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ES2428384T3 - Partículas similares al virus de la influenza (VLP) que contienen hemaglutinina producida dentro de una planta - Google Patents

Partículas similares al virus de la influenza (VLP) que contienen hemaglutinina producida dentro de una planta Download PDF

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ES2428384T3
ES2428384T3 ES08783201T ES08783201T ES2428384T3 ES 2428384 T3 ES2428384 T3 ES 2428384T3 ES 08783201 T ES08783201 T ES 08783201T ES 08783201 T ES08783201 T ES 08783201T ES 2428384 T3 ES2428384 T3 ES 2428384T3
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hemagglutinin
virus
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ES08783201T
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English (en)
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Marc-André D'Aoust
Manon Couture
Frédéric ORS
Sonia Trepanier
Pierre-Olivier Lavoie
Michèle DARGIS
Louis-Philippe Vezina
Nathalie Landry
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Medicago Inc
Original Assignee
Medicago Inc
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Publication date
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Abstract

Un método para producir partículas similares al virus de la influenza (VLP) en una planta, que comprende: a) introducir un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una hemaglutinina deinfluenza (HA) operativamente enlazada a una región reguladora activa en la planta dentro de la planta, o en unaporción de la misma, b) incubar la planta bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo así las VLP, c) cosechar la planta, y d) purificar las VLP, en donde las VLP están en un intervalo de tamaño de 80 - 300 nm.

Description

Partículas similares al virus de la influenza (VLP) que contienen hemaglutinina producida dentro de una planta
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con la producción de partículas similares a virus. Más específicamente, la presente invención está dirigida a la producción de partículas similares a virus que comprenden antígenos de influenza.
Antecedentes de la invención
La influenza es la causa principal de muerte en seres humanos debido a un virus respiratorio. Los síntomas comunes incluyen fiebre, dolor de garganta, respiración entrecortada y dolor muscular, entre otros. Durante la temporada de gripe, los virus de la influenza infectan 10 - 20% de la población en todo el mundo, conduciendo a 250
-
500.000 muertes anualmente.
Los virus de la influenza son virus encapsulados que brotan de la membrana plasmática de células de mamíferos infectados. Se clasifican en tipos A, B o C, con base en las nucleoproteínas y antígenos de matriz de proteína presentes. Los virus de la influenza tipo A pueden además dividirse en subtipos de acuerdo con la combinación de glicoproteínas de superficie de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) presentes. La HA controla la capacidad del virus para unirse y penetrar la célula huésped. La NA remueve residuos de ácido siálico terminal de las cadenas de glicano en la célula huésped y las proteínas de la superficie viral, lo cual evita la agregación viral y facilita la movilidad del virus. Actualmente, se reconocen los subtipos 16 HA (H1 - H16) y 9 NA (N1 - N9). Cada virus de influenza del tipo A presenta un tipo de glicoproteína HA y un tipo de glicoproteína NA. Generalmente, cada subtipo exhibe una especificidad de especie; por ejemplo, se sabe que todos los subtipos de HA y NA infectan aves, mientras que sólo los subtipos H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10, N1, N2, N3 y N7 han demostrado que infectan seres humanos (Horimoto 2006; Suzuki 2005). Los virus de la influenza que comprenden H5, H7 y H9 se consideran las formas más altamente patógenas de virus de influenza A, y es más probable que causen futuras pandemias.
Las pandemias de influenza son usualmente causadas por virus de influenza altamente transmisibles y virulentos, y pueden conducir a niveles elevados de enfermedad y muerte a escala mundial. El surgimiento de nuevos subtipos de influenza A dio como resultado 4 pandemias mayores en el siglo 20. La gripe española, causada por un virus H1N1, en 1918 - 1919 condujo a la muerte a más de 50 millones de personas en todo el mundo entre 1917 y 1920. Actualmente, el riesgo de surgimiento de un nuevo subtipo, o de la transmisión a seres humanos de un subtipo endémico en animales, está siempre presente. De interés especial es una forma altamente virulenta de una influenza aviar (también llamada “gripe aviar”), brotes de los cuales han sido reportados en varios países alrededor del mundo. En muchos casos, esta gripe aviar puede resultar en tasas de mortalidad cercanas al 100% en un lapso de 48 horas. La diseminación del virus de influenza aviar (H5N1), identificada primero en Hong Kong en 1997, a otros países asiáticos y europeos se ha postulado que está relacionado con los patrones migratorios de aves silvestres.
El método actual para combatir la influenza en seres humanos es por medio de vacunación anual. La vacuna es usualmente una combinación de varias cepas que se predice son las cepas dominantes para la “gripe de la temporada” entrante. La predicción es coordinada por la Organización Mundial de la Salud. Generalmente, el número de dosis de vacunas producidas cada año no es suficiente para vacunar a la población mundial. Por ejemplo, Canadá y los Estados Unidos obtienen suficientes dosis de vacunas para inmunizar alrededor de un tercio de su población, mientras sólo 17% de la población de la Unión Europea pueden ser vacunados. Es evidente que la producción actual en todo el mundo de vacuna contra la influenza podría ser insuficiente frente a una pandemia de gripe en todo el mundo. Incluso si la producción anual necesaria pudiera de algún modo cumplirse en un año determinado, las cepas dominantes cambian de año en año, de modo que la acumulación en momentos de menos necesidad en el año no es práctica. La producción económica a gran escala de una vacuna efectiva contra la influenza es de interés significativo tanto para el gobierno como para la industria privada por igual.
Las reservas virales para su uso en vacunas son producidas en huevos fertilizados. Las partículas virales son cosechadas, y para una vacuna viral inactivada, interrumpidas por medio de detergente para inactivarlas. Las vacunas vivas atenuadas se elaboran a partir de virus de la influenza que fueron adaptados para crecer a baja temperatura lo cual significa que a temperatura corporal normal, se atenúa la vacuna. Tal vacuna se autoriza en los Estados Unidos para su uso en individuos comprendidos entre 5 y 49 años de edad. Las vacunas de virus enteros inactivados no causan ningún daño por la inactivación con agentes químicos y han sido producidas en huevos embrionarios o en cultivos de células de mamíferos. Todos estos tipos de vacuna muestran algunas ventajas y desventajas específicas. Una ventaja de vacunas derivadas de virus enteros es el tipo de inmunidad inducida por tales vacunas. En general, las vacunas divididas inducen una fuerte respuesta de anticuerpos mientras las vacunas elaboradas a partir de virus enteros inducen tanto una respuesta de anticuerpos (humoral) como celular. Aun cuando una respuesta de anticuerpos funcional es un criterio para obtener la licencia que se correlaciona con la protección inducida por una vacuna, existe una evidencia cada vez mayor de que una respuesta de células T es también importante en la inmunidad contra influenza - esto puede también proporcionar mejor protección en los ancianos.
Con el fin de inducir una respuesta inmune celular, se desarrollaron vacunas elaboradas a partir de virus completos. Debido a la alta patogenicidad de la cepa de la influenza (por ejemplo, H5N1), estas vacunas son producidas en una instalación BL3+. Para cepas de influenza altamente patógenas tales como H5N1, algunos fabricantes han modificado la secuencia génica de la hemaglutinina con el fin de reducir la patogenicidad de la cepa de la influenza y volverla no virulenta y más fácilmente producida en huevos embrionarios o cultivos celulares de mamíferos. Otros también utilizan cepas de influenza nuevamente mezcladas en las cuales las secuencias genéticas para las proteínas de hemaglutinina y neuraminidasa se clonan en una cepa donadora de influenza poco patógena de alto rendimiento (A/PR/8/34; Quan F-S et al, 2007). Aunque estos métodos pueden producir vacunas útiles, no proporcionan una solución a la necesidad de una producción rápida, de bajo costo, y en gran volumen de vacunas a escala necesaria para satisfacer la necesidad global en un año normal, y es casi seguro que sería insuficiente frente a una pandemia.
Al utilizar esta tecnología genética inversa, se podría necesitar también mutar la secuencia genética de la proteína HA para hacerla no virulenta. Para cepas de influenza altamente patógenas, la producción de vacunas a partir de virus completos requiere ya sea procedimientos de confinamiento o que las vacunas resultantes no coincidan exactamente con la secuencia genética del virus circulante. En el caso de vacunas vivas atenuadas, existe aún un riesgo de que la vacuna administrada pueda recombinarse con un virus de la influenza del huésped, conduciendo a un nuevo virus de influenza.
Aunque este método mantiene el epítopo antigénico y las modificaciones después de la traducción, existen una cantidad de inconvenientes con este método, incluyendo el riesgo de contaminación debido al uso de virus completos y rendimientos variables dependiendo de la cepa del virus. Pueden presentarse niveles de protección por debajo del óptimo por la heterogeneidad genética en el virus debido a su introducción en los huevos. Otras desventajas incluyen planificación extensa para obtener los huevos, riesgos de contaminación debidos a compuestos químicos utilizados en la purificación, y largos periodos de producción. También, personas hipersensibles a proteínas del huevo no pueden ser candidatas aptos para recibir la vacuna.
En el caso de una pandemia, la producción de vacunas divididas se limita por la necesidad para adaptar la cepa para ser cultivada en huevos y los rendimientos de producción variable logrados. Aunque esta tecnología ha sido utilizada durante años para la producción de vacunas de temporada, difícilmente puede responder en un plazo razonable a una pandemia y la capacidad de fabricación a nivel mundial es limitada.
Para evitar el uso de huevos, los virus de la influenza también han sido producidos en cultivo de células de mamífero, por ejemplo, en células MDCK o PERC.6, o similares. Otro enfoque es la genética inversa, en la cual se producen virus por transformación celular con genes virales. Estos métodos, sin embargo, también requieren el uso de virus completos así como métodos elaborados y ambientes de cultivo específicos.
Se han desarrollado diferentes productos recombinantes como candidatos de vacunas recombinantes contra influenza. Estos procedimientos se han enfocado en la expresión, producción y purificación de proteínas HA y NA de influenza tipo A, incluyendo la expresión de estas proteínas utilizando células de insectos infectadas con baculovirus (Crawford et al, 1999; Johansson, 1999), vectores virales y construcciones de vacunas de ADN (Olsen et al., 1997).
Se conocen bien los detalles específicos de una infección de virus de la influenza. En pocas palabras, el ciclo infeccioso se inicia por la unión de la proteína HA de la superficie del virión a un receptor celular que contiene ácido siálico (glicoproteínas y glicolípidos). La proteína NA media el procesamiento del receptor de ácido siálico, y la penetración de virus en al célula depende de una endocitosis mediada por el receptor que depende de HA. En los límites de acidez de los endosomas internalizados que contienen un virión de influenza, la proteína HA experimenta cambios conformacionales que conducen a la fusión de membranas virales y celulares y el desprendimiento del recubrimiento del virus y la liberación mediada por M2 de proteínas MI a partir de ribonucleoproteínas asociadas con la nucleocápside (RNP), las cuales migran en el núcleo celular para la síntesis del ARN viral. Los anticuerpos para las proteínas HA evitan la infección por virus neutralizando la infectividad viral, mientras que los anticuerpos para proteínas NA median su efecto en etapas tempranas de la replicación viral.
Crawford et al. (1999) divulga la expresión de HA de influenza en células de insectos infectadas con baculovirus. Las proteínas expresadas son descritas como capaces de evitar una enfermedad de influenza letal causada por subtipos de influenza H5 y H7 aviar. Johansson et al. (1999) enseña que las proteínas HA y NA de influenza expresada en baculovirus inducen respuestas inmunes en animales, superiores a aquellas inducidas por una vacuna convencional. La inmunogenicidad y eficacia de la hemaglutinina expresada por baculovirus del virus de influenza equina se comparó con un candidato de vacuna de ADN homólogo (Olsen et al., 1997). Colectivamente, estos datos demuestran que se puede inducir un alto grado de protección contra un desafío por parte del virus de la influenza con proteínas HA o NA recombinantes, utilizando varios enfoques experimentales y en diferentes modelos de animales.
Ya que investigaciones previas han demostrado que las glicoproteínas superficiales de la influenza, HA y NA, son los objetivos primarios para provocar inmunidad protectora contra el virus de la influenza y que M1 proporcione un objetivo conservado para inmunidad celular para influenza, un nuevo candidato de vacuna puede incluir estos antígenos virales como una partícula macromolecular de proteína, tal como partículas similares a virus (VLP). Como productos para vacunas, las VLP ofrecen la ventaja de ser más inmunogénicas que la subunidad o los antígenos recombinantes y son capaces de estimular tanto la respuesta inmune humoral como celular (Grgacic y Anderson, 2006). Además, la partícula con estos antígenos de influenza pueden desplegar epítopos conformacionales que producen anticuerpos neutralizantes para múltiples cepas del virus de influenza.
La producción de una cepa del virus de la influenza no infecciosa para propósitos de vacunas es una forma para evitar una infección inadvertida. Alternativamente, se han investigado partículas similares a virus (VLP) como sustitutos para los virus cultivados. Las VLP imitan la estructura de la cápside viral, aunque carecen de un genoma, y de este modo no pueden replicar o proporcionar un medio para una infección secundaria.
Varios estudios han demostrado que las proteínas de influenza recombinantes se auto-ensamblan en las VLP en un cultivo celular utilizando plásmidos de expresión de mamíferos o vectores de baculovirus (Gomez-Puertas et al., 1999; Neumann et al., 2000; Latham y Galarza, 2001). Gomez-Puertas et al. (1999) divulgan que la formación eficiente de VLP de influenza depende de los niveles de expresión de varias proteínas virales. Neumann et al. (2000) establecen un sistema basado en plásmidos de expresión de mamíferos para generar partículas infecciosas similares al virus de la influenza completamente a partir de los ADNc clonados. Latham y Galarza (2001) reportaron la formación de las VLP de influenza en células de insectos infectadas con baculovirus recombinante que coexpresan genes HA, NA, M1 y M2. Estos estudios demuestran que las proteínas del virión de influenza pueden auto-ensamblarse después de la coexpresión en células eucariotas.
Gomez-Puertas et al. (2000) enseñan que, además de la hemaglutinina (HA), la proteína matriz (M1) del virus de la influenza es esencial para la germinación de VLP a partir de células de insectos. Sin embargo, Chen et al. (2007) enseñan que M1 podría no ser requerida para la formación de VLP y observaron que la liberación eficiente de M1 y las VLP requieren la presencia de HA y la actividad de sialidasa provista por NA. La NA escinde los ácidos siálicos de las glicoproteínas en la superficie de las células produciendo las VLP, y liberando las VLP en el medio.
Quan et al 2007 enseñan que una vacuna de VLP producida en un sistema de expresión de baculovirus (célula de insecto) induce una inmunidad protectora contra algunas cepas del virus de la influenza (A/PR8/34 (H1N1)). Se observó que las VLP estudiadas por Quan brotan de la membrana plasmática, y se consideró que eran del tamaño y morfología correctos, similares a aquellas obtenidas en un sistema de mamífero (células MDCK).
Los virus encapsulados pueden obtener su envoltura lipídica cuando ‘brotan' fuera de la célula infectada y obtienen la membrana de la membrana plasmática, o de aquella de un orgánulo interno. Las partículas de virus de la influenza y las VLP brotan de la membrana plasmática de la célula huésped. En sistemas de células de mamíferos o de baculovirus, por ejemplo, la influenza brota de la membrana plasmática (Quan et al. 2007). Se sabe que sólo unos pocos virus encapsulados infectan plantas (por ejemplo, miembros de los Tospovirus y Rabdovirus). Los virus conocidos encapsulados de plantas, se caracterizan por brotar de las membranas internas de la célula huésped, y no de la membrana plasmática. Aunque un pequeño número de VLP recombinantes han sido producidas en plantas hospederas, ninguna se derivó de la membrana plasmática, planteando la cuestión de que si las VLP derivadas de la membrana plasmática, incluyendo las VLP de influenza, pueden ser producidas en plantas.
Las tecnologías actuales para la producción de VLP de influenza se basan en la coexpresión de múltiples proteínas virales, y esta dependencia representa una desventaja de estas tecnologías ya que en caso de una pandemia y de epidemias anuales, el tiempo de respuesta es crucial para la vacunación. Un sistema de producción más simple de VLP, que se basa en la expresión de sólo una proteína viral es deseable para acelerar el desarrollo de la vacuna.
Con el fin de proteger a la población mundial de la influenza y para evitar futuras pandemias, los fabricantes de vacunas necesitarán desarrollar métodos rápidos, efectos para producir dosis de vacunas. El uso actual de huevos fertilizados para producir vacunas es insuficiente e implica un proceso lento.
Resumen de la invención
Un objetivo de la invención es proporcionar partículas mejoradas similares al virus de la influenza (VLP).
La presente invención también proporciona un método para producir partículas similares al virus de la influenza (VLP) en una planta, que comprende:
a) introducir un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una hemaglutinina (HA) de influenza, operativamente enlazada a una región reguladora activa en la planta, dentro de la planta o una porción de la misma,
b) incubar la planta o una porción de la misma bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo así las VLP,
cosechando la planta y purificando o separando las VLP del tejido vegetal, en donde las VLP tienen un tamaño en el intervalo de 80 - 300 nm.
La presente invención incluye el método anterior en donde, en la etapa de introducción (etapa a), el ácido nucleico puede expresarse ya sea en forma transitoria en la planta, o expresarse en forma estable en la planta. Además, se pueden purificar las VLP utilizando cromatografía por exclusión de tamaño.
La presente invención también proporciona una partícula similar a virus (VLP) producida de acuerdo con el método que comprende una proteína HA del virus de la influenza y uno o más de un lípido de la planta.
También se incluye en la presente invención una composición que comprende una dosis efectiva de una VLP producida de acuerdo con el método que comprende una proteína HA del virus de la influenza, uno o más de un lípido de la planta, y un portador farmacéuticamente aceptable.
También se contemplan fragmentos o porciones de proteínas HA que forman VLP en una planta.
La VLP puede comprender una proteína HA de uno o más de un subtipo, incluyendo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16 o un fragmento o porción de los mismos. Ejemplos de subtipos que comprenden tales proteínas HA incluyen A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/pollo/Nueva York/1995, A/gaviota argéntea/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/ánade real/MN/33/00, A/pato/Shanghái/1/2000, A/ánade de cola larga/TX/828189/02, A/Pavo/Ontario/6118/68 (H8N4), A/pato cuchareta/ Irán/G54/03, A/pollo/Alemania/N/1949 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56 (H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5),A/Gaviota/Maryland/704/77 (H13N6), A/Ánade real/Gurjev/263/82, A/pato/Australia/341/83 (H15N8), A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburgo/66, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1), A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6Nl), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2).
En un aspecto de la invención, la proteína Ha puede ser un subtipo H1, H2, H3, H5, H6, H7 o H9. En otro aspecto, la proteína H1 puede ser de la cepa A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), o A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1). La proteína H3 puede también ser de la cepa A/Brisbane 10/2007 (H3N2)
o A/Wisconsin/67/2005 (H3N2). En un aspecto adicional de la invención, la proteína H2 puede ser de la cepa A/Singapur/1/57 (H2N2). La proteína H5 puede ser de la cepa A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)
o A/Indonesia/5/2005. En un aspecto de la invención, la proteína H6 puede ser de la cepa A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1). La proteína H7 puede ser de la cepa A/Equino/Praga/56 (H7N7). En un aspecto de la invención, la proteína H9 es de la cepa A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). En un aspecto adicional de la invención, la proteína HA puede ser de un virus de la influenza tipo B, incluyendo B/Malasia/2506/2004 o B/Florida/4/2006. Ejemplos de secuencias de aminoácidos de las proteínas HA de los subtipos H1, H2, H3, H5, H6, H7 o H9 incluyen las SEQ ID NOs: 48 - 59.
La proteína HA del virus de la influenza puede ser H5 Indonesia.
La presente invención involucra moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias que codifican una proteína HA. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender además una o más regiones reguladoras operativamente enlazadas a la secuencia que codifica una proteína HA. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender una secuencia que codifica una H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16. La proteína HA codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser un subtipo H1, H2, H3, H5, H6, H7 o H9. La proteína H1 codificada por la molécula de ácido nucleico es de la cepa A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), o A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1). La proteína H3 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Brisbane 10/2007 (H3N2), o A/Wisconsin/67/2005 (H3N2). La proteína H2 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Singapur/1/57 (H2N2). La proteína H5 codificada por la molécula de ácido nucleico puede también ser de la cepa A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) o A/Indonesia/5/2005. La proteína H6 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1). La proteína H7 codificada por la molécula de ácido nucleico puede también ser de la cepa A/Equino/Praga/56 (H7N7). Adicionalmente, la proteína H9 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). Los ejemplos de secuencias de moléculas de ácido nucleico que codifican tales proteínas HA de los subtipos H1, H2, H3, H5, H6, H7 o H9 incluyen las SEQ ID NOs: 36 - 47 y 60 - 73.
La secuencia de ácido nucleico puede codificar la proteína HA del virus de la influenza H5 Indonesia.
Las regiones reguladoras que pueden enlazarse operativamente a una secuencia que codifica una proteína HA incluyen aquellas que son operativas en una célula vegetal, una célula de insecto o una célula de levadura. Tales regiones reguladoras pueden incluir una región reguladora de plastocianina, una región reguladora de Ribulosa 1,5bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCo), una proteína de unión a/b de clorofila (CAB), ST-LS1, una región reguladora de polihedrina, o una región reguladora gp64. Otras regiones reguladoras incluyen una 5' UTR, 3’ UTR o secuencias terminadoras. La región reguladora de plastocianina puede ser una región reguladora de plastocianina de alfalfa; las secuencias 5’ UTR, 3’ UTR o terminadoras también pueden ser secuencias de alfalfa.
Las composiciones de la invención son útiles en la inducción de inmunidad a una infección por virus de la influenza en un sujeto. Puede comprender administrar la partícula similar a virus que comprende una proteína de HA del virus de la influenza, uno o más de un lípido de planta, y un portador farmacéuticamente aceptable. La partícula similar a virus puede administrarse a un sujeto en forma oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea.
Adicionalmente la presente invención se relaciona con una partícula similar a virus (VLP) que comprende una proteína HA del virus de la influenza y uno o más de un lípido hospedador derivado de una planta.
También se contemplan composiciones que comprenden las VLP de dos o más cepas o subtipos de influenza. Los dos o más subtipos o cepas se pueden seleccionar del grupo que comprende: A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/pollo/Nueva York/1995, A/gaviota argéntea/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/ánade real/MN/33/00, A/pato/Shanghái/1/2000, A/ánade de cola larga/TX/828189/02, A/Pavo/Ontario/6118/ 68 (HBN4), A/pato cuchareta/Irán/G54/03, A/pollo/Alemania/N/1949 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56(H11N6), A/pato/ Alberta/60/76 (H12N5), A/Gaviota/Maryland/704/77 (H13N6), A/Ánade real/Gurjev/263/82, A/pato/Australia/341/83 (H15N8), A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburgo/66, A/PuertoRico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1), A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). Dos o más subtipos o cepas de VLP pueden estar presentes en cantidades aproximadamente equivalentes; alternativamente uno o más subtipos o cepas pueden ser la mayoría de las cepas o subtipos representados.
La presente invención se relaciona con una composición de la invención para uso en la inducción de inmunidad con una infección por virus de la influenza en un animal u organismo objetivo que comprende la administración de una dosis efectiva de una vacuna que comprende una o más de una VLP, la VLP producida utilizando una planta hospedera. La vacuna puede administrarse en forma oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea. El organismo objetivo puede seleccionarse del grupo que comprende seres humanos, primates, caballos, cerdos, aves, aves acuáticas (aviar), aves migratorias, codorniz, pato, ganso, aves de corral, pollo, camello, caninos, perros, felinos, gatos, tigre, leopardo, civeta, visón, marta, hurones, mascotas, ganado, ratones, ratas, focas, ballenas y similares.
La presente invención se relaciona con un método para producir VLP que contienen hemaglutinina (HA) a partir de diferentes cepas de influenza en una planta hospedera capaz de producir una VLP. Las VLP que se producen en
La producción de VLP en plantas presenta varias ventajas sobre la producción de estas partículas en un cultivo de células de insecto. Los lípidos de plantas pueden estimular las células inmunes específicas y mejorar la respuesta inmune inducida. Las membranas de plantas están constituidas por lípidos, fosfatidilcolina (PC) y fosfatidil etanolamina (PE) y también contienen glicoesfingolípidos que son únicos para plantas y algunas bacterias y protozoarios. Los esfingolípidos son inusuales porque no son ésteres de glicerol como PC o PE sino que consisten más bien de un amino alcohol de cadena larga que forma un enlace amida con una cadena de ácido graso que contiene más de 18 carbonos. La PC y la PE así como los glicoesfingolípidos pueden unirse a moléculas CD1 expresadas por células inmunes de mamíferos tal como células que presentan antígenos (APC) similares a células dendríticas y macrófagos y otras células incluyendo linfocitos B y T en el timo y el hígado (Tsuji, M., 2006). Más aún, además del efecto adyuvante potencial de la presencia de lípidos de plantas, la capacidad de los N-glicanos de la planta para facilitar la captura de antígenos de glicoproteína por células que presentan antígenos (Saint-Jore-Dupas, 2007), puede ser ventajosa para la producción de VLP en plantas.
Sin ánimo de ceñirse a una teoría en particular, se anticipa que las VLP elaboradas en las plantas inducirán una reacción inmune más fuerte que las VLP elaboradas en otros sistemas de fabricación y que la reacción inmune inducida por estas VLP elaboradas en las plantas será más fuerte cuando se compara con la reacción inmune inducida por vacunas de virus completos vivos o atenuados.
Contrario a las vacunas elaboradas a partir de virus completos, las VLP tienen la ventaja de que no son infecciosas, por lo tanto la contención biológica restrictiva no es un problema importante como podría ser al trabajar con un virus infeccioso completo, y no se requiere para la producción. Las VLP elaboradas en la planta, proporcionan una ventaja adicional de nuevo al permitir que el sistema de expresión sea cultivado en un invernadero o campo, siendo así significativamente más económicas y adecuadas para ser escaladas.
Adicionalmente, las plantas no comprenden las enzimas implicadas en la síntesis y la adición de residuos de ácido siálico a las proteínas. Las VLP puede ser producidas en la ausencia de neuraminidasa (NA), y no hay necesidad de coexpresar NA, o de tratar las células productoras o de extraer con sialidasa (neuraminidasa) para asegurar la producción de VLP en las plantas.
Las VLP producidas de acuerdo con la presente invención no comprenden la proteína M1 la cual se sabe que se enlaza al ARN. El ARN es un contaminante de la preparación de VLP y es indeseado cuando se obtienen la aprobación reglamentaria para el producto de VLP.
El resumen de la invención no describe necesariamente todas las características de la invención.
Breve descripción de las figuras
Estas y otras características de la invención se volverán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la cual se hace referencia a las figuras anexas, en donde:
La FIGURA 1A muestra una secuencia de un casete de expresión basado en plastocianina de alfalfa utilizado para la expresión de H1 de acuerdo con una forma de realización de la presente invención (SEQ ID NO: 8). El péptido de señal de la proteína disulfuro isomerasa (PDI) está subrayado. Los sitios de restricción BglII (AGATCT) y SacI (GAGCTC) utilizados para clonación se muestran en negritas.
La Figura 1B muestra un diagrama esquemático de dominios funcionales de hemaglutinina de influenza. Después de la escisión de los fragmentos HA0, HA1 y HA2 permanecen unidos por un puente disulfuro.
La FIGURA 2A muestra una representación del plásmido 540 ensamblado para la expresión del subtipo H1 de HA. La FIGURA 2B muestra una representación del plásmido 660 ensamblado para la expresión del subtipo H5 de HA.
La FIGURA 3 muestran una cromatografía por exclusión de tamaño de extractos de proteína a partir de hojas que producen hemaglutinina H1 o H5. La FIGURA 3A muestra el perfil de elusión de H1; Azul Dextrano 2000 (triángulos) y proteínas (diamantes). La FIGURA 3B muestra la inmunodetección (transferencia tipo Western; anti H1) de fracciones de elución de H1 después de la cromatografía por exclusión de tamaño (cuentas de S500HR). La FIGURA 3C muestra el perfil de elución de H5; Azul Dextrano 2000 (triángulos) y proteínas (diamantes). La FIGURA 3D muestra la inmunodetección (transferencia tipo Western; anti H5) de fracciones de elusión de H5 después de la cromatografía por exclusión de tamaño (cuentas de S500HR).
La FIGURA 4 muestra una fotomicrografía de microscopio electrónico de estructuras grandes de hemaglutinina H1 y H5 a partir de la fracción 9 de elución desde una columna por exclusión de tamaño. La FIGURA 4A muestra una amplificación de 50.000 veces de una VLP de H1 que muestra la presencia de múltiples estructuras similares (la barra representa 200 nm). La FIGURA 4B muestra un aumento de 150.000 veces de una VLP de H1 (la barra representa 100 nm). La FIGURA 4C muestra un aumento de 50.000 veces de una VLP de H5 que muestran la presencia de múltiples estructuras similares (la barra representa 50 nm).
La FIGURA 5A muestra la secuencia del fragmento del terminal N de H1 (SEQ ID NO: 1). La FIGURA 5B muestra el fragmento del terminal C de H1 (SEQ ID NO: 2). La FIGURA 5C muestra la secuencia completa que codifica HA0 de H1 (SEQ ID NO: 28).
La FIGURA 6 muestra la secuencia que codifica H5 flanqueada por un sitio HindIII inmediatamente secuencia arriba de ATG inicial, y un sitio SacI inmediatamente secuencia abajo del codón de detención (TAA) (SEQ ID NO: 3).
La FIGURA 7A muestra la secuencia del cebador Plasto-443c (SEQ ID NO: 4). La FIGURA 7B muestra la secuencia del cebador SpHA(Ind)-Plasto.r (SEQ ID NO: 5). La FIGURA 7C muestra la secuencia del cebador PlastoSpHA(Ind).c (SEQ ID NO: 6). La FIGURA 7D muestra la secuencia del cebador HA(Ind)-Sac.r (SEQ ID NO: 7).
