ES2492498T3 - Panel de biomarcadores para el diagnóstico y la predicción de rechazo de injerto - Google Patents

Abstract

Un método para monitorizar una respuesta de Rechazo Agudo (RA) en un sujeto que ha recibido un aloinjerto de riñón, comprendiendo dicho método: (a) evaluar el nivel de expresión de NKTR, MAPK9, PBEF1, PSEN1 y DUSP1 en una muestra del sujeto para obtener un resultado de expresión génica; y (b) emplear el resultado de expresión génica para predecir la aparición de una respuesta de RA, diagnosticar una respuesta de RA y/o caracterizar una respuesta de RA; en el que un resultado de expresión génica de expresión disminuida de NKTR y MAPK9 y de expresión aumentada de DUSP1, PBEF1 y PSEN1 en dicha muestra del sujeto indica una respuesta de RA.

Description

DESCRIPCIÓN

Panel de biomarcadores para el diagnóstico y la predicción de rechazo de injerto

Antecedentes 5

El trasplante de un injerto de órgano o tejido de un donante a un paciente hospedador es un aspecto de determinados procedimientos médicos y protocolos de tratamiento. Pese a los esfuerzos para impedir el rechazo de injerto a través de la compatibilidad del tipo de tejido entre el hospedador y el donante, en los procedimientos de trasplante donde un órgano donante se introduce en un hospedador, generalmente se requiere terapia 10 inmunosupresora para mantener la viabilidad del órgano donante en el hospedador. Sin embargo, a pesar del amplio uso de terapia inmunosupresora, puede producirse el rechazo de trasplante de órganos.

El rechazo agudo (RA) de aloinjerto de tejido es una respuesta inmunitaria compleja que implica el reconocimiento de linfocitos T del aloantígeno en el aloinjerto, señales coestimuladoras, elaboración de moléculas efectoras por 15 linfocitos T activados, y respuesta inflamatoria dentro del injerto. La activación y el reclutamiento de leucocitos circulantes en el aloinjerto es un aspecto principal de este proceso.

La detección temprana del RA es una de las preocupaciones clínicas fundamentales en el cuidado de receptores de trasplante, incluyendo receptores de trasplante renal. La detección del RA antes de la aparición de disfunción renal 20 permite el tratamiento satisfactorio de esta afección con inmunosupresión agresiva. Del mismo modo es importante reducir la inmunosupresión en pacientes que no tienen RA para minimizar la toxicidad farmacológica.

Por consiguiente, en el campo interesan técnicas para monitorizar una respuesta de RA en un receptor de trasplante, incluyendo predicción, diagnóstico y caracterización del RA. La presente invención atiende estas y otras 25 necesidades.

Sumario de la invención

Se proporcionan métodos para monitorizar una respuesta de rechazo agudo (RA) en un sujeto que tiene un injerto 30 renal, por ejemplo, para predecir, diagnosticar y/o caracterizar una respuesta de RA, incluyendo la supervivencia del injerto en un sujeto. En la realización práctica de los métodos en cuestión, el nivel de expresión de NKTR, MAPK9, PBEF1, PSNE1 y DUSP1 en una muestra del sujeto, por ejemplo, una muestra de sangre o biopsia, se evalúa, por ejemplo, a nivel de ácido nucleico y/o proteína, para monitorizar al sujeto, donde una expresión disminuida de NKTR y MAPK9 y una expresión aumentada de DUSP1, PBEF1 y PSEN1 indican una respuesta de RA. También se 35 proporcionan kits que encuentran uso en la realización práctica de los métodos en cuestión. Los métodos encuentran uso en diversas aplicaciones.

Los aspectos de la invención en cuestión incluyen métodos para monitorizar una respuesta de rechazo agudo (RA) en un sujeto que ha recibido un aloinjerto renal que incluyen: (a) evaluar el nivel de expresión de genes en una 40 muestra del sujeto para obtener un resultado de expresión génica, donde los genes son NKTR, MAPK9, DUSP1, PBEF1 (también denominado NAMPT) y PSEN1; y (b) emplear el resultado de la expresión génica para predecir la aparición de una respuesta de RA; diagnosticar una respuesta de RA, y/o caracterizar una respuesta de RA en un sujeto, monitorizando de esta manera una respuesta de RA del sujeto, donde una expresión disminuida de NKTR y MAPK9 y una expresión aumentada de DUSP1, PBEF1 y PSEN1 indican una respuesta de RA. 45

En determinadas realizaciones, la etapa de evaluación incluye además evaluar el nivel de expresión de genes adicionales seleccionados de uno o más de: CFLAR, RNF-130, IFNGR1, ITGAX y RYBP. En determinadas realizaciones, se evalúa el nivel de expresión de los 10 genes indicados anteriormente. En determinadas realizaciones, la etapa de evaluación comprende analizar un producto de expresión de los genes en la muestra. En 50 determinadas realizaciones, el producto de expresión es un transcripto de ácido nucleico mientras que en otras realizaciones, el producto de expresión es una proteína. En determinadas realizaciones, la etapa de evaluación comprende un ensayo de RT-PCR. En determinadas realizaciones, el ensayo de RT-PCR es un ensayo de RT-PCR cuantitativo. En determinadas realizaciones, la muestra es una muestra de sangre. En determinadas realizaciones, el resultado de la expresión génica se emplea para predecir la aparición de una respuesta de RA entre 6 y 3 meses por 55 adelantado. En determinadas realizaciones, el resultado de la expresión génica se emplea para caracterizar una respuesta de RA como una respuesta de RA resistente a esteroides.

También se describen métodos para determinar la identidad de un tejido que se está rechazando en una respuesta de RA, que incluye evaluar el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado de uno o más de NKTR, MAPK9, 60 DUSP1, PBEF1 (también denominado NAMPT), PSEN1, CFLAR, RNF-130, IFNGR1, ITGAX y RYBP en una muestra del sujeto para obtener un resultado de expresión génica y emplear el resultado de la expresión génica para determinar la identidad de un tejido que se está rechazando. El ensayo es aplicable no solo al rechazo de trasplante de numerosos tejidos, incluyendo trasplantes de riñón, corazón, hígado, pulmón e intestinal.

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También se describen métodos para determinar un régimen inmunosupresor para un sujeto que ha recibido un injerto que incluye: (a) evaluar el nivel de expresión de al menos un gen en una muestra del sujeto para obtener un resultado de expresión génica, donde el al menos un gen se selecciona del grupo que consiste en: NKTR, MAPK9, DUSP1, PBEF1 (también denominado NAMPT) y PSEN1; y (b) emplear el resultado de expresión génica para determinar un régimen inmunosupresor del sujeto. En determinados casos, se evalúa el nivel de expresión de todos 5 los genes del grupo de 5 genes anterior. En determinados casos, la etapa de evaluación incluye además evaluar el nivel de expresión de genes adicionales seleccionados de uno o más de: CFLAR, RNF-130, IFNGR1, ITGAX y RYBP. En determinados casos, se evalúa el nivel de expresión de los 10 genes indicados anteriormente.

