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ES2541614T3 - Método de selección de agentes que mejoran la piel seca asociada con la dermatitis atópica empleando la actividad de bleomicina hidrolasa como medida - Google Patents

Método de selección de agentes que mejoran la piel seca asociada con la dermatitis atópica empleando la actividad de bleomicina hidrolasa como medida Download PDF

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ES2541614T3
ES2541614T3 ES10834616.4T ES10834616T ES2541614T3 ES 2541614 T3 ES2541614 T3 ES 2541614T3 ES 10834616 T ES10834616 T ES 10834616T ES 2541614 T3 ES2541614 T3 ES 2541614T3
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Yayoi Kamata
Mami Yamamoto
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Shiseido Co Ltd
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Abstract

Un método in vitro para seleccionar y evaluar mejoradores de la piel seca causada por la dermatitis atópica que se lleva a cabo en células cultivadas, que comprende: evaluar un fármaco candidato como un mejorador de la piel seca causada por la dermatitis atópica en el caso de que el fármaco candidato aumente significativamente la expresión y/o la actividad de la bleomicina hidrolasa en comparación con un fármaco de control, donde la expresión y/o la actividad de la bleomicina hidrolasa se considera que ha aumentado significativamente en el caso de que la actividad de la transcripción de un gen que codifica la bleomicina hidrolasa ha aumentado significativamente en comparación con la de un control, y donde la actividad de la transcripción se considera que ha aumentado significativamente en el caso de que la actividad de unión de los factores de transcripción MZF-1, Sp-1 y/o GATA-1 a la región reguladora de la transcripción de un gen que codifica la bleomicina hidrolasa ha aumentado significativamente en comparación con la de un control.

Description

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Cuando se utiliza en la presente descripción, "aumenta significativamente la expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa en comparación con un fármaco de control" se refiere al caso en el que el nivel de expresión medido, la actividad de la bleomicina hidrolasa o ambas es de 120% o más , 150% o más, o 200% o más, respectivamente, en comparación con un fármaco que no tiene un efecto de mejora sobre la piel seca, y particularmente un efecto de mejora sobre la piel seca causada por la dermatitis atópica.
Según la presente invención el aumento de la expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa se logra mediante el aumento de la actividad de la transcripción de un gen que codifica la enzima. Una región flanqueante 5' de un gen que codifica la bleomicina hidrolasa, y en particular una región reguladora de la transcripción, y los factores de transcripción que se unen a esa región, se muestran en la figura 11. La región reguladora de la transcripción mencionada anteriormente tiene una región que se extiende de 216 pb a 1216 pb aguas arriba de la secuencia que codifica la enzima. La región reguladora de la transcripción contiene preferiblemente una región que se extiende 816 pb aguas arriba desde el punto de vista de obtener un alto nivel de actividad de la bleomicina hidrolasa.
Una región que se extienda al menos 216 pb aguas arriba de la secuencia que codifica la bleomicina hidrolasa tiene que estar incluida para expresar esta enzima. Entre los factores de transcripción descritos en la figura. 11, se cree que la expresión de la bleomicina hidrolasa se aumenta incrementando las actividades de unión de IRF-1, IRF-2, MZF-1, Sp-1 y GATA-1 contenidas en esta región. De hecho, cuando la expresión de la bleomicina hidrolasa se incrementa irradiando con luz ultravioleta (UV) (datos no mostrados), se observa una correlación entre los niveles de expresión de MZF-1 y GATA-1 y la intensidad de UV y el tiempo de irradiación (figura 13).
Aquí, en el caso de que la actividad de transcripción de un gen que codifica la bleomicina hidrolasa, es decir la actividad de unión del factor de transcripción MZF-1, Sp-1 y/o GATA-1 a la región reguladora de la transcripción de ese gen, se aumente significativamente por un fármaco candidato, en 120% o más , 150% o más o 200% o más, respectivamente, en comparación con un fármaco de control, el nivel de expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa se puede considerar que aumenta significativamente.
La expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa también se ve afectada por las citoquinas. Por ejemplo, la interleuquina-4 (IL-4), que se sabe que está implicada en la dermatitis atópica y es una citoquina de tipo Th2, regula a la baja la expresión de la bleomicina hidrolasa. Esto coincide con el bajo nivel de expresión de la bleomicina hidrolasa observado en la piel de pacientes con dermatitis atópica. Por otro lado, el interferón-γ, que es una citoquina Th1 típica que tiene la acción opuesta de IL-4 de inhibir la producción de IgE, aumenta significativamente la expresión de bleomicina hidrolasa. Además, el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), que es una citoquina Th2 representativa de citoquinas inflamatorias, también aumenta significativamente la expresión de esta enzima. Además de estas sustancias, la expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa también se aumenta por la irradiación UV. Aunque los resultados de los mismos no se muestran, se ha confirmado que la actividad de la bleomicina hidrolasa en la piel de las mejillas o en otra zona en el cuerpo susceptible a la irradiación ultravioleta aumenta por irradiación UV.
La presente solicitud además proporciona un método para mejorar o prevenir la piel seca causada por dermatitis atópica aumentando significativamente la expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa en el tejido de la piel.
