ES2428321T3 - Composiciones y métodos para tratar la enfermedad del pulmón inflamado - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a TL1A para uso en un método de tratamiento de asma, en el que elanticuerpo bloquea la unión de TL1A a DR3 y disminuye la actividad de DR3, según lo cual disminuye la expresiónde IL- 13.

Description

Composiciones y métodos para tratar la enfermedad del pulmón inflamado

La invención se refiere a los campos de la medicina y la inmunología. Más en particular, la invención se refiere a anticuerpos para modular las respuestas implicadas en el asma.

Antecedentes de la invención

El asma es una enfermedad reactiva de las vías respiratorias episódica caracterizada por hipersensibilidad a alergenos y otros estímulos, edema, constricción de las vías respiratorias y sobreproducción de mucosidad. Es frecuente en países industrializados, produciéndose en aproximadamente 4-5% de la población de EE.UU. Cada año es responsable de aproximadamente 3 millones de visitas a la consulta del médico, un par de cientos de miles de hospitalizaciones y varios miles de muertes. Lasley, M., Pediatrics en Review, 24: 222, 2.003. Su impacto económico se estima en casi 3 mil millones de dólares al año. Id.

La característica del asma es inflamación traqueobronquial provocada por diversos diferentes estímulos incluyendo alergenos, ejercicio, infecciones y tensión emocional. Exacerbando la situación, esta inflamación hace a las vías respiratorias hipersensibles a los estímulos que la provocan. La inflamación de las vías respiratorias crónica, no tratada, puede conducir a cambios anatómicos irreversibles y pérdida permanente de función pulmonar. Aunque los mecanismos bioquímicos y celulares responsables de provocar la inflamación asociada al asma no están completamente comprendidos, el tejido de las vías respiratorias asmáticas se caracteriza por niveles incrementados de mediadores inflamatorios tales como histamina, bradicinina, leucotrienos, factor activador de plaquetas, prostaglandinas tromboxano diversas citocinas (por ej., IL-4, IL-5, IL-8 e IL-13) y quimiocinas (por ej., LTB-4 y eotaxina) e infiltración de mastocitos, eosinófilos, linfocitos T, plaquetas y neutrófilos.

De las citocinas implicadas en la inflamación del pulmón, se ha reconocido IL-13 como un agente central en la enfermedad del pulmón inflamado e hiperreactividad de las vías respiratorias, alérgica (AHR, por sus siglas en inglés) (véase, por ejemplo, Mattes et al., J Immunol 167: 1.683, 2.001; Pinto et al., Sangre, 88: 3.299-3.305, 1.996; Pope et al., J Allergy Clin Immunol, 108: 594-601., 2.001. Por ejemplo, los estudios han demostrado (i) que se requiere producción de IL-13 por células CD4 tipo TH2 para hiperreactividad de las vías respiratorias y contracción, sobreproducción de mucosidad e hiperplasia de células caliciformes (Whittaker et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 27: 593-602, 2.002) y (ii) que IL-13 contribuye a infiltración de células inflamatorias.

Los linfocitos T desempeñan una función central en la regulación de respuestas inmunitarias. Las células T auxiliares expresan el marcador superficial CD4 y proporcionan ayuda a las células B para la producción de anticuerpos y ayuda a las células T CD8 para desarrollar actividad citotóxica. Otras células T CD4 inhiben la producción de anticuerpos y la citotoxicidad. Las células T regulan el equilibrio entre ataque de células infectadas o tumorígenas y tolerancia a las células del cuerpo. El ataque inmunitario desregulado puede conducir a autoinmunidad, mientras que la sensibilidad inmunitaria disminuida da como resultado infección crónica y cáncer. CD30, como se desvela en la presente memoria, es un regulador tanto de la iniciación de la respuesta de las células T como también como finalizador de la respuesta en una fase posterior de la respuesta inmunitaria.

El receptor 3 de la muerte (DR3) (Chinnaiyan et al., Science 274: 990, 1.996) es un miembro de la familia de receptores TNF (TNFRSF25). También se conoce como TRAMP (Bodmer et al., Immunity 6: 79, 1.997), wsl-1 (Kitson et al., Nature 384: 372, 1.996), Apo-3 (Marsters et al., Curr Biol 6: 1.669, 1996) y LARD (Screaton et al., Proc Natl Acad Sci U S A 94: 4.615, 1.997) y contiene un dominio de muerte típico. La transinfección de células 293 con DR3 humano (hDR3) indujo muerte celular programada y NF-κB activado. El ligando de origen similar para DR3 ha sido identificado recientemente como TL1A (Migone et al., Immunity 16: 479, 2.002) y ha demostrado que tiene actividad coestimuladora para DR3 en células T por la inducción de NF-κB y la supresión de muerte celular programada por expresión de cIAP2 (Wen et al., J Biol Chem 25: 25, 2.003). TL1A también se une al receptor señuelo 3 (DcR3/TR-6), que sugiere que el afinamiento de la accesibilidad de TL1A biológica es de importancia crítica. Se han observado múltiples formas generadas por corte y empalme de ARNm de DR3 humano, que sugiere la regulación en el nivel post-transcripcional (Screaton et al., Proc Natl Acad Sci U S A 94: 4.615, 1.997).

Muchos miembros de la familia de receptores TNF tienen la capacidad para inducir muerte celular por muerte celular programada o inducir señales coestimuladoras para función de células T. La regulación de estas rutas opuestas se ha clarificado recientemente para TNF-R1, el receptor que contiene dominio de muerte prototípico que puede causar muerte celular programada o proliferación de células T positivas receptoras (Micheau and Tschopp. Cell 114: 181, 2.003). Activación de NF-κB por un complejo de señalización que consta de TNF-R1 vía TRADD, TRAF2 y RIP induce asociación de FLIPL con un segundo complejo de señalización que consta de TNFRI, TRADD y FADD, evitando la activación de la caspasa 8 siempre que persista la señalización de NF-κB. Se ha demostrado que DR3 puede inducir la muerte celular programada en células transinfectadas e inducir NF-κB y las tres rutas MAP-cinasa (Chinnaiyan et al., Science 274: 990, 1.996; Bodmer et al., Immunity 6: 79, 1.997; Kitson et al., Nature 384: 372,1.996; Marsters et al., Curr Biol 6: 1.669, 1.996; Screaton et al., Proc Natl Acad Sci U S A 94: 4.615, 1.997; Wen et al., J Biol Chem 25: 25, 2.003). El bloqueo de NF-KB, pero no de MAP-cinasa y la inhibición de síntesis de proteínas dio como resultado muerte celular mediada por DR3, que sugiere que las señales NF-κB median efectos

anti-apoptóticos por la síntesis de proteínas anti-apoptóticas.

La expresión de DR3 humano es pronunciada en tejidos linfoides, principalmente en el bazo, ganglios linfáticos, timo e intestino delgado, que sugiere una función importante para DR3 en los linfocitos. El DR3 murino se ha suprimido por recombinación homóloga en células madre embriónicas (Wang et al., Mol Cell Biol 21: 3.451, 2.001). Los ratones DR3-/- muestran selección negativa disminuida por anti-CD3 en el timo pero selección negativa normal por superantígenos y selección positiva perfecta de timocitos. Las células T periféricas maduras no fueron afectadas por deficiencia de DR3. A pesar de una cantidad significativa de investigación preliminar, la función fisiológica de DR3 queda deficientemente caracterizada.

La patente internacional WO 0135995 desvela agentes de unión específicos de TR3 biológicamente activos y métodos para su uso. Los agentes de unión específicos de TR3 biológicamente activos son útiles para inhibir la proliferación de células que expresan TR3. Estos agentes biológicamente activos son útiles en particular para tratar enfermedades mediadas por células T tales como enfermedad del injerto contra el hospedador, rechazo de órganos, crecimiento de tumores, autoinmunidad e inflamación.

La patente internacional WO 0064465 desvela nuevas proteínas del Dominio de Muerte que contiene Receptor (DR3 y DR3-V1) que son miembros de la familia de los receptores de factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés). En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las proteínas DR3 y DR3-V1 humanas. También se proporcionan polipéptidos DR3 y DR3-V1 ya que son vectores, células huésped y métodos recombinantes para producir los mismos. Se describen además métodos de detección sistemática para identificar agonistas y antagonistas de actividad de DR3 y DR3-V1.

La patente de EE.UU. 2003129189 desvela polipéptidos TNF-gamma-alfa y TNF-gamma-beta humanos y ADN (ARN) codificando dichos polipéptidos y un procedimiento para producir dichos polipéptidos por técnicas recombinantes. También se desvelan métodos para utilizar dichos polipéptidos para inhibir el crecimiento celular, por ejemplo en un tumor o cáncer, para facilitar la curación de heridas, para proporcionar resistencia contra infección, inducir actividades inflamatorias y estimular el crecimiento de ciertos tipos de células para tratar enfermedades, por ejemplo reestenosis. También se desvelan métodos de diagnóstico para detectar una mutación en las secuencias de ácidos nucleicos de TNF-gamma-alfa y TNF-gamma-beta o sobreexpresión de los polipéptidos de TNF-gamma-alfa y/o TNF-gamma-beta. También se desvelan antagonistas contra dichos polipéptidos y su uso como terapéutico para tratar caquexia, choque septicémico, malaria cerebral, inflamación, artritis y rechazo de injerto.

Se conocen por lo tanto diversas moléculas para actuar en la mediación de una respuesta inmunitaria e inflamación. La identificación de dichas moléculas y su función en la inflamación proporciona nuevos objetos de estudio para tratar enfermedades del pulmón inflamado, incluyendo asma.

Así, existe una necesidad de desarrollar fármacos eficaces en el tratamiento de enfermedades del pulmón inflamado. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas también.

Sumario de la invención

La invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a TL1A para uso en un método de tratamiento del asma, en el que el anticuerpo bloquea la unión de TL1A a DR3 y disminuye la actividad de DR3, según lo cual disminuye la expresión de IL-13.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. A y B, la expresión de mDR3 y mTL1A en linfocitos en reposo. A. Timocitos restringidos en células CD4/CD8 dobles negativas (ADN), dobles positivas (DP) o simples positivas (SP). B. Esplenocitos y células de los ganglios linfáticos restringidos en células positivas CD4, CD8, B220 o células negativas CD4, CD8. C. Expresión de mDR3 y mTL1A en células activadas. Los esplenocitos se activaron con anti-CD3 (5 μg/ml) o LPS (1 μg/ml) inmovilizado durante 24 horas. D. La proliferación de células B muestra activación de células B con LPS.

Figura 2. A. Formas generadas por corte y empalme de mDR3. Se realizó RT-PCR en estirpes celulares de ratón y tejidos de ratón. Se subclonaron productos RT-PCR en vector PCR II usando el estuche de clonación TOPO y se confirmaron como las formas generadas por corte y empalme de mDR3 por secuenciación. CRD: dominio rico en cisteína (por sus siglas en inglés); TM: dominio transmembrana; DD: dominio de la muerte (por sus siglas en inglés). Arterisco: codón de detención. B. Proceso de corte y empalme alternativo inducido por activación de DR3 humano. Se activaron células mononucleares de sangre periférica (las PBMC) con PHA (5 μg/ml) o anti-hCD3 (5 μg/ml) y antihCD28 (1 μg/ml) inmovilizados o PMA (10 ng/ml) e ionomicina (400 ng/ml). Se recogieron las células en los instantes de tiempo indicados y se realizó RT-PCR. Se usó �-actina humana como control interno. La banda superior de las tres bandas visibles representa la forma generada por corte y empalme DR3 que retiene el intrón entre el exón 6 y 7; la banda media representa DR3 de longitud completa (FL, por sus siglas en inglés) y la banda del fondo muestra la forma generada por corte y empalme que carece de exón 6. C. Determinación cuantitativa del proceso de corte y empalme mediante el programa informático Análisis Molecular (BioRad, Hercules, CA). Se calculó la razón por comparación de la intensidad de la banda de longitud total con la banda superior en cada muestra. La razón procedente de las hPBMC recientes se designó como 100%.

Figura 3. Ratones transgénicos DR3. A. Las construcciones transgénicas de DR3 de ratón estaban bajo el control de activador y potenciador CD2 humano. B. La expresión específica de células T de DR3 en ratones transgénicos en esplenocitos restringidos en células positivas CD4 o CD8 o en células negativas CD4/CD8.

Figura 4. Reducción de número de células CD8 y frecuencia en ratones transgénicos mDR3-Δ5,6 y mDR3-FL. Se analizaron suspensiones de una sola célula de timo, bazo y ganglios linfáticos inguinales. Se contaron las células por exclusión con Azul Tripán para números totales de células y se tiñeron con CD4-Cyc y CD8-PE para análisis FACS. Se realizaron cálculos estadísticos usando compañeros de camada como controles; n. s.: no significativo; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Figura 5. Proliferación de células T inducida por activación alterada en ratones transgénicos DR3. A: Proliferación de esplenocitos en la estimulación durante 3 días como se indicó; B: Proliferación de células CD4+ o C: células CD8+.

D: Unión a anexina de células transgénicas y de control después de 72 horas de activación con anti-CD3 inmovilizado y anti-CD28 soluble. Se recogieren células CD4+, se lavaron y después se tiñeron con Anexina -V-PE y 7-AAD. E: En las mismas condiciones de cultivo que en D, se recogieron esplenocitos transgénicos y de control, se lavaron y se tiñeron con CD25-FITC, CD8-PE y CD4-CYC. F: Producción de IL-2 reducida por células T transgénicas DR3. Se purificaron células T por selección negativa y se activaron con anti-CD3 inmovilizado y anti-CD28 soluble durante 3 días. Se analizó en los sobrenadantes la producción de IL-2 por ensayo ELISA. ** p 0,0078.

Figura 6. Las células CD4+ transgénicas DR3 producen de manera espontánea citocinas Th2 en la activación in vitro. A: Se activaron 1 x 105/pozo w.t. o células T CD4+ transgénicas DR3 con anti-CD3 inmovilizado y anti-CD28 soluble. Se recogieron los sobrenadantes después de 72 horas y se realizaron los ELISA de citocina. B: Se activaron células CD4+ como se describe en A. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 h, 48 h y 72 h de cultivo y se analizó la producción de citocina por ELISA. En cada experimento, se mezclaron entre sí tres a cuatro bazos de mDR3-tg. Las Figuras representan uno de tres experimentos independientes. n. s.: no significativo; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001

Figura 7. Los ratones transgénicos DR3 desarrollan una respuesta de anticuerpos Th2 desviadas después de inmunización in vivo. A: Isotipos IgG previamente a inmunización B: Se inmunizaron ratones con 100 μg/DNP-KLH animal en PBS estéril y se ensayó su isotipo específico del antígeno una y tres semanas después de inmunización. Se recubrieron placas de 96 pozos de alta unión con DNP-BSA a 0,8 μg/ml para detectar anticuerpos específicos anti-DNP. Las Figuras representan uno de tres experimentos independientes. ** p<0,01; * p<0,05; n. s.: no significativo:

Figura 8. A: Inflamación de pulmón aumentada en ratones transgénicos DR3. Inflamación de pulmón disminuida en ratones transgénicos DR3-DN comparado con números de células w.t. y composición en BALF. Se sensibilizaron animales por inyección i. p. de 66 μg de ovalbúmina y 6,6 mg de alumbre los días 0 y 5 y se estimularon con ovalbúmina al 0,5% en aerosol en PBS el día 12. Se hizo recuento de células diferencial en citospinas de células de lavado broncoalveolar, teñidas con Wright-Giemsa. B: Producción de IgE específica aumentada en DR3 transgénico e IgE disminuido en ratones transgénicos DR3-DN comparado con ratones w.t. con asma experimental. Se detectó IgE específico de ovalbúmina por ELISA en placas recubiertas de ovalbúmina. Cinco animales por grupo; n. s.: no significativo, *: p<0,05, **: p<0,01 **

Figura 9. Inflamación de pulmón aumentada y mucosidad en ratones transgénicos DR3. Inflamación y mucosidad disminuida en ratones transgénicos DR3-DN. Infiltración de células inflamatorias (fila superior) y secreción de mucosidad (fila inferior) en los pulmones de ratones w.t., transgénicos DR3. Los animales se sensibilizaron y se estimularon como se describió anteriormente. Después de recolección BALF, se eliminaron los pulmones, se fijaron, se embebieron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina-eosina (fila superior) o PAS (fila inferior). Inserciones: Mayor aumento de células de infiltración.

Figura 10. Recuentos de células diferenciales en BALF de ratones w.t. a los que se ha inyectado anticuerpo anti-TL1A. Se sensibilizaron ratones por inyecciones i. p. de ovalbúmina con alumbre los días 0 y 5 y se estimularon con ovalbúmina en aerosol el día 12. Se inyectó anticuerpo L4G6 o control de isotipo 50 μg i. p. los días 11, 12, 13 y 14. Se recogió BALF el día 15 y se analizó la composición celular en citospinas teñidas con Wright-Giemsa. Tres ratones por grupo, n. s.: no significativo, *: p<0,05, **: p<0,01.

Figura 11. Respuestas de la citocina a inmunización KLH en ratones adultos y recién nacidos. Se inmunizaron ratones BALB/c recién nacidos de 1 día y adultos de 8 semanas i. p. y s. c. con KLH en PBS; a los neonatos se les suministró 10 μg y a los adultos 100 μg totales. Cuatro semanas más tarde, se volvieron a inmunizar todos los ratones con 100 μg de KLH en PBS. Una semana más tarde, se prepararon células de los ganglios linfáticos CD4+ y se estimularon en presencia de APC esplénico con 50 μg/ml de KLH. Se recogieron los sobrenadantes después de 72 h de cultivo y se ensayó el contenido en citocina usando estuches ELISA específicos de murina. Se muestran las proporciones de IL-4 (pg/ml): IFN-γ (pg/ml x 103) producidas por células CD4+ de neonato frente a adulto. Se obtuvieron resultados similares usando células CD4+ IL-4 : IFN-γ esplénicas y en la cepa C57BL/6 de ratón.

Figura 12. Expresión de DR3 en linfocitos CD4+ recién aislados y activados Con A de ratones adultos y recién nacidos. Se activaron células de los ganglios linfáticos de ratones BALB/c de 7 días o adultos con 2 μg/ml de Con A

y después se tiñeron las veces indicadas. Se muestra la tinción con el anticuerpo de segunda fase solo (línea discontinua) o anti-DR3 (líneas continuas) entre células CD4+ restringidas. La tinción con anticuerpo de segunda fase solo fue similar para todos los instantes de tiempo así que se muestra sólo la tinción de fondo a las 22 h.

Figura 13. Proceso de corte y empalme alternativo inducido por activación de DR3 humano. Se activaron las PBMC humanas con PMA (10 ng/ml) e ionomicina (400 ng/ml) (izquierda) sola y en presencia de inhibidores (derecha). Se recogieron las células después de 12 horas y se realizó RT-PCR. Se usó -actina humana como control interno. La banda superior de las tres bandas visibles representa la forma generada por corte y empalme DR3 que retiene el intrón entre el exón 6 y 7; la banda media representa DR3 de longitud total (FL) (flecha) y la banda del fondo muestra la forma generada por corte y empalme que carece del exón 6. Los paneles inferiores muestran la determinación cuantitativa de ARNm de FL-DR3 expresado como intensidad relativa para células no activadas. M – marcador de peso molecular.

Figura 14. El bloqueo de señales de DR3 por transgenes DN-DR3 negativos dominantes en células T bloquea la polarización Th2. La sobreexpresión de FL-DR3 de longitud completa transgénico en células T causa producción de citocina Th2 aumentada durante activación primaria. Se activaron células CD4 purificadas de w.t., (barra abierta) ratones transgénicos FL-DR3 (negro) y ratones transgénicos de DR3 dominante negativo (gris) durante tres días con anti-CD3 y anti-CD28. Después de 72 h, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron (A). Se lavaron las células y se volvieron a poner en placas sobre anti CD3 durante 48 h adicionales antes de análisis de los sobrenadantes (B). Obsérvense los diferentes ejes γ en activación secundaria y la producción aumentada en CD4 w.t. pero no CD4 transgénico de DN-DR3. n. s. - no significativo; * p<0,05; **: p<0,01; p<0,001.

Figura 15. Se transinfectaron células diana P815 con FL-mDR3 o con mΔ5,6-DR3 generado por corte y empalme alternativamente, una forma de DR3 que carece de exones 5 y 6 que codifican parte del dominio extracelular. A. Se transinfectaron EL4 con mTL1A y se usaron como células efectoras a la razón efector:diana indicada con P815-DR3

o P815-Δ5,6-DR3 marcado con Cr en ensayos de 5 horas. B. Se usaron sobrenadantes recogidos de cultivos de EL4-TL1A (106/ml, 24 h) a la concentración indicada con las mismas dianas P815 durante 5 h y se determinó la liberación de Cr. C. Inhibición de liberación de Cr mediada por TL1A por anticuerpo monoclonal L4G6, pero no por otros anticuerpos. El clon L2G8 muestra inhibición parcial. El anticuerpo L4G6 purificado causa una inhibición del 50% a 20 ng/ml.

Figura 16 es una serie de gráficos que muestran que la deficiencia en CD30 elimina la producción de IL-13 de las vías respiratorias y disminuye los exudados celulares en fluido broncoalveolar (BALF, por sus siglas en inglés) en la exposición antigénica. Se inmunizaron ratones i. p. con ovalbúmina y alumbre el día 0 y 5 y se estimularon con ovalbúmina en aerosol el día 12. Tres días más tarde, Se recogió BALF por lavado con 3 x 0,5 ml de PBS, se homogeneizaron los pulmones y se produjeron sobrenadantes por centrifugación. Se contaron los exudados celulares en BALF y se caracterizaron mediante tinción de Wright Giemsa en citospinas. Se determinaron las citocinas por ELISA.

La Figura 17 son dos gráficos que muestran que la deficiencia en CD30 interfiere con la producción de IL-13 en los ganglios linfáticos regionales y reduce la producción de GM-CSF, pero no tiene influencia sobre otros niveles de citocina y sobre los niveles de IgE en el pulmón o el suero. Los linfocitos torácicos aislados de los ratones en los experimentos descritos en la Figura 1 se volvieron a estimular in vitro con 1 mg/ml de ovalbúmina durante tres días. Se midieron los niveles de IgE en el pulmón y en el suero por ELISA.

La Figura 18 es una mancha y gráficos que muestran que las señales de CD30 para producción de IL-13 son independientes de TCR. Se activaron células T transgénicas DO11 TCR con ovalbúmina durante 5 días para inducir la expresión de CD30 y, después de lavado, se volvieron a estimular con anticuerpo anti-CD30 o células P815 transinfectadas con CD30-L (ligando-CD30), en ausencia o presencia de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 o P815-B7 (células P815 transinfectadas con B7) como se indicó. Se determinaron los niveles de ARNm de citocinas por ensayos de protección de ARN (A); se midió la producción de IL-13 por ELISA (B, C).

La Figura 19 es una tabla que enumera genes de regulación mejorada en respuesta a señalización de CD30.

La Figura 20 es una fotografía de un gel que muestra que se induce secreción de metaloproteinasa de matriz (MMP9) por señales de CD30. Se trataron células YT de CD30 positivo (linfoma LGL, 2 x 105/ml) con 5 μg/ml de anticuerpo anti-CD30 agonista (C10) durante los periodos indicados en medio 5 de suero sin objetivo y se recogieron sobrenadantes. A los controles no se suministró anticuerpo. Me. Sólo medio. Se analizaron los sobrenadantes por zimografía en SDS-PAGE, que incorpora 0,33 mg/ml de gelatina en la matriz de gel. MMP9 digiere la gelatina para dejar una banda sin gelatina que parece blanca después de tinción con azul Coomasie. M – Marcadores en kD.

Las Figuras 2 1 A y 21 B muestran las secuencias de nucleótido (SEC ID Nº: 1) y aminoácido (SEC ID Nº: 2), respectivamente, de DR3 humano (GenBank nº de acceso X63679).

Las Figuras 22A y 22B muestran las secuencias de nucleótido (SEC ID Nº: 3) y aminoácido (SEC ID Nº: 4), respectivamente, de CD30 humano (GenBank nº de acceso M83554).

La Figura 23 es una serie de gráficos que muestran que EAE no se resuelve en ratones knockout (k.o., por sus 5

siglas en inglés) con Ligando-CD30. A la cepa natural y a los ratones knockout con CD30-Ligando (CD30-LKO) se les inyectó el día 0 MOG (un péptido procedente de glicoproteína de oligodendrocito principal) en condiciones conocidas para inducir EAE. La puntuación clínica de la enfermedad se muestra: 0 no enfermedad, 6 muerte; 1-5 parálisis ascendente, que aumenta, empezando en la cola. A: puntuación de los 18 ratones inyectados, incluyendo en los ratones medios que no se pusieron enfermos; incidencia de enfermedad 12/18. C: mismos datos que en A, pero sólo representando gráficamente la puntuación de ratones que llegan a estar enfermos. B y C, procedimiento y análisis idéntico en CD30-LKO. Las flechas en C y D señalan a resolución espontánea en w. t. pero no en CD30-LKO.

La Figura 24 es una serie de gráficos que muestran que anti-CD30 interfiere en la resolución de la enfermedad en ratones w. t. (paneles superiores) y empeora EAE en CD30-LKO (paneles inferiores). A los ratones se les inyectó MOG como en la Figura 23. El día 0, 4, 7 y 12, se suministró a los ratones también 100 μg de anticuerpo anti-CD30 por vía intraperitoneal.

La Figura 25 muestra la expresión de mDR3 en ganglios linfáticos de ratones wt B6 y ratones transgénicos DR3 medido por citometría de flujo.

La Figura 26 muestra la expresión de mTL1A en ganglios linfáticos bronquiales (los LN, por sus siglas en inglés) de ratones wt B6 sensibilizados con ovalbúmina y estimulados con aerosol. La Figura 26A muestra que el anticuerpo monoclonal anti-mTL1A teñía mTL1A en células P815 transinfectadas con TL1A, pero no células no transinfectadas. La Figura 26B muestra que la expresión de mTL1A sólo fue detectada en una porción de células dendríticas que expresan CD11c (las DC, por sus siglas en inglés) (flecha) en células de los ganglios linfáticos bronquiales de ratones wt B6 sensibilizados con ovalbúmina (OVA) y estimulados con aerosol.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona anticuerpos para uso en métodos para tratar el asma. Los anticuerpos disminuyen la actividad de DR3. DR3 es un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR). Como se desvela en la presente memoria, disminuir la actividad o la expresión de DR3 disminuye la expresión de interleucina13 (IL-13). La disminución de la expresión de IL-13 se puede usar para aliviar un signo o síntoma asociado a una enfermedad inflamatoria. Los anticuerpos son útiles para tratar la enfermedad del pulmón inflamado, asma.

En una realización, la invención se basa en la caracterización adicional de la función fisiológica de DR3 en células T periféricas y el descubrimiento de que DR3 desempeña una función importante en el desarrollo de la enfermedad del pulmón inflamado (asma). En la realización de la invención, se crearon ratones transgénicos DR3 que expresan DR3 bajo el activador de CD2 específico de células T. Para ganar conocimiento en la función biológica de versiones de DR3 generadas por corte y empalme alternativamente, se generaron transgenes de murina para DR3 de longitud completa (DR3-FL), para una versión de DR3 generada por corte y empalme alternativamente pero asociada a la membrana (DR3-Δ5,6) y para una versión de DR3 negativo dominante (DR3-DN) que carece del dominio intracelular. Los datos obtenidos indicaron que DR3 está regulado hacia arriba muy temprano durante la activación de células T por un proceso de corte y empalme alternativo y que contribuye a la regulación de la polarización Th1/Th2 de células CD4.

El transgen DR3 de longitud completa soportó la producción de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-13 e IL-10) y suprimieron la secreción de IFN-γ durante la activación primaria de células CD4. Por el contrario, el transgen DR dominante negativo que bloqueó la señalización DR3 no tuvo efecto en la producción de citocinas durante la activación primaria. La ausencia de efecto de transgenes DN-DR3 durante la activación primaria sugiere que las señales de DR3 no se producen en células de cepa natural (w.t.) durante el cebado. La activación secundaria de células CD4

w.t. con anti-CD3 da como resultado una producción aumentada 5-10 veces de ambas citocinas Th1 y Th2. Por el contrario, la presencia del transgen DN-DR3 bloqueó completamente y selectivamente la producción aumentada de citocinas Th2 (incluyendo IL-10) pero dejó la producción de IFN-γ no afectada.

La relevancia fisiológica de estos hallazgos se demostró en experimentos en animales que mostraron que DR3 es un receptor crítico en la inducción de la enfermedad del pulmón inflamado. Se crearon ratones transgénicos DR3 que expresan DR3 bajo el activador CD2 específico de células T. Para ganar conocimiento en la función biológica de versiones de DR3 generadas por corte y empalme alternativamente, se generaron transgenes de murina para DR3 de longitud completa (DR3-FL), para una versión de DR3 generada por corte y empalme alternativamente pero asociada a la membrana (DR3-Δ5,6) y para una versión de DR3 negativa dominante (DR3-DN) que carece del dominio intracelular. Los datos obtenidos indicaron que DR3 está regulado hacia arriba muy temprano durante la activación de células T por un proceso de corte y empalme alternativo y que contribuye a la regulación de la polarización Th1/Th2 de células CD4. En particular, se crearon ratones transgénicos de DR3 que expresan DR3 de longitud completa en células T y ratones transgénicos DR3-DN negativo dominante en que las señales DR3 en células T se bloquean por la forma negativa dominante de DR3 y se usaron en un modelo de asma de ovalbúmina de murina. En el modelo, los ratones transgénicos de DR3 mostraron inflamación exagerada de pulmón comparado con los compañeros de camada no transgénicos. Por el contrario, los ratones que expresan la forma negativa dominante de DR3 no muestran inflamación del pulmón.

Estos resultados fueron validados usando un anticuerpo que se une a y bloquea el acoplamiento de TL1A (TNFSF15) de DR3. La administración de anticuerpos anti-TL1A a ratones sensibilizados con ovalbúmina normal durante exposición a ovalbúmina de las vías respiratorias en el modelo de asma de ovalbúmina de murina bloqueó completamente la respuesta del pulmón inflamado observada sin tratamiento con anticuerpos o con anticuerpo de control (no específico de TL1A). Debido a que los ratones recién nacidos y los niños presentan un sesgo acusado de Th2 que en el desarrollo normal de las transiciones del sistema inmunitario a un sesgo de Th1 en adultos, se comparó la expresión de DR3 en células T en ratones recién nacidos a la de ratones adultos. Se expresó DR3 a mayores niveles en los ratones recién nacidos, sugiriendo que su expresión está relacionada con el sesgo de Th2 de ratones en desarrollo.

A diferencia de cualquier otro miembro de la familia TNF-R, se encontró que la expresión de DR3 estaba controlada por el proceso de corte y empalme de ARNm alternativo. El reposo de las células T expresó poca o ninguna proteína DR3, pero contenía altos niveles de ARNm de DR3 generado por corte y empalme de manera aleatoria. En la activación de células T vía el receptor de células T, se activó la proteína cinasa C (PKC, por sus siglas en inglés). La activación de PKC a su vez medió el correcto proceso de corte y empalme de DR3 de longitud completa y la expresión superficial de la proteína. Esta regulación única de expresión de DR3 permite la rápida expresión de proteínas DR3 en células T y permite la regulación medioambiental de expresión de DR3 vía niveles de PKC influyentes responsables del proceso de corte y empalme y expresión de DR3.

Se describe el descubrimiento de que CD30 desempeña una función importante en la regulación de respuestas de los linfocitos T implicada en la patogénesis del asma. En particular, se demostró (i) que la señalización por CD30 puede provocar la producción de IL-13 incluso en ausencia de estimulación de receptores de células T y (ii) que, comparado con ratones de control, los ratones knockout por CD30 y CD30-Ligando presentan eosinofilia disminuida y producción de IL-13 después de exposición de las vías respiratorias en un modelo de AHR de murina. Así, la modulación de la función de CD30 debería conducir a producción de IL-13 disminuida e inflamación de las vías respiratorias reducida.

Se describe el descubrimiento de que CD30 desempeña un papel importante en la regulación de respuestas de linfocitos T implicadas en las respuestas del sistema inmunitario normal y anormal. En particular, usando ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE, por sus siglas en inglés; un modelo para esclerosis múltiple humana), se demostró que las señales mediadas por CD30 desempeñan una función importante en la resolución de la enfermedad. En otros estudios, la estimulación de CD30 (i) indujo a las células T a producir producción de IL-13 y

(ii) reguló hacia arriba CCR7, un receptor mensajero que dirige las células T a los ganglios linfáticos. En ausencia de señalización de CD30, las células T no producen IL-13 y no redirigen el tráfico a los ganglios linfáticos.

Se describen métodos tanto para regular hacia arriba una respuesta inmunitaria mediada por células T (por ejemplo, para regular hacia arriba una respuesta anti-tumoral aumentando las señales de CD30) como para suprimir la regulación hacia abajo de una respuesta inmunitaria (por ejemplo, para mantener respuestas inmunitarias contra tumores). En cambio, se describen métodos para disminuir la respuesta inmunitaria bloqueando las señales de CD30 y para aumentar la regulación hacia abajo de una respuesta inmunitaria que continúa aumentando las señales de CD30.

De acuerdo con esto, se describe un método de tratamiento de una enfermedad reactiva de las vías respiratorias en un individuo animal. El método incluye la etapa de administrar al individuo un agente que module al menos una actividad funcional de CD30. También se describe un método para modular una respuesta de las células T en un individuo animal. El método incluye la etapa de administrar al individuo un agente que module al menos una actividad funcional de CD30.

El agente usado en el método puede ser un anticuerpo, por ejemplo, uno que se una específicamente a CD30 o CD30-ligando. También puede ser CD30, CD30-Ligando o un derivado o variante de los mismos tales como una proteína de fusión de CD30-inmunoglobulina.

El agente que modula al menos una actividad funcional de CD30 también puede tomar la forma de un ácido nucleico, por ejemplo, una construcción antisentido, una ribozima o una construcción de ARNi. También puede ser que cause un gen que codifique CD30 o CD30-Ligando para llegar a ser no funcional o uno que interfiere con señalización transmembrana mediada por CD30, por ejemplo, un agente que fija como objetivo TRAF2 o p38.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la materia a que pertenece esta invención. Definiciones entendidas comúnmente de términos biológicos moleculares se pueden encontrar en Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5ª edición, Springer-Verlag: Nueva York, 1.991 y Lewin, Genes V, Oxford University Press: Nueva York, 1.994.

Como se usa en la presente memoria, "proteína" o "polipéptido" significa cualquier cadena de aminoácidos unida a péptidos, sin tener en cuenta la longitud o modificación postraduccional, por ejemplo, glicosilación o fosforilación.

Por el término "ligando" se quiere decir una molécula que se unirá a un sitio complementario en una estructura determinada. Por ejemplo, un ligando CD30 (CD30-Ligando) se une a CD30 y TL1A es un ligando para DR3.

El término "se une específicamente", como se usa en la presente memoria, cuando se hace referencia a un polipéptido, incluyendo anticuerpos, o receptor, se refiere a una reacción de unión que es determinativa de la presencia de la proteína o del polipéptido o receptor en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Así, en las condiciones diseñadas, por ejemplo, condiciones de inmunoensayo en el caso de un anticuerpo, el ligando o anticuerpo especificado se une a su "objetivo" particular (por ejemplo, un ligando CD30 se une específicamente a un CD30) y no se une en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra

o a otras proteínas con las que el ligando o anticuerpo puede ponerse en contacto en un organismo. En general, una primera molécula que "se une específicamente a " una segunda molécula presenta una afinidad de unión mayor que aproximadamente 105, por ejemplo, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 y 1012 o más, moles/litro.

Una "actividad funcional de CD30" es cualquier actividad realizada normalmente por CD30. Por ejemplo, las actividades funcionales incluyen la capacidad para unir específicamente CD30-Ligando, la capacidad para causar señalización transmembrana por TRAF2 y P38 y la capacidad para causar producción de IL-13 aumentada por linfocitos T cuando se estimulan.

Como se usa en la presente memoria, el término "enfermedad del pulmón inflamado" se refiere a una enfermedad asociada a una respuesta inflamatoria o inmunitaria en el pulmón. Las enfermedades del pulmón inflamado ejemplares incluyen, por ejemplo, asma, lesión aguda del pulmón, síndrome disneico agudo del adulto, enfisema, bronquitis crónica, fibrosis quística y enfermedad pulmonar intersticial tal como neumonía atípica, fibrosis idiopática y fibrosis intersticial.

El asma es una enfermedad de anafilaxia localizada o atopia y se caracteriza como una enfermedad inflamatoria. En algunos casos, el asma es provocada por exposición a alergenos (asma alérgica), mientras que en otros casos, el asma es provocada independientemente de estimulación por alergenos (asma intrínseca). En la inhalación de un alergeno por un individuo asmático, se inicia una respuesta inmunitaria, que da como resultado la liberación de mediadores de hipersensibilidad incluyendo histamina, bradicinina, leucotrienos, prostaglandinas, tromboxano A2 y factor activador de plaquetas. La fase inicial de la respuesta asmática también da como resultado la liberación de factores quimiotácticos que reclutan células inflamatorias tales como eosinófilos y neutrófilos. Las manifestaciones clínicas de estos casos incluyen oclusión del lumen bronquial con mucosidad, proteínas y partículas celulares; desprendimiento del epitelio; engrosamiento de la membrana basal; acumulación de fluido (edema) e hipertrofia de los músculos lisos bronquiales.

La lesión pulmonar aguda tiene lugar cuando una agresión a los pulmones causa una reacción inflamatoria aguda, que da como resultado disnea, hipoxemia e infiltrados alveolares difusos y puede conducir a fallo respiratorio. La lesión pulmonar aguda puede tener lugar con una variedad de agresiones pulmonares, incluyendo, por ejemplo, septicemia y traumatismo. La extensión de la lesión pulmonar aguda depende, por ejemplo, de la magnitud del daño inicial, agresiones repetidas tales como septicemia persistente o tejido necrótico e inflamado retenido y agresiones añadidas de tratamiento incluyendo barotraumastismo, hiperoxia e infección nosocomial.

El síndrome disneico agudo del adulto (ARDS, por sus siglas en inglés) es una forma de lesión aguda del pulmón observada con frecuencia en pacientes previamente sanos. El ARDS se caracteriza por velocidades respiratorias rápidas, una sensación de respiración entrecortada profunda, hipoxemia grave no sensible a oxígeno complementario e infiltrados pulmonares extendidos no explicado por enfermedad cardiovascular o sobrecarga de volumen. El ARDS tiende a seguir una serie diversa de agresiones sistémicas y pulmonares, aunque la mayoría de ARDS está asociada a infección sistémica o pulmonar, traumatismo grave o contenidos gástricos de aspiración. El estímulo crucial para el desarrollo de ARDS es una respuesta inflamatoria a lesión de tejido distante o local. Los trastornos asociados a ARDS incluyen aspirado de contenidos gástricos, agua dulce y salada e hidrocarburos; traumatismo en el sistema nervioso central, anoxia, ataques o presión intracraneal aumentada; sobredosis o reacciones a fármacos; alteraciones hematológicas; infección incluyendo septicemia, neumonía y tuberculosis; inhalación de toxinas tales como oxígeno, humo o productos químicos corrosivos; trastornos del metabolismo tales como pancreatitis; choque y traumatismo tal como émbolos de grasa, contusión pulmonar, traumatismo no torácico grave y derivación cardiopulmonar.

La enfermedad pulmonar intersticial incluye, por ejemplo, fibrosis idiopática, fibrosis intersticial y neumonía atípica. La neumonía atípica, también conocida como alveolitis alérgica, resulta de la inhalación de diversos antígenos y productos químicos del ambiente. Los síntomas de la enfermedad incluyen sibilancia y disnea y la enfermedad está asociada a infiltración de paredes alveolares con linfocitos, células plasmáticas y otras células inflamatorias. La enfermedad puede ser una enfermedad grave o puede estar presente en una forma crónica con fibrosis pulmonar en el progreso a enfermedad fibrótica intersticial con patrón restrictivo en la función pulmonar.

La bronquitis crónica es una inflamación de los tubos bronquiales y se puede manifestar en general de dos formas. La "bronquitis crónica simple" se relaciona con la exposición a irritantes ambientales, incluyendo exposición laboral a polvo, granos y minas así como humo del tabaco. La exposición a dichos irritantes ambientales está asociada a cambios inflamatorios en las vías respiratorias.

Otra forma de bronquitis crónica es la "bronquitis obstructiva crónica," que también está muy relacionada con el humo del tabaco. Los pacientes que presentan bronquitis obstructiva crónica con frecuencia presentan enfisema,

que se asocia de manera similar al humo del tabaco. El enfisema está asociado a la destrucción progresiva, crónica, de la estructura alveolar y espacios de aire agrandados. La destrucción de la estructura alveolar está asociada a proteasas liberadas por neutrófilos (leucocito polimorfonuclear; PMN, por sus siglas en inglés) reclutados en el pulmón por macrófagos alveolares pulmonares. Los síntomas de enfisema incluyen excesiva dificultad al respirar en el esfuerzo.

La fibrosis quística es una enfermedad genética letal caracterizada por secreciones mucosas anormalmente viscosas, que conducen a enfermedad pulmonar crónica. La secreción de ión cloruro anormal tiene lugar en la fibrosis quística debido a mutaciones en un canal de iones cloruro de las células epiteliales, el regulador transmembrana de fibrosis quística (CFTR, por sus siglas en inglés). La progresión de la enfermedad con frecuencia está marcada por el descenso gradual de la función pulmonar. La principal fuente de morbilidad en los pacientes de fibrosis quística es la enfermedad pulmonar asociada a las infecciones bacterianas crónicas y recurrentes y los efectos a largo plazo acumulativos perjudiciales de la respuesta inflamatoria resultante sobre el tejido pulmonar.

Como se usa en la presente memoria, el término "tratar una enfermedad del pulmón inflamado" se refiere al alivio de un signo o síntoma asociado a la enfermedad del pulmón inflamado. El tratamiento de una enfermedad del pulmón inflamado está destinado a incluir una reducción en el comienzo o magnitud de un signo o síntoma asociado a una enfermedad del pulmón inflamado. Un experto en la materia puede reconocer fácilmente y determinar el alivio de un signo o síntoma asociado a una enfermedad particular del pulmón inflamado.

En una realización, la descripción se refiere a un método para modular una respuesta inmunitaria de células T. El método incluye la etapa de modular la función de DR3 en la célula T, en la que la respuesta de células T causa un síntoma de enfermedad del pulmón inflamado. La célula T situada en un individuo animal comprende poner en contacto la célula con un agente que bloquea la interacción de DR3 y TL1A. El agente es un anticuerpo que se une específicamente a TL1A.

La descripción se refiere adicionalmente a un método para modular una respuesta inmunitaria de células T por modulación de la función de DR3 en la célula T. Dicho método es útil para modular una célula T situada en un individuo animal.

Se describe un método para tratar una enfermedad reactiva de las vías respiratorias en un individuo animal. El método puede incluir la etapa de administrar al individuo un agente que modula al menos una actividad funcional de CD30. El agente puede ser un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a CD30 o CD30ligando. El agente puede ser CD30 o CD30-Ligando. El agente puede ser una proteína de fusión de CD30inmunoglobulina. El agente puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, una construcción antisentido, una ribozima o una construcción de ARNi. El agente puede ser uno que cause un gen que codifique CD30 o CD30-Ligando para hacerse no funcional. El agente puede ser uno que interfiera con señalización transmembrana mediada por CD30. El agente puede fijar como objetivo TRAF2 o p38.

Se describe un método para modular Respuestas de células T en un individuo animal. El método puede incluir la etapa de administrar al individuo un agente que module al menos una actividad funcional de CD30. Se pueden usar agentes similares a los descritos anteriormente para modular actividad de CD30 para tratar enfermedad reactiva de las vías respiratorias o enfermedades del pulmón inflamado, como se desvela en la presente memoria, en dicho método. Además, el agente puede ser una proteína de fusión de CD30-Ligando-CD8 para modular una actividad funcional de CD30.

La descripción se refiere adicionalmente a un método para tratar una enfermedad del pulmón inflamado por administración de un agente que disminuye la actividad de DR3 según lo cual disminuye la expresión de IL-13. La enfermedad del pulmón inflamado es asma. El agente disminuye la actividad de DR3. El agente es un anticuerpo que se une a un TL1A ligando de DR3.

Se describe que un agente puede disminuir la expresión de DR3 o CD30. El agente puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico. El ácido nucleico puede codificar un ácido nucleico antisentido, una ribozima o una construcción de interferencia de ARN. Se puede administrar una composición que contenga uno o más agentes que disminuyan la actividad de DR3 y CD30.

Se describe un anticuerpo para modular una respuesta de las células T o enfermedad reactiva de las vías respiratorias en un individuo animal por administración al individuo de un agente que module al menos una actividad funcional de DR3.

Métodos biológicos

Los métodos y composiciones descritos en la presente memoria utilizan técnicas convencionales en las ciencias biológicas. Dichas técnicas son conocidas en general en la técnica y se describen con detalle en tratados de metodología tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2.001 y Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York, 1.992 (con actualizaciones periódicas). Se describen métodos inmunológicos, por ejemplo, preparación de anticuerpos específicos del antígeno, inmunoprecipitación e

inmunotransferencia, por ejemplo, en Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al., John Wiley & Sons, Nueva York, 1.991; Methods de Immunological Analysis, ed. Masseyeff et al., John Wiley & Sons, Nueva York, 1.992 y Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1.988). También se pueden adaptar métodos convencionales de transferencia de genes y tratamiento de genes para uso en la presente invención, como se describe, por ejemplo, en Gene Therapy: Principles and Applications, ed. T. Blackenstein, Springer Verlag, 1.999; Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), ed. P. D. Robbins, Humana Press, 1.997 y Retro-vectors for Human Gene Therapy, ed. C. P. Hodgson, Springer Verlag, 1.996.

CD30

Se describe la modulación de CD30 como un tratamiento o profiláctico para la enfermedad del pulmón inflamado, incluyendo hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR, por sus siglas en inglés), en particular asma. También se describe la modulación de CD30 como un método para regular Respuestas de células T. CD30 es una proteína de 595 aminoácidos descrita originalmente por Durkop et al. (Cell 68: 421, 1.992). Es un miembro de la superfamilia de receptores TNF, presenta cinco repeticiones ricas en cisteína y se expresa en células B y T activadas con mitógeno. CD30 une su ligando CD30L (también conocido como CD153) para co-estimular la activación de células T. CD30L es una proteína de unión a CD30 descrita originalmente por Smith et al. (Cell 73: 1.349, 1.993). Se expresa en Células T y B, monocitos/macrófagos, neutrófilos, megacariocitos, precursores eritroides y eosinófilos.

Modulación de una actividad funcional de DR3 o CD30

Los métodos de la descripción utilizan un agente que modula al menos una actividad funcional de DR3.

Los agentes que unen DR3 son anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que unen específicamente TL1A. De manera similar, los agentes que unen TL1A son anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que unen específicamente TL1A y muteínas de los mismos. Los anticuerpos anti-TL1A se pueden fabricar según métodos conocidos tales como los descritos en la presente memoria.

Los anticuerpos usados en los métodos de la descripción incluyen anticuerpos policlonales y, además, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 y moléculas producidas usando una biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno particular, se pueden preparar usando la proteína DR3-Ligando (TL1A) descrita anteriormente y tecnología de hibridoma estándar (véase, por ejemplo, Kohler et al., Nature 256: 495, 1.975; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511, 1.976; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292, 1.976; Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T Cell Hibridomas," Elsevier, N. Y., 1.981; Ausubel et al., supra). En particular, se pueden obtener anticuerpos monoclonales por cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante estirpes celulares continuas en cultivo tal como se describe en Kohler et al., Nature 256: 495, 1.975 y la Patente de EE.UU. Nº 4.376.110; la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., Immunology Today 4: 72, 1.983; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2.026, 1.983) y la técnica EBV-hibridoma (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy," Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96, 1.983). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de los mismos.

Los anticuerpos de la descripción incluyen así anticuerpos que se encuentran en la naturaleza así como anticuerpos que no se encuentran en la naturaleza, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de cadena única, anticuerpos quiméricos, bifuncionales y humanizados, así como fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Dichos anticuerpos que no se encuentran en la naturaleza se pueden construir usando la síntesis de péptidos en fase sólida, se pueden producir de manera recombinante o se pueden obtener, por ejemplo, por detección sistemática de bibliotecas combinatorias que constan de cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables como se describe por Huse et al. (Science 246: 1.275-1.281 (1.989)). Estos y otros métodos para fabricar anticuerpos funcionales son conocidos para los expertos en la materia (Winter and Harris, Immunol. Today 14: 243-246 (1.993); Ward et al., Nature 341: 544-546 (1.989); Harlow and Lane, supra, 1.988); Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1.992); Borrabeck, Antibody Engineering, 2ª ed. (Oxford University Press 1.995)).

Para modular un DR3 el anticuerpo puede impedir de manera estérica la interacción física de DR3 y TL1A. Un anticuerpo para TL1A puede modular un DR3 impidiendo la interacción de DR3 y TL1A.

Además de anticuerpos, se describen agentes que se encuentran en la naturaleza y de ingeniería que unen específicamente DR3, TL1A, CD30 o ligando de CD30. Los agentes que unen específicamente DR3 o CD30 pueden actuar como agonistas o antagonistas. Los agentes que unen específicamente AL1A o ligando CD30 pueden obstruir DR3-TL1A o interacciones de CD30-ligando CD30, respectivamente. Un ejemplo de un agente que se encuentra en la naturaleza que se une específicamente a TL1A es una forma soluble de DR3. De manera similar, un agente que se encuentra en la naturaleza que se une específicamente a ligando CD30 es una forma soluble de CD30. Un ejemplo de un agente de ingeniería que se une específicamente a TL1A es una proteína de fusión de DR3-inmunoglobulina y un ejemplo de un agente de ingeniería que se une específicamente a ligando CD30 es una proteína de fusión de CD30-inmunoglobulina.

También son útiles los agentes que regulan hacia abajo la expresión de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30. En el caso de DR3, la proteína se expresa en la membrana sólo después de proceso de corte y empalme correcto de

ARNm preexistente pero generado por corte y empalme de manera aleatoria. Se mostró que el proceso de corte y empalme correcto estaba mediado por activación de PKC. Por lo tanto, los inhibidores de PKC o intermedios de señalización regulados hacia abajo serán eficaces inhibidores de señales de DR3.

Se podía emplear una serie de diferentes agentes para este fin incluyendo ribozimas y construcciones de interferencia antisentido y de ARN (ARNi). Moléculas antisentido de ácidos nucleicos útiles son aquéllas que se hibridan específicamente en condiciones celulares a ARNm celular y/o ADN genómico codificador de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30 de una manera que inhiba la expresión de la proteína, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción. La unión puede ser por complementariedad de pares de bases convencionales o, por ejemplo, en el caso de unión dúplex de ADN, por interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice.

Se pueden suministrar construcciones antisentido, por ejemplo, como un plásmido de expresión que, cuando se transcribe en la célula, produce ARN que es complementario a al menos una porción única del ARNm celular que codifica DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30. Alternativamente, la construcción antisentido puede tomar la forma de una sonda de oligonucleótido generada ex vivo que, cuando se introduce en una célula que expresa DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30, causa inhibición de la expresión de proteína por hibridación con un ARNm y/o secuencias genómicas codificadoras para DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30. Dichas sondas de oligonucleótido son oligonucleótidos modificados preferiblemente que son resistentes a nucleasas endógenas, por ejemplo, exonucleasas y/o endonucleasas y por lo tanto son estables in vivo. Moléculas de ácidos nucleicos ejemplares para uso como oligonucleótidos antisentido son análogos de fosforamidato, fosfotioato y metilfosfonato de ADN (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nos. 5.176.996; 5.264.564 y 5.256.775). Adicionalmente, se han revisado propuestas generales para construir oligómeros útiles en tratamiento antisentido (véase, por ejemplo, Van der Krol et al. (1.988) Biotechniques 6: 958-976 y Stein et al. (1.988) Cancer Res 48: 2.659-2.668. Métodos para seleccionar y preparar moléculas de ácidos nucleicos antisentido son conocidos en la técnica y se incluyen propuestas in silico (Patzel et al. Nucl. Acids Res. 27: 4.328-4.334 (1.999); Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93: 8.502-8.507 (1.996); Lebedeva y Stein, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 41: 403-419 (2.001); Juliano y Yoo, Curr. Opin. Mol. Ther.

2: 297-303 (2.000) y Cho-Chung, Pharmacol. Ther. 82: 437-449 (1.999); Mir y Southern, Nature Biotech. 17: 788-792 (1.999)). Con respecto a ADN antisentido, se prefieren oligodesoxirribonucleótidos procedentes del sitio de iniciación de la traducción, por ejemplo, entre las regiones -10 y + 10 de una secuencia de nucleóticos codificadora de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30.

Se ha desarrollado una serie de métodos para suministrar ADN o ARN antisentido a células. Por ejemplo, se pueden introducir moléculas antisentido directamente en una célula por electroporación, transinfección mediada por liposomas, transinfección mediada por CaPO4, infección de vector vírico o uso de una pistola génica. Se pueden usar moléculas de ácidos nucleicos modificadas diseñadas para fijar como objetivo las células deseadas, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido ligados a péptidos o anticuerpos que se unen específicamente a receptores o antígenos expresados en la superficie celular objetivo. Para conseguir altas concentraciones intracelulares de oligonucleótidos antisentido, como se puede requerir para suprimir la traducción en ARNm endógenos, una propuesta preferida utiliza una construcción de ADN recombinante en que se pone el oligonucleótido antisentido bajo el control de un fuerte activador, por ejemplo, el activador de CMV.

También se pueden usar moléculas de ribozima diseñadas para escindir de manera catalítica transcripciones de ARNm de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30 para evitar la traducción de los ARNm de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30 y la expresión de proteínas de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30 (véase, por ejemplo, Wright y Kearney, Cancer Invest. 19: 495, 2.001; Lewin y Hauswirth, Trends Mol. Med. 7: 221, 2.001; Sarver et al. Science 247: 1.2221.225, 1.990; Hauswirth y Lewin, Prog. Retin. Eye Res. 19: 689-710 (2.000); Ke et al., Int. J. Oncol. 12: 1.391-1.396 (1.998); Doherty et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 30: 457-475 (2.001); Bartel y Szostak, Science 261: 1.411

1.418 (1.993); Breaker, Chem. Rev. 97: 371-390 (1.997) y Santoro y Joyce, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94: 4.262

4.266 (1.997) y la Patente de EE.UU. Nº 5.093.246). Como ejemplo, las ribozimas cabeza-martillo que escinden los ARNm en posiciones dictadas por regiones flanqueadas que forman pares de bases complementarias con el ARNm objetivo se podían usar siempre que el ARNm objetivo tenga la siguiente secuencia común: 5'-UG-3' (véase, por ejemplo, Haseloff y Gerlach Nature 334: 585-591, 1.988). Para aumentar la eficacia y minimizar la acumulación intracelular de transcripciones de ARNm no funcionales, se debería lograr por ingeniería una ribozima a fin de que el sitio de reconocimiento de escisión esté situado cerca del extremo 5’ del ARNm objetivo. Se pueden suministrar ribozimas a una célula usando un vector.

En el caso de que se tenga que administrar una ribozima a un individuo sin que se suministre usando un vector vírico u otro, se puede modificar la ribozima, si se desea, para mejorar la estabilidad. Modificaciones útiles en una ribozima terapéutica incluyen, pero no se limitan a, bloquear el extremo 3’ de la molécula y las posiciones 2' de pirimidinas. Las ribozimas estabilizadas pueden tener semividas de horas y se pueden administrar repetidamente usando, por ejemplo, inyección intravenosa o tópica. Los expertos en la materia entienden que una ribozima también se puede administrar por expresión en un vector de tratamiento génico vírico.

También se pueden usar otros métodos para reducir la expresión génica de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30 en una célula. Por ejemplo, la expresión génica de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30 se puede reducir por inactivación

o "inhibición" del gen de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30 o su activador usando recombinación homóloga diana (véase, por ejemplo, Kempin et al., Nature 389: 802, 1.997; Smithies et al., Nature 317: 230-234, 1.985; Thomas y

Capecchi, Cell 51: 503-512, 1.987 y Thompson et al., Cell 5: 313-321, 1.989). Por ejemplo, se puede usar una variante génica de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30 no funcional, mutante, o una secuencia de ADN completamente no relacionada, flanqueada por gen de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30 endógeno, (o las regiones codificadoras o regiones reguladoras del gen de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30), con o sin un marcador seleccionable y/o un marcador seleccionable negativo, para transinfectar células que expresan proteína de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30, respectivamente, in vivo.

La expresión génica de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30 también se puede reducir fijando como objetivo secuencias de desoxirribonucleótidos complementarias para la región reguladora del gen de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30, esto es, el activador y/o potenciadores de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30, para formar estructuras de triple hélice que eviten la transcripción de las respectivas en células objetivo (véase en general, Helene, C., Anticancer Drug Des. 6 (6): 569-84, 1.991; Helene, C., et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27-36, 1.992 y Maher, L. J., Bioassays 14 (12): 807-15, 1.992). Las moléculas de ácidos nucleicos que se tienen que usar en esta técnica son preferiblemente monocatenarias y constan de desoxirribonucleótidos.

Además de lo anterior, se puede usar ARNi para regular hacia abajo la expresión de DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30 en una célula. ARNi es un método de interferencia con la transcripción de ARNm específicos por la producción de ARNs pequeños (los ARNsi) y los ARN de horquilla corta (los ARNsh) (véase Paddison y Hannon, Cancer Cell 2: 17-23, 2.002; Fire et al., Nature 391: 806-811 (1.998); Hammond et al. Nature Rev Gen 2: 110-119 (2.001); Sharp, Genes Dev 15: 485-490 (2.001); Hutvagner y Zamore, Curr Opin Genetics & Development 12: 225-232 (2.002); Bernstein et al., Nature 409: 363-366 (2.001); Nykanen et al., Cell 107: 309-321 (2.001)).

Métodos para disminuir una actividad de un polipéptido, por ejemplo, DR3 o CD30, son conocidos para los expertos en la materia. Se entiende que una disminución en actividad de un polipéptido incluye tanto disminuir el nivel de expresión del polipéptido así como disminuir una actividad biológica presentada por el polipéptido.

También se puede disminuir una actividad de DR3 o CD30 usando un inhibidor. Un inhibidor puede ser un compuesto que disminuye la expresión, actividad o señalización intracelular de DR3 o CD30. Dicho inhibidor puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña, proteína, péptido, peptidomimético, ribozima, molécula de ácido nucleico u oligonucleótido, oligosacárido o combinación de los mismos, como se desvela en la presente memoria. Los métodos para generar dichas moléculas son conocidos para los expertos en la materia (Huse, Patente de EE.UU. Nº 5.264.563; Francis et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 422-428 (1.998); Tietze et al., Curr. Biol., 2: 363-371 (1.998); Sofia, Mol. Divers. 3: 75-94 (1.998); Eichler et al., Med. Res. Rev. 15: 481-496 (1.995); Gordon et al., J. Med. Chem.

37: 1.233-1.251 (1.994); Gordon et al., J. Med. Chem. 37: 1.385-1.401 (1.994); Gordon et al., Acc. Chem. Res. 29: 144-154 (1.996); Wilson y Czarnik, eds., Combinatorial Chemistry: Synthesis and Application, John Wiley & Sons, Nueva York (1.997)). También se pueden obtener bibliotecas que contienen grandes números de compuestos naturales y sintéticos de fuentes comerciales. Se pueden preparar bibliotecas combinatorias de moléculas usando métodos de la química combinatoria conocidos, como se discutió anteriormente. Un inhibidor puede incluir, por ejemplo, un antagonista; una molécula negativa dominante que evite la activación de DR3 o CD30; anticuerpos, proteínas, moléculas pequeñas y oligonucleótidos para inhibir una actividad o la expresión de DR3 o CD30; ribozimas, moléculas de ácidos nucleicos antisentido y moléculas de ácidos nucleicos que codifican factores de transcripción reguladores negativos que evitan o reducen la expresión de DR3 o CD30, así como células o virus que contienen dichas ribozimas y moléculas de ácido nucleico. Un experto en la materia entenderá fácilmente que se pueden usar éstas y otras moléculas que inhiben la expresión, actividad o señalización de DR3 o CD30, como un inhibidor.

Un experto en la materia puede determinar fácilmente una disminución en la actividad o la expresión de un DR3 o CD30. Por ejemplo, se pueden usar sondas o cebadores de ácidos nucleicos para examinar la expresión de ARNm de DR3 o CD30 y se pueden usar anticuerpos de DR3 o CD30 para examinar los niveles de expresión de los respectivos polipéptidos. El efecto de un inhibidor se puede determinar fácilmente por ensayo de su efecto sobre una actividad biológica, por ejemplo, la expresión de IL-13. Se pueden usar estos y otros métodos adecuados, que se pueden determinar fácilmente por los expertos en la materia, para ensayar el efecto de un compuesto como inhibidor potencial de DR3 o CD30.

También se pueden usar otros métodos para modular la función de DR3 o CD30, por ejemplo, modulando una función de señalización de DR3 o CD30. Por ejemplo, un método para modular una función de CD30 es interferir con señalización aguas abajo iniciada por CD30. Por ejemplo, la señalización de CD30 está mediada por TRAF2 y p38. Los agentes que fijan como objetivo estas moléculas se podían usar para modular la función de CD30. Se conocen inhibidores farmacológicos de p38. Los agentes capaces de modular la función de TRAF2 y p38 se pueden fabricar según técnicas conocidas, por ejemplo, construcciones antisentido o de ARNi.

Como se describe en los Ejemplos, se ha usado un modelo de ratón para identificar agentes que modulan la expresión y/o la actividad de DR3 y CD30 y para examinar la función de DR3 y señalización de CD30 en la producción de IL-13. Sin embargo, se entiende por los expertos en la materia que dicho modelo se considera representativo de otros modelos animales, incluyendo ser humano. En tal caso, un experto en la materia puede determinar fácilmente una forma adecuada de un agente para un organismo particular. Por ejemplo, la forma de un agente que actúa en un ratón y modula DR3 o CD30 se puede usar en un ser humano si esa forma tiene

sustancialmente la misma actividad moduladora en un ser humano. Alternativamente, una forma humana análoga del agente se puede generar fácilmente por un experto en la materia usando, por ejemplo, la secuencia humana de DR3 o CD30 (véanse las Figuras 21 y 22). Por ejemplo, una forma soluble de DR3 o CD30 que actúa como una negativa dominante puede ser generada a partir de secuencias humanas de DR3 y CD30 usando métodos conocidos para los expertos en la materia. El uso de la forma humana puede ser útil para limitar respuestas inmunitarias no deseables contra un antígeno extraño. De manera similar, una forma humanizada de un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo injertado usando CDRs de un anticuerpo no humano, por ejemplo, ratón, hámster, conejo y similares, se puede usar para tratar un ser humano siempre que la forma injertada tenga suficiente afinidad y especificidad para la forma humana del antígeno. Si la molécula objetivo de DR3 o CD30 es humana, la secuencia humana se puede usar para ensayar la eficacia de un agente en la modulación de la actividad de la forma humana de DR3 o CD30. Por ejemplo, la secuencia humana se puede usar para identificar sistemáticamente los anticuerpos que se unen a las respectivas moléculas de DR3 o CD30 o se puede usar un anticuerpo generado contra una molécula de DR3 o CD30 de otra especie si el anticuerpo experimenta reacción cruzada con el DR3 o CD30 humano y se une con suficiente afinidad y especificidad. Un experto en la materia puede determinar fácilmente una forma adecuada de un agente de la invención para una necesidad particular.

Modulación de la función de DR3 por sobreexpresión de transcripciones de DR3 o por expresión de manera selectiva de ciertas variantes generadas por corte y empalme de transcripciones de DR3.

Debido a que DR3 inicia polarización de Th2 dominante, aumentar la actividad de DR3 será beneficioso en síndromes autoinmunitarios dominados por actividad Th1. Estos incluyen esclerosis múltiple, artritis reumatoide y otros. En tales casos, la actividad de DR3 se puede regular hacia arriba por sobreexpresión de una transcripción de DR3 o por expresión de manera selectiva de ciertas variantes generadas por corte y empalme de transcripciones de DR3.

Modulación de actividad de PKC.

Como se desvela en la presente memoria, la activación de PKC media el proceso correcto de corte y empalme de DR3 y se puede usar, por lo tanto, para modular la expresión de DR3. La actividad de PKC se puede aumentar o disminuir usando agentes conocidos. Para reducir la actividad de PKC, los agentes que se podían usar incluyen péptido inhibidor de PKC (Upstate Biotechnology), H7, Bryostatin, GF109203X (Bisindolimaleimida), RO 318220, fragmento de EGF-R miristolado, RO 32-0432 y estaurosporina. Para aumentar la actividad de PKC, los agentes que se podían usar incluyen ésteres de forbol tales como PMA.

Métodos para suministrar un agente a una célula.

Se pueden suministrar agentes a una célula por cualquier método conocido. Por ejemplo, se puede añadir una composición que contiene el agente a células suspendidas en medio. Alternativamente, se puede administrar un agente a un animal, por ejemplo por una ruta parenteral, con una célula que expresa DR3, TL1A, CD30 o ligando CD30 a fin de que el agente se una a la célula in situ.

Modulación de la función de DR3 o CD30 en un individuo animal.

Los agentes descritos anteriormente se pueden administrar a animales incluyendo seres humanos en cualquier formulación adecuada. Por ejemplo, se pueden formular composiciones para fijar como objetivo una célula que exprese DR3 o que exprese CD30 en portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables tal como disolución salina fisiológica o una disolución de sal tamponada. Se pueden seleccionar portadores y diluyentes adecuados sobre la base de modo y ruta de administración y práctica farmacéutica estándar. Una descripción de portadores y diluyentes farmacéuticamente aceptables ejemplares, así como formulaciones farmacéuticas, se puede encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto clásico en este campo y en USP/NF. Se pueden añadir otras sustancias a las composiciones para estabilizar y/o conservar las composiciones.

Cuando se administra a un individuo, se puede administrar una composición como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, disoluciones acuosas tales como agua o disolución salina fisiológicamente tamponada u otros disolventes o vehículos tales como glicoles, glicerol, aceites tales como aceite de oliva o ésteres orgánicos inyectables. Un portador farmacéuticamente aceptable puede contener compuestos fisiológicamente aceptables que actúen, por ejemplo, para estabilizar o aumentar la absorción de la composición. Tales compuestos fisiológicamente aceptables incluyen, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular u otros estabilizantes o excipientes. Un experto en la materia conocerá que la elección de un portador farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración de la composición. Un experto en la materia sabrá que una composición farmacéutica se puede administrar a un individuo por diversas vías incluyendo, por ejemplo, por vía oral o por vía parenteral, tal como por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal o por inhalación. La composición se puede administrar por inyección o por intubación.

Polarización de una respuesta de células T/asma y otros trastornos.

Polarizar una respuesta de las células T hacia una ruta Th1 o Th2 por modulación de la actividad de DR3 debería ser útil para tratar una serie de enfermedades. Por ejemplo, suprimir respuestas de Th2 con bloqueadores de DR3 debería ser útil para tratar el asma y para el inmunotratamiento de tumores. Aumentar las respuestas de Th2 con agonistas de DR3, por otra parte, debería ser beneficioso para tratar la autoinmunidad dominada por Th1 y para reducir el riesgo de rechazo de trasplante.

Como se desvela en la presente memoria, inhibir la actividad de tanto DR3 como CD30 sinérgicamente inhibe la señalización de IL-13 (véase el Ejemplo 8). Se describe adicionalmente usar uno o más agentes para disminuir la actividad de tanto DR3 como CD30. Como inhibir la actividad de DR3 y CD30 disminuye la expresión de IL-13, se entiende que un método puede usar una combinación de las composiciones desveladas en la presente memoria para disminuir la actividad tanto de DR3 como de CD30. Dicha combinación puede actuar sinérgicamente para disminuir la expresión de IL-13. Dicha combinación se puede usar por lo tanto para tratar una enfermedad del pulmón inflamado tal como asma.

El asma alérgico (hiperreactividad de las vías respiratorias) está causado por exposición de las vías respiratorias a un antígeno de un individual que ha sido sensibilizado al mismo antígeno por exposición previa. El sistema inmunitario (mucosal) asociado a las vías respiratorias responde a exposición antigénica con producción de IL-13, que pone en marcha las secuelas de hiperreactividad de las vías respiratorias.

Como se desvela en la presente memoria, DR3 se expresa en células NKT y el TL1A de ligando DR3 se expresa en ganglios linfáticos bronquiales (Ejemplo 9). Sin estar limitados a un mecanismo particular, los datos experimentales soportan el siguiente modelo para los casos patógenos que conducen a asma. La exposición de antígeno por las vías respiratorias da como resultado la absorción del antígeno (ejemplificado con ovalbúmina en estudios descritos en la presente memoria) por células dendríticas (DC) situadas en la mucosa y submucosa. Las células dendríticas cargadas de antígeno llegan a estar activadas y migran a ganglios linfáticos de drenaje, donde expresan TL1A en su superficie. Los ganglios linfáticos contienen células NKT entre sus residentes. Las células NKT expresan constitutivamente DR3 y son susceptibles a señales de TL1A por DC cargada de antígeno que llega al ganglio linfático. NKT responde a DR3 que provoca producción de IL-13. Este caso recluta células T de CD4-memoria específica de antígeno local a las células dendríticas y media la expansión clonal de CD4 y la producción de citocina TH2 aumentada. La expansión clonal de las células T CD4 de la memoria aumenta por señales de CD30 que emanan en células CD4 activadas por unión de CD30-L.

El bloqueo de TL1A/DR3 inhibe la iniciación (caso provocado) mientras que el bloqueo de CD30/CD30-L inhibe la fase de multiplicación (expansión clonal de CD4). TL1A y DR3 también pueden estar implicados en la multiplicación. Tanto la iniciación como la multiplicación contribuyen a la verdadera manifestación del asma.

Se describen métodos para la detección sistemática de un agente que module la señalización de DR3 o CD30, por ejemplo, que inhiba la actividad de DR3 o CD30 tal como la producción de IL-13. Dicho agente se puede detectar sistemáticamente por los métodos desvelados en la presente memoria. Así, se describen métodos para identificar fármacos candidatos para el tratamiento de enfermedades del pulmón inflamado, incluyendo asma. Se describe un método para identificar un anticuerpo que se une específicamente a DR3 o CD30. El anticuerpo puede ser generado usando métodos de rutina, como se desvela en la presente memoria (véase el Ejemplo 4). En una realización particular, el anticuerpo es generado contra la secuencia de DR3 o CD30 humana (véanse las Figuras 21 y 22). También se pueden identificar otros tipos de agentes, como se desvela en la presente memoria.

Ejemplos

Ejemplo 1

Generación y caracterización de ratones transgénicos de DR3

Materiales y métodos: Ratones. Todos los ratones se usaron a la edad de 6-12 semanas y se mantuvieron en instalaciones sin patógenos según las directrices de la Universidad de Miami Comité para el Uso y Cuidado Animal.

Medio y Reactivos. Se cultivaron células en Medio Mínimo Esencial de Dulbecco Modificado de Iscove (Invitrogen, Carlsbad, CA) enriquecido con FBS inactivado por calor al 10% (Invitrogen), 10 μg/ml de gentamicina (Invitrogen) y

-

mercaptoetanol 50 μM (Bio-Rad). Se purificaron CD3 anti-ratón monoclonal y CD3 anti-humano de los sobrenadantes de cultivo del 2C11 y las estirpes celulares OKT3, respectivamente (ATCC, Manassas, VA). Se adquirieron CD28 anti-ratón monoclonal y CD28 anti-humano en eBioscience (San Diego, CA). Concanavalina A (ConA), fitohemaglutinina (PHA) y lipopolisacárido (LPS) fueron de Sigma (St. Louis, MO). IL-2 de murina recombinante fue de BioSource International (Camarillo, CA). Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA, por sus siglas en inglés) e ionomicina fueron adquiridos en Calbiochem (San Diego, CA).

Anticuerpos. Anticuerpos monoclonales directamente conjugados, incluyendo isocianato de fluoresceína (FITC, por sus siglas en inglés) y CD4 anti-ratón conjugado con cicromo, ficoeritrina (PE) y CD8a anti-ratón conjugado con cicromo, B220 anti-ratón conjugado con FITC, CD25 anti-ratón conjugado con FITC, Anexina conjugada con PE y 7

aminoactinomicina (7-AAD) fueron adquiridos en BD/PharMingen (San Diego, CA). El control de IgG de hámster se adquirió en eBioscience. Previamente a tinción, las células se trataron con CD16/CD32 anti-ratón purificado (receptor Fc-γIII/II, PharMingen) e IgG humano purificado (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA).

Generación de DR3 anti-ratón de hámster armenio y anticuerpos monoclonales TL1A anti-ratón. La porción extracelular de DR3 de ratón se clonó en armazón con la parte Fc de IgG 1 de ratón en pBMG-Neo de vector de expresión modificado y se transinfectó la construcción en una estirpe celular de fibroblastos NIH 3T3 usando precipitación con CaPO4. Se seleccionaron clones positivos con G418, se volvieron a clonar y ensayar para producción de mDR3-Ig por ELISA. Se purificó MDR3-Ig del sobrenadante sin suero de células transinfectadas en una columna de proteína A, se dializó en PBS y se esterilizó por filtración. Se expresó proteína de unión a maltosa mTL1A clonada (MBP, por sus siglas en inglés) en E. coli y se purificó la proteína de fusión en columna de maltosaagarosa.

Se inmunizaron hámsters armenios tres veces cada dos semanas con 50 μg de mDR3-Ig o mTL1A-MBP en adyuvante de Freund por vía intraperitoneal. Tres días previamente a la fusión, se reforzaron hámsters con 50 μg de las proteínas por vía intravenosa. Se fusionaron esplenocitos de hámster con el SP20 de mieloma de murina con polietilenglicol (PEG) y después se pusieron en placas en medio a base de metilcelulosa durante dos semanas (estuche ClonaCell-HY, StemCell Technologies Inc., Vancouver, Canadá). Se recogió un ciento de colonias y se analizó por ELISA en placas recubiertas con la proteína de fusión inmunizante. Se ensayó en los sobrenadantes de clones positivos la capacidad para detectar isoformas de mDR3 en células transinfectadas por citometría de flujo y ensayo de western. Se purificaron anticuerpos de un sobrenadante Nutridoma-SP (Roche, Indianapolis, IN) en una columna de proteínas G, se dializaron en PBS y se esterilizaron por filtración.