También se describen sistemas para monitorizar una respuesta de rechazo agudo (RA) en un sujeto que ha recibido 10 un aloinjerto, incluyendo el sistema: (a) un elemento de evaluación de expresión génica configurado para evaluar el nivel de expresión de al menos un gen en una muestra del sujeto para obtener un resultado de expresión génica, donde el al menos un gen se selecciona del grupo que consiste en: NKTR, MAPK9, DUSP1, PBEF1 (también denominado NAMPT) y PSEN1; y (b) un elemento de determinación de fenotipo para emplear el resultado de expresión génica para predecir la aparición de una respuesta de RA, para diagnosticar una respuesta AR y/o 15 caracterizar una respuesta de RA en un sujeto, monitorizando de este modo la respuesta de RA del sujeto. En determinados casos, se evalúa el nivel de expresión de todos los genes del grupo de 5 genes anterior. En determinados casos, el elemento de evaluación de la expresión génica comprende al menos un reactivo para analizar un producto de expresión de al menos un gen de una muestra. En determinados casos, el producto de expresión del al menos un gen es un transcripto de ácido nucleico mientras que en otros casos, el producto de 20 expresión es una proteína. En determinados casos, el elemento de evaluación de la expresión génica comprende cebadores de PCR específicos para el al menos un gen. En determinados casos, el elemento de evaluación de la expresión génica se configura además para evaluar el nivel de expresión de genes adicionales seleccionados de uno o más de: CFLAR, RNF-130, IFNGR1, ITGAX y RYBP. En determinados casos, se evalúa el nivel de expresión de los 10 genes indicados anteriormente. En determinados casos, el elemento de determinación del fenotipo 25 comprende un valor de expresión de referencia para el al menos un gen.

Aspectos de la invención en cuestión incluyen kits para monitorizar una respuesta de rechazo agudo (RA) de un sujeto que ha recibido un aloinjerto, que incluyen: (a) un cebador específico de genes para genes junto con reactivos para analizar un producto de expresión de los genes de una muestra para obtener un resultado de expresión génica, 30 donde los genes son: NKTR, MAPK9, DUSP1, PBEF1 (denominado también NAMPT) y PSEN1; y (b) un elemento de determinación del fenotipo que comprende un valor de expresión de referencia para los genes para emplear el resultado de la expresión génica para predecir la aparición de una respuesta de RA, para diagnosticar una respuesta de RA y/o caracterizar una respuesta de RA en el sujeto, monitorizando de esta manera una respuesta de RA en el sujeto. En determinadas realizaciones, el elemento de evaluación de la expresión génica se configura además para 35 evaluar el nivel de expresión de genes adicionales seleccionados de uno o más de: CFLAR, RNF-130, IFNGR1, ITGAX y RYBP. En determinadas realizaciones, se evalúa el nivel de expresión de los 10 genes indicados anteriormente. En determinadas realizaciones, el elemento de evaluación de expresión génica incluye pares de cebadores de PCR específicos para uno o más de los genes indicados anteriormente (por ejemplo para su uso en un ensayo RT-PCR para la expresión génica). En determinadas realizaciones, el elemento de evaluación de expresión 40 génica incluye pares de cebadores de PCR específicos para los 5 genes en el grupo de 5 genes, mientras que en otras realizaciones, el elemento de evaluación de la expresión génica incluye pares de cebadores de PCR específicos para los 10 genes indicados anteriormente.

También se describen productos de programas informáticos para monitorizar una respuesta de rechazo agudo (RA), 45 en un sujeto que ha recibido un aloinjerto, donde el producto del programa informático, cuando se carga en un ordenador, se configura para emplear un resultado de la expresión génica de una muestra derivada del sujeto para determinar un resultado de monitorización de RA y proporcionar el resultado de la monitorización del RA a un usuario en un formato legible para el usuario, donde el resultado de la monitorización del RA se selecciona de la predicción y aparición de una respuesta de RA, diagnosticando una respuesta de RA y/o caracterizando una 50 respuesta de RA en el sujeto, donde el resultado de la expresión génica incluye datos de expresión para uno o más genes seleccionados de: NKTR, MAPK9, DUSP1, PBEF1 y PSEN1. En determinados casos, el resultado de la expresión incluye datos de expresión para todos los genes del grupo de 5 genes anterior. En determinados casos, el resultado de la expresión incluye datos de expresión para genes adicionales seleccionados de uno o más de: CFLAR, RNF-130, IFNGR1, ITGAX y RYBP. En determinados casos, el resultado de la expresión incluye datos de 55 expresión para los 10 genes indicados anteriormente.

Definiciones

Por comodidad, en este documento se recopilan algunos términos empleados en la memoria descriptiva, en los 60 ejemplos y en las reivindicaciones adjuntas.

“Rechazo agudo o RA” es el rechazo por el sistema inmunitario de un receptor de trasplante de tejido cuando el tejido trasplantado es inmunológicamente extraño. El rechazo agudo se caracteriza por infiltración del tejido trasplantado de células inmunitarias del receptor, que realizan su función efectora y destruyen el tejido trasplantado. 65 La aparición del rechazo agudo es rápida y generalmente se produce en seres humanos a las pocas semanas

después de cirugía de trasplante. Generalmente, el rechazo agudo puede inhibirse o suprimirse con fármacos inmunosupresores tales como rapamicina, ciclosporina A, anticuerpo monoclonal anti-CD40L y similar.

El “rechazo de trasplante crónico o RC” generalmente se produce en seres humanos al cabo de algunos meses a años después del injerto, incluso en presencia de inmunosupresión satisfactoria de rechazo agudo. La fibrosis es un 5 factor común en el rechazo crónico de todos los tipos de trasplantes de órganos. El rechazo crónico puede describirse normalmente por una serie de trastornos específicos que son característicos del órgano particular. Por ejemplo, en los trasplantes de pulmón, dichos trastornos incluyen destrucción fibroproliferativa de las vías respiratorias (bronquiolitis obliterante); en trasplantes de corazón o trasplantes de tejido cardiaco, tal como sustituciones de válvulas, dichos trastornos incluyen ateroesclerosis fibrótica; en trasplante de riñón, dichos 10 trastornos incluyen, nefropatía obstructiva, nefroesclerosis, nefropatía tubulointersticial; y en trasplantes de hígado dichos trastornos incluyen síndrome de desaparición de conductos biliares. El rechazo crónico también puede caracterizarse por lesión isquémica, denervación del tejido trasplantado, hiperlipidemia e hipertensión asociada con fármacos inmunosupresores.

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La expresión “rechazo de trasplante” incluye rechazo de trasplante tanto agudo como crónico.

La expresión “condiciones de ensayo rigurosas”, como se utiliza en este documento, se refiere a condiciones que son compatibles para producir pares de unión de ácidos nucleicos, por ejemplo, ácidos nucleicos unidos a la superficie y en fase de solución, de suficiente complementariedad para proporcionar el nivel de especificidad 20 deseado en el ensayo al mismo tiempo que son menos compatibles para la formación de pares de unión entre miembros de unión de complementariedad insuficiente para proporcionar la especificidad deseada. Las condiciones de ensayo rigurosas son la suma o combinación (totalidad) de condiciones tanto de hibridación como de lavado.

Las “condiciones de hibridación rigurosa” y las “condiciones de lavado de hibridación rigurosa” en el contexto de 25 hibridación de ácidos nucleicos (por ejemplo, como en hibridaciones en matriz, Southern o Northern) son dependientes de secuencias, y son diferentes bajo diferentes parámetros experimentales. Las condiciones de hibridación rigurosa que pueden utilizarse para identificar ácidos nucleicos dentro del ámbito de la invención pueden incluir, por ejemplo, hibridación en un tampón que comprenda formamida al 50 %, 5XSSC y SDS al 1 % a 42 ºC, o hibridación en un tampón que comprenda 5XSSC y SDS al 1 % a 65 ºC, tanto con un lavado de 0,2xSSC como con 30 SDS al 0,1 % a 68 ºC. Las condiciones de hibridación rigurosas ejemplares también pueden incluir hibridación en un tampón de formamida al 40 %, NaCl 1 M y SDS al 1 % a 37 ºC, y un lavado en 1xSSC a 45 ºC. Como alternativa, puede emplearse hibridación con ADN unido a filtro en NaHPO4 0,5 M, dodecil sulfato sódico (SDS) al 7 %, EDTA 1 mM a 65 ºC, y lavado en 0,1xSSC/SDS al 0,1% a 68 ºC. Incluso condiciones de hibridación rigurosas adicionales incluyen hibridación a una temperatura de 60 ºC o más elevada y 3xSSC (cloruro de sodio 450 mM/citrato de sodio 35 45 mM) o incubación a 42 ºC en una solución que contiene formamida al 30%, NaCl 1 M, sarcosina sódica al 0,5 %, MES 50 mM, pH 6,5. Los expertos habituales reconocerán fácilmente que pueden utilizarse condiciones de hibridación y lavado alternativas aunque comparables para proporcionar condiciones de rigurosidad similares.