En el método para mejorar o prevenir la piel seca causada por la dermatitis atópica, se aumenta significativamente la expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa en la piel en comparación con, por ejemplo, la expresión y/o actividad en la piel antes de someterse a este método de tratamiento. "Aumenta significativamente" se refiere al caso en el que, por ejemplo, la expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa sean de un valor de 120% o más, 150%
o más o 200% o más.
En el método, se usa un fármaco arbitrario que aumenta significativamente la expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa. Además, no hay limitaciones sobre el fármaco siempre que aumente la expresión y/o actividad de esta enzima. El fármaco y similares utilizados en el método se pueden aplicar a la piel de forma arbitraria siempre que se pueda aplicar a la piel y sea capaz de lograr el objeto de la presente invención, y el fármaco se puede aplicar solo o se puede aplicar mediante la incorporación de otros componentes arbitrarios. Además, no hay limitaciones en la ubicación de la piel donde se aplica el fármaco, e incluye cualquier piel en la superficie del cuerpo, incluyendo el cuero cabelludo.
En un segundo aspecto de la misma, la presente invención proporciona un método ex vivo para diagnosticar la predisposición a la piel seca causada por la dermatitis atópica, que comprende determinar una tendencia hacia la piel seca causada por la dermatitis atópica en el caso de que la expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa en el tejido de la piel se reduzca significativamente en comparación con la de la piel de control, mientras se determina la ausencia de una tendencia a la piel seca causada por la dermatitis atópica si es igual o mayor que la de la piel control. El método se lleva a cabo como se describe en las reivindicaciones adjuntas.
El que la piel de un sujeto esté seca o no se puede considerar basándose en la subjetividad del sujeto o el médico y similares, o se puede considerar objetivamente midiendo el contenido de humedad de la piel usando un analizador de humedad de la superficie de la piel. Por ejemplo, como se explica en el experimento 3 de la presente descripción, si un sujeto tiene la piel seca o no también se puede considerar según la subjetividad de un sujeto basándose en la grasa, la susceptibilidad al secado y similares según el diagrama de flujo descrito en la figura 6.
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Aunque la piel seca se puede evaluar fácilmente, considerar si la piel de un sujeto está predispuesta a la piel seca causada por la dermatitis atópica puede ser difícil. Según el método ex vivo de diagnóstico de la presente invención, se puede hacer un diagnóstico no sólo del estado actual de la piel de un sujeto, sino también en cuanto a si el sujeto es susceptible a la piel seca causada por la dermatitis atópica o no.
"La expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa en el tejido de la piel se reduce significativamente en comparación con la de la piel de control" se refiere al caso en el que la expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa medida es del 80% o menos, 70% o menos, 60% o menos, 50% o menos, 30% o menos o 10% o menos en comparación con, por ejemplo, "piel de control" normal que se considera piel húmeda por un médico desde una perspectiva dermatológica. "Igual o mayor que el de la piel de control" se refiere al caso en el que la expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa medida es, por ejemplo, 80% o más, 90% o más o 100% o más en comparación con, por ejemplo, "piel de control" normal que se considera piel húmeda por un médico desde una perspectiva dermatológica.
Aunque la toma de una muestra de la capa córnea de la piel para servir como un espécimen se puede llevar a cabo mediante un procedimiento arbitrario, es preferible "tape stripping" desde el punto de vista de la conveniencia. "Tape stripping" se refiere a un método por el cual una muestra de la capa córnea se recoge mediante la adhesión de un trozo de cinta adhesiva sensible a la presión a la capa superficial de la piel y despegando la cinta de modo que la capa córnea de la piel se adhiere a la cinta adhesiva sensible a la presión despegada. El uso del método de "tape stripping" hace que sea posible medir la expresión y la actividad de la bleomicina hidrolasa simplemente mediante el muestreo de la capa córnea con un sol trozo de la cinta, lo que permite evaluar de forma no invasiva la piel seca causada por la dermatitis atópica utilizando la bleomicina hidrolasa como indicador. En un método preferible que emplea "tape stripping", la capa superficial de la piel se limpia primero con etanol, por ejemplo, para eliminar la materia sebácea, la suciedad y similares, se coloca suavemente una pieza de cinta adhesiva sensible a la presión cortada con un tamaño adecuado (como 5 cm x 5 cm) sobre la superficie de la piel, se presiona todo el trozo de cinta sobre la superficie de la piel mediante la aplicación de una presión uniforme, y se despega posteriormente la cinta adhesiva sensible a la presión mientras se aplica una fuerza uniforme. La cinta adhesiva sensible a la presión puede ser una cinta de celofán disponible comercialmente, y ejemplos de cinta adhesiva sensible a la presión que se pueden usar incluyen Scotch Super Strength Mailing Tape (3M) y cinta de celofán (CelloTape®, Nichiban).
A continuación se proporciona una explicación más detallada de la presente invención haciendo una lista de ejemplos específicos de la misma. Además, la presente invención no se limita por estos ejemplos específicos.
Ejemplos
Se utilizaron los siguientes materiales en los experimentos.
La calpaína I se adquirió de EMD Biosciences Inc. La bleomicina hidrolasa se preparó a partir de la capa córnea epidérmica humana según el documento no patente 5. La IL-4 y la IFN-γ humanas se adquirieron de Peprotech EC (Londres, Inglaterra). La IL-13 y la IL-17A/F humanas se produjeron por R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN). La citrulina-4-metilcoumaril-7-amida (Cit-MCA) se adquirió de Bachem Bioscience Inc. (Bubendorf, Suiza). Se utilizaron productos de grado reactivo para todas las otras sustancias químicas utilizadas.
El cultivo de queratinocitos
Los queratinocitos epidérmicos humanos normales derivados de epidermis neonatal (Kurabo, Osaka, Japón) se cultivaron en un medio EpiLife (Cascade Biologics, Portland, OR) que contiene baja concentración (0,03 mM) de calcio y el suplemento de crecimiento HKGS (Cascade Biologics). Todas las células se incubaron a 37°C mientras se les suministra 5% de CO2 y se utilizaron dentro de 4 conductos. Las células se recogieron con una confluencia de 70%, con una confluencia de 100%, 2 días después de la confluencia y 2 días después de la confluencia en calcio 2 mM.
Experimento 1
Se cree que la bleomicina hidrolasa actúa en la etapa final de la producción de NMF. En este caso, existe la posibilidad de que la expresión de esta enzima disminuya en la piel seca. En este experimento, se realizó un estudio para saber si una disminución de la expresión y/o actividad de la bleomicina hidrolasa en la piel estaba relacionada con la piel seca o no.
Se recogieron muestras de la capa córnea epidérmica por “Tape stripping” que consiste en adherir cinta adhesiva transparente sensible a la presión (CelloTape®, Nichiban) a una superficie de la piel en el brazo y continuación despegar la cinta. La cinta adherida con la capa córnea epidérmica se cortó en trozos, se sumergió en un amortiguador de extracción (Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0), NaCl 0,14 M, 0,1% de Tween-20, 1 ml), y se sometió a tratamiento ultrasónico para preparar un extracto de la capa córnea. Entonces se sometió el extracto de capa córnea a un ensayo de inmunotransferencia. El anticuerpo anti-bleomicina hidrolasa (BH) utilizado se preparó según el método de Kamata, et al. (Journal of Biological Chemistry, 2009). Más específicamente, el extracto de la capa córnea se sometió a electroforesis en SDS seguido de transferencia a Immobilon-P (Millipore), y tras lavar la película transferida, se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo anti-BH. Tras retirar el anticuerpo mediante lavado adicional, se permitió que la película reaccionase con el anticuerpo secundario unido a
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En base a los resultados de este experimento, se puede determinar que tanto los niveles de aminoácidos libres como la función de barrera disminuyen significativamente en el caso de una cantidad absoluta baja de bleomicina hidrolasa. Aunque no se muestran los datos, incluso en el caso de usar un extracto de capa córnea obtenido de la mejilla, se confirmó que existe una relación proporcional entre la cantidad de bleomicina hidrolasa y la función de barrera.
Experimento 3
En este experimento, se realizó una encuesta entre las estudiantes mencionadas en base al diagrama de flujo mostrado en la figura 6, y la piel de las estudiantes se clasificó dentro de una de las cuatro categorías que consisten en piel húmeda, piel seca, piel grasa seca y piel grasa. Los resultados de este estudio y la correlación con los resultados para los parámetros de la piel medidos en el Experimento 2 antes mencionado se muestran en la figura 7. En base a la figura 7, se determinó que la actividad de la bleomicina hidrolasa de las estudiantes clasificadas como que tenían la piel grasa seca era significativamente alta.
Experimento 4
En este experimento, se hizo un estudio de la localización de la bleomicina hidrolasa y la filagrina en la piel.
Tinción inmunohistoquímica
La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo según el método de Kamata, et al. (J. Biol. Chem., Vol. 284, Issue 19, 12829-12836, May 8, 2009). Para las muestras se utilizaron secciones congeladas de piel humana que tienen un espesor de 5 µm e IgG anti BH de rata. Más específicamente, las muestras de piel humana se obtuvieron de pacientes que padecen dermatitis atópica en la Universidad Médica de Tokio tras obtener el consentimiento informado. Este estudio fue aprobado por “Tokyo Medical University Institutional Review Board” y “Shideido Special Subcommettee” en relación con la ética humana.
Se incubaron las secciones de dermatitis atópica humana (piel afectada y piel no afectada) y la piel normal durante 1 hora a temperatura ambiente con IgG anti BH de rata e IgG anti filagrina humana, seguido de lavado con PBS y posterior incubación con un anticuerpo secundario unido a un fluorescente en la forma de Alexa Fluor 555 o 488 (Molecular Probes Inc., Eugene, OR). Se utilizó DAPI (4',6'-diamino-2-fenilindol, de Molecular Probes) para visualizar el núcleo.
Los resultados de la tinción de tejidos de piel normal se muestran en la figura 8, mientras que los resultados de la comparación de la piel de un sujeto sano (piel normal) y la piel de un paciente con dermatitis atópica (zona de la erupción atópica) se muestran en la figura 9. Como se muestra en la figura 8, se demostró que la bleomicina hidrolasa se expresaba mucho en la capa superior de la epidermis y se localizaba de la misma manera que la filagrina. Por otro lado, en las zonas de erupción atópica, la expresión de la bleomicina hidrolasa y de la filagrina era baja en comparación con la piel normal (Fig. 9).
PCR cuantitativa
El nivel de expresión de la bleomicina hidrolasa en los queratinocitos se midió por PCR cuantitativa usando el método descrito a continuación. La medida se llevó a cabo utilizando el Light Cycler 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), mientras que se utilizó el Light Cycler FastStart DNA Master CYBR Green I para el reactivo. Se añadieron alícuotas de 0,6 µl de cada uno de cebadores de la bleomicina hidrolasa y 6,8 µl de agua a 10 µl de mezcla maestra de SYBR Green I para llegar a un volumen total de 20 µl seguido de llevar a cabo 45 ciclos de PCR consistentes en 15 segundos a 95°C, 20 segundos a 55°C y 20 segundos a 72°C. Los resultados obtenidos se corrigieron mediante la comparación con los resultados para un gen constitutivo en forma de G3PDH.
Cebador directo: TGTGGTTTGGCTGTGATGTT (SEQ ID NO. 1).
Cebador inverso: GCACCATCCTGATCATCCTT (SEQ ID NO. 2).
Los resultados de la PCR cuantitativa anteriormente mencionada se presentan en la figura 10. Como se muestra en la figura 10, la bleomicina hidrolasa se expresó más en los queratinocitos que habían alcanzado la confluencia, es decir los queratinocitos diferenciados, en comparación con los queratinocitos con 80% de confluencia, es decir los queratinocitos no diferenciados. En otras palabras, en base a los resultados de este experimento, se determinó que esta enzima no se expresa a niveles altos en células basales antes de la diferenciación. Los resultados de esta PCR cuantitativa apoyan los resultados obtenidos en la tinción de tejidos antes mencionada.
Experimento 5
1) Ensayo de luciferasa de promotores de BH usando queratinocitos epidérmicos humanos
Se añadió un amortiguador de lisis (200 µl) a los queratinocitos en fase proliferativa (aprox. 80% de confluencia) o a los queratinocitos diferenciados (tras alcanzar la confluencia, se exponen al aire y se añade calcio 2 mM continuándose el cultivo durante 2 días) para lisar las células. Se utilizó el sistema de ensayo de luciferasa Bright
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Glo (Promega Co., Madison, WI, USA) para la medición. Se transfirieron 20 µl de muestra a un tubo determinado seguido de la medición utilizando Auto Lumat Plus (LP9538, Berthold GmbH & Co., KG, Bad Wildbad, Germany). Según los resultados mostrados en la figura 12, se determinó que con el fin de expresar la bleomicina hidrolasa, la región reguladora de la transcripción mencionada anteriormente debe tener una región que se extiende al menos 216 pb aguas abajo de la secuencia que codifica la enzima.
2) La irradiación UV de NHEK
Se recogió el ARN por un método determinado a las 3 horas, 24 horas y 48 horas posteriores a la irradiación con UVB a 30 mJ o 60 mJ (Torex F120S-E-30/DMR, 20 W, Toshiba Medical Supply), y se midieron los niveles de expresión del ARNm de la bleomicina hidrolasa y de la calpaína por PCR cuantitativa. Como resultado, la muestra recogida 48 horas después de irradiar a 30 mJ expresó el nivel más alto de bleomicina hidrolasa (Figura 13).
3) Efecto de citoquinas en la expresión de Bleomicina
Se añadieron IL-4 (concentración final: 0,1, 1,0 o 10 ng/ml), TNF-α (concentración final: 0,1, 1,0 o 10 ng/ml) e IFN-γ (concentración final: 1,0, 10 o 100 ng/ml) respectivamente a queratinocitos cultivados en fase proliferativa, y tras incubar durante 24 horas, se recogió el ARN utilizando Isogen. La expresión del ARNm de la bleomicina hidrolasa se midió por PCR cuantitativa. Los resultados se muestran en la figura 14. Según los resultados mostrados en la figura 14, se determinó que la interleucina-4 (IL-4), que es un tipo de citoquina Th2, regula a la baja la expresión de la bleomicina hidrolasa.
Experimento 6 (IRF-1/2 se muestran por razones de comparación)
Caracterización del gen de BH humana
1) Clonación de la región flanqueante 5' de BH
Se amplificó la región flanqueante 5' de BH según la secuencia de nucleótidos del gen de BH humana utilizando el kit Genome Walker (Clontech, Mountain View, CA) según el protocolo del fabricante usando un cebador específico del gen 1 (GSP1) que tiene la secuencia 5'-tcctcgagtctgtatcagagcagctaca-3' (SEQ ID. NO 3) y un cebador específico del gen 2 (GSP) que tiene la secuencia 5'-tgaacacgcgtccgagctgctcatggcg-3' (SEQ ID NO. 4). En resumen, la PCR primaria se llevó a cabo utilizando Ex Taq ADN polimerasa (Takara, Shiga, Japan) en presencia de 5% de dimetilsulfóxido usando GSP1 y un cebador adaptador (AP) 1 y utilizando un protocolo de PCR de dos etapas recomendado por el fabricante que consiste en 7 ciclos de 25 segundos a 94°C y 4 minutos a 72°C seguido de 32 ciclos de 25 segundos a 94°C y 4 minutos a 67°C, y finalmente elongación durante 4 minutos a 67°C. A continuación, la mezcla de la PCR primaria se diluyó y se usó como molde de la amplificación de PCR secundaria usando GSP2 y AP2. La PCR secundaria se llevó a cabo de la misma manera que la PCR primaria con la excepción de que se usan 5 ciclos en lugar de 7 ciclos para el número de ciclos iniciales y se usan 20 ciclos en lugar de 32 ciclos para el número de ciclos posteriores. Se produjeron mutantes de deleción 5' continuos de la región flanqueante 5' de BH por PCR utilizando los cebadores mostrados en la figura 15. Después de la amplificación, todos los productos de PCR se clonaron en un Vector pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI) seguido por la determinación de la secuencia utilizando el ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Con el fin de construir un plásmido reportero pGL3-1216/+1, se llevó a cabo la PCR bajo las condiciones de 30 ciclos de desnaturalización inicial durante 4 minutos a 94°C, 30 segundos a 94°C y 1 minuto a 72°C seguida de elongación final durante 4 minutos a 72°C usando como plantillas pGEM-T-1216/+1 junto con un par de cebadores específicos de BH (5'-ccgggtaccatcagagttccttagaa-3' (SEQ ID NO. 5) y 5'-taaatacgcgttggcgcccacgctgccg-3' (SEQ ID NO. 6)) que contiene los sitios de restricción KpnI y MluI. La mezcla de PCR resultante se digirió con KpnI y MluI y se clonó en el vector pGL3-Basic (Promega). Además, el vector pGL3-Basic contiene el gen de la luciferasa de luciérnaga. Todas las construcciones se prepararon usando el kit Qiagen Plasmid Midi (Qiagen, Dusseldorf, Germany).
2) Mutagénesis dirigida
La mutagénesis de los sitios de unión MZF-1, Sp-1 y IRF-1/2 se llevó a cabo mediante el kit Quick Change Site-Directed Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA) según el protocolo del fabricante. Se utilizaron los cebadores que consisten en 5'-ggaccccgtttcagcctccccgcc-3' (SEQ ID NO.7) (cebador directo del sitio Sp-1 mutante) y 5'ggcggggaggctgaaacggggtcc-3' (SEQ ID NO. 8) (cebador inverso del sitio Sp-1 mutante) para producir una mutación por deleción en Sp-1. Se utilizaron los cebadores que consisten en 5'-gactcagcaacgcggttttgtccctccgc-3' (SEQ ID NO. 9) (cebador directo del sitio MZF-1 mutante) y 5'-gcggagggacaaaaccgcgttgctgagtca-3' (SEQ ID NO. 10) (cebador inverso del sitio MZF-1 mutante) para el MZF-1 mutante. Se utilizaron los cebadores que consisten en 5'gccgccgagcctccggcgctcc-3 '(SEQ ID NO. 11) (cebador directo del sitio IRF-1/2 mutante) y 5'ggagcgccggaggctcggcggc-3' (SEQ ID NO. 12) (cebador inverso del sitio IRF-1/2 mutante) para el IRF-1/2 mutante.
3) Transfección y medición de la actividad del promotor
Los queratinocitos se cultivaron en una placa de cultivo tisular de 12 pocillos con una densidad de 5 x 104 células/pocillo, y se transfectaron usando el reactivo de transfección FuGene HD (Roche Diagnostics, Basel,
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4) Análisis de RT-PCR cuantitativa en tiempo real
Se analizaron los niveles de transcripción de BH y factores relacionados mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. El ARN total se extrajo a partir de células cultivadas utilizando Isogen (Nippon Gene, Tokio, Japan) según el protocolo del fabricante. El ARN total se transcribió de forma inversa a ADNc utilizando SuperScript™ II (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se llevó a cabo la RT-PCR en tiempo real con el sistema LightCycler Raid Cycler usando el LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics) según el protocolo del fabricante. La información relativa a los cebadores utilizados se muestra en la figura 16. Se utilizó gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como gen de referencia. La especificidad de los fragmentos amplificados se confirmó por medio del análisis cuantitativo de las curvas de fusión utilizando el software de análisis LightCycler. Se normalizaron las cantidades de ARNm en base al ARNm de GAPDH y, finalmente se indicó como porcentaje del ARNm de un control no tratado.
5) Inhibición de IRF-1 e IRF-2 basada en ARNsi
Los queratinocitos cultivados se transfectaron utilizando Lipofectamine RNAi Max (Invitrogen, Carlsbad, CA) con 40 nM de IRF-1ip, IRF-2ip y siCONTROL A (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) según el protocolo del fabricante. Posteriormente las células fueron cultivadas durante 24 horas en un medio sin anticuerpos, seguido de la extracción del ARN total y el análisis por RT-PCR en tiempo real en la forma descrita anteriormente.
6) Análisis del cambio en la movilidad electroforética (EMSA)
Se prepararon las sondas bicatenarias de los oligonucleótidos por alineamiento de los oligonucleótidos monocatenarios biotinilados con los oligonucleótidos no marcados monocatenarios (Figura 17). Se llevó a cabo la extracción nuclear y EMSA usando un kit de extracción nuclear y el kit EMSA Gel Shift (Panomics, Santa Clara, CA). Los extractos nucleares (4 µg) se incubaron durante 30 minutos a 15°C con 1x amortiguador de unión, 1 µg de Poly[d (IC)] y sondas biotilinadas (50 pmol) que corresponden a los sitios de unión MZF-1, Sp-1, IRF -1/2 y GATA-1. Con el fin de llevar a cabo un ensayo competitivo, se añadió el doble de la cantidad de sonda no marcada a la reacción de unión antes de añadir las sondas biotilinadas. Estas mezclas de incubación fueron entonces sometidas a electroforesis con 0,5x de amortiguador TBE en 8% de gel de poliacrilamida seguido por transferencia a una membrana de nylon Biodyne B (Pall, Port Washington, NY). Las bandas se visualizaron usando el kit de detección de quimioluminiscencia proporcionado en el Kit de EMSA Gel Shift.
7) Resultados
Aislamiento y caracterización de los promotores del gen de BH humano
Se ha determinado que un gran número de sitios de unión del factor de transcripción putativo están presentes dentro de la región flanqueante 5' de la BH humana según los resultados de una búsqueda usando el programa Genome Net MOTIF (Figura 18A). En particular, puesto que las secuencias que muestran una estrecha coincidencia con las secuencias de consenso reconocidas por MZF-1, Sp-1, IRF-1/2 y GATA-1/2 están presentes en una región que se extiende desde -216 hasta 1 próxima a la localización de los lugares de iniciación de la transcripción, se sugirió que estos factores de transcripción están involucrados en la regulación de la actividad del promotor de BH. Más precisamente, se llevó a cabo un análisis de deleción para determinar las regiones promotoras de BH (Figura 18B). El mayor nivel de actividad de luciferasa se detectó en los queratinocitos diferenciados transfectados con pGL3-816. Sin embargo, la actividad relativa de la luciferasa de los plásmidos de deleción se mantuvo elevada hasta que la deleción llegaba a pGL3-216. Entre las construcciones, el plásmido que contiene el fragmento que se extiende desde -444 hasta +1 (indicado como pGL3-444) demostró una actividad significativamente menor en los queratinocitos cultivados, y se sugirió que había una actividad supresora aguas arriba en la región desde -616 hasta -444. Puesto que estos resultados demostraron que la región desde -216 hasta -1 contiene el promotor mínimo para la transcripción del gen de BH, la secuencia de nucleótidos de la misma se muestra en la figura 18C. Dado que esta secuencia no contenía una caja TATA o CCAAT, se sugirió que posee propiedades constitutivas de este gen. Por otro lado, varios sitios de unión del factor de transcripción, tales como MZF-1, Sp-1, IRF-1/2 y GATA-1/2, estaban presentes en esta región promotora.
Identificación del elemento de acción en cis latente implicado
Regulación del gen de BH
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Se construyó una nueva serie de mutantes de deleción dirigida a cada elemento de acción en cis para determinar el elemento de acción en cis latente del promotor mínimo implicado en la regulación de la transcripción de la expresión del gen de BH. La actividad promotora se vio regulada muy a la baja en el caso de la deleción de los sitios de unión MZF-1, Sp-1 y el IRF-1/2 (Figura 19A).
Además, se llevó a cabo una investigación en cuanto a si estos factores de transcripción son realmente capaces de unirse a cada uno de los sitios de unión putativos o no. Por lo tanto, se llevó a cabo un ensayo de cambio en la movilidad electroforética (EMSA) utilizando un extracto nuclear a partir de queratinocitos cultivados junto con sondas de oligonucleótidos bicatenarias que contienen el sitio de unión MZF-1, Sp-1, GATA-1 o IRF-1/2. Como se muestra en la figura 19B, aunque Sp-1, MZF-1 y IRF-1/2 se unieron al sitio diana que corresponde al promotor BH, GATA-1/2 no se unió. Estos resultados indican que estos sitios de unión de la región promotora que se extiende desde -216 hasta -105 pb son esenciales para el elemento de acción en cis en la transcripción de BH.
Regulación mediada por citoquinas de la expresión del gen de BH
Dado que la BH es una enzima generadora de NMF, tiene el potencial de implicarse en la fisiopatología de la DA. Por consiguiente, se realizó una investigación de los efectos de las citoquinas Th1, Th2 y Th17 sobre la expresión del gen de BH. La figura 20A indica que la citoquina Th1, IFN-γ, regula a la baja la expresión del ARNm de BH de una manera dependiente de la dosis en los queratinocitos proliferativos. Por otra parte, las citoquinas Th2 y Th17 no mostraron efecto significativo alguno en la expresión de BH. Se obtuvieron resultados similares con los queratinocitos diferenciados (datos no mostrados). Se llevó a cabo un ensayo del promotor con el fin de determinar el papel de IFN-γ en la regulación de la expresión del gen de BH, y se especificaron los elementos de respuesta.
Como se muestra en la figura 20B, el IFN-γ regula a la baja la actividad del promotor de BH en los queratinocitos proliferativos transfectados con pGL3-BH-616 que contienen una secuencia de unión a IRF-1/2 entre -131 y -120. Después de la deleción de esta secuencia, el IFN-γ ya no inhibía la actividad del promotor de BH (Figura 20B). Además, se inhibió la expresión génica de IRF-1 y IRF-2 usando ARN pequeño de interferencia (ARNsi) con el fin de determinar si IRF-1/2 es un mediador esencial de la regulación a la baja de la BH inducida por IFN-γ. La actividad de IFN-γ se inhibió significativamente en los queratinocitos cultivados transfectados con ARNsi de IRF-1 o de IRF-2 (40 nM) (Figura 20C). Estos resultados sugieren fuertemente que la secuencia de unión IRF-1/2 es esencial para la regulación a la baja de la expresión del gen de BH inducida por IFN-γ.
Expresión de BH y de los factores relacionados en los queratinocitos cultivados
Se analizó por PCR en tiempo real la expresión de la BH, de la calpaína-1 y de los factores de expresión putativos en las células proliferativas y diferenciadas con el fin de investigar el mecanismo de regulación de la transcripción en la epidermis. Como se muestra en la figura 21A, el ARNm de BH se reguló al alta en los queratinocitos diferenciados, como en aquellos 2 días después de la confluencia (3,6 veces) y en los cultivados a una concentración de calcio alta (8,6 veces), en comparación con los queratinocitos proliferantes. Estos resultados coinciden con los datos del ensayo de promotor (Figura 18B). También se obtuvieron resultados similares con respecto a la calpaína I (aumento en la regulación al alta de aproximadamente 2,5 veces). Además, se realizó una investigación de los vectores de expresión de diversos factores de transcripción tales como MZF-1, Sp-1, GATA-1, IRF-1 y IRF-2 en los queratinocitos proliferativos. Como se muestra en la figura 21B, estos factores de transcripción se regularon al alta en los queratinocitos diferenciados de acuerdo con la expresión de la BH. Sin embargo, la expresión del ARNm de GATA-1 fue significativamente menor en comparación con otros factores (<1/32). Se cree que GATA-1 no juega un papel importante en los queratinocitos. Por consiguiente, se sugiere que la BH se sintetiza de una manera dependiente de la diferenciación mediada por MZF-1 y Sp-1. El hecho de que IRF-1 y IRF-2 también se regulen al alta por estímulos de la diferenciación indica que la expresión de BH es extremadamente sensible a IFN-γ.
Efectos de las citoquinas Th1 y Th2 en la expresión de factores de transcripción putativos
Se realizó una investigación de la regulación dependiente de citoquinas de estos factores de transcripción. La figura 22A indica que el IFN-γ regula al alta considerablemente la expresión del ARNm de IRF-1 en una forma dependiente de la dosis. Del mismo modo, la expresión de IRF-2 se regulaba al alta en presencia de IFN-γ. En contraste, la expresión de IRF-1 y IRF-2 se incrementó significativamente sólo en presencia de IL-4 a 100 ng/ml (Figura 22B). Es interesante observar que tanto MZF-1 como Sp-1 se regulaban a la baja más eficazmente en presencia de IL-4 a 10 ng/ml (Figura 22C). Estos resultados sugieren que la expresión de BH está regulada directa e indirectamente por las citoquinas Th1 y Th2, respectivamente.
Regulación a la baja de BH en la piel con dermatitis atópica
Aunque las mutaciones con pérdida de funcionalidad de FLG están relacionadas con el mecanismo de aparición de la DA, existe la posibilidad de que no esté relacionada con una deleción génica, sino más bien con un trastorno en la ruta de descomposición o patología de la DA. Por consiguiente, a continuación se realizó una investigación de la localización de la BH y de la filagrina en la piel afectada y la piel no afectada de los pacientes con DA junto con la actividad de BH en esas zonas. En la piel normal, la tinción doble con anticuerpo anti-BH y anticuerpo anti-filagrina demostró la localización simultánea de BH y filagrina en la epidermis superior, y particularmente en la capa granular,
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como se indicó anteriormente (Figura 23A). A un aumento mayor, aunque se indicó claramente que la BH se localizada desde la capa granular hasta la capa córnea, la filagrina se limita a las células granulares. Por el contrario, la expresión de BH disminuyó dramáticamente en la piel afectada y en la piel no afectada de los pacientes con DA observados en este estudio (n=7). Todos estos resultados indican que, a pesar de que se detectó tinción significativa todo el tiempo, se indicó una tinción de filagrina comparativamente débil. Además de la inmunohistoquímica, la actividad de la BH se midió en los extractos de las células de la capa cornea procedentes de las muestras de “tape peeling” obtenidas de 18 pacientes con DA y de 30 voluntarios sanos. Los extractos obtenidos de la piel afectada y de la piel no afectada de los pacientes de DA mostraban una actividad de BH considerablemente inferior a la de los voluntarios sanos (27,1% y 8,8% inferior, respectivamente). (Figura 23B). Estos resultados mostraban que la BH se localiza junto a la filagrina, y que la actividad de la misma disminuye considerablemente en la piel de los pacientes que padecen DA.
Discusión
En este estudio, se examinó el mecanismo de regulación de la expresión génica de la BH mediante la clonación y caracterización funcional de la región promotora. Se identificó que una región importante para la actividad del promotor de BH estaba presente en una región situada -216 pb aguas arriba por análisis de promotor (Figura 18B). En esta región, los sitios de unión putativos MZF-1 y Sp-1 mostraron un efecto significativo sobre la actividad del promotor de BH (Figuras 18C y 19A). Es interesante resaltar que también se ha indicado que Sp-1 y MZF-1 están implicados en la regulación de PAD1 que es una enzima importante para la iniciación de la descomposición de la filagrina. El Sp-1 es un miembro típico de la familia de tipo Sp/Kruppel de las proteínas con dedos de cinc que funcionan como factores de transcripción en las células de mamífero. Se cree que está implicado en casi todos los aspectos de la actividad celular, incluyendo la proliferación, la apoptosis, la diferenciación y la transformación neoplásica. En la epidermis humana, Sp-1 es un factor regulador importante de los genes que participan en la diferenciación epidérmica, incluyendo la involucrina, la loricrina, la transglutaminasa, y los genes PAD1, PAD2 y PAD3. El MZF-1 es un factor de transcripción que pertenece a la familia Krupple de las proteínas con dedos de cinc, y se expresa en las células hematopoyéticas totipotentes diferenciadas y en las células madre de la médula ósea. Sin embargo, no se ha descrito la función de MZF-1 durante la regulación de la transcripción en la epidermis de mamíferos. Se ha descubierto que MZF-1, Sp-1 y BH están regulados al alta simultáneamente en los queratinocitos diferenciados en comparación con los queratinocitos proliferativos (Figura 21B), lo que indica el papel de la BH en la diferenciación en lugar de en la constitución. Estos resultados indican claramente que estos factores de transcripción funcionan como factores activación de la regulación básica de la transcripción de BH durante la diferenciación final de los queratinocitos.
Por otro lado, una investigación de los elementos de acción en cis define además los sitios de unión IRF-1/2 dentro de esta región. Se confirmó que los IRF se unen directamente a la región promotora de BH mediante el uso de EMSA (Figura 19B). La mutagénesis dirigida de esta región de unión provocó una disminución significativa en la actividad del promotor de BH (Figura 19A). En consecuencia, los factores de transcripción IRF-1/2 son muy probablemente también necesarios para la actividad del promotor mínima del gen de BH en condiciones básicas. La familia los IRF consiste en un grupo de factores de transcripción, y en la actualidad, se han identificado nueve miembros de los IRF (desde IRF-1 hasta IRF-9) en varios tipos de células y tejidos. Estas moléculas IRF juegan un papel en la defensa antiviral, en la respuesta/regulación inmunitaria y en la regulación del crecimiento celular estimulada por IFN-α, IFN-β e IFN-γ. Se ha demostrado que IRF-1 y IRF-2 funcionan como agonistas y antagonistas implicados en la regulación de numerosos genes inducidos por IFN-γ. Es interesante observar que el IFN-γ disminuye notablemente la expresión del ARNm de la BH (Figuras 20A y 20B). Los análisis mutagénicos de bloqueo y de sitio dirigido confirmaron que los sitios de unión de IRF-1/2 están implicados en la inhibición de la expresión de BH mediada por IFN-γ (Figuras 20B y 20C). Estos resultados indican claramente que IRF-1/2 son mediadores de la regulación a la baja del gen de BH mediada por IFN-γ en los queratinocitos humanos. Por otra parte, las citoquinas Th2 de IL-4 e IL-13 no demostraron ninguna acción directa en absoluto durante la incubación durante 24 horas (Figura 20A). Sin embargo, estas citoquinas Th2 inhibieron significativamente la expresión de moléculas activadoras en forma de MZF-1 y Sp-1. En consecuencia, es razonable pensar que las citoquinas Th2 regulan a la baja la expresión de BH.
Además, se ha demostrado que la BH está drásticamente regulada a la baja en la piel de DA afectada y no afectada (Figuras 23A y 23B). Aunque la mutación de la filagrina es un factor de riesgo primario para enfermedades relacionadas con trastornos de barrera tales como la DA, los análisis de la mutación indicaron que esta mutación es responsable de menos del 50% de las incidencias de estas enfermedades en Irlanda y de no más del 20% de las incidencias en Japón. Existe la hipótesis de que la síntesis defectuosa de filagrina así como los trastornos asociados con la descomposición de la filagrina están implicados en una ruptura de la función de barrera. Está claro que la disminución de los niveles de NMF produce la piel seca, y que esto provoca una ruptura de la barrera de la piel. La DA es bien conocida por ser una enfermedad polarizada en Th2. Sin embargo, los informes recientes sugieren que las citoquinas Th1 también desempeñan un papel en la DA. Por ejemplo, la "DA intrínseca" se caracteriza inmunológicamente por bajos niveles de expresión de IL-4, IL-5 e IL-13 y un alto nivel de expresión de IFN-γ. Además, se produce un cambio de Th1 a Th2 durante una transición de la fase aguda a la fase crónica de la piel de DA. Estos resultados también indican la posibilidad de que el IFN-γ pueda jugar un papel más importante de lo que se pensaba anteriormente.
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