ES2403129B1 - Compuestos maleimido-furanilo útiles en un procedimiento general de preparación de derivados maleimido-oligonucleótido - Google Patents
Compuestos maleimido-furanilo útiles en un procedimiento general de preparación de derivados maleimido-oligonucleótido Download PDFInfo
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Abstract
Compuestos maleimido-furanilo útiles en un procedimiento general de preparación de derivados maleimido-oligonucleótido.#Los compuestos de fórmula (I) sustancialmente en forma exo o sus sales, donde: X es un birradical seleccionado entre -(CH{sub,2}){sub,n}-*,#-(CH{sub,2}CH{sub,2}O){sub,n}CH{sub,2}CH{sub,2}-*, metilciclohexilo y metilfenilo; n es un número entero que oscila entre 1 y 30; Y es un radical seleccionado entre -COOH, un radical fosforamidito sustituido y N-hidroxisuccinimido éster (u otro éster activo) del ácido carboxílico; y * representa el lugar por donde X se une a Y, son útiles en un procedimiento general para la preparación en fase sólida de derivados maleimido-oligonucleótido.
Description
Compuestos maleimido-furanilo útiles en un procedimiento general de preparación de derivados maleimido-oligonucleótido
La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología y, en particular, con la nanotecnología, la biología molecular y la terapia génica. En concreto, la presente invención se refiere a compuestos maleimido-furanilo que son útiles como intermedios en un procedimiento general de preparación en fase sólida de derivados maleimido-oligonucleótido.
ESTADO DE LA TÉCNICA
En la actualidad existe un gran interés en la identificación y desarrollo de oligonucleótidos que sean útiles en terapia y en diagnóstico. El uso de oligonucleótidos en terapia génica tiene como objetivo la inactivación de los genes implicados en el proceso de una enfermedad. Existen varias estrategias para el tratamiento con oligonucleótidos.
La terapia antisentido utiliza oligonucleótidos con la secuencia complementaria al ARNm del gen diana, lo que activa un mecanismo de silenciamiento génico. También se puede usar para alterar la transcripción del gen defectuoso modificando, por ejemplo, su patrón de edición de intrones y exones.
También se hace uso de moléculas pequeñas de ARNi para activar un mecanismo de silenciamiento génico similar al de la terapia antisentido.
Otra posibilidad es utilizar oligodesoxiribonucleótidos como un señuelo para los factores que se requieren en la activación de la transcripción de los genes diana. Los factores de transcripción se unen a los señuelos en lugar de al promotor del gen defectuoso, lo que reduce la expresión de los genes diana. Además, los oligonucleótidos de ADN monocatenario han sido utilizados para dirigir el cambio de una única base dentro de la secuencia de un gen mutante.
Por otro lado, en el diagnóstico se emplean fragmentos de ácidos nucleicos con un marcaje adecuado (tales como las sondas de ADN) para la hibridación específica a un ácido nucleico a detectar. La secuencia específica de la nueva cadena doble se visualiza con ayuda del marcaje. De este modo se pueden detectar enfermedades genéticas, cancerígenas, virales o provocadas por otros agentes patógenos.
Para las aplicaciones mencionadas más arriba, existen varias limitaciones asociadas con el direccionamiento a la célula específica, el transporte a través de la membrana celular y la estabilidad del oligonucleótido. De esta manera, cuando se administra el oligonucleótido con un fin terapéutico o diagnóstico, el resultado obtenido es a veces muy inferior al esperado, ya que o bien no llega a la célula diana, o bien no consigue atravesar la membrana o se degrada.
En los últimos años se han desarrollado protocolos con el fin de superar tales limitaciones. Estos protocolos se basan en la conjugación del oligonucleótido a una molécula que es la que dirige, de manera específica, el oligonucleótido a la célula diana, la que facilita el transporte a través de la membrana celular o la que estabiliza el oligonucleótido. Ejemplos de moléculas que se pueden usar con este fin son los péptidos de penetración celular, lípidos o poliaminas, entre otros (cf. H. Lönnberg, “Solid-phase synthesis of oligonucleotide conjugates useful for delivery and targeting of potential nucleic acids therapeutics”, Bioconjugate Chem. 2009, vol. 20, pp. 10651094; Y. Singh et al., “Chemical strategies for oligonucleotide-conjugates synthesis”, Curr. Org. Chem. 2008, vol. 12, pp. 263-290). Dichas moléculas así como los marcajes que se puedan incorporar a un oligonucleótido se refieren, de aquí en adelante, como “agentes”.
En el estado de la técnica se conocen numerosos protocolos mediante los cuales se conjugan oligonucleótidos a agentes del tipo indicado más arriba. En la mayoría de estos protocolos, una de las etapas consiste en derivatizar el oligonucleótido con un grupo funcional. Esta etapa de derivatización es necesaria para poder generar, en etapas posteriores, el conjugado oligonucleótido-agente. En esta etapa de derivatización se puede usar como grupo funcional la maleimida, obteniéndose, de esta manera, derivados maleimido-oligonucleótido. La derivatización con maleimida permite la conjugación posterior de cualquier agente que incluya un grupo nucleófilo, tal como un tiol, o un dieno. Hasta la fecha, los procedimientos descritos en el estado de la técnica para la preparación de derivados maleimido-oligonucleótido tienen lugar en solución (cf. Harrison G. H. et al., “Synthesis and hybridization analysis of a small library of peptide-oligonucleotide conjugates”, Nucleic Acids Res. 1998, vol. 26, pp. 3136-3145; Zanta M. A. et al., “Gene delivery: A single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus”, Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, vol. 96, pp. 91-96). Los procedimientos descritos para la obtención de derivados maleimidooligonucleótido, al tener lugar en solución, presentan problemas de regioselectividad. Esto repercute negativamente en la pureza del derivado maleimido-oligonucleótido resultante y, a su vez, en el rendimiento de dichos procedimientos, ya que la cantidad que se acaba obteniendo del derivado se reduce al ser necesarias etapas posteriores para su purificación. El hecho de que estos procedimientos den lugar a derivados con un rendimiento y pureza bajos repercute en las etapas posteriores, en las que el oligonucleótido, funcionalizado con la maleimida, se conjuga al agente de interés (péptido, proteína, etc.) para que el oligonucleótido tenga el efecto terapéutico o diagnóstico deseado. Partiendo de una cantidad pequeña del derivado maleimidooligonucleótido, se dispone de una cantidad final del oligonucleótido con actividad terapéutica o diagnóstica muy inferior a la inicialmente esperada.
Existe por lo tanto la necesidad de proporcionar procedimientos que permitan obtener derivados maleimido-oligonucleótido con un rendimiento y pureza adecuados.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores de la presente invención han desarrollado un procedimiento general de preparación de derivados maleimido-oligonucléotido en fase sólida que es regioselectivo. Este procedimiento comprende, en una primera etapa, el acoplamiento de un grupo maleimido a un oligonucleótido de interés (por tener una aplicación nanotecnológica, diagnóstica o terapéutica deseada), que se encuentra inmovilizado sobre un soporte sólido. Los investigadores han comprobado que cuando el grupo maleimido se encuentra protegido por una porción furanilo, formando de esta manera un nuevo compuesto maleimido-furanilo, la etapa de acoplamiento es regioselectiva.
Como consecuencia, el procedimiento general es automatizable, transcurre con rendimientos elevados y permite obtener, al final del procedimiento, un derivado maleimido-oligonucleótido de alta pureza.
Una segunda etapa del procedimiento general de preparación de derivados maleimido-oligonucleótido de la invención es la liberación del derivado oligonucleotídico, del soporte. En este sentido, los inventores han encontrado que el compuesto maleimido-furanilo tiene que estar sustancialmente en configuración exo ya que, a diferencia del isómero endo, el isómero exo es estable en las condiciones en las que el oligonucléotido se libera del soporte.
Adicionalmente, los inventores de la presente invención han encontrado que usando el compuesto maleimido-furanilo de la invención, el cual se caracteriza por comprender grupos metilo en las posiciones 2 y 5 de la porción furanilo, se puede llevar a cabo la reacción de tipo retro-Diels-Alder en unas condiciones más suaves. Esta reacción es la última etapa del procedimiento general de la invención y se lleva a cabo para obtener finalmente el derivado maleimido-oligonucleótido de interés.
Por todo lo anterior, el compuesto maleimido-furanilo diseñado por los investigadores de la presente invención es un intermedio clave en el procedimiento general de la invención.
Así, un primer aspecto la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) sustancialmente en configuración exo, o una sal del mismo:
H
(I)
donde:
X es un birradical seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- (CH2)n-* , -(CH2CH2O)nCH2CH2-* ,
CH2
y
;
*
CH2
*
n es un número entero que oscila entre 1 y 30; representando * el lugar por donde X se une a Y; Y es un radical seleccionado del grupo que consiste en:
representando la línea ondulada el lugar por donde Y se une a X; PG es un grupo protector de fosfato; y R1 y R2 son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan entre un radical alquilo C1-C10 y un radical morfolino.
Tal y como se ha indicado más arriba, el procedimiento general de preparación de derivados maleimido-oligonucleótido de la invención es regioselectivo. Esta regioselectividad se debe, por un lado, a que la porción maleimida se encuentra protegida por la porción furanilo y, por otro lado, a que el procedimiento de derivatización se lleva a cabo en fase sólida.
El compuesto de fórmula (I) según el primer aspecto de la invención se caracteriza por tener la porción maleimida protegida con una porción furanilo. De esta manera, cuando se hace reaccionar el compuesto de fórmula (I) con el oligonucleótido (con el fin de derivatizarlo), la reacción tiene lugar por un único punto de la porción maleimida (i.e., por el radical Y del compuesto de fórmula (I)), evitando así reacciones secundarias debidas a la existencia de reactividad en otras posiciones de la porción maleimida.
Adicionalmente, el hecho de que el oligonucleótido se encuentre inmovilizado en el soporte ayuda a que la derivatización tenga lugar por el punto deseado del oligonucleótido. La regioselectividad de la etapa de derivatización se puede mejorar si el oligonucleótido, que se encuentra inmovilizado en el soporte sólido, tiene los grupos reactivos (i.e., fosfatos, OH y grupos amino exocíclicos de las bases) bloqueados, excepto el grupo reactivo del oligonucleótido por donde se pretende que tenga lugar la reacción de derivatización con el compuesto de fórmula (I). Para el bloqueo de los grupos hidroxilo, grupos fosfato y grupos amino exocíclicos se pueden usar grupos protectores bien conocidos en el estado de la técnica.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de preparación del compuesto de fórmula (I) definido en el primer aspecto de la invención en el que Y es -COOH, que comprende las etapas de: (a) llevar a cabo una reacción Diels-Alder entre un compuesto de fórmula (II) y un compuesto de fórmula (III),
(II) (III)
donde X es según se ha definido más arriba, y (b) llevar a cabo un tratamiento del compuesto obtenido en la etapa (a) con una base nucléofila para aislar el compuesto de fórmula (I).
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de preparación del compuesto de fórmula (I) definido en el primer aspecto de la invención en el que Y es
O PG
OP
R1
N
R2
donde la línea ondulada, PG, R1 y R2 son según se definen más arriba, que comprende la reacción de un compuesto de fórmula (IV) con un compuesto de fórmula (V):
O
O CH3
PG ZP
O
OHNX
R1
N
H3C
H O R2H
en un disolvente aprótico y en condiciones anhidras,
donde Z se selecciona entre halógeno y diisopropilamino, y X es según se ha definido
más arriba.
15 En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de preparación en fase sólida de un derivado maleimido-oligonucleótido de fórmula (VI),
O
N X Y' oligonucleótido
O
(VI)
25 donde X es según se define en el primer aspecto de la invención, y Y’ se selecciona entre
PGO
–CO- # y
#OP
O donde la línea ondulada representa el lugar por donde Y’ se une a X, # representa el lugar por donde Y’ se une al oligonucleótido y PG es según se define más arriba; el procedimiento comprendiendo las siguientes etapas: (a) acoplar el compuesto de fórmula (I) del primer aspecto de la invención a un oligonucleótido que se encuentra inmovilizado en un soporte sólido, para obtener el compuesto de fórmula (VII)
O
O CH3
N X Y' oligonucleótido
HH3C O
H (VII)
donde P es el soporte sólido, (b) liberar el compuesto de fórmula (VII), resultante de la etapa (a), del soporte sólido para dar lugar al compuesto de fórmula (VIII);
H
(VIII)
y (c) someter el compuesto de fórmula (VIII) a una reacción retro-Diels-Alder, de manera que se obtiene el derivado de fórmula (VI).
Como ya se ha indicado más arriba, el compuesto de fórmula (I) y el hecho de que el acoplamiento al oligonucleótido tenga lugar en fase sólida confieren regioselectividad al procedimiento de preparación del cuarto aspecto de la invención.
El compuesto de fórmula (I) de la invención, dependiendo de la disposición espacial de sus átomos, puede adquirir una configuración exo o endo. De acuerdo con la presente invención, el compuesto de fórmula (I) se encuentra sustancialmente en configuración exo, lo que significa que tiene un porcentaje en isómero exo igual o superior al 95%, más preferiblemente igual o superior al 98%.
Los inventores han descubierto que el compuesto de fórmula general (I) es estable en las condiciones necesarias para obtener el compuesto (VIII) a partir del compuesto (VII). Esta estabilidad viene conferida por el hecho de que el compuesto de la invención está sustancialmente en configuración exo. Tal y como se ilustra más abajo, cuando se utiliza amoníaco, que es un reactivo frecuentemente utilizado para liberar un oligonucleótido de un soporte sólido, se observa que si se utiliza una mezcla de producto exo/endo el producto que se recupera es el correspondiente al aducto exo, mientras que la forma endo se degrada dando lugar a productos secundarios no deseados. Los resultados experimentales obtenidos permiten concluir que usando un compuesto de fórmula (I), que se encuentra sustancialmente en configuración exo, se obtiene un compuesto (VIII) más puro, ya que se minimizan los productos secundarios asociados con la degradación del isómero endo, y el rendimiento final del derivado maleimido-oligonucleótido es también mayor.
Por otro lado, los investigadores han comprobado que el hecho de que la porción furanilo esté sustituida en las posiciones 2 y 5 por grupos metilo permite llevar a cabo la reacción de tipo retro-Diels-Alder de la etapa (c) en unas condiciones más suaves. El hecho de poder trabajar en unas condiciones más suaves minimiza el riesgo de que pueda degradarse el oligonucleótido, lo cual, a su vez, contribuye a que el rendimiento del proceso sea mayor.
Como ya se ha explicado más arriba, la producción de derivados maleimidooligonucleótido es una etapa intermedia necesaria para que el oligonucleótido acabe conjugándose al agente que le confiera la especificidad celular, sea estable, o tenga la capacidad de ser transportado a través de la membrana celular (cf. Lönnberg H. et al., supra).
El hecho de que el derivado maleimido-oligonucleótido de fórmula (VI) de la presente invención se obtenga de manera regioselectiva y con un rendimiento y pureza adecuados repercute positivamente en la generación posterior de los conjugados oligonucleótido-agente (que son los que tienen la aplicación nanotecnológica, terapéutica o diagnóstica deseada). Cuanto más puro sea el derivado maleimidooligonucleótido, menos productos secundarios se obtendrán durante la conjugación del agente al derivado, lo cual repercute de manera positiva en el rendimiento final del producto oligonucleótido-agente ya que no serán necesarias etapas adicionales de purificación.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula
(VII) O
O CH3
N X Y' oligonucleótido
H3C
H
H O (VII)
donde X, Y’ y P son según se definen más arriba.
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (VIII):
O
O CH3
N X Y' oligonucleótido
H3C
H O
H
(VIII) donde X y Y’ son según se definen más arriba. DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES PARTICULARES De acuerdo con lo indicado más arriba, en un primer aspecto la invención se refiere a
un compuesto de fórmula general (I) sustancialmente en configuración exo, o a una sal del mismo. Preferiblemente, R1 y R2 son iguales.
La sal de un compuesto de fórmula (I) se obtiene en el caso que Y sea -COOH. Procedimientos de preparación de sales de ácido carboxílico son de conocimiento general para el experto en la materia.
5 En una realización preferida del primer aspecto de la invención, R1 y R2 son un
radical alquilo C1-C10. Preferiblemente, R1 y R2 son isopropilo.
El grupo protector de fosfato (PG) puede ser cualquiera de los conocidos en el
estado de la técnica (cf. Beaucage S. L. “Oligodeoxyribonucleotides synthesis.
10 Phosphoramidite approach", Capítulo 3, "Methods in Molecular Biology", volumen 20, "Protocols for oligonucleotides and analogues", Ed. Agrawal S., Humana Press, 1993, pp. 41 y 43). En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el grupo protector de fosfato se selecciona del grupo que consiste en -CH2CH2CN, metilo, 2ciano-1,1-dimetiletilo y p-nitrofeniletilo.
15 En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, X es -(CH2)n-* o -(CH2CH2O)nCH2CH2-*, teniendo * el mismo significado que en el primer aspecto de la invención. Preferiblemente, n oscila de 1-20, más preferiblemente de 1-10.
20 En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, Y es –COOH ó
O PG
O P
R1
N
25 R2
teniendo la línea ondulada, PG, R1 y R2 el mismo significado que en el primer aspecto de la invención.
30 En todavía aún otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el compuesto se selecciona entre los de fórmulas (Ia) y (Ib).
O
H
(Ia)
(Ib)
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula (I) en el que Y es –COOH.
En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, la etapa (b) de tratamiento con la base nucleófila comprende las subetapas: (b1) poner en contacto el compuesto obtenido en la etapa (a) con una base nucleófila a temperatura ambiente; (b2) eliminar la base; (b3) acidificar el medio resultante a un pH igual o inferior a 3; y (b4) aislar el producto resultante. Preferiblemente, el medio resultante se acidifica a un pH de 1-2. Preferiblemente, la base nucleófila se selecciona entre amoníaco, una amina primaria y una amina secundaria. Más preferiblemente, la base nucleófila de la etapa (b) es amoníaco.
En otra realización preferida del segundo aspecto de la invención, la etapa (b) de tratamiento con una base nucleófila del procedimiento puede repetirse las veces que sean necesarias para alcanzar la proporción en isómero exo deseada.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula (I) en el que Y es
O PG
OP
R1
N
R2
donde la línea ondulada, PG, R1 y R2 son según se definen en el primer aspecto de la invención.
En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, Z es cloro o diisopropilamino.
En otra realización del tercer aspecto de la invención, cuando Z es cloro, la reacción entre el compuesto de fórmula (IV) y (V) tiene lugar en presencia de una amina terciaria.
En otra realización del tercer aspecto de la invención, cuando Z es diisopropilamino, la reacción entre el compuesto de fórmula (IV) y (V) tiene lugar en presencia de un tetrazol.
Compuestos de fórmula (I) en los que Y es
teniendo la línea ondulada el mismo significado que en el primer aspecto de la
invención, se pueden obtener de acuerdo con el esquema de reacción adjunto.
O
O OO CH3
OH
+
N HON
H3C H O OH
temperatura ambiente carbodiimida
THF durante una noche
OO
O
O CH3 ON
N
H3C HO
OH
En un cuarto aspecto, la invención proporciona un procedimiento para preparar un maleimido-oligonucleótido de fórmula (VI), según se ha indicado más arriba.
El soporte sólido para llevar a cabo el procedimiento puede ser cualquiera de los conocidos en el estado de la técnica que sea adecuado para el ensamblaje de oligonucleótidos. A modo de ejemplo ilustrativo y no limitativo, el soporte puede estar compuesto de silicatos, sílice, poliestireno o redes poliméricas misceláneas. Entre los primeros cabe destacar los soportes de vidrio de tamaño de poro controlado (“CPG”) que presentan las ventajas adicionales de resistencia mecánica, accesibilidad de los grupos funcionales independiente de la elección del disolvente orgánico y posibilidad de variar la porosidad del soporte.
El oligonucleótido inmovilizado en el soporte sólido puede ser cualquiera que sea de interés para el experto en la materia ya sea por tener una aplicación nanotecnológica, terapéutica o diagnóstica. Así, el oligonucleótido inmovilizado en el soporte sólido puede ser ADN o ARN natural. Opcionalmente, los nucleótidos que constituyen el oligonucleótido pueden estar modificados. Estas modificaciones se pueden encontrar en la porción azúcar, base y/o fosfato. Son bien conocidos en el estado de la técnica procedimientos para llevar a cabo tales modificaciones. Ejemplos ilustrativos y no limitativos de oligonucleótidos con azúcares modificados son aquellos en los que el azúcar se ha reemplazado por una porción morfolino, derivados LNA (“Locked nucleic acid”), 2’-OMe o 2’-F; ejemplos ilustrativos y no limitativos de bases modificadas son 5-Me-dC, 5-propinil-dC, desazanucleobases, 5-Me-U, 5-Br-U y 2-aminopurina; y ejemplos ilustrativos y no limitativos de fosfatos modificados son Me-fosfonatos, fósforotioatos y fosforamidatos.
La etapa (a) del procedimiento del cuarto aspecto de la invención se puede llevar a cabo en presencia de cualquiera de los agentes de acoplamiento que se usan habitualmente en la síntesis de péptidos. En una realización preferida del procedimiento del cuarto aspecto de la invención, la etapa (a) se lleva a cabo en presencia del agente de acoplamiento 4-nitrobencenosulfonato de pentafluorofenilo y del catalizador 1-hidroxibenzotriazol.
En el momento de llevar a cabo la etapa (a) del procedimiento del cuarto aspecto de la invención, el oligonucleótido se encuentra inmovilizado en el soporte sólido por su extremo 3’ ó 5’. Dicho oligonucleótido puede haber sido sintetizado in situ, siguiendo protocolos bien establecidos y que son rutinarios para el experto en la materia, el cual podrá determinar las condiciones de reacción adecuadas (tales como grupos protectores, condiciones de activación, etc.) para generar el oligonucleótido de interés (cf. Beaucage S. L. “Oligodeoxyribonucleotides synthesis. Phosphoramidite approach", Capítulo 3, Methods in Molecular Biology, volumen 20: "Protocols for oligonucleotides and analogues", Ed. Agrawal S., Humana Press 1993, pp. 33-61). Una alternativa sería inmovilizar el oligonucleótido obtenido mediante otros medios (por ejemplo se puede haber aislado a partir de una librería genómica), sobre el soporte.
Cuando tiene lugar la etapa (a) del procedimiento del cuarto aspecto de la invención, la derivatización del oligonucleótido tiene lugar entre el radical Y del compuesto de fórmula (I) del primer aspecto de la invención y un grupo -OH o –NH2 libre del oligonucleótido.
Para obtener un oligonucleótido con un grupo –NH2 libre, se incorpora, al oligonucleótido, un aminoalcohol (cualquiera de los disponibles comercialmente) en el que el grupo -NH2 está protegido con un grupo protector (por ejemplo, monometoxitritilo (MMT)) y el grupo –OH está derivatizado como un grupo fosforamidito, mediante cualquiera de los procedimientos que son bien conocidos en el estado de la técnica. A continuación, se elimina el grupo protector del grupo amino, de manera que el grupo –NH2 libre ya puede reaccionar con el radical Y del compuesto de fórmula (I).
Teniendo en cuenta el significado de Y, la derivatización que tiene lugar en la etapa
(a) se puede dar como sigue:
a) cuando Y es –COOH ó
la derivatización tiene lugar con un grupo –NH2 libre del oligonucleótido, generándose un enlace amida (cf. Montalbetti C. A. G. N. et al., “Amide bond formation and peptide coupling”, Tetrahedron 2005, vol. 61, pp. 10827-10852). De esta manera, Y, tras la derivatización, se convierte en Y’= -CO-; y
b) cuando Y es
O PG
OP
R1
N
R2
la derivatización tiene lugar con un grupo –OH libre del oligonucleótido, generándose un grupo fosfotriéster (cf. Beaucage, S. L. et al., “Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach”, Tetrahedron 1992, vol. 48, pp. 2223-2311). De esta manera, Y, tras la derivatización, se convierte en una Y’
PG
O
# O OP
El grupo –OH o –NH2 a través del cual tiene lugar la derivatización puede encontrarse en el extremo 5’, 3’ o en un nucleótido no terminal, es decir que no se encuentre ocupando la posición terminal (5’ ó 3’) en el oligonucleótido.
Es preferible que el oligonucleótido presente todos los grupos reactivos –OH y –NH2 modificados químicamente, a excepción del grupo –OH o –NH2 a través del cual se desea que tenga lugar la reacción de derivatización de la etapa (a). Así se mejora la regioselectividad de la etapa, ya que el compuesto de fórmula (I) únicamente podrá reaccionar con el –OH/-NH2 libre (es decir, con el –OH/-NH2 no modificado químicamente). Dependiendo de la modificación que se lleve a cabo en los nucleótidos que formen el oligonucleótido, la derivatización con el compuesto de fórmula (I) tendrá lugar en una posición u otra.
A modo ilustrativo y no limitativo, se puede sintetizar en fase sólida un oligonucleótido usando nucleósidos que presentan un grupo fosforamidito. A partir de aquí, se podrían dar diferentes escenarios dependiendo de dónde presenten el grupo fosforamidito: (a) usando nucleósidos 3’-fosforamidito (cf. Beaucage S. L. 1993, supra; Brown T. et al., “Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis”, Capítulo 1, "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", Ed. Eckstein F., Oxford University Press, 1991, pp. 1-24) la derivatización podría tener lugar por el extremo 5’ del oligonucleótido resultante, que es el quedaría libre; y (b) usando nucleósidos 5’-fosforamidito (cf. Beaucage S. L. 1993, supra), la derivatización podría tener lugar por el extremo 3’ del oligonucleótido resultante, que es el que quedaría libre.
Se pueden obtener oligonucleótidos con la maleimida de fórmula (I) unida a una base
- o un azúcar, empleando para su síntesis derivados nucleosídicos con la porción base
- o azúcar convenientemente modificada. Existen protocolos bien establecidos en el estado de la técnica para modificar las regiones reactivas de los nucleótidos que
constituyen un oligonucleótido (cf. Herdewijn P., “Heterocyclic modifications of oligonucleotides and antisense technology”, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2000, vol. 10, pp. 297-310; Cobb A. J. A., “Recent highlights in modified oligonucleotide chemistry”, Org. Biomol. Chem. 2007, vol. 5, pp. 3260-3275; Venkatesan N. et al.,“Novel phosphoramidite building blocks in synthesis and applications toward modified oligonucleotides”, Curr. Med. Chem. 2003, vol. 10, pp. 1973-1991).
Una vez se genera el compuesto de fórmula (VII) (i.e., una vez ha tenido lugar la derivatización del oligonucleótido), éste se libera del soporte usando cualquiera de los protocolos bien establecidos en el estado de la técnica. El experto en la materia podrá escoger cualquiera de estos protocolos siempre que las condiciones de reacción utilizadas no degraden el compuesto de fórmula (VII) generado en la etapa (a). En una realización preferida, el compuesto de fórmula (VIII) se libera del soporte de fase sólida añadiendo una base nucleófila. Ejemplos ilustrativos y no limitativos de bases nucleófilas son el amoníaco, las aminas primarias y las aminas secundarias. Preferiblemente, la base nucleófila es amoníaco.
Las condiciones en las que tienen lugar tanto la Diels-Alder del procedimiento del segundo aspecto de la invención, como la retro-Diels-Alder del procedimiento del cuarto aspecto de la invención son bien conocidas para el experto en la materia. Preferiblemente, la reacción retro-Diels-Alder se lleva a cabo con microondas a una temperatura comprendida entre 80-100 ºC.
Alternativamente, la reacción retro-Diels-Alder mediante la cual el compuesto de fórmula (VIII) da lugar al derivado maleimido-oligonucleótido de fórmula (VI) según la etapa (c) del procedimiento de preparación del derivado maleimido-oligonucleótido de fórmula (VI) indicado anteriormente, puede llevarse a cabo por adición de un hidrocarburo aromático (C6-C8) al producto resultante de la etapa (b), seco (este producto puede secarse por coevaporación con el mismo hidrocarburo aromático), y calentamiento a una temperatura comprendida entre 80-100 ºC. Preferiblemente el hidrocarburo aromático utilizado en la reacción es el tolueno. Preferiblemente, la reacción se lleva a cabo a unos 90 ºC. Generalmente, el tiempo de reacción oscila entre 2 y 5 horas.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Preparación del ácido 3-(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-azatriciclo[5.2.1.02,6] dec-8-en-4-il)propanoico (Ia)
Se pesaron 100 mg (0,59 mmol) de ácido 3-maleimido propiónico y se disolvieron en 2 ml de acetonitrilo. Seguidamente, se adicionaron 400 !l de 2,5-dimetilfurano (3,72 mmol) y el conjunto se calentó a 60 oC con agitación constante durante 6 h. Transcurrido este tiempo se eliminó el disolvente a presión reducida, obteniéndose el compuesto Ia como un aceite ocre de forma cuantitativa. El producto se caracterizó por ESI-MS (modo negativo) y 1H-RMN. La proporción de los diastereómeros exo/endo del aducto de Diels-Alder formado, determinada a partir de la integración de las áreas de las señales de los CH olefínicos (∀ 6,30 ppm para el aducto exo y ∀ 6,19 ppm para el aducto endo) en el espectro 1H-RMN, fue: 78:22. Para la integración de las áreas se usó el software MestRe-C.
1H-RMN (CDCl3, 400 MHz): aducto exo: ∀ 6,30 (s, 2H), 3,79 (t, J= 7,3 Hz, 2H) 2,83 (s, 2H), 2,67 (t, J= 7,3 Hz, 2H), 1,70 (s, 6H) ppm; aducto endo: ∀ 6,19 (s, 2H), 3,64 (t, J=
7,3 Hz, 2H) 3,22 (s, 2H), 2,54 (t, J= 7,3 Hz, 2H), 1,78 (s, 6H) ppm. ESI-MS (modo negativo) m/z 263,83 [M-H]-(M calc: 265,10).
A continuación, se pesaron 100 mg (0,38 mmol) de la mezcla exo/endo 78:22 del ácido Ia y se disolvieron en 4 ml de solución acuosa concentrada de amoníaco al 32% (44 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente y en agitación durante una noche. Posteriormente, se eliminó el amoníaco a presión reducida y la solución acuosa obtenida se acidificó con ácido trifluoroacético hasta pH 1-2. Inmediatamente después se extrajo la solución acuosa con diclorometano (3 # 10 ml). La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio anhidro. Después se filtró el sólido y se eliminó el disolvente hasta sequedad. Se aisló el ácido Ia con un rendimiento del 90 %. El producto se caracterizó por 1H-RMN. El espectro obtenido fue el mismo que el indicado en el párrado anterior, si bien las áreas de los picos eran diferentes. A continuación, se determinó la proporción de diastereómeros del producto mediante la integración de las áreas de las señales de los CH olefínicos en el espectro 1H-RMN (∀ 6,30 ppm para el aducto exo y ∀ 6,19 ppm para el aducto endo) usando el software MestRe-C. Así, se determinó que la proporción exo/endo era 98:2.
Ejemplo 2: Preparación de 3-(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-aza-triciclo[5.2.1.02,6]dec8-en-4-il)propanoil-NH-(CH2)6-O-(PO)(OCNE)-5'O-[dT10 protegida]-succinil-CPG.
La síntesis de la cadena oligonucleotídica modificada en su extremo 5' con un grupo amino (protegido) se llevó a cabo en condiciones estándar siguiendo el método fosfito triéster, en un sintetizador ABI 3400 y a la escala de 1 !mol. Se utilizaron los fosforamiditos comerciales 5’-DMT-dT (0,1 M) y MMT-amino-C6 (0,15 M), así como el soporte sólido estándar CPG funcionalizado con el primer nucleósido.
El grupo protector monometoxitritilo (MMT) del grupo amino se eliminó mediante tratamientos sucesivos con solución destritilante hasta la desaparición del color amarillo intenso característico del catión MMT. A continuación, se lavó la resina con diclorometano.
Para el acoplamiento del ácido Ia a 0,5 !mol de oligonucleotidil-resina se pesaron 1,7 mg (6,4 !mol) del ácido 1, 2,7 mg (7,3 !mol) del agente acoplante PFNB (4nitrobencenosulfonato de pentafluorofenilo) y 1,0 mg (7,4 !mol) de 1hidroxibenzotriazol (HOBt). Se disolvió el conjunto en 100 !l de solución 0,8 M de LiCl en N-metilpirrolidinona/N,N-dimetilformamida 1:1 (v/v). Inmediatamente después, se añadió a la disolución 5,0 !L de N,N-diisopropiletilamina (DIEA) (29,4 !mol) y la mezcla se dejó en agitación y a temperatura ambiente durante 15 minutos para asegurar una buena activación del ácido Ia. Transcurrido este tiempo, se adicionó al reactor que contenía la resina. La resina se dejó muy bien tapada para evitar la pérdida de reactivos y en agitación constante durante 6 h. Pasado este tiempo se filtró y se eliminó el exceso de reactivos lavando con N,N-dimetilformamida (3 # 5 ml), diclorometano (3 # 5 ml) y metanol (3 # 5 ml). La resina se secó mediante corriente de argón.
Ejemplo 3: Preparación de 3-(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-aza-triciclo[5.2.1.02,6]dec8-en-4-il)propanoil-NH-(CH2)6-O-(PO2-)-5'O-dT10.
H
Se introdujeron 0,3 !mol de 3-(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-aza-triciclo[5.2.1.02,6]dec-8-en-4-il)propanoil-NH-(CH2)6-O-(PO)(OCNE)-5'O-[ dT10 protegida]-succinil-CPG en un vial con tapón de rosca y se añadieron 300 !L de solución acuosa concentrada de amoníaco (32%). Tras 90 min de reacción a temperatura ambiente, se filtró, se lavó la resina con agua, y se eliminó el amoníaco del filtrado a presión reducida. La solución acuosa resultante se congeló y liofilizó.
Cuando el experimento descrito en el ejemplo 2 se llevó a cabo con una mezcla de los dos diastereómeros de Ia en proporción exo/endo 78:22, el análisis por HPLC en fase reversa (C18) del crudo de desanclaje mostró dos picos con tiempos de retención de 15,1 min (23%) y 17,8 min (77%), respectivamente (condiciones de análisis: 5 a 60% de B en 30 min, A: TEAA 0,05 M (TEAA=acetato de trietilamonio) y
B: acetonitrilo/agua 1:1, v/v). Los dos productos se colectaron y analizaron por ESI-MS (modo negativo). El producto de tiempo de retención 17,8 min (77%) correspondía al oligonucleótido deseado (m/z 3406, M calc 3407), y el de tiempo de retención 15,1 min (23%) correspondía al mismo oligonucleótido con la imida hidrolizada (m/z 3424, M calc. 3425).
En cambio, cuando el experimento descrito en el ejemplo 2 se lleva a cabo con Ia sustancialmente en configuración exo (exo) el análisis por HPLC en fase reversa del crudo de desanclaje muestra que el producto deseado (tiempo de retención 17,8 min) se encuentra en un 97 %. Los resultados indican que sólo el aducto exo se mantiene estable al tratamiento con amoníaco, y no el aducto endo. En consecuencia, se obtiene el aducto exo del oligonucleótido modificado con la maleimida protegida.
El producto se purificó mediante HPLC semipreparativa (columna Phenomenex (C18), 250x10 mm, 10 !m, condiciones de análisis: 5 a 60% de B en 30 min, A: TEAA 0,05 M y B: acetonitrilo/agua 1:1, v/v). Se obtuvo el oligonucleótido modificado en 5’ (aducto exo), ESI-MS (modo positivo): m/z 3405,72 [M+H]+ (M calc 3404,66).
Ejemplo 4: Preparación de 5'-maleimido-oligonucleótido (dT10) En un vial de microondas con capacidad de 200-500 !l se introdujeron 200 !l de una disolución 2,46 x 10-2 mM de 3-(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-azatriciclo[5.2.1.02,6]dec-8-en-4-il)propanoil-NH-(CH2)6-O-(PO2-)-5'O-dT10 en metanol/agua
1:1 (v/v). A continuación, se sometió la solución a irradiación con microondas durante 60 min a 90 oC.
El análisis del crudo por HPLC mostró dos picos con tiempos de retención de 15,9 min (73%) y 17,7 min (27%), respectivamente (condiciones de análisis: 5 a 60% de B en 30 min, A: TEAA 0,05 M y B: acetonitrilo/agua 1:1 v/v). El análisis por ESI-MS (modo negativo) de los productos anteriores puso de manifiesto que el pico con tiempo de retención de 15,9 min correspondía al oligonucleótido funcionalizado en el extremo 5’ con un grupo maleimido (m/z 3309, M calc 3310), y el pico con tiempo de retención de 17,8 min correspondía a producto de partida en el que la maleimida no se había desprotegido.
Ejemplo 5: Preparación de [2-(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-azatriciclo [5.2.1.02,6]dec-8-en-4-il)-etil](N,N-diisopropil)(2-cianoetil)fosforamidito (Ib)
a) N-(2-hidroxietil)maleimida.
N CH2CH2OH
La N-(2-hidroxietil)maleimida se preparó de acuerdo con lo descrito en Heath W. H. et al., “Degradable cross-linkers and strippable imaging materials for step-and-flash imprint lithography”, Macromolecules 2008, vol. 41, pp. 719-726.
b) 4-(2-hidroxietil)-1,7-dimetil-10-oxa-4-azatriciclo[5.2.1.02,6]dec-8-en-3,5-diona, isómero exo.
H
Una mezcla de N-(2-hidroxietil)maleimida (800 mg, 5,67 mmol), 2,5-dimetilfurano (3,2 ml, 30,1 mmol) y acetonitrilo (13 ml) se calentó a 65 oC durante una noche en atmósfera de argón. Pasado este tiempo la mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y se evaporó a sequedad, dando un aceite. El producto se caracterizó por 1H-RMN. A continuación se determinó la proporción de diastereómeros exo/endo del producto mediante la integración de las áreas de las señales de los CH olefínicos en el espectro 1H-RMN (∀ 6,32 ppm para el aducto exo y ∀ 6,23 ppm para el aducto endo) usando el software MestRe-C. Así, se determinó que la proporción relativa de los isómeros exo/endo era de 4:1.
1H-RMN (CDCl3, 400 MHz) aducto exo: ∀ 6,32 (s, 2H), 3,76 (t, J=4,5 Hz, 2H), 3,70 (t, J=4,5 Hz, 2H), 2,87 (s, 2H), 1,71 (s, 6H) ppm; aducto endo: ∀ 6,23 (s, 2H), 3,74 (t, J=4,5 Hz, 2H), 3,57 (t, J=4,5 Hz, 2H), 3,26 (s, 2H), 1,79 (s, 6H) ppm.
A continuación, se trataron 500 mg de la mezcla 4:1 de los isómeros exo y endo de 2(2,5-dimetilfurilmaleimidil)etanol con 25 ml de una disolución acuosa concentrada de amoníaco (32 %) durante una noche. Pasado este tiempo, se eliminó el amoníaco en el rotavapor, concentrándose la muestra hasta un volumen de unos 5 ml. Esta disolución acuosa se diluyó con 20 ml de disolución acuosa saturada de NaCl y 5 ml de disolución acuosa de HCl al 10 %, y se extrajo con diclorometano (4 # 200 ml). El total de las fases orgánicas se secó sobre MgSO4 y se eliminó el disolvente en el rotavapor. El producto se caracterizó por 1H-RMN. Los picos del espectro obtenido eran los característicos de la forma exo concluyéndose, de esta manera, que el aceite resultante (340 mg) contenía exclusivamente el isómero exo del 4-(2-hidroxietil)-1,7dimetil-10-oxa-4-azatriciclo[5.2.1.02,6]dec-8-en-3,5-diona.
c) [2-(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-azatriciclo[5.2.1.02,6]dec-8-en-4-il)-etil](N,N
diisopropil)(2-cianoetil)fosforamidito (Ib)
(Ib)
350 mg del producto obtenido en el apartado (b) anterior (1,48 mmol) se secaron mediante coevaporación con acetonitrilo anhidro (2 #). Tras añadir diclorometano anhidro (1 ml), trietilamina (1 ml, 7,17 mmol) y (2cianoetoxi)cloro(diisopropilamino)fosfina (360 !l, 1,55 mmol), la mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente y en atmósfera de argón durante 1 h. Pasado este tiempo, se añadieron 10 ml de diclorometano y se realizaron extracciones con disolución acuosa de NaHCO3 al 5 % (2 # 25 ml) y solución acuosa saturada de NaCl
(1 # 25 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4 y se eliminó el disolvente en el rotavapor. El análisis por 31P-RMN del producto resultante mostró la señal esperada
para un fosforamidito (∀ 148 ppm), además de pequeñas impurezas a 14 y 8 ppm. El
producto se obtuvo puro (31P-RMN: ∀ 148 ppm) tras cromatografía en columna sobre gel de sílice, eluyendo con diclorometano y un 5 % de trietilamina.
Ejemplo 6: [2-(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-azatriciclo[5.2.1.02,6]dec-8-en-4-il)-etil]
O-PO2-)-5'O-dT10
O O
O N CH2CH2O P O dT10 O
O
H
La síntesis de la cadena oligonucleotídica se llevó a cabo en condiciones estándar siguiendo el método del fosfito triéster, en un sintetizador ABI 3400 y a la escala de 1 !mol. Se utilizaron el fosforamidito comercial de 5’-DMT-dT (0,1 M) y el soporte sólido estándar CPG funcionalizado con el primer nucleósido.
Una vez efectuada la elongación de la cadena oligonucleotídica, se eliminó, en el mismo sintetizador, el protector dimetoxitritilo del extremo 5' y se incorporó el derivado fosforamidito Ib (0,13 M) utilizando la metodología que para la elongación de la cadena oligonucleotídica (doble acoplamiento, 5 min/acoplamiento) descrita en el párrafo anterior.
Una alícuota de oligonucleotidil-resina correspondiente a 0,1 !mol de oligonucleótido se introdujo en un vial con tapón de rosca y se trató con 100 !l de disolución acuosa concentrada de amoníaco durante 1 h a temperatura ambiente, tras lo cual la resina se filtró y lavó con agua. Se eliminó el amoníaco del filtrado a presión reducida. La solución acuosa resultante se congeló y liofilizó. El análisis por HPLC del crudo de desanclaje mostró un pico prácticamente único con tiempo de retención de 15,8 min (99%) (condiciones de análisis: 5 a 60% de B en 30 min, A: TEAA 0,05 M y B: acetonitrilo/agua 1:1, v/v). Este pico correspondía al oligonucleótido funcionalizado en el extremo 5’ con la maleimida protegida en configuración exo.
MALDI TOF-MS (THAP=trihidroxiacetofenona, citrato amónico, modo negativo): m/z 3276,47 (M calc 3277,56).
Ejemplo 7: 5'Maleimido-oligonucleótido (dT10).
Una disolución 12,5 !M del producto resultante del tratamiento con amoníaco ([2-(1,7dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-azatriciclo[5.2.1.02,6]dec-8-en-4-il)-etil]-O-PO2-)-5'O-dT10) en MeOH/H2O 1:1 (v/v) (200 !L) se introdujo en un vial de microondas y se irradió a 90 oC durante 90 min. Tras eliminar el metanol en el rotavapor, se llevó a cabo el análisis del crudo por HPLC. El cromatograma mostró, además de pequeñas impurezas, un pico con tiempo de retención de 15,8 min (<5 %), correspondiente al producto de partida, y un pico mayoritario con tiempo de retención de 14,3 min (85 %) correspondiente al maleimido-oligonucleótido deseado (condiciones de análisis: 5 a 60% de B en 30 min, A: TEAA 0,05 M y B: acetonitrilo/agua 1:1, v/v). MALDI TOF-MS (THAP, citrato amónico, modo negativo): m/z 3180,46 (M calc 3181,50).
Ejemplo 8: Efecto de la presencia de los grupos metilo en la posición 2 y 5 de la porción furanilo en el compuesto de fórmula (I)
Con el fin de determinar si la presencia de los grupos metilo en la porción furanilo del compuesto de fórmula (I) afectaban de alguna manera al procedimiento de preparación del derivado maleimido-oligonucleótido, se llevó a cabo la reacción retro-Diels-Alder para los compuestos (a) y (b):
HH
(a) (b) El compuesto (a) corresponde a una realización de la presente invención. El compuesto (b) se incluye a modo comparativo.
Cada uno de los compuestos se disolvió en una mezcla metanol:agua 1:1 (v/v). A partir de aquí:
- -
- para el compuesto (a) se determinó que irradiando con microondas a 80ºC durante 10 minutos se conseguía un 92% de la porción maleimida libre; y -para el compuesto (b) se determinó que irradiando con microondas a 120ºC durante 10 minutos se conseguía un 96% de la porción maleimida libre.
Para determinar la proporción de maleimida libre, se llevó a cabo un análisis HPLC en fase reversa:
A: agua + 0.045% de ácido trifluoroacético
B: CH3CN + 0.036% de ácido trifluoroacético Gradiente: de 0 a 15 % de B en 30 minutos El tiempo de retención del producto generado durante la retro-Diels-Alder fue de
10.15 minutos. A continuación se comprobó que dicho tiempo de retención correspondía con el determinado en una muestra de ácido 3-maleimidopropiónico comercial:
De los resultados obtenidos en este ensayo se puede concluir que la presencia de los grupos metilo en la porción furanilo suaviza las condiciones de la reacción retro-Diels-Alder, en comparación con las condiciones necesarias para conseguir un rendimiento del mismo orden con un derivado maleimido-furanilo en el que la porción furanilo no incluye sustituyentes metilo.
El hecho de que la retro-Diels-Alder se pueda realizar en condiciones más suaves tiene la ventaja principal de respetar la integridad del oligonucleótido que se encuentra unido al compuesto de fórmula (I) del primer aspecto de la invención, minimizando, así, el riesgo de que el oligonucleótido se degrade.
Ejemplo 9: [2-(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-azatriciclo[5.2.1.02,6]dec-8-en-4-il)-etil]O-PO2-)-5'O-oligonucleótido
Se incorporó el [2-(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-azatriciclo[5.2.1.02,6]dec-8-en-4-il)etil](N,N-diisopropil)(2-cianoetil)fosforamidito a las oligonucleotidil-resinas usando un doble acoplamiento de 5 minutos. Se omitió la etapa de bloqueo de los hidroxilos libres para permitir que el acoplamiento se repitiera si el rendimiento de dicho acoplamiento no era suficiente. Después de la oxidación, una alícuota del maleimidooligonucleótido totalmente protegido y unido aresina se trató con amoniaco acuoso concentrado a temperatura ambiente durante 1 h, y, tras eliminar el amoniaco a presión reducida el crudo se analizó por HPLC (C18). Se observó prácticamente un solo pico o un pico muy mayoritario en todos los casos. Este compuesto se recogió y se caracterizó por espectrometría de masas siendo el oligonucleótido esperado [2(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-azatriciclo [5.2.1.02,6]dec-8-en-4-il )-etil]-O-PO2-)-5'Ooligonucleótido.
Se llevó a cabo este procedimiento para obtener los siguientes oligonucleótidos (además de [maleimida protegida]-dT10, ya descrito): [maleimida protegida]5’dCAGATGTCAC, [maleimida protegida]-5’dTCTCCCAGCGTGCGCCAT, maleimida protegida]-5’dCAGCAGCAGAGTCTTCATCAT,y [maleimida protegida]-5’U10 protegido a partir de los correspondientes productos de partida. Para los tres primeros el tratamiento con amoníaco se prolongó 4 h para asegurar la desprotección de la base nucleótídica. En el caso del oligoribonucleótido (U10), una alícuota de crudo (0.1 !mol) obtenida después del tratamiento con amoníaco (3 h, temperatura ambiente) se evaporó a sequedad y se coevaporó con etanol absoluto (3#). Se añadieron DMSO (30 !L) y TEA·3HF (30 !L), y la mezcla se dejó reaccionar durante 8 h a temperatura ambiente. El reactivo que separa los grupos protectores 2'-OH se extinguió con isopropil trimetilsilil éter (120 !L, 10 min de tiempo de reacción), y el oligoribonucleótido se precipitó por adición de 1 mL de éter anhidro. La mezcla se centrifugó a 1100 rpm por min a 5 oC y se decantó el éter. La adición de éter, centrifugación y decantación se repitió dos veces. El oligoribonucleótido [maleimida protegida]-U10 resultante se secó mediante burbujeo de argon. Los crudos se analizaron por HPLC (C18). Los oligonucleótidos se purificaron por HPLC y se caracterizaron por MALDI-TOF MS.
[Maleimida protegida]-5’dCAGATGTCAC. 90 % en el crudo; tR =13.7 min; m/z 3309.8 [M-H]-, M calcd. 3309.6.
[Maleimida protegida]-5’dTCTCCCAGCGTGCGCCAT. 97 % en el crudo; tR =13.8 min; m/z 5708.4 [M-H]-, M calcd. 5708.0.
[Maleimida protegida]-5’dCAGCAGCAGAGTCTTCATCAT. 86 % en el crudo; tR =14.3 min: m/z 6684.5 [M-H]-, M calcd. 6686.2.
[Maleimida protegida]-5’U10 protegido. 75 % en el crudo; tR = 14.0 min; m/z 3297.7 [M-H]-, M calcd. 3297.4.
Ejemplo 10: 5'maleimido-oligonucleótidos
Desprotección promovida por microondas Se introdujo una solución de ([2-(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-azatriciclo [5.2.1.02,6]dec-8-en-4-il)-etil]-O-PO2)-5'O-oligonucleótido en una mezcla 1:1 (v/v) MeOH/H2O (25 !M, 500-1000 !L) en un vial para microondas y se irradió durante 90 min a 90 oC. El disolvente se eliminó bajo vacío (rotavapor) y el crudo resultante se disolvió en agua y se analizó por HPLC (C18).
Este procedimiento se llevó a cabo para preparar los maleimido-oligonucleótidos siguientes (además de maleimido-5’dT10, ya descrito): maleimido-5’dCAGATGTCAC), maleimido-5’dTCTCCCAGCGTGCGCCAT), maleimido-5’dCAGCAGCAGAGTCTTCATCAT), maleimido-5’U10) a partir de los materiales correspondientes de partida.
Desprotección mediante calefacción en tolueno
Una solución de ([2-(1,7-dimetil-3,5-dioxo-10-oxa-4-azatriciclo [5.2.1.02,6] dec-8-en-4il)-etil]-O-PO2)-5'-O-oligonucleótido se introdujo en un vial y se evaporó a sequedad (rotavapor). El residuo resultante se secó por coevaporación con tolueno (2 #), y se añadió tolueno (la cantidad que se necesitaría para obtener una solución de 25 !M, si fuera el oligonucleótido soluble en tolueno). Esta mezcla se calentó durante 3 horas, tras lo cual se eliminó el tolueno a presión reducida. El crudo resultante de maleimido5’oligonucleótido se disolvió en agua y se analizó por HPLC (C18).
Este procedimiento se llevó a cabo para preparar los siguientes maleimidooligonucleótidos: maleimido-5’dCAGATGTCAC), maleimido-5’dTCTCCCAGCGTGCGCCAT) y maleimido-5’dCAGCAGCAGAGTCTTCATCAT) a partir de los materiales correspondientes de partida.
Los maleimido-oligonucleótidos (soluciones acuosas de los crudos) se analizaron por HPLC (C18). La caracterización se llevó a cabo por espectrometría de masas (MALDI-TOF MS).
Maleimido-5'dT10 : retro Diels-Alder promovida por microondas. Rendimiento: 97 %; tR=
14.3 min; m/z 3180.5 [M-H]-, M calc 3181.5.
Maleimido-5’dCAGATGTCAC: retro Diels-Alder promovida por microondas, rendimiento: 96 %; retro Diels-Alder en tolueno, rendimiento: 99 %; tR= 11.9 min; m/z 3213.7 [M-H]-, M calcd. 3213.5.
5 Maleimido-5’dTCTCCCAGCGTGCGCCAT: retro Diels-Alder promovida por microondas, rendimiento: 96 %; retro Diels-Alder en tolueno, rendimiento cuantitativo; tR= 13.8 min; m/z 5611.2 [M-H]-, M calcd. 5611.9.
Maleimido-5’dCAGCAGCAGAGTCTTCATCAT: retro Diels-Alder promovida por 10 microondas, rendimiento: 95 %; retro Diels-Alder en tolueno, rendimiento: 94 %; tR=
Maleimido-5’U10 retro Diels-Alder promovida por microondas, rendimiento: 92 %; tR=
11.8 min; m/z 3201.6 [M-H]-, M calcd. 3201.3. 15
Claims (16)
- REIVINDICACIONES1. Compuesto de fórmula (I) sustancialmente en configuración exo, o una sal del mismo:H(I)donde:X es un birradical seleccionado del grupo que consiste en: -(CH2)n-* , -(CH2CH2O)nCH2CH2-* ,CH2*CH2*y;n es un número entero que oscila entre 1 y 30; representando * el lugar por donde X se une a Y; Y es un radical seleccionado del grupo que consiste en: O OO PG
- -
- COOH,
OP y;R1 ONNR2Orepresentando la línea ondulada el lugar por donde Y se une a X; PG es un grupo protector de fosfato; yR1 y R2 son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan entre un radical alquilo C1-C10 y un radical morfolino. - 2. Compuesto según la reivindicación 1, donde R1 y R2 son radicales alquilo C1-C10.5 3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde PG se selecciona del grupo que consiste en -CH2CH2CN, metilo, 2-ciano-1,1-dimetiletilo y pnitrofeniletilo.
- 4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde X es -(CH2)n-* o 10 -(CH2CH2O)nCH2CH2-*, teniendo * el mismo significado que en la reivindicación 1.
- 5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde Y es -COOH óO PGOPR1NR2teniendo la línea ondulada, PG, R1 y R2 el mismo significado que en la reivindicación20 1.
- 6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que se selecciona entre los de fórmulas (Ia) y (Ib).OH 30 (Ia)(CH2)2CNOOO CH3OP NNH3C H OH (Ib)
- 7. Procedimiento de preparación del compuesto de fórmula (I) definido en la reivindicación 1 en el que Y es -COOH, que comprende las etapas de:(a) llevar a cabo una reacción Diels-Alder entre un compuesto de fórmula (II) y un compuesto de fórmula (III),(II) (III)donde X tiene el mismo significado que en la reivindicación 1, y(b) llevar a cabo un tratamiento del compuesto obtenido en la etapa (a) con una base nucléofila para aislar el compuesto de fórmula (I).
-
- 8.
- Procedimiento según la reivindicación 7, donde la etapa (b) de tratamiento con la base nucleófila comprende las subetapas: (b1) poner en contacto el compuesto obtenido en la etapa (a) con una base nucleófila a temperatura ambiente; (b2) eliminar la base; (b3) acidificar el medio resultante a un pH igual o inferior a 3; y (b4) aislar el producto resultante.
-
- 9.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde la base nucleófila se selecciona entre amoníaco, una amina primaria y una amina secundaria.
-
- 10.
- Procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula (I) definido en la reivindicación 1 en el que Y es
O PGOPR1NR2donde la línea ondulada, PG, R1 y R2 tienen el mismo significado que en la reivindicación 1,que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IV) con un compuesto de fórmula (V):PGOOO CH3ZPR1OH NNXR2H3C H OH(IV) (V)en un disolvente aprótico y en condiciones anhidras, donde Z se selecciona entre halógeno y diisopropilamino , y X tiene el mismo significado que en la reivindicación 1. - 11. Procedimiento de preparación en fase sólida del derivado maleimidooligonucleótido de fórmula (VI),N X Y' oligonucleótido(VI)donde X tiene el mismo significado que en la reivindicación 1, Y’ se selecciona entrePGO# OOP–CO-# ydonde la línea ondulada representa el lugar por donde Y’ se une a X, # representa el lugar por donde Y’ se une al oligonucleótido, y PG tiene el mismo significado que en la reivindicación 1;el procedimiento comprendiendo las siguientes etapas:(a) acoplar el compuesto de fórmula (I), definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, a un oligonucleótido que se encuentra inmovilizado en un soporte sólido, para obtener el compuesto de fórmula (VII)O O CH3 N X Y' oligonucleótidoH3C H OH(VII) donde P es el soporte sólido,(b) liberar el compuesto de fórmula (VII), resultante de la etapa (a), del soporte sólido para dar lugar al compuesto de fórmula (VIII); yO O CH3N X Y' oligonucleótidoHH3C OH (VIII) (c) someter el compuesto de fórmula (VIII) a una reacción retro-Diels-Alder, de manera que se obtiene el derivado de fórmula (VI).
-
- 12.
- Procedimiento según la reivindicación 11, donde la etapa (a) se lleva a cabo en presencia de 4-nitrobencenosulfonato de pentafluorofenilo y 1-hidroxibenzotriazol.
-
- 13.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, donde la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de una base nucleófila.
-
- 14.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde la etapa (c) se lleva a cabo con microondas a una temperatura comprendida entre 80-100 ºC.
-
- 15.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde la etapa (c) se lleva a cabo por coevaporación con un hidrocarburo aromático (C6-C8) a una temperatura comprendida entre 80-100 ºC.
-
- 16.
- Procedimiento según la reivindicación 15, donde el hidrocarburo aromático (C6-C8) es tolueno.
-
- 17.
- Compuesto de fórmula (VII)
O O CH3N X Y' oligonucleótidoH3C H OH(VII)donde X tiene el mismo significado que en la reivindicación 1, Y’ se selecciona entre# O 5 la línea ondulada representa el lugar por donde Y’ se une a X, # representa el lugar por donde Y’ se une al oligonucleótido, y P es un soporte sólido.OP–CO- # y10 18. Compuesto de fórmula (VIII)OO CH3N X Y' oligonucleótidoH3CHOH(VIII)donde 20 X tiene el mismo significado que en la reivindicación 1, Y’ se selecciona entre O PG–CO- # y#OPO PGOla línea ondulada representa el lugar por donde Y’ se une a X, y # representa el lugar por donde Y’ se une al oligonucleótido.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2403129 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20140512 |