-108” y las referencias citadas en su interior.

Ejemplos de tales secuencias de control son secuencias a las que se unen inductores o represores y así regulan la expresión del ácido nucleico. Las secuencias de control también engloban además la región sin traducir de 5', intrones o la región 3' no codificante de genes, tales como, por ejemplo, el intrón de actina-1, o los intrones de Adh1-S 1, 2 y 6 (referencia general: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Se ha demostrado que pueden desempeñar una función significativa en la regulación de la expresión génica. Así, se ha demostrado que las secuencias sin traducir de 5' pueden potenciar la expresión transitoria de genes heterólogos. Ejemplos de potenciadores de la traducción que pueden mencionarse son la secuencia conductora de 5' del virus del mosaico del tabaco (Gallie 1987) y similares. Además, pueden promover la especificidad por tejido (Rouster 1998). Además, pueden promover la especificidad por tejido (Rouster 1998). En cambio, la región sin traducir de 5' del gen opaque-2 suprime la expresión. La deleción de la región en cuestión conduce a una elevada actividad génica (Lohmer 1993). Las secuencias de control genético también pueden englobar secuencias de unión al ribosoma para iniciar la traducción. Esto se prefiere en particular cuando la secuencia de ácidos nucleicos que va a expresarse no proporcione secuencias adecuadas o cuando no sean compatibles con el sistema de expresión.

El casete de expresión puede comprender ventajosamente una o más secuencias potenciadoras, asociadas operativamente a un promotor, que hacen posible una elevada expresión recombinante de la secuencia de ácidos nucleicos. También pueden insertarse secuencias ventajosas adicionales, tales como elementos reguladores o terminadores adicionales, en el extremo 3' de las secuencias de ácidos nucleicos que van a expresarse recombinantemente. Señales de poliadenilación que son adecuadas como secuencias de control son señales de poliadenilación de planta, preferentemente aquellas que se corresponden esencialmente con señales de poliadenilación de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, en particular el terminador de octopina sintasa (OCS) y el terminador de nopalina sintasa (NOS).

Una o más copias de las secuencias de ácidos nucleicos que van a expresarse recombinantemente pueden estar presentes en la construcción de gen. Se entiende además que las secuencias de control genético significan secuencias que codifican proteínas de fusión que consisten en una secuencia de péptidos señal.

Las secuencias de control deben entenderse además como aquellas que permiten la eliminación de las secuencias insertadas del genoma. Procedimientos basados en el sistema cre/lox (Sauer B 1998; Odell 1990; Dale 1991), FLP/FRT (Lysnik 1993) o Ac/Ds (Wader 1987; documento US 5.225.341; Baker 1987; Lawson 1994) permiten una eliminación, específica de tejido y/o inducible si es apropiada, de una secuencia de ADN específica del genoma del organismo huésped. Secuencias de control pueden significar en este contexto las secuencias flanqueantes específicas (por ejemplo, secuencias lox), que después permiten la eliminación (por ejemplo, por medio de cre recombinasa).

El componente genético y/o casete de expresión de la invención puede comprender adicionalmente elementos funcionales. El término elemento funcional debe entenderse en sentido amplio y se refiere a todos aquellos elementos que tienen un efecto sobre la generación, amplificación o función del componente genético, casetes de expresión u organismos recombinantes según la invención. Los elementos funcionales pueden incluir, por ejemplo, (pero no deben limitarse a):

1. Genes marcadores de selección

Los genes marcadores de selección son útiles para seleccionar y separar satisfactoriamente células transformadas o recombinadas homólogas. Preferentemente, dentro del procedimiento de la invención, un marcador puede

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2) Genes indicadores

Los genes indicadores codifican fácilmente proteínas cuantificables y, mediante su color o actividad enzimática, hacen posible una evaluación de la eficacia de transformación, el sitio de expresión o el tiempo de expresión. Muy especialmente preferidos en este contexto son los genes que codifican proteínas indicadoras (Schenborn 1999) tales como la proteína verde fluorescente (GFP) (Sheen 1995; Haseloff 1997; Reichel 1996; Tian 1997; documento WO 97/41228; Chui 1996; Leffel 1997), cloranfenicol transferasa, una luciferasa (Ow 1986; Millar 1992), el gen aecuorina (Prasher 1985), β-galactosidasa, gen de locus R (que codifica una proteína que regula la producción de pigmentos de antocianina (coloración roja) en tejido de planta y así hace posible el análisis directo de una actividad de promotor sin la adición de sustancias auxiliares adicionales o sustratos cromogénicos (Dellaporta 1988; Ludwig 1990), siendo la β-glucuronidasa (GUS) muy especialmente preferida (Jefferson 1987a,b). La expresión de β-glucuronidasa (GUS) se detecta por un color azul tras la incubación del tejido con ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónico, la expresión de luciferasa bacteriana (LUX) se detecta por emisión de luz; la expresión de luciferasa de luciérnaga (LUC) se detecta por emisión de luz después de la incubación con luciferina; y la expresión de galactosidasa se detecta por un color azul brillante después de que el tejido se tiñera con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-Dgalactopiranósido. También pueden usarse genes indicadores como marcadores puntuables como alternativas a marcadores de resistencia a antibióticos. Tales marcadores se usan para detectar la presencia o para medir el nivel de expresión del gen transferido. El uso de marcadores puntuables en plantas para identificar o marcar células genéticamente modificadas funciona bien solo cuando la eficiencia de modificación de la célula es alta.

3) Orígenes de replicación, que garantizan la amplificación de los casetes de expresión o vectores según la invención en, por ejemplo, E. coli. Ejemplos que pueden mencionarse son ORI (origen de replicación de ADN), pBR322 ori o P15A ori (Maniatis 1989). Ejemplos adicionales de sistemas de replicación funcional en E. coli son ColE1, pSC101, pACYC184 o similares. Además de o en lugar del sistema de replicación en E. coli, puede emplearse un sistema de replicación de amplia variedad de huéspedes, tal como los sistemas de replicación de los plásmidos de incompatibilidad P-1; por ejemplo, pRK290. Estos plásmidos son particularmente eficaces con plásmidos Ti armados y desarmados para la transferencia de ADN-T al huésped de planta. 4) Elementos que son necesarios para la transformación mediada por Agrobacterium, tales como, por ejemplo, el límite derecho y/u, opcionalmente, el izquierdo del ADN-T o la región vir. 5) Sitios de clonación múltiple (MCS) para permitir y facilitar la inserción de una o más secuencias de ácidos nucleicos.

Normalmente, las construcciones que comprenden un ADN-T (o cualquier otra construcción de ADN empleada dentro del alcance de la presente invención) se preparan usando técnicas de expresión transgénica. Las técnicas de expresión recombinante implican la construcción de ácidos nucleicos recombinantes y la expresión de genes en células transfectadas. Se conocen en la técnica técnicas de clonación molecular para lograr estos fines. Una amplia variedad de procedimientos de clonación y amplificación in vitro adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes son muy conocidos para los expertos. Ejemplos de estas técnicas e instrucciones suficientes para dirigir a los expertos a través de muchos ejercicios de clonación se encuentran en Berger y Kimmel (1987), Maniatis 1989, Silhavy 1984, Ausubel 1998). Preferentemente, la construcción de ADN según la invención se genera uniendo los constituyentes esenciales anteriormente mencionados de la construcción de ADN juntos en la secuencia anteriormente mencionada usando las técnicas de recombinación y clonación con las que está familiarizado el experto.

La construcción de construcciones de polinucleótidos generalmente requiere el uso de vectores capaces de replicarse en bacterias. Están comercialmente disponibles una plétora de kits para la purificación de plásmidos de bacterias. Para su uso apropiado, seguir las instrucciones del fabricante (véase, por ejemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; Strataclean™, de Stratagene; y, QIAexpress™ Expression System, Qiagen). Los plásmidos aislados y purificados pueden entonces manipularse adicionalmente para producir otros plásmidos, usarse para transfectar células o incorporarse en Agrobacterium tumefaciens para infectar y transformar plantas. Si Agrobacterium es el medio de transformación, se construyen vectores lanzadera.

4. El procedimiento de transformación

Los procedimientos de la invención son útiles para obtener plantas transgénicas, o células, partes, tejidos, material recolectado derivado de las mismas.

Por consiguiente, otra materia de la invención se refiere a plantas transgénicas o células vegetales que comprenden en su genoma, preferentemente en su ADN cromosómico nuclear, la construcción de ADN según la invención (por ejemplo, el ADN-T que comprende los límites del plásmido Ri pRi2659), y a células, cultivos celulares, tejidos, partes

o material de propagación tal como, por ejemplo, en el caso de organismos de planta, hojas, raíces, semillas, fruto, polen y similares, derivados de tales plantas. Otro aspecto importante de la invención incluye la progenie de las plantas transgénicas preparadas por los procedimientos desvelados, además de las células derivadas de tal progenie, y las semillas obtenidas de tal progenie.

Pueden excluirse variedades de plantas, particularmente variedades de plantas registrables según los Derechos de las Obtenciones Vegetales. Se observa que una planta no necesita considerarse una “variedad de planta”

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simplemente debido a que contiene establemente dentro de su genoma un transgén, introducido en una célula de la planta o un ancestro de la misma. Además de una planta, la presente invención proporciona cualquier clon de una planta tal, semilla, progenie autofecundada o híbrida y descendientes, y cualquier parte o propágula de cualquiera de éstos, tales como esquejes y semilla, que puede usarse en la reproducción o propagación, sexual o asexual. También está englobado por la invención una planta que es una descendencia sexualmente o asexualmente propagada, clon o descendiente de una planta tal, o cualquier parte o propágula de dicha planta, descendencia, clon

o descendiente. También pueden usarse plantas genéticamente modificadas según la invención que pueden ser consumidas por los seres humanos o animales como alimentos o pienso, por ejemplo, directamente o tras el procesamiento conocido en la técnica.

El procedimiento de la invención puede emplearse prácticamente en todas las variedades de plantas, que incluyen variedades de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas (como se define y se especifica anteriormente). Sorprendentemente, la cepa de Agrobacterium rhizogenes desarmada de la invención produjo alta eficiencia de transformación para plantas monocotiledóneas como, por ejemplo, maíz (Zea mays). Hay diversos procedimientos para la transformación de plantas monocotiledóneas. El bombardeo con partículas está frecuentemente favorecido, debido a su eficiencia y no limitación de la variedad de huéspedes (Christou 1995; Jahne 1995). Sin embargo, la estructura irregular y el número de eventos de transformación (por ejemplo, múltiples copias o fragmentadas) requiere cribado y análisis detallado de un alto número de los transgénicos resultantes (Hadi 1996; Trick 1997). Por otra parte, el establecimiento de un sistema para la transformación de plantas monocotiledóneas mediado por Agrobacterium se ha considerado difícil, ya que la infección de plantas monocotiledóneas por Agrobacterium es un evento muy raro y solo podría lograrse eficiencia razonable usando cepas 'super-virulentas' de A. tumefaciens y/o acetosiringona, un compuesto fenólico que induce la expresión de genes vir sobre el plásmido Ti (Belarmino 2000; Eady 2000; Hiei 1994; Smith y Hood 1995; Wilmink 1992). Sin embargo, no hay informes antes de la presente invención de la transformación de monocotiledóneas mediada por una cepa de A. rhizogenes desarmada.

También pueden emplearse numerosos explantes, tejidos de plantas o cultivo de células de planta como material diana para el proceso de co-cultivo. Un experto reconocerá que después de que se ha incorporado establemente la construcción de ADN en plantas transgénicas y confirmado que es operable, puede introducirse en otras plantas por cruce sexual. Puede usarse cualquiera de las varias técnicas de cultivo estándar, dependiendo de las especies que vayan a cruzarse.

Para transferir el ADN a la célula de planta, explantes de planta se co-cultivan con Agrobacterium rhizogenes desarmado de la invención que comprende el ADN-T transgénico. A partir del material de planta infectado (por ejemplo, secciones de hoja, raíz o tallo, pero también protoplastos o suspensiones de células vegetales), pueden regenerarse plantas intactas usando un medio adecuado que puede contener, por ejemplo, antibióticos o biocidas para seleccionar células transformadas. Las plantas obtenidas pueden entonces cribarse en presencia del ADN introducido, en este caso la construcción de ADN según la invención. Tan pronto como el ADN se ha integrado en el genoma del huésped, el genotipo en cuestión es, generalmente, estable y la inserción en cuestión también se encuentra en las generaciones posteriores. Preferentemente, la planta establemente transformada se selecciona utilizando un marcador de selección comprendido en el ADN-T transgénico. Las plantas obtenidas pueden cultivarse e hibridarse del modo habitual. Deben cultivarse dos o más generaciones con el fin de garantizar que la integración genómica sea estable y hereditaria.

Son adecuados diversos tejidos como material de partida (explante) para el proceso de transformación mediado por Agrobacterium que incluye, pero no se limitan a, callo (documentos US 5.591.616; EP-A1 604 662), embriones inmaduros (documento EP-A1 672 752), polen (documento US 54.929.300), brote apical (documento US 5.164.310)

o transformación in planta (documento US 5.994.624). El procedimiento y material descrito en el presente documento puede combinarse con prácticamente todos los procedimientos de transformación mediados por Agrobacterium conocidos en la técnica. Combinaciones preferidas incluyen, pero no se limitan a, los siguientes materiales de partida y procedimientos:

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Material / citación

Plantas monocotiledóneas:

Embriones inmaduros (documento EP-A1 672 752) Callo (documento EP-A1 604 662) Callo embriogénico (documento US 6.074.877) Inflorescencia (documento US 6.037.522) Flor (in planta) (documento WO 01/12828)

Banana

Documentos US 5.792.935; EP-A1 731 632; US 6.133.035

Cebada

Documento WO 99/04618

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(continuación)

Variedad

Material / citación

Maíz

Documentos US 5.177.010; US 5.987.840

Piña

Documentos US 5.952.543; WO 01/33943

Arroz

Documentos EP-A1 897 013; US 6.215.051; WO 01/12828

Trigo

Documentos AU-B 738 153; EP-A1 856 060

Judías

Documentos US 5.169.770; EP-A1 397 687

Brassica

Documentos US 5.188.958; EP-A1 270 615; EP-A1 1.009.845

Cacao

Documento US 6.150.587

Cítrico

Documento US 6.103.955

Café

Documento AU 729 635

Algodón

Documentos US 5.004.863; EP-A1 270 355; US 5.846.797; EP-A1 1.183.377; EP-A1 1.050.334; EP-A1 1.197.579; EP-A1 1.159.436 Transformación en polen (documento US 5.929.300) Transformación in planta (documento US 5.994.624)

Guisante

Documento US 5.286.635

Pimiento

Documento US 5.262.316

Álamo

Documento US 4.795.855

Soja

Nudo cotiledonar de plantas de semillero de soja germinadas Brote apical (documento US 5.164.310) Tejido meristemático axilar de nudo de hoja primario, o superior, de aproximadamente 7 días de plantas de semillero de soja germinadas Cultivos de callo organogénico Ejes de embrión deshidratados Documentos US 5.376.543; EP-A1 397 687; US 5.416.011; US 5.968.830; US 5.563.055; US 5.959.179; EP-A1 652 965; EP-A1 1.141.346

Remolacha azucarera

Documentos EP-A1 517 833; WO 01/42480

Tomate

Documento US 5.565.347

La eficiencia de la transformación con Agrobacterium puede potenciarse por numerosos otros procedimientos conocidos en la técnica como, por ejemplo, formación de incisiones, infiltración a vacío (documento WO 00/58484), 5 choque térmico y/o centrifugación, adición de nitrato de plata, sonicación, etc. En una realización preferida de la invención, se hacen incisiones en el material de explante antes de la inoculación (co-cultivo) con Agrobacterium. Pueden usarse muchos procedimientos de formación de incisiones, que incluyen, por ejemplo, corte, erosión, perforación, pinchado, penetración con partículas finas o fluidos presurizados, formación de incisiones con plasma, aplicación de presión hiperbárica, o sonicación. La formación de incisiones puede realizarse usando objetos tales

10 como, pero no se limitan a, bisturís, tijeras, agujas, objetos abrasivos, aerógrafos, partículas, pistolas eléctricas de genes u ondas de sonido. Otra alternativa es la infiltración a vacío (documentos EP-A1 1.141.356; EP-A1 1.171.618). Otros procedimientos para aumentar la eficiencia de transformación de Agrobacterium pueden conocerse en la técnica pueden combinarse, que incluyen, pero no se limitan a, sonicación (documento EP-A1 904.362) o reducción de peso del tejido diana (documento EP-A1 1.137.790).