La FIGURA 8A muestra la secuencia de aminoácidos de la secuencia del péptido HA1 (SEQ ID NO: 9). La FIGURA 8B muestra la secuencia de aminoácidos de la secuencia del péptido HA5 (SEQ ID NO: 10). El péptido señal nativo se indica en negritas.
La FIGURA 9 muestra la secuencia de HA del subtipo H7 de influenza A (SEQ ID NO: 11).
La FIGURA 10A muestra la secuencia de HA de influenza A, subtipo H2 (SEQ ID NO: 12). La FIGURA 10B muestra la secuencia del subtipo H3 de HA de influenza A (SEQ ID NO: 13). La FIGURA 10C muestra la secuencia del subtipo H4 de HA de Influenza A (SEQ ID NO: 14). La FIGURA 10D muestra la secuencia del subtipo H5 de HA de Influenza A (SEQ ID NO: 15). La FIGURA 10E muestra la secuencia del subtipo H6 de HA de Influenza A (SEQ ID NO: 16). La FIGURA 10F muestra la secuencia del subtipo H8 de HA de Influenza A (SEQ ID NO: 17). La FIGURA 10G muestra la secuencia del subtipo H9 de HA de Influenza A (SEQ ID NO: 18). La FIGURA. 10H muestra la secuencia del subtipo H10 de HA de Influenza A (SEQ ID NO: 19). La FIGURA 10I muestra la secuencia del subtipo H11 de HA de Influenza A (SEQ ID NO: 20). La FIGURA 10J muestra la secuencia del subtipo H12 de HA de Influenza A (SEQ ID NO: 21). La FIGURA 10K muestra la secuencia del subtipo H13 de HA de Influenza A (SEQ ID NO: 22). La FIGURA 10L muestra la secuencia del subtipo H14 de HA de Influenza A (SEQ ID NO: 23). La FIGURA 10M muestra la secuencia del subtipo H15 de HA de Influenza A (SEQ ID NO: 24). La FIGURA 10N muestra la secuencia del subtipo H16 de HA de Influenza A (SEQ ID NO: 25). La Figura 10O muestra la secuencia de HA de Influenza B (SEQ ID NO: 26). La FIGURA 10P muestra la secuencia de HA de Influenza C (SEQ ID NO: 27). La FIGURA 10Q muestra la secuencia del cebador Xmal-pPlas.c (SEQ ID NO: 29). La FIGURA 10R muestra la secuencia del cebador SacI-ATG-pPlas.r (SEQ ID NO: 30). La FIGURA 10S muestra la secuencia del cebador SacIPlasTer.c (SEQ ID NO: 31). La FIGURA 10T muestra la secuencia del cebador EcoRI-PlasTer.r (SEQ ID NO: 32).
La FIGURA 11 muestra una representación esquemática de varias construcciones como se utiliza en la presente. La construcción 660 comprende la secuencia de nucleótidos para codificar el subtipo H5 de HA enlazado operativamente al promotor de plastocianina (plasto) y el terminador (Pter); la construcción 540 comprende la secuencia de nucleótidos para codificar el subtipo H1 de HA en combinación con un péptido señal de proteína disulfuro isomerasa de alfalfa (SP PDI), y se enlaza operativamente a un promotor de plastocianina (Plasto) y un terminador (Pter); la construcción 544 ensamblada para la expresión del subtipo H1 de HA, la secuencia de nucleótidos que codifica H1 se combina con un péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa de alfalfa (SP PDI) y un cierre de leucina GCN4pII (en lugar del dominio de transmembrana y la cola citoplasmática de H1) y se enlaza operativamente al promotor de plastocianina (Plasto) y al terminador (Pter); y la construcción 750 para la expresión de la región de codificación M1 de A/PR/8/34 de influenza se combina al virus de grabado del tabaco (TEV) 5' UTR, y se enlaza operativamente con el promotor doble 35S y el terminador Nos.
La FIGURA 12 muestra la inmunodetección de H5, utilizando anticuerpos anti-H5 (Vietnam), en extractos de proteína de hojas de N. benthamiana transformadas con la construcción 660 (carril 3). La H5 comercial de A/Vietnam/1203/2004 de influenza se utilizó como control positivo de detección (carril 1), y se utilizó un extracto de proteína de hojas transformadas con un vector vacío como control negativo (carril 2).
La FIGURA 13 muestra la caracterización de estructuras de hemaglutinina por medio de cromatografía por exclusión de tamaño. El extracto de proteína de biomasas separadas que producen H5, H1, H1 soluble o H1 y M1 se separaron mediante filtración en gel en S-500 HR. Se fraccionó también H1 comercial en forma de rosetas (roseta H1). La FIGURA 13A muestra fracciones en elución analizadas para el contenido relativo de proteínas (se muestra el Nivel Relativo de Proteína - un perfil de elución de proteínas estándar de un fraccionamiento de biomasa). Se indica el pico de elución con Azul Dextrano 2000 (estándar de referencia 2 MDa). La FIGURA 13B muestra fracciones de elución analizadas por la presencia de hemaglutinina por medio de inmunotransferencia con anticuerpos anti-H5 (Vietnam) (para H5). La FIGURA 13C muestra fracciones de elución analizadas para anticuerpos anti-influenza A para H1. La FIGURA 13D muestra fracciones de elución analizadas para anticuerpos anti-influenza A para H1 soluble. La FIGURA 13E muestra fracciones de elución analizadas para anticuerpos anti-influenza A para roseta H1. La FIGURA 13F muestra fracciones de elución analizadas para anticuerpos anti-influenza A para H1+M1.
Las FIGURA 14 muestran la concentración de estructuras H5 de influenza por medio de centrifugación en gradiente de sacarosa y examen por microscopía electrónica de fracciones concentradas de hemaglutinina. La FIGURA 14A muestra la caracterización de fracciones a partir de la centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa. Cada fracción fue analizada por la presencia de H5 por inmunotransferencia utilizando anticuerpos anti-H5 (Vietnam) (panel superior) y por su contenido relativo de proteínas y capacidad de hemaglutinación (gráfico). La FIGURA 14B muestra el examen por microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa de fracciones agrupadas 17, 18 y 19 de centrifugación por gradiente de sacarosa. La barra representa 100 nm.
La FIGURA 15 muestra la purificación de las VLP de H5 de influenza. La FIGURA 15A muestra análisis SDS-PAGE teñido con Azul de Coomassie del contenido de proteína en las etapas de clarificación - carril 1, extracto sin purificar; carril 2, extracto ajustado a pH 6; carril 3, extracto tratado con calor; carril 4, extracto filtrado en DE; las etapas de purificación por afinidad de fetuína; carril 5, carga; carril 6, lavado; carril 7, elución (concentrado 10 veces). La FIGURA 15B muestra el examen por microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa de la muestra de VLP de H5 purificada. La barra representa 100 nm. La FIGURA 15C muestra la VLP de H5 aislada aumentada que muestra detalles de la estructura. La FIGURA 15D muestra el producto de la VLP de H5 en una SDS-PAGE de reducción teñida con Coomassie (carril A) y transferencia tipo Western (carril B) utilizando anticuerpo policlonal de conejo surgido contra HA de la cepa A/Vietnam/l203/2004 (H5N1)
La FIGURA 16 muestra una secuencia de nucleótidos para el gen de hemaglutinina (HA) del virus de la Influenza A (A/Nueva Caledonia/20/99(H1N1)), región codificante completa. No. de acceso del GenBank AY289929 (SEQ ID NO: 33).
La FIGURA 17 muestra una secuencia de nucleótidos para ARNm de Medicago sativa para la proteína disulfuro isomerasa. No. de acceso del GenBank Z11499 (SEQ ID NO: 34).
La FIGURA 18 muestra una secuencia de nucleótidos para el segmento 7 del virus de la Influenza A (A/Puerto Rico/8/34(H1N1)), secuencia completa. No. de acceso del GenBank NC_002016.1 (SEQ ID NO: 35).
La FIGURA 19 muestra la localización de la acumulación de VLP por medio de observación con microscopio electrónico de transmisión de tinción positiva de tejido que produce H5. CW: pared celular, ch: cloroplasto, pm: membrana plasmática; VLP: partícula similar a virus. La barra representa 100 nm.
La FIGURA 20 muestra la inducción de respuestas de anticuerpo en suero 14 días después del refuerzo en ratones Balb/c vacunados con VLP de H5 de influenza elaborada en plantas o HA soluble recombinante. FIGURA 20(A) Respuestas de anticuerpos de ratones inmunizados mediante inyección intramuscular. FIGURA 20(B) Respuestas de anticuerpos de ratones inmunizados mediante administración intranasal. Se midieron las respuestas de anticuerpos contra virus H5N1 completos inactivados (A/Indonesia/5/505). GMT: concentración promedio geométrica. Los valores son la GMT (log2) de concentraciones de punto final recíprocas de cinco ratones por grupo. Las barras representan la desviación promedio. * p < 0,05 comparada con HA soluble recombinante.
La FIGURA 21 muestran la respuesta de anticuerpos de inhibición por hemaglutinación (HAI) 14 días después del refuerzo en ratones Balb/c vacunados con VLP de H5 de influenza elaborada en plantas o HA soluble recombinante. FIGURA 21(A) Respuestas de anticuerpos de ratones inmunizados mediante inyección intramuscular. FIGURA 21(B) Respuestas de anticuerpos de ratones inmunizados mediante administración intranasal. Se midieron las respuestas de anticuerpos HAI utilizando virus H5N1 completos inactivados (A/Indonesia/5/O5). GMT: concentración promedio geométrica. Los valores son la GMT (log2) de concentraciones de punto final recíprocas de cinco ratones por grupo. Las barras representan la desviación promedio. * p < 0,05 y ** p < 0,01 comparada HA soluble recombinante.
La FIGURA 22 muestra el efecto del adyuvante en la inmunogenicidad de las VLP en ratones. FIGURA 22(A) Efecto del alumbre en ratones inmunizados mediante inyección intramuscular. FIGURA 22(B) Efecto del Quitosano en ratones inmunizados mediante administración intranasal. Se midieron las respuestas de anticuerpos HAI utilizando Virus H5N1 completos inactivados (A/Indonesia/5/05). GMT: concentración promedio geométrica. Los valores son la GMT (log2) de concentraciones de punto final recíprocas de cinco ratones por grupo. Las barras representan la desviación promedio. * p < 0,05 comparada con la HA soluble recombinante correspondiente.
La FIGURA 23 muestra la respuesta de anticuerpos a la administración de VLP. FIGURA 23(A) Isotipo de inmunoglobulina Anti-Indonesia/5/05 en ratones vacunados con inyección intramuscular, 30 días después del refuerzo. Los valores son la GMT (log2) de concentraciones de punto final recíprocas de cinco ratones por grupo. Se realizó el ELISA utilizando virus inactivados completos como el agente de recubrimiento. Las barras representan la desviación promedio. * p < 0,05, ** p < 0,001 en comparación con la HA soluble recombinante correspondiente. FIGURA 23(B) Concentraciones de anticuerpo contra virus inactivados completos. Todos los grupos son estadísticamente diferentes al control negativo.
La FIGURA 24 muestra una concentración de anticuerpos contra virus inactivados completos homólogos (A/Indonesia/5/05), 2 semanas después de la primera dosis (semana 2), 14 días después del refuerzo (semana 5) o 30 días después del refuerzo (semana 7). GMT: concentración promedio geométrica. Los valores son la GMT (log2) de concentraciones de punto final recíprocas de cinco ratones por grupo. * p < 0,05 en comparación con la HA soluble recombinante.
La FIGURA 25 muestra la reactividad cruzada in vitro de anticuerpos en suero. (A) Concentraciones de anticuerpo contra virus inactivados completos. (B) Concentraciones de inhibición de la hemaglutinación contra diferentes virus inactivados completos. Los valores son la GMT (log2) de concentraciones de punto final recíprocas de cinco ratones por grupo. Las barras representan la desviación promedio. Todos los grupos son estadísticamente diferentes al control negativo. * p < 0,05 y ** p < 0,001 comparada con la HA soluble recombinante correspondiente.
La FIGURA 26 muestra la eficacia de la VLP de H5 elaborada a partir de una planta. (A) tasa de supervivencia de ratone después del reto con 10 LD50 (4,09 x 105 CCID50) de la cepa de influenza A/Turquía/582/06 (H5N1). (B) Peso corporal de ratones inmunizados después del reto. Los valores son el peso corporal promedio de los ratones supervivientes.
La FIGURA 27 muestra el origen de las VLP de influenza derivadas de una planta. (A) Composición lipídica polar de las VLP de influenza purificadas. Los lípidos contenidos en un equivalente de 40 μg de proteínas, fueron extraídos de la VLP como se describió, separados por medio de HP-TLC, y comparados con el perfil de migración de lípidos aislados de la membrana plasmática del tabaco purificada (PM). Las abreviaturas de los lípidos son las siguientes: DGDG, Digalactosildiacilglicerol; gluCER, glucosil-ceramida; PA, ácido fosfático; PC, fosfatidilcolina; PE, fosfatidiletanolamina; PG, fosfatidilglicerol; PI, fosfatidilinositol; PS, fosfatidilserina; SG, Esteril-glicósido. (B) Composición de lípido neutra de las VLP de influenza purificadas. Los lípidos contenidos en un equivalente de 20 μg de proteínas fueron extraídos de VLP como se describe, separados por HP-TLC y comparados con la migración de sitosterol. (C) Inmunodetección de la ATPasa de la bomba de protones del marcador de la membrana plasmática (PMA) en las VLP purificadas y PM altamente purificada de hojas de tabaco (PML) y células de tabaco BY2 (PMBY2). Se cargaron dieciocho microgramos de proteína en cada carril.
La FIGURA 28 muestra el intervalo de secuencia de los sitios DraIII a SacI del clon 774 - secuencia de nucleótidos de A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 36). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, iniciando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negritas y subrayado.
La FIGURA 29 muestra el intervalo de secuencias de los sitios DraIII a SacI del clon 775 - secuencia de nucleótidos de A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 37). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados: ATG está en negritas y subrayado.
La FIGURA 30 muestra el intervalo de secuencias de los sitios DraIII a SacI del clon 776 - secuencia de nucleótidos de A/Brisbane 10/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 38). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3’. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negritas y subrayado.
La FIGURA 31 muestra el intervalo de secuencias de los sitios DraIII a SacI del clon 777 - secuencia de nucleótidos de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) (SEQ ID NO: 39). La secuencia de codificación se flanquea por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5' y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción se subrayan: ATG está en negritas y se subraya.
La FIGURA 32 muestra el intervalo de secuencias de los sitios DraIII a SacI del clon 778 - secuencia de nucleótidos de B/Malasia/2506/2004 (SEQ ID NO: 40). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5' y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados: ATG está en negritas y subrayado.
La FIGURA 33 muestra el intervalo de secuencias de los sitios DraIII a SacI del clon 779 - secuencia de nucleótidos de B/Florida/4/2006 (SEQ ID NO: 41). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5' y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negritas y subrayado.
La FIGURA 34 muestra el intervalo de secuencias de sitios DraIII a SacI del clon 780 - secuencia de nucleótidos de A/Singapur/1/57 (H2N2) (SEQ ID NO: 42). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5' y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negritas y subrayado.
La FIGURA 35 muestra el intervalo de secuencias de los sitios DraIII a SacI del clon 781 - secuencia de nucleótidos de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 43). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negritas y subrayado.
La FIGURA 36 muestra el intervalo de secuencias de los sitios DraIII a SacI del clon 782 - secuencia de nucleótidos de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) (SEQ ID NO: 44). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negritas y subrayado.
La FIGURA 37 muestra el intervalo de secuencias de los sitios DraIII a SacI del clon 783 - secuencia de nucleótidos de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (SEQ ID NO: 45). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3’. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negritas y subrayado.
La FIGURA 38 muestra el intervalo de secuencias de los sitios DraIII a SacI del clon 784 - secuencia de nucleótidos de A/Equino/Praga/56 (H7N7) (SEQ ID NO: 46). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negritas y subrayado.
La FIGURA 39 muestra el intervalo de secuencias de los sitios DraIII a SacI del clon 785 - secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (SEQ ID NO: 47). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negritas y subrayado.
La FIGURA 40A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 48) del polipéptido traducido del clon 774 (A/Brisbane/S9/2007 (H1N1)). El marco de lectura abierto del clon 774 inicia con el ATG indicado en la Figura 28. La Figura 40B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 49) del polipéptido traducido del clon 775 (A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1)). El marco de lectura abierto del clon 775 inicia con el ATG indicado en la Figura 29.
La FIGURA 41A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 50) del polipéptido traducido del clon 776 (A/Brisbane/10/2007 (H3N2)). El marco de lectura abierto del clon 776 inicia con el ATG indicado en la Figura 30. La Figura 41B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 51) del polipéptido traducido del clon 777 (A/Wisconsin/67/2005 H3N2)). El marco de lectura abierto del clon 777 inicia con el ATG indicado en la Figura 31.
La FIGURA 42A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 52) del polipéptido traducido del clon 778 (B/Malasia/2506/2004). El marco de lectura abierto del clon 778 inicia con el ATG indicado en la Figura 32. La Figura 42B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 53) del polipéptido traducido del clon 779 (B/Florida/4/2006). El marco de lectura abierto del clon 779 inicia con el ATG indicado en la Figura 33.
La FIGURA 43A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 54) del polipéptido traducido del clon 780 (A/Singapur/1/57 (H2N2)). El marco de lectura abierto del clon 780 inicia con el ATG indicado en la Figura 34. La Figura 43B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 55) del polipéptido traducido del clon 781 (A/Anhui/1/2005 (H5N1)). El marco de lectura abierto del clon 781 inicia con el ATG indicado en la Figura 35.
La FIGURA 44A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 56) del polipéptido traducido del clon 782 (A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)). El marco de lectura abierto del clon 782 inicia con el ATG indicado en la Figura 36. La Figura 44B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No: 57) del polipéptido traducido del clon 783 (A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1)). El marco de lectura abierto del clon 783 inicia con el ATG indicado en la Figura 37.
La FIGURA 45A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 58) del polipéptido traducido del clon 784 (A/Equino/Praga/56 (H7N7)). El marco de lectura abierto del clon 784 inicia con el ATG indicado en la Figura 38. La Figura 45B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 59) del polipéptido traducido del clon 785 (A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)). El marco de lectura abierto del clon 785 inicia con el ATG indicado en la Figura 39.
La FIGURA 46 muestra la inmunodetección (transferencia tipo Western) de fracciones de elución de las VLP producidas en la planta, siguiendo por cromatografía por exclusión de tamaño. Se muestran los subtipos H1, H2, H5, H6 y H9 de hemaglutinina. La hemaglutinina se detecta en las fracciones 7 - 14, que corresponden a la elución de las VLP.
La FIGURA 47 muestra un análisis de inmunotransferencia de la expresión de una serie de hemaglutinina H1 de cepas epidémicas anuales. Se cargaron diez y veinte microgramos de extractos de proteínas en los carriles 1 y 2, respectivamente.
La FIGURA 48 muestra un análisis de inmunotransferencia de la expresión de una serie de hemaglutinina H5 de cepas pandémicas potenciales. Se cargaron diez y veinte microgramos de extractos de proteínas en los carriles 1 y 2, respectivamente.
La FIGURA 49 muestra una inmunotransferencia de H5 de la cepa A/Indonesia/5/2005 en extractos de proteínas de hojas de Nicotiana tabacum, agroinfiltradas con AGL1/660. Se infiltraron dos plantas y se cargaron 10 y 20 μg de proteína soluble de cada planta en los carriles 1 y 2, respectivamente.
La FIGURA 50 muestra la reactividad cruzada in vitro de anticuerpos en suero. Las concentraciones de inhibición por hemaglutinación (H1) en suero de hurón, 14 días (A) después de la primera inmunización y (B) después del 2do refuerzo con la VLP de H5 de influenza elaborada en la planta. Se midieron las respuestas de anticuerpos HAI utilizando los siguientes virus H5N1 completos inactivados: A/pavo/Turquía/1/05, A/Vietnam/1194/04; A/Anhui/5/05 y la cepa homóloga A/Indonesia/5/05. Los valores son la GMT (log2) de concentraciones de punto final recíprocas de cinco hurones por grupo. Banda diagonal - A/Indonesia/6/O6 (clado 2.1.3); verificado - A/pavo/Turquía/l/O5 (clado 2.2); barra blanca - A/Vietnam/1194/04 (clado 1); barra negra - A/Anhui/5/05. Se indican los respondedores. Las barras representan la desviación promedio.
La FIGURA 51 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H5 de A/indonesia/5/2005 (Construcción # 660), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 52 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H1 de A/Nueva Caledonia/20/1999 (Construcción # 540), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 53 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H1 de A/Brisbane/59/2007 (construcción # 774), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 54 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H1 de A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (construcción # 775), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 55 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H2 de A/Singapur/1/57 (H2N2) (construcción # 780), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 56 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H5 de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (Construcción # 781), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 57 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H5 de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) (Construcción # 782), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 58 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H6 de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (Construcción # 783), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 59 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H9 de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (Construcción # 785), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 60 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H3 de A/Brisbane/10/2007 (H3N2), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 61 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H3 de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 62 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H7 de A/Equino/Praga/56 (H7N7), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 63 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de HA de B/Malasia/2506/2004, 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 64 muestra la secuencia de ácido nucleico de un casete de expresión de HA que comprende el promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de HA de B/Florida/4/2006, 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras.
La FIGURA 65 muestra una secuencia de aminoácidos de consenso (SEQ ID NO: 74) para HA de A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) (codificado por la SEQ ID NO: 33), A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 48), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 49) y la SEQ ID NO: 9. X1 (posición 3) es A o V; X2 (posición 52) es D o N; X3 (posición 90) es K o R; X4 (posición 99) es K o T; X5 (posición 111) es Y o H; X6 (posición 145) es V o T; X7 (posición 154) es E o K; X8 (posición 161) es R o K; X9 (posición 181) es V o A; X10 (posición 203) es D o N; X11 (posición 205) es R o K; X12 (posición 210) es T o K; X13 (posición 225) es R o K; X14 (posición 268) es W o R; X15 (posición 283) es T o N; X16 (posición 290) es E o K; X17 (posición 432) es I o L; X18 (posición 489) es N o D.
La FIGURA 66 muestra la secuencia de aminoácidos de H1 Nueva Caledonia (AAP34324.1) codificada por la SEQ ID NO: 33
La FIGURA 67 muestra la secuencia de aminoácidos de H1 Puerto Rico (NC_0409878.l) codificada por la SEQ ID NO: 35.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se relaciona con la producción de partículas similares a virus. Más específicamente, la presente invención se dirige a la producción de partículas similares a virus que comprende antígenos de influenza.
La siguiente descripción es de una forma de realización preferida.
La presente invención involucra un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una hemaglutinina (HA) de la influenza, enlazada operativamente a una región reguladora activa en una planta.
Además, la presente invención proporciona un método para producir partículas similares a virus (VLP) en una planta. El método implica introducir un ácido nucleico que codifica una hemaglutinina de influenza (HA) operativamente enlazado a una región reguladora activa en la planta, dentro de la planta, o porción de la planta, e incubar la planta o una porción de la planta bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo así las VLP.
Las VLP de acuerdo con la invención se producen a partir del virus de la influenza, sin embargo, se prevé que también se pueden producir las VLP a partir de otro virus derivado de la membrana plasmática incluyendo, aunque sin limitarse a Sarampión, Ébola, Marburgo y VIH.
La invención incluye las VLP que comprenden hemaglutinina (HA) de la influenza de todos los tipos del virus de la influenza las cuales pueden infectar seres humanos, incluyendo por ejemplo, aunque sin limitarse al subtipo A (H1N1) muy predominante (por ejemplo, A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1)), el subtipo A/Indonesia/5/05 (H5N1) (SEQ ID NO: 60) y el tipo B menos común (por ejemplo, la SEQ ID NO: 26, Figura 10O), y el tipo C (SEQ ID NO: 27, Figura 10P), y a las HA obtenidas de otros subtipos de influenza. Las VLP de otros subtipos de influenza se incluyen también en la presente invención, por ejemplo, A/Brisbane/59/2007 (H1N1; SEQ ID NO: 48), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1; SEQ ID No: 49), A/Singapur/1/57 (H2N2; SEQ ID NO: 54), A/Anhui/l/2005 (H5N1; SEQ ID NO: 55), A/Vietnam/ll94/2004 (H5N1; SEQ ID NO: 56); A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1; SEQ ID NO: 57); A/Hong Kong 1073/99 (H9N2; SEQ ID NO: 59); A/Brisbane/lo/2007 (H3N2; SEQ ID NO: 50), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2; SEQ ID NO: 51), A/Equino/Praga/56 (H7N7); SEQ ID NO: 58), B/Malasia/2506/2004 (SEQ ID NO: 52), o B/Florida/4/2006 (SEQ ID NO: 53).
La presente invención también se relaciona con virus de la influenza que infectan otros mamíferos o animales huésped, por ejemplo, seres humanos, primates, caballos, cerdos, aves, aves acuáticas, aves migratorias, codorniz, pato, ganso, aves de corral, pollo, camello, caninos, perros, felinos, gatos, tigre, leopardo, civeta, visón, marta, hurones, mascotas, ganado, ratones, ratas, foca, ballena y similares.
La invención también incluye, aunque no se limita a, las VLP derivadas de influenza que obtienen una envoltura lipídica de la membrana plasmática de la célula en la cual se expresan las proteínas de VLP. Por ejemplo, cuando la VLP se expresa en un sistema basado en plantas, la VLP puede obtener una envoltura lipídica de la membrana plasmática de la célula.
Generalmente, el término “lípido” se refiere a moléculas de origen natural solubles en grasa (lipofílicas). El término se utiliza también más específicamente para referirse a ácidos grasos y sus derivados (incluyendo tri, di y monoglicéridos y fosfolípidos), así como otros metabolitos que contienen esterol soluble en grasa o esteroles. Los fosfolípidos son un componente principal de todas las membranas biológicas, junto con glicolípidos, esteroles y proteínas. Los ejemplos de fosfolípidos incluyen fosfatidil etanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidil inositol, fosfatidil serina y similares. Los ejemplos de esteroles incluyen zoosteroles (por ejemplo, colesterol) y fitoesteroles. Se han identificado más de 200 fitoesteroles en varias especies de plantas, los más comunes son campesterol, estigmasterol, ergosterol, brasicasterol, delta-7-estigmasterol, delta-7-avenasterol, daunosterol, sitosterol, 24metilcolesterol, colesterol o beta-sitosterol. Como comprenderá alguien ordinariamente capacitado en la técnica, la composición de lípidos de la membrana plasmática de una célula puede variar con las condiciones de cultivo o de crecimiento de la célula u organismo a partir del cual se obtiene la célula.
Las membranas celulares generalmente comprenden bicapas de lípidos, así como proteínas para diferentes funciones. Se pueden encontrar concentraciones localizadas de lípidos particulares en la bicapa lipídica, denominadas como “balsas lipídicas". Sin ánimo de ceñirnos a ninguna teoría en particular, las balsas lipídicas pueden tener papeles significativos en endo y exocitosis, entrada o salida de virus u otros agentes infecciosos, transducción de señales intercelulares, interacción con otros componentes estructurales de la célula u organismo, tales como matrices intracelulares y extracelulares.
Con referencia al virus de la influenza, el término “hemaglutinina" o “HA” como se utiliza en la presente se refiere a una glicoproteína encontrada en el exterior de las partículas virales de la influenza. La HA es una glicoproteína del tipo I de membrana homotrimérica, que comprende generalmente un péptido de señal, un dominio de HA1, y un dominio de HA2 que comprende un sitio de anclaje que abarca la membrana en el terminal C y una pequeña cola citoplasmática (Figura 1B). Las secuencias de nucleótidos que codifican HA son bien conocidas y están disponibles véase por ejemplo, la base de BioDefence Public Health (Virus de la Influenza; véase URL: biohelthbase.org) o el National Center for Biotechnology Information (véase URL: ncbi.nlm.nih.gov).
El término “homotrímero" u “homotrimérico” indica que un oligómero está formada por tres moléculas de proteína HA. Sin ánimo de ceñirnos a ninguna teoría en particular, la proteína HA se sintetiza como una proteína precursora monomérica (HA0) de aproximadamente 75 kDa, la cual se ensambla en la superficie dentro de una proteína trimérica alargada. Antes de que se produzca la trimerización, la proteína precursora se escinde en un sitio de escisión de activación conservado (también llamado como un péptido de fusión) en 2 cadenas polipeptídicas, HA1 y HA2 (que comprenden la región transmembrana), enlazadas por medio de un enlace de disulfuro. El segmento HA1 puede ser de 328 aminoácidos de longitud, y el segmento HA2 puede ser de 221 aminoácidos de longitud. Aunque esta escisión puede ser importante para infectividad del virus, puede no ser esencial para la trimerización de la proteína. La inserción de HA dentro de la membrana del retículo endoplasmático (ER) de la célula huésped, la escisión del péptido de señal y glicosilación de la proteína son eventos de traducción conjunta. El repliegue correcto de HA requiere la glicosilación de la proteína y la formación de 6 enlaces disulfuro dentro de la cadena. El trímero de HA se ensambla dentro del complejo cis y trans-Golgi, jugando el dominio transmembrana un papel en el proceso de trimerización. Las estructuras cristalinas de las proteínas HA tratadas con bromelina, las cuales carecen del dominio transmembrana, han mostrado una estructura altamente conservada entre las cepas de influenza. También se ha establecido que la HA experimenta mayores cambios conformacionales durante el proceso de infección, los cuales requieren que la HA0 precursora se escinda en las 2 cadenas polipeptídicas HA1 y HA2. La proteína HA puede ser procesada (es decir, comprender los dominios HA1 y HA2) o puede no ser procesada (es decir, comprender el dominio de HA0).
La presente invención se relaciona con el uso de una proteína HA que comprende el dominio transmembrana e incluye los dominios HA1 y HA2, por ejemplo, la proteína de HA puede ser HA0, o HA procesada que comprende HA1 y HA2. La proteína HA puede utilizarse en la producción o la formación de las VLP utilizando una planta, o célula de una planta o un sistema de expresión.
La HA expresada de acuerdo con la presente invención puede obtenerse a partir de cualquier subtipo. Por ejemplo, la HA puede ser del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16. La HA recombinante puede también comprender una secuencia de aminoácidos basada en la secuencia de cualquier hemaglutinina conocida en el estado del arte - véase por ejemplo, la base de BioDefence Public Health (Virus de la Influenza; véase URL: biothelthbase.org) o el National Center for Biotechnology Information (véase URL: ncbi.nlm.nih.gov). Además, la HA puede basarse en la secuencia de una hemaglutinina que se aísla de uno o más virus de la influenza recientemente identificados o emergentes.
La presente invención también incluye las VLP que comprenden las HA obtenidas de uno o más de un subtipo de influenza. Por ejemplo, las VLP pueden comprender una o más de una HA del subtipo H1 (codificada por la SEQ ID NO: 28), H2 (codificada por la SEQ ID NO: 12), H3 (codificada por la SEQ ID NO: 13), H4 (codificada por la SEQ ID NO: 14) H5 (codificada por la SEQ ID NO: 15), H6 (codificada por la SEQ ID NO: 16), H7 (codificada por la SEQ ID NO: 11), H8 (codificada por la SEQ ID NO: 17), H9 (codificada por la SEQ ID NO: 18), H10 (codificada por la SEQ ID NO: 19), H11 (codificada por la SEQ ID NO: 20), H12 (codificada por la SEQ ID NO: 21), H13 (codificada por la SEQ ID NO: 27), H14 (codificada por la SEQ ID NO: 23), H15 (codificada por la SEQ ID NO: 24), H16 (codificada por la SEQ ID NO: 25) o una combinación de las mismas. Una o más de una HA a partir de uno o más de un subtipo de influenza pueden coexpresarse dentro de célula vegetal o de insecto para asegurar que la síntesis de una o más de una HA resulta en la formación de las VLP que comprenden una combinación de las HA obtenidas a partir de uno o más de un subtipo de influenza. La selección de la combinación de las HA puede determinarse por medio del uso pretendido de la vacuna preparada a partir de la VLP. Por ejemplo, una vacuna para su uso en la inoculación de aves pueden comprender cualquier combinación de subtipos de HA, mientras que las VLP útiles para inocular seres
5 humanos pueden comprender subtipos de uno o más de los subtipos H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10, N1, N2, N3 y N7. Sin embargo, se pueden preparar otras combinaciones de subtipos de HA dependiendo del uso del inóculo.
Por lo tanto, la presente invención está dirigida a una VLP producida de acuerdo con l invención que comprende uno
o más de un subtipo de HA.
La presente invención involucra por lo tanto ácidos nucleicos que codifican hemaglutininas que forman las VLP 10 cuando se expresan en plantas.
Las proteínas HA de influenza exhiben un intervalo de similitudes y diferencias con respecto al peso molecular, el punto isoeléctrico, tamaño, complemento de glicano y similares. Las propiedades fisicoquímicas de las diversas hemaglutininas pueden ser útiles para permitir la diferenciación entre las HA expresadas en una planta, célula de insecto o sistema de levadura, y pueden ser de uso particular cuando se coexpresa más de una HA en un sistema
15 sencillo. En la tabla 1 se proporcionan ejemplos de tales propiedades fisicoquímicas.
Tabla 1: Propiedades fisicoquímicas de hemaglutininas de influenza
ClonNo. Tipo
Cepas de influenza AA Glicanos Peso molecular (kDa) Punto isoeléctrico
HA0
HA1 HA2 HA0 HA1 HA2 HA0 HA0l HA1 HA1l HA2 HA2l HA0 HA1 HA2
774
H1 A/Brisbane/59/2007 548 326 222 9 7 2 61 75 36 47 25 28 6,4 7,5 5,3
775
H1 A/Islas Salomón/3/2006 548 326 222 9 7 2 61 75 36 47 25 28 6,1 6,7 5,3
776
H3 A/Brisbane/10/2007 550 329 221 12 11 1 62 80 37 54 25 27 8,5 9,6 5,2
777
H3 A/Wisconsin/67/2005 550 329 221 11 19 1 62 79 37 52 25 27 8,8 9,6 5,3
778
B B/Malasia/2506/2004 570 347 223 12 8 4 62 80 38 50 24 30 8,0 9,7 4,5
779
B B/Florida/4/2006 569 346 223 10 7 3 62 77 38 48 24 29 8,0 9,7 4,5
780
H2 A/Singapur/1/57 547 325 222 6 4 2 62 71 36 42 25 28 6,0 7,5 4,9
781
H5 A/Anhui/1/2005 551 329 222 7 5 2 62 73 37 45 25 28 6,2 8,9 4,7
782
H5 A/Vietnam/1194/2004 552 330 222 7 5 2 63 74 38 45 25 28 6,4 9,1 4,8
783
H6 A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 550 328 222 8 5 3 62 75 37 45 25 30 5,7 5,9 5,6
784
H7 A/Equino/Praga/56 552 331 221 6 4 2 62 71 37 49 25 28 8,9 9,7 4,9
785
H9 A/Hong Kong/1073/99 542 320 199 9 7 2 61 75 36 46 23 26 8,4 9,5 5,3
La presente invención también involucra secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 11, que codifican HA a partir de H1, H5 o H7, respectivamente, una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas a la SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 11, o una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas a un complemento de la SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos codifica una proteína de hemaglutinina que cuando se expresa forma una VLP, y que la VLP induce la producción de un anticuerpo cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula vegetal forma una VLP, y la VLP puede utilizarse para producir un anticuerpo que es capaz de enlazarse a HA, incluyendo HA, HA0, HA1 o HA2 maduras de uno o más tipos o subtipos de influenza. La VLP, cuando se administra a un individuo induce una respuesta inmune.
La hibridación bajo condiciones de hibridación rigurosas es conocida en el arte (véase por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 y suplementos; Maniatis et al., en Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook y Russell, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición 2001. Un ejemplo de tales condiciones de hibridación rigurosas puede ser aproximadamente 16 20 horas de hibridación en 4 X SSC a 65°C, seguido por un lavando en 0,1 X SSC a 65°C durante una hora, o 2 lavados en 0,1 X SSC a 65°C cada uno durante 20 o 30 minutos. Alternativamente, un ejemplo de una condición de hibridación rigurosa podría ser durante la noche (16 - 20 horas) en formamida al 50%, 4 X SSC a 42°C, seguida por un lavando en 0,1 X SSC a 65°C durante una hora, o 2 lavados en 0,1 X SSC a 65°C cada uno durante 20 o 30 minutos, o durante la noche (16 - 20 horas) o hibridación en amortiguador de fosfato acuoso Church (SDS al 7%; amortiguador de NaPO4 0,5 M, pH 7,2; EDTA 10 mM) a 65°C, con 2 lavados ya sea a 50°C en 0,1 X SSC, SDS al 0,1% durante 20 o 30 minutos cada uno, o 2 lavados a 65°C en 2 X SSC, SDS al 0,1% durante 20 o 30 minutos cada uno.
Adicionalmente, la presente invención puede involucrar secuencias de nucleótidos que se caracterizan por tener aproximadamente 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% o cualquier cantidad entre éstas, identidad de secuencias, o similitud de secuencias, con la secuencia de nucleótidos que codifica la HA a partir de H1 (SEQ ID NO: 28), H5 (SEQ ID NO: 3) o H7 (SEQ ID NO: 11), en donde la secuencia de nucleótidos codifica una proteína de hemaglutinina que cuando se expresa en plantas forma una VLP, y que la VLP induce la producción de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula vegetal forma una VLP, y la VLP puede utilizarse para producir un anticuerpo que es capaz de enlazar HA, incluyendo HA, HA0, HA1 o HA2 maduras. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmune.
En forma similar, la presente invención involucra las HA asociadas con los siguientes subtipos H1 (codificada por la SEQ ID NO: 28), H2 (codificada por la SEQ ID NO: 12), H3 (codificada por la SEQ ID NO: 13), H4 (codificada por la SEQ ID NO: 14), H5 (codificada por la SEQ ID NO: 15), H6 (codificada por la SEQ ID NO: 16), H7 (codificada por la SEQ ID NO: 11), H8 (codificada por la SEQ ID NO: 17), H9 (codificada por la SEQ ID NO: 18), H10 (codificada por la SEQ ID NO: 19), H11 (codificada por la SEQ ID NO: 20), H12 (codificada por la SEQ ID NO: 21), H13 (codificada por la SEQ ID NO: 27), H14 (codificada por la SEQ ID NO: 23), H15 (codificada por la SEQ ID NO: 24), H16 (codificada por la SEQ ID NO: 25); véanse las Figuras 10A a 10P), y las secuencias de nucleótidos que se caracterizan porque tienen aproximadamente de 70 a 100% o cualquier cantidad entre ellas, 80 a 100% o cualquier cantidad entre ellas, 90 - 100% o cualquier cantidad entre ellas, o 95 - 100% o cualquier cantidad entre ellas, de identidad de secuencias con H1 (SEQ ID NO: 28), H2 (SEQ ID NO: 12), H3 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 11), H8 (SEQ ID NO: 17), H9 (SEQ ID NO: 18), H10 (SEQ ID NO: 19), H11 (SEQ ID NO: 20), H12 (SEQ ID NO: 21), H13 (SEQ ID NO: 27), H14 (SEQ ID NO: 23), H15 (SEQ ID NO: 24), H16 (SEQ ID NO: 25), en donde la secuencia de nucleótidos codifica una proteína hemaglutinina que cuando se expresa forma una VLP, y que la VLP induce la producción de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula vegetal forma una VLP, y la VLP puede utilizarse para producir un anticuerpo que es capaz de enlazar HA, incluyendo HA, HA0, HA1 o HA2 maduras. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmune.
Una “respuesta inmune” generalmente se refiere a una respuesta del sistema inmune adaptivo. El sistema inmune adaptivo comprende generalmente una respuesta humoral, y una respuesta mediada por células. La respuesta humoral es el aspecto de la inmunidad que es mediada por anticuerpos secretados, producidos en las células del linaje de linfocitos B (células B). Los anticuerpos secretados se enlazan a antígenos en las superficies de los microbios invasores (tal como virus o bacterias), que los marcan para destrucción. La inmunidad humoral se utiliza generalmente para referirse a la producción de anticuerpos y los procesos que la acompañan, así como las funciones efectoras de anticuerpos, incluyendo la activación de células Th2 y la producción de citoquinas, generación de células de memoria, promoción de opsonina de fagocitosis, eliminación de patógenos y similares. Los términos “modular” o “modulación” o similares se refieren a un incremento o disminución en una respuesta o parámetro particular, como se determina por medio de cualquiera de los diferentes ensayos generalmente conocidos
o utilizados, algunos de los cuales se usan como ejemplos en la presente invención.
Una respuesta mediada por células es una respuesta inmune que no implica anticuerpos, sino más bien implica la activación de macrófagos, células asesinas naturales (NK), linfocitos T citotóxicos específicos del antígeno, y la liberación de varias citoquinas en respuesta a un antígeno. La inmunidad mediada por células se utiliza generalmente para referirse a alguna activación de las células Th, activación de células Tc y respuestas mediadas por células T. La inmunidad mediada por células es de importancia particular en respuesta a infecciones virales.
Por ejemplo, la inducción de linfocitos T CD8 positivos específicos para el antígeno puede medirse utilizando un ensayo ELISPOT; la estimulación de linfocitos T CD4 positivos puede medirse utilizando un ensayo de proliferación. Las concentraciones de anticuerpos anti-influenza pueden cuantificarse utilizando un ensayo ELISA; se pueden medir también los isotipos de anticuerpos reactivos cruzados o específicos de antígenos utilizando anticuerpos antiisotipo (por ejemplo, anti-IgG, IgA, IgE o IgM). Los métodos y técnicas para realizar tales ensayos son bien conocidos en la técnica.
Puede también utilizarse un ensayo de inhibición de hemaglutinación (HI o HAI) para demostrar la eficacia de anticuerpos inducidos por una vacuna, o una composición de vacuna puede inhibir la aglutinación de glóbulos rojos (RBC) por HA recombinante. Las concentraciones de anticuerpos inhibitorios de hemaglutinación de muestras de suero pueden evaluarse por microtitulación de HAI (Aymard et al 1973). Los eritrocitos de cualquiera de las diversas especies pueden utilizarse - por ejemplo, de caballo, pavo, pollo o similares. Este ensayo da información indirecta en el ensamble del trímero de HA en la superficie de la VLP, confirmando la presentación apropiada de sitios antigénicos en las HA.
También se pueden utilizar concentraciones de HAI de reactividad cruzada para demostrar la eficacia de una respuesta inmune a otras cepas del virus relacionadas con el subtipo de vacuna. Por ejemplo, el suero de un sujeto inmunizado con una composición de vacuna de una primera cepa (por ejemplo, las VLP de A/Indonesia 5/05) puede utilizarse en un ensayo de HAI con una segunda cepa de virus completo o de partículas virales (por ejemplo, A/Vietnam/1194/2004) y la concentración de HAI determinada.
La presencia o los niveles de citoquina también pueden cuantificarse. Por ejemplo, una respuesta de célula T auxiliar (Th1/Th2) será caracterizada por medio de la medición de células que secretan IFN-y e IL-4 utilizando ELISA (por ejemplo, kits BD Biosciences OptEIA). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o esplenocitos obtenidos de un sujeto pueden cultivarse, y analizarse el sobrenadante. Los linfocitos T pueden también cuantificarse por medio de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), utilizando etiquetas y métodos fluorescentes marcadores específicos que son bien conocidos en la técnica.
También puede llevarse a cabo un ensayo de microneutralización para caracterizar una respuesta inmune en un sujeto, véase por ejemplo los métodos de Rowe et al., 1973. Las concentraciones de neutralización de virus pueden obtenerse en varias formas, incluyendo: 1) enumeración de placas de lisis (ensayo de placas) después de la fijación/coloración de las células con cristal violeta; 2) observación microscópica de lisis celular en cultivo; 3) ELISA y detección espectrofotométrica de proteína de virus NP (correlacionado con infección viral de células huéspedes).
La identidad de secuencias o similitud de secuencias puede determinarse utilizando un programa de comparación de secuencias de nucleótidos, tal como aquella suministrada dentro de DNASIS (por ejemplo, utilizando, aunque sin limitarse a los siguientes parámetros: penalización de 5 por GAP, de 5 por # de diagonales superiores, penalización de 10 por GAP fija, de 2 por una tupla k, de 10 por abertura flotante, y de 5 por tamaño de ventana). Sin embargo se conocen bien en el arte otros métodos de alineación de secuencias para comparación, por ejemplo, los algoritmos de Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2: 482), Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444) y por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y BLAST), o por alineación manual e inspección visual.
El término “dominio de hemaglutinina" se refiere a un péptido que comprende ya sea el dominio HA0, o los dominios HA1 y HA2. El dominio de hemaglutinina no incluye el péptido señal, el dominio transmembrana o la cola citoplasmática encontrada en la proteína de origen natural.
El término “partícula similar a virus" (VLP), o “partículas similares a virus" o las “VLP" se refiere a estructuras que se auto-ensamblan y comprenden proteínas estructurales tal como proteína HA de influenza. Las VLP son generalmente morfológica y antigénicamente similares a viriones producidos en una infección, aunque carecen de información genética suficiente para replicarse y de este modo no son infecciosas. En algunos ejemplos, las VLP pueden comprender una especie de proteína simple o más de una especie de proteína. Para las VLP que comprenden más de una especie de proteína, la especie de proteína pueden ser de las misma especie de virus o pueden comprender una proteína de una especie diferente, género, subfamilia o familia de virus (como se designa por medio de la nomenclatura ICTV). En otros ejemplos, se pueden modificar una o más de las especies de proteínas que comprenden una VLP a partir de la secuencia de origen natural. Las VLP pueden producirse en células huéspedes adecuadas incluyendo células huéspedes de plantas e insectos. Después de la extracción de la célula huésped y del aislamiento y purificación adicional bajo condiciones adecuadas, las VLP pueden purificarse como estructuras intactas.
Las VPL producidas a partir de proteínas derivadas de influenza, de acuerdo con la presente invención, no comprenden la proteína M1. Se sabe que la proteína M1 enlaza ARN (Wakefield y Brownlee, 1989) que es un contaminante de la preparación de VLP. La presencia del ARN es indeseada cuando se obtiene la aprobación reglamentaria para el producto de VLP, por lo tanto una preparación de VLP que carece de ARN puede ser ventajosa.
Las VPL de la presente invención se producen en una célula huésped que se caracteriza porque carece de la capacidad para sialilar proteínas, por ejemplo, carece de sialidasa, es decir una célula vegetal. Las VPL producidas como se describe en la presente invención no comprenden típicamente neuraminidasa (NA). Sin embargo, la NA puede ser coexpresada con HA, en caso de que se deseen las VPL que comprenden HA y NA.
Una VLP producida en una planta de acuerdo con algunos aspectos de la invención puede acomplejarse con lípidos derivados de la planta. La VLP puede comprender un péptido de HA0, HA1 o HA2. Los lípidos derivados de plantas pueden estar en la forma de una bicapa de lípido, y pueden comprender además una envoltura que rodea la VLP. Los lípidos derivados de plantas pueden comprender componentes lipídicos de la membrana plasmática de la planta en donde se produce la VLP, incluyendo, aunque sin limitarse a fosfatidilcolina (PC), fosfatidil etanolamina (PE), glicoesfingolípidos, fitoesteroles o una combinación de los mismos. Un lípido derivado de una planta puede alternativamente denominarse como un “lípido de la planta”. Se conocen ejemplos de fitoesteroles en la técnica, e incluyen, por ejemplo, estigmasterol, sitosterol, 24-metilcolesterol y colesterol - véase por ejemplo, Mongrand et al., 2004.
Las VPL pueden evaluarse por estructura y tamaño, por ejemplo, mediante un ensayo de hemaglutinación, microscopía electrónica o por cromatografía por exclusión de tamaño.
Para cromatografía por exclusión de tamaño, las proteínas solubles totales pueden extraerse del tejido vegetal por medio de homogenización de la muestra (Polytron) de material vegetal triturado y congelado en un amortiguador de extracción, y se remueve el material insoluble por centrifugación. La precipitación con PEG puede también ser benéfica. La proteína soluble se cuantifica, y el extracto pasa a través de una columna SephacrylTM. Puede utilizarse Azul Dextrano 2000 como estándar de calibración. Después de la cromatografía, se pueden analizar adicionalmente las fracciones por inmunotransferencia para determinar el complemento de proteína de la fracción.
Sin ánimo de ceñirnos a ninguna teoría en particular, la capacidad de la HA para enlazarse a RBC de diferentes animales se efectúa por la afinidad de la HA por los ácidos siálicos a2,3 o a2,3 y la presencia de aquellos ácidos siálicos en la superficie de RBC. La HA equina y aviar de los virus de la influenza aglutinan eritrocitos de todas las diferentes especies, incluyendo pavos, pollos, patos, cobayos, seres humanos, ovejas, caballos y vacas; mientras que las HA de seres humanos se enlazarán a los eritrocitos de pavos, pollos, patos, cobayos, seres humanos y ovejas (véase también Ito T. et al, 1997, Virology, vol 227, p. 493 - 499; y Medeiros R et al, 2001, Virology, vol 289 p. 74 - 85). En las Tablas 2A y 2B se presentan ejemplos de reactividad de especies de las HA de diferentes cepas de influenza.
Tabla 2A: Especies de RBC enlazadas por las HA de cepas seleccionadas de influenza estacional
Estacional
Cepa No Origen Caballo Pavo
H1
A/Brisbane/59/2007 (H1N1) 774 Humano + ++
A/Islas Salomón /3/2006 (H1N1)
775 Humano + ++
H3
A/Brisbane/10/2007 (H3N2) 776 Humano + ++
A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)
777 Humano + ++
B
B/Malasia/2506/2004 778 Humano + ++
B/Florida/4/2006
779 Humano + ++
Tabla 2B: Especies de RBC enlazadas por las HA de cepas seleccionadas de influenza pandémica
Pandémica
Cepa No Origen Caballo Pavo
H2
A/Singapur/1/57 (H2N2) 780 Humano + ++
H5
A/Anhui/1/2005 (H5N1) 781 Hu-Av ++ +
A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)
782 Hu-Av ++ +
H6
A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) 783 Aviar ++ +
H7
A/Equino/Praga/56 (H7N7) 784 Equino ++ ++
H9
A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) 785 Humano ++ +
Como se utiliza en la presente invención, una “proteína” se refiere generalmente a una cadena de aminoácidos
conectados por medio de un enlace peptídico, que puede plegarse en una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria para lograr una morfología particular. Alternativamente, los términos polipéptido, péptido o fragmentos de péptidos pueden utilizarse en un contexto similar.
Un fragmento o porción de una proteína, proteína de fusión o polipéptido incluye un péptido o polipéptido que comprende un subconjunto del complemento de aminoácidos de una proteína o polipéptido particular, siempre y cuando el fragmento pueda formar una VLP cuando se expresa. El fragmento puede, por ejemplo, comprender una región antigénica, una región que induce una respuesta por estrés, o una región que comprende un dominio funcional de la proteína o el polipéptido. El fragmento puede también comprender una región o dominio común para las proteínas de la misma familia general, o el fragmento puede incluir suficiente secuencia de aminoácidos para identificar específicamente la proteína de longitud completa de la cual se deriva.
Por ejemplo, un fragmento o porción puede comprender aproximadamente desde 60% hasta aproximadamente 100% de la longitud total de la proteína, o cualquier cantidad entre estos valores, siempre y cuando el fragmento pueda formar una VLP cuando se expresa. Por ejemplo, aproximadamente desde 60% hasta aproximadamente 100%, aproximadamente desde 70% hasta aproximadamente 100%, aproximadamente desde 80% hasta aproximadamente 100%, aproximadamente desde 90% hasta aproximadamente 100%, aproximadamente desde 95% hasta aproximadamente 100% de la longitud total de la proteína, o cualquier cantidad entre estos valores. Alternativamente, un fragmento o porción puede ser de aproximadamente 150 hasta aproximadamente 500 aminoácidos, o cualquier cantidad entre estos valores, dependiendo de la HA, y siempre y cuando el fragmento pueda formar una VLP cuando se expresa. Por ejemplo, un fragmento puede ser de 150 hasta aproximadamente 500 aminoácidos, o cualquier cantidad entre estos valores, aproximadamente desde 200 hasta aproximadamente 500 aminoácidos o cualquier cantidad entre estos valores, aproximadamente desde 250 hasta aproximadamente 500 aminoácidos o cualquier cantidad entre estos valores, aproximadamente desde 300 hasta aproximadamente 500 o cualquier cantidad entre estos valores, aproximadamente desde 350 hasta aproximadamente 500 aminoácidos o cualquier cantidad entre estos valores, aproximadamente desde 400 hasta aproximadamente 500 o cualquier cantidad entre estos valores, aproximadamente desde 450 hasta aproximadamente 500 o cualquier cantidad entre estos valores, dependiendo de la HA, y siempre y cuando el fragmento pueda formar una VLP cuando se expresa. Por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40 ó 50 aminoácidos, o cualquier cantidad entre estos valores pueda ser removida del terminal C, el terminal N o ambos el terminal N y el C y una proteína de HA, siempre y cuando el fragmento pueda formar una VLP cuando se expresa.
La numeración de los aminoácidos en cualquier secuencia dada es relativa a la secuencia particular, sin embargo, alguien capacitado en la técnica puede determinar fácilmente la “equivalencia” de un aminoácido particular en una secuencia con base en la estructura y/o secuencia. Por ejemplo, si 6 aminoácidos del terminal N fueran removidos cuando se construía un clon para cristalografía, esto cambiaría la identidad numérica específica del aminoácido (por ejemplo, con relación a la longitud total de la proteína), aunque no alteraría la posición relativa del aminoácido en la estructura.
Las comparaciones de una secuencia o de secuencias pueden hacerse utilizando un algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990, J. Mol Biol. 215: 403 - 410). Una búsqueda por BLAST permite la comparación de una secuencia de consulta con una secuencia específica o grupo de secuencias, o con una biblioteca o base de datos más grande (por ejemplo, GenBank o GenPept) de secuencias, e identificación no solamente de secuencias que exhiban 100% de identidad, sino también aquellas con menor grado de identidad. Las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos pueden compararse utilizando un algoritmo BLAST. Además, la identidad entre dos o más secuencias puede determinarse alineando las secuencias juntas y determinando el % de identidad entre las secuencias. La alineación puede llevarse a cabo utilizando el Algoritmo BLAST (por ejemplo, como el disponible a través del GenBank; URL: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/ utilizando parámetros predeterminados: Programa: blastn; Base de datos: nr; Esperado 10; filtro: predeterminado; Alineación: por pares; Códigos Genéticos de Consulta: Estándar (1)), o BLAST2 a través de EMBL, URL: embl-heidelberg.de/Services/index.html utilizando parámetros predeterminados: Matriz BLOSUM62; Filtro: predeterminado, ecofiltro: encendido, Esperado 10, corte: predeterminado; Cadena: ambas; Descripciones: 50, Alineamientos: 50; o FASTA, utilizando parámetros predeterminados), o por medio de comparación manual de las secuencias y calculando el % de identidad.
La presente invención describe, aunque no se limita a la clonación de un ácido nucleico que codifica HA en un vector de expresión vegetal, y la producción de las VLP de influenza a partir de la planta, adecuados para producción de vacunas. Los ejemplos de tales ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, aunque no se limitan a, una HA del virus de influenza A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 61), una HA de A/Indonesia/5/05 del subtipo (H5N1) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 60), A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 36, 48, 62), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 37, 49, 63), A/Singapur/1/57 (H2N2) (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 42, 54, 64), A/Anhui/1/2005 (HSN1) (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 43, 55, 65), A/Vietnam/1194/2004 (HSN1) (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 44, 56, 66), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 45, 57, 67), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 47, 59, 68), A/Brisbane/10/2007 (H3N2) (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 38, 50, 69), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 49, 51, 70), A/Equino/Praga/56 (H7N7) (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 46, 58, 71), B/Malasia/2506/2004 (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 40, 52, 72), B/Florida/4/2006 (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 41, 53, 73). Los números correspondientes de la construcción o del clon para estas cepas se proporciona en la Tabla 1. Las secuencias de ácido nucleico que corresponden a las SEQ ID NOs: 46 - 47 comprenden una plastocianina secuencia arriba y operativamente enlazada a la secuencia de codificación de la HA para cada uno de los tipos o subtipos, como se ilustra en las Figuras 28 - 49. Las secuencias de ácido nucleico que corresponden a las SEQ ID NOs: 60 - 73 comprenden un casete de expresión de HA que comprende un promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, una secuencia de codificación de hemaglutinina de una HA, 3' UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras, como se ilustra en las Figuras 51 - 64.
Las VPL pueden también utilizarse para producir reactivos que constan de proteínas estructurales recombinantes de influenza que se auto-ensamblan en estructuras de proteínas macromoleculares homotípicas inmunogénicas y funcionales, incluyendo partículas subvirales de influenza y VLP de influenza, en células de plantas transformadas.
Por lo tanto, la invención proporciona las VLP, y un método para producir las VLP virales en un sistema de expresión de una planta, a partir de la expresión de una sola proteína de la envoltura. Las VPL son VLP de influenza.
La presente invención involucra además la clonación de un ácido nucleico que codifica una HA, por ejemplo, aunque sin limitarse a la HA del virus de influenza humana A/Indonesia/5/05 (H5N1) en un vector de una planta y la producción de candidatos o reactivos de vacuna de influenza que constan de proteínas estructurales recombinantes de influenza que se auto-ensamblan en estructuras de proteínas macromoleculares homotípicas funcionales e inmunogénicas, incluyendo partículas de influenza subvirales y VLP de influenza, en células vegetales transformadas.
El ácido nucleico que codifica la HA se expresa en una célula de una planta, o en una planta. El ácido nucleico que codifica la HA se puede sintetizar por medio de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando ARN para HA. Por ejemplo, el ARN se puede aislar del virus de influenza humana A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), o del virus de influenza humana A/Indonesia/5/05 (H5N1), u otros virus de influenza por ejemplo A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1), A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equino/Praga/56 (H7N7), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, o de células infectadas con un virus de la influenza. Para transcripción inversa y PCR, se pueden utilizar cebadores de oligonucleótidos específicos para ARN de HA, por ejemplo, aunque sin limitarse a secuencias de HA del virus de la influenza A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) o secuencias de HA0 del Virus de la influenza humana A/Indonesia/5/05 (H5N1), o secuencias de HA de los subtipos de influenza A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1), A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equino/Praga/56 (H7N7), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006. Adicionalmente, un ácido nucleico que codifica HA puede sintetizarse químicamente utilizando métodos como lo sabría alguien capacitado en la técnica.
Las copias de ADNc resultantes de estos genes pueden clonarse en un vector de expresión adecuado como el requerido por el sistema de expresión huésped. Ejemplos de vectores de expresión apropiados para plantas se describen posteriormente.
La presente invención está dirigida además a una construcción génica que comprende un ácido nucleico que codifica HA, como se describió anteriormente, operativamente enlazado a un elemento regulador que es operativo en una planta. Ejemplos de elementos reguladores operativos en una célula vegetal y que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención incluyen, aunque no se limitan a, una región reguladora de plastocianina (patente de los Estados Unidos No. 7.125.978), o una región reguladora de Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO; patente de los Estados Unidos No. 4.962.028), proteína de enlazamiento de clorofila a/b (CAB; Leutwiler et al; 1986), ST-LS1 (asociada con el complejo que libera oxígeno del fotosistema II y descrito por Stockhaus et al. 1987, 1989). Un ejemplo de una región reguladora de plastocianina es una secuencia que comprende los nucleótidos 10 - 85 de la SEQ ID NO: 36, o una región similar de cualquiera de las SEQ ID NOs: 37 - 47.
Por lo tanto, la invención se relaciona con un ácido nucleico que comprende una región reguladora y una secuencia que codifica una HA de influenza. La región reguladora puede ser un elemento regulador de plastocianina, y la HA de la influenza puede seleccionarse de un grupo de cepas o subtipos de influenza, que comprende A/Nueva Caledonia/20/99 del subtipo (H1N1), A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1), A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equino/Praga/56 (H7N7), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006. Las secuencias de ácido nucleico que comprenden un elemento regulador de plastocianina y una HA de influenza se ejemplifican en la presente invención por las SEQ ID NOs: 36 - 47.
Se sabe que puede haber diferencias de secuencias en la secuencia de las secuencias de aminoácidos de la hemaglutinina de la influenza, o los ácidos nucleicos que las codifican, cuando se cultiva el virus de la influenza en huevos, o en células de mamífero (por ejemplo, células MDCK) o cuando se aíslan de un sujeto infectado. Ejemplos no limitantes de tales diferencias se ilustran en la presente invención, incluyendo el Ejemplo 18. Además, como lo comprenderá alguien capacitado en la técnica, puede observarse una variación adicional dentro de las hemaglutininas de influenza obtenidas de nuevas cepas ya que continúan produciéndose mutaciones adicionales. Debido a la variabilidad conocida de secuencia entre diferentes hemaglutininas de influenza, la presente invención incluye las VLP que pueden elaborarse utilizando cualquier hemaglutinina de influenza con tal que cuando se expresa en un huésped como se describe en la presente invención, la hemaglutinina de influenza forma una VLP.
Pueden determinarse las alineaciones de las secuencias y las secuencias de consenso utilizando cualquiera de los diversos paquetes de software conocidos en la técnica, por ejemplo, MULTALIN (F. CORPET, 1988, Nucl. Acids Res., 16 (22), 10881 - 10890), o pueden alinearse secuencias manualmente y determinarse las similitudes y diferencias entre las secuencias.
La estructura de las hemaglutininas está bien estudiada y se sabe que las estructuras están muy conservadas. Cuando se superponen las estructuras de hemaglutinina, se observa un alto grado de conservación estructural (rmsd <2A). Esta conservación estructural se observa aun cuando la secuencia de aminoácidos puede variar en algunas posiciones (véase, por ejemplo, Skehel and Wiley, 2000 Ann Rev. Biochem 69: 531 - 69; Vaccaro et al 2005). Regiones de las hemaglutininas están también bien conservadas, por ejemplo:
•
Dominios estructurales: La poliproteína HA0 se escinde para proporcionar la HA madura. La HA es un homotrímero con cada monómero que comprende un dominio de enlazamiento receptor (HA1) y un dominio de anclaje de membrana (HA2) enlazado por medio de u enlace disulfuro sencillo; los 20 residuos del terminal N de la subunidad HA2 pueden también denominarse como el dominio o secuencia de fusión de HA. También está presente una región de “cola" (interna a la envoltura de la membrana). Cada hemaglutinina comprende estas regiones o dominios. Las regiones o dominios individuales se conservan típicamente en longitud.
•
Todas las hemaglutininas contienen el mismo número y posición de los puentes disulfuro intra e intermoleculares. La cantidad y posición en la secuencia de aminoácidos de las cisteínas que participan en la red del puentes de disulfuro se conserva entre las HA. Ejemplos de estructuras que ilustran los puentes disulfuro intra e intermoleculares característicos y otros aminoácidos conservados y sus posiciones relativas se describen, por ejemplo, en Gamblin et al, 2004 (Science 303: 1838 - 1842). Los ejemplos de estructuras y secuencias incluyen 1RVZ, 1RVX, 1RVT, 1RV0, 1RUY, 1RU7, disponibles en el Banco de Datos de Proteínas (URL: www.rcsb.org).
•
Cola citoplasmática - la mayoría de las hemaglutininas comprende 3 cisteínas en las posiciones conservadas. Una o más de estas cisteínas pueden estar palmitoiladas como una modificación posterior la traducción.
La variación de aminoácidos se tolera en hemaglutininas de virus de influenza. Esta variación proporciona nuevas cepas que se identifican continuamente. La infectividad entre las nuevas cepas puede variar. Sin embargo, se mantiene la formación de trímeros de hemaglutinina, los cuales posteriormente forman las VLP. La presente invención, por lo tanto, se refiere a una secuencia de aminoácidos de hemaglutinina, o un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de hemaglutinina, que forma las VLP en una planta, e incluye secuencias conocidas y variantes de secuencias que pueden desarrollarse.
La Figura 65 ilustra un ejemplo de tal variación conocida. Esta figura muestra una secuencia de aminoácidos de consenso (SEQ ID No: 74) para HA de las siguientes cepas H1N1:
A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) (codificada por la SEQ ID NO: 33),
A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 48),
A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 49) y
la SEQ ID NO: 9. x1 (posición 3) es A o V; X2 (posición 52) es D o N; X3 (posición 90) es K o R; X4 (posición 99) es K o T; X5 (posición 111) es Y o H; X6 (posición 145) es V o T; X7 (posición 154) es E o K; X8 (posición 161) es R o K; X9 (posición 181) es V o A; X10 (posición 203) es D o N; X11 (posición 205) es R o K; X12 (posición 210) es T o K; X13 (posición 225) es R o K; X14 (posición 268) es W o R; X15 (posición 283) es T o N; X16 (posición 290) es E o K; X17 (posición 432) es I o L; X18 (posición 489) es N o D.
Como otro ejemplo de tal variación, se muestra una alineación de secuencia y una secuencia de consenso para HA de A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) (codificada por la SEQ ID NO: 33), A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 48), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 49), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) y SEQ ID NO: 9 a continuación en la Tabla 3.
Tabla 3: Alineación de la secuencia y de la secuencia de consenso para HA de cepas H1N1 seleccionadas
SEQ ID NO. Secuencias
La secuencia de consenso indica en letras mayúsculas los aminoácidos comunes a todas las secuencias en una posición designada; las letras minúsculas indican aminoácidos comunes para al menos la mitad, o la mayoría de las 5 secuencias; el símbolo ! es cualquiera de I o V; el símbolo $ es cualquiera de L o M; el símbolo % es cualquiera de F
o Y; el símbolo # es cualquiera de N, D, Q, E, B o Z; el símbolo “." no es aminoácido (por ejemplo, una supresión); X en la posición 3 es cualquiera de A o V; X en la posición 52 es cualquiera de E o N; X en la posición 90 es K o R; X en la posición 99 es T o K; X en la posición 111 es cualquiera de Y o H; X en la posición 145 es cualquiera de V o T; X en la posición 157 es K o E; X en la posición 162 es R o K; X en la posición 182 es V o A; X en la posición 203 es
10 N o D; X en la posición 205 es R o K; X en la posición 210 es T o K; X en la posición 225 es K o Y; X en la posición 333 es H o una supresión; X en la posición 433 es I o L; X en la posición 49 es N o D.
Como otro ejemplo de tal variación, se muestra una secuencia de alineación y una secuencia de consenso para HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 55), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) y A/Indonesia/5/2006 (H5N1) (SEQ ID NO: 10) a continuación en la Tabla 4.
Tabla 4 : Alineación de secuencia y secuencia de consenso para HA de cepas H1N1 seleccionadas
SEQ ID NO. Secuencias
La secuencia de consenso indica en letras mayúsculas los aminoácidos comunes a todas las secuencias en una posición designada; las letras minúsculas indican aminoácidos comunes a por lo menos la mitad, o una mayoría de las secuencias; el símbolo ! es cualquiera de I o V; el símbolo $ es cualquiera de L o M; el símbolo % es cualquiera de F o Y; el símbolo # es cualquiera de N, D, Q, E, B o Z; X en la posición 102 es cualquiera de T, V o A; X en la posición 110 es cualquiera de S, D o N; X en la posición 156 es cualquiera de S, K o T.
Las alineaciones descritas e ilustradas anteriormente y las secuencias de consenso son ejemplos no limitantes de variantes en secuencias de aminoácidos de hemaglutinina que pueden utilizarse en varias formas de realización de la invención para la producción de las VPL en una planta.
Un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos puede determinarse fácilmente, ya que los codones para cada aminoácido se conocen en la técnica. La provisión de una secuencia de aminoácidos, por lo tanto, enseña las secuencias degeneradas de ácido nucleico que la codifican. La presente invención, por lo tanto, proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la hemaglutinina de aquellas cepas y subtipos de influenza divulgados en la presente invención (por ejemplo, A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/pollo/Nueva York/1995, A/gaviota argéntea/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/ánade real/MN/33/00, A/pato/Shanghái/1/2000, A/ánade de cola larga/TX/828189/02, A/Pavo/Ontario/6118/68 (H8N4), A/pato cuchareta/ Irán/G54/03, A/pollo/Alemania/N/1949 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56 (H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5),A/Gaviota//Maryland/704/77 (H13N6), A/Ánade real/Gurjev/263/82, A/pato/Australia/341/83 (H15N8), A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburgo/66, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1), A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)), así como las secuencias degeneradas que codifican las hemaglutininas anteriores.
Además, una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico puede determinarse fácilmente, ya que se conocen el codón o los codones para cada aminoácido. La provisión de un ácido nucleico, por lo tanto, enseña una secuencia de aminoácidos codificada por él. La invención, por lo tanto, proporciona secuencias de aminoácidos de la hemaglutinina de aquellas cepas y subtipos de influenza divulgados en la presente invención (por ejemplo, A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/pollo/Nueva York/1995, A/gaviota argéntea/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/ánade real/MN/33/00, A/pato/Shanghái/1/2000, A/ánade de cola larga/TX/828189/02, A/Pavo/Ontario/6118/68 (H8N4), A/pato cuchareta/Irán/G54/03, A/pollo/Alemania/N/1949 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56 (H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5), A/Gaviota/Maryland/704/77 (H13N6), A/Ánade/ Gurjev/263/82, A/pato/Australia/341/83 (H15N8), A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburgo/66, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1), A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)).
En plantas, las VLP de influenza brotan desde la membrana plasmática (véase el Ejemplo 5 y la Figura 19) por lo tanto la composición de lípidos de las VLP refleja su origen. Las VLP producidas de acuerdo con la presente invención comprenden HA de uno o más de un tipo o subtipo de influenza, acomplejadas con lípidos derivados de plantas. Los lípidos de plantas pueden estimular células inmunes específicas y mejorar la respuesta inmune inducida. Las membranas de plantas están constituidas por lípidos, fosfatidilcolina (PC) y fosfatidil etanolamina (PE) y también contienen glicoesfingolípidos, saponinas y fitoesteroles. Adicionalmente, las balsas lipídicas se encuentran también en membranas plasmáticas de plantas - estos microdominios se enriquecen en esfingolípidos y esteroles. En las plantas, se sabe que se presentan una variedad de fitoesteroles, incluyendo estigmasterol, sitosterol, 24metilcolesterol y colesterol (Mongrand et al., 2004).
La PC y la PE, así como los glicoesfingolípidos pueden enlazarse a moléculas CD1 expresadas por células inmunes de mamíferos tales como células que presentan antígenos (APC) como células dendríticas y macrófagos y otras células incluyendo linfocitos B y T en el timo y el hígado (Tsuji M., 2006). Las moléculas CD1 son estructuralmente similares a las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de la clase I y su papel es presentar antígenos de glicolípidos a células NKT (células T asesinas naturales). Después de la activación, células inmunes innatas activan células NKT tales como células NK y células dendríticas y también activan células inmunes adaptivas como las células B y las células T que producen anticuerpos.
Una variedad de fitoesteroles pueden encontrarse en una membrana plasmática - el complemento específico puede variar dependiendo de la especie, las condiciones de crecimiento, recursos de nutrientes o estado del patógeno, para mencionar unos pocos factores. Generalmente, el beta-sitosterol es el fitoesterol más abundante.
Los fitoesteroles presentes en una VLP de influenza acomplejados con una bicapa de lípido, tal como una envoltura derivada de la membrana plasmática pueden proporcionar una composición ventajosa de vacuna. Sin ánimo de ceñirnos a ninguna teoría particular, las VPL elaboradas en la planta acomplejadas con una bicapa de lípidos, tal como una envoltura derivada de la membrana plasmática, pueden inducir una reacción inmune más fuerte que las VLP elaboradas en otros sistemas de expresión, y pueden ser similares a la reacción inmune inducida por el hígado
o vacunas de virus completos atenuados.
Por lo tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona una VLP producida de acuerdo con la invención acomplejada con una bicapa de lípidos derivada de plantas. En algunas formas de realización, la bicapa de lípidos derivada de plantas puede comprender la envoltura de la VLP.
La VLP producida dentro de una planta puede inducir una HA que comprende N-glicanos específicos de plantas. Por
lo tanto, esta invención también proporciona una VLP que comprende HA que tiene N-glicanos específicos de plantas.
Además, se conoce la modificación del N-glicano en plantas (véase por ejemplo, el documento U.S. 60/944.344) y puede producirse la HA que tiene N-glicanos modificados. Puede obtenerse la HA que comprende un patrón de glicosilación modificado, por ejemplo con N-glicanos fucosilados , xilosilados o ambos, fucosilados y xilosilados reducidos, o puede obtenerse la HA que tiene un patrón de glicosilación modificado, en donde la proteína carece de fucosilación, xilosilación, o ambos, y comprende una mayor galactosilación. Además, la modulación de las modificaciones posteriores a la traducción, por ejemplo, la adición de galactosa terminal puede resultar en una reducción de fucosilación y xilosilación de la HA expresada cuando se compara a una planta de tipo silvestre que expresa HA.
Por ejemplo, y que no debe considerarse como limitante, la síntesis de la HA que tiene un patrón de glicosilación modificado puede lograrse por medio de la coexpresión de la proteína de interés junto con una secuencia de nucleótidos que codifica beta-1.4galactosiltransferasa (GalT), por ejemplo, aunque sin limitarse a GalT de mamífero,
o GalT humana, sin embargo también puede utilizarse GalT de otras fuentes. El dominio catalítico de GalT puede también fusionarse a un dominio de CTS (es decir, la cola citoplasmática, el dominio transmembrana, la región tallo) de la N-acetilglucosaminil transferasa (GNT1, para producir una enzima híbrida GNT1-GalT, y la enzima híbrida puede coexpresarse con HA. La HA puede también coexpresarse junto con una secuencia de nucleótidos que codifica N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT-III), por ejemplo, aunque sin limitarse a GnT-III de mamífero o GnT-III humana, puede utilizarse también GnT-III de otras fuentes. Adicionalmente, también puede utilizarse una enzima híbrida GNT1-GnT-III, que comprende el CTS de GNT1 fusionado a GnT-III.
Por lo tanto, la presente invención también incluye VLP, que comprenden HA que tiene N-glicanos modificados, que son producidos por los métodos de la invención.
Sin ánimo de ceñirnos a ninguna teoría en particular, la presencia de N-glicanos de plantas sobre HA puede estimular la respuesta inmune promoviendo el enlazamiento de HA por células que presentan antígenos. Se ha propuesto la estimulación de la respuesta inmune utilizando N-glicano de plantas por parte de Saint-jore-Dupas et al. (2007). Además, la conformación de la VLP puede ser ventajosa para la presentación del antígeno, y mejora el efecto adyuvante de la VLP cuando se acompleja con una capa de lípidos derivada de la planta.
Por “región reguladora”, “elemento regulador" o “promotor” se entiende una porción de ácido nucleico típicamente, aunque no siempre, secuencia arriba de la región que codifica las proteínas de un gen, la cual puede estar compuesta de ADN o ARN o tanto ADN como ARN. Cuando una región reguladora está activa, y en asociación operativa, o enlazada operativamente, con un gen de interés, esto puede resultar en la expresión de un gen de interés. Un elemento regulador puede ser capaz de mediar la especificidad orgánica, o controlar el desarrollo o la activación genética temporal. Una “región reguladora" incluye elementos promotores, elementos promotores centrales que exhiben una actividad promotora basal, elementos que son inducibles en respuesta a un estímulo externo, elementos que median la actividad promotora tal como elementos reguladores negativos o mejoradores de la transcripción. La “región reguladora", como se utiliza en la presente invención, también incluye elementos que son activos después de la transcripción, por ejemplo, elementos reguladores que modulan la expresión genética tales como mejoradores de la traducción y de la transcripción, represores de la traducción y de la transcripción, secuencias de activación secuencia arriba, y determinantes de la inestabilidad del ARNm. Varios de estos últimos elementos pueden ubicarse próximos a la región de codificación.
En el contexto de esta divulgación, el término “elemento regulador" o “región reguladora” típicamente se refiere a una secuencia de ADN, usualmente, aunque no siempre, secuencia arriba (5’) a la secuencia de codificación de un gen estructural, el cual controla la expresión de la región de codificación proporcionando el reconocimiento para la ARN polimerasa y/u otros factores requeridos para que la transcripción inicie en un sitio particular. Sin embargo, debe entenderse que otras secuencias de nucleótidos, ubicadas dentro de los intrones, o 3’ de la secuencia pueden también contribuir a la regulación de expresión de una región de codificación de interés. Un ejemplo de un elemento regulador que proporciona el reconocimiento para la ARN polimerasa u otros factores de transcripción para asegurar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. La mayoría, aunque no todos los elementos promotores eucariotas contienen una caja TATA, una secuencia de ácido nucleico conservada que consta de pares de bases de nucleótidos de adenosina y timidina usualmente situados aproximadamente 25 pares de bases secuencia arriba de un sitio de inicio de la transcripción. Un elemento promotor comprende un elemento promotor basal, responsable por el inicio de la transcripción, así como otros elementos reguladores (como se enlistó anteriormente) que modifican la expresión génica.
Existen varios tipos de regiones reguladoras, incluyendo aquellas que se regulan por desarrollo, inducibles o constitutivas. Una región reguladora que se regula por desarrollo, o controla la expresión diferencial de un gen bajo su control, se activa dentro de ciertos órganos o tejidos de un órgano en momentos específicos durante el desarrollo de ese órgano o tejido. Sin embargo, algunas regiones reguladoras que se regulan por desarrollo pueden activarse preferencialmente dentro de ciertos órganos o tejidos en etapas específicas del desarrollo, también pueden ser activas en una forma regulada por desarrollo, o a un nivel basal en otros órganos o tejidos dentro de la planta también. Ejemplos de regiones reguladoras específicas de tejidos, por ejemplo, véase - especifica de una región reguladora, incluye al promotor de napina, y al promotor de cruciferina (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595 599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125 - 130). Un ejemplo de un promotor específico de la hoja incluye el promotor de plastocianina (Figura 1b o la SEQ ID NO: 23); patente de los Estados Unidos No. 7.125.978).
Una región reguladora inducible es aquella que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una
o más secuencias o genes de ADN en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias o genes de ADN no serán transcritos. Típicamente el factor de proteína que se enlaza específicamente a una región reguladora inducible para activar la transcripción puede presentarse en una forma activa, que es luego directa o indirectamente convertida a la forma activa por el inductor. Sin embargo, el factor de proteína también puede estar ausente. El inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, metabolito, regulador de crecimiento, herbicida o compuesto fenólico o un estrés fisiológico impuesto directamente por calor, frío, sal o elementos tóxicos
o indirectamente mediante la acción de un patógeno o agente infeccioso tal como un virus. Una célula vegetal que contiene una región reguladora inducible puede ser expuesta a un inductor aplicando externamente el inductor a la célula o planta por ejemplo por aspersión, riego, calentamiento o métodos similares. Los elementos reguladores inducibles pueden derivarse ya sea de genes de la planta o que no son de la planta (por ejemplo, Gatz, C. y Lenk, I.
R.
P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352 - 358). Ejemplos de promotores inducibles potenciales incluyen, aunque no se
limitan al promotor inducible de tetraciclina (Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 48, 89 - 108), el promotor inducible por esteroides (Aoyama, T. y Chua, N. H., 1997, Plant J. 2, 397 - 404) y el promotor inducible por etanol (Salter, M. G., et al., 1998, Plant Journal 16, 127 - 132; Caddick, M. X. et al., 1998, Nature Biotech, 16, 177 180) genes IB6 y CK11 inducibles por citoquinina (Brandstatter, I. y Kieber, J. J., 1998, Plant Cell 10, 1009 - 1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982 - 985) y el elemento inducible por auxina, DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963 - 1971).
Una región reguladora constitutiva dirige la expresión de un gen a través de las diferentes partes de una planta y continuamente durante todo el desarrollo de la planta. Ejemplos de elementos reguladores constitutivos conocidos incluyen promotores asociados con el transcripto 35S de CaMV (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810 - 812), la actina 1 del arroz (Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3: 1155 - 1165), actina 2 (An et al., 1996, Plant J., 10: 107 - 121) o tms 2 (patente de los Estados Unidos No. 5.428.147) y los genes para la triosafosfato isomerasa 1 (Xu et al., 1994, Plant Physiol. 106: 459 - 467), el gen de la ubiquitina 1 de maíz (Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637 - 646), los genes 1 y 6 de ubiquitina de Arabidopsis (Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637 - 646), y el gen del factor 4A de inicio de la traducción de tabaco (Mandel et al., 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995 - 1004). El término “constitutivo” como se utiliza en la presente invención, no necesariamente indica que un gen bajo control de la región reguladora constitutiva se expresa al mismo nivel en todos los tipos de células, sino que el gen se expresa en un amplio rango de tipos celulares aun cuando a menudo se observa una variación en abundancia.
Por “operativamente enlazado” se entiende que las secuencias particulares, por ejemplo, un elemento regulador y una región de codificación de interés, interactúan ya sea directa o indirectamente para llevar a cabo una función pretendida, tal como la medición o modulación de la expresión génica. La interacción de las secuencias operativamente enlazadas puede, por ejemplo, ser mediada por proteínas que interactúan con las secuencias operativamente enlazadas.
Una o más de las secuencias de nucleótidos usadas en los métodos de la presente invención puede expresarse en cualquier huésped vegetal adecuado que se transforma por la secuencia de nucleótidos, o construcciones, o vectores de la presente invención. Los ejemplos de huéspedes adecuados incluyen, aunque no se limitan a, cultivos agrícolas incluyendo alfalfa, canola, Brassica spp., maíz, Nicotiana spp, alfalfa, patata, ginseng, guisante, avena, arroz, soja, trigo, cebada, girasol, algodón y similares.
Una o más de las construcciones genética quiméricas de la presente invención pueden comprender además una región 3’ no traducida. Una región 3' no traducida se refiere a aquella porción de un gen que comprende un segmento de ADN que contiene una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora capaz de efectuar el procesamiento del ARNm o expresión genética. La señal de poliadenilación se caracteriza usualmente efectuando la adición de rastros de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm. Las señales de poliadenilación se reconocen comúnmente por la presencia de homología con la forma canónica 5' AATAAA-3’ aunque no son infrecuentes las variaciones. Una o más de las construcciones genéticas quiméricas de la presente invención pueden también incluir potenciadores adicionales, ya sea potenciadores de traducción o de transcripción, según se requiera. Estas regiones potenciadoras son bien conocidas por personas capacitadas en la técnica, y pueden incluir el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes. El codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación para asegurar la traducción de la secuencia completa.
Ejemplos no limitantes de regiones 3' adecuadas son las regiones 3' no traducidas, transcritas que contienen una señal de poliadenilación de genes del plásmido que inducen tumor (Ti) de Agrobacterium, tal como los genes de plantas y de nopalina sintasa (gen Nos) tal como los genes de proteína de almacenamiento de soja, la subunidad pequeña del gen de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBlSCO; patente de los Estados Unidos No. 4.962.028), el promotor utilizado en la regulación de la expresión de la plastocianina (Pwee y Gray, 1993). Un ejemplo de un promotor de plastocianina se describe en la patente de los Estados Unidos No. 7.125.978.
Como se describe en la presente invención, se ha encontrado que los promotores que comprenden secuencias potenciadoras con eficacia demostrada en la expresión de la hoja, son efectivos en expresión transitoria. Sin ánimo de ceñirnos a ninguna teoría en particular, la unión de elementos reguladores secuencia arriba de un gen fotosintético por medio de la unión a la matriz nuclear puede mediar una fuerte expresión. Por ejemplo hasta -784 desde el sitio de inicio de la traducción del gen de plastocianina de guisante puede utilizarse para mediar la fuerte expresión génica del reportero.
Para ayudar en la identificación de las células de plantas transformadas, las construcciones de esta invención pueden manipularse además para incluir marcadores seleccionables de plantas. Marcadores seleccionables útiles incluyen enzimas que proporcionan resistencia a compuestos químicos tal como un antibiótico por ejemplo, gentamicina, higromicina, kanamicina o herbicidas tal como fosfinotricina, glifosato, clorosulfurón y similares. En forma similar, se pueden utilizar las enzimas que permiten la producción de un compuesto identificable por medio de cambio de color tal como GUS (beta-glucuronidasa), o luminiscencia, tal como luciferasa o GFP.
También se utilizan de acuerdo con los métodos de esta invención plantas transgénicas, células de plantas o semillas que contienen la construcción genética quimérica de la presente invención. Los métodos para regenerar plantas completas a partir de células de la planta se conocen también en la técnica. En general, se cultivan células de plantas transformadas en un medio apropiado, el cual puede contener agentes selectivos tal como antibióticos, en donde se utilizan marcadores seleccionables para facilitar la identificación de células de plantas transformadas. Una vez se forman los callos, se puede estimular la formación de brotes empleando las hormonas apropiadas de plantas de acuerdo con métodos conocidos y se transfieren los brotes al medio de enraizamiento para regeneración de las plantas. Las plantas pueden utilizarse luego para establecer generaciones repetitivas, ya sea a partir de semillas o utilizando técnicas de propagación vegetativas. También pueden generarse plantas transgénicas sin utilizar cultivos de tejidos.
También se consideran parte de esta invención las plantas transgénicas y árboles que contienen la construcción génica quimérica que comprende un ácido nucleico que codifica HA0 recombinante para la producción de VLP, de acuerdo con la presente invención.
Los elementos reguladores usados en la presente invención pueden también combinarse con la región de codificación de interés para expresión dentro de un rango de organismos huéspedes que son sensibles a transformación, o expresión transitoria. Tales organismos incluyen, aunque no se limitan a plantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, por ejemplo, aunque sin limitarse a maíz, plantas de cereales, trigo, cebada, avena, Nicotiana spp, Brassica spp, soja, judías, guisantes, alfalfa, patata, tomate, ginseng y Arabidopsis.
Los métodos para transformación estable, y regeneración de estos organismos están establecidos en la técnica y son conocidos por alguien capacitado en la técnica. El método para obtener plantas transformadas y regeneradas no es crítico para la presente invención.
Por “transformación” se entiende la transferencia interespecífica estable de información genética (secuencia de nucleótidos) que se manifiesta genotípicamente, fenotípicamente o ambas. La transferencia interespecífica de la información genética desde una construcción quimérica a un huésped puede ser heredable y la transferencia de la información genética se considera estable, o la transferencia puede ser transitoria y la transferencia de la información genética no es heredable.
Por el término “materia vegetal”, se entiende cualquier material derivado de una planta. La materia vegetal puede incluir una planta completa, tejido, células o cualquier fracción de los mismos. Además, la materia vegetal puede comprender componentes intracelulares de la planta, componentes extracelulares de la planta, extractos líquidos o sólidos de las plantas, o una combinación de los mismos. Además, la materia vegetal puede comprender plantas, células vegetales, tejido, un extracto líquido o una combinación de los mismos, de hojas de las plantas, tallos, frutos, raíces o una combinación de los mismos. La materia vegetal puede comprender una planta o una porción de la misma la cual no ha sido sometida a cualquiera de las etapas de procesamiento. Sin embargo, se contempla también que el material vegetal puede ser sometido a etapas de procesamiento mínimas como se define a continuación, o procesamiento más riguroso, incluyendo purificación parcial o sustancial de proteínas utilizando técnicas comúnmente conocidas en el arte, aunque sin limitarse a cromatografía, electroforesis y similares.
Por el término “procesamiento mínimo" se entiende materia vegetal, por ejemplo, una planta o porción de la misma que comprende una proteína de interés, la cual se purifica parcialmente para producir un extracto vegetal, homogenato, fracción del homogenato vegetal o similares (es decir, mínimamente procesado). La purificación parcial puede comprender, aunque sin limitarse a rompimiento de las estructuras celulares de la planta por lo que se crea una composición que comprende componentes vegetales solubles y componentes vegetales insolubles los cuales pueden separarse por ejemplo mediante, aunque sin limitarse a, centrifugación, filtración o combinación de los mismos. En este sentido, las proteínas secretadas dentro del espacio extracelular de la hoja u otros tejidos podrían obtenerse fácilmente utilizando extracción al vacío o centrifugación, o se podrían extraer los tejidos bajo presión por medio del paso a través de rodillos o por molienda o similares para comprimir o liberar la proteína libre dentro del espacio extracelular. El procesamiento mínimo podría también implicar la preparación de extractos sin purificar de proteínas solubles, ya que estas preparaciones podrían tener una contaminación insignificante de productos vegetales secundarios. Además, el procesamiento mínimo puede implicar la extracción acuosa de la proteína soluble de las hojas, seguida por la precipitación con cualquier sal adecuada. Otros métodos pueden incluir maceración a gran escala y extracción de los jugos con el fin de permitir el uso directo del extracto.
La materia vegetal, en la forma de material o tejido vegetal puede suministrarse oralmente a un sujeto. La materia vegetal puede administrarse como parte de un suplemento dietético, junto con otros alimentos, o encapsularse. La materia o el tejido vegetal pueden también concentrarse para mejorar o incrementar el buen sabor, o proporcionarse junto con otros materiales, ingredientes, o excipientes farmacéuticos, según se requiera.
Los ejemplos de un sujeto u organismo objetivo a los cuales puede administrarse las VLP producidas de acuerdo con la presente invención pueden incluir, aunque no limitarse a, seres humanos, primates, aves, aves acuáticas, aves migratorias, gaviotas, patos, gansos, aves de corral, pollos, cerdos, ovejas, equinos, caballos, camellos, caninos, perros, felinos, gatos, tigres, leopardos, civetas, visones, martas, hurones, mascotas, ganado, conejos, ratones, ratas, cobayos u otros roedores, focas, ballenas y similares. Tales organismos objetivo son ejemplos, y no deben considerarse como limitantes para las aplicaciones y usos de la presente invención.
Se contempla que una planta que comprende la proteína de interés, o que expresa la VLP que comprende la proteína de interés puede ser administrada a un sujeto u organismo objetivo, en una variedad de formas, dependiendo de la necesidad y de la situación. Por ejemplo, la proteína de interés obtenida de la planta puede ser extraída antes de su uso ya sea en forma purificada, parcialmente purificada o sin purificar. Si la proteína va a ser purificada, entonces puede producirse ya sea en plantas comestibles o no comestibles. Además, si la proteína se administra en forma oral, el tejido vegetal puede cosecharse y ser suministrado directamente al sujeto, o el tejido cosechado puede secarse antes de ser administrado, o se le puede permitir a un animal comer la planta sin tener que cosechar previamente. También se considera dentro del alcance de esta invención suministrar los tejidos vegetales cosechados como un suplemento alimenticio dentro del pienso para animales. Si se va a suministrar tejido vegetal a un animal con poco o ningún procedimiento adicional, se prefiere que el tejido vegetal que se va a administrar sea comestible.
El silenciamiento genético de posterior a la transcripción (PTGS) puede estar involucrado en la limitación de la expresión de transgenes en plantas, y puede utilizarse la coexpresión de un supresor de silenciamiento del virus Y de patata (HcPro) para contrarrestar la degradación específica de los ARNm transgénicos (Brigneti et al., 1998). Los supresores alternativos de silenciamiento son bien conocidos en la técnica y pueden utilizarse como se describe en la presente invención (Chiba et al., 2006, Virology 346: 7 - 14), por ejemplo, aunque sin limitarse a, TEV -pl/HC-Pro (virus del grabado del tabaco-pl/HC-Pro), BYV -p21, p19 del virus de enanismo arbustivo del tomate (TBSV p19), proteína de la cápside del virus de rizadura del tomate (TCV-CP), 2b del virus del mosaico del pepino; CMV-2b), p25 del virus X de la patata (PVX-p25), p11 del virus M de la patata (PVM-p11), p11 del virus S de la patata (PVS-p11), p16 del virus de quemadura del arándano, (BScV-p16), p23 del virus de la tristeza de los cítricos (CTV-p23), p24 del virus-2 asociado con el enrollamiento de hoja de la vid, (GLRaV-2 p24), p10 del virus A de la vid, (GVA-p10), p14 del virus B de la vid (GVB-p14), p10 del virus latente de Heracleum (HLV-p10) o p16 del virus latente común del ajo (GCLV-p16). Por lo tanto, un supresor de silenciamiento, por ejemplo, aunque sin limitarse a, HcPro, TEV -p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 o GVA-p10, puede coexpresarse junto con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés para asegurar además altos niveles de producción de proteína dentro de una planta.
Además, pueden producirse las VLP de manera que comprendan una combinación de subtipos de HA. Por ejemplo, las VLP pueden comprender uno o más de una HA del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, o una combinación de los mismos. La selección de la combinación de las HAS puede determinarse por el uso pretendido de la vacuna preparada a partir de la VLP. Por ejemplo, una vacuna para uso en la inoculación de aves puede comprender cualquier combinación de subtipos de HA, mientras que las VLP útiles para inocular seres humanos pueden comprender subtipos de uno o más de uno de los subtipos H1, H2, H3, H5. Sin embargo, otras combinaciones del subtipo de HA puede prepararse dependiendo del uso de la VLP. Con el fin de producir las VLP que comprenden combinaciones de los subtipos de HA, el subtipo deseado de HA puede coexpresarse dentro de la misma célula vegetal.
Además, las VLP producidas como se describe en la presente invención no comprenden neuraminidasa (NA). Sin embargo, la NA puede coexpresarse con la HA en el caso en donde se deseen VLP que comprendan HA y NA.
Por lo tanto, la presente invención incluye además un vector adecuado que comprende la construcción quimérica adecuada para uso ya sea con sistemas de expresión estables o transitorios. La información genética puede también ser proporcionada dentro de una o más de una construcción. Por ejemplo, se puede introducir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de interés en una construcción, y se puede introducir una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que modifica la glicosilación de la proteína de interés utilizando una construcción separada. Estas secuencias de nucleótidos pueden luego coexpresarse dentro de una planta. Sin embargo, puede utilizarse también una construcción que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica tanto la proteína de interés como la proteína que modifica el perfil de glicosilación de la proteína de interés. En este caso la secuencia de nucleótidos comprendería una primera secuencia que contiene una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína de interés enlazada operativamente a una región promotora o reguladora, y una segunda secuencia que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína que modifica el perfil de glicosilación de la proteína de interés, la segunda secuencia enlazada operativamente a una región promotora o reguladora.
Por “coexpresado" se entiende que dos o más de dos secuencias de nucleótidos se expresan aproximadamente al mismo tiempo dentro de la planta, y dentro del mismo tejido de la planta. Sin embargo, las secuencias de nucleótidos no necesitan expresarse exactamente al mismo tiempo. Más bien, las dos o más secuencias de nucleótidos se expresan en una forma tal que los productos codificados tengan una oportunidad de interactuar. Por ejemplo, la proteína que modifica la glicosilación de la proteína de interés puede expresarse ya sea antes o durante el periodo cuando la proteína de interés se expresa de tal manera que la modificación de la glicosilación de la proteína de interés tiene lugar. Las dos o más de dos secuencias de nucleótidos pueden coexpresarse utilizando un sistema de expresión transitorio, en donde las dos o más secuencias se introducen dentro de la planta aproximadamente al mismo tiempo bajo condiciones tales que se expresen ambas secuencias. Alternativamente, una planta de plataforma que comprende una de las secuencias de nucleótidos, por ejemplo, la secuencia que codifica la proteína que modifica el perfil de glicosilación de la proteína de interés, puede transformarse, ya sea transitoriamente o en una forma estable, con una secuencia adicional que codifica la proteína de interés. En este caso, la secuencia que codifica la proteína que modifica el perfil de glicosilación de la proteína de interés puede expresarse dentro de un tejido deseado, durante una etapa deseada de desarrollo, o su expresión puede inducirse utilizando un promotor inducible, y la secuencia adicional que codifica la proteína de interés puede expresarse bajo condiciones similares y en el mismo tejido, para asegurar que se coexpresan las secuencias de nucleótidos.
Las construcciones pueden introducirse en las células de la planta utilizando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores virales de la planta, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, etc. Para la revisión de tales técnicas véase por ejemplo, Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, páginas 421 - 463 (1988); Geierson y Corey, Plant Molecular Biology, 2ª edición, (1988); y Miki y Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. En Plant Metabolism, 2a edición, DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd, Londres, páginas 561 - 579 (1997). Otros métodos incluyen la incorporación directa de ADN, el uso de liposomas, electroporación, por ejemplo, utilizando protoplastos, microinyección, microproyectiles o bigotes e infiltración al vacío. Véase por ejemplo, Bilang, et al. (Gene 100: 247 - 250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104 - 112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111 - 116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30 - 36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70 - 73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229 - 1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91: 694 701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach y Weissbach, eds. Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler y Zielinski eds., Academic Press Inc., 1989), Liu y Lomonossoff (J. Virol Meth, 105: 343 - 340, 2002), las patentes norteamericanas Nos. 4.945.050; 5.036.006; y 5.100.792, las solicitudes de patentes norteamericanas con No de Serie 08/438.666, presentada el 10 de mayo de 1995, y 07/951.715, presentada el 25 de septiembre de 1992.
Pueden utilizarse métodos de expresión transitoria para expresar las construcciones utilizadas en los métodos de la presente invención (véase Liu y Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105: 343 - 348). Alternativamente, puede utilizarse un método de expresión transitoria con base en vacío, como lo describen Kapila et al. 1997. Estos métodos pueden incluir, por ejemplo, aunque sin limitarse a, un método de Agroinoculación o Agroinfiltración, sin embargo, también se pueden utilizar otros métodos transitorios como se observó anteriormente. Ya sea con la Agroinoculación o con la Agroinfiltración, una mezcla de Agrobacterias que incluye el acido nucleico deseado ingresa a los espacios intercelulares de un tejido, por ejemplo, las hojas, la porción aérea de la planta (incluyendo tallo, hojas y flores), otra porción de la planta (tallo, raíz, flor) o la planta completa. Después de cruzar la epidermis el Agrobacterium infecta y transfiere copias de ADN-t dentro de las células. El ADN-t se transcribe en forma episomal y se traduce el ARNm, conduciendo a la producción de la proteína de interés en células infectadas, sin embargo, el paso del ADN-t dentro del núcleo es transitorio.
Si la secuencia de nucleótidos de interés codifica un producto que sea directa o indirectamente tóxico para la planta, entonces al utilizar el método de la presente invención, se puede reducir dicha toxicidad en toda la planta expresando selectivamente la secuencia de nucleótidos de interés dentro de un tejido deseado o una etapa deseada del desarrollo de la planta. Además, el periodo limitado de expresión que resulta de la expresión transitoria puede reducir el efecto cuando se produce un producto tóxico en la planta. Se puede utilizar un promotor inducible, un promotor especifico del tejido, o un promotor específico de la célula, para dirigir selectivamente la expresión de la secuencia de interés.
Las VLP de HA recombinante de la presente invención pueden utilizarse junto con vacunas existentes para influenza, para suplementar las vacunas, hacerlas más eficaces, y para reducir la administración de las dosis necesarias. Como lo sabría una persona capacitada en la técnica, la vacuna puede dirigirse contra uno o más de un virus de la influenza. Los ejemplos de vacunas adecuadas incluyen, aunque no se limitan a aquellas comercialmente disponibles de Sanofi-Pasteur, ID Biomedical, Merial, Sinovac, Chiron, Roche, Medlmmune, GlaxoSmithKline, Novartis, Sanofi-Aventis, Serono, Shire Pharmaceuticals y similares.
Si se desea, las VLP producidas de acuerdo con la presente invención pueden mezclarse con un adyuvante adecuado como lo sabría una persona capacitada en la técnica. Además, se puede utilizar la VLP en una composición de vacuna que comprende una dosis efectiva de la VLP para el tratamiento de un organismo objetivo, como se definió anteriormente. Además, la VLP producida de acuerdo con la presente invención puede combinarse con las VLP obtenidas utilizando diferentes proteínas de influenza, por ejemplo, neuraminidasa (NA).
Por lo tanto, la presente invención proporciona las VLP y comparaciones de la invención para inducir inmunidad a la infección por virus de la influenza en un animal u organismo objetivo que comprende administrar una dosis efectiva de una vacuna que comprende una o más de una VLP. La vacuna puede administrarse en forma oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea.
La administración de las VLP producidas de acuerdo con la presente invención se describe en el Ejemplo 6. La administración de una VLP de H5 elaborada en la planta resulta en una respuesta significativamente más elevada cuando se compara con la administración de HA soluble (véanse las Figuras 21A y 21B).
Como se muestra en las Figuras 26A y 26B, las VLP de H5 A/Indonesia/5/05 administradas a un sujeto le proporcionaron protección cruzada a un reto con influenza A/Turquía/582/06 (H5N1; “H5N1 de Turquía"). La administración de las VLP H5 de Indonesia antes del reto no resultó en ninguna pérdida de la masa corporal. Sin embargo, los sujetos a los cuales no se les administró las VLP de H5, pero se los retó con H5N1 de Turquía, exhibieron una pérdida significativa de masa corporal, y varios sujetos murieron.
Estos datos, por lo tanto, demuestran que las VLP de influenza elaboradas en la planta que comprenden la proteína viral de hemaglutinina H5 inducen una respuesta inmune especifica para cepas de influenza patógenas, y que las partículas similares a virus pueden brotar desde una membrana plasmática de la planta.
Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición que comprende una dosis efectiva de una VLP producida de acuerdo con la invención que comprende una proteína HA del virus de la influenza, uno o más de un lípido de la planta, y un portador farmacéuticamente aceptable. La proteína HA del virus de la influenza puede ser H5 Indonesia/5/2006. También se proporciona una VLP o composición para uso en la inducción de inmunidad a una infección por virus de la influenza en un sujeto. El uso comprende administrar la partícula similar al virus que comprende una proteína HA del virus de la influenza, uno o más de un lípido de la planta, y un portador farmacéuticamente aceptable. La partícula similar al virus puede administrarse a un sujeto en forma oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea.
Las composiciones de acuerdo con varias formas de realización de la invención pueden comprender las VLP de dos o más cepas o subtipos de influenza. “Dos o más” se refiere a dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10 o más cepas o subtipos. Las cepas o subtipos representados pueden ser un solo subtipo (por ejemplo, todos H1N1, o todos H5N1), o pueden ser una combinación de subtipos. Los ejemplos de subtipos y de cepas incluyen, aunque no se limitan a aquellos divulgados en la presente invención (por ejemplo, A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/pollo/Nueva York/1995, A/gaviota argéntea/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/ánade real/MN/33/00, A/pato/Shanghái/1/2000, A/ánade de cola larga/TX/828189/02, A/Pavo/Ontario/ 6118/68(HBN4), A/pato cuchareta/Irán/G54/03, A/pollo/Alemania/N/1949 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56 (H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5), A/Gaviota/Maryland/704/77 (H13N6), A/Ánade/Gurjev/263/82, A/pato/Australia/341/83 (H15N8), A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburgo/66, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1), A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/ 67/2005 (H3N2), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapur/1/57 (H2N2) , A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)).
La elección de la combinación de cepas y subtipos puede depender del área geográfica de los sujetos que pueden estar expuestos a influenza, la proximidad de especies animales a una población humana que va a ser inmunizada (por ejemplo, especies de aves acuáticas, animales de granja tales como cerdos, etc.) y las cepas que portan, están expuestos, o pueden estar expuestos, a predicciones de deriva antigénica dentro de subtipos o cepas, o combinaciones de estos factores. Ejemplos de combinaciones utilizadas en años anteriores están disponibles (véase URL: who.int/csr/dieease/influenza/vaccine recommendationsl/en). Algunas o todas estas cepas pueden emplearse en las combinaciones mostradas, o en otras combinaciones, en la producción de una composición de vacuna.
Más particularmente, los ejemplos de combinaciones pueden incluir las VLP de dos o más cepas o subtipos seleccionados del grupo que comprende: A/Brisbane/59/2007 (H1N1), un virus similar a A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), un virus similar a A/Brisbane/10/2007 (H3N2), B/Florida/4/2006, un virus similar a B/Florida/4/2006.
Otro ejemplo de combinación puede incluir las VLP de dos o más cepas o subtipos seleccionados del grupo que comprende A/Indonesia/5/2005, un virus similar a A/Indonesia/5/2005, A/Vietnam/1194/2004, un virus similar a A/Vietnam/1194/2004, A/Anhui/1/05, un virus similar a A/Anhui/1/05, A/ganso/Guiyang/337/2006, un virus similar a A/ganso/Guiyang/337/2006, A/pollo/Shanxi/2/2006, o un virus similar a A/pollo/Shanxi/2/2006.
Otro ejemplo de combinación puede incluir las VLP de cepas de influenza A/Pollo/Italia/13474/99 (tipo H7) o A/Pollo/Columbia Británica/04 (H7N3).
Otro ejemplo de combinación puede incluir las VLP de A/Pollo/Hong Kong/G9/97 o A/Hong Kong/1073/99. Otro ejemplo de combinación puede comprender las VLP de A/Islas Salomón/3/2006. Otro ejemplo de combinación puede comprender las VLP de A/Brisbane/10/2007. Otro ejemplo de combinación puede comprender las VLP de A/Wisconsin/67/2005. Otro ejemplo de combinación puede comprender las VLP de las cepas o subtipos
5 B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006 o B/Brisbane/3/2007.
Las dos o más VLP pueden expresarse individualmente, y las VLP purificadas o semipurificadas combinarse posteriormente. Alternativamente, las VLP pueden coexpresarse en el mismo huésped, por ejemplo, una planta. Las VLP pueden combinarse o producirse en una relación deseada, por ejemplo, aproximadamente proporciones equivalentes, o pueden combinarse de tal manera que un subtipo o cepa comprenda la mayoría de las VLP en la
10 composición.
Por lo tanto, la invención proporciona composiciones que comprenden las VLP de dos o más cepas o subtipos, producidas de acuerdo con los métodos de la invención.
Las VLP de los virus encapsulados generalmente adquieren su envoltura a partir de la membrana de la cual ellas brotan. Las membranas plasmáticas de la planta tienen un complemento de fitoesterol que puede tener efectos 15 inmunoestimuladores. Para investigar esta posibilidad, se administraron las VLP de H5 elaboradas en la planta a animales en presencia o ausencia de un adyuvante, y la HAI (respuesta de anticuerpo de inhibición de hemaglutinación) determinada (Figuras 22A, 22B). En la ausencia de un adyuvante añadido, las VLP de H5 elaboradas en la planta demuestran una HAI significativa, indicativa de una respuesta inmune sistémica para administración del antígeno. Además, los perfiles de isotipo del anticuerpo de las VLP administradas en presencia o
20 en ausencia del adyuvante, son similares (Figura 23A).
La Tabla 5 enlista las secuencias proporcionadas en varias formas de realización de la invención.
Tabla 5 : Descripción de las secuencia para los identificadores de secuencia.
SEQ ID No
Descripción de la secuencia Se divulga en
1
Fragmento H1 del terminal N Figura 5a
2
Fragmento H1 del terminal C Figura 5b
3
Secuencia de codificación de H5 Figura 6
4
cebador Plato-443c Figura 7a
5
cebador SpHA(Ind)-Plasto.r Figura 7b
6
cebador Plasto-SpHA(Ind).c Figura 7c
7
cebador HA(Ind)-Sac.r Figura 7d
8
Secuencia del casete de expresión con base en plastocianina de alfalfa usada para la expresión e H1 Figura 1
9
Secuencia del péptido HA1 (A/New Caledonia/20/99) Figura 8a
10
Secuencia del péptido HA5 (A/Indonesia/5/2006) Figura 8b
11
Secuencia que codifica el subtipo H7 de influenza A (A/pollo/New York/1995) Figura 9
12
Secuencia que codifica el subtipo H2 de influenza A (A/gaviota argéntea/DE/677/88 (H2N8)) Figura 10a
13
Secuencia que codifica el subtipo H3 de influenza A (A/Texas/32/2003) Figura 10b
14
Secuencia que codifica el subtipo H4 de influenza A (A/pato real/MN/33/00) Figura 10c
15
Secuencia que codifica el subtipo H5 de influenza A (A/pato/Shanghái/1/2000) Figura 10d
16
Secuencia que codifica el subtipo H6 de influenza A (A/ánade de cola larga/TX/828189/02) Figura 10e
17
Secuencia que codifica el subtipo H8 de influenza A (A/Pavo/Ontario/6118/68(H8N4)) Figura 10f
18
Secuencia que codifica el subtipo H9 de influenza A (A/pato cuchareta/Irán/G54/03) Figura 10g
19
Secuencia que codifica el subtipo H10 de influenza A (A/pollo/Alemania/N/1949(H10N 7)) Figura 10h
20
Secuencia que codifica el subtipo H11 de influenza A (A/pato/Inglaterra/56(H11N6)) Figura 10i
21
Secuencia que codifica el subtipo H12 de influenza A (A/pato/Alberta/60/76(H12N5)) Figura 10j
22
Secuencia que codifica el subtipo H13 de influenza A (A/Gaviota/Maryland/704/77(H13N6)) Figura 10k
23
Secuencia que codifica el subtipo H14 de influenza A (A/Pato real/Gurjev/263/82) Figura 10I
24
Secuencia que codifica el subtipo H15 de influenza A (A/pato/Australia/341/83 (H15N8)) Figura 10m
25
Secuencia que codifica el subtipo H16 de influenza A (A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3)) Figura 10n
26
Secuencia que codifica HA de influenza B (B/Lee/40) Figura 10o
27
Secuencia que codifica HA de influenza C (C/Johannesburgo/66) Figura 10p
28
Secuencia de HAO H1 completa Figura 5c
29
Cebador XmaI-pPlas.c Figura 10q
(continuación) (continuación)
SEQ ID No
Descripción de la secuencia Se divulga en
30
Cebador SacI-ATG-pPlas.r Figura 10r
31
Cebador SacI-PlasTer.c Figura 10s
32
Cebador EcoRI-PlasTer.r Figura 10t
33
A/New Caledonia/20/99 (H1N1), GenBank Acceso No. AY289929 Figura 16
34
Proteína disulfuro isomerasa de M. Sativa, GenBank Acceso No. Z11499 Figura 17
35
A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), GenBank Acceso No. NC_002016.1 Figura 18
36
Clon 774: ADN de DraIII a Sac1 que comprende la región reguladora de plastocianina operativamente enlazada con la secuencia que codifica HA de A/Brisbane/59/2007 (H1N1) Figura 28
37
Clon 775: ADN de DraIII a Sac1 que comprende la región reguladora de plastocianina operativamente enlazada con la secuencia que codifica HA de A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1) Figura 29
38
Clon 776: ADN de DraIII a Sac1 que comprende la región reguladora de plastocianina operativamente enlazada con la secuencia que codifica HA de A/Brisbane 10/2007 (H3N2) Figura 30
39
Clon 777: ADN de DraIII a Sac1 que comprende la región reguladora de plastocianina operativamente enlazada con la secuencia que codifica HA de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) Figura 31
40
Clon 778: ADN de DraIII a Sac1 que comprende la región reguladora de plastocianina operativamente enlazada con la secuencia que codifica HA de B/Malasia/2506/2004 Figura 32
41
Clon 779: ADN de DraIII a Sac1 que comprende la región reguladora de plastocianina operativamente enlazada con la secuencia que codifica HA de B/Florida/4/2006 Figura 33
42
Clon 780: ADN de DraIII a Sac1 que comprende la región reguladora de plastocianina operativamente enlazada con la secuencia que codifica HA de A/Singapur/1/57 (H2N2) Figura 34
43
Clon 781: ADN de DraIII a Sac1 que comprende la región reguladora de plastocianina operativamente enlazada con la secuencia que codifica HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) Figura 35
44
Clon 782: ADN de DraIII a Sac1 que comprende la región reguladora de plastocianina operativamente enlazada con la secuencia que codifica HA de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) Figura 36
45
Clon 783: ADN de DraIII a Sac1 que comprende la región reguladora de plastocianina operativamente enlazada con la secuencia que codifica HA de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) Figura 37
46
Clon 784: ADN de DraIII a Sac1 que comprende la región reguladora de plastocianina operativamente enlazada con la secuencia que codifica HA de A/Equino/Praga/56 (H7N7) Figura 38
47
Clon 785: ADN de DraIII a Sac1 que comprende la región reguladora de plastocianina operativamente enlazada con la secuencia que codifica HA de A/HongKong/1073/99 (H9N2) Figura 39
48
Clone 774 secuencia de aminoácidos de HA de A/Brisbane/59/2007 (H1N1) Figura 40A
49
Clone 775 secuencia de aminoácidos de HA de A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1) Figura 40B
50
Clone 776 secuencia de aminoácidos de HA de A/Brisbane 10/2007 (H3N2) Figura 41A
51
Clone 777 secuencia de aminoácidos de HA de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) Figura 41B
52
Clone 778 secuencia de aminoácidos de HA de B/Malasia/2506/2004 Figura 42A
53
Clone 779 secuencia de aminoácidos de HA de B/Florida/4/2006 Figura 42B
54
Clone 780 secuencia de aminoácidos de HA de A/Singapur/1/57 (H2N2) Figura 43A
55
Clone 781 secuencia de aminoácidos de HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) Figura 43B
56
Clone 782 secuencia de aminoácidos de HA de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) Figura 44A
57
Clone 783 secuencia de aminoácidos de HA de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) Figura 44B
58
Clone 784 secuencia de aminoácidos de HA de A/Equino/Praga/56 (H7N7) Figura 45A
59
Clone 785 secuencia de aminoácidos de HA de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) Figura 45B
60
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de H5 de A/Indonesia/5/2005 (Construcción # 660), secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 51
61
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de H1 de A/New Caledonia/20/1999 (Construcción # 540) , secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 52
62
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de H1 de A/Brisbane/59/2007 (construcción # 774), secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 53
63
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de H1 de A/Islas Salomón /3/2006 (H1N1) (construcción # 775), secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 54
SEQ ID No
Descripción de la secuencia Se divulga en
64
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de H2 de A/Singapur/1/57 (H2N2) (construcción # 780), secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 55
65
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de H5 de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (Construcción # 781), secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 56
66
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de H5 de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) (Construcción # 782), secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 57
67
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de H6 de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (Construcción # 783), secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 58
68
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de H9 de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (Construcción # 785), secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 59
69
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de H3 de A/Brisbane/10/2007 (H3N2), secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 60
70
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de H3 de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 61
71
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de H7 de A/Equino/Praga/56 (H7N7), secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 62
72
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de HA de B/Malasia/2506/2004, secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 63 profética
73
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, la secuencia que codifica hemaglutinina de HA de B/Florida/4/2006, secuencias terminadora y 3’ URT de plastocianina de alfalfa Figura 64
74
Consenso de las SEQ ID NOs: 49, 48, 33 y 9 Figura 65
75
Secuencia de aminoácidos de H1 de New Caledonia (AAP34324.1) codificada por la SEQ ID NO: 33 Figura 67
76
Secuencia de aminoácidos de H1 de Puerto Rico (NC_0409878.1) codificada por la SEQ ID NO: 35 Figuras 68
Ahora, se describirá la invención en forma detallada a modo de referencia únicamente con los siguientes ejemplos 5 no limitantes.
Métodos y Materiales
1. Ensamblaje de casetes de expresión
Todas las manipulaciones se hicieron utilizando los protocolos generales de biología molecular de Sambrook y Russell (2001). La primera etapa de clonación consistió en ensamblar un plásmido receptor que contiene elementos 10 reguladores en dirección 5' y en dirección 3' del gen de plastocianina de alfalfa. Se amplificaron el promotor de plastocianina y de las secuencias 5’ UTR a partir del ADN genómico de alfalfa utilizando los cebadores de oligonucleótidos Xmal-pPlas.c (SEQ ID NO: 29; Figura 10Q) y Sacl-ATG-pPlas.r (SEQ ID NO: 30; Figura 10R). El producto resultante de la amplificación se digirió con XmaI y SacI y se ligó en pCAMBIA2300 (Cambia, Canberra, Australia), previamente digerido con las mismas enzimas, para crear pCAMBIApromo Plasto. De manera similar, las
15 secuencias UTR 3' y del terminador del gen de plastocianina se amplificaron a partir de ADN genómico de alfalfa utilizando los siguientes cebadores: Sacl-PlasTer.c (SEQ ID NO: 31; Figura 10S) y EcoRI-PlasTer.r (SEQ ID NO: 32; Figura 10T), y se digirió el producto con SacI y EcoRI antes de ser insertado en los mismos sitios de pCAMBIApromo-Plasto para crear pCAMBIAPlasto.
Se sintetizó el marco de lectura abierto del gen H1 de la cepa de influenza A/Nueva Caledonia/20/99 (HlN1) en dos
20 fragmentos (Plant Biotechnology Institute, National Research Council, Saskatoon, Canadá). Un primer fragmento sintetizado corresponde a la secuencia de codificación de H1 de tipo silvestre (No. de acceso del GenBank AY289929; SEQ ID NO: 33; Figura 16) que carece del péptido señal en el extremo 5' y la secuencia de codificación del dominio transmembrana en el extremo 3'. Se añadió un sitio de restricción BglII en el extremo 5' de la secuencia de codificación y se añadió un sitio doble SacI/StuI inmediatamente en dirección 3’ del codón de finalización en el extremo terminal 3' del fragmento, para producir la SEQ ID NO: 1 (Figura 5A). También se sintetizó un segundo fragmento que codifica el extremo terminal C de la proteína H1 (que comprende un dominio transmembrana y una cola citoplasmática) desde el sitio KpnI hasta el codón de detención, y se flanqueado en 3' por los sitios de restricción SacI y StuI (SEQ ID NO. 2; Figura 5B).
El primer fragmento H1 se digirió con BglII y SacI y se clonó en los mismos sitios de un vector binario (pCAMBIAPlasto) que contiene el promotor de plastocianina y se fusionó 5’ UTR con el péptido señal del gen de la proteína disulfuro isomerasa de alfalfa (PDI) (nucleótidos 32 - 103; Acceso No. Z11499; SEQ ID NO: 34; Figura 17) lo que resultó en un gen quimérico PDI-H1 en dirección 3’ de los elementos reguladores de plastocianina. La secuencia del casete con base en plastocianina que contiene el péptido señal PDI se presentan en la Figura 1 (SEQ ID NO: 8). El plásmido resultante contenía una región de codificación H1 fusionada con el péptido señal PDI y flanqueado por elementos reguladores de plastocianina. La adición de la región de codificación del extremo terminal C (que codifica el dominio transmembrana y la cola citoplasmática) se obtuvo al insertar el fragmento sintetizado (SEQ ID NO: 2; Figura 5B) previamente digerido con KpnI y SacI, en el plásmido de expresión H1. El plásmido resultante, denominado 540, se presenta en la Figura 11 (véase también la Figura 2A).
2. Ensamblaje del casete de expresión H5
Se sintetizó un fragmento que codifica hemaglutinina a partir de la cepa de influenza A/Indonesia/5/05 (H5N1; No. de Acceso LANL ISDN125873) mediante Epoch Biolabs (Sugar Land, TX, EUA). El fragmento producido, que contenía la región de codificación H5 completa incluyendo el péptido señal nativo flanqueado por un sitio HindIII inmediatamente en dirección 5' del ATG inicial, y un sito Sacl inmediatamente en dirección 3' del codón de detención (TAA), se presenta en la SEQ ID NO: 3 (Figura 6). Se clonó la región de codificación H5 en un casete de expresión con base en plastocianina a través del método de ligación con base en PCR presentado en Darveau et al. (1995). En resumen, se obtuvo una primera amplificación por PCR utilizando los cebadores Plato-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) y SpHA(Ind)-Plasto.r (SEQ ID NO: 5; Figura 7B) y pCAMBIApromoPlasto como plantilla. De manera paralela, se llevó a cabo una segunda amplificación con los cebadores Plasto-SpHA(Ind).c (SEQ ID NO: 6; Figura 7C) y HA(Ind)Sac.r (SEQ ID NO: 7; Figura 7D) con el fragmento de codificación H5 como plantilla. La amplificación obtenida de ambas reacciones se mezcló y esta mezcla sirvió como plantilla para una tercera reacción (reacción de ensamblaje) utilizando Plato-443c (SEQ ID No: 4; Figura 7A) y HA(Ind)-Sac.r (SEQ ID NO: 7; Figura 7D) como cebadores. Se digirió el fragmento resultante con BamHI (en el promotor de plastocianina) y SacI (en el extremo 3’ del fragmento) y se clonó en pCAMBIAPlasto previamente digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante, denominado 660, se presenta en la figura 2B (véase también la Figura 11).
El casete que codifica la forma soluble de H1 se preparó reemplazando la región de codificación por el dominio transmembrana y la cola citoplasmática en 540 a través de un fragmento que codifica la variante GCN4 pII de cierre de leucina (Harbury et al., 1993, Science 1993; 262: 1401 - 1407). Este fragmento se sintetizó con los sitios de flanqueo KpnI y SacI para facilitar la clonación. El plásmido resultante de este reemplazo se denominó 544 y el casete de expresión se ilustra en la figura 11.
Se sintetizó una fusión entre 5’ UTR del virus del grabado del tabaco (TEV) y el marco de lectura abierto del gen M1 de la influenza A/PR/8/34 (Acceso # NC_002016) con un sitio SacI de flanqueo añadido en dirección 3’ del codón de detención. El fragmento se digirió con SwaI (en el 5’ UTR del TEV) y SacI, y se clonó en un casete de expresión con base en 2X35S/TEV en un plásmido binario pCAMBIA. El plásmido resultante perforó la región de codificación M1 bajo el control de un promotor 2X35S/TEV y 5’ UTR y el terminador NOS (construcción 750; figura 11).
Se preparó una construcción HcPro (35HcPro) como se describe en Hamilton et al. (2002). Todos los clones se secuenciaron para confirmar la integridad de las construcciones. Se utilizaron los plásmidos para transformar Agrobacterium tumefaciens (AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, EUA) mediante electroporación (Mattanovich et al., 1989). Se confirmó la integridad de todas las cepas de A. tumefaciens a través de mapeo de restricción.
3. Preparación de biomasa vegetal, inóculos, agroinfiltración, y cosecha
Se cultivaron plantas de Nicotiana benthamiana o Nicotiana tabacum a partir de semillas en pisos llenos de un sustrato de musgo con turba comercial. Se permitió que las plantas crecieran en el invernadero con un fotoperiodo de 16/8 y un régimen de temperatura de 25°C durante el día/20°C durante la noche. Tres semanas después de sembrar las semillas, se seleccionaron plántulas individuales, se trasplantaron en macetas y se permitió que crecieran en el invernadero durante tres semanas adicionales bajo las mismas condiciones ambientales. Antes de la transformación, se removieron brotes apicales y axilares en diferentes momentos como se indica a continuación, ya sea pinchando los brotes de la planta o a través de un tratamiento químico de la planta.
Se cultivaron las agrobacterias transfectadas con las construcciones 660, 540, 544, 750 o 35sHcPro en un medio YEB complementado con ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico (MES) 10 mM, acetosiringona 20 μM, 50 μg/ml de kanamicina y 25 μg/ml de carbenicilina pH 5,6 hasta que alcanzaron un OD600, entre 0,6 y 1,6. Se centrifugaron las suspensiones de agrobacterias antes de usarlas y se resuspendieron en un medio de infiltración (MgC2 10 mM y MES 10 mM pH 5,6). Se realizó la infiltración mediante jeringa como lo describen Liu y Lomonossoff (2002, Journal of Virological Methods, 105: 343 - 348). Para la infiltración al vacío, se centrifugaron suspensiones de A. tumefaciens, se resuspendieron en el medio de infiltración y se almacenaron durante la noche a 4°C. El día de la infiltración, se diluyeron los lotes de cultivo en 2,5 volúmenes de cultivo y se permitió que se calentaran antes de utilizarse. Plantas completas de N. benthamiana o N. tabacum se colocaron bocabajo en la suspensión bacteriana en un tanque de acero inoxidable cerrado herméticamente con un vacío de 20 - 40 Torr durante 2 minutos. Después de la infiltración por jeringa o al vacío, las plantas regresaron al invernadero durante un periodo de incubación de 4 5 días hasta la cosecha.
4.
Muestreo de hojas y extracción de proteínas totales
Después de la incubación, se cosechó la parte aérea de las plantas, se congeló a -80°C, y se trituró. Se extrajeron las proteínas solubles totales mediante homogenización (Politrón) de cada muestra de material de la planta congelada y triturada en tres volúmenes de Tris 50 mM frio pH 7,4, NaCl 0,15 M, y fluoruro de fenil metanosulfonilo 1 mM. Después de la homogenización, se centrifugaron las suspensiones a 20.000 g durante 20 minutos a 4°C y estos extractos sin purificar depurados (sobrenadantes) se conservaron para análisis. El contenido de proteína total de los extractos sin purificar depurados se determinó mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando albúmina de suero bovino como estándar de referencia.
5.
Cromatografía de exclusión por tamaño del extracto de proteína
Las columnas para cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de 32 ml de perlas de alta resolución S-500 SephacrylTM (S-500 HR: GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. 17-06l3-10) se empacaron y equilibraron con un amortiguador de equilibrio/elución (Tris 50 mM pH8, NaCl 150 mM). Se cargaron uno y medio mililitros de extracto de proteína sin purificar en la columna seguido por una etapa de elución con 45 mL del amortiguador de equilibrio/elución. Se recolectó la elución en fracciones de 1,5 mL en relación con el contenido de proteína de las fracciones eluídas y se monitoreó mediante la mezcla de 10 μL de la fracción con 200 μL del reactivo de coloración de proteínas diluido Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Se lavó la columna con 2 volúmenes de columna de NaOH 0,2 N seguido por 10 volúmenes de columna de Tris 50 mM de pH 8, NaCl 150 mM, etanol al 20%. Cada separación estuvo seguida por la calibración de la columna con Azul Dextrano 2000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, EUA). Los perfiles de elución de Azul Dextrano 2000 y las proteínas solubles huésped se compararon entre cada separación para asegurar la uniformidad de los perfiles de elución entre las columnas utilizadas.
6.
Análisis de Proteínas e Inmunotransferencia
Se determinaron las concentraciones de proteína mediante el ensayo de proteínas BCA (Pierce Biochemicals, Rockport, IL). Se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y se tiñeron con Azul de Coomassie. Los geles teñidos se escanearon y se realizó el análisis de densitometría utilizando el software ImageJ (NIH).
Se precipitaron las proteínas de la fracción de elución de SEC con acetona (Bollag et al., 1996), se resuspendieron en un 1/5 del volumen en el amortiguador de equilibrio/elusión y se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y se electrotransfirieron sobre membranas de difluoruro de polivinileno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, IN) para inmunodetección. Antes de la inmunotransferencia, se bloquearon las membranas con leche descremada al 5% y Tween-20 al 0,1% en solución salina amortiguada con Tris (TBS-T) durante 16 - 18 horas a 4°C.
La inmunotransferencia se realizó mediante incubación con un anticuerpo adecuado (Tabla 6), en 2 μg/ml de leche descremada al 2% en TBS-Tween 20 al 0,1%. Los anticuerpos secundarios utilizados para la detección de quimioluminiscencia fueron como se indica en la Tabla 4, se diluyeron como se indica en leche descremada al 2% en TES-Tween 20 al 0,1%. Se detectaron los complejos inmunorreactivos mediante quimioluminiscencia utilizando luminol como sustrato (Roche Diagnostics Corporation). Se llevó a cabo la conjugación de enzima de peroxidasa de rábano del anticuerpo IgG humano utilizando el kit de conjugación de Peroxidasa Activada EZ-Link Plus® (Pierce, Rockford, IL).
Tabla 6: Condiciones de electroforesis, anticuerpos, y diluciones para inmunotransferencia de las proteínas expresadas.
Subtipo de HA
Cepa de influenza Condición de la electroforesis Anticuerpo primario Dilución Anticuerpo secundario Dilución
H1
A/Brisbane/ 59/2007 (H1N1) Reductora FII 10-I50 4 μg/ml Antirratón de cabra (JIR 115-035-146) 1:10 000
H1
A/Islas Salomón/ 3/ 2006 (H1N1) Reductora NIBSC 07/104 1:2000 Anti-oveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
H1
A/Nueva Caledonia/ 20/99 (H1N1) Reductora FII 10-I50 4 μg/ml Antirratón de cabra (JIR 115-035-146) 1:10 000
H2
A/Singapur/ 1/57 (H2N2) No reductora NIBSC 00/440 1:1000 Anti-oveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
H5
A/Indonesia/ 5/2005 (H5N1) Reductora ITC IT- 003-005V 1:4000 Anticonejo de cabra (JIR 111-035-144) 1:10 000
H5
A/Anhui/1/2005 (H5N1) Reductora NIBSC 07/338 1:750 Anti-oveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
H5
A/Vietnam/ 1194/ 2004 (H5N1) No reductora ITC IT- 003-005 1:2000 Anticonejo de cabra (JIR 111-035-144) 1:10 000
H6
A/Cerceta/Hong Kong/ W312/97 (H6N1) No reductora BEI NR 663 1:500 Anti-oveja de conejoD (JIR 313-035-045) 1:10 000
H9
A/Hong Kong/ 1073/99 (H9N2) Reductora NIBSC 07/146 1:1000 Anti-oveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
FII: Fitzgerald Industries International, Concord, MA, EUA; NISBIC: National Institute for Biological Standards and Control; JIR: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA; BEI NR: Biodefense and emerging infections research resources repository; ITC: Immune Technology Corporation, Woodside, NY, EUA;
El ensayo de hemaglutinación para H5 se basó en un método descrito por Nayak y Reichl (2004). En resumen, se hicieron diluciones dobles seriales de las muestras de prueba (100 μL) en placas de microtitulación de 96 pozos con fondo en forma V que contenían 100 μL de PBS, dejando 100 μL de la muestra diluida por pozo. Se añadieron cien microlitros de una suspensión de glóbulos rojos de pavo al 0,25% (Bio Link Inc., Syracuse, NY) a cada pozo, y se incubaron las placas durante 2 horas a temperatura ambiente. Se registró la cantidad recíproca de la dilución más elevada que muestra hemaglutinación completa como la actividad de HA. De manera paralela, se diluyó un estándar de HA recombinante (A/Vietnam/1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT) en PBS y se corrió como control en cada placa.
7.
Ultracentrifugación en gradiente de sacarosa
Se reunión un mililitro de las fracciones 9, 10 y 11 eluido a partir de la cromatografía de filtración en geles sobre biomasa que contenía H5, se cargó en un gradiente de densidad de sacarosa discontinua de 20 - 60% (p/v) y se centrifugó durante 17,5 horas a 125.000 g (4°C). Se fraccionó el gradiente en 19 fracciones de 3 mL comenzando desde la parte superior y se dializaron para remover la sacarosa antes del análisis inmunológico y los ensayos de hemaglutinación.
8.
Microscopía electrónica
Las fracciones de elución de SEC para ser observadas mediante microscopía electrónica (EM) se concentraron primero utilizando unidades de ultrafiltración 30 MWCO (Millipore, Billerica, MA, EUA). Las fracciones concentradas se fijaron en PBS de pH 7,4 que contenían glutaraldehído al 2% durante 24 horas a 4°C. Una vez fijadas las muestras, se adsorbieron en retículas de níquel de 200 mallas recubiertas con Formvar (Canemco, Lakefield, Canadá) durante 2 minutos, y las se lavaron las retículas dos veces con agua desionizada antes de teñirlas con ácido fosfotúngstico al 1%. Se realizaron observaciones bajo microscopía electrónica de transmisión con amplificaciones que iban de 10.000X a 150.000X (para las imágenes en las Figuras 4A y 4B).
Alternativamente, se colocaron cien microlitros de las muestras a examinar en un tubo de ultracentrifugación Airfuge (Beckman Instruments, Palo Alto, CA, EUA). Se colocó una retícula en la parte inferior del tubo, que luego se centrifugó durante 5 minutos a 120.000 g. Se removió la retícula, se la secó cuidadosamente y colocó en una gota de ácido fosfotúngstico al 3% con un pH de 6 para coloración. Se examinaron las retículas en un microscopio electrónico de transmisión (TEM) Hitachi 7100 (para las imágenes en las Figuras 14B, 15B y 15C).
Para las imágenes en la Figura 19, se fijaron bloques de hojas de aproximadamente 1 mm3 en PBS que contenía glutaraldehído al 2,5% y se lavaron en PBS que contenía sacarosa al 3% antes de la etapa posterior de fijación en tetraóxido de osmio al 1,33%. Las muestras fijadas se embebieron en resina Spurr y se colocaron capas ultradelgadas en una retícula. Las muestras fijadas se tiñeron de forma positiva con acetato de uranilo al 5% y citrato de plomo al 0,2% antes de la observación. Las retículas se analizaron en un microscopio de electrones de transmisión (TEM) Hitachi 7100.
9. Análisis de lípidos de membranas plasmáticas
Se obtuvieron las membranas plasmáticas (PM) de hojas de tabaco y se cultivaron células BY2 después del fraccionamiento celular de acuerdo con Mongrand et al. mediante la repartición en un sistema bifásico de polímeros acuosos con polietilenglicol 3350/dextrano T-500 (cada uno al 6,6%). Todas las etapas se realizaron a 4°C.
Se extrajeron y purificaron los lípidos a partir de las diferentes fracciones de acuerdo con Bligh y Dyer. Se separaron los lípidos polares y neutros mediante HP-TLC monodimensional utilizando los sistemas de solventes descritos en Lefebvre et al. Se detectaron los lípidos de fracciones de PM después de teñir con acetato de cobre, como lo describen Macala et al. Se identificaron los lípidos mediante la comparación de su tiempo de migración con los de los estándares (todos los estándares se obtuvieron a través de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA, excepto por SG que se obtuvo a través de Matreya, Pleasant Gap, PA, EUA).
10.
Purificación de VLP de H5
Se homogeneizaron 660 hojas infiltradas congeladas de N. benthamiana en 1,5 volúmenes de Tris 50 mM pH 8, NaCl 150 mM y metabisulfito de sodio al 0,04% utilizando un mezclador comercial. Se suplementó el extracto resultante con PMSF 1 mM y se ajustó a pH 6 con ácido acético 1 M antes de calentar a 42°C durante 5 minutos. Se añadió tierra de diatomeas (DE) al extracto trato con calor para adsorber los contaminantes precipitados por medio del cambio del pH y tratamiento con calor, y se filtró la suspensión a través de un papel filtro Whatman. Se centrifugó el extracto clarificado resultante a 10.000 x g durante 10 minutos a RT para remover la DE residual, pasado a través de filtros Acropack 20 de 0,8/0,2 μm y cargó en una columna de afinidad de fetuína-agarosa (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Después de una etapa de lavado en NaCl 400 mM, Tris 25 mM pH 6, se eluyeron las proteínas enlazadas con NaCl 1,5 M, MES 50 mM pH 6. Se suplementaron las VLP eluidas con Tween-80 hasta una concentración final de 0,0005% (v/v). Se concentraron las VLP en una membrana Amicon MWCO de 100 kDa se centrifugó a 10.000 x g durante 30 minutos a 4°C y se resuspendió en PBS pH 7,4 con Tween-80 al 0,01% y timerosal al 0,01%. Se esterilizaron las VLP suspendidas por filtración antes de su utilización.
11.
Estudios con animales
Ratones
Los estudios sobre la respuesta inmunológica a la administración de VLP de influenza se llevaron a cabo con ratones hembra BALB/c de 6 - 8 semanas de edad (Charles River Laboratories). Se dividieron al azar setenta ratones en catorce grupos de cinco animales. Se utilizaron ocho grupos para inmunización intramuscular y se utilizaron seis grupos para probar la vía intranasal de administración. Todos los grupos se inmunizaron con un régimen de dos dosis, la inmunización de refuerzo se realizó 3 semanas después de la primera inmunización.
Para la administración intramuscular en las patas traseras, se inmunizaron los ratones sin anestesiar ya sea con la vacuna VLP H5 elaborada a partir de plantas (0,1, 1, 5 o 12 μg), o un antígeno de hemaglutinina (HA) de control. El Ha de control contenía hemaglutinina soluble recombinante producida con base en la cepa A/Indonesia/5/05 H5N1 y se purificó a partir de un cultivo de células 293 (Immune Technology Corp., New York, EUA) (utilizado 5 μg por inyección a menos que se indique otra cosa). El amortiguador de control era PES. Este antígeno consiste de los aminoácidos 18 - 530 de la proteína HA y tiene una etiqueta His y un sitio de escisión modificado. La microscopía electrónica confirmó que este producto comercial no está en la forma de las VLP.
Para medir el efecto del adyuvante, se inmunizaron dos grupos de animales con 5 μg de la vacuna con VLP H5 elaborada a base de plantas más un volumen de Alhidrogel al 2% (alumbre, Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY, EUA) o con 5 μg de hemaglutinina recombinante purificada a partir de un cultivo de células 293 más un volumen de alumbre. Se dividieron al azar setenta ratones en catorce grupos de cinco animales. Se utilizaron ocho grupos para inmunización intramuscular y se utilizaron seis grupos para probar la vía intranasal de administración. Todos los grupos se inmunizaron con un régimen de refuerzo principal, la inmunización de refuerzo se realizó 3 semanas después de la primera inmunización.
Para la administración intramuscular en las patas traseras, se inmunizaron los ratones sin anestesiar con la VLP H5 elaborada a partir de plantas (0,1, 1, 5 ó 12 μg), o el antígeno de hemaglutinina de control (HA) (5 μg) o PBS. Todas las preparaciones de antígenos se mezclaron con Alhidrogel al 1% (alumbre, Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY, EUA) en una proporción de volumen de 1:1 antes de las inmunizaciones. Para medir el
efecto del adyuvante, se inmunizaron dos grupos de animales ya sea con 5 μg de la vacuna con VLP H5 elaborada a partir de plantas o con 5 μg del antígeno HA de control sin ningún adyuvante.
Para administración intranasal, se anestesiaron brevemente los ratones por medio de inhalación de isoflurano utilizando una cámara de inducción automática. Posteriormente, fueron inmunizaron con la adición de gotas de 4 μl /fosa nasal con la vacuna de VLP elaborada a partir de plantas (0,1 o 1 μg), o con el antígeno HA de control (1 μg) o con PBS. Todas las preparaciones de antígeno se mezclaron con glutamato de quitosano al 1% (Protosan, Novamatrix/ FMC BioPolymer, Noruega) antes de las inmunizaciones. Posteriormente, los ratones inhalaron las soluciones. Para verificar el efecto del adyuvante con la vía intranasal de administración, se inmunizaron dos grupos de animales con un 1 μg de la vacuna con VLP H5 elaborada a partir de plantas o con 1 μg del antígeno HA de control.
Hurones
Se utilizaron diez grupos de 5 hurones (machos, 18 - 24 semanas de edad, con una masa aproximada de 1 kg). El tratamiento para cada grupo es como se describe en la Tabla 7. El adyuvante utilizado fue Alhidrogel (alumbre) (Superfos Biosector, Dinamarca) al 2% (final = 1%). La composición de la vacuna consistió de las VLP de A/Indonesia/5/05 (H5N1) asociadas con la membrana, producida como se describió. El control de la vacuna (control positivo) fue una H5 recombinante enlazada a la membrana completamente glicosilada de la cepa de Indonesia producida utilizando adenovirus en un cultivo de células 293 por parte de Immune Technology Corporation (ITC).
Tabla 7. Grupos de tratamiento
Grupo
n Producto inyectado a los animales Vía de administración Adyuvante
1
5 PBS (control negativo) i. m.* -
2
5 Vacuna-planta, 1 mg i. m. -
3
5 Vacuna-planta, 1 mg i. m. Alumbre
4
5 Vacuna-planta, 5 mg i. m. -
5
5
Vacuna-planta, 5 mg i. m. Alumbre
6
5 Vacuna-planta, 7,5 mg i. m. -
7
5 Vacuna-planta, 15 mg i. m. -
8
5 Vacuna-planta, 15 mg i. m. Alumbre
9
5 Vacuna-planta, 30 mg i. m. -
10
5 Vacuna-control, 5 mg i. m. -
* i. m.: intramuscular
Se evaluaron hurones con respecto a su salud y apariencia generales (peso corporal, temperatura rectal, postura, pelaje, patrones de movimiento, respiración, excremento) de forma regular durante el estudio. Los animales se inmunizaron mediante una inyección intramuscular (volumen total de 0,5 - 1,0) en los cuadríceps en el día 0, 14 y 28; para los protocolos que incorporan adyuvantes, la composición de la vacuna se combinó con Alhidrogel inmediatamente antes de la inmunización en una proporción de volumen de 1:1). Se obtuvieron muestras del suero en el día 0 antes de la inmunización, y en el día 21 y 35. Se sacrificaron los animales (desangramiento/punción cardiaca) en los días 40 - 45, y se recogieron los bazos y se realizó la necropsia.
Las concentraciones de anticuerpos contra la influenza pueden cuantificarse en ensayos de ELISA utilizando virus H5N1 desactivados homólogos o heterólogos.
Las concentraciones de anticuerpos inhibidores de hemaglutinación de las muestras de suero (antes de la inmunización en el día 21 y el día 35,) se evaluaron a través de microtitulación de HAI como se describe (Aymard et al. 1973). En resumen, se trataron previamente los sueros con enzimas que destruyen los receptores, inactivación con calor y mezcla con una suspensión de eritrocitos (glóbulos rojos lavados, RBC). Se recomiendan los RBC lavados de caballo (10%) de Lampire y en vista de que el ensayo puede variar dependiendo de la fuente de RBC (dependiendo del caballo), se ensayaron los RBC lavados de 10 caballos para seleccionar el lote más sensible. Alternativamente, pueden utilizarse RBC de pavo. La concentración de anticuerpos se expresó como la cantidad recíproca de la dilución más elevada que inhibe completamente la hemaglutinación.
Concentraciones de HAI de reacción cruzada: Se midieron las concentraciones de HAI de hurones inmunizados con una vacuna para A/Indonesia/5/05 (clado 2.1) utilizando cepas de influenza H5N1 inactivadas de otro subclado o clado tal como las cepas vietnamitas del clado 1 A/Vietnam/1203/2004 y A/Vietnam/1194/2004 o A/Anhui/O1/2005 (subclado 2.3) o A/pavo/Turquía/1/05 (subclado 2.2). Todos los análisis se realizaron en muestras de individuos.
Análisis de los datos: El análisis estadístico (ANOVA) se realizará sobre todos los datos para establecer si las diferencias entre los grupos son estadísticamente significativas.
Diseño experimental para reto letal (ratones)
Se dividieron ciento veintiocho ratones al azar en dieciséis grupos de ocho animales, estando un grupo no inmunizado y no retado (control negativo). Todos los grupos se inmunizaron a través de administración intramuscular en un régimen de dos dosis, siendo la segunda inmunización dos semanas después de la primera inmunización.
Para la administración intramuscular en las patas traseras, se inmunizaron los ratones sin anestesiar con VLP H5 elaborada a partir de plantas (1, 5 o 15 μg), o 15 μg del antígeno HA de control o PBS. Todas las preparación de antígeno se mezclaron con un volumen de Alhidrogel al 1% antes de las inmunizaciones (alumbre, Accurate Chemical Scientific Corporation, Westbury, NY, EUA).
Durante el periodo de inmunización, se pesaron los ratones una vez a la semana y se observaron y monitorearon para detectar reacciones locales en el sitio de inyección.
Veintidós días después de la segunda inmunización, se retaron los ratones anestesiados en forma intranasal (i. n.) en un laboratorio de contención BL4 (P4-Jean Mérieux-INSERM, Lyon, Francia) con una dosis infectiva del cultivo de células al 50% de 4.09 x 106 (CCID50) del virus de la influenza A/Turquía/582/06 (amablemente proporcionado por el Dr. Bruno Lina, Universidad de Lyon, Lyon, Francia). Después del reto, se observaron los ratones para detectar síntomas clínicos de enfermedad y se pesaron diariamente, durante un periodo de catorce días. Los ratones con síntomas severos de infección y pérdida de peso de �25% se sometieron a eutanasia después de la anestesia.
Recolección de sangre, lavados pulmonares y nasales y recolección de bazos
Se llevaron a cabo recolecciones de sangre de la vena safena lateral catorce días después de la primera inmunización y catorce días después de la segunda inmunización en los animales sin anestesiar. Se recolectó el suero mediante centrifugación a 8000 g durante 10 minutos.
Cuatro semanas después de la segunda inmunización, se anestesiaron los ratones con CO2 gaseoso e inmediatamente después de terminar, se uso una punción cardiaca para recolectar la sangre.
Después del sangrado final, se insertó un catéter en la tráquea hacia los pulmones y se colocó un ml de una solución tipo cóctel del inhibidor de proteasa - PBS fría en una jeringa de 1 cc unida al catéter y se inyectó a los pulmones y luego se la retiró para su análisis. Este procedimiento de lavado se llevó a cabo dos veces. Los lavados pulmonares se centrifugaron para retirar los restos celulares. Para los lavados nasales, se insertó un catéter hacia el área nasal y se bombearon 0,5 ml de la solución tipo cóctel del inhibidor de proteasa - PBS a través del catéter en los pasajes nasales y luego se hizo la recolección. Los lavados nasales se centrifugaron para retirar los restos celulares. La recolección de bazos se realizó en ratones inmunizados a nivel intramuscular con 5 μg de la vacuna elaborada a base de plantas con adyuvantes o 5 μg del antígeno H5 recombinante con adyuvantes, así como en ratones inmunizados a nivel intranasal con 1 μg de la vacuna elaborada a partir de plantas con adyuvantes o 1 μg del antígeno H5 recombinante con adyuvantes. Los bazos recolectados se colocaron en RPMI suplementado con gentamicina y se machacaron en un tubo cónico de 50 ml con un émbolo de una jeringa de 10 ml. Los bazos machacados se enjuagaron 2 veces y se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en un amortiguador de lisis ACK durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los esplenocitos se lavaron en PBS gentamicina, se resuspendieron en RPMI al 5% y se cuantificaron. Los esplenocitos se utilizaron para el ensayo de proliferación.
Concentraciones de anticuerpos
Las concentraciones de anticuerpos contra la influenza de los sueros se midieron a los 14 días después la primera inmunización, así como en los días 14 y 28 días después de la segunda inmunización. Las concentraciones se determinaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utilizando el virus inactivado A/Indonesia/5/05 como el antígeno de recubrimiento. Las concentraciones de punto final se expresaron como el valor recíproco de la dilución más elevada que alcanzó un valor de OD de al menos 0,1 mayor que el de las muestras de control negativo.
Para la determinación de la clase de anticuerpos (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM), se evaluaron las concentraciones mediante ELISA como se describió previamente.
Títulos de inhibición de hemaglutinación (HI)
Los títulos de inhibición de hemaglutinación (HI) de los sueros se midieron a los 14 y 28 días después de la segunda inmunización como se describió previamente (WHO 2002; Kendal 1982). Las preparaciones de virus inactivados de las cepas A/Indonesia/5/05 o A/Vietnam/1203/2004 se utilizaron para ensayar las muestras de suero de ratón para detectar actividad de HI. Se trataron previamente los sueros con enzima II destructora del receptor (RDE II) (Denka Seiken Co., Tokio, Japón) preparada a partir de Vibrio cholerae (Kendal 1982). Los ensayos de HI se realizaron con glóbulos rojos de pavo al 0,5%. Los títulos de anticuerpos HI se definieron como la cantidad recíproca de la dilución más elevada que provocó la inhibición completa de la aglutinación.
Ejemplos
Ejemplo 1: Expresión transitoria de hemaglutinina del virus de la influenza A/Indonesia/5/05 (H5N1) mediante agroinfiltración en plantas N. benthamiana.
La capacidad del sistema de expresión transitoria para producir hemaglutinina de influenza se determinó mediante la expresión del subtipo H5 de la cepa A/Indonesia/5/O5 (H5N1). Como se presenta en la Figura 11, la secuencia de codificación de genes de hemaglutinina (acceso No. EF541394), con su péptido señal nativo y dominio transmembrana, se ensambló primero en el casete de expresión de plastocianina - promotor, 5’ UTR, 3’ UTR, y secuencias de terminación de la transcripción del gen de plastocianina de alfalfa - y el casete ensamblado (660) se insertó en un plásmido binario pCAMBIA. Este plásmido se transfectó posteriormente en Agrobacterium (AGL1), lo que creo la cepa recombinante AGL 1/660, la cual se utilizó para la expresión transitoria.
Se infiltraron plantas de N. benthamiana con AGL 1/660, y se recolectaron las hojas después de un periodo de incubación de seis días. Para determinar si se acumuló H5 en las hojas agroinfiltradas, se extrajeron primero las proteínas del tejido de hojas infiltradas y se analizaron mediante transferencia tipo Western utilizando anticuerpos policlonales anti-H5 (Vietnam). Se detectó una banda única de aproximadamente 72 kDa en los extractos (Figura 12), correspondiendo en tamaño a la forma HA0 no escindida de la hemaglutinina de influenza. La H5 comercial utilizada como control positivo (A/Vietnam/1203/2004; Protein Science Corp., Meriden, CT, EUA) se detectó como dos bandas de aproximadamente 48 y 28 kDa, lo que corresponde al peso molecular de los fragmentos HA1 y HA2, respectivamente. Esto demostró que la expresión de H5 en las hojas infiltradas resulta en la acumulación del producto de traducción sin escindir.
La formación de trímeros de HA activos se demostró mediante la capacidad de los extractos de proteína sin purificar de las hojas transformadas con AGL 1/660 para aglutinar los glóbulos rojos de pavo (datos no mostrados).
Ejemplo 2: Caracterización de estructuras que contienen hemaglutinina en extractos de planta utilizando cromatografía de exclusión por tamaño
El ensamble de hemaglutinina de influenza producido con plantas en estructuras de alto peso molecular se analizó mediante filtración en gel. Los extractos de proteína sin purificar de las plantas infiltradas con AGL1/660 (1,5 mL) se fraccionaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en columnas SephacrylTM S-500 HR (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, EUA). Las fracciones de elución se sometieron a ensayo para detectar su contenido de proteínas totales y para detectar la abundancia de HA utilizando inmunodetección con anticuerpos anti-HA (Figura 13A). Como se muestra en la Figura 13A, la elución de Azul Dextrano (2 MDa) presentó un pico temprano en la fracción 10 mientras que el grueso de las proteínas huésped se retuvo en la columna y se eluyó entre las fracciones 14 y 22. Cuando las proteínas de 200 μL de cada fracción de elución de SEC se concentraron (5 veces) mediante precipitación con acetona y se analizaron mediante transferencias tipo Western (Figura 15A, H5), se encontró principalmente hemaglutinina (H5) en las fracciones 9 a 14 (Figura 13B). Sin querer ceñirse a ninguna teoría en particular, esto sugiere que la proteína HA se había ensamblado o bien en una gran superestructura o que se había unido con una estructura de alto peso molecular.
Se ensambló un segundo casete de expresión con la secuencia de ácido nucleico de H1 de A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) (SEQ ID NO: 33; Figura 16; GenBank, No de acceso AY289929) para producir la construcción 540 (Figura 11). Se diseñó una construcción genética quimérica para producir una forma trimérica soluble de H1 en la que el péptido señal originado a partir de un gen para la proteína disulfuro isomerasa vegetal, y se reemplazó el dominio transmembrana de H1 por una variante pII del cierre de leucina GCN4, un péptido mostró autoensamblarse en trímeros (Harbury et al., 1993) (casete 544, Figura 11). A pesar de carecer del dominio transmembrana, esta forma trimérica soluble fue capaz de llevar a cabo la hemaglutinación (datos no mostrados).
Se fraccionaron los extractos de proteína de plantas infiltradas con AGL1/540 o AGL1/544 por medio de SEC y la presencia de fracciones eluidas de Hl se analizó mediante transferencias tipo Western con anticuerpos anti-influenza tipo A (Fitzgerald, Concord, MA, EUA). En las hojas infiltradas con AGL1/540, se acumuló H1 principalmente como una estructura de peso molecular muy elevado, con el pico orientado hacia las estructuras de menor tamaño (H1; Figura 13C). En las hojas infiltradas con AGL1/544, la forma soluble de H1 se acumuló como trímeros aislados como se demuestra por medio del patrón de elusión de la filtración en gel, que es paralela al perfil elusión de la proteína huésped (H1 soluble; Figura 13D). En comparación, las rosetas H1 (Protein Science Corp., Meriden, CT, EUA), que consisten de micelas de 5 - 6 trímeros de hemaglutinina eluidas en las fracciones 12 a 16 (Figura 13E), antes que la forma soluble de H1 (Figura 13D) y después que la H1 nativa (Figura 13C).
Para evaluar el impacto de la coexpresión de M1 en el ensamble de hemaglutinina en la estructura, se ensambló un casete de expresión M1 utilizando el ácido nucleico correspondiente a la secuencia de codificación de A/PR/8/34 (H1N1) M1 (SEQ ID NO: 35; Figura 18; GenBank, No. de acceso Nc_002016). La construcción se denominó 750 y se presenta en la Figura 11. Para la coexpresión de M1 y H1, se mezclaron suspensiones de AGL1/540 y AGL1/750 en volúmenes iguales antes de la infiltración. La infiltración conjunta de múltiples suspensiones de Agrobacterium permite la coexpresión de múltiples transgenes. El análisis de las transferencias tipo Western de las fracciones de elución SEC muestra que la coexpresión de M1 no modificó el perfil de elusión de las estructuras H1, sino que resultó en una disminución en la acumulación de H1 en las hojas agroinfiltradas (véase la Figura 13F).
Ejemplo 3: Aislamiento de estructuras H5 mediante centrifugación en gradiente de sacarosa y observación bajo microscopio electrónico
La observación de la estructura de hemaglutinina bajo microscopio electrónico (EM) requirió de una concentración y nivel de pureza más elevados que los obtenidos a partir de SEC con los extractos de proteína de hojas sin purificar. Para permitir la observación en el EM de las estructuras H5, se concentró primero un extracto de proteínas de hojas sin purificar mediante precipitación en PEG (PEG al 20%) seguido por resuspensión en 1/10 volúmenes del amortiguador de extracción. Se fraccionó el extracto de proteínas concentrado mediante filtración en gel S-500 HR y se agruparon las fracciones de elución 9, 10, y 11 (que corresponden al volumen vacío de la columna) y se aislaron adicionalmente de las proteínas huésped mediante ultracentrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa de 20 - 60%. El gradiente de sacarosa se fraccionó comenzando desde la parte superior y se dializaron y concentraron las fracciones en una unidad de filtración centrífuga de 100 NMWL antes del análisis. Como se muestra en las transferencias tipo Western y los resultados de hemaglutinación (Figura 14A), el H5 se acumuló principalmente en las fracciones 16 a 19 que contenían " 60% de sacarosa, mientras que la mayoría de las proteínas huésped presentaron un pico en la fracción 13. Las Fracciones 17, 18, y 19 se agruparon, se tiñeron de forma negativa y se observaron bajo el EM. El examen de la muestra demostró claramente la presencia de estructuras esféricas con puntas con un tamaño en el intervalo de 80 a 300 nm, que coincidía con las características morfológicas de las VLP de influenza (Figura 14B).
Ejemplo 4: Purificación de las VLP H5 de influenza de la biomasa vegetal
Además de un contenido abundante de proteínas solubles, los extractos de hojas de planta contienen una mezcla compleja de azúcares solubles, ácidos nucleicos y lípidos. El extracto sin purificar se clarificó mediante un cambio de pH y un tratamiento con calor seguido por la filtración en tierra diatomáceas (véase la sección de Material y método para una descripción detallada del método de clarificación). La Figura 15A (carriles 1 - 4) presenta un contenido de proteínas que se compara con el gel teñido con Azul de Coomassie en las diferentes etapas de la clarificación. Una comparación del contenido de proteínas en el extracto sin purificar (carril 1) y en el extracto clarificado (carril 4) revela la capacidad de las etapas de clarificación para reducir el contenido global de proteína y remover la mayoría de los contaminantes principales visibles en 50 kDa en los extractos de hojas sin purificar. La banda de 50 kDa corresponde a la subunidad grande de RuBisCO que representa hasta 30% de las proteínas totales de las hojas.
Las VLP H5 de influenza se purificaron a partir de estos extractos clarificados mediante cromatografía de afinidad en una columna con fetuína. Una comparación de la fracción cargada (Figura 15A, carril 5) con las VLP que fluyen a través de la columna (Figura 15A, carril 6) y las eluidas (Figura 15 A, línea 7) demuestra la especificidad de la columna de afinidad de fetuína para las VLP H5 de influenza en el extracto clarificado de la planta.
El procedimiento de purificación resultó en una pureza de más del 75% en H5 como se determinó mediante la densitometría en gel de SDS-PAGE teñido con Azul de Coomassie (Figura 15A, carril 7). Co el propósito de evaluar la calidad estructural del producto purificado, el H5 purificado se concentró en una unidad filtrante por centrifugación de 100 NMWL (límite nominal de peso molecular) y se examinó bajo un EM después de la tinción negativa. La Figura 15B muestra un sector representativo que indica la presencia abundante de las VLP. Un análisis más detallado confirmó la presencia de puntas sobre las VLP (Figura 15C)
Como se muestra en la Figura 15D, las VLP de H5 se purificaron hasta alcanzar una pureza de aproximadamente 89% a partir del extracto de hojas clarificado mediante cromatografía de afinidad en una columna con fetuína, con base en la densidad de la hemaglutinina de H5 teñida con Azul de Coomassie y en la determinación del contenido de proteínas totales a través del método de BCA.
La bioactividad de las VLP de HA se confirmó mediante su capacidad para aglutinar los glóbulos rojos de pavo (datos no mostrados).
La Figura 20B también confirma la identidad de la VLP purificada visualizada mediante transferencias tipo Western e inmunodetección con un suero policlonal anti-H5 (A/Vietnam/1203/2004). Se detectó una banda única de aproximadamente 72 kDa y corresponde en tamaño a la forma HA0 no escindida de la hemaglutinina de influenza. La Figura 15c muestra la estructura de la VLP de la vacuna con las puntas de hemaglutinina que cubren su estructura.
Se formularon las VLP para la inmunización de ratones por medio de filtración a través de un filtro de 0,22 μm; se midió el contenido de endotoxina utilizando el kit de detección LAL de endotoxinas (Lisado de Amebocitos de Limulus) (Lonza, Walkserville, MS, EUA). La vacuna filtrada contenía 105,8 ± 11,6% EU/ml (unidades de endotoxina/ml).
Ejemplo 5: Localización de las VLP de influenza en plantas
Para localizar las VLP y confirmar su origen de membrana plasmática, se fijaron secciones delgadas de hojas de plantas que producen H5 y examinaron bajo TEM después de tinción positiva. La observación de las células de las hojas indicó la presencia de las VLP en cavidades extracelulares formadas por la invaginación de la membrana plasmática (Figura 19). La forma y posición observadas de las VLP demostró que a pesar de la aposición de sus membranas plasmáticas en la pared celular, las células de la planta tienen la plasticidad requerida para producir las VLP de influenza derivadas de su membrana plasmática y acumularlas en el espacio apoplástico.
Ejemplo 6: Análisis de lípidos de la membrana plasmática
La confirmación adicional de la composición y origen de las VLP de influenza de plantas se obtuvo a través de los análisis del contenido de lípidos. Los lípidos se extrajeron de las VLP purificadas y se comparó su composición con aquel de las membranas plasmáticas de tabaco altamente purificadas mediante cromatografía de capa fina de alto rendimiento (HP-TLC). Los patrones de migración de lípidos polares y neutros de las VLP y las membrana plasmáticas de control fueron similares; Las VLP purificadas contenían los fosfolípidos más importantes (fosfatidilcolina y fosfatidil etanolamina) y esfingolípidos (glucosil-ceramida) encontrados en la membrana plasmática (Figura 27A), y ambos contenían esteroles libres como los únicos lípidos neutros (Figura 27B). Sin embargo, la inmunodetección de un marcador de proteína de la membrana plasmática (ATPasa) en extractos purificados de VLP mostró que la bicapa de lípidos de VLP no contiene una de las principales proteínas asociada con las membrana plasmáticas de las plantas, lo que sugiere que las proteínas huésped pueden haber sido excluidas de las membranas durante el proceso de brote de las VLP de las células de la planta (Figura 27C).
Ejemplo 7: Inmunogenicidad de las VLP de H5 y el efecto de la vía de administración
Los ratones recibieron VLP de H5 elaboradas a partir de plantas mediante una inyección intramuscular, o en forma intranasal (inhalación). Se inyectaron 0,1 a 12 μg de las VLP en forma intramuscular a los ratones, con alumbre como adyuvante, de acuerdo con los métodos descritos. Se observaron los títulos pico de los anticuerpos con la menor cantidad de antígeno, en una magnitud similar a aquella de 5 μg de hemaglutinina soluble recombinante (HA) (Figura 20A).
Se administraron 0,1 a 1 μg de las VLP de H5 elaboradas a partir de plantas en forma intranasal con un adyuvante de quitosano proporcionado para una mayor respuesta de anticuerpos que aquella de HA soluble recombinante con un adyuvante de alumbre (Figura 20B).
Para ambas rutas de administración, y por encima del rango de cantidades de antígeno, se observó seroconversión en todos los ratones sometidos a prueba. El antígeno soluble de H5 recombinante confirió títulos bajos (<1/40) o insignificantes (1<1/10 para el H5 recombinante sin adyuvante).
Ejemplo 8: VLP de H5 de la concentración de anticuerpos para inhibición de la hemaglutinación (HAI)
La Figura 21 A, B ilustra la respuesta de los anticuerpos para la inhibición de hemaglutinación (HAI) 14 días después de un "refuerzo" con VLP de H5 elaborada a partir de plantas, o HA soluble recombinante. La dosis más baja de antígenos (0,1 μg) cuando se administrada en forma intramuscular produce una respuesta superior de HAI a una administración 10 veces mayor (5 μg) de HA soluble recombinante. Dosis mayores de VLP de H5 produjeron un incremento moderado en HAI con respecto a la dosis más baja.
La respuesta de HAI después de la administración intranasal aumento de manera significativa en los ratones a los que se les administró las VLP de H5 elaboradas a partir de plantas (1,0 o 0,1 μg) en comparación con aquellos a los que se les administró 1 μg de HA soluble recombinante, lo que fue similar al control negativo. Todos los ratones inmunizados a través de inyección intramuscular de las VLP de H5 (de 0,1 a 12 μg) presentaron títulos de HAI más elevados que los ratones inmunizados con el antígeno HA de control (Figura 4a - ahora 21A). Para la misma dosis de 5 μg, las VLP indujeron títulos de HAI 20 veces más elevados que la dosis correspondiente del antígeno de control HA. Las VLP también indujeron títulos significativamente más elevados de HAI que el antígeno HA de control cuando se suministraron a través de la ruta intranasal (Figura 21b). Para una dosis determinada de VLP de H5, los niveles de los títulos de HAI fueron menores en ratones inmunizados en forma intranasal que para los ratones inmunizados en forma intramuscular; 1 μg de VLP indujo un título medio de HAI de 210 cuando se administró en forma i. m. mientras que la misma dosis indujo un título medio de HAI de 34 administrada en forma i. n.
Cuando se administrarse en forma intramuscular, todas las dosis de las VLP indujeron altos niveles de anticuerpos capaces de unirse con virus inactivados completos homólogos (Figuras 20b y 24). No se encontró ninguna diferencia significativa entre la vacuna de VLP elaborada a partir de plantas y el antígeno HA de control (excepto en el grupo de VLP de 12 μg 14 días después del refuerzo), debido a que ambas preparaciones de antígeno inducen títulos elevados de enlazamiento de anticuerpos contra la cepa homóloga. Sin embargo, cuando se administraron en forma intranasal, las VLP indujeron títulos más elevados de enlazamiento de anticuerpos que en el caso del antígeno HA de control (Figura 20b). Cuando se mezclaron con quitosano, la inmunización con un microgramo de VLP indujo un título promedio recíproco de Ab de 5.500, 8.6 veces más elevado que el nivel encontrado en ratones inmunizados con 1 μg del antígeno HA de control (título promedio recíproco de Ab de 920).
La inmunogenicidad de las VLP de influenza derivadas de plantas se investigó posteriormente a través de un estudio de intervalo de dosis en ratones. Se inmunizaron grupos de 5 ratones BALB/c en forma intramuscular dos veces en intervalos de 3 semanas con 0,1 μg a 12 μg de las VLP que contienen HA de influenza A/Indonesia/5/05 (H5N1) formulada en alumbre (relación de 1:1). Los títulos de inhibición de hemaglutinación (HI), que utilizan el antígeno del virus inactivado completo (A/Indonesia/5/O5 (H5N1)), se midieron en sueros recolectados 14 días después de la segunda inmunización. La Inmunización con dosis de VLP tan bajas 0,1 μg indujo la producción de anticuerpos que inhibieron los virus de eritrocitos de aglutinación en diluciones elevadas (Figura 21A). La inmunización paralela de ratones con 5 μg de antígeno H5 de control con adyuvantes de alumbre no correspondientes a VLP (también de A/Indonesia/5/O5) induce una respuesta de HI que fue 2 - 3 registros más bajas que la obtenida con la dosis más baja de VLP.
Para ambas rutas de administración y por encima de un rango de cantidades de antígenos, la respuesta de HAI es superior en los ratones a los que se les administró las VLP.
Ejemplo 9: Efecto del adyuvante sobre la inmunogenicidad de las VLP de H5
Las VLP de H5 elaboradas a partir de plantas tienen un origen de membrana plasmática (Figura 19, Ejemplo 5). Sin ceñirse a ninguna teoría en particular, los virus encapsulados o las VLP de virus encapsulados generalmente adquieren su envoltura a partir de la membrana a través de la cual brotan. Las membranas plasmáticas de la planta tienen un complemento de fitoesterol que rara vez, si es que se encuentra alguno en células animales y varios de estos esteroles han mostrado tener efectos inmunoestimuladores.
Las VLP de H5 elaboradas a partir de plantas se administraron en forma intramuscular (Figura 22A) o intranasal (Figura 22B) a ratones en presencia o en ausencia de un adyuvante y se determinó la HAI (respuesta de anticuerpos de inhibición de hemaglutinación). Las VLP en presencia o en ausencia de un adyuvante añadido (alumbre o quitosano, como en estos ejemplos) en cualquier sistema de administración demostró una inhibición de hemaglutinina HAI significativamente mayor que el caso de HA soluble recombinante. Incluso en ausencia de un adyuvante añadido (es decir alumbre o quitosano), las VLP de H5 elaboradas a partir de plantas demuestran un HAI significativo, lo que indica una respuesta inmunológica sistémica a la administración del antígeno.
El alumbre mejoró el nivel promedio de los títulos de HAI en un factor de 5 para la administración intramuscular de VLP (Figura 22a) y en un factor de 3,7 para el antígeno HA de control. Cuando se administra en forma i. m., 5 μg de las VLP indujeron un título promedio de HAI 12 veces mayor que la dosis correspondiente del antígeno HA de control. El quitosano no reforzó el nivel promedio de HAI del antígeno HA de control (Figura 22b), mientras que incrementó el nivel promedio de HAI de los ratones inmunizados con 1 μg de VLP administrado en forma i. n. en un factor de 5 veces.
Ejemplo 10: Isotipos de anticuerpos
Los ratones a los cuales se les administró las VLP de H5 elaboradas a partir de plantas o HA soluble recombinante en presencia o en ausencia de alumbre como un adyuvante añadido, demostraron una variedad de isotipos de inmunoglobulina (Figura 23A).
En presencia de un adyuvante añadido, los perfiles de isotipos de anticuerpos de las VLP y HA son similares, siendo IgG1 el isotipo dominante. Cuando se administran las VLP o HA sin un adyuvante añadido, se reduce la respuesta de IgG1, pero siguen manteniéndose títulos similares de respuesta del isotipo dominante para las VLP, con IgM, IgG2a, IgG2B e IgG3 a los mostrados en presencia de un adyuvante añadido. Los títulos de IgG1, IgG2a, e IgG2b se reducen de manera notable cuando se administra HA sin un adyuvante añadido.
Estos datos, por lo tanto, demuestran que las VLP elaboradas a partir de plantas no requieren un adyuvante añadido para provocar una respuesta de anticuerpos en un huésped.
Los títulos de anticuerpos contra cepas del virus de influenza desactivados completos (A/Indonesia/5/05; A/Vietnam/1203/04) en ratones a los cuales se les administraron las VLP elaboradas a partir de plantas o HA recombinante soluble en forma intramuscular en presencia de un antígeno añadido se ilustran en la Figura 23B. No se observa una diferencia significativa en los títulos de los anticuerpos para estas cepas de la influenza en ratones a los cuales se les administró 1 μg o 5 μg de las VLP o 5 μg de HA soluble.
Ejemplo 11: Reactividad cruzada de anticuerpos en suero inducidos por la vacuna de VLP de H5
Se evaluó la reactividad cruzada de anticuerpos en suero inducidos por VLP de H5 contra los virus de influenza inactivados completos de diferentes cepas. Todas las dosis de VLP (de 0,1 a 12 μg) así como 5 μg de antígeno HA de control indujeron títulos altos de anticuerpos de enlazamiento contra una cepa del clado 1 (A/Vietnam/1194/04), la cepa homóloga A/Indonesia/5/05 del clado 2.1, y una cepa del caldo 2.2 A/pavo/Turquía/1/05 (Figura 25A).
Sin embargo, solo la VLP elaborada a partir de plantas indujo un título de HAI contra la cepa A/pavo/Turquía/1/05 (Figura 25b). Los títulos de HAI para la cepa de A/Indonesia/5/05 fueron elevados para las VLP.
Ejemplo 12: Protección cruzada conferida por la inmunización con VLP de H5 elaborada a partir de plantas
Los ratones a los cuales se les había administrado previamente un régimen de dos dosis de las VLP de H5 de A/Indonesia/5/05 como se describió, fueron posteriormente retados en forma intranasal con el virus infeccioso A/Turquía/582/06 (H5SN1) de influenza ("Turquía H5N1") y observados. La dosis administrada, por animal, fue de 10 LD50 (4,09 x 105 CCID50).
A los 7 días después del reto, únicamente 37,5% de los ratones a los que se les administró el control de la vacuna de PBS sobrevivieron a la exposición a la cepa Turquía H5N1 (Figura 26A). 100% de los animales a los que se les administró antígeno de control (HA) o 1, 5 o 15 μg de las VLP de H5 Indonesia sobrevivieron hasta 17 días después del reto, cuando concluyó el experimento.
Se controló también la masa corporal de los ratones durante el experimento y se represento gráficamente la masa promedio de los ratones sobrevivientes (Figura 26B). Los ratones a los cuales se les administró 1, 5 o 15 μg de las VLP de H5 Indonesia antes del reto no perdieron masa de manera apreciable durante el transcurso del experimento, y en particular, los ratones a los cuales se les administró 5 μg de las VLP parecieron haber aumentado su masa de forma significativa. Los ratones de control negativo (que no fueron retados con Turquía H5N1) no aumentaron ni disminuyeron de manera apreciable su masa corporal. Los ratones de control positivo (a los cuales no se les administraron las VLP, pero que fueron expuestos a Turquía H5N1) mostraron una pérdida significativa de peso corporal durante el transcurso del experimento, y tres de estos ratones murieron. Debido a que la masa corporal es un promedio de todos los ratones en cohorte, la sustracción de los ratones ‘más enfermos‘ (los 3 que murieron) puede conducir a un incremento aparente general en la masa, sin embargo, obsérvese que la masa corporal promedio de al cohorte de control positivo aún está significativamente por debajo de aquella de las cohortes negativas o las tratadas con VLP.
Por tanto, estos datos demuestran que las VLP de influenza elaboradas a partir de plantas que comprenden la proteína viral de hemaglutinina H5 inducen una respuesta inmunológica específica para cepas de influenza patógenas, y que las partículas similares a virus pueden brotar a partir de las membranas plasmáticas de la planta.
Por tanto, estos datos demuestran que las plantas son capaces de producir partículas similares al virus de la influenza, y también, por primera vez, que las partículas similares a virus pueden brotar a partir de una membrana plasmática de una planta.
Además, utilizando tecnología actual de expresión transitoria, se produjo un primer lote de antígenos únicamente 16 días después de que se obtuviera la secuencia de HA objetivo. Bajo los rendimientos actuales para las VLP de H5, y con un ejemplo de dosis de 5 μg por sujeto, cada kg de las hojas infiltradas puede producir -20.000 dosis de vacuna. Esta combinación única de simplicidad de la plataforma, capacidad de reacción e inmunogenicidad potente proporciona, entre otras formas de realización, una nuevo método de respuesta en el contexto de una pandemia.
Ejemplo 13: Caracterización de estructuras que contienen hemaglutinina en extractos de plantas utilizando cromatografía de exclusión por tamaño
El ensamble de hemaglutinina de influenza producida con plantas de diferentes subtipos en estructuras de alto peso molecular se evaluó mediante filtración en gel. Los extractos de proteínas sin purificar o concentradas de plantas infiltradas con AGL1/660, AGL1/540, AGL1/783, AGL1/780 y AGL1/785 (1,5 mL) se fraccionaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en columnas SephacrylTM S-500 HR (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, EUA). Como se muestra en la Figura 46, la elución de Azul Dextrano (2 MDa) presentó un pico anticipado en la fracción 10. Cuando se concentraron las proteínas de 200 μL de cada fracción de elución de SEC (5 veces) mediante precipitación con acetona y se analizaron mediante transferencias tipo Western (Figura 46), se encontraron principalmente hemaglutininas en las fracciones 7 a 14, y son indicativas de la incorporación de HA en las VLP. Sin ánimo de ceñirnos a ninguna teoría en particular, esto sugiere que la proteína HA o bien había sido ensamblada en una gran superestructura o se unió a una estructura de elevado peso molecular, sin importar el subtipo producido.
Ejemplo 14: Expresión transitoria de hemaglutinina del virus de la influenza estacional mediante agroinfiltración en plantas de N. benthamiana
La capacidad del sistema de expresión transitoria para producir hemaglutininas de influenzas estacional se determinó mediante la expresión del subtipo H1 de la cepas A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (plásmido # 774), A/Nueva Caledonia/20/1999 (H1N1) (plásmido # 540) y A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (plásmido # 775). Las secuencias que codifican al gen de hemaglutinina se ensamblaron primero en el casete de expresión de plastocianina - promotor, 5’ UTR, 3’ UTR y las secuencias de terminación de la transcripción del gen de plastocianina de alfalfa - y se insertaron los casetes ensamblados en un plásmido binario pCAMBIA. Se transfectaron luego los plásmidos en Agrobacterium (AGL1), lo que produjo cepas de Agrobacterium AGL1/774, AGL1/540 y AGL1/775, respectivamente.
Se infiltraron plantas N. benthamiana con AGL1/774, AGL1/540 y AGL1/775, y se cosecharon las hojas después de un periodo de incubación de seis días. Para determinar si H1 se acumuló en las hojas agroinfiltradas, se extrajeron primero las proteínas del tejido de hojas infiltradas y se analizaron mediante transferencias tipo Western utilizando anticuerpos anti-H1. Se detectó una sola banda de aproximadamente 72 kDa en los extractos (Figura 47), lo que corresponde en tamaño a la forma HA0 sin escindir de la hemaglutinina de influenza. Esto demostró que la expresión de diferentes cepas epidémicas anuales de hemaglutinina en las hojas infiltradas resulta en la acumulación del producto de traducción sin escindir.
Ejemplo 15: Expresión transitoria de la hemaglutinina del virus de la influenza pandémica potencial mediante agroinfiltración en plantas de N. benthamiana
La capacidad del sistema de expresión transitoria para producir hemaglutininas de influenza potencial se determinó mediante la expresión del subtipo H5 de la cepas A/Anhui/1/2005 (H5N1) (plásmido # 781), A/Indonesia/5/2005 (H5N1) (plásmido # 660) y A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) (plásmido # 782). Las secuencias de codificación de genes de hemaglutinina se ensamblaron primero en el casete de expresión de plastocianina - secuencias del promotor, 5’ UTR, 3’ UTR y de terminación de la transcripción del gen de plastocianina de alfalfa - y se insertaron los casetes ensamblados en un plásmido binario pCAMBIA. Los plásmidos se transfectaron posteriormente en Agrobacterium (AGL1).
Se infiltraron las plantas de N. benthamiana con AGL1/781, AGL1/660 y AGL1/782, y se cosecharon las hojas después de un periodo de incubación de seis días. Para determinar si H5 se acumuló en las hojas agroinfiltradas, se extrajo primero la proteína del tejido de hojas infiltradas y se analizó mediante transferencia tipo Western utilizando anticuerpos anti-H5. Se detectó una banda única de aproximadamente 72 kDa en los extractos (Figura 48), lo que corresponde en tamaño a la forma de HA0 sin escindir de la hemaglutinina de influenza. Esto demostró que la expresión de diferentes cepas pandémicas potenciales de hemaglutinina en las hojas infiltradas resulta en la acumulación del producto de traducción sin escindir.
Ejemplo 16: Expresión transitoria de H5 mediante agroinfiltración en plantas de N. tabacum
La capacidad del sistema de expresión transitoria para producir hemaglutinina de influenza en hojas de Nicotiana tabacum se analizó a través de la expresión del subtipo H5 de la cepa A/Indonesia/5/2005 (H5N1) (plásmido # 660). Las secuencias de codificación de genes de hemaglutinina se ensamblaron primero en el casete de expresión de plastocianina - secuencias del promotor, 5’ UTR, 3’ UTR y de terminación de la transcripción del gen de plastocianina de alfalfa - y se insertaron los casetes ensamblados en un plásmido binario pCAMBIA. Los plásmidos se transfectaron posteriormente en Agrobacterium (AGL1).
Las plantas de N. tabacum se infiltraron con AGL1/660 y se cosecharon las hojas después de un periodo de incubación de seis días. Para determinar si H5 se acumuló en las hojas agroinfiltradas, se extrajo primero la proteína del tejido de hojas infiltradas y se analizó mediante transferencia tipo Western utilizando anticuerpos anti-H5. Se detectó una banda única de aproximadamente 72 kDa en los extractos (Figura 49), lo que corresponde en tamaño a la forma de HA0 sin escindir de la hemaglutinina de influenza. Esto demostró que la expresión de hemaglutinina en las hojas infiltradas de N. tabacum resulta en la acumulación del producto de traducción sin escindir.
Ejemplo 17: Inmunogenicidad de la vacuna de VLP de HSN1 elaborada a partir de plantas de A/Indonesia/5/05 (H5N1) en hurones
Se realizó un estudio de escalada de dosis en hurones para evaluar la inmunogenicidad de las VLP derivadas de plantas. Se evaluó la reactividad cruzada in vitro de anticuerpos de suero inducidos por la vacuna de VLP de H5 en
5 3 dosis (1, 5 y 15 μg) mediante la inhibición de hemaglutinación de otras tres cepas H5N1 - A/pavo/Turquía/1/05 (clado 2.2), A/Vietnam/1194/04 (clado 1) y A/Anhui/5/05 (todos virus inactivados completos), utilizando suero tomado 14 días después de la primera dosis de la vacuna (Figura 50A), y 14 días después de la segunda dosis (Figura 50 B). Para las 3 concentraciones de dosis, se observó reactividad cruzada.
Ejemplo 18: Análisis de los resultados de inmunogenicidad de acuerdo con los criterios de CHMP.
10 El Comité de la EMEA para Productos Medicinales para uso Humano (CHMP) (http://www.emea.europa.eu/htms/general/contacts/CHMP/CHMP.html) establece tres criterios (aplicados después de la segunda dosis) para la eficacia de la vacuna: 1 - El número de seroconversión o incremento significativo en los títulos de HI (4 veces) > 40%; 2 - Incremento geométrico medio de por lo menos 2,5; 3 - La proporción de sujetos que obtienen un título de H1 de 1/40 debe ser de por lo menos el 70%. El Análisis de estos criterios en el modelo de
15 hurón se muestra en las Tablas 8 - 11. (*) indica que se cumplen o se exceden los criterios de CHMP. Se muestra en la Tabla 12 un resumen del análisis de inmunogenicidad cruzada en relación con los criterios del CHMP para la concesión de licencias.
Los animales se evaluaron diariamente en cuanto a peso corporal, temperatura y condición general. No se registraron señales de enfermedad o malestar durante el estudio. El peso corporal y la temperatura estuvieron
20 dentro de los rangos normales durante el estudio. La vacuna fue segura y tolerada por los animales del estudio.
Tabla 8: Datos para una cepa homóloga (A/Indonesia/5/05) Tabla 9: Datos para una cepa heteróloga (A/Vietnam/1194/04)
Día
Criterios Grupo de estudio
1 μg
1 μg con adyuvante 5 μg 5 μg con adyuvante 7,5 μg 15 μg 15 μg con adyuvante 30 μg 5 μg ITC
14 (después de la primera inyección)
% de incremento de 4 veces en el título de HI Incremento geométrico medio % del título de HI de 1/40 0% 0% 0% 100% 7,6 60% 0% 0% 0% 100% * 15,6 * 100% * 20% 1,3 20% 20 % 1,2 0% 80% * 11,2 * 80% * 0% 0% 0% 0% 0% 0%
Título de HI medio
38 78 56
35 (14 días después del refuerzo)
% de incremento de 4 veces en el título de HI Incremento geométrico medio % del título de HI de 1/40 0% 0% 0% 100% * 10,8 * 100% * 0% 0% 0% 60% * 5,9 * 100% * 0% 0,7 0% 0% 0% 0% 40% * 4 * 100% * 0% 0% 0% 0% 0% 0%
Título de HI medio
411 465 217
Día
Criterios Grupo de estudio
1 μg
1 μg con adyuvante 5 μg 5 μg con adyuvante 7,5 μg 15 μg 15 μg con adyuvante 30 μg 5 μg ITC
14 (después de la primera inyección)
% de incremento de 4 veces en el título de HI Incremento geométrico medio % del título de HI de 1/40 0% 1,2 0% 0% 1,2 0% 0% 1,3 0%
35
% de incremento de 4 veces en el título de HI 60% 80% * 60%
(después del
Incremento geométrico medio 2,3 5,1 * 1,78
refuerzo)
% del título de HI de 1/40 0% 80% * 20%
Tabla 10: Datos para una cepa heteróloga (A/pavo/Turquía/1/05)
Día
Criterios Grupo de estudio
1 μg
1 μg con adyuvante 5 μg 5 μg con adyuvante 7,5 μg 15 μg 15 μg con adyuvante 30 μg 5 μg ITC
14 (después de la primera inyección)
% de incremento de 4 veces en el título de HI Incremento geométrico medio % del título de HI de 1/40 40% 1,9 40% 20% 1,7 20% 60% 2,8 40%
35 (después del refuerzo)
% de incremento de 4 veces en el título de HI Incremento geométrico medio % del título de HI de 1/40 80% * 10,6 * 100% * 100% * 20,8 * 100% * 80% * 7,7 * 100% *
Tabla 11: Datos para una cepa heteróloga (A/Anhui/5/05)
Día
Criterios Grupo de estudio
1 μg
1 μg con adyuvante 5 μg 5 μg con adyuvante 7,5 μg 15 μg 15 μg con adyuvante 30 μg 5 μg ITC
14 (después de la primera inyección)
% de incremento de 4 veces en el título de HI Incremento geométrico medio % del título de HI de 1/40 40% 1,8 20% 20% 1,3 20% 80% * 6,4 * 80% *
35 (después del refuerzo)
% de incremento de 4 veces en el título de HI Incremento geométrico medio % del título de HI de 1/40 100% * 11,8 * 100% * 100% * 14,4 * 80% * 60% * 3 * 80% *
10 Tabla 12: Resumen del análisis de inmunogenicidad cruzada en relación con los criterios de CHMP para concesión de licencia.
Cepa
Criterios Grupo de estudio
1 mg con adyuvante
5 mg con adyuvante 15 mg con adyuvante
A/pavo/Turquía/1/05 (clado 2.2
% de incremento de 4 veces en el título de HI Incremento geométrico medio % del título de HI de 1/40 80% * 10,6 * 100% * 100% * 20,8 * 100% * 80% * 7,7 * 100% *
A/Anhui/1/05 (clado 2.3)
% de incremento de 4 veces en el título de HI Incremento geométrico medio % del título de HI de 1/40 100% * 11,8 * 100% * 100% * 14,4 * 80% * 60% * 3* 80% *
A/Vietnam/1194/04 (clado 1)
% de incremento de 4 veces en el título de HI Incremento geométrico medio % del título de HI de 1/40 60% 2,3 0% 80% * 7,1 * 80% * 60% 1,78 20%
Ejemplo 18: Selección de secuencias de nucleótidos de hemaglutinina
15 Se recuperaron las secuencias de nucleótidos de HA a partir de una base de datos de secuencias de influenza (véase la URL: flu.lanl.gov), o la fuente del virus de influenza del NCBI (véase la URL: ncbi.n.m.hih.gov/genomes/FLU/FLU.html). Para muchas de las secuencias de ácidos nucleicos de HA, se enlistaron múltiples entradas en las bases de datos (Tabla 13). Alguna variación se asocia principalmente con el sistema de cultivo (Origen - MDCK, huevo, desconocido, ARN viral/aislado clínicamente); por ejemplo, el sitio de glicosilación en
20 la posición 194 (numeración de proteína madura) de la HA se encuentra ausente cuando el virus de la influenza tipo B se expresa en fluido alantóico de huevos (véase también Chen et al., 2008). Para algunas secuencias, los dominios pueden estar ausentes (por ejemplo, clones incompletos, artefactos de secuenciación, etc.). La secuencia de hemaglutinina puede dividirse en 5 dominios: péptido señal (SP), HA1, HA2, transmembrana (DTm) y cola citoplasmática. Los dominios de una primera secuencia pueden combinarse con un dominio de una segunda secuencia existente, por ejemplo el péptido señal de una primera secuencia de la cepa puede combinarse con el resto de la secuencia de codificación de hemaglutinina de una segunda cepa para proporcionar una secuencia de codificación completa.
Tabla 13: Variación en los subtipos de influenza para secuencias de codificación de HA seleccionadas
Cepa
No. de referencia de la base de datos e la secuencia Origen SP HA 1 HA 2 DTm Divergencia
H1
A/Islas Salomón/3 /2006 ISDN231 558 (rec. de la vacuna) MDCK Y Y Y Y 189: R o G, 220: K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R(Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
A/Islas Salomón/3/ 2006
ISDN238 190 Huevo Y Y Y Y 189: R o G, 220: K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R(Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
A/Islas Salomón/3/ 2006
EU 10072 4 ? Y Y Y Y 189: R o G, 220: K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
A/Islas Salomón/3/ 2006
ISDN220 951 MDCK Y Y N N 189: R o G, 220: K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
A/Islas Salomón/3/ 2006
ISDN220 953 Huevo Y Y N N 189: R o G, 220: K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
A/Islas Salomón/3/ 2006
EU12413 7 Huevo Y Y N N 189: R o G, 220: K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
A/Islas Salomón/3/ 2006
EU12413 5 MDCK Y Y N N 189: R o G, 220: K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
A/Islas Salomón/3/ 2006
EU12417 7 MDCK Y Y Y Y 189: R o G, 220: K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
H1
A/Brisbane /59/2007 ISDN282 676 MDCK Y Y Y 203: D/I/N D es el más abundante en H1
A/Brisbane/ 59/2007
ISDN285 101 Huevo Y Y N N 203: D/I/N D es el más abundante en H1
A/Brisbane/ 59/2007
ISDN285 777 Huevo Y Y Y Y 203: D/I/N D es el más abundante en H1
A/Brisbane/ 59/2007
ISDN282 677 Huevo Y Y Y Y 203: D/I/N D es el más abundante en H1
H3
A/Brisbane /10/2007 ISDN274 893 Huevo Y Y Y Y 202: V/G, 210: L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/1 0/2007
ISDN257 648 MDCK N Y Y Y n 202: V/G, 210: L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/1 0/2007
ISDN256 751 Huevo Y Y Y Y 202: V/G, 210: L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/1 0/2007
ISDN273 757 Huevo Y Y Y Y 202: V/G, 210: L/P, 215: del Ala, 242: S/I
(continuación)(continuación)(continuación)
Cepa
No. de referencia de la base de datos de la secuencia Origen SP HA 1 HA 2 DTm Divergencia
A/Brisbane/1 0/2007
ISDN273 759 Huevo Y Y Y Y 202: V/G, 210: L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/1 0/2007
EU 19924 8 Huevo N Y Y Y 202: V/G, 210: L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/1 0/2007
EU19936 6 Huevo Y Y Y Y 202: V/G, 210: L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/1 0/2007
ISDN257 043 Huevo N Y Y Y 202: V/G, 210: L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/ 10/2007
EU19925 0 MDCK N Y Y Y 202: V/G, 210: L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/ 10/2007
ISDN275 357 Huevo N Y N N 202: V/G, 210: L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/ 10/2007
ISDN260 430 Huevo N Y Y Y 202: V/G, 210: L/P, 215: del Ala, 242: S/I
H3
A/Wisconsin/ 67/2005 ISDN131 464 (rec. de la vacuna) ? N Y Y N 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y
A/Wisconsin/ 67/2005
DQ86594 7 ? N Y parte N 138: A/S 156: H/Q 186: GN 196: H/Y
A/Wisconsin/ 67/2005
EF473424 ? N Y Y N 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y
A/Wisconsin/ 67/2005
ISDN138 723 Huevo N Y Y Y 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y
A/Wisconsin/ 67/2005
EF473455 Huevo N Y Y Y 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y
A/Wisconsin/ 67/2005
ISDN!38 724 ? N Y Y Y 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y
B
B/Malasia /2506/2004 ISDN126 672 (rec. de la vacuna) Huevo Y Y N N 120 K/N 210 T/A
B/Malasia/ 2506/200 4
EF566433 Huevo Y Y N N 120 K/N 210 T/A
B/Malasia/ 2506/200 265 4
ISDN231 265 Huevo Y Y Y Y 120 K/N 210 T/A
B/Malasia/ 2506/200 4
ISDN231 557 MDCK Y Y Y Y 120 K/N 210 T/A
B/Malasia/ 2506/200 4
EF566394 MDCK Y Y N N 120 K/N 210 T/A
B/Malasia/ 2506/200 4
EU12427 4 Huevo Y Y Y Y 120 K/N 210 T/A
B/Malasia/ 2506/200 4
EU12427 5 MDCK Y Y Y Y 120 K/N 210 T/A
B/Malasia/ 2506/2004
ISDN124 776 MDCK Y Y N N N 120 K/N 210 T/A
B
B/Florida/4 /2006 ISDN261 649 Huevo Y Y Y N Carece de sitio de glicosilación en la posición 211; 10 aminoácidos de DTm/ cola citoplasmática
B/Florida/ 4/2006
EU10060 4 MDCK N Y N N
B/Florida/ 4/2006
ISDN218 061 MDCK N Y N N
B/Florida/ 4/2006
ISDN285 778 Huevo Y Y Y Y Incluye cola citoplasmática
Cepa
No. de referencia de la base de datos e la secuencia Origen SP HA 1 HA 2 DTm Divergencia
B
B/Brisbane /3/2007 ISDN256 628 Huevo N Y N N Carece de sitio de glicosilación en la posición 211
B/Brisbane/ 3/2007
ISDN263 782 Huevo Y Y Y Y Carece de sitio de glicosilación en la posición 211
B/Brisbane/ 3/2007
ISDN263 783 MDCK Y Y Y Y
H5
A/Vietnam/1 194/ 2004 ISDN3 86 (rec. de la vacuna) ? Y Y Y Y
A/Vietnam/ 1194/2004
AY65133 3 ? Y Y Y Y
A/Vietnam/ 1194/2004
EF541402 ? Y Y Y Y
H5
A/Anhui1/1/2 005 DQ37928 (rec. de la vacuna) ? Y Y Y Y
A/Anhui1/1/2 005
ISDN131 465 Huevo Y Y Y Y
H7
A/Pollo/ Italia/ 13474 /1999 AJ91720 Gen de ARN Y Y Y Y
H7
A/Equino/ Praga/56 AB29827 7 (Lab. de reclasificación) ? Y Y Y Y 152 (R/G) 169 (T/I) 208 (N/D) (sitio de glicosilación abolido)
A/Equino/ Praga/56
X62552 ? Y Y Y Y
H9
A/Hong Kong/ 1073 /1999 AJ404626 ? Y Y Y Y
A/Hong Kong/ 1073 /1999
AB08022 6 ? N Y N N
H2
A/Singapur/ 1/1957 AB29607 4 ? Y Y Y Y
A/Singapur/ 1/1957
L20410 ARN Y Y Y Y
A/Singapur/ 1/1957
L11142 ? Y Y Y Y
H2
A/Japón/30 5/1957 L20406 ? Y Y Y Y
A/Japón/3 05/1957
L20407 ? Y Y Y Y
A/Japón/3 05/1957
CY01497 6 ? Y Y Y Y
A/Japón/3 05/1957
AY20995 3 ? Y Y N N
A/Japón/3 05/1957
J02127 ? Y Y Y Y
A/Japón/3 05/1957
DQ50884 1 ? Y Y Y Y
A/Japón/3 05/1957
AY64308 6 ? Y Y Y N
Cepa
No. de referencia de la base de datos e la secuencia Origen SP HA 1 HA 2 DTm Divergencia
A/Japón/3 05/1957
AB28933 7 ? Y Y Y Y
A/Japón/3 05/1957
AY64308 5 ? Y Y Y Y
A/Japón/3 05/1957
AY64308 7 Resist. al fármac. Y Y Y N
H6
A/Cerceta/ Hong Kong/ W312/1997 (H6N1) AF25047 9 Huevo Y Y Y Y
Y, N - Sí, No, respectivamente SP - presencia de secuencia de péptido señal Y/N HA1 - dominio completo de HA1 Y/N HA2 - dominio completo de HA2 Y/N DTm - dominio completo transmembrana Y/N
Cepa: H1 de A/Islas Salomón/3/2006 Se compararon ocho secuencias de amino ácidos, y se identificaron las variaciones. (Tabla 14). La posición 171 mostró una variación de glicina (G) o arginina (R) en algunas secuencias. Tabla 14: Variación de amino ácidos en A/Islas Salomón/3/2006
Aminoácido #
MDCK Huevo
212
K T
241
Q R
542
L R
Numeración a partir de M inicial
10 Cepa: H1 de A/Brisbane/59/2007
La position 203 mostró una variación de ácido aspártico (D), isoleucina (I) o asparagina (N).
Cepa: H3 de A/Brisbane/10/2007
Se observaron variaciones de la secuencia en 5 posiciones (Tabla 15). En la posición 215, se observó una supresión
en dos secuencias muestreadas. 15 Tabla 15: H3 de la variación de aminoácidos de A/Brisbane/10/2007 Cepa: H3 de A/Wisconsin/67/2005
Origen
202, 210, 215, 235 242*
ISDN274893
Huevo V L -Y I
ISDN273759
Huevo G P A S I
EU199248
Huevo G P A S I
EU199366
Huevo G P A S I
ISDN273757
Huevo V L -S S
ISDN257043
Huevo G P A S I
EU199250
MDCK G L A S I
ISDN375357
Huevo G P A S I
ISDN260430
Huevo G P A S I
ISDN256751
Huevo G P A S I
ISDN257648
MDCK G L A S I
* Numeración a partir de M inicial
Se observaron variaciones de la secuencia en esta cepa en 4 posiciones (Tabla 16). Tabla 16: H3 de una variación de aminoácidos de A/Wisconsin/67/2005
Origen
138, 156, 186, 196
ISDN138724
Desconocido A H G S H V A H G S Q V A H G A H G H Y H Y H H
DQ865947
Desconocido
EF473424
Desconocido
ISDN138723
Huevo
ISDN131464
Desconocido
EF473455
Huevo
* Numeración a partir de la proteína madura
Cepa: B de B/Malasia/2506/2004 Se observó una variación en dos posiciones (Tabla 17). La. posición 120 no es un sitio de glicosilación; la posición 210 tiene que ver con la glicosilación; esta glicosilación se elimina después del cultivo en huevos. Tabla 17: Hemaglutinina de una variación de aminoácidos de B/Malasia/2506/2004
Aminoácido #
MDCK Huevo
120
K N
210
T A
* Numeración a partir de la mitad de SP
Cepa: hemaglutinina de B/Florida/4/2006; ISDN261649 Las variaciones observadas incluyen variaciones de las secuencias de aminoácidos en la posición 211, dependiendo del sistema de cultivo. Se encuentra asparagina (N) en secuencias aisladas de células MDCK, mientras que se
15 encuentra ácido glutámico (D) en la secuencia aislada de los huevos. La posición 211 es un sitio de glicosilación, y se elimina después del cultivo en los huevos. Cepa: H2 de A/Singapur/ 1/1957 Se observaron variaciones en la secuencia en 6 posiciones (Tabla 18). Tabla 18: H2 de una variación de aminoácidos de A/Singapur/1/1957
Origen
Aminoácido No.D 166 168 199\236 238 358
L20410
ARN viral K E T L E G K L K G T Q K G T Q/L S S G G V I V V
L11142
Desconocido
AB296074
Desconocido
Consenso A/Japón/305/1957
‘Numeración a partir de la proteína madura
Cepas: H5 de A/Vietnam/1194/2004 y H5 de A/Anhui/l/2005 No se observaron variaciones en la secuencia de aminoácido después de la alineación de las secuencias principales de cualquiera de estas cepas de H5.
25 Cepa: H6 de A/Cerceta/Hong Kong/W312/1997 Únicamente estaba disponible una entrada para la cepa (AF250179). Cepa: H7 de A/Equinos/Praga/56
Se encontraron un total de 2 entradas de secuencia en las bases de datos. La entrada AB298877 se excluyó ya que se trataba de un laboratorio de reclasificación. Cepa: H9 de A/Hong Kong/1073/1999; AJ404626 Se encontraron un total de 2 entradas de secuencia en las bases de datos. Solo una estaba completa.
5 La presente invención ha sido descrita con respecto a una o más formas de realización. Sin embargo, será evidente para aquellos capacitados en la técnica que es posible realizar una serie de variaciones y modificaciones sin alejarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Medicago Inc. D’Aoust, Marc-Andre Couture, Manon Ors, Frederic Trepanier, Sonia Lavoie, Pierre-Olivier 10 Dargis, Michele Vezina, Louis-Philippe Landry, Nathalie.
<120> Partículas similares al virus de la influenza (VLP) que contienen Hemaglutinina
<130> V81270WO
<160> 76
<170> PatentIn versión 3.5 15 <210> 1
<211> 1556
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 1
<210> 2
<211> 219
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 2
5 <210> 3
<211> 1719
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 3
<210> 4
<211> 25
5
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 4
10
gtattagtaa ttagaatttg gtgtc 25
<210> 5
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
15
<220>
<223> Cebador
<400> 5
gcaagaagaa gcactatttt ctccattttc tctcaagatg atta
44
<210> 6
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 6
ttaatcatct tgagagaaaa tggagaaaat agtgcttctt cttgc
45
<210> 7
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 7
actttgagct cttaaatgca aattctgcat tgtaacga 38
<210> 8
<211> 1471
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 8
<210> 9
<211> 565
<212> PRT
<213> Virus de la influenza
<400> 9
<210> 10
<211> 568
<212> PRT
<213> Virus de la influenza
<400> 10
<210> 11
<211> 1629
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 11
<210> 12
<211> 1773
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 12
<210> 13
<211> 1086
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 13
<210> 14
<211> 1048
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 14
<210> 15
<211> 1707
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 15
<210> 16
<211> 1050 <212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 16
<210> 17
<211> 1698
<212> ADN 10 <213> Virus de la influenza A
<400> 17
<210> 18
<211> 1363
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 18
<210> 19
10 <211> 1727
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 19
<210> 20
<211> 1698
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 20
<210> 21
<211> 1695
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 21
<210> 22
<211> 1701
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 22
<210> 23
<211> 1749
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 23
<210> 24
<211> 1762
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 24
<210> 25
<211> 1760
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 25
<210> 26
<211> 1882
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 26
<210> 27
<211> 2073
<212> ADN
<213> Virus de la influenza A
<400> 27
<210> 28
<211> 1670
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 28
<210> 29
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 29
agttccccgg gctggtatat ttatatgttg tc 32
<210> 30
<211> 46
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 30
aatagagctc cattttctct caagatgatt aattaattaa ttagtc
46
<210> 31
<211> 46
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 31
aatagagctc gttaaaatgc ttcttcgtct cctatttata atatgg
46
<210> 32
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 32
ttacgaattc tccttcctaa ttggtgtact atcatttatc aaagggga 48
<210> 33
<211> 1711
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 33
<210> 34
<211> 1781
<212> ADN
<213> Medicago Sativa
<400> 34
<210> 35
<211> 1027
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 35
<210> 36
<211> 1788
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 36
<210> 37
<211> 1788
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 37
<210> 38
<211> 1791
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 38
<210> 39
<211> 1791
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 39
<210> 40
<211> 1848
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 40
<210> 41
<211> 1845
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> Clon
<400> 41
10
<210> 42
<211> 1779
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 42
<210> 43
<211> 1794
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 43
<210> 44
<211> 1797
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 44
<210> 45
<211> 1791
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 45
<210> 46
<211> 1803
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 46
<210> 47
<211> 1773
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 47
<210> 48
<211> 565
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 48
<210> 49
5 <211> 565
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
10 <400> 49
<210> 50
<211> 566
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 50
<210> 51
<211> 566
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 51
<210> 52
<211> 585
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 52
<210> 53
<211> 584
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 53
<210> 54
<211> 562
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 54
<210> 55
<211> 567
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 55
<210> 56
<211> 568
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 56
<210> 57
<211> 566
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 57
<210> 58
<211> 570
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 58
<210> 59
<211> 560
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Clon
<400> 59
<210> 60
<211> 3111
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 60
<210> 61
<211> 3123
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 61
<210> 62
<211> 3088
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 62
<210> 63
<211> 3102 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 63
<210> 64
<211> 3093
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 64
<210> 65
<211> 3108
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Casete de expresión
<400> 65
<210> 66
<211> 3111
5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 66
<210> 67
<211> 3105
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 67
<210> 68
<211> 3087
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 68
<210> 69
<211> 3105
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 69
<210> 70
<211> 3105
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 70
<210> 71
<211> 3117 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 71
<210> 72
<211> 3162
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 72
<210> 73
<211> 3159
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión
<400> 73
<210> 74
<211> 565
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Consenso
<220> 10 <221> característica nueva
<222> (3)..(3)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (52)..(52)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (90)..(90)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (99)..(99)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (111)..(111)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (145)..(145)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (157)..(157)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (162)..(162)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (182)..(182)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (203)..(203)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (205)..(205)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (210)..(210)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (225)..(225)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (268)..(268)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (283)..(283)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva <222> (290)..(290)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
5 <222> (432)..(432)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> característica nueva
<222> (489)..(489) 10 <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<400> 74
<210> 75
<211> 565
<212> PRT
<213> Virus de la influenza
<400> 75
<210> 76
<211> 252
<212> PRT
<213> Virus de la influenza
<400> 76
Referencias:
Aymard, H. M., M. T. Coleman, W. R. Dowdle, W. G. Laver, G. C. Schild, and R. G. Webster. 1973. Influenza virus neuraminidase-inhibition test procedures. Bull. W.h.O. 48: 199 - 202 Bollag, D. M., Rozycki, M. D., and Edelstein, S. J. (1996) Protein nmthods (ZM edition). Wi1ey-Liss, New York, USA.
Bligh, E. G., & Dyer, W. J. Can. J. Med. SCL 37, 911 - 917 (1959). Chen, B. J., Leser, G. P., Morita, E., and Lamb R. A. (2007) Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase, but not the matrix protein, are required for assembly and budding of plasmid-derived virus-like particles. J. Virol. 81, 7111
-
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un método para producir partículas similares al virus de la influenza (VLP) en una planta, que comprende: a) introducir un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una hemaglutinina de
    influenza (HA) operativamente enlazada a una región reguladora activa en la planta dentro de la planta, o en una porción de la misma, b) incubar la planta bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo así las VLP, c) cosechar la planta, y d) purificar las VLP, en donde las VLP están en un intervalo de tamaño de 80 - 300 nm.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y H16.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 2, en donde en la etapa de introducción (etapa a), el ácido nucleico se expresa en forma transitoria en la planta.
  4. 4.
    El método de la reivindicación 1 o 2, en donde en la etapa de introducción (etapa a), el ácido nucleico se expresa en forma estable en la planta.
  5. 5.
    Una partícula similar a un virus (VLP) producida mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una proteína de hemaglutinina del virus de la influenza (HA) y uno o más de un lípido derivado de una planta.
  6. 6.
    La VLP de la reivindicación 5, en donde la proteína HA de influenza es Indonesia H5.
  7. 7.
    Una composición que comprende una dosis efectiva de la VLP de la reivindicación 5 o la reivindicación 6 para inducir una respuesta inmunológica y un portador farmacéuticamente aceptable.
  8. 8.
    Una VLP producida por medio del método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o la VLP de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde la HA del virus de la influenza comprende N-glicanos, o N-glicanos modificados específicos de la planta.
  9. 9.
    La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o la reivindicación 8, o la composición de la reivindicación 7, para uso en la inducción de inmunidad para una infección causada por virus de la influenza en un individuo.
  10. 10.
    La VLP de la reivindicación 9, en donde la VLP es adecuada para administración oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea.
  11. 11.
    Una composición que comprende una dosis efectiva de la VLP de la reivindicación 8 para inducir una respuesta inmune, y un portador farmacéuticamente aceptable.
  12. 12.
    La composición de la reivindicación 11 para uso en la inducción de inmunidad para una infección causada por virus de la influenza en un individuo.
  13. 13.
    La composición de la reivindicación 12, en donde la composición es adecuada para administración oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea.
  14. 14.
    Un alimento suplementado que comprende la VLP como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 u
  15. 8.
    Fig. 9
    >BHB940420 I gb : AF071776 I Símbolo : HA I Nombre : precursor de hemaglutinina I Organismo : Virus de influenza A A/pollo/Nueva York/1995 I Cromosoma : 4 I Subtipo : H7 I Huésped : Aviar
    Fig. 10A
    Fig. 10B Subtipo H3 (SEQ ID NO: 13) >BHB2107299 I gb : EF473574 I Símbolo : HA I Nombre : hemaglutinina I Organismo : Virus de influenza A A /Tejas/32/2003 I Segmento : 4 I Subtipo : H3 I Huésped : Humano
    Fig. 10C
    >BHB1050162 I gb : DQ021859 I Símbolo : HA I Nombre : hemaglutinina I Organismo : Virus de influenza A A /ánade real/MN/33/00 I Segmento : 4 I Subtipo : H4 I Huésped : Aviar
    Fig. 10D
    >BHB950029 I gb : AF501235 I Símbolo : HA I Nombre : hemaglutinina I Organismo : Virus de influenza A A /pato/Shanghái/1/2000 I Segmento : 4 I Subtipo : H5 I Huésped : Aviar
    Fig. 10E
    >BHB1049778 I gb : DQ021667 I Símbolo : HA I Nombre : hemaglutinina I Organismo : Virus de influenza A A /ánade de cola larga/TX/828189/02 I Segmento : 4 I Subtipo : H6 I Huésped : Aviar
    Fig. 10F
    >gi I 221317 I dbj I D90304.1 I FLAHAH8N4 Virus de influenza A (A /Pavo/Ontario/6118/68 (H8N4) I gen para el precursor de hemaglutinina, cds completo
    Fig. 10G
    >BHB954830 I gb : AMO87218 I Símbolo : HA I Nombre : hemaglutinina I Organismo : Virus de influenza A A /pato cuchareta/Irán/G54/03 I Segmento : 4 I Subtipo : H9 I Huésped : Aviar
    Fig. 10H
    >gi I 324365 I gb I M21647.1 I FLAMS84HA Virus de influenza A (A /pollo/Alemania/N/1949 (H10N7) I precursor de hemaglutinina, gen, cds completo
    Fig. 10I
    >gi I 221307 I dbj I D90306.1 I FLAHAH11N Virus de influenza A (A /pato/Inglaterra/56/(H11N6)) gen para el precursor de hemaglutinina, cds completo
    Fig. 10J
    >gi I 221309 I dbj I D90307.1 I FLAHAH12N Virus de influenza A (A /pato/Alberta/60/76 (H12N5)) gen para el precursor de hemaglutinina, cds completo
    Fig. 10K
    >gi I 221311 I dbj I D90308.1 I FLAHAH13N Virus de influenza A (A /Gaviota/Maryland/704/77 (H13N6)) gen para el precursor de hemaglutinina, cds completo
    Fig. 10L
    >gi I 324045 I gb I M35997.1 I FLAH1424 Virus de influenza A A /Ánade real/Gurjev/263/82 hemaglutinina subtipo H14 gen
    Fig. 10M
    >gi I 1226068 I gb I L43916.1 I FLAHEMAC influenza A/pato/Australia/341/83 (H15N8)) ARNm de hemaglutinina, cds completo
    Fig. 10N
    Subtipo H16 (SEQ ID NO: 25)
    >gi I 56425020 I gb I AY68489.1 I Virus de influenza A (A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3)) gen de hemaglutinina (HA), cds completo
    Fig. 10O Influenza B (SEQ ID NO: 26)
    >gi I 325175 I gb I K00423.1 I FLBHAZO influenza B/Lee/40, hemaglutinina (seg 4), segmento completo
    Fig. 10P
    Influenza C (SEQ ID NO: 27)
    >gi I 325317 I gb I M17868.1 I FLCHAJO influenza C/Johannesburgo/66, ARN de hemaglutinina esterasa (seg 4), cds completo
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