Análisis por citometría de flujo. Las suspensiones de una sola célula se prepararon de timo, bazo o ganglios linfáticos inguinales. Se tiñeron 105 células con CD4-FITC, CD8-Cyc y DR3 anti-ratón o TL1A anti-ratón de hámster armenio durante 30 minutos a 4°C. Se lavaron las células en tampón FACS (PBS que contenía BSA al 0,5% y AEDT 2 mM) y después se trataron con IgG humano durante 5 min a 4°C, antes de tinción con anti-IgG de hámster armenio de cabra-Biotina (Jackson ImmunoResearch) durante 30 minutos a 4°C. Se lavaron las células en tampón FACS y después se tiñeron con Estreptavidina-PE (PharMingen) durante 30 minutos a 4°C. Se analizaron las muestras usando un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) de Becton Dickinson LSR instrument (Becton Dickinson; San Jose CA) y el programa informático CELLQuest™. También se combinó B220-FITC con anticuerpos de DR3 anti-ratón o TL1A anti-ratón de hámster armenio para detectar su nivel de expresión en células B.

RT-PCR. Se extrajo ARN mensajero de estirpes celulares o tejidos de murina con el estuche Micro Fast-Track (Invitrogen) y se transcribió inverso ADNc usando el estuche Superscript II (Invitrogen). Se subclonaron productos RT-PCR en el vector PCR II usando el estuche de clonación TOPO (Invitrogen) y se confirmaron como formas de corte y empalme de mDR3 por secuenciación.

El proceso de corte y empalme alternativo inducido por activación de DR3 se estudió con células humanas debido a que los productos generados por el proceso de corte y empalme se pudieron separar después de PCR por electroforesis de gel de agarosa. Se aislaron las PBMC humanas de donantes sanos por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll Hypaque. Se activaron 5 millones de células por muestra con PHA (5 μg/ml) o se inmovilizaron anti-hCD3 (OKT3, 5 μg/ml) y anti-hCD28 (1 μg/ml) o PMA (10 ng/ml) e ionomicina (400 ng/ml). Se recogieron las células en los instantes de tiempo indicados y se extrajo ARNm y se convirtió en ADNc usando el estuche Invitrogen. Se usó -actina humana como control interno. La determinación cuantitativa de productos PCR se realizó con la ayuda de programa informático Molecular Analyst (BioRad).

Generación de ratones transgénicos. La molécula de longitud completa de DR3 de murina (mDR3-FL) y la variante generada por corte y empalme de DR3 que carece de los exones 5º y 6º (mDR3-Δ5,6) y la versión negativa dominante de DR3, mDR3-DN, aa 1-234, que carece del dominio intracelular se clonaron en los sitios EcoR I y BamH I de activador CD2 humano y vector potenciador (Love et al., J Exp Med 179: 1.485, 1.994). Los fragmentos de ADN que se tienen que inyectar en oocitos se separaron de las secuencias del vector por digestión de Not I y se purificaron por purificación de Gel (Qiagen, Valencia, CA) y elución (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Se realizaron microinyecciones de ADN en los huevos fertilizados por la instalación en la Universidad de Miami, School of Medicine. Se investigaron fundadores potenciales por PCR de ADN de la cola. El par de cebadores se situó al principio y al final de los sitios de clonación, por lo tanto se usó el mismo par de cebadores para los tres transgenes mDR3. El cebador del principio es 5' CGC TCT TGC TCT CTG TGT ATG 3' (SEC ID Nº: 5) y el cebador del final es 5' CTG CCA GCC CTC TTC CAT C 3' (SEC ID Nº: 6). Se criaron ratones transgénicos en el preparatorio de C57BL/6J por unión progresiva de animales transgénicos hemizigóticos con C57BL/6J w.t. (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

Ensayo de proliferación de células T. Se pusieron en placas esplenocitos por triplicado a 1 x 105 células/pozo en placas de fondo plano de 96 pozos. Se activaron células con anti-CD3 inmovilizado (2 μg/ml) con o sin anti-CD28 soluble (1 μg/ml) o ConA (5 μg/ml) o PMA (10 ng/ml) con ionomicina (400 ng/ml). Para proliferación de células T, se estimularon células CD4+ purificadas a 1 x 105 células/pozo o células CD8+ a 5x 104 células/pozo con anti-CD3 recubierto (2 μg/ml) con anti-CD28 soluble (1 μg/ml). Se añadió mIL-2 recombinante al cultivo a 1.000 U/ml en

experimentos indicados. Se cultivaron células durante 72 h y se pulsaron durante las últimas 6 h de incubación con 1 μCi/pozo de [3H] timidina (Perkin Elmer, Boston, MA) y la incorporación de timidina se cuantificó usando un contador de centelleo.

Preparación de células CD4+ y CD8+ purificadas. Se purificaron CD4+ o CD8+ o células T de murina de esplenocitos por selección negativa (estuche SpinSep por StemCell Technology Inc.) según el protocolo de fabricación. La pureza fue examinada de manera rutinaria alrededor de 90%-96% por tinción con CD4-Cyc o CD8-PE.

Inmunización e isotipo de anticuerpo. Se inmunizaron ratones transgénicos y w. t. (de 6-10 semanas) adultos con 100 μg de hemocianina (DNP-KLH) de lapa conjugada a dinitrofenilo (DNP) (CalBiochem). Se inyectó a cada ratón en tres sitios, i. p. y s. c. entre los omóplatos y en la base de la cola con 100 μl/ sitio en PBS estéril. Una semana y tres semanas después de inmunización, se extrajeron muestras de sangre de los ratones y se separó suero para análisis ELISA de anticuerpos IgG1 específicos de anti-DNP e IgG2a específicos de anti-DNP.

ELISA de citocina y suero. Para los ensayos ELISA de citocina se recogieron los sobrenadantes durante el ensayo de proliferación. Se realizó ELISA sándwich por las instrucciones del fabricante. Se usaron pares de anticuerpo de BD para análisis de IL-2, IFN-γ e IL-4. Los reactivos para ELISA de IL-13 fueron adquiridos en R&D Systems (Minneapolis, MN) y los reactivos para ELISA de IL-5 fueron adquiridos en eBioscience.

Para determinar el isotipo de anticuerpos IgG1 e IgG2a específicos de anti-DNP, se analizaron sueros de animales individuales. Se recubrieron placas de 96 pozos con 0,8 μg/ml de DNP-albúmina (DNP-BSA) (CalBiochem) durante la noche a 4°C. Se bloquearon después los pozos con PBS que contenían FBS al 10% (tampón de bloqueo) durante 1 h a temperatura ambiente. Se lavaron las placas con PBS que contenía Tween-20 al 0,05% (tampón de lavado). Se diluyó suero progresivamente en tampón de bloqueo y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. Se lavaron las placas y se añadieron 100 μl de IgG1 anti-ratón conjugado con biotina o IgG2a anti-ratón conjugado con biotina a 2 μg/ml (ambos de BD/PharMingen) a cada pozo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Se lavaron las placas y se añadieron 100 μl de dilución 1:1.000 de estreptavidina-peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) (BD/ PharMingen) a cada pozo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las placas de nuevo y se añadieron 100 μl de disolución de sustrato de sal de diamonio de 2,2'-azinobis-[3-etilbenzotizolin-6-ácido sulfónico], (ABTS) a cada pozo. Se leyeron las placas en un lector de ELISA (Benchmark Plus, Bio-Rad).

Análisis estadísticos. Se realizaron análisis estadísticos usando un ensayo t de Student de dos colas con el Programa Informático GraphPad Prism, San Diego, CA; p<0,05 se considera significativo. Los datos en el texto se presentan como la media ± SEM.

Resultados: La expresión de mDR3 y mTL1A en compartimentos linfoides. Se generaron anticuerpos monoclonales a DR3 y TL1A de murina inmunizando hámsters armenios, usando una proteína de fusión mDR3-Ig o una proteína de fusión mTL1A-MBP como antígeno. La fusión de esplenocitos con la selección de SP20 y HAT de mieloma de murina generó los hibridomas. Se evaluó la especificidad de los anticuerpos de sobrenadantes de hibridoma por ELISA usando las proteínas de fusión para recubrir placas de microlitros y por citometría de flujo de sobrenadante de hibridoma la unión a estirpes celulares transinfectadas con mDR3 o mTL1A.

Debido a que la proteína mDR3 se expresó a niveles muy bajos en linfocitos en reposo, se desarrollo un ensayo de tinción de sándwich de tres capas para aumentar la señal. En el timo, la expresión de mDR3 se restringió a poblaciones de CD4+ y CD8+ positivas únicas y ausencia en timocitos dobles positivos o dobles negativos (Figura 1A). En el bazo y los ganglios linfáticos, la expresión de mDR3 se restringió a células T de CD4+ y CD8+ con mayor expresión en células CD4+ y no se observó en células B y otras células no T (Figura 1B). No fue detectable TL1A de murina en células de bazo en reposo (Figura 1B), timocitos o células de ganglio linfático. Sin embargo, ambos mDR3 y mTL1A se indujeron después de 24 h de activación de CD3 de células CD4+ y CD8+, pero no en células B activadas con LPS (Figura 1C)..

DR3 de murina presenta diez formas de ARNm generado por corte y empalme alternativamente. Se ha indicado que existe DR3 humano en 12 formas de ARNm generadas por corte y empalme de manera diferente, aumentando la posibilidad de que se hayan conservado de manera evolucionada rutas moleculares similares. Realizando RT-PCR en estirpes celulares de ratón y tejidos de ratón, se identificaron 10 formas de corte y empalme para mDR3 (Figura 2A). Cuatro formas generadas por corte y empalme retienen el segundo intrón, creando de ese modo un codón de interrupción en el armazón que causaría la terminación temprana de la traducción, lo más probablemente dando como resultado una proteína no funcional. Dos formas generadas por corte y empalme que carecen del exón 5 o el exón 6 codifican dos proteínas potencialmente solubles con sólo tres dominios ricos en cisteína completos (los CRD) (Wang et al., Immunogenetics 53: 59, 2.001). Tres formas desprovistas de ambos exones 5 y 6 codifican receptores de membrana que carecen del cuarto CRD.

Para estudiar el efecto de la activación de células T en el proceso de corte y empalme en DR3 humano, se desarrolló un ensayo de RT-PCR. Debido a que siete de las doce formas generadas por corte y empalme de hDR3 se saltan el exón 6, el exón justo antes del dominio transmembrana, se designaron pares de cebadores que se situaban en los exones 4 y 7 para centrar el estudio alrededor del exón 6. En células T humanas en reposo, tres

formas generadas por corte y empalme principales se resolvieron fácilmente y se expresaron en niveles casi equivalentes. Después de activación por PHA, o anti-hCD3 y anti-hCD28 o PMA e ionomicina, se indujo la forma de longitud completa de DR3 a dos veces el nivel de las otras dos formas. La regulación hacia arriba del ARNm de longitud completa de DR3 es un caso temprano (Figuras 2B, 2C), siendo ya detectable después de tres h. El proceso de corte y empalme de DR3 es independiente de nueva síntesis de proteínas pero requiere señales de PKC como se indicó por bloqueantes farmacológicos.

La expresión de DR3 transgénico en forma de longitud completa, como variante generada por corte y empalme transmembrana y como forma negativa dominante. Una forma generada por corte y empalme de DR3, designada como mDR3-Δ5, 6 carece de los exones 5 y 6 pero retiene el armazón de lectura; codifica una proteína transmembrana con un dominio de muerte típico, pero que carece del cuarto CRD. Si esta forma podía diferir de DR3 de longitud completa por especificidad o afinidad de la unión de ligando se investigó usando estirpes transgénicas para ambos mDR3-FL (longitud completa) y mDR3-Δ5, 6 además de un transgen de mDR3-DN (dominante negativo) para imitar el fenotipo de ratones knockout. La expresión de estas tres formas se dirigió por el activador y potenciador de CD2 humano (Figura 3A). Se sobreexpresó DR3 en todos los fundadores transgénicos y la expresión fue específica de las células T (Figura 3B).

Reducción de células T CD8 y células T CD4 en ratones transgénicos de DR3. Se analizaron cinco ratones procedentes de cada uno de dos ratones fundadores transgénicos de DR3-FL, cinco ratones de cada uno de dos ratones fundadores transgénicos mDR3-Δ5,6 y cinco ratones de una camada no transgénica se analizaron para determinar la frecuencia de subpoblaciones de linfocitos en órganos linfoides (Figura 4). El número total de timocitos y esplenocitos en ratones transgénicos de DR3 tendió a ser inferior, aunque la diferencia no fue significativa en la mayoría de los casos. En los ganglios linfáticos, sin embargo, el número total de células disminuyó significativamente en ratones transgénicos de DR3-FL y en la cría de uno de los fundadores de los ratones de DR3Δ5,6 tg. Analizando el número de células T de CD4 y CD8, se encontró una fuerte reducción de células T de CD8 por 50% o más en ganglios linfáticos, bazo y timo. El número de células T de CD4 estuvo menos afectado. Las células de CD4 DR3-Δ5,6-tg fueron normales en ganglios linfáticos y bazo pero reducidas en el timo. Las células de CD4 de DR3-FL-tg por otra parte se vieron afectadas y reducidas en número en los tres órganos. Los datos indican que la sobreexpresión transgénica de DR3 es más perjudicial para células CD8 que células CD4 y el transgen de DR3-FL es más eficaz en este sentido que el transgen Δ-5,6. El transgen de DR3-DN no tuvo efecto significativo en el número de células de CD4 o CD8 o la celularidad de cualquiera de los órganos linfoides.

Proliferación inducida por activación disminuida en ratones transgénicos de DR3. Los esplenocitos de mDR3-Δ5,6-tg y mDR3-FL-tg muestran una fuerte reducción de la proliferación en la respuesta a anti-CD3 con o sin anti-CD28 o a Con A sola cuando se compara con controles de la camada (Figura 5A). Por el contrario, los esplenocitos de mDR3DN-tg proliferaron en un nivel comparable como las células de control de la camada, que sugiere que las señales DR3 no contribuyen a la proliferación en células w.t. Para excluir la posibilidad de que la proliferación disminuida fuera debida a los números de células T menores en los esplenocitos, se purificaron células CD4+ y CD8+ por selección negativa y se analizaron. Ambas células CD4+ y CD8+ transgénicas proliferaron deficientemente en respuesta a anti-CD3 y anti-CD28. El efecto de los transgenes FL y Δ5,6 DR3 fue similar (Figura 5B, C). Sin embargo, las células T transgénicas fueron capaces de proliferar normalmente como respuesta a PMA e ionomicina, que indica que los transgenes DR3 interfirieron con la señalización más bien que con el ciclo celular. La absorción disminuida de timidina por células T transgénicas no fue debida a muerte celular programa aumentada; las células CD4+ transgénicas experimentaron muerte celular programada a un nivel comparable a las células de control de la camada cuando se determina por tinción con Anexina y 7-AAD (Figura 5D). Las células T de CD4+ y CD8+ transgénicas regulan hacia arriba IL-2Rα (CD25) así como las células de control de los miembros de la camada, que implica que el defecto de proliferación no fue debido a insensibilidad a IL-2 (Figura 5E). No se observó, sin embargo, que las células T transgénicas produjeran menos IL-2 comparado con células T de control (Figura 5F). Sin embargo, IL-2 exógeno añadido no salvó el defecto de proliferación de células transgénicas de DR3 (Figura 5B).

Las células CD4+ transgénicas de DR3 se polarizan espontáneamente hacia la relación de linaje Th2 in vitro e in vivo. Las células CD4+ transgénicas DR3 en la activación se diferencian de manera espontánea en células Th2 sin estar sometidas a condiciones de polarización de Th2. Después de un periodo de activación de tres días con anti-CD3 inmovilizadas y anti-CD28 solubles, las células CD4+ transgénicas de DR3 produjeron cantidades significativamente mayores de IL-4, IL-5 e IL-13 que las células CD4+ de control. En las mismas condiciones, IFN-γ, la marca citocina para células Th1, se redujo en células mDR3-FL-tg pero no disminuyó en células transgénicas de DR3-Δ5,6 cuando se compara con células CD4+ no transgénicas de control. El transgen DR3-DN no tuvo efecto en IFN-γ o producción de IL-4 (Figura 6A).

Las células T de CD4+ transgénicas de DR3, al tiempo que presentan proliferación disminuida, produjeron cantidades significativamente mayores de IL-4 después de 24 horas y 48 horas de activación; en los mismos instantes de tiempo, las células T de CD4+ de control no produjeron cantidades detectables o produjeron cantidades insignificantes de IL-4 (Figura 6B). Comparado con las células CD4+ de control, las células CD4+ transgénicas de DR3 produjeron consecuentemente menores cantidades de IL-2. La producción de IFN-γ fue normal en DR3-Δ5,6-tg y disminuyó en células CD4 de DR3-FL-tg.

Las citocinas de tipo Th2, especialmente IL-4, activan la producción de anticuerpos IgG1 por células B; por otra parte, las citocinas de tipo Th1 tales como IFN-γ activan la producción de anticuerpos IgG2a por células B. El impacto de la sobreexpresión de mDR3 en ratones transgénicos se midió in vivo por inmunización de ratones con DNP-KLH y analizando los niveles de anticuerpos IgG1 e IgG2a específicos de anti-DNP. Antes de inmunización, los ratones transgénicos DR3-Δ5,6 contenían niveles comparables de IgG1, IgG2a, IgG2b e IgE en suero que los ratones de control (Figura 7A). Una y 3 semanas después de inmunización, los ratones transgénicos de DR3 generaron títulos dos veces mayores de IgG1 específico de antígeno que los controles de los miembros de la camada, al tiempo que generaban niveles comparables de IgG2a específico de antígeno (Figura 7B). Los niveles de IgE específicos de anti-DNP no fueron detectables. De acuerdo con la producción de citocinas in vitro, mDR3-DN-tg mantuvo niveles comparables de respuestas específicas de antígeno que los ratones miembros de la camada.

Ejemplo 2

Modelo de ratones transgénicos de DR3 de inflamación de pulmón.

La expresión de DR3 y TL1A en linfocitos activados. ARNm de DR3 existe en formas generadas por corte y empalme de manera aleatoria en linfocitos en reposo. Se encuentran pequeñas cantidades de proteína DR3 en células CD4 y CD8 en reposo. No se detecta ARNm de TL1A en células de ratones adultos o seres humanos en reposo. Cuando se activaron con ARNm de longitud completa de DR3 anti-CD3 y anti-CD28, y la proteína se regula hacia arriba rápidamente en células T tanto CD4+ como CD8+ por proceso correcto de corte y empalme de ARNm, la activación de células T también da como resultado expresión de proteína TL1A; las células B activadas no expresan proteína DR3 o TL1A. Para estudiar la expresión de DR3 y TL1A de ratón y la señalización sobre un nivel de proteínas, se desarrollaron anticuerpos monoclonales usando mDR3-Ig recombinante y MBP (proteína de unión a maltosa)-proteínas de fusión a TL1A como antígenos para inmunización y detección sistemática de hibridomas. Los dos sobrenadantes de hibridoma anti-DR3 y anti-TL1A o anticuerpos purificados se pueden usar para citometría de flujo e Inmunohistoquímica en secciones congeladas. Además, el clon 4C12 anti-DR3 mostró actividad agonista, imitando la unión y activación de TL1A y como se demostró por muerte de células transinfectadas de DR3 y estimulando la proliferación de células T activadas in vitro. El clon L4G6 anti-TL1A presentó actividad de bloqueo de TL1A debido a que inhibía la muerte mediada por TL1A de células transinfectadas de DR3 in vitro y bloqueaba la inflamación de pulmón in vivo.

Los linfocitos de ratones transgénicos DR3 producen grandes cantidades de citocinas Th2, incluyendo IL-13. Para determinar la función de DR3 en células T periféricas, se crearon tres cepas de ratón transgénicas diferentes: una que expresa DR3 de longitud total; una que expresa una forma negativa dominante de DR3 (DR3-DN) y una que expresa TL1A. Todas se expresaron bajo el control de activador CD2 específico de células T. Se trataron dos isoformas funcionales de receptor DR3 que difieren en el número de dominios ricos en cisteína en la región extracelular (DR3 fl y DR3 Δ5,6) para expresión transgénica. Las dos mostraron casi el fenotipo idéntico.

En intentos por bloquear la señalización de DR3 in vivo e in vitro, se creó el transgen DR3-DN dominante negativo por eliminación de la región de señalización citoplasmática del receptor. Cuando se sobreexpresa en células T, DR3-DN inhibe la señalización de DR3, actuando como estructura señuelo receptora y haciendo trímeros de no señalización con cadenas de DR3 w.t. Se detectaron sistemáticamente los fundadores para ratones transgénicos DR3, DR3-DN y TL1A por biopsias de la cola y se verificó la expresión del transgen por FACS. La expresión del transgen DR3 fue mayor en células transgénicas en reposo que en células w.t activadas. Los niveles de expresión de transgenes DR3-DN y TL1A fueron similares a los de transgenes DR3. Las células CD4+ de ratones transgénicos DR3 produjeron mayores cantidades de las citocinas Th2 (1L-4, IL-5, IL-13) cuando se activaron in vitro con anti-CD3 ligado a la placa. Al mismo tiempo, las células CD4+ transgénicas DR3 produjeron cantidades significativamente disminuidas de IFN-γ e IL-2, que sugiere que DR3 transgénico causa sesgo de Th2 en ratones. El transgen DR3 dominante negativo no tuvo efecto sobre la producción de citocina en activación primaria, que sugiere que DR3 no contribuye a cebado en células w.t.

La respuesta del anticuerpo a DNP en ratones transgénicos DR3 se desplazó a anticuerpos de tipo Th2. Se detectaron niveles mayores de IgG1 específico de DNP (Th2) en el suero de ratones transgénicos DR3 inmunizados con DNP-KLH, al tiempo que los niveles de IgG2a (Th1) fueron similares a w.t. El DR-DN tg no afectó al isotipo del anticuerpo isotipo después de inmunización primaria. El hallazgo de que las células transgénicas DR3-DN y TL1A producían citocinas Th1 y Th2 similares a células w.t. indicó que los efectos observados no estaban causados por la construcción transgénica. Para asegurar que el fenotipo de ratones transgénicos DR3 no estaba causado por ruptura génica por construcción transgénica integrada, se usaron camadas de diferentes fundadores en los experimentos.

Debido a que DR3 es un receptor de muerte, potencialmente capaz de inducir muerte celular vía activación de caspasas así como de células protectoras de muerte celular programada por activación de la ruta NF-κB, la viabilidad de las células activadas se ensayó con tinción de 7-AAD. Los linfocitos transgénicos DR3 recién asilados o activados presentaron el mismo porcentaje de células muertas cuando se compara con linfocitos w.t. Se requiere señalización DR3 para la enfermedad del pulmón inflamado en la exposición de las vías respiratorias a antígeno. La producción aumentada de las citocinas Th2 IL-4, IL-5 e IL-13 y la polarización Th2 de células T transgénicas de DR3 sugirieron una susceptibilidad aumentada al asma en ratones transgénicos DR3.

Para ensayar esta hipótesis, se utilizó el modelo de ratón de inflamación aguda de pulmón inducida por ovalbúmina. Se sensibilizaron ratones sin manipular (w.t.), transgénicos DR3 y transgénicos DR3-DN con inyecciones intraperitoneales de ovalbúmina con alumbre los días 0 y 5 y se estimularon con ovalbúmina en aerosol el día 12. Tres días más tarde, se observó una inflamación pulmonar moderada en ratones w.t. Las células de infiltración que representan en su mayoría eosinófilos se encontraron en el fluido de lavado broncoalveolar (BALF) (Figura 8A) y en secciones teñidas de hematoxilina-eosina (H&E); se detectó hipersecreción de mucosidad con tinción de ácido periódico-Schiff (PAS) (Figura 9, fila inferior). Los ratones transgénicos DR3 tenían un fenotipo asmático muy aumentado con grandes números de células de infiltración, más del 90% de las cuales fueron eosinófilos. También aumentó la secreción de mucosidad (Figura 9) y se detectaron niveles mayores de IgE específicos de ovalbúmina en el suero de ratones transgénicos DR3 sensibilizados y se estimularon con ovalbúmina (Figura 8B). IL-4, IL-5 e IL-13 fueron fácilmente detectables en el BALF de ovalbúmina sensibilizados y se estimularon los ratones transgénicos de DR3, pero apenas detectables en BALF de ratones w.t. y transgénicos DR3-DN. El bloqueo de DR3 bloquea la inflamación pulmonar en ratones w.t. En activación primaria, los linfocitos transgénicos DR3-DN produjeron cantidades w.t. de citocinas Th1 y Th2 cuando se activaron por entrecruzamiento de TCR in vitro. Sin embargo, los ratones transgénicos DR3-DN sensibilizados y estimulados con ovalbúmina mostraron signos fuertemente disminuidos de inflamación pulmonar cuando se compara con ratones w.t. (Figuras 8, 9). Los números totales de células y números de eosinófilos en BALF disminuyeron comparado con ratones w.t., mientras que los números de linfocitos y macrófagos fueron comparables (Figura 8A). Las secciones de pulmón de ratones DR3-DN también mostraron reducción significativa en infiltración eosinófila y secreción de mucosidad comparado con ratones w.t. (Figura 9) y el nivel de IgE específico de ovalbúmina en el suero disminuyó significativamente (Figura 8B).

Se investigó si el bloqueo de unión de TL1A a DR3 in vivo bloqueaba la inflamación del pulmón. Se administró Anticuerpo de bloqueo de TL1A L4G6 in vivo a ratones sensibilizados con ovalbúmina los días -1, 0, +1 y +2 de la exposición de las vías respiratorias con aerosol. El bloqueo de interacciones de TL1A-DR3 por el anticuerpo dio como resultado más de 80% de reducción de los números de eosinófilos en el BALF (Figura 10).

El control del desarrollo de la expresión y correlación de DR3 con sesgo de Th2 neonatal. Las respuestas de CD4+ a inmunización no polarizante, estándar, es sesgada en Th2 en neonatos (Figura 11). Se comparó el nivel de expresión de DR3 linfocitos en reposo y activados de ratones adultos y recién nacidos. Se observó la expresión elevada de DR3 en células CD4+ de neonato recién asiladas (Figura 12). Las células CD4+ de neonato en estado de reposo expresaron dos veces más DR3 que las células adultas basándose en intensidad de fluorescencia media (MFI). Las células activadas de ratones de 7 días expresaron DR3 máxima a aproximadamente 3-4 veces el nivel de células adultas activadas. Además, la cinética de la expresión de DR3 en ratones de 7 días se aceleró comparado con células adultas.

El proceso de corte y empalme de DR3 se controla por Activación PKC. El correcto proceso de corte y empalme de ARNm de DR3 está dirigido por activación de linfocitos. Se investigaron las señales requeridas para el proceso de corte y empalme de DR3. El tratamiento con PMA e Ionomicina (Figura 13) y PMA sola indujo el proceso correcto de corte y empalme de DR3, que indica que PKC puede ser responsable del proceso de corte y empalme mediado por activación de DR3. El proceso de corte y empalme de DR3 no se bloqueó por inhibidores de la síntesis de proteínas. El proceso de corte y empalme de DR3 por PKC se confirmó con inhibidores farmacológicos. H7 bloqueó completamente el proceso de corte y empalme de DR3 inducido por activación. Por el contrario, los inhibidores de ERK1/2 (UO126, Calbiochem); p38 (SB203580) o CAM-cinasa dependiente de Ca-calmodulina (KN93) no tuvieron efecto sobre el proceso de corte y empalme.

Ejemplo 3

Transgen DR3 dominante negativo.

El bloqueo de señales de DR3 por transgenes DN-DR3 dominantes negativos en células T bloquea la polarización de Th2. Se purificaron células CD4 por selección negativa y se activaron con CD3 anti-ratón inmovilizado (2 μg/ml) y CD28 anti-ratón soluble (1 μg/ml). Se recogieron los sobrenadantes después de un cultivo de 3 días para la respuesta primaria. Se lavaron las células, se volvieron a poner en placas y se reactivaron con CD3 anti-ratón inmovilizado (1 μg/ml) durante dos días. Haciendo referencia a la Figura 14, la sobreexpresión de FL-DR3 de longitud completa transgénico en células T causó producción de citocina Th2 aumentada para activación primaria. Las células CD4 purificadas de ratones w.t., (barra abierta) transgénicos FL-DR3 (negro) y transgénicos de DR3 dominante negativo (gris) se activaron durante tres días con anti-CD3 y anti-CD28. Después de 72 h, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron (A). Se lavaron las células y se volvieron a poner en placas en anti CD3 durante unas 48 h adicionales antes de análisis de los sobrenadantes (B). Obsérvense los diferentes ejes y en activación secundaria y producción aumentada en CD4 w.t. pero no DN-DR3 tg CD4.

Ejemplo 4

Generación de Anticuerpos DR3 y TL1A.

Se generó una proteína de fusión de DR3-Ig, se purificó y se usó para inmunizar hámsters. Se obtuvieron sobrenadantes de hibridoma y se detectaron sistemáticamente por ELISA usando la proteína de fusión de DR3-Ig

como un agente de detección sistemática. La naturaleza de los hibridomas se verificó por citometría de flujo de Células tumorales transinfectadas de DR3, por métodos Western y por estudios funcionales. Todos los anticuerpos detectaron DR3 de longitud completa y alternativamente generado por corte y empalme en células transinfectadas por FACS, uno de los anticuerpos detectó DR3 en los métodos Western y uno de los anticuerpos (4C12) mostró actividad agonista, que media la señalización de DR3 en ausencia de TL1A.

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales TL1A por inmunización de hámsters con una fusión de proteína de unión a TL1A-maltosa. Los anticuerpos TL1A detectaron TL1A transinfectado por citometría de flujo. Uno de los anticuerpos (L4G6) mostró actividad antagonista, que bloquea unión de TL1A a DR3.

Haciendo referencia a la Figura 15, se transinfectaron células objetivo P815 con FL-mDR3 o con mΔ5,6-DR3 generado por corte y empalme alternativamente, una forma de DR3 que carece de exón 5 y 6 que codifica parte del dominio extracelular. A. Se transinfectó EL4 con mTL1A y se usó como células efectoras a la relación efector:objetivo indicada con P815-DR3 o P815-Δ5,6-DR3 marcado con Cr en ensayos de 5 horas. B. Se usaron sobrenadantes de cultivos de EL4-TL1A (106/ml, 24 h) recogidos a la concentración indicada con los mismos objetivos P815 durante 5 h y se determinó la liberación de Cr. C. Inhibición de liberación de Cr mediada por TL1A por anticuerpo monoclonal L4G6, pero no por otros anticuerpos. El clon L2G8 muestra inhibición parcial. El anticuerpo L4G6 purificado causa el 50% de inhibición a 20 ng/ml.

Ejemplo 5

Producción de IL-13 y eosinofilia en el pulmón.

La función de CD30 en la inflamación del pulmón se examinó usando un modelo de murina de AHR inducido por inmunización de ratones con ovalbúmina en presencia de alumbre como adyuvante y dos semanas más tarde estimulación de los ratones con ovalbúmina por la vía nasal o por inhalación de ovalbúmina en aerosol (Mattes et al.,

J. Immunol.167: 1.683, 2.001). Se inmunizaron ratones sin manipular (w.t.) e inhibidos de CD30 por inyección intraperitoneal (i. p.) con ovalbúmina (10 μg) y alumbre (2 mg) el día 0 y día 5. El día 12, se estimularon los ratones con ovalbúmina en aerosol. Se inyectaron ratones de control (tanto w.t. como inhibidos con CD30) con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) más bien que ovalbúmina. Tres días más tarde, (a) se recogió fluido broncoalveolar (BALF) por lavado (3 x 0,5 ml de PBS) (b) se recogió el sobrenadante resultante de homogenizado y centrifugado de los pulmones ("fluido del pulmón"), (c) se aislaron los ganglios linfáticos torácicos y (d) se recogió suero. Haciendo referencia a la Figura 16, se hizo recuento de exudados celulares en BALF y se caracterizaron por tinción de Wright Giemsa y se determinaron los niveles de IL-13, IL-4, 1L-5, IFN-γ y GM-CSF en la muestras por ELISA. Los resultados mostraron que los niveles de IL-13 en BALF y el fluido de pulmón eran inferiores en ratones knockout con CD30 que los ratones w.t.. En comparación, sin embargo, los niveles de IL-4, IL-5, GM-CSF e IFN-γ fueron aproximadamente los mismos en ambos ratones knockout con CD30 y w.t. entre los animales inmunizados con ovalbúmina y estimulados, el número de células en BALF fue significativamente mayor para los animales w.t. comparado con los animales inhibidos con CD30. Se cuantificó el número de macrófagos, linfocitos, neutrófilos y eosinófilos en BALF. Aunque el número de macrófagos fue aproximadamente el mismo en ambos ratones w.t. e Inhibidos con CD30, el número de las otras células (lo más notablemente eosinófilos) disminuyó fuertemente en los ratones knockout comparado con los ratones w.t.

Haciendo referencia a la Figura 17 (gráfica izquierda), los linfocitos obtenidos de ganglios linfáticos torácicos de los ratones descritos inmediatamente anteriormente se volvieron a estimular in vitro con ovalbúmina y después se analizaron para producción de IL-13, IL-4, IL-5, IFN-γ y GM-CSF. Los resultados mostraron que la producción de IL13 se redujo enormemente y la producción de GM-CSF fue menor en cultivos de células obtenidas de los ratones knockout con CD30 comparado con los obtenidos de los ratones w.t. Los niveles de IL-4, IL-5 e IFN-γ fueron aproximadamente los mismos en cultivos de células obtenidas de ambos ratones knockout con CD30 y w.t.

Haciendo referencia a la Figura 17 (derecha), se determinaron los niveles de IgE en BALF, fluido de pulmón y suero. Los resultados mostraron que los niveles de IgE fueron más o menos los mismos en ambos, ratones knockout con CD30 y w.t.

Ejemplo 6

La producción de IL-13 por señales de CD30 está mediada por TRAF2 y p38.

Se transmitieron señales de CD30 vía TRAF2 y NF-KB. Los ratones transgénicos DO11 TCR específicos para ovalbúmina expresaron altos niveles de CD30 en la activación. Para investigar los requerimientos de señalización para la producción de IL-13 por CD30, se analizaron inhibidores de señalización y ratones transgénicos genéticamente modificados. Las células T transgénicas DO 11 TCR – transgénicas dominante negativo de TRAF (DN) fueron incapaces de producir IL-13 en la señalización de CD30; por el contrario las células T transgénicas IK-Bα-DN produjeron niveles normales de IL-13 en la estimulación de CD3 0 con CD30-Ligando (CD153). De manera similar, los inhibidores p38 farmacológicos, pero no los inhibidores de MEK, bloquearon la producción de IL-13 mediada por CD30. En gran medida, haciendo referencia a la Figura 18, se transmiten señales de CD30 sin estimulación de TCR recurrente a diferencia de las señales de CD28 que requieren acoplamiento de TCR. El

anticuerpo anti-CD30 (Figuras 18A, B) o CD30-L solo (C) regularon hacia arriba selectivamente mensaje de IL-13 y proteína, mientras que la regulación hacia arriba de IL-4, IL-5, IL-10 e IFNγ requería coestimulación TCR.

La función de CD30 en la producción de IL-13 también se investigó usando Células YT, una estirpe celular de linfoma humano que sobreexpresa CD30 de manera constitutiva. El acoplamiento de CD30 con el anticuerpo C10 anti-CD30 agonista causó regulación hacia arriba de niveles en ARNm de IL-13 en células YT. En otros experimentos las células YT transinfectadas con TRAF2DN mostraron regulación hacia abajo de 95 genes por 1,7 veces o más comparado con células YT transinfectadas simuladas. Como se muestra en la Figura 19, IL-13 estaba entre los genes regulados hacia abajo más fuertemente. La Figura 19 muestra productos génicos agrupados por el programa Gene Spring en el grupo de moléculas transductoras de señal, incluyendo IL-13.

Ejemplo 7

Las señales de CD30 aumentan la producción de MMP9 por linfocitos.

Las metaloproteinasas de matriz 9 (MMP9), una gelatinasa, está fuertemente regulada hacia arriba por señales de CD30 inducidas con un anticuerpo agonista anti-CD30. Como se muestra en la Figura 20, esta actividad fue detectable en el sobrenadante de células activadas con CD30 en zimogramos. La secreción de MMP9 puede ser un contribuyente significativo a fibrosis subepitelial vía la activación proteolítica de pro-TGF-1 segregado de células epiteliales en la estimulación de IL-13.

Ejemplo 8

EAE no se resuelve en ratones knock out

Se sabe que EAE muestra remisión espontánea en ratones sin manipular, con una segunda y tercera onda de enfermedad más suave recurrente en una fracción de los ratones afectados. Esta forma ondulada de enfermedad es similar a esclerosis múltiple en el hombre. Para inducir EAE, se inyectó a ratones sin manipular y knockout CD30-Ligando (CD30-LKO) el día 0 MOG, un péptido procedente de glicoproteína oligodendrocítica principal en condiciones que se sabe que inducen EAE. Los resultados se muestran en la Figura 23. La resolución espontánea de la enfermedad no tuvo lugar en ratones k.o. CD30-L, que sugiere que se requiere CDD30-L para la resolución de la enfermedad.

Ejemplo 9

El anticuerpo anti-CD30 interfiere en la resolución de EAE en ratones sin manipular y empeora EAE en ratones knockout de CD30-L.

Haciendo referencia a la Figura 24, el efecto de anticuerpo anti-CD30 en la resolución de EAE se examinó en ratones w.t. y ratones k.o. CD30 -Ligando. Se inyectó a los ratones MOG como en el Ejemplo 8. Los días 0, 4, 7 y 12, se suministraron a los ratones también 100 μg de anticuerpo anti CD30 (número de catálogo 558769, BD Biosciences Pharingen, San Diego, CA) por vía intraperitoneal. En los ratones w.t., la administración de anticuerpo anti-CD30 aumentó la incidencia de enfermedad a 10/10 (100%); causó una forma más severa de enfermedad y evitó la resolución de la enfermedad (que normalmente tienen lugar en ratones w.t. alrededor del día 15). El tratamiento con anticuerpo anti-CD30 por lo tanto imitó los efectos observados en ratones k.o. CD30-L. La administración de anticuerpo anti-CD30 a ratones k.o. CD30-L aumentó la incidencia y la importancia de la enfermedad y causó muerte en 3 de 10 ratones. Estos datos indican que CD30 es un regulador negativo importante de respuestas inmunitarias. En ausencia de CD30-Ligando o en presencia de anticuerpo anti-CD30, las respuestas inmunitarias son mucho más fuertes, que indica que la estimulación de CD30 da como resultado regulación hacia abajo de la respuesta inmunitaria.

Ejemplo 10

Sinergia de CD30 y bloqueo de DR3 en la prevención de polarización TH2 y asma.

Los ratones transgénicos DR3 dominantes negativos (DN) fueron incapaces de señalizar vía DR3 (véanse los Ejemplos 1-3). Estos ratones transgénicos DR3 dominante negativo producen citocinas Th2 disminuidas, incluyendo IL-13 y presentan susceptibilidad disminuida al asma (Ejemplo 2). Los ratones deficientes en CD30 también muestran producción disminuida de IL-13 y susceptibilidad reducida al asma (véase el Ejemplo 5).

Se han generado ratones deficientes en CD30-L que son incapaces de provocar señales de CD30 por el ligando similar (véanse los Ejemplos 8 y 9). Estos ratones fueron generados usando métodos conocidos y esencialmente como se usan para crear Ratones deficientes en CD30. Se ha demostrado que las células T CD4 deficientes en CD30-L presentan Actividad de la Enfermedad del huésped contra el Injerto disminuida después de trasplante de médula ósea alogénico.

Se cruzan ratones DN-DR-tg con ratones deficientes en CD30-L para generar ratones deficientes en CD30-L, transgénicos de DN-DR3. Se ensayaron esplenocitos de estos ratones para proliferación de células T esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Los niveles de diversas citocinas, incluyendo IL-13, se ensayan por ELISA

esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Se ensaya en los ratones el efecto sobre la enfermedad del pulmón inflamado usando el modelo de inflamación aguda de pulmón inducida por ovalbúmina esencialmente como se describe en el Ejemplo 2. Estos y otros tipos de ensayos conocidos se pueden usar para caracterizar la supresión sinérgica de la producción de IL-13 y debería ser incluso más resistente al asma que las cepas parenterales.

En otra propuesta, se trataron ratones CD30-L con un anticuerpo anti TL1A de bloqueo, tal como el anticuerpo L4G6 descrito en el Ejemplo 4. Se miden las citocinas como se describió anteriormente. El efecto sobre la señalización también se ensaya esencialmente como se describe en el Ejemplo 4. Este procedimiento debería eliminar la unión de TL1A a DR3 y sinergizar con la ausencia de señales de CD30.

El efecto sinérgico de bloquear señales de CD30 y DR3 simultáneamente se espera que potencie la actividad de cada agente solo. Por lo tanto, el uso de uno o más de los agentes que bloqueen ambas señalizaciones de CD30 y DR3 se espera que permita la inhibición sinérgica de señalización de IL-13 y dicha combinación se pueda usar para tratar la enfermedad del pulmón inflamado, incluyendo asma. El uso de los agentes que bloqueen la señalización de ambos CD30 y DR3 permite la reducción de la dosis de cada agente solo y disminuye posibles efectos secundarios al tiempo que se mantiene o aumenta la actividad terapéutica.

Ejemplo 11

Expresión de DR3 y TL1A en células del sistema inmunitario.

Se examinó la expresión de DR3 en células T específicas. DR3 se expresa en células T asesinas naturales (NKT). Se ha demostrado por otros que se requieren células NKT para la inducción de asma.

La Figura 25 muestra la expresión de mDR3 en ganglios linfáticos de ratones wt B6 y ratones transgénicos DR3 medida por citometría de flujo. Se tiñeron células de los ganglios linfáticos inguinales en reposo con anti DR3 y el respectivo segundo anticuerpo. La expresión de DR3 se muestra después de restringe en células CD4, CD8, B220 o CD11c. se restringen las células NK NK1.1 positivas y CD3 negativas; las células NKT se restringen NK1.1 y CD3 células doble positivas.

También se examinó la expresión de TL1A del DR3 ligando. Los ganglios linfáticos bronquiales, pero no otros ganglios linfáticos, expresan TL1A después de inmunización. Dada la expresión de TL1A en los ganglios linfáticos bronquiales y la expresión de DR3 en células NKT, el caso más temprano en la inducción de asma puede ser por unión de TL1A de los ganglios linfáticos bronquiales a DR3 en células NKT, que se activaron para producir IL-13. Esto es el episodio clave en la iniciación de AHR.

La Figura 26 muestra la expresión de mTL1A en los ganglios linfáticos bronquiales (los LN) de ratones wt B6 sensibilizados con ovalbúmina y estimulados con aerosol. La Figura 26A muestra que el anticuerpo monoclonal antimTL1A tiñó mTL1A en células P815 transinfectadas con TL1A, pero no células no transinfectadas. La Figura 26B muestra que la expresión de mTL1A sólo se detectó en una porción de CD11c que expresa DC (flecha) en células de los ganglios linfáticos bronquiales de ratones wt B6 sensibilizados con OVA y estimulados con aerosol. Las células fueron restringidas en células positivas CD4, CD8, B220, CD11c o DX5 o células doble positivas NK1.1 y CD3.

DC positivo CD11c en otros ganglios linfáticos son negativos para TL1A. Los ganglios linfáticos bronquiales son TL1A positivo sólo después de estimulación con aerosol.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo que se une específicamente a TL1A para uso en un método de tratamiento de asma, en el que el

   anticuerpo bloquea la unión de TL1A a DR3 y disminuye la actividad de DR3, según lo cual disminuye la expresión 5 de IL- 13.

2. 2.

   El anticuerpo según la reivindicación 1, para uso en un método de tratamiento de asma según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

3. 3.

   El anticuerpo según la reivindicación 1, para uso en un método de tratamiento del asma según la reivindicación 1,

   en el que el asma se caracteriza por infiltración de eosinófilos en el pulmón y el anticuerpo reduce el número de 10 eosinófilos en el pulmón.