15 Las bacterias Agrobacteria rhizogenes desarmadas de la invención se cultivan y se usan de un modo como se conoce en la técnica. El vector que comprende la cepa de Agrobacterium puede, por ejemplo, cultivarse durante 3

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días en medio YEB (véase el Ejemplo 2.6) complementado con el antibiótico apropiado (por ejemplo, 50 mg/l de espectinomicina). Las bacterias se recogen con un bucle del medio sólido y se resuspenden. En una realización preferida de la invención, los cultivos de Agrobacterium se inician usando alícuotas congeladas a -80 ºC. Para el tratamiento con Agrobacterium de pecíolos aislados, las bacterias se resuspenden en el medio usado para el cultivo de pecíolos.

La concentración de Agrobacterium usada para la infección y co-cultivo puede necesitar ser variada. Así, puede usarse un intervalo de concentraciones de Agrobacterium de 105 a 1010 ufc/ml y un intervalo de periodos de cocultivo de algunas horas a 7 días. El co-cultivo de Agrobacterium con los pecíolos aislados se lleva a cabo en general durante 1 a 5, preferentemente 2 a 4 días.

A continuación, los explantes se inoculan con el cultivo de Agrobacterium durante algunos minutos a algunas horas, normalmente aproximadamente 10 minutos a 3 horas, preferentemente aproximadamente 0,5 horas a 1 hora. Se drena el medio en exceso y se permite que Agrobacterium se co-cultive con el tejido diana durante varios días, normalmente tres días en la oscuridad. Durante esta etapa, Agrobacterium transfiere a la construcción de gen extraño a algunas células en el tejido diana. Normalmente no está presente agente de selección durante esta etapa.

Es posible, aunque no necesario, emplear uno o más compuestos fenólicos en el medio antes o durante el co-cultivo de Agrobacterium. “Compuestos fenólicos de planta” o “fenólicos de planta” adecuados dentro del alcance de la invención son aquellas moléculas fenólicas sustituidas aisladas que pueden inducir una respuesta quimiotáctica positiva, particularmente aquellas que pueden inducir el aumento de la expresión del gen vir en un plásmido Ri que contiene Agrobacterium sp. Se prefiere acetosiringona. Además, se espera que ciertos compuestos, tales como osmoprotectores (por ejemplo, L-prolina preferentemente a una concentración de aproximadamente 700 mg/l o betaína), fitohormonas (entre otras, NAA), opinas o azúcares, actúen sinérgicamente cuando se añadan en combinación con compuestos fenólicos de planta. El compuesto fenólico de planta, particularmente acetosiringona, puede añadirse al medio antes de poner en contacto los pecíolos aislados con Agrobacteria (durante, por ejemplo, varias horas a un día). Posibles concentraciones de compuestos fenólicos de planta en el medio oscilan de aproximadamente 25 µM a 700 µM. Sin embargo, para los procedimientos de la invención, preferentemente no se emplea acetosiringona. Condiciones de inducción particularmente adecuadas para Agrobacterium tumefaciens se han descrito por Vernade y col. (1988).

La suplementación del medio de co-cultivo con antioxidantes (por ejemplo, ditiotreitol) o compuestos de tiol (por ejemplo, L-cisteína, Olhoft 2001) que puede disminuir la necrosis de tejido debido a las respuesta de defensa de las plantas (como oxidación fenólica) puede mejorar adicionalmente la eficiencia de la transformación mediada por Agrobacterium.

Después del co-cultivo pueden incluirse etapas para eliminar, suprimir el crecimiento o destruir Agrobacterium rhizogenes. Esta etapa pueden incluir una o más etapas de lavado. El medio empleado después de la etapa de cocultivo contiene preferentemente un bactericida (antibiótico). Esta etapa pretende terminar o al menos retardar el crecimiento de las células no transformadas y destruir las células de Agrobacterium restantes. Antibióticos preferidos que van a emplearse son, por ejemplo, carbenicilina (500 mg/l) o Timentin™(GlaxoSmithKline; una mezcla de ticarcilina disódica y clavulanato potásico; 0,8 g de Timentin™ contiene 50 mg de ácido clavulánico con 750 mg de ticarcilina. Químicamente, la ticarcilina disódica es la sal de disodio del ácido N-(2-carboxi-3,3-dimetil-7-oxo-4-tia-1azabiciclo[3.2.0]hept-6-il)-3-tiofenomalonámico. Químicamente, el clavulanato potásico es (Z)-(2R,5R)-3-(2hidroxietiliden)-7-oxo-4-oxa-1-azabiciclo[3.2.0]heptano-2-carboxilato de potasio).

Después de la etapa de co-cultivo, los explantes co-cultivados se incuban preferentemente sobre un medio de regeneración que comprende al menos un factor de crecimiento de planta. Los medios empleados pueden contener adicionalmente al menos un compuesto, que en combinación con el gen marcador de selección, permite la identificación y/o puede aplicarse a la selección de células vegetales (por ejemplo, un agente selectivo). Sin embargo, se prefiere que los explantes se incuben durante un cierto tiempo, preferentemente 5 a 14 días, después de la etapa de co-cultivo en medio que carece de un compuesto de selección. El establecimiento de un nivel de resistencia fidedigno contra dicho compuesto de selección necesita algún tiempo para prevenir el daño accidental por el compuesto de selección incluso a las células transformadas y tejido.

Las células transformadas, es decir, aquellas que comprenden el ADN integrado en el ADN de la célula huésped, pueden seleccionarse de células no transformadas preferentemente usando el procedimiento de selección de la invención. Tan pronto como se ha generado una célula de planta transformada, puede obtenerse una planta intacta usando procedimientos conocidos para el experto. Por ejemplo, se usan cultivos de callo como material de partida. La formación de brote y raíz puede inducirse en esto como biomasa de células todavía sin diferenciar en el modo conocido. Los brotes obtenidos pueden plantarse y cultivarse.

Las técnicas mediadas por Agrobacterium normalmente pueden producir la administración de genes a un número limitado de células en el tejido elegido como diana. Por tanto, en una realización preferida de la invención, se aplica un agente selectivo después de la transformación para destruir todas las células en los tejidos elegidos como diana que no se transforman o para identificar células transformadas mediante una ventaja selectiva. La duración del cultivo depende, en parte, de la toxicidad del agente de selección para células no transformadas. El gen marcador

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de selección y el compuesto de selección correspondiente usado para dicha selección o cribado puede ser cualquiera de una variedad de compuestos de selección bien conocidos, tales como antibióticos, herbicidas o Daminoácidos (véase más adelante para detalles). La duración de esta etapa de cultivo es variable (dependiendo del compuesto de selección y su concentración, el gen marcador de selección), extendiéndose de un día a 120 días. La inserción de un gen marcador de selección y/o cribable está comprendida dentro del alcance del procedimiento de la invención. Esto puede ser ventajoso, por ejemplo, para el uso posterior como rasgo resistente a herbicidas.

Por ejemplo, con el gen de resistencia a kanamicina (neomicina fosfotransferasa, NPTII) como marcador selectivo, la kanamicina puede incluirse en el medio a una concentración de aproximadamente 3 a 200 mg/l. Concentraciones típicas para la selección son 5 a 50 mg/l. El tejido se cultiva en este medio durante un periodo de 1 a 3 semanas, preferentemente aproximadamente 7 días, hasta que se han desarrollado los brotes.

Por ejemplo, con el gen de resistencia a fosfinotricina (bar) como marcador selectivo, la fosfinotricina puede incluirse en el medio a una concentración de aproximadamente 3 a 200 mg/l. Concentraciones típicas para la selección son 5 a 50 mg/l. El tejido se cultiva en este medio durante un periodo de 1 a 3 semanas, preferentemente aproximadamente 7 días, hasta que se han desarrollado los brotes. Por ejemplo, con el gen dao1 como marcador selectivo, puede incluirse en el medio D-serina o D-alanina a una concentración de aproximadamente 3 a 100 mg/l. Concentraciones típicas para la selección son 20 a 40 mg/l. El tejido se cultiva en este medio durante un periodo de 1 a 3 semanas, preferentemente aproximadamente 7 días, hasta que se han desarrollado los brotes.

Las células vegetales transformadas, derivadas por cualquiera de las técnicas de transformación anteriores, pueden cultivarse para regenerar una planta completa que posee el genotipo transformado y así el fenotipo deseado. Tales técnicas de regeneración se basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido, basándose normalmente en un marcador de biocida y/o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. Se describe la regeneración de plantas de protoplastos cultivados (Evans 1983; Binding, 1985). La regeneración también puede obtenerse de callo de planta, explantes, embriones somáticos (Dandekar 1989; McGranahan 1990), órganos o partes de los mismos. Se describen tales técnicas de regeneración (generalmente en Klee 1987). Se describen otras técnicas de regeneración disponibles (Vasil 1984; Weissbach 1989).

Los medios que se emplean durante el procedimiento de la invención para la regeneración y/o selección pueden estar opcionalmente adicionalmente complementados con uno o más reguladores del crecimiento de plantas como, por ejemplo, compuestos de citoquinina (por ejemplo, 6-bencilaminopurina) y/o compuestos de auxina (por ejemplo, 2,4-D). El término “regulador del crecimiento de plantas” (PGR), como se usa en el presente documento, significa compuestos que se producen naturalmente o sintéticos (no que se producen naturalmente) que pueden regular el crecimiento y desarrollo de plantas. Los PGR pueden actuar individualmente o conjuntamente con otro o con otros compuestos (por ejemplo, azúcares, aminoácidos). El término “auxina” o “compuestos de auxina” comprende compuestos que estimulan el alargamiento y división celular, diferenciación de tejido vascular, desarrollo de frutos, formación de raíces adventicias, producción de etileno y, a altas concentraciones, inducen la desdiferenciación (formación de callo). La auxina que se produce naturalmente más común es el ácido indolacético (IAA), que es transportado polarmente en raíces y tallos. Se usan ampliamente auxinas sintéticas en el agricultura moderna. Los compuestos de auxina comprenden ácido indol-3-butírico (IBA), ácido naftilacético (NAA) y ácido 2,4diclorofenoxiacético (2,4-D). Los compuestos que inducen la formación de brotes incluyen, pero no se limitan a, IAA, NAA, IBA, citoquininas, auxinas, quinetinas, glifosato y tiadiazorun.

El término “citoquinina” o “compuesto de citoquinina” comprende compuestos que estimulan la división celular, expansión de cotiledones y crecimiento de yemas laterales. Retrasan la senescencia de hojas desprendidas y, en combinación con auxinas (por ejemplo, IAA), pueden influir en la formación de raíces y brotes. Los compuestos de citoquinina comprenden, por ejemplo, 6-isopenteniladenina (IPA) y 6-benciladenina/6-bencilaminopurina (BAP).

Los descendientes pueden generarse por propagación sexual o no sexual. La propagación no sexual puede realizarse por introducción de embriogénesis somática por técnicas muy conocidas en la técnica. Preferentemente, se generan descendientes por propagación / fertilización sexual. La fertilización puede realizarse tanto por autofecundación (auto-polinización) como cruce con otras plantas transgénicas o no transgénicas. La planta transgénica de la invención puede funcionar en el presente documento tanto de planta materna como paterna. Los descendientes pueden comprender una o más copias del gen de rasgo agronómicamente valioso. Preferentemente, se aíslan descendientes que solo comprenden una copia de dicho gen de rasgo.

Todas las composiciones y procedimientos desvelados y reivindicados en el presente documento pueden prepararse y ejecutarse sin excesiva experimentación en vista de la presente divulgación. Aunque las composiciones y procedimientos de la presente invención se han descrito en términos de realizaciones preferidas, será evidente para aquellos expertos en la materia que pueden aplicarse variaciones a la composición, procedimientos y en las etapas

o en la secuencia de etapas del procedimiento descrito en el presente documento sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están tanto químicamente como fisiológicamente relacionados pueden estar sustituidos con los agentes descritos en el presente documento, mientras que se lograrían los mismos resultados o similares. Todos aquellos sustitutos similares y

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modificaciones evidentes para aquellos expertos en la materia se consideran que están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de aquellos expertos en la materia a la que se refiere la presente invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en el presente documento por referencia al mismo grado que si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara específicamente e individualmente que se incorpora por referencia. Ahora se ilustrarán ciertos aspectos y realizaciones de la invención a modo de ejemplo y con referencia a la figura descrita más adelante.

Secuencias

1.

SEC ID Nº: 1: Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia del flanco derecho de pRI2659

2.

SEC ID Nº: 2: Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia del flanco izquierdo de pRI2659

3.

SEC ID Nº: 3: Secuencia de ácidos nucleicos del vector de clonación pRL278 (nº de acceso de GenBank: L05083)

4.

SEC ID Nº: 4: Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región de ADN-T de pRI2659 (nº de acceso de GenBank AJ271050).

5.

SEC ID Nº: 5: Motivo de la secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de la cepa K599 de Agrobacterium M1:5'-AATCGTCGATGCGAATTGTTG-3'

6.