En determinadas realizaciones, la rigurosidad de las condiciones de lavado establece las condiciones que 40 determinan si un ácido nucleico se hibrida específicamente con un ácido nucleico unido a la superficie. Las condiciones de lavado utilizadas para identificar ácidos nucleicos pueden incluir, por ejemplo: una concentración salina de aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y una temperatura de al menos aproximadamente 50 ºC o de aproximadamente 55 ºC a aproximadamente 60 ºC; o, una concentración salina de aproximadamente 0,15 M de NaCl a 72 ºC durante aproximadamente 15 minutos; o, una concentración salina de aproximadamente 0,2xSSC a 45 una temperatura de al menos aproximadamente 50 ºC o aproximadamente de 55 ºC a aproximadamente 60 ºC durante aproximadamente de 15 a aproximadamente 20 minutos; o, el complejo de hibridación se lava dos veces con una solución con una concentración salina de aproximadamente 2xSSC que contenga SDS al 0,1 % a temperatura ambiente durante 15 minutos y después se lava dos veces con 0,1xSSC que contenga SDS al 0,1 % a 68 ºC durante 15 minutos; o, condiciones equivalentes. Las condiciones rigurosas para el lavado también pueden 50 ser, por ejemplo, 0,2xSSC/SDS al 0,1 % a 42 ºC.

Un ejemplo específico de condiciones de ensayo rigurosas es la hibridación rotativa a 65 ºC en un tampón de hibridación basado en sal con una concentración de cationes monovalentes total de 1,5 M (por ejemplo, como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 09/655,482 presentada el 5 de septiembre del 2000.) 55 seguida de lavados de 0,5XSSC y 0,1XSSC a temperatura ambiente.

Las condiciones de ensayo rigurosas son condiciones de hibridación que son al menos tan rigurosas como las condiciones representativas anteriores, donde un conjunto de condiciones determinado se considera que es al menos tan riguroso si sustancialmente no se producen complejos de unión adicionales que carecen de 60 complementariedad suficiente para proporcionar la especificidad deseada en el conjunto de condiciones determinado en comparación con las condiciones específicas anteriores, donde por “sustancialmente no más” significa menos de aproximadamente 5 veces más, normalmente menos de aproximadamente 3 veces más. En la técnica se conocen otras condiciones de hibridación rigurosas y también pueden emplearse, según sea apropiado.

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Como se usa en este documento, las expresiones “gen” o “gen recombinante” se refieren a un ácido nucleico que comprende una fase de lectura abierta que codifica un polipéptido, incluyendo secuencias exónicas y (opcionalmente) intrónicas. El término “intrón” se refiere a una secuencia de ADN presente en un gen determinado que no se traduce en proteína y generalmente se encuentra entre exones en una molécula de ADN. Además, un gen puede incluir opcionalmente su promotor natural (es decir, el promotor con el que los exones e intrones del gen 5 están unidos operativamente en una célula no recombinante, es decir, una célula de origen natural) y secuencias reguladoras asociadas y puede o no tener secuencias aguas arriba del sitio de inicio AUG y puede o no incluir secuencias líder no traducidas, secuencias señal, secuencias no traducidas aguas abajo, secuencias de inicio y terminación transcripcionales, señales de poliadenilación, secuencias de inicio y terminación traduccionales, sitios de unión al ribosoma y similares. 10

Una “secuencia codificante de proteína” o una secuencia que “codifica” un polipéptido o péptido particular, es una secuencia de ácidos nucleicos que se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de inicio en el extremo 5’ (amino) y un codón de terminación de la 15 traducción en el extremo 3’ (carboxi). Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, secuencias de ADNc de ARNm viral, procariota o eucariota, de ADN genómico de ADN viral, procariota o eucariota e incluso secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción puede localizarse en posición 3’ con respecto a la secuencia codificante.

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Los términos “referencia” y “control” se utilizan indistintamente para referirse a un valor conocido o a un conjunto de valores conocidos frente al cual puede compararse un valor observado. Como se usa en este documento, conocido significa que el valor representa un parámetro comprendido, por ejemplo, un nivel de expresión de un gen marcador en un fenotipo de supervivencia o pérdida de injerto.

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La expresión “ácido nucleico” incluye ADN, ARN (mono o bicatenario), análogos (por ejemplo, moléculas PNA o LNA) y derivados de estos. Los términos “ácido ribonucleico” y “ARN” como se utilizan en este documento significan un polímero compuesto de ribonucleótidos. Las expresiones “ácido desoxirribonucleico” y “ADN” como se utilizan en este documento significan un polímero compuesto de desoxirribonucleótidos. El término “ARNm” significa ARN mensajero. Un “oligonucleótido” generalmente se refiere a un multímero nucleotídico de aproximadamente 10 a 100 30 nucleótidos de longitud, mientras que un “polinucleótido” incluye un multímero nucleotídico que tiene cualquier número de nucleótidos.

Los términos “proteína” y “polipéptido” utilizados en esta solicitud son intercambiables. “Polipéptido” se refiere a un polímero de aminoácidos (secuencia de aminoácidos) y no se refiere a una longitud específica de la molécula. Por 35 tanto los péptidos y oligopéptidos se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Este término también se refiere a o incluye modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilación y similar. Dentro de la definición se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido, polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la materia, que se producen tanto de manera natural como no natural. 40

Los términos “valoración” y “evaluación” se usan indistintamente para referirse a cualquier forma de medición, e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Los términos “determinación”, “medición”, “valoración” y “análisis” se utilizan indistintamente e incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas. El análisis puede ser relativo o absoluto. “Valorar la presencia de” incluye determinar la cantidad de algo presente, así como 45 determinar si está presente o ausente.

En esta solicitud algunas abreviaturas empleadas incluyen las siguientes:

RA: Rechazo Agudo; AZA: Azatioprina; VBK: Virus BK; CMV: Citomegalovirus; CSA: ciclosporina A; AED: 50 Anticuerpos Específicos del Donante; VEB: virus de Epstein-Barr; TDF: tasa de descubrimientos falsos; FK: FK506; HCT: Hematocrito; DVR: donante vivo relacionado; MMF: Micofenolato de Mofetilo; LSP: Leucocitos de Sangre Periférica; APM: Análisis de Predicción de Micromatrices; ARP: Anticuerpo Reactivo al Panel; C-PCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real; ROC: Característica Operativa del Receptor (Receiver Operating Characteristic); ASM: Análisis Significativo de Micromatrices; STA: estable; SNS: pacientes 55 del estudio (SNS01) de trasplante renal pediátrico multicéntrico aleatorizado basado en esteroides frente a sin esteroides financiado por la CCTPT (Cooperative Clinical Trials in Pediatric Transplantation) U01 del NIH ; WBC: (White Blood Cell) glóbulos blancos.