SEC ID Nº: 6: Motivo de la secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de la cepa K599 de Agrobacterium M2: 5'-GTTTTGTCCTGACGCTGTCGCGA-3'

7.

SEC ID Nº: 7: Motivo de la secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de la cepa K599 de Agrobacterium M3: 5'-TCTAACGATCGCTGCGCTCCGGA-3'

8.

SEC ID Nº: 8: Motivo de la secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de la cepa K599 de Agrobacterium M4: 5'-CGCCACGAGGCGCGACGGA-3'

9.

SEC ID Nº: 9: Motivo de la secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de la cepa K599 de Agrobacterium M5: 5'-TTATGGGCGAATTGATCTGA-3'

10.

SEC ID Nº: 10 Motivo de la secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de la cepa K599 de Agrobacterium M6: 5'-GTCCTGCTAAGGATTGATGCCT-3'

11.

SEC ID Nº: 11 Motivo de la secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de la cepa K599 de Agrobacterium M7: 5'-AGACCAGTCCTTGTGAAACC-3'

12.

SEC ID Nº: 12 Motivo de la secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de la cepa K599 de Agrobacterium M8: 5'-CCTGGGCATTTTTGTTGTTGG-3'

13.

SEC ID Nº: 13 Motivo de la secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de la cepa K599 de Agrobacterium M9: 5'-AATGGTATGGCTTCGAGGTG-3'

14.

SEC ID Nº: 14 Motivo de la secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de la cepa K599 de Agrobacterium M10: 5'-CTCAAAGAAGACCGTACCGACA-3'

15.

SEC ID Nº: 15 Vector binario pBPSEW008 [p-NOS::c-bar:a-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS]

16.

SEC ID Nº: 16 Vector binario pBPSMM192b [p-AtAhas::c-csr1-2::t-AtAHAS t-NOS::c-gusINT::p-SUPER]

17.

SEC ID Nº: 17 JT-Vector binario pBPSMM232 [p-ZmUbi1::c-ZmAHASL/Xi12::t-ZmAHAS t-NOS::c-gusINT::p-ZmUbi1] pBPSMM232 es un vector que como tal no es replicable en Agrobacterium, sino solo en E. coli. La transformación en Agrobacterium que comprende el plásmido super-binario pSB1 produce un plásmido quimérico (pSB1/pBPSMM232) por fusión mediada por selección entre pBPSMM232 y pSB1; Komari 1996)

18.

SEC ID Nº: 18 Secuencia del límite izquierdo de pRi2659 5-TGGCAGGATA TATTGTGGTG TAAA-3'

19.

SEC ID Nº: 19 Secuencia del límite derecho de pRi2659 5'-TGACAGGATA TATCCCCTTG TCTA-3'

20.

SEC ID Nº: 20 Secuencia intergénica de ARNr 16S-23S de la cepa K599 de Agrobacterium

21.

SEC ID Nº: 21 ADN genómico que codifica ARNr 16S de la cepa K599 de Agrobacterium

22.

SEC ID Nº: 22 Vector de deleción pBPSSH009

23.

SEC ID Nº: 23 Vector de deleción pRL278 LF/RF (también llamado pBPSSH009b)

24.

SEC ID Nº: 24 Secuencia de ácidos nucleicos que codifica pRI2659Δ (que no comprende el marcador de selección de tetraciclina (tet))

25.

SEC ID Nº: 25: Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf1, similar a integrasa/recombinasa similar a mll6374, [Mesorhizobium loti MAFF303099]

26.

SEC ID Nº: 26 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf13, débilmente similar a ri-orf22 en pRi1724, similar a la proteína hipotética Bcep02000337 [Burkholderia fungorum LB400]

27.

SEC ID Nº: 27 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf14, probable gen transportador de cucumbopina, similar a riorf37 en pRi1724, un probable transportador de mikimopina

28.

SEC ID Nº: 28: Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf16, similar a SMa2205 Sinorhizobium meliloti 1021 (cepa: 1021), un sistema de transporte de espermidina/putrescina tipo ABC COG1176 [E], componente I de permeasa

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(continuación)

29.

SEC ID Nº: 29 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf19, similar a hutl, imidazolona-5-propionato hidrolasa [Agrobacterium tumefaciens str. C58], menos similar a riorf39 en pRi1724, ruta de KEGG: metabolismo de histidina 00340.

30.

SEC ID Nº: 30 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf20, similar a riorf41 en pRi1724, una proteína hipotética

31.

SEC ID Nº: 31 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf21, similar a riorf42 en pRi1724, un homólogo del gen hutU, una urocanasa, número EC 4.2.1.49

32.

SEC ID Nº: 32 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf22, similar a la proteína de función desconocida DUF886 [Mesorhizobium sp. BNC1] y menos similar a riorf43 en pRi1724, similar a gen desconocido próximo al gen hutR en Pseudomonas putida

33.

SEC ID Nº: 33 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf23, similar al extremo C similar a la familia transposasa de IS30

34.

SEC ID Nº: 34 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf32, similar a riorf60 en pRi1724, similar al gen gatA-1 [glutamil-ARNt amidotransferasa, subunidad A (gatA-1) Sulfolobus solfataricus P2]

35.

SEC ID Nº: 35 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf34, similar a riorf62 en pRi1724, gen transportador ABC hipotético similar al gen agaB, ácido agropínico permeasa, pfam00528: BPD_transp_1; componente de la membrana interna del sistema de transporte dependiente de la unión a proteína

36.

SEC ID Nº: 36 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf35, similar a riorf63 en pRi1724, gen transportador ABC hipotético similar al gen dppC, pfam00528: BPD_transp_1; componente de la membrana interna del sistema de transporte dependiente de la unión a proteína

37.

SEC ID Nº: 37 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf36, similar a riorf64 en pRi1724, gen transportador ABC hipotético similar al gen moaD, ácido manopínico permeasa, COG1123: componentes de ATPasa de diversos sistemas de transporte tipo ABC.

38.

SEC ID Nº: 38 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf37, similar a riorf66 en pRi1724, similar al gen amaB, N-carbamoil-beta-alanina amidohidrolasa

39.

SEC ID Nº: 39 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf39, similar a riorf68 en pRi1724, débilmente similar al gen pck, pfam01633: Colina_cinasa; Colina/etanolamina cinasa

40.

SEC ID Nº: 40 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf40, similar a riorf69 en pRi1724, similar a MLCB1779.29 (probable gen monofosfatasa) en Mycobacterium leprae, cd01641: IMPasa_ Bacteriana_similar_1; familia predominantemente bacteriana de fosfatasas dependientes de Mg++, relacionadas con inositol monofosfatasas

41.

SEC ID Nº: 41 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf41, similar a riorf71 en pRi1724, gen quimiorreceptor hipotético similar al gen orf2 en pTi 15955

42.

SEC ID Nº: 42 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf44, similar a riorf74, similar al gen teuB (proteína de unión al azúcar periplásmica), COG1879: RbsB; sistema de transporte de azúcar tipo ABC, componente periplásmico [transporte y metabolismo de hidratos de carbono].

43.

SEC ID Nº: 43 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf45, similar a riorf75 en pRi1724, similar al gen teuA (transportador ABC de azúcar de unión a ATP), gen transportador ABC hipotético, COG1129: MgIA; sistema de transporte de azúcar tipo ABC, componente de ATPasa [transporte y metabolismo de hidratos de carbono].

44.

SEC ID Nº: 44 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf46, similar a riorf76 en pRi1724, similar al gen teuC1 (transportador ABC de azúcar-permeasa), un gen transportador ABC hipotético, pfam02653: BPD_transp_2; sistema de transporte de aminoácidos de cadena ramificada / componente de permeasa.

45.

SEC ID Nº: 45 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf47, similar a riorf77 en pRi1724, similar al gen teuC2 (transportador ABC de azúcar-permeasa), un gen transportador ABC hipotético, pfam02653: BPD_transp_2; sistema de transporte de aminoácidos de cadena ramificada / componente de permeasa.

46.

SEC ID Nº: 46 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf48, similar a riorf78 en pRi1724, COG2755

[E] lisofosfolipasa L1 y esterasas relacionadas.

47.

SEC ID Nº: 47 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf50, similar a riorf80 de pRi1724, un homólogo del gen glpD, glicerol-3-fosfato deshidrogenasa [Agrobacterium tumefaciens str. C58]

48.

SEC ID Nº: 48 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf51, similar a riorf81 en pRi1724, un homólogo del gen acs (acetil-CoA sintetasa), EC 6.2.1.1.

49.

SEC ID Nº: 49 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf52, similar a riorf82 de pRi1724, un homólogo del gen adk, pfam00406: ADK; adenilato cinasa, EC 2.7.4.3.

50.

SEC ID Nº: 50 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf53, similar a riorf83 en pRi1724, un gen quimiorreceptor hipotético similar al gen orf2 en pTi 15955

51.

SEC ID Nº: 51 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf54, similar a riorf84, un homólogo del gen cbbF, cd00354: FBPasa; fructosa-1,6-bisfosfatasa, una enzima que cataliza la hidrólisis de fructosa-1,6-bifosfato en fructosa-6-fosfato y es crítica en la ruta de gluconeogénesis.

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(continuación)

76.

SEC ID Nº: 76 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf99, similar a riorf135 en pRi1724, débilmente similar al gen y4aO en pNGR234a.

77.

SEC ID Nº: 77 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf103, similar al gen riorf137 en pRi1724 y el gen orf4 en pTiA6NC.

78.

SEC ID Nº: 78 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf105, similar a riorf139 en pRi1724, similar a la región sin caracterizar entre los genes y4jF y y4jG en pNGR234a.

79.

SEC ID Nº: 79 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf106, similar riorf140 en pRi1724 y al gen orf300 en Escherichia coli, pfam00004: AAA; familia de ATPasa asociada a diversas actividades celulares (AAA).

80.

SEC ID Nº: 80 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf107, similar al extremo N de riorf141 en pRi1724, una proteína hipotética.

81.

SEC ID Nº: 81 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf109, débilmente similar a SERP1653 Staphylococcus epidermidis RP62A (cepa: RP62A), una proteína hipotética.

82.

SEC ID Nº: 82 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf10, similar a riorf142 en pRi1724, similar al gen para el exón 6 de la proteína de unión luminal en Arabidopsis thaliana.

83.

SEC ID Nº: 83 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf111, similar a riorf143 en pRi1724 y al gen spdB3 en pSG5.

84.

SEC ID Nº: 84 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf112, similar a riorf144 en pRi1724.

85.

SEC ID Nº: 85 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf114, gen virF putativo, similar a riorf146 en pRI1724 y tiorf133 en pTiSAKURA.

86.

SEC ID Nº: 86 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf117, similar a riorf149 en pRi1724, similar al extremo N. aatA (atu2196) aspartato aminotransferasa A [Agrobacterium tumefaciens str. C58].

87.

SEC ID Nº: 87 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf119, probable virH, similar a riorf151 en pRi1724, citocromo P450-tipo oxidasa, probablemente proteína tipo IV secretada mediante virB/D4.

88.

SEC ID Nº: 88 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf120, probable virA, similar a riorf152 en pRi1724, receptor en el sistema regulador virA/G de dos componentes.

89.

SEC ID Nº: 89 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf121, probable virB1, similar a riorf153 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

90.

SEC ID Nº: 90 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf123, probable virB3, similar a riorf155 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

91.

SEC ID Nº: 91 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf125, probable virB5, similar a riorf157 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

92.

SEC ID Nº: 92 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf126, probable virB6, similar a riorf158 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

93.

SEC ID Nº: 93 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf127, probable virB7, similar a riorf159 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

94.

SEC ID Nº: 94 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf129, probable virB9, similar a riorf161 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

95.

SEC ID Nº: 95 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf1131, probable virB11, similar a riorf163 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

96.

SEC ID Nº: 96 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf132, probable virG, similar a riorf164 en pRi1724, activador en el sistema regulador virA/G de dos componentes.

97.

SEC ID Nº: 97 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf133, proteína hipotética, similar a aa1-103 pf ISBm1 transposasa orfB [Brucella suis 1330] (NP 697552).

98.

SEC ID Nº: 98 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf137, probable virD1, similar a riorf167 en pRi1724, una proteína accesoria de endonucleasa del límite de ADN-T regulada por virA/G.

99.

SEC ID Nº: 99 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf138, probable virD2, similar a riorf168 en pRi1724, la endonucleasa del límite de ADN-T regulada por virA/G.

100.

SEC ID Nº: 100 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf140, probable virD4, similar a riorf170 en pRi1724, componente regulado por virA/G del sistema de secreción tipo IV de virB/D4.

101.

SEC ID Nº: 101 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf142, probable virF, similar a riorf172 en pRi1724, y menos similar a tiorf133 en pTiSAKURA, una proteína de secreción tipo IV mediante el complejo de virB/D4.

102.

SEC ID Nº: 102 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf143, probable virE3, similar a riorf173 en pRi1724 y virE3 en pRiA6NC, interacciona con virE2 y IMPA1 (AtKAP-alfa) en A. tumefaciens, proteína secretada de tipo IV de virB/D4.

103.

SEC ID Nº: 103 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf144, similar a Mesorhizobium loti MAFF303099 mlr1626, manosa-6-fosfato isomerasa predicha.

104.

SEC ID Nº: 104 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf145, similar a integrasa de fago

105.

SEC ID Nº: 105 Secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región RF::tet::LF de pRi2659Δtet (que comprende marcador de selección de tetraciclina (tet))

106.

SEC ID Nº: 106 Secuencia de ácidos nucleicos que codifica pRi2659

107.

SEC ID Nº: 107 Cebador de PCR dentro de CDS de virG 5'-TACTTCCTCC TCACGCACTC-3'

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(continuación)

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SEC ID Nº: 137 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf242, similar a riorf73 en pRi1724, gen represor hipotético, similar a SMa2004 [Sinorhizobium meliloti 1021], regulador transcripcional de la familia ROK putativa.

138.

SEC ID Nº: 138 Secuencia de ácidos nucleicos complementaria de pRi2659 que contiene rcorf74 a rcorf76

139.

SEC ID Nº: 139 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf76, probable gen traC, procesamiento de ADN conjugal del plásmido Ti, similar a riorf111 en pRi1724.

140.

SEC ID Nº: 140 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf274, probable gen traG, similar a riorf109 en pRi1724, cd01126: TraG_VirD4; la familia TraG/TraD/VirD4 son proteínas de conjugación bacterianas.

141.

SEC ID Nº: 141 Secuencia de ácidos nucleicos complementaria de pRi2659 que contiene rcorf83 a rcorf95

142.

SEC ID Nº: 142 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf95, probable gen tral similar a riorf131 en pRi1724, reguladores de detección de cuórum tipo Luxl, sintetiza 3-oxooctanoilhomoserina lactona, pfam00765: Autoind_synth; Autoinductor sintetasa.

143.

SEC ID Nº: 143 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf294, probable gen trbB similar a riorf130 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

144.

SEC ID Nº: 144 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf293, probable gen trbC similar a riorf129 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

145.

SEC ID Nº: 145 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf91, probable gen trbE similar a riorf127 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

146.

SEC ID Nº: 146 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf89, homólogo del gen trbK similar a riot125 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

147.

SEC ID Nº: 147 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf88, probable gen trbF similar a riort123 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

148.

SEC ID Nº: 148 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf287, probable gen trbF similar a riorf123 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

149.

SEC ID Nº: 149 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf86, probable gen trbG similar a riorf122 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

150.

SEC ID Nº: 150 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf85, probable gen trbH similar a riorf121 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

151.

SEC ID Nº: 151 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf84, probable gen trbl similar a riorf120 en pRi1724, pfam03743: Trbl; proteína similar a Trbl de conjugación bacteriana.

152.

SEC ID Nº: 152 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf83, probable gen traR similar a riorf119 en pRi1724 y traR/AGR pTi 249 en pTiC58.

153.

SEC ID Nº: 153 Secuencia de ácidos nucleicos complementaria de pRi2659 que contiene rcorf100 a rcorf102

154.

SEC ID Nº: 154 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf102, similar al gen integrasa hipotético orf2 (similar al gen similar a integrasa de Pseudomonas) en pTiA6NC.

155.

SEC ID Nº: 155 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf101, similar al fragmento del extremo N de pA 22 Agrobacterium tumefaciens str. C58 (cepa: C58, cepa aislada: Cereon), una proteína integrasa COG0582 [L].

156.

SEC ID Nº: 156 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf100, similar al extremo C de pA 22 Agrobacterium tumefaciens str. C58 (cepa: C58, cepa aislada: Cereon), COG0582 [L] Proteína integrasa.

157.

SEC ID Nº: 157 Secuencia de ácidos nucleicos complementaria de pRi2659 que contiene rcorf115 a rcorf116

158.

SEC ID Nº: 158 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf116, probable proteína de captación de potasio, similar a Atu0711 iAgrobacterium tumefaciens str. C58 y riorf148 en pRi1724 y al gen kup, pfam02705: K_trans; proteína transportadora de potasio K+.

159.

SEC ID Nº: 159 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf115, similar a riorf147 en pRi1724 y el gen y4mC en homólogo de pNGR234a, un gen inducido por vir.

160.

SEC ID Nº: 160 Secuencia de ácidos nucleicos complementaria de pRi2659 que contiene rcorf134 a rcorf136

161.

SEC ID Nº: 161 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf136, probable virC1, similar a riorf166 en pRi1724, proteína regulada por virulencia virA/G, AGR_pTi_18p; VirC1; se une a secuencia multiplicadora adyacente al límite derecho de ADN-T; aumenta el nivel de procesamiento de ADN-T.

162.

SEC ID Nº: 162 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf135, probable virC2, similar a riorf165 en pRi1724, proteína regulada por virulencia virA/G del procesamiento de ADN-T.

163.

SEC ID Nº: 163 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf134, proteína hipotética, similar a aa4122/142 de ISBm1 transposasa orfA [Brucella suis 1330] (NP 697551).

164.

SEC ID Nº: 164 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf15, similar a SMa2207, un transportador ABC putativo, proteína de unión a ATP [Sinorhizobium meliloti 1021], COG3842: PotA; sistemas de transporte de espermidina/putrescina tipo ABC, componentes de ATPasa [transporte y metabolismo de aminoácidos]

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Ejemplos

(continuación) Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf17, probable transportador de cucumbopina, similar a riorf34, una proteína hipotética [Agrobacterium rhizogenes] el probable gen transportador de mikimopina Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf229, similar a riorf57 en pRi1724, un homólogo de eutC, cadena ligera de etanolamina amoniaco-liasa Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf33, similar a riorf61 en pRi1724, gen transportador ABC hipotético similar a PH0807, pfam00496: SBP_bac_5; proteínas de unión a soluto extracelulares bacterianas, familia 5 Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf38, similar a riorf67 en pRI1724, débilmente similar al gen pck, smart00587: CHK; ZnF_C4 y dominio HLH que contiene dominio cinasa Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf49, similar a riorf79 en pRi1724, un homólogo del gen glpK (glicerol cinasa), EC 2.7.1.30. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf65, similar riorf95 en pRI1724, similar a la región en la dirección 3' del gen nylA en pOAD2. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf73, similar a AGR_pTi_225 nucleasa [Agrobacterium tumefaciens str. C58], un homólogo de nucleasa (termonucleasa) microcócica COG1525 [L]. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf75, probable gen traD, proteína conjugal de transferencia similar a riorf110 en pRi1724. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf78, probable gen traF, similar a riorf113 en pRi1724, COG4959: TraF; ruta secretora tipo IV, proteasa TraF [modificación postraduccional, renovación de proteínas, chaperonas / tráfico y secreción Intracelular]. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf81, similar a riorf117 en pRi1724, una proteína hipotética o Agrobacterium rhizogenes (cepa: MAFF03-01724), cd00093: HTH_XRE; proteínas similares a la familia XRE de hélice-giro-hélice. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf90, probable gen trbJ similar a riorf126 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti, COG5314; proteína de transferencia conjugal/exclusión de la entrada [tráfico y secreción intracelular]. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf92, probable gen trbD similar a riorf128 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf104, similar a riorf138 en pRi1724 y gen gvp1 en pHH1, pfam04079: DUF387; proteína (similar a Ypuh) de reguladores transcripcionales putativos. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf108, similar al extremo C de riorf141 en pRi1724, una proteína hipotética. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf113, débil similar durante 79 aa a blr8180 de Bradyrhizobium japonicum USDA 110 (cepa: USDA 110), COG1760 [E] L-serina desaminasa. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf118, similar a riorf150 en pRi1724, gen aatA en homólogo de Rhizobium leguminosarum, pseudogén hipotético que se divide por desplazamiento del marco. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf122, probable virB2, similar a riorf154 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf124, probable virB4, similar a riorf156 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf128, probable virB8, similar a riorf160 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf130, probable virB10, similar a riorf162 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf139, probable virD3, similar a riorf169 en pRi1724, regulado por virA/G, no requerida para virulencia, posible factor de variedad de huéspedes. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf141, probable virD5, similar a riorf171 en pRi1724, componente regulado por virA/G del sistema de secreción tipo IV de virB/D4. Secuencia de aminoácidos codificada por rcorf146, similar a Y4rB Rhizobium sp. NGR234. Secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia flanqueante de ADN-T izquierda de la cepa K599 de Agrobacterium.

A menos que se indique lo contrario, los productos químicos y reactivos en los ejemplos se obtienen de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), las endonucleasas de restricción son de New England Biolabs (Beverly, MA) o Roche (Indianápolis, IN), los oligonucleótidos se sintetizaron por MWG Biotech Inc. (High Point, NC), y otras enzimas

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de modificación o kits referentes a productos químicos y ensayos biológicos moleculares son de Clontech (Palo Alto, CA), Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega Corporation (Madison, WI) o Stratagene (La Jolla, CA). Los materiales para los medios de cultivo celular se obtienen de Gibco/BRL (Gaithersburg, MD) o DIFCO (Detroit, MI). Las etapas de clonación llevadas a cabo para los fines de la presente invención, tales como, por ejemplo, escisiones con restricción, electroforesis en gel de agarosa, purificación de fragmentos de ADN, transferencia de ácidos nucleicos a membranas de nitrocelulosa y de nailon, enlace de fragmentos de ADN, transformación de células de E. coli, crecimiento de bacterias, multiplicación de fagos y análisis de secuencias de ADN recombinante, se llevan a cabo como se describe por Sambrook (1989). La secuenciación de moléculas de ADN recombinantes se lleva a cabo usando un secuenciador de ADN de fluorescencia láser ABI siguiendo el procedimiento de Sanger (Sanger 1977), a menos que se indique de otro modo. Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplo 1: Desarme de la cepa K599 de Agrobacterium

La cepa K599 de Agrobacterium es una bacteria de la tierra que produce la enfermedad de las raíces pilosas en muchas plantas dicotiledóneas que incluyen soja. Se ha mostrado que la cepa K599 es altamente infecciosa en raíces de soja. La cepa K599 de Agrobacterium (depositada bajo el número de acceso NCPPB2659 en the British NCPPB stock center; www.ncppb.com, Laboratorio de Ciencias Central de la Colección Nacional de Bacterias Patógenas de Plantas, Sand Hutton, York Y041 1 LZ, Inglaterra) se cultivó en cultivo líquido (medio LB) a 28 ºC y se realizaron protocolos de extracción de ADN modificados para purificar plásmidos pRi usando el kit Qiagen Large Construct, nº de catálogo 12462, para enriquecer la preparación de ADN en el plásmido pRi2659.

Se hicieron hibridaciones Southern usando sondas de límite derecho (285 pb) o izquierdo (240 pb) para verificar la corrección del mapa de restricción física de la región de ADN-T de pRi2659 (véase Fig. 6). Se determinó que la enzima de restricción Sphl dio fragmentos aceptables (mayores de 2 kb de franqueamiento) usando regiones homólogas para un vector de deleción. Se construyó un banco de clones subgenómicos de fragmentos Sphl de pRi2659 de K599 en pUC19. El ADN de la cepa K599 de Agrobacterium aislada enriquecido en el plásmido pRI2659 se digirió con Sphl y migró sobre un gel de agarosa al 0,8 %. Las regiones de fragmentos que representan un fragmento de 2905 pb que contiene ADN del flanco derecho y un fragmento de 7.498 pb que contiene ADN del flanco izquierdo se escindieron del gel de agarosa y se purificaron usando un kit de extracción en gel Qiagen QIAquick, nº de catálogo 28706. Estos fragmentos de gel purificados se ligaron en pUC19 para generar un banco de clones sub-genómico.

Se sondaron elevaciones de colonias del banco de clones con tanto fragmentos del límite derecho como del límite izquierdo para identificar clones que contenían ADN flanqueante. Se identificaron dos clones: un fragmento de 2.905 pb que contenía ADN del flanco derecho y un fragmento de 7.498 pb que contenía ADN del flanco izquierdo. Cada uno de estos clones se subclonó adicionalmente y se secuenció usando cebadores directos e inversos estándar (SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente).

Se construyó el casete de deleción de Agrobacterium usando fragmentos de 2,1 kb de cada clon flanqueante. Las regiones homólogas proporcionan espacio suficiente para que tenga lugar la doble recombinación homóloga. Se construyó un casete similar que contenía el gen de resistencia a tetraciclina entre los fragmentos FD y FI (véase la Fig. 12 para el diagrama de flujo). Estas construcciones se verificaron por secuencia. Los casetes de FD/FI y FD/Tet/FI se clonaron en una versión modificada por conector de pRL278 (SEC ID Nº: 3; Peter Wolk, Universidad del Estado de Michigan) produciendo el vector plasmídico pRL278FI/FD (SEC ID Nº: 23; sin casete Tet) y el vector plasmídico pBPSSH009 (SEC ID Nº: 22; con casete Tet), respectivamente. Estos vectores permiten la eficaz selección de recombinantes homólogos dobles por el uso del gen sacB. La adición de sacarosa a los medios de crecimiento que contienen recombinantes homólogos individuales produce el compuesto tóxico levan. Este compuesto actúa de contra-selección contra cepas que contienen el plásmido, obligando a un cruzamiento doble que resuelve el fenotipo no mutante o la deleción deseada. pBPSSH009 y pRL278LF/RF, respectivamente, se introdujeron por electroporación en la cepa K599 y se seleccionaron usando kanamicina 100 µg/ml. Se recuperaron cruzamientos individuales que contienen el plásmido de deleción que se ha integrado en el plásmido Ri y se realizó contra-selección sobre sacarosa. Se llevó a cabo selección con sacarosa/sacB del siguiente modo: se cultivaron eventos de cruzamiento simple confirmados (por hibridación Southern) que contenían el vector resistente a kanamicina con sacB y construcción de deleción durante la noche sin selección para permitir que tuviera lugar la recombinación. Se sembró una dilución sucesiva del cultivo sobre medio de contra-selección de agar-LB que contenía 5 % de sacarosa v/v. Después de 2 días, las colonias que aparecieron se cultivaron y se aislaron y usó ADN genómico para confirmar la deleción de la región de ADN-T por hibridación Southern. Se aislaron cruzamientos dobles y la confirmación molecular de la deleción del ADN-T se confirmó por hibridación Southern (Fig. 6). La sonda usada en la hibridación Southern fue la misma que se usó anteriormente para aislar el fragmento que contiene la región flanqueante derecha de pRi2659. Es un fragmento de 200 pb que contiene la secuencia de límite y flanqueante derecha tanto en la dirección 5' como en la dirección 3' del límite. Para la transferencia Southern, las muestras de ADN genómico se digirieron con Sphl y migraron sobre gel de agarosa al 0,8 %.

Las cepas obtenidas se nombraron del siguiente modo:

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-Cepas K599 de Agrobacterium [pRi2659Atet]: SHA001 y SHA016 son cepas K599 de Agrobacterium

desarmadas que carecen de su región de ADN-T que comprende un casete de expresión de tetraciclina (tet)

(obtenidas usando pBPSSH009). Las cepas SHA001 y SHA016 de Agrobacterium son ambas cepas

funcionalmente equivalentes del tipo resistente a tetraciclina desarmadas, es decir, que comprenden el plásmido

pRi2659Atet. -Cepa K599 de Agrobacterium [pRi2659Δ]: SHA017 es una cepa K599 de Agrobacterium desarmada que carece

de su región de ADN-T (obtenida usando pRL278LF/RF, también conocida como pBPSSH009b).

Pruebas funcionales del síndrome de la raíz pilosa sobre cotiledones de soja (véase más adelante, Ejemplo 2) confirmaron la pérdida del fenotipo de enfermedad. Se realizaron experimentos de transformación de plantas en soja, maíz, tomate y Arabidopsis (véase más adelante) y se confirmaron las propiedades infecciosas de plantas en la cepa desarmada. En todas las especies de plantas se detectó expresión transitoria de β-glucuronidasa (GUS). Además, se detectó expresión estable de GUS en diversas especies de plantas que incluyen tejidos de soja, maíz y tomate. También se han recuperado plantas de Arabidopsis estables resistentes a Pursuit™ y glufosinato. El plásmido pSB1 super-virulento (Komari 1996) se ha movilizado en la cepa K599 desarmada y se verificó que era eficaz en la transformación de maíz.

Ejemplo 2: Ensayos de raíces pilosas

Se usaron semillas de soja (cultivar Williams 82) para el siguiente ensayo. 1. 6 días antes de la inoculación, se esterilizan semillas de soja. Semillas sin heridas/fisuras sobre la superficie se disponen en un vaso de precipitados estéril. Se usan 30 semillas para cada cepa de Agrobacterium que va a evaluarse y se cubren con 95 % de etanol durante un minuto. Se elimina el etanol y las semillas se tratan con 10 % de blanqueante recién preparado con 0,0005 % de TritonX-100 durante 10 min. El blanqueante se cambia cada 3 minutos. Después, el blanqueante se drena y las semillas se lavan 4 veces en agua estéril. Se colocan 10 semillas sobre una placa de agar al 1 %, se sella con Parafilm™ y se pone a 25 ºC, 16 h/día de iluminación (70-100 µE/m2s).

Inoculación de Agrobacterium para el ensayo de raíces pilosas:

Antes de la inoculación, las sojas germinadas se disponen bajo una campana de flujo laminar. Se saca un cultivo de Agrobacterium durante la noche fresco del agitador y se determina la DO650. Se dispone una alícuota de 1 ml en un tubo de microcentrífuga estéril y las Agrobacteria se precipitan a 12.000 rpm durante 3 minutos. Se retira el sobrenadante y las Agrobacteria se resuspenden en medio de infección (1x sales de MS, 3,6 % de glucosa, 6,9 % de sacarosa, 100 mg/l de mio-inositol, 1,5 mg/l de 2,4-D, 1 mg/l de aminoácidos cas, 1 mg/l de HCl de tiamina, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de HCl de piridoxina).

Se ajusta la DO650 a 1,0. Las Agrobacteria se incuban en medio de infección durante 1 hora antes de la infección para inducir la cascada del gen vir. Solo se cortan los cotiledones verdes de las plantas de semillero y el lado adaxial se hiere con un bisturí. Los cotiledones se disponen sobre placas de agar con el lado abaxial hacia arriba. La superficie herida de cada cotiledón se inocula con 17 a 20 µl de Agrobacteria. Las placas se tapan con Parafilm y se disponen a condición de 25 ºC, 16 h/día de iluminación (70-100 µE/m2s) para el co-cultivo. Tres días después de la inoculación, los cotiledones se transfieren a medio de selección (1x sales de MS, 1x vitaminas B5 de Gamborg, 3 % de sacarosa, 100 mg/l de carbinicilina, pH 6,2 con KOH). Las placas se sellan y se ponen de nuevo en la misma condición de cultivo. Después de dos semanas pueden detectarse y recogerse raíces pilosas que están creciendo en la superficie del medio (para etapas inductoras de raíces pilosas). Se disponen raíces recogidas sobre medio de selección. Después de dos a tres semanas adicionales, las líneas de raíz que están creciendo sobre el medio de selección se subcultivan sobre medio que no comprende agente de selección. Deben subcultivarse cada 4 semanas. Las raíces deben cultivarse en la oscuridad.

Ejemplo 3: Crecimiento y preparación de Agrobacterium para la transformación de plantas

Se preparan cultivos de Agrobacterium cubriendo como manchas bacterias que llevan el vector binario deseado sobre medio de crecimiento YEP sólido y se incuban a 25 ºC hasta que aparecen las colonias (aproximadamente 2 días). Dependiendo de los genes marcadores de selección presentes sobre el plásmido Ri, el vector binario y los cromosomas bacterianos, pueden usarse diferentes agentes de selección para la selección de A. tumefaciens y rhizogenes en los medios sólidos y líquidos YEP. Después de aproximadamente dos días, se aísla una colonia individual (con un palillo estéril) y se inocula en 50 ml de líquido YEP con antibióticos con agitación (175 rpm, 25 ºC) hasta que se alcanza una DO650 entre 0,8 y 1,0 (aproximadamente 2 días). Se preparan disoluciones madre de trabajo de glicerol (15 %) para la transformación y se guardan como disoluciones madre de Agrobacterium de un ml en tubos Eppendorf de 1,5 ml a -70 ºC.

Medio de crecimiento YEP (medio de Agrobacterium):

10 g/l de Bacto-peptone, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 12 g/l de agar (Difco), antibióticos apropiados; pH 7,0

El día antes de la inoculación del explante, se inoculan 200 ml de YEP con 5 µl a 3 ml de disolución madre de trabajo de Agrobacterium en un matraz Erlenmeyer de 500 ml. Agitar el matraz durante la noche a 25 ºC hasta que

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la DO650 esté entre 0,8 y 1,0. Antes de preparar los explantes de soja, las Agrobacteria se sedimentan por centrifugación durante 10 min a 5.500 x g a 20 ºC. El sedimento se resuspende en medio CCM líquido a la densidad deseada (DO650 0,5 a 0,8) y se pone a temperatura ambiente al menos 30 minutos antes de uso.

Medio CCM líquido (=medio de co-cultivo):

1/10 de sales B5, 1/10 de disolución madre de MS hierro, 3 % de sacarosa, MES 20 mM, 1X vitaminas B5, acetosiringona 200 µM, ácido giberélico 0,7 µM, 6-bencil-aminopurina 7,5 µM; pH 5,4.

Ejemplo 4: Transformación de plantas

Ejemplo 4a: Transformación de soja

Preparación de plantas de semillero y Agrobacterium

Se esterilizan semillas de soja de diversos cultivares durante 24 a 48 horas en gas cloro añadiendo 3,5 ml de HCl a 100 ml de blanqueante (5,25 % de hipoclorito de sodio) en un desecador con una tapa de cierre hermético. Después de la esterilización, las semillas se sacan y se siembran aproximadamente 20 semillas sobre medio de germinación [1X sales principales de B5, 1X sales secundarias de B5, 1X MSIII hierro, 2 % de sacarosa, 1X vitaminas B5, BAP 0 a 5 µM, 0,8 % de agar purificado (Sigma); pH 5,8] en recipientes PlantCon. Las plantas de semillero se cultivan a la luz (150 µm2s) hasta que los cotiledones sean verdes, se haya fraccionado la envoltura de la semilla y el epicótilo se haya expandido a aproximadamente 0,5 cm de longitud (aproximadamente 7 días) para explantes de hoja y 1 a 4 cm para explantes de planta de semillero.

La cepa K599 de Agrobacterium (pRi2659Δtet) desarmada o la cepa AGL1 de A. tumefaciens que llevan el vector binario pBPSEW008 [p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT:t-NOS] (SEC ID Nº: 15) o pBPSMM192b [pAtAhas::c-csr1-2:t-AtAHAS t-NOS::c-gusINT::p-SUPER] (SEC ID Nº: 16) se cubren como manchas sobre YEP sólido [10 g/l de Bacto-peptone (Difco; Becton, Dickinson, and Co., Cockeysville, MD, EE.UU.), 5 g/l de extracto de levadura (Difco), 5 g/l de NaCl, 50 mg/l de kanamicina, 1,2 % de agar granulado (Difco) sólido solo; pH 7,0] y se incuban a 25 ºC durante 2 días. Se recogió una colonia individual con un palillo estéril y se dispuso en 50 ml de YEP líquido con antibióticos y se agitaron (1755 rpm) a 25 ºC durante 16 h. Después de alcanzar una DO650 0,8 a 1,0, se prepararon disoluciones madre de trabajo al 15 % de glicerol y se guardaron a menos 80 ºC. Un día antes de la inoculación de explantes, se añadieron disoluciones madre de trabajo (depende del crecimiento y concentración de la disolución madre de Agrobacterium, cualquiera entre 5 µl y 50 µl) de la cepa de Agrobacterium más 50 mg/l de kanamicina a medio líquido YEP en un matraz Erlenmeyer. Los matraces se agitaron durante la noche a 25 ºC hasta que la DO650 alcanzó 0,8. Antes de preparar los explantes de soja, Agrobacterium se sedimentó por centrifugación durante 10 min a 5.500 x g a 20 ºC y se resuspendió en medio de co-cultivo líquido [1/10X sales principales B5, 1/10X sales secundarias B5, 1/10X MSIII hierro, 1X vitaminas B5, 3 % de sacarosa, MES 20 mM, acetosiringona 200 µM, GA3 0,72 µM, BAP 7,5 µM; pH 5,4] a la densidad deseada (por ejemplo, DO650 0,5) y se incubaron a temperatura ambiente 30 min.

Preparación e inoculación de explantes

Explante de hojas: Se retiraron el cotiledón y el epicótilo del hipocótilo 2 mm por debajo del nudo cotiledonar. Para exponer el epicótilo y las hojas unifoliadas, los cotiledones se separaron el uno del otro y entonces se sacó el epicótilo por encima del nudo cotiledonar. Las hojas primarias, que consisten en la lámina, el pecíolo y las estípulas, se eliminaron en el nodo primario cortando cuidadosamente en la base de las estípulas de forma que los meristemos axilares se incluyeran en el explante. Se hirió el explante cortando el área entre las estípula con un bisturí afilado 3 a 5 veces y se eliminaron todos los brotes previamente formados.

Explante de planta de semillero: Se preparan explantes eliminando la mayoría de las raíces en la unión del hipocótilo/epicótilo o por encima sobre el hipocótilo (si el hipocótilo es muy largo), un cotiledón y cualquier crecimiento de tejido axilar en este nudo, el epicótilo justo por encima del nudo primario que incluye la punta apical, y todas las hojas previamente formadas del nudo primario. Entonces, se daña el nudo primario punzando en la punta del epicótilo donde se encuentra los meristemos axilares usando un bisturí afilado 5 a 10 veces.

Después de la preparación de explantes, los explantes se sumergieron completamente en la suspensión de Agrobacteria durante 30 min. Después de la incubación, los explantes de hojas se transfirieron sobre papel de filtro estéril para eliminar el exceso de cultivo de Agrobacterium y se dispusieron con el lado herido en contacto con un papel de filtro de 7 cm redondo que cubre el medio de co-cultivo sólido [1/10X sales principales B5, 1/10X sales secundarias B5, 1/10X MSIII hierro, 1X vitaminas B5, 3 % de sacarosa, MES 20 mM, AS 200 µM, GA3 0,72 µM, BAP 7,5 µM, (L-cisteína 0,825 a 8,25 mM, Sigma, ditiotreitol 0 a 1 mM, tiosulfato de sodio 0 a 1 mM), 0,5 % de agar purificado; pH 5,4]. Los explantes de planta de semillero se transfirieron sobre el papel de filtro que recubre el medio de co-cultivo sin transferir. Este papel de filtro previene el crecimiento en exceso de Agrobacterium sobre los explantes de soja. Se envolvieron cinco placas con Parafilm “M” (American National Can, Chicago, Illinois, EE.UU.). Los explantes de hoja se incubaron durante dos días y los explantes de planta de semillero durante 5 días en la oscuridad a 25 ºC.

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Selección y regeneración de plantas

Después de la incubación, se eliminó Agrobacterium en exceso lavando los explantes en medio de inducción de brotes líquidos [1X sales principales B5, 1X sales secundarias B5, 1X MSIII hierro, 1X vitaminas B5, 3 % de sacarosa, MES 3 mM, BAP 1,0 uM (explante de planta de semillero) o 2,5 µM (explante de hoja), kinetina 5 µM, 250 mg/l de ticarcilina; pH 5,6] y el explante de hojas se secó por transferencia sobre papel de filtro estéril para prevenir el daño por agua, especialmente sobre la lámina. A continuación, aproximadamente 10 explantes de hoja y 5 explantes de planta de semillero se transfirieron sobre medio de inducción de brotes sólido [0,8 % de agar purificado (Sigma)] sin selección con glufosinato durante 7 días. Los explantes de hoja se dispusieron en el medio de forma que la hoja se encontrara perpendicular a la superficie del medio con el pecíolo incorporado en el medio y la lámina fuera del medio y los explantes de planta de semillero con el epicótilo entero en contacto con el medio. Las placas se envolvieron con cinta de ventilación Scotch 394 (3M, St. Paul, Minnesota, EE.UU.) y se dispusieron en una cámara de crecimiento con una temperatura promedio de 25 ºC bajo ciclo de 18 h de luz/6 h de oscuridad a 70-100 µE/m2s.

Después de 7 días, los explantes de hoja se transfirieron a medio de inducción de brotes con 3,0 mg/l de glufosinato y los explantes de planta de semillero a medio de inducción de brotes con 5,0 mg/l de glufosinato. En este momento, hubo un considerable desarrollo de brotes de novo en la base del pecíolo sobre explantes de hoja y en la punta del epicótilo en el nudo primario sobre los explantes de planta de semillero. Después de 2 semanas sobre medio de inducción de brotes con selección, los explantes de hoja se transfirieron a medio de alargamiento de brotes [1X sales principales de MS, 1X sales secundarias de MS, 1X MSIII hierro, 1X vitaminas B5, 3 % de sacarosa, MES 3 mM, L-asparagina 0,378 mM, ácido L-piroglutámico 0,775 mM, IAA 0,057 µM, GA3 1,44 µM, trans-zeatina ribósido 2,85 µM, 250 mg/l de ticarcilina, 0,8 % de agar purificado (Sigma); pH 5,6] con 3 mg/l de selección con glufosinato para estimular el alargamiento de brotes de los primordios de brotes. Para los explantes de planta de semillero, la almohadilla de brotes se elimina del explante de la punta del epicótilo y se transfiere al mismo medio de alargamiento de brotes. A continuación, los explantes se transfirieron a medio SEM fresco cada 3 semanas hasta que el explante muere o se alargan brotes sanos. Durante la transferencia, se eliminaron los brotes muertos y se cortó la base del explante donde se forma el tejido de callo para ayudar a facilitar la transferencia de nutrientes y agua a los brotes por encima. A continuación, los brotes alargados se transfirieron a medio de enraizamiento (½ X sales B5, 1/2X disolución madre de MS hierro, 2 % de sacarosa, MES 3 mM, ácido indol-butírico 5 µM, 250 mg/l de Timentin, 0,8 % de agar Noble; pH 5,6) hasta que se formaron raíces. A continuación, el brote enraizado se transfirió a tierra (1:1 (peso/peso) de mezcla de tierra de Carolina:Metro) en una cámara de crecimiento bajo 20 horas de luz hasta que se expandió el tercer trifoliado. A continuación, las plantas se cultivaron a madurez en un invernadero bajo un régimen de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad.

Ensayos histoquímicos de GUS

Se evaluaron explantes de hoja para la actividad de GUS colocando en tinción histoquímica de GUS [Na2HPO4 80 mM (pH 8,0), Na2EDTA 8 mM, 0,8 % (v/v) de Triton-X, 1,6 % (v/v) de sulfóxido de dimetilo, 20 % (v/v) de metanol, K4Fe(CN)6 0,38 mM, sal de X-glucuro CHA 1 mM (Inalco, Milán, Italia)] durante 1 día a 37 ºC, después de lo cual el tejido de hoja se lavó en 70 % (v/v) de etanol y se limpió en 95 % de etanol (Jefferson 1987; Kosugi 1990).

Diseño experimental

Para el experimento uno, se prepararon 40 explantes para la inoculación con AGL1 o SHA016 que llevaban el pBPSMM192b binario (SEC ID Nº: 16) y se ensayaron para la expresión transitoria de GUS 5 días después del cocultivo. En un segundo experimento con 3 repeticiones, se probó la regeneración de brotes en un total de 120 explantes inoculados con diferentes concentraciones (DO650: 0, 0,125, 0,25, 0,5) de AGL1 o SHA016 de Agrobacterium, llevando ambos pBPSEW008 (SEC ID Nº: 15). En un tercer experimento, se prepararon 120 explantes para la inoculación con SHA016 o AGL1, llevando ambos pBPSEW008 (SEC ID Nº: 15), y se tiñó un subconjunto para la expresión estable de GUS 36 días después del co-cultivo. Se determinaron las frecuencias de transformación putativas en un cuarto experimento ensayando la tinción histológica de GUS sobre brotes de alargamiento de explantes de planta de semillero transformados con tanto la cepa SHA017 (pSB1) de Agrobacterium como AGL1, llevando ambas pBPSE008 (SEC ID Nº: 15). Este experimento consistió en 5 fechas de inoculación diferentes.

En el primer experimento, tanto AGL1 de A. tumefaciens como la cepa K599 de Agrobacterium desarmada (SHA016) fueron satisfactorios en transferir el ADN-T en el pecíolo del explante de hoja (Fig. 3). El cuarenta y dos y medio por ciento de los explantes infectados con AGL1 mostraron focos GUS+ en las áreas diana, mientras que SHA016 mostró focos GUS+ en el 10 % de las áreas diana (Tabla 1). La reducción en la expresión transitoria de GUS sobre aquellos explantes infectados con SHA016 fue principalmente un resultado de la muerte de tejido durante el co-cultivo.

Tabla 1. La capacidad de cepas AGL1 y SHA016 de Agrobacterium para infectar explantes de hoja.

Cepa

Explantes totales infectados Explantes con focos GUS (+) en áreas diana

AGL1

40 17 (42,5 %)

SHA016

40 4 (10 %)

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En el segundo experimento, el potencial de regeneración de los explantes inoculados con diferentes concentraciones de K599 desarmado no se diferenciaron significativamente los unos de los otros en este estudio.

Tabla 2. Potencial de regeneración de explantes inoculados con diferentes concentraciones de K599 desarmado

Repetición

DO 650:0 DO 650:0,125 DO 650:0,25 DO 650:0,5

1

8/10 8/10 9/10 3/10

2

10/10 8/10 8/10 6/10

3

3/10 4/10 9/10 9/10

5 En el tercer experimento, todos los explantes que se sacrificaron para la tinción histoquímica de GUS después de 35 días después de la inoculación mostraron expresión estable de GUS sobre los explantes de hoja (Fig. 4).

Se prepararon un total de 900 explantes de planta de semillero en el cuarto experimento, de los que 288 se inocularon con AGL1 (pBPSEW008) y 612 se inocularon con SHA017 (pSB1, pBPSEW008) (Tabla 3). En este estudio, se identificó un brote GUS+ (0,35%) de explantes inoculados con AGL y se identificaron 25 brotes GUS+

10 independientes (4,1%) de explantes inoculados con SHA017. De estos, diez de los brotes del tratamiento de SHA017 se desarrollaron en plantas T0 maduras. El análisis de Southern de las diez plantas T0 confirmó que cada planta fue un evento de transformación independiente basándose en los patrones de integración de ADN-T en el genoma de la planta. La herencia del ADN-T en las progenies T1 de una línea, 21-2, también se confirmó por hibridación Southern del ADN genómico de planta con sondas de los genes gus y bar (Fig. 15).

15 Tabla 3. Producción de brotes alargados y plantas gus+ de explantes de plantas de semillero inoculados con tanto la cepa AGL1 como SHA017 de Agrobacterium.

Experimento nº

Cepa de Agrobacterium Número de explantes inoculados Nº de explantes con brote alargado GUS+ Nº de plantas maduras GUS+

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AGL 35 0 0

E071304

SHA017 174 3 0

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AGL 104 0 0

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SHA017 93 5 3

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AGL 100 1 0

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SHA017 100 9 2

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AGL 27 0 0

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SHA017 108 0 0

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AGL 22 0 0

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SHA017 137 8 5

Ejemplo 4b: Transformación de Arabidopsis thaliana

Se cultivaron plantas de Arabidopsis thaliana (ecotipo Col-0) en tierra hasta que florecieron. Se quitaron flores

20 primarias para aumentar las flores en flores secundarias. Se transformaron cepas MP90 (GV3101 (pMP90); Koncz y Schell 1986), SHA001 y K599 no mutante de Agrobacterium con las construcciones de interés pBPSEW008 (SEC ID Nº: 15) y pBPSMM192b (SEC ID Nº: 16) y se cultivaron en 250 ml en medio LB líquido (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl (EM Science)) hasta que el cultivo alcanzó una DO650 de 1,2. Las células bacterianas se recogieron por centrifugación (15 minutos, 4.000 x g) y se resuspendieron en disolución de infiltración

25 (5 % de sacarosa, 0,05 % de SILWET L-77 [Lehle Seeds, Cat. nº VIS-02], 0,217 % de sales de MS [Sigma M5524]) a una DO650 de 0,8-0,9.

A continuación, las plantas de A. thaliana en florecimiento se transformaron por el procedimiento de inmersión floral (Clough y Bent 1998) con la cepa de Agrobacterium transgénica que lleva el vector descrito anteriormente sumergiendo durante 10-20 segundos en la disolución de Agrobacterium. Después, las plantas se mantuvieron en la 30 cámara de crecimiento hasta que las semillas pudieron recogerse. Se seleccionaron semillas transgénicas sembrando semillas esterilizadas en la superficie sobre medio de crecimiento (4,4 g/l de sales de MS [Sigma

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Erlenmeyer. Los matraces se agitaron durante la noche a 25 ºC hasta que la DO650 alcanzó 0,8. Antes de preparar los explantes de tomate, Agrobacterium se sedimentó por centrifugación durante 10 min a 5.500 x g a 20 ºC y se resuspendió en medio de co-cultivo líquido [1/10X sales principales de B5, 1/10X sales secundarias de B5, 1/10X MSIII hierro, 1X vitaminas B5, 3 % de sacarosa, MES 20 mM, acetosiringona 200 µM, GA3 0,72 µM, BAP 7,5 µM; pH 5,4] a la densidad deseada (por ejemplo, DO650 de 0,5) y se incubaron a temperatura ambiente 30 min.

Preparación de explantes

Se retiran cotiledones de plantas de semillero de aproximadamente 8 días de edad y se colocan sobre placa de Petri estéril. Se retiran ambos extremos de los cotiledones y se cortan por la mitad transversalmente, se transfieren sobre papel de filtro estéril con el lado adaxial hacia abajo y se colocan sobre el medio pre-cultivado [sales de MS y vitaminas, 16 g/l de glucosa, 0,1 mg/l de NAA, 1 mg/l de BAP, 0,7 % de agar purificado, pH 5,8] durante dos días en la oscuridad a 22 ºC.

Co-cultivo

El papel de filtro con los explantes se coloca sobre el medio de co-cultivo [sales de MS y vitaminas, 16 g/l de glucosa, 0,1 mg/l de NAA, 1 mg/l de BAP, 0,7 % de agar purificado, acetosiringona 150 µM, pH 5,8] y se inocula con suspensión de Agrobacterium (0,3-0,5 a DO650) durante dos a tres días en la oscuridad a 22 ºC.

Selección y regeneración de plantas

Al final del tercer día, los explantes se colocan con el lado abaxial hacia abajo sobre el medio de recuperación (1X sales de MS y vitaminas, 16 g/l de glucosa, 2 mg/l de zeatina, 0,7 % de agar purificado, 200 mg/l de Timentin) durante una semana a 25 ºC en la sala de cultivo (70 µE/m2s). Después de la recuperación, los explantes se transfieren sobre el medio de selección/regeneración (1X sales de MS y vitaminas, 30 g/l de sacarosa, 2 mg/l de zeatina, 0,7 % de agar purificado, 200 mg/l de Timentin, Pursuit 50-100 nM, pH 5,8) durante 2,5 semanas. Las yemas de los brotes en los callos se escinden de los cotiledones y se transfieren sobre el medio de alargamiento (1X sales de MS y vitaminas, 20 g/l de sacarosa, 0,5 mg/l de zeatina o 0,25 mg/l de IBA, 0,7 % de agar purificado, 200 mg/l de Timentin y Pursuit 50-100 nM) durante 2-3 semanas. Los brotes que se alargan se escinden de los callos y se colocan sobre el medio de enraizamiento (1X sales de MS y vitaminas, 20 g/l de sacarosa, 0,25 mg/l de IBA, 0,7 % de agar purificado, 100 mg/l de Timentin, Pursuit 50 nM, pH 5,8) durante 2-3 semanas hasta que las plántulas están listas para ser trasplantadas a la tierra.

Ensayos histoquímicos de GUS

Se evaluaron explantes de hoja para la actividad de GUS colocando en tinción histoquímica de GUS [Na2HPO4 80 mM (pH 8,0), Na2EDTA 8 mM, 0,8 % (v/v) de Triton-X, 1,6 % (v/v) de sulfóxido de dimetilo, 20 % (v/v) de metanol, K4Fe(CN)6 0,38 mM, sal de X-glucuro CHA 1 mM (Inalco, Milán, Italia)] durante 1 día a 37 ºC, después de lo cual el tejido de hoja se lavó en 70 % (v/v) de etanol y se limpió en el 95 % de etanol (Jefferson y col. 1987, Kosugi y col. 1990).

Se obtuvieron plántulas de tomate transgénicas usando la cepa K599 de Agrobacterium (SHA001) desarmada que contiene pBPSMM192b (SEC ID Nº: 16) (véase la Fig. 5).

Ejemplo 4e: Transformación mediada por Agrobacterium de Zea mays

Semillas de ciertas líneas endogámicas de maíz o líneas híbridas de maíz se germinan, enraízan y adicionalmente se cultivan en invernaderos. Las mazorcas de las plantas de maíz se recogen 8 a 14 (promedio 10) días después de la polinización (DAP) y se aíslan embriones inmaduros de las mismas. El momento preciso de la recogida varía dependiendo de las condiciones de crecimiento y la variedad de maíz. La longitud óptima de los embriones inmaduros para la transformación es aproximadamente 1 a 1,5 mm, que incluye la longitud del escutelo. El embrión debe ser translúcido, no opaco. Los embriones escindidos se recogen en medio líquido basado en MS (que comprende 1,5 mg/l de 2,4-D). Se añade acetosiringona (50 a 100 µM) al medio en tanto al mismo tiempo que la inoculación con Agrobacterium como justo antes de la infección con Agrobacterium.

Preparación de Agrobacterium: Se cultiva la cepa SHA017 (K599 [pRi2659Δ]) de Agrobacterium transformada con el plásmido de interés (pSB1/pBPSMM232; este plásmido es un plásmido quimérico resultante de la fusión de pBPSMM232 (SEC ID Nº: 17 [p-ZmUbi1::c-ZmAHASL/Xi12::t-ZmAHAS t-NOS::c-gusINT::p-ZmUbi1]) con pSB1 (Komari 1996) sobre medio YEP. La suspensión de Agrobacterium se agita con vórtex en el medio anteriormente indicado (que comprende medio de acetosiringona 100 µM durante preferentemente 1-2 horas antes de la infección).

Inoculación / co-cultivo: La suspensión bacteriana se añade al microtubo (placa) que contiene embriones inmaduros previamente empapados y se deja a temperatura ambiente (20-25 ºC) durante 5 a 30 minutos. Se elimina la suspensión bacteriana en exceso y los embriones inmaduros y las bacterias en el medio de residuo se transfieren a una placa de Petri. Los embriones inmaduros se colocan sobre el medio de co-cultivo con el lado plano hacia abajo (escutelo hacia arriba). La placa se sella y se incuba en la oscuridad a 22 ºC durante 2-3 días (medio de co-cultivo: MS-base, 1,5 mg/l de 2,4-D, AgNO3 15 µM, acetosiringona 100 µM). Alternativamente, los embriones inmaduros

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escindidos se ponen directamente sobre el medio de co-cultivo con el lado plano hacia abajo (escutelo hacia arriba). Se añade suspensión de células de Agrobacterium diluida a cada embrión inmaduro. La placa se sella y se incuba en la oscuridad a 22 ºC durante 2-3 días.

Recuperación: Después del co-cultivo, los embriones se transfieren a medio de recuperación (MS-base que comprende 1,5 mg/l de 2,4-D, 150 mg/l de Timentin) y se incuban las placas en la oscuridad a 27 ºC durante aproximadamente 5 a 7 días con el lado del escutelo hacia arriba.

Selección de callos transformados: Los embriones inmaduros se transfieren a medio de selección (medio de recuperación que comprende además el agente selectivo, por ejemplo, D-alanina en concentración de 0,3 a 30 mM) (escutelo hacia arriba) y se incuban en la oscuridad a 27 ºC durante 10-14 días (primera selección). Todos los embriones inmaduros que producen callos variables se subcultivan al 2-3º medio de selección. En esta etapa, se elimina cualquier raíz que se haya formado. La incubación se produce durante 2 semanas bajo las mismas condiciones para la primera selección (segunda selección). Los callos regenerables se escinden del escutelo (los callos regenerables son de color blanquecino, compactos, no limosos y pueden tener algunas estructuras similares a embrión) y se transfieren al 2-3º medio de selección fresco. Las placas se envuelven y se incuban en la oscuridad a 27 ºC durante 2 semanas (la 3ª selección puede no ser necesaria para la mayoría de los genotipos, los callos regenerables pueden transferirse a medio de regeneración).

Regeneración de plantas transformadas: Se escinden callos proliferados (blanquecinos que forman estructuras embrionarias) del mismo modo que para la 2ª/3ª selección y se transfieren a medio de regeneración (como medio de selección pero sin 2,4-D). Las placas se envuelven y se ponen a la luz (aprox. 2.000 lux) a 25 ó 27 ºC durante 2 semanas, o hasta que sean visibles estructuras similares a brotes. Transferencia a medio de regeneración fresco si fuera necesario. Se transfieren secciones de callos con brotes regenerados o estructuras similares a brotes a una Phytatray que contiene medio de enraizamiento y se incuban durante 2 semanas bajo la misma condición que la etapa anterior, o hasta que se hayan desarrollado plántulas enraizadas. Después de 2 a 4 semanas sobre medio de enraizamiento (medio MS semi-concentrado, sin 2,4-D, sin agente selectivo), los callos que todavía tienen regiones verdes (pero que no han regenerado plantas de semillero) se transfieren a Phytatrays de enraizamiento nuevas. Las plantas de semillero enraizadas se transfieren a tierra Metromix en el invernadero y se cubren cada una con cúpula de plástico durante al menos 1 semana, hasta que se hayan establecido las plantas de semillero. Cuando las plantas alcanzan las etapas de 3-4 hojas, se fertilizan con Osmocote y a continuación se pulverizan con agente selectivo (por ejemplo, D-alanina o D-serina) y se cultivan en el invernadero durante otras dos semanas. Las plantas no transgénicas deben desarrollar síntomas herbicidas o mueren en este momento. Las plantas supervivientes se trasplantan en macetas de 10'' con MetroMix y 1 cucharilla de té de Osmocote.

Ejemplo 5: Purificación, secuenciación y anotación del plásmido pRi2569Δ

Se cultivó la cepa SHA017 de Agrobacterium (K599 de Agrobacterium desarmada [pRi2659Δ]) en 5 litros de caldo LB a 28 ºC durante la noche. Se extrajo ADN total según un protocolo de lisis alcalina estándar, seguido de extracción con fenol-cloroformo (Sambrook y col. 1989). Se aisló ADN del plásmido pRi2659Δ del ADN total usando electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), con un sistema CHEF-DRIII (Bio-Rad, Cat. nº: 170-3695). El ADN total se cargó en un gel de agarosa certificado de campo pulsado al 1 % (Bio-Rad, Cat. nº: 162-0137) en 0,5x tampón TBE (Tris-borato 45 mM, EDTA 1 mM), seguido de PFGE a 6 V/cm, con tiempo de cambio inicial de 1 segundo y tiempo de cambio final de 25 segundos a 14 ºC durante 24 h. Después de la electroforesis, las tiras de gel que contenían el carril del marcador molecular y el borde del carril de muestra de ambos lados del gel se escindieron, se tiñeron con bromuro de etidio (Sigma) y se obtuvieron imágenes. Una banda visible resuelta estuvo en las tiras de gel y el resto del ADN quedó en el pocillo. La banda individual se escindió y se recuperó usando electroelución según Fu y Dooner (2000).

Se usó ADN recuperado como molde para la amplificación por PCR con cebadores específicos de pRi para confirmar la recuperación de ADN de pRi. Se diseñaron cebadores dentro de las regiones conservadas del gen vir de pRi1724 (nº de acceso de GenBank AP002086).

Cebador directo virG: 5'-TACTTCCTCC TCACGCACTC-3' (SEC ID Nº 27) Cebador inverso virB: 5'-GCCAGCAATG ATCAAGAATT TGTTT-3' (SEC ID Nº 28)

Podrían generarse fragmentos de pRi mediante procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia, tal como clonación con pistola de genes. La preparación de plásmido Ri podría digerirse individualmente con diversas enzimas de restricción comercialmente disponibles, tales como BamHI, SphI, EcoRI, HindIII (todas disponibles de New England Biolabs, Beverly, MA) y sub-clonarse en un vector tipo pUC similarmente digerido, tal como pBlueScript (Stratagene, La Jolla, CA). Entonces, podrían secuenciarse clones individuales, y ensamblarse secuencias individuales en cóntigos para generar el mapa de secuencia completo como se describe más adelante.

Se secuenció pRi2659Δ purificado según Margulies y col. (2005) y Sanger (1977). Se enmascaró la secuencia del vector usando cross_match (Green © 1994-1999) y los datos en bruto de la secuencia limpios se ensamblaron según Margulies y col. (2005) y CAP3 (Huang y Madan 1999). El hueco restante de la secuencia se llenó por amplificación por PCR y secuenciación posterior usando los siguientes cebadores:

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Cebador directo de PCR G109: 5'-TTGGTGCGAC AACTCCTCGG CG-3' (SEC ID Nº 29)

Cebador directo de PCR G112: 5'-GGTGAGCTCG ATCAGCTTCG GC-3' (SEC ID Nº 30)

Se realizaron reacciones de secuenciación en productos de PCR según Sanger (1977). Para el pulido final, la secuencia de borrador se dividió en 100 fragmentos teniendo cada fragmento un solapamiento de 50 bases extendidas a su fragmento de conjunción; las lecturas de la secuencia en bruto altamente idénticas a cada fragmento se reunieron y se reensamblaron con CAP3 a una alta rigurosidad. Estas secuencias consenso

5 ensambladas a partir de cada fragmento se ensamblaron con CAP3 de nuevo para generar los mapas de secuencia de pRi2659Δ (SEC ID Nº: 24), pRi2659Δtet (SEC ID Nº: 25) y pRi2659 (SEC ID Nº: 26) en Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad CA). La nueva secuencia de pRi2659 se anotó usando BLASTx a e-10 (Altschul y col. 1997) y la versión 148 de edición de datos de proteínas de GenBank Genpept.

Ejemplo 6: Proteínas codificadas por pRi2659Δ

10 La siguiente tabla (Tabla 4) enumera las proteínas probablemente codificadas por marcos de lectura abiertos en el plásmido pRi2659Δ (SEC ID Nº: 24). Se enumeran las SEC ID Nº de proteína (SINo) y una descripción detallada del aminoácido codificado.

Tabla 4: Marcos de lectura abiertos de pRi2659Δ y sus SEC ID Nº de proteína (SINo)

Característica

SINo Detalles

rcorf1

25 similar a la integrasa/recombinasa similar a mll6374, [Mesorhizobium loti MAFF303099]

rcorf2

124 similar a riorf1 en pRi1724, homólogo del gen orf3 en IS66

rcorf3

123 débilmente similar a mlr6097, proteína de control de la asimilación de nitrógeno [Mesorhizobium loti MAFF303099], COG0583 [K] Regulador de la transcripción

rcorf4

122 Extremo N similar a STH1062, similar a la proteína de unión a ATP del transportador ABC de glutamina [Symbiobacterium thermophilum IAM 14863]; extremo C similar a bll6362, proteína hipotética en Bradyrhizobium japonicum USDA 110, COG2079 [R] Proteína sin caracterizar que participa en el catabolismo del propionato

rcorf5

121 similar a Bcep02000339 [Burkholderia fungorum LB400], similar a blr3310, COG0765: proteína permeasa de transportador ABC [Bradyrhizobium japonicum USDA 110]

rcorf6

120 similar a COG0765 [Burkholderia fungorum LB400], similar a PSPTO5181, transportador ABC de cistina, proteína permeasa, putativa [Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000]

rcorf7

119 similar a COG0834 Burkholderia fungorum LB400 COG0834, similar a STH1060, proteína de unión al sustrato transportador ABC de glutamina [Symbiobacterium thermophilum IAM 14863]

rcorf8

118 similar a la proteína de utilización de hidantoína de C58 de A. tumefaciens hyuB

rcorf9

117 similar a la proteína de utilización de hidantoína de C58 de A. tumefaciens hyuA

rcorf10

116 similar a la proteína reguladora transcripcional [Bradyrhizobium japonicum USDA 110], represor transcripcional del operón de gluconato de hélice_giro_hélice

rcorf11

115 similar a riorf40 en pRi1724, un homólogo del gen hutH, cd01441: HAL; la histidina amoniaco-liasa (HAL) cataliza la primera etapa en la degradación de histidina a glutamato

rcorf12

114 débilmente similar a riorf20 en pRi1724, similar a la proteína hipotética Bcep02000338 [Burkholderia fungorum LB400].

rcorf13

26 débilmente similar a riorf22 en pRi1724, similar a la proteína hipotética Bcep02000337 [Burkholderia fungorum LB400]

rcorf14

27 probable gen transportador de cucumbopina, similar a riorf37 en pRi1724, un probable transportador de mikimopina

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(continuación)

Característica

SINo Detalles

rcorf15

164 similar a SMa2207, una proteína de unión a ATP del transportador ABC putativo [Sinorhizobium meliloti 1021], COG3842: PotA; sistemas de transporte de espermidina/putrescina tipo ABC, componente de ATPasas [transporte y metabolismo de aminoácidos]

rcorf16

28 similar a SMa2205 Sinorhizobium meliloti 1021 (cepa: 1021), un sistema de transporte de espermidina/putrescina tipo ABC COG1176 [E], componente de permeasa I

rcorf17

165 probable transportador de cucumbopina, similar a riorf34, una proteína hipotética [Agrobacterium rhizogenes] el probable gen transportador de mikimopina

rcorf18

126 similar a la proteína hipotética AGR_L_1821 [Agrobacterium tumefaciens str. C58], un homólogo del gen sdeB, cd01298: ATZ_TRZ_similar; la familia TRZ/ATZ contiene enzimas de la ruta de degradación de atrazina e hidrolasas relacionadas

rcorf19

29 similar a hutl, imidazolona-5-propionato hidrolasa [Agrobacterium tumefaciens str. C58], menos similar a riorf39 en pRi1724, ruta de KEGG: metabolismo de histidina 00340.

rcorf20

30 similar a riorf41 en pRi1724, una proteína hipotética

rcorf21

31 similar a riorf42 en pRi1724, un homólogo del gen hutU, una urocanasa, número EC 4.2.1.49

rcorf22

32 similar a proteína de función desconocida DUF886 [Mesorhizobium sp. BNC1] y menos similar a riorf43 en pRi1724, similar a gen desconocido próximo al gen hutR en Pseudomonas putida

rcorf23

33 similar al extremo C similar a la familia transposasa de IS30

rcorf24

134 similar a riorf51 en pRi1724, débilmente similar al gen mtrR de la familia reguladora bacteriana de tetR.

rcorf25

133 similar a riorf52 en pRi1724, similar la proteína de la familia de descarboxilasa MCA2182 [Methylococcus capsulatus str. Bath]

rcorf26

132 probable gen idi, similar a riorf53 en pRi1724, similar a idi, isopentenil-difosfato deltaisomerasa [Mycobacterium tuberculosis CDC1551] EC 5.3.3.2.

rcorf27

131 probable trans-zeatina sintasa, similar a riorf54 en pRi1724, EC 2.5.1.-.

rcorf28

130 probable gen GALLS, similar a riorf55 en pRi1724, complementa virE2, mecanismo desconocido, requerido para la transformación de plantas estable eficaz.

rcorf29

166 similar a riorf57 en pRi1724, un homólogo de eutC, cadena ligera de la etanolamina amoniaco-liasa

rcorf30

129 similar a riorf58 en pRi1724, un homólogo de eutB, cadena pesada de la etanolamina amoniaco-liasa

rcorf31

128 similar riorf59 en pRi1724, similar al gen orf3 en Methylobacterium extorquens, COG3931 [E] N-Formilglutamato predicho

rcorf32

34 similar a riorf60 en pRi1724, similar al gen gatA-1 [glutamil-ARNt amidotransferasa, subunidad A (gatA-1) Sulfolobus solfataricus P2]

rcorf33

167 similar a riorf61 en pRi1724, gen transportador ABC hipotético similar a PH0807, pfam00496: SBP_bac_5; proteínas de unión al soluto extracelulares bacterianas, familia 5

rcorf34

35 similar a riorf62 en pRi1724, gen transportador ABC hipotético similar al gen agaB, ácido agropínico permeasa, pfam00528: BPD_transp_1; Componente de la membrana interna del sistema de transporte dependiente de la unión a proteína

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(continuación)

Característica

SINo Detalles

rcorf35

36 similar a riorf63 en pRi1724, gen transportador ABC hipotético similar al gen dppC, pfam00528: BPD_transp_1; Componente de la membrana interna del sistema de transporte dependiente de la unión a proteína

rcorf36

37 similar a riorf64 en pRi1724, gen transportador ABC hipotético similar al gen moaD, ácido manopínico permeasa, COG1123: componente de ATPasas de diversos sistemas de transporte tipo ABC.

rcorf37

38 similar a riorf66 en pRi1724, similar al gen amaB, N-carbamoil-beta-alanina amidohidrolasa

rcorf38

168 similar a riorf67 en pRi1724, débilmente similar al gen pck, smart00587: CHK; ZnF_C4 y dominio HLH que contiene dominio de cinasas

roorf39

39 similar a riorf68 en pRi1724, débilmente similar al gen pck, pfam01633: Colina_cinasa; colina/etanolamina cinasa

rcorf40

40 similar a riorf69 en pRi1724, similar a MLCB1779.29 (probable gen monofosfatasa) en Mycobacterium leprae, cd01641: IMPasa_Bacteriana_similar_1; familia predominantemente bacteriana de fosfatasas dependientes de Mg++, relacionadas con inositol monofosfatasas

rcorf41

41 similar a riorf71 en pRi1724, gen quimiorreceptor hipotético similar al gen orf2 en pTi15955

rcorf42

137 similar a riorf73 en pRi1724, gen represor hipotético, similar a SMa2004 [Sinorhizobium meliloti 1021], regulador transcripcional de la familia ROK putativa.

rcorf43

136 similar a riorf73 en pR11724, similar a SMa2002 [Sinorhizobium meliloti 1021], COG2755 [E] Lisofosfolipasa L1 y esterasas relacionadas.

rcorf44

42 similar a riorf74, similar al gen teuB (proteína de unión al azúcar periplásmica), COG1879: RbsB; sistema de transporte de azúcar tipo ABC, componente periplásmico [transporte y metabolismo de hidratos de carbono].

rcorf45

43 similar a riorf75 en pRi1724, similar al gen teuA (transportador ABC de azúcar de unión a ATP), gen transportador ABC hipotético, COG1129: MgIA; sistema de transporte de azúcar tipo ABC, componente de ATPasa [transporte y metabolismo de hidratos de carbono].

rcorf46

44 similar a riorf76 en pRi1724, similar al gen teuC1 (transportador ABC de azúcarpermeasa), un gen transportador ABC hipotético, pfam02653: BPD_transp_2; sistema de transporte de aminoácidos de cadena ramificada / componente de permeasa.

rcorf47

45 similar a riorf77 en pRi1724, similar al gen teuC2 (transportador ABC de azúcarpermeasa), un gen transportador ABC hipotético, pfam02653: BPD_transp_2; sistema de transporte de aminoácidos de cadena ramificada / componente de permeasa.

rcorf48

46 similar a riorf78 en pRi1724, COG2755 [E] Lisofosfolipasa L1 y esterasas relacionadas.

rcorf49

169 similar a riorf79 en pRi1724, un homólogo del gen glpK (glicerol cinasa), EC 2.7.1.30.

rcorf50

47 similar a riorf80 de pRi1724, un homólogo del gen glpD, glicerol-3-fosfato deshidrogenasa [Agrobacterium tumefaciens str. C58]

rcorf51

48 similar a riorf81 en pRi1724, un homólogo del gen acs (acetil-CoA sintetasa), EC 6.2.1.1.

rcorf52

49 similar a riorf82 de pRi1724, un homólogo del gen adk, pfam00406: ADK; adenilato cinasa, EC 2.7.4.3.

rcorf53

50 similar a riorf83 en pRi1724, un gen quimiorreceptor hipotético similar al gen orf2 en pTi15955

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(continuación)

Característica

SINo Detalles

rcorf54

51 similar a riorf84, un homólogo del gen cbbF, cd00354: FBPasa; fructosa-1,6bisfosfatasa, una enzima que cataliza la hidrólisis de fructosa-1,6-bifosfato en fructosa6-fosfato y es crítica en la ruta de la gluconeogénesis.

rcorf55

52 homólogo del gen cbbA, a cd00947: TBP_aldolasa_IIB; tagatosa-1,6-bisfosfato (TBP) aldolasa y aldolasas de clase II tipo B relacionadas

rcorf56

53 similar a la cadena A de pdb, triosafosfato isomerasa de levadura (tri1)

rcorf57

54 similar a riorf88 en pRi1724 y al gen phrR, proteína de unión a ADN, familia XRE de hélice-giro-hélice.

rcorf58

55 similar a riorf89 en pRi1724 y al gen thcR, dominio conservado, HTH_ARAC; hélice_giro_hélice, proteína de control del operón de arabinosa

rcorf59

56 similar a riorf90 en pRi1724 y Atu6096 en pTiC58, conservada en especies de Mesorhizobium y Agrobacterium.

rcorf60

57 similar a riorf91 en pR11724, también similar a varias proteínas hipotéticas en especies de Agrobacterium, Mesorhizobium y Nitrobacter.

rcorf61

58 similar a riorf92 en pRi1724, proteína hipotética conservada en varias cepas de Agrobacterium y Mesorhizobium.

rcorf62

59 similar a riorf93, similar al gen jhp0928 en Helicobacter pylori, COG0827; una ADN metilasa específica de adenina [replicación, recombinación y reparación de ADN].

rcorf63

60 similar a la proteína de reparto de AGR_pTi_191 Agrobacterium tumefaciens str. C58, proteína de reparto, COG1475 [K] Reguladores transcripcionales predichos.

rcorf64

61 similar a la proteína hipotética MesoDRAFT_1041 [Mesorhizobium sp. BNC1], conservada en especies de Agrobacterium, Mesorhizobium y Nitrobacter.

rcorf65

170 similar riorf95 en pRI1724, similar a la región en la dirección 3' del gen nylA en pOAD2.

rcorf66

62 similar a la proteína hipotética MesoDRAFT_1043 [Mesorhizobium sp. BNC1], conservada en especies de Agrobacterium, Mesorhizobium y Nitrobacter.

rcorf67

63 similar a riorf96 en pRi1724, una proteína hipotética débilmente similar a la región en la dirección 3' del gen hydL en Tiocapsa roseopersicina.

rcorf68

64 similar a AGR_pTi_204 [Agrobacterium tumefaciens str. C58] y argG, argininosuccinato sintasa, de Streptomyces clavuligerus.

rcorf69

65 similar a riorf100 en pRi1724, similar al gen ardC en pSa (plásmido IncW) COG4227, probable proteína conjugal de transferencia (proteína anti-restricción).

rcorf70

66 similar a riorf101 en pRI1724, similar a mll9093 aspartato 1-descarboxilasa [Mesorhizobium loti MAFF303099] y el gen pgi en Xanthomonas citri, COG0853 [H] Aspartato 1-descarboxilasa.

rcorf71

67 similar a similar a riorf106 en pRi1724, similar al gen teuB en pRtrCFN299a, COG1879: RbsB; sistema de transporte de azúcar tipo ABC, componente periplásmico [transporte y metabolismo de hidratos de carbono].

rcorf72

68 similar a riorf107 en pRi1724, similar al gen mcpC (gen mcpC en Rhizobium) en Rhizobium leguminosarum, smart00283: MA; dominios similares a la quimiotaxis aceptora de metilo (transductor sensorial de la quimiotaxis).

rcorf73

171 similar a AGR_pTi_225 nucleasa [Agrobacterium tumefaciens str. C58], COG1525 [L] Homólogos de nucleasa microcócica (termonucleasa).

rcorf74

140 probable gen traG, similar a riorf109 en pRi1724, cd01126: TraG_VirD4; la familia TraG/TraD/VirD4 son proteínas de conjugación bacteriana.

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(continuación)

Característica

SINo Detalles

rcorf75

172 probable gen traD, proteína conjugal de transferencia similar a riorf110 en pRi1724.

rcorf76

139 probable gen traC, procesamiento de ADN conjugal del plásmido Ti, similar a riorf111 en pRi1724.

rcorf77

69 probable gen traA, similar a riorf112 en pRi1724, COG0507: RecD; exoDNasa dependiente de ATP (exonucleasa V), subunidad alfa -miembro I de la superfamilia helicasa [replicación, recombinación y reparación de ADN].

rcorf78

173 Probable gen traF, similar a riorf113 en Ri1724, COG4959: TraF; ruta secretora tipo IV, proteasa TraF [modificación postraduccional, renovación de proteínas, chaperonas / tráfico y secreción Intracelular].

rcorf79

70 probable gen traB, similar a riorf114 en pRi1724.

rcorf80

71 similar a riorf115 en pRi1724, una proteína hipotética de Agrobacterium rhizogenes (cepa: MAFF03-01724)

rcorf81

174 similar a riorf117 en pRi1724, una proteína hipotética de Agrobacterium rhizogenes (cepa: MAFF03-01724), cd00093: HTH_XRE; proteínas similares a la familia XRE de hélice-giro-hélice.

rcorf82

72 Probable gen traM similar a riorf118 en pRi1724, antagonista de TraR.

rcorf83

152 probable gen traR similar a riorf119 en pRi1724 y traR/AGR pTi 249 en pTiC58.

rcorf84

151 Probable gen trbl similar a riorf120 en pRi1724, pfam03743: Trbl; proteína similar a Trbl de conjugación bacteriana.

rcorf85

150 probable gen trbH similar a riorf121 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

rcorf86

149 probable gen trbG similar a riorf122 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

rcorf87

148 probable gen trbF similar a riorf123 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

rcorf88

147 probable gen trbF similar a riorf123 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

rcorf89

146 homólogo del gen trbK similar a riorf125 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

rcorf90

175 probable gen trbJ similar a riorf126 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti, COG5314; proteína de transferencia conjugal/exclusión de la entrada [tráfico y secreción intracelular].

rcorf91

145 probable gen trbE similar a riorf127 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

rcorf92

176 probable gen trbD similar a riorf128 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

rcorf93

144 probable gen trbC similar a riorf129 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

rcorf94

143 probable gen trbB similar a riorf130 en pRi1724, sistema de transferencia tipo IV requerido para la conjugación de plásmido Ri/Ti.

rcorf95

142 probable gen tral similar a riorf131 en pRi1724, reguladores de detección de cuórum tipo Luxl, sintetiza 3-oxooctanoilhomoserina lactona, pfam00765: Autoind_synth; Autoinductor sintetasa.

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Característica

SINo Detalles

rcorf96

73 probable gen repA similar a riorf132 Agrobacterium rhizogenes (cepa: MAFF03-01724), cd00550: ArsA_ATPasa; ATPasa de translocalización de oxianiones (ArsA) y cd00592: HTH_MERR; MERR regulador de la transcripción de hélice-giro-hélice, dominio del extremo N.

rcorf97

74 probable gen repB similar a riorf133 en pRi1724, smart00470: ParB; proteína de dominio de nucleasa similar a ParB.

rcorf98

75 probable gen repC similar a riorf134 en pRi1724, esencial para la replicación vegetativa.

rcorf99

76 similar a riorf135 en pRi1724, débilmente similar al gen y4aO en pNGR234a.

rcorf100

156 similar al extremo C de pA 22 Agrobacterium tumefaciens str. C58 (cepa: C58, cepa aislada: Cereon), COG0582 [L] Proteína integrasa.

rcorf101

155 similar al fragmento del extremo N de pA 22 Agrobacterium tumefaciens str. C58 (cepa: C58, cepa aislada: Cereon), COG0582 [L] Proteína integrasa.

rcorf102

154 similar al gen de integrasa hipotética orf2 (similar al gen similar a integrasa de Pseudomonas) en pTiA6NC.

rcorf103

77 similar al gen riorf137 en pRi1724 y el gen orf4 en pTiA6NC.

rcorf104

177 similar a riorf138 en pRi1724 y el gen gvp1 en pHH1, pfam04079: DUF387; proteína de reguladores transcripcionales putativos (similar a Ypuh).

rcorf105

78 similar a riorf139 en pRi1724, similar a la región sin caracterizar entre los genes y4jF y y4jG en pNGR234a.

rcorf106

79 similar riorf140 en pRi1724 y al gen orf300 en Escherichia coli, pfam00004: AAA; familia de ATPasa asociada a diversas actividades celulares (AAA).

rcorf107

80 similar al extremo N de riorf141 en pRi1724, una proteína hipotética.

rcorf108

178 similar al extremo C de riorf141 en pRi1724, una proteína hipotética.

rcorf109

81 débilmente similar a SERP1653 Staphylococcus epidermidis RP62A (cepa: RP62A), una proteína hipotética.

rcorf110

82 similar a riorf142 en pRi1724, similar al gen para el exón 6 de la proteína de unión luminal en Arabidopsis thaliana.

rcorf111

83 similar a riorf143 en pRi1724 y al gen spdB3 en pSG5.

rcorf112

84 similar a riorf144 en pRi1724.

rcorf113

179 débil similar durante 79 aa a blr8180 de Bradyrhizobium japonicum USDA 110 (cepa: USDA 110), COG1760 [E] L-serina desaminasa.

rcorf114

85 gen virF putativo, similar a riorf146 en pRI1724 y tiorf133 en pTiSAKURA.

rcorf115

159 similar a riorf147 en pRi1724 y el gen y4mC en homólogo de pNGR234a, un gen inducido por vir.

rcorf116

158 probable proteína de captación de potasio, similar a Atu0711 iAgrobacterium tumefaciens str. C58 y riorf148 en pRi1724 y al gen kup, pfam02705: K_trans; proteína transportadora de potasio K+.

rcorf117

86 similar a riorf149 en pRi1724, similar al extremo N. aatA (atu2196) aspartato aminotransferasa A [Agrobacterium tumefaciens str. C58].

rcorf118

180 similar a riorf150 en pRi1724, gen aatA en homólogo de Rhizobium leguminosarum, pseudogén hipotético que se divide por desplazamiento del marco.

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Característica

SINo Detalles

rcorf119

87 probable virH, similar a riorf151 en pRi1724, oxidasa tipo citocromo P450, probablemente proteína secretada tipo IV mediante virB/D4.

rcorf120

88 probable virA, similar a riorf152 en pRi1724, receptor en el sistema regulador virA/G de dos componentes.

rcorf121

89 probable virB1, similar a riorf153 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

rcorf122

181 probable virB2, similar a riorf154 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

rcorf123

90 probable virB3, similar a riorf155 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

rcorf124

182 probable virB4, similar a riorf156 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

rcorf125

91 probable virB5, similar a riorf157 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

rcorf126

92 probable virB6, similar a riorf158 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

rcorf127

93 probable virB7, similar a riorf159 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

rcorf128

183 probable virB8, similar a riorf160 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

rcorf129

94 probable virB9, similar a riorf161 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

rcorf130

184 probable virB10, similar a riorf162 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

rcorf131

95 probable virB11, similar a riorf163 en pRi1724, sistema de secreción tipo IV requerido para la transferencia del complejo T.

rcorf132

96 probable virG, similar a riorf164 en pRi1724, activador en el sistema regulador virA/G de dos componentes.

rcorf133

97 proteína hipotética, similar a aa1-103 de ISBm1 transposasa orfB [Brucella suis 1330] (NP 697552).

rcorf134

163 proteína hipotética, similar a aa4-122/142 de ISBm1 transposasa orfA [Brucella suis 1330] (NP 697551).

rcorf135

162 probable virC2, similar a riorf165 en pRi1724, proteína regulada por virulencia virA/G del procesamiento de ADN-T.

rcorf136

161 probable virC1, similar a riorf166 en pRi1724, proteína regulada por virulencia virA/G, AGR_pTi_18p; VirC1; se une a secuencia multiplicadora adyacente a el límite derecho de ADN-T; aumenta el nivel de procesamiento de ADN-T.

rcorf137

98 probable virD1, similar a riorf167 en pRi1724, una proteína accesoria de endonucleasa del límite de ADN-T regulada por virA/G.

rcorf138

99 probable virD2, similar a riorf168 en pRi1724, la endonucleasa del límite de ADN-T regulada por virA/G.

rcorf139

185 probable virD3, similar a riorf169 en pRi1724, regulada por virA/G, no requerida para virulencia, posible factor de variedad de huéspedes.

5

10

15

20

25

30

35

40

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20-07-2015

(continuación)

Característica

SINo Detalles

rcorf140

100 probable virD4, similar a riorf170 en pRi1724, componente regulado por virA/G del sistema de secreción tipo IV virB/D4.

rcorf141

186 probable virD5, similar a riorf171 en pRi1724, componente regulado por virA/G del sistema de secreción tipo IV virB/D4.

rcorf142

101 probable virF, similar a riorf172 en pRi1724, y menos similar a tiorf133 en pTi-SAKURA, una proteína de secreción de tipo IV mediante el complejo de virB/D4.

rcorf143

102 probable virE3, similar a riorf173 en pRi1724 y virE3 en pRiA6NC, interacciona con virE2 y IMPA1 (AtKAP-alfa) en A. tumefaciens, proteína secretada de tipo IV de virB/D4.

rcorf144

103 similar a Mesorhizobium loti MAFF303099 mlr1626, manosa-6-fosfato isomerasa predicha.

rcorf145

104 similar a integrasa de fago

rcorf146

187 similar a Y4rB Rhizobium sp. NGR234.

REFERENCIAS

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Nº de acceso de GenBank M63985

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Nº de acceso de GenBank U09118

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Nº de acceso de GenBank U09119

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Nº de acceso de GenBank U38846, nucleótidos 3862 a 5325 o incluso 5342

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US 5.106.739

224.

US 5.187.267

225.

US 5.225.341

226.

US 5.352.605

227.

US 5.416.011

228.

US 5.463.175

229.

US 5.504.200

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US 5.565.350

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WO 91/13980

271.

WO 91/13991

272.

WO 92/16635

273.

WO 93/01294

274.

WO 93/07278

275.

WO 93/21334

276.

WO 93/21334

277.

WO 94/02620

278.

WO 94/21794

279.

WO 95/15389

280.

WO 95/19443

281.

WO 95/23230

282.

WO 96/12814

283.

WO 97/41228;

284.

WO 98/18940

285.

WO 98/22593

286.

WO 98/45456

287.

WO 98/45461

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Claims (1)

1. imagen1

   imagen2