Breve descripción de las figuras 60

Figura 1. Resumen del Diseño del Estudio. El presente estudio se dividió en 2 partes específicas: En la parte 1 del estudio, se realizaron análisis transversales de micromatrices de muestras de sangre periférica en 3 plataformas de micromatrices diferentes - las matrices Affymetrix, Agilent y ADNc. Los datos de las matrices generados de las 3 plataformas se compararon, mapeando los productos de transcripción, con los nombres de 65 los genes de la Organización del Genoma Humano (HUGO, Human Gene Organization). Se aplicaron

procedimientos de normalización apropiados para cada conjunto de datos seguido de Análisis de Predicción de Micromatrices, APM, para la identificación de genes regulados significativamente en RA, utilizando un umbral de significado común (TDF<10 %). 525 genes fueron comunes entre todos los genes específicos de RA expresados diferencialmente a lo largo de las 3 plataformas. Se seleccionó un conjunto de 32 genes para la verificación inicial en 34 muestras (Conjunto de Verificación) seleccionado de las muestras utilizadas en las micromatrices. 5 De los 32 genes ensayados, los 10 genes más significativos (p<0,03) se validaron adicionalmente en 42 muestras independientes (Conjunto de Validación 1). Se generó un modelo de regresión utilizando la expresión de 5 genes más significativos del Conjunto de Validación 1. Después este modelo se aplicó al segundo conjunto independiente de 64 muestras (Conjunto de Validación 2) para clasificación de RA verdadero. En la Parte 2 del estudio, se realizaron análisis de C-PCR longitudinales de 5 genes de muestras de sangre emparejadas 10 extraídas antes de RA (preRA; n=27) y después de RA (postRA; n=30), en las que a 57 muestras de RA en serie se aplicó el modelo de regresión.

Figura 2. Verificación y Validación de Expresión Génica del Conjunto de 5 Genes. La agrupación de matrices de muestras de sangre periférica a través del conjunto de 525 genes comunes muestra la agrupación de muestras por fenotipo de diagnóstico. En esta figura (Figura 2A) se muestra la agrupación de 59 muestras procesadas en 15 matrices Affymetrix; la agrupación de muestras por fenotipo se observa a través de los 525 genes solapantes, diferencialmente expresados en las 3 plataformas de micromatrices (véase la Figura 5), sin tener en cuenta la recogida, el procesamiento o los factores de confusión clínicos múltiples de las muestras. Las muestras se agrupan por fenotipo (RA o STA) a través de los 525 genes. Aquí se muestran datos de agrupación representativos para las muestras procesadas solo en la matriz Affymetrix. La expresión resumida del conjunto 20 de 10 genes seleccionados se muestra como se mide en una de las plataformas de matriz (Affymetrix) (Figura 2B). Se muestran los factores de cambio y puntuación q del Análisis Significativo de Micromatrices, ASM, de los datos de micromatriz de Affymetrix en muestras de sangre entera. La expresión de los mismos 10 genes se muestra para el Conjunto de Verificación de muestras C-PCR (Figura 2C). El factor de cambio en C-PCR fue las diferencias medias entre muestras de RA y STA; el significado para las diferencias de expresión por Q-PCR se 25 determinó por ensayo de la T, donde se consideró que el valor de p <0,05 era significativo. En el conjunto de validación independiente de muestras de sangre (Conjunto de Validación 1), se muestra la expresión de los 5 genes más significativos. Las nuevas muestras de sangre, no utilizadas en los análisis de matriz, se separan de nuevo por fenotipo (RA o STA) a través de los 5 genes (Figura 2D). Los factores de cambio y valores de p de los 5 genes en las muestras utilizadas en el Conjunto de Validación 1 se muestran en la Figura 2E. 30

Figura 3. Curva Característica Operativa del Receptor (ROC). Utilizando un análisis de modelo de regresión logística, se generó un modelo de predicción de los datos de expresión por C-PCR de 5 genes de muestras independientes (Conjunto de Validación 1). La especificidad y sensibilidad del modelo se muestra mediante la puntuación ROC=95,2 %. El modelo de regresión se aplicó a un conjunto de muestras independiente (conjunto de Validación 2), donde la expresión de 5 genes separa claramente RA de STA (agrupamiento no supervisado), 35 y los 5 genes diferencialmente expresados son significativamente diferentes en RA cuando se comparan con STA (p<0,02).

Figura 4. Predicción de Rechazo Agudo por Muestreo de Sangre del Conjunto de 5 Genes Antes de Disfunción Clínica del Injerto. El modelo de regresión se aplicó a muestras secuencialmente extraídas de pacientes en el conjunto de muestras STA (Figura 4A), a diversos momentos en los 2 primeros años posteriores al trasplante, 40 para evaluar la probabilidad de predicción como RA a diferentes momentos después del trasplante. Las muestras STA se agruparon en muestras extraídas al cabo de 0 a 3 meses, al cabo de 0 a 6 meses, al cabo de 6 a 12 meses y al cabo de 12 a 24 meses después de trasplante. Cada una de las muestras de sangre tuvo una biopsia emparejada para confirmar la ausencia de RA en el injerto en el momento de la extracción de las muestras de sangre. El error medio y típico de probabilidad de RA se calculó en todas las muestras STA utilizando la 45 expresión coordinada del conjunto de 5 genes a diferentes momentos después de trasplante renal. Como se observa, la probabilidad de cualquiera de las muestras STA que se están prediciendo como RA, en cualquier momento después del trasplante, era menor del 50 %. Hubo 2 muestras STA mal clasificadas (S99 con una puntuación de probabilidad de RA del 58 % y S88 con una puntuación de predicción de RA del 72 %; véase la Figura 9). Ambos pacientes con muestras STA mal clasificadas han pasado a desarrollar RA comprobado por 50 biopsia a los 6 meses de la toma de muestras de sangre. En el panel de la derecha (Figura 4B), se muestra la media y el error típico de probabilidad de RA de muestras de sangre extraídas en el momento de RA comprobado por biopsia, así como para muestras extraídas (como parte de extracción de muestras protocolo) a los 1-3 meses antes y 3-6 meses antes de la muestra RA (preRA). Como se observa, la probabilidad de clasificación de la muestra de sangre como RA (generalmente 75-100 %), concuerda totalmente con el 55 diagnóstico de RA por biopsia. Después de intensificar la inmunosupresión en el diagnóstico de RA (impulsando esteroides o anticuerpos), la probabilidad de predicción de RA disminuye, demostrando que la probabilidad de predicción de RA de la firma del conjunto de 5 genes se reduce aumentando la inmunosupresión. La probabilidad de predicción de RA para todas las muestras en el conjunto RA, es significativamente más alta en todas las muestras preRA, RA y postRa, en comparación con cualquiera de las muestras STA (p<0,001), lo que sugiere 60 que los pacientes que desarrollan RA pueden tener un umbral de activación inmunitaria más elevado que los pacientes que nunca desarrollan RA después del trasplante.

La Figura 5 proporciona diagramas de Venn que muestran los genes significativos para RA dentro de cada plataforma de descubrimiento y los genes de solapamiento significativo en negrita, confirmado ASM a través de preparaciones de muestras (q <10 %) (A) o a través de diferentes plataformas de micromatriz (B). Los 525 genes 65 solapantes (doble subrayado) están estadísticamente regulados de manera significativa (ensayo

hipergeométrico; p <0,001), en comparación con muestras STA y son comunes a RA, sin tener en cuenta la hibridación con diferentes plataformas de matriz y del uso de diferentes métodos de extracción de sangre periférica.

La Figura 6A muestra un listado de genes e ID de sondas ABI para genes analizados utilizando C-PCR. La Figura 6B muestra valores de expresión normalizados para 10 genes por C-PCR a través de 34 muestras de 5 sangre en el conjunto de verificación (17 RA, 17 STA).

La Figura 7 es un resumen de valores de expresión génica sobre matriz y C-PCR a través de las 34 muestras en el conjunto de verificación para 3 genes indicados en la bibliografía como diferencialmente expresados en RA.

La Figura 8 muestra valores de expresión normalizados para 10 genes a través de 42 muestras de sangre independientes (21 RA y 21 STA) en el conjunto de validación 1 por C-PCR. 10

La Figura 9 muestra valores de expresión normalizados para 5 genes a través de 64 muestras de sangre independientes (32 RA y 32 STA) en el conjunto de validación 2 por C-PCR.

La Figura 10 compara diferentes modelos de clasificación para RA a través del conjunto de 10 genes (panel superior) y conjunto de 5 genes (panel inferior).

La Figura 11 muestra los 18 factores de confusión demográficos y clínicos examinados en todos los 15 experimentos por C-PCR.

La Figura 12 muestra resultados de correlación de Pearson y ensayo de t (según sea apropiado) para determinar cualquier influencia de los 18 parámetros de la Figura 11 como posibles factores de confusión para la expresión del conjunto de 5 genes.

La Figura 13 es una representación gráfica de los resultados de la Figura 12. 20

La Figura 14 muestra la correlación entre el grado de biopsia de Banff, positividad C4d Peritubular y RA humoral frente a celular y la probabilidad de predicción de RA.

Figura 15. El panel A muestra la probabilidad de predicción de RA en muestras emparejadas extraídas 6 meses antes y después del episodio de RA. El panel B muestra valores de p que comparan la puntuación de predicción de RA frente a puntuaciones de preRA y postRA. 25

El panel C es una representación gráfica de los datos del panel A. El panel D es un gráfico que muestra la probabilidad de RA en muestras STA. El panel E muestra los datos utilizados en el gráfico mostrado en el panel D.

La Figura 16 muestra un análisis de trascendencia biológica de los 525 genes solapantes a través de las tres plataformas de matriz utilizando el Sistema Ingenuity (IPA; 2008). 30

La Figura 17 es una representación gráfica de la información mostrada en la Figura 16.

La Figura 18 muestra una tabla de referencia cruzada de las muestras y ensayos realizados.

Descripción de las realizaciones específicas

35

Se proporcionan métodos para monitorizar una respuesta de rechazo agudo (RA) en un sujeto que tiene un injerto, por ejemplo, para predecir, diagnosticar y/o caracterizar una respuesta de RA. En la realización práctica de los métodos en cuestión, el nivel de expresión de genes en una muestra del sujeto, por ejemplo, una muestra de sangre o biopsia, se evalúa, por ejemplo, a nivel de ácido nucleico y/o proteína para monitorizar al sujeto. También se proporcionan kits que encuentran uso en la realización práctica de los métodos en cuestión. Los métodos 40 encuentran uso en diversas aplicaciones.

Antes de describir la presente invención con más detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, de tal manera que, por supuesto, pueden modificarse. También ha de entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene la finalidad de describir solo realizaciones 45 particulares, y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invención estará solo limitado por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, a la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto dictamine claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior de 50 ese intervalo y cualquier otro que se establezca o valor intermedio en ese intervalo establecido, se incluye en la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también se incluyen en la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o los dos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la invención. 55

Determinados intervalos están presentes en este documento con valores numéricos que van precedidos por el término “aproximadamente”. El término “aproximadamente” se utiliza en este documento para proporcionar soporte literal al número exacto que precede, así como un número que está cerca de o se aproxima al número que precede al término. En la determinación de si un número está cerca de o se aproxima a un número específicamente indicado, 60 el número no indicado cerca de o aproximado puede ser un número que, en el contexto en el que se presente, proporcione el equivalente sustancial del número específicamente indicado.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto habitual en la materia a la cual pertenece esta 65 invención. Aunque en la realización práctica o ensayo de la presente invención también pueden utilizarse cualquiera

de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, ahora se describen métodos y materiales ilustrativos representativos.

Todas las publicaciones y patentes citadas en esta memoria descriptiva se citan para desvelar y describir los métodos y/o materiales en relación con los cuales se citan las publicaciones. La mención de cualquier publicación es 5 para su divulgación antes de la fecha de presentación y no debe considerarse como una admisión de que la presente invención no tenga derecho a antedatar dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales las cuales pueden precisar una confirmación independiente.

10

Se observa que, como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “uno”, “una” y “el”, “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto dictamine claramente otra cosa. También se observa que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Así pues, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de dicha terminología exclusiva como “únicamente”, “solamente” y similar en relación con la enumeración de elementos de reivindicación, o uso de una 15 limitación “negativa”.

Como se ha resumido anteriormente, el objetivo de la invención se dirige a métodos para monitorizar una respuesta de RA en un sujeto, así como a kits para su uso en la realización práctica de los métodos en cuestión. Al describir adicionalmente la invención, primero se describen los métodos en cuestión, seguido de una revisión de los reactivos 20 y kits para uso en la realización práctica de los métodos en cuestión.

MÉTODOS PARA MONITORIZAR UNA RESPUESTA DE RECHAZO AGUDO

Como se ha revisado anteriormente, la invención en cuestión proporciona métodos para monitorizar una respuesta 25 de RA de un sujeto que ha recibido un injerto. En determinadas realizaciones, se monitoriza a un sujeto para predecir si se producirá una respuesta de RA, donde el método puede predecir un RA a partir de entre 6 y 3 meses antes de que se produzca una respuesta de RA. En determinadas realizaciones, se monitoriza a un sujeto para determinar si hay una respuesta en curso de RA. En determinadas realizaciones, se monitoriza a un sujeto para caracterizar una respuesta de RA que se produce o se ha producido, por ejemplo, para determinar la gravedad y/o 30 clase de una respuesta de RA anterior, por ejemplo, sin una respuesta de RA es/fue una respuesta de RA resistente a esteroides.

También se describen métodos para determinar la identidad de un tejido que se está rechazado en una respuesta de RA y métodos para determinar un régimen inmunosupresor para un sujeto que ha recibido un injerto, por ejemplo, un 35 aloinjerto.

Así pues, determinadas realizaciones de la invención proporcionan métodos para evaluar, por ejemplo, en términos de predicción, la supervivencia de injerto en un sujeto que comprende un injerto. Por ejemplo, los métodos en cuestión pueden utilizarse para determinar si un sujeto generará una respuesta de RA contra un injerto que, en 40 ausencia de intervención inmunosupresora eficaz, dará como resultado la pérdida del tejido injertado. Como tal, la invención en cuestión proporciona métodos para evaluar si en un sujeto o paciente trasplantado sobrevivirá o se perderá un injerto. En determinadas realizaciones, los métodos pueden contemplarse como métodos para determinar si un sujeto con trasplante tiene un fenotipo de supervivencia de injerto, es decir, un fenotipo en el que el injerto sobrevivirá. Un fenotipo de supervivencia de injerto es un fenotipo caracterizado por la presencia de 45 supervivencia de injerto prolongada. Por supervivencia de injerto “prolongada” se entiende supervivencia de injerto durante al menos aproximadamente 5 años más allá del muestreo actual, a pesar de la aparición de uno o más episodios anteriores de RA. En determinadas realizaciones, la supervivencia del injerto se determina para pacientes en los que se ha producido al menos un episodio de rechazo agudo (RA). Así pues, estas realizaciones son métodos para determinar o predecir la supervivencia de injerto después de RA. La supervivencia de injerto se determina o 50 predice en determinadas realizaciones en el contexto de terapia de trasplante, por ejemplo, terapia inmunosupresora, donde las terapias inmunosupresoras son conocidas en la técnica. Incluso en otras realizaciones, se proporcionan métodos para determinar la clase y/o gravedad de rechazo agudo (y no solo la presencia del mismo).

55

Como se sabe en el campo del trasplante, un injerto de órgano, tejido o célula (células) puede ser alogénico o xenogénico, de tal manera que los injertos pueden ser aloinjertos o xenoinjertos. Como órganos y tejidos de interés se incluyen, pero sin limitación: piel, corazón, riñón, hígado, médula ósea y otros órganos.

En la realización práctica de los métodos en cuestión, para monitorizar una respuesta de RA en el hospedador se 60 analiza una muestra del sujeto o paciente, por ejemplo células o grupos de las mismas, por ejemplo, tejidos. Por consiguiente, la primera etapa de los métodos en cuestión es obtener una muestra adecuada del sujeto o paciente de interés, es decir, de un paciente que tiene un aloinjerto renal.

La muestra procede de cualquier fuente inicial adecuada, donde las fuentes de muestras de interés incluyen, pero 65 sin limitación, muchas fuentes fisiológicas diferentes, por ejemplo, líquido cefalorraquídeo (LCR), orina, saliva,

lágrimas, muestras procedentes de tejidos, por ejemplo, homogeneizados (tales como muestras de biopsia del tejido u órgano trasplantado (incluyendo, pero sin limitación, biopsias de riñón, corazón, pulmón)) y sangre o derivados de los mismos.

En determinadas realizaciones, una fuente inicial adecuada para la muestra del paciente es una muestra de sangre. 5 Como tal, la muestra empleada en los ensayos de estas realizaciones en cuestión es generalmente una muestra procedente de sangre. La muestra procedente de sangre puede proceder de sangre entera o de una fracción de la misma, por ejemplo, suero, plasma, fracción celular, etc., donde en determinadas realizaciones la muestra procede de células sanguíneas recogidas de sangre entera. De particular interés como una fuente de muestra son las células mononucleares/linfocitos de sangre periférica (CMSP/LSP). Para obtener dichas muestras puede emplearse 10 cualquier protocolo conveniente, donde en la técnica se conocen bien protocolos adecuados (por ejemplo, fraccionamiento por gradiente de densidad de una muestra de sangre entera) y se describe un protocolo representativo en la Sección Experimental, más adelante.

En la realización práctica de los métodos en cuestión, la muestra se analiza para obtener una evaluación del nivel de 15 expresión, por ejemplo, perfil de expresión, para los genes indicados en la Tabla 1, donde la expresión perfil de expresión se utiliza ampliamente para incluir un perfil de expresión genómico, por ejemplo, un perfil de expresión de productos de transcripción de ácido nucleico, por ejemplo, los ARNm, de uno o más genes de interés, o un perfil de expresión proteómico, por ejemplo, un perfil de expresión de una o más proteínas diferentes, donde las proteínas/polipéptidos son productos de expresión de los genes de interés. En determinadas realizaciones, también 20 se evalúa el nivel de expresión de uno o más genes adicionales distintos de los indicados en la Tabla 1, donde en determinadas realizaciones, el gen (o genes) adicional se selecciona de los indicados en la Tabla 2. Aquí se observa que un perfil de expresión que incluya una evaluación del nivel de expresión de los genes de la Tabla 1 y cualquier combinación de los genes de la Tabla 2 encuentra uso en la monitorización de un sujeto que tiene o que está predispuesto a desarrollar una respuesta de RA en el tejido injertado, incluyendo la evaluación de la expresión de los 25 10 genes indicados en las Tablas 1 y 2.

Tabla 1. 5 genes cuyo nivel de expresión puede utilizarse para monitorizar RA en un sujeto que tiene un aloinjerto.

Símbolo del Gen

Nombre del Gen Nº ID del Gen del NCBI

DUSP1

quinasa 1 específica dual 1843

MAPK9

proteína quinasa activada por mitógeno 5601

NKTR

secuencia de reconocimiento tumoral-destructora natural 4820

PBEF1 (o NAMPT)

factor potenciador de colonias de prelinfocitos B 10135

PSEN1

presenilina 1 5663

Tabla 2. 5 genes adicionales cuyo nivel de expresión puede utilizarse para monitorizar RA en un sujeto que tiene un 30 aloinjerto.

Símbolo del Gen

Nombre del Gen Nº ID del Gen del NCBI

CFLAR

regulador de la apoptosis similar a caspasa 8 y FADD 8837

IFNGR1

receptor 1 de interferón gamma 3459

ITGAX

integrina alfa X 3687

RNF130

proteína 130 de dedo de anillo 55819

RYBP

proteína de unión a anillo 1 e YY1 23429

En el más amplio sentido, la evaluación de la expresión puede ser cualitativa o cuantitativa. Como tal, cuando la detección es cualitativa, los métodos proporcionan una lectura o evaluación, por ejemplo, valoración, de si el analito diana, por ejemplo, ácido nucleico u otro producto de escisión (por ejemplo, proteína), está presente o no en la 35 muestra a ensayar. En otras realizaciones adicionales, los métodos proporcionan una detección cuantitativa de si el analito diana está presente en la muestra que se va a ensayar, es decir, una evaluación o valoración de la cantidad real o abundancia relativa del analito diana, por ejemplo, ácido nucleico en la muestra que se va a ensayar. En dichas realizaciones, la detección cuantitativa puede ser absoluta o, si el método es un método de detección de dos o más analitos diferentes, por ejemplo, ácidos nucleicos diana, en una muestra, relativa. Como tal, el término 40 “cuantificar “cuando se usa en el contexto de cuantificar un analito diana, por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos, en una muestra puede referirse a cuantificación absoluta o relativa. La cuantificación absoluta puede realizarse por inclusión de una concentración (o concentraciones) conocida de uno o más analitos control y haciendo referencia al nivel detectado del analito diana con los analitos de control conocidos (por ejemplo a través de la generación de una

curva patrón). Como alternativa, la cuantificación relativa puede realizarse por comparación de niveles o cantidades detectadas entre dos o más analitos diana diferentes para proporcionar una cuantificación relativa de cada uno de los dos o más analitos diferentes, por ejemplo, relativos entre sí. Además, puede considerarse una cuantificación relativa utilizando una muestra de control, o de referencia como se realiza normalmente en ensayos basados en matriz, así como en análisis de PCR cuantitativa/RT-PCR (descritos con más detalle más adelante). 5

Como se ha indicado anteriormente, en las Tablas 1 y 2 se muestran genes/proteínas que encuentran uso en la monitorización de una respuesta de RA en un sujeto, es decir, genes/proteínas que se expresan diferencialmente o que están presentes a diferentes niveles en sujetos que han tenido, están teniendo actualmente o tendrán un episodio de RA. Obsérvese que para los genes en estas tablas, la información detallada, incluyendo información de 10 secuencia exacta, puede determinarse a través de la base de datos del NCBI Entrez Gene encontrada en el sitio web http(colon)//www(dot)ncbi.nlm.nih(dot)gov. La información detallada de cada gen se obtiene después seleccionando “Gene” y buscando el Nº ID del Gen indicado en estas tablas.

En determinadas realizaciones, pueden analizarse genes adicionales además de los listados en las Tablas 1 y 2, e 15 incluyen otros genes cuyo nivel/patrón de expresión puede utilizarse para determinar una respuesta de RA así como genes cuyo nivel/patrón de expresión puede utilizarse para evaluar características de trasplante adicionales, incluyendo, pero sin limitación: un fenotipo tolerante a injerto en un sujeto, una lesión de aloinjerto crónica (rechazo crónico) en sangre; toxicidad farmacológica inmunosupresora o efectos secundarios adversos incluyendo hipertensión inducida por fármacos; genes asociados con la edad o con el índice de masa corporal que se 20 correlacionan con patología renal o que explican diferencias en la aceptación del rechazo relacionado con la edad del receptor; marcadores de inmunotolerancia en sangre entera; genes encontrados en estudios bibliográficos con funciones inmunomoduladoras que pueden desempeñar una función en las repercusiones del trasplante. Además, pueden evaluarse otros genes relacionados con la función del ensayo de matrices, por ejemplo, para evaluar la calidad de la muestra (sesgo 3’ a 5’ en la localización de la sonda), error de muestreo en estudios basados en 25 biopsias, marcadores de superficie celular y genes normalizantes para calibrar resultados de hibridación (genes ejemplares en estas categorías pueden encontrarse en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/375,681, presentada el 3 de marzo de 2006).

En determinadas realizaciones, para determinar si un sujeto que ha recibido un aloinjerto tiene un fenotipo de 30 tolerancia a injerto se evalúan genes adicionales, por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente provisional 61/089.805, presentada el 18 de agosto del 2008. Por fenotipo de tolerancia a injerto se entiende que el sujeto no rechaza un injerto de órgano, tejido o célula (células) que se ha introducido en/sobre el sujeto. En otras palabras, el sujeto tolera o mantiene el tejido, órgano o célula (células) que se le ha trasplantado. Un rasgo del fenotipo de tolerancia a injerto detectado o identificado es que es un fenotipo que se produce sin terapia 35 inmunosupresora, es decir, está presente en un sujeto que no se somete a terapia inmunosupresora de tal manera que al hospedador no se le administran agentes inmunosupresores.

En estas realizaciones, además de evaluar uno o más genes indicados en las Tablas 1 y 2 para determinar una respuesta de RA en un sujeto que tiene un aloinjerto, también se evalúan uno o más genes seleccionados de las 40 Tablas 3 y 4 a continuación para determinar si un sujeto tiene un fenotipo de tolerancia a injerto. La evaluación de cualquier combinación de genes indicados en las Tablas 3 y 4 encuentra uso en dichas realizaciones, incluyendo la evaluación de la expresión de todos los genes indicados en cualquiera o en las dos Tablas 3 y 4.

Tabla 3: Listado de 28 genes cuyos niveles de expresión predicen 3 clases distintas de sujetos (HD frente a TOL 45 frente a CAN).

Símbolo

ID Entrez Gene HD frente a TOL frente a CAN

TP73

7161 SI

CIRBP

1153 SI

VNN1

8876 SI

ATXN1

6310 SI

BMP2K

55589 SI

KIAA1324

57535 SI

PLXNC1

10154 SI

CCL3

6348 SI

WNK1

65125 SI

CCL3L3

414062 SI

IL6

3569 SI

MYL2

4633 SI

KIF15

56992 SI

IPO13

9670 SI

TMEM117

84216 SI

KIAA1609

57707 SI

RUNX2

860 SI

CBFA2T2

9139 SI

TUBB4

10382 SI

PDPN

10630 SI

PRPF40B

25766 SI

NRTN

4902 SI

KRT17

3872 SI

TSPAN7

7102 SI

CLGN

1047 SI

CCL2

6347 SI

CENPN

55839 SI

DOPEY2

9980 SI

Tabla 4: Listado de genes (24 genes) que se expresan diferencialmente de manera significativa positiva o negativamente entre 3 clases (HD frente a SP frente a IN)

gen

ID Entrez Gene Z_JT valor P JT HDSPIN CD3+ CD4+/CD8+ CD45+/CD45-

AGBL3

340351 -3,50419 0,00046 SÍ

ELAVL1

1994 -3,50419 0,00046 SI

NUPL1

9818 -3,39854 0,00068 SI

KLF5

688 -3,22245 0,00127 SI

MYLIP

29116 -3,22245 0,00127 SI

ATXN3

4287 -3,15201 0,00162 SI

ZDHHC17

23390 -2,97592 0,00292 SI

PGM3

5238 -2,87027 0,0041 SI

ZMYM2

7750 -2,76462 0,0057 SI

FAM110C

642273 -2,58853 0,00964 SI Virgen

OR10J3

441911 3,25767 0,00112 SI

SSX3

10214 3,25767 0,00112 SI

GNG13

51764 3,29289 0,00099 SI

KIAA1751

85452 3,3281 0,00087 SI

RGMA

56963 3,36332 0,00077 SI

IL1F8

27177 3,43376 0,0006 SI

GPHA2

170589 3,53941 0,0004 SI

MKL2

57496 3,57463 0,00035 SI

TRPV1

7442 3,64507 0,00027 SI

KRTAP13-1

140258 3,75072 0,00018 SI

NOTCH4

4855 3,78594 0,00015 SI

OR13C4

138804 3,82116 0,00013 SI

KCNE1

3753 3,96203 0,00007 SI

En determinadas realizaciones, el perfil de expresión obtenido es un perfil de expresión genómico o de ácido nucleico, en el que la cantidad o nivel de uno o más ácidos nucleicos se determina en la muestra, por ejemplo, el transcripto de ácido nucleico del gen de interés. En estas realizaciones, la muestra que se ensaya para generar el perfil de expresión empleado en los métodos de diagnóstico es una que es una muestra de ácido nucleico. La 5 muestra de ácido nucleico incluye una pluralidad o población de ácidos nucleicos distintos que incluye la información de expresión de los genes de interés determinativos del fenotipo de la célula o tejido que se está diagnosticando. El ácido nucleico puede incluir ácidos nucleicos de ARN o ADN, por ejemplo, ARNm, ARNc, ADNc, etc., siempre que la muestra conserve la información de expresión del tejido o célula hospedadora del cual se obtiene. La muestra puede prepararse de diversas maneras, como se sabe en la técnica, por ejemplo, por aislamiento de ARNm de una célula, 10 donde el ARNm aislado se utiliza como es, amplificado, empleado para preparar ADNc, ARNc, etc., como se sabe en la técnica de expresión diferencial. En determinadas realizaciones, la muestra se prepara a partir de una célula o tejido extraído de un sujeto a diagnosticar, por ejemplo, mediante biopsia de tejido, utilizando protocolos convencionales, donde los tipos de células o de tejidos, a partir de los cuales pueden generarse dichos ácidos nucleicos, incluyen cualquier tejido en el que exista el modelo de expresión del fenotipo a determinar, incluyendo, sin 15 limitación, células linfocíticas de sangre periférica, etc., como se ha indicado anteriormente.

El perfil de expresión puede generarse a partir de la muestra inicial de ácido nucleico utilizando cualquier protocolo conveniente. Aunque se conocen varias maneras diferentes de generar perfiles de expresión, tales como las empleadas en el campo del análisis de expresión génica diferencial, un tipo de protocolo representativo y 20 conveniente para generar perfiles de expresión son los protocolos de generación de perfiles de expresión génica basados en matrices. En determinadas realizaciones, dichas aplicaciones son ensayos de hibridación en los que se emplea una matriz de ácido nucleico que presenta ácidos nucleicos “sonda” para cada uno de los genes a ensayar/perfilar en el perfil a generar. En estos ensayos, primero se prepara una muestra de ácidos nucleicos diana a partir de la muestra de ácido nucleico inicial que va a ensayarse, donde la preparación puede incluir marcar los 25 ácidos nucleicos diana con un marcador, por ejemplo, un miembro de un sistema de producción de señales. Después de la preparación de la muestra del ácido nucleico diana, la muestra se pone en contacto con la matriz en condiciones de hibridación, por lo que se forman complejos entre ácidos nucleico diana que son complementarios a secuencias sonda unidas a la superficie de la matriz. Después se detecta la presencia de complejos hibridados, cualitativa o cuantitativamente. La tecnología de hibridación específica que puede realizarse en la práctica para 30 generar los perfiles de expresión empleados en los métodos en cuestión incluye la tecnología descrita en las Patentes de Estados Unidos Nos 5.143.854; 5.288.644; 5.324.633; 5.432.049; 5.470.710; 5.492.806; 5.503.980; 5.510.270; 5.525.464; 5.547.839; 5.580.732; 5.661.028; 5.800.992; así como en los documentos WO 95/21265; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; EP 373 203; y EP 785 280. En estos métodos, una matriz de ácidos nucleicos “sonda” que incluye una sonda para cada uno de los genes determinativos del fenotipo cuya expresión se 35 está ensayando se pone en contacto con ácidos nucleico diana como se ha descrito anteriormente. El contacto se realiza en condiciones de hibridación, por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas, y después se retira el ácido nucleico no unido.

El patrón de ácido nucleico hibridado resultante proporciona información relativa a la expresión de cada uno de los 40 genes que se han confirmado, donde la información de la expresión es en términos de si el gen se expresa o no y normalmente a que nivel, donde los datos de expresión, es decir, perfil de expresión (por ejemplo, en forma de un transcriptosoma), pueden ser tanto cualitativos como cuantitativos.

Como alternativa, pueden emplearse métodos no basados en matrices para cuantificar los niveles de uno o más 45 ácidos nucleicos en una muestra, incluyendo PCR cuantitativa, PCR cuantitativa en tiempo real y similar. (Para detalles generales con respecto a la PCR en Tiempo Real véase: An Essential Guide, K. Edwards et al., eds., Horizon Bioscience, Norwich, R. U. (2004)).

Cuando el perfil de expresión es un perfil de expresión de proteína, puede emplearse cualquier protocolo de 50 cuantificación de proteínas conveniente, donde se determinan los niveles de una o más proteínas en la muestra ensayada. Como métodos representativos se incluyen, pero sin limitación: matrices proteómicas, citometría de flujo, inmunoensayos convencionales (por ejemplo, ensayos ELISA, transferencia de western), ensayos de actividad de proteínas, incluyendo ensayos de actividad de proteínas múltiples, etc.

55

Después de la obtención de los datos de expresión, o perfil de expresión, de la muestra que ese está ensayando, se analiza el perfil de expresión. En determinadas realizaciones, los análisis incluyen comparar el perfil de expresión con un perfil de referencia o control para monitorizar un episodio de RA en el sujeto a partir del cual se obtiene/procede la muestra. Los términos “referencia” y “control”, como se utilizan en este documento, significan un patrón de expresión génica o de niveles de expresión estandarizado de determinados genes a usar para interpretar 5 la firma de expresión de un paciente determinado con respecto a una respuesta de RA. El perfil de referencia o control puede ser un perfil que se obtiene a partir de una célula/tejido que se sabe que tiene el fenotipo deseado, por ejemplo, que tiene un fenotipo RA, y por lo tanto puede ser un perfil de referencia o control positivo. Además, el perfil de referencia/control puede ser de una célula/tejido que se sabe que no tiene el fenotipo deseado, por ejemplo, un fenotipo AR negativo (por ejemplo STA o control no trasplantado), y por lo tanto ser un perfil de referencia/control 10 negativo.

En determinadas realizaciones, el perfil de expresión obtenido se compara con un solo perfil de referencia/control para obtener información con respecto a una respuesta de RA. En otras realizaciones adicionales, el perfil de expresión obtenido se compara con dos o más perfiles de referencia/control diferentes para obtener información más 15 detallada en lo que respecta al fenotipo RA de la célula/tejido analizado. Por ejemplo, el perfil de expresión obtenido puede compararse con un perfil de referencia negativo y positivo para obtener información confirmada con respecto a si la célula/tejido tiene un fenotipo RA particular.

La comparación del perfil de expresión obtenido y el uno o más perfiles de referencia/control pueden realizarse 20 utilizando cualquier metodología conveniente, donde los expertos conocen diversas metodologías en la técnica de matrices, por ejemplo, comparando imágenes digitales de los perfiles de expresión, comparando bases de datos de datos de expresión, etc. Las patentes que describen formas de comparar perfiles de expresión incluyen, pero sin limitación, las Patentes de Estados Unidos Nos 6.308.170 y 6.228.575. Anteriormente también se describen métodos de comparación de perfiles de expresión. 25

La etapa de comparación da como resultado información en relación con la similitud o diferencia del perfil de expresión obtenido con respecto al perfil (o perfiles) de control/referencia, cuya información de similitud/diferencia se emplea para determinar el fenotipo de la célula/tejido que se está analizando y por lo tanto proporciona una forma de monitorizar una RA en el sujeto. Por ejemplo, la similitud del perfil de expresión génica obtenido con el perfil de 30 expresión génica de una muestra control de un sujeto que experimenta una respuesta de RA activa indica que la célula/tejido analizado procede de un sujeto que experimenta AR. Del mismo modo, la similitud del perfil de expresión génica obtenido con el perfil de expresión génica de una muestra de control de un sujeto que no ha tenido (o no está teniendo) un episodio de RA (por ejemplo, STA) indica que la célula/tejido analizado es de un sujeto que no experimenta AR. 35

Dependiendo del tipo y de la naturaleza del perfil (o perfiles) de referencia/control con el que se compara el perfil de expresión, la etapa de comparación anterior produce varios tipos diferentes de información con respecto a la célula/tejido que se analiza. Como tal, la etapa de comparación anterior puede producir una determinación positiva/negativa de una respuesta de RA en curso. En muchas realizaciones, la información anterior obtenida sobre 40 la célula/tejido que se está analizando se emplea para predecir si un sujeto experimentará una respuesta de RA, por ejemplo, al cabo de 3 a 6 meses a partir del momento de recoger la muestra, y/o para caracterizar una respuesta de RA, por ejemplo, si una respuesta de RA es resistente o sensible a esteroides. En determinadas realizaciones, la determinación/predicción del RA puede asociarse con una determinación de características adicionales del injerto y su función. Por ejemplo, en determinadas realizaciones pueden evaluarse otras patologías relacionadas con injertos, 45 por ejemplo, rechazo crónico (o CAN) y/o toxicidad farmacológica (DT) (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/375.681, presentada el 3 de marzo de 2006).

Los métodos en cuestión encuentran uso además en aplicaciones farmacogenómicas. En estas aplicaciones, un sujeto/hospedador/paciente se monitoriza primero para RA de acuerdo con la invención en cuestión y después se 50 trata utilizando un protocolo determinado, al menos en parte, sobre los resultados de la monotorización. Por ejemplo, la presencia o ausencia de RA puede evaluarse en un hospedador utilizando un protocolo tal como el protocolo de diagnóstico descrito en la sección anterior. El sujeto puede después tratarse utilizando un protocolo cuya idoneidad se determina utilizando los resultados de la etapa de monitorización. Por ejemplo, cuando se predice que el sujeto tiene una respuesta de RA al cabo de los próximos 3 a 6 meses, la terapia inmunosupresora puede modularse, por 55 ejemplo, aumentarse o pueden cambiarse los fármacos, como se sabe en la técnica para el tratamiento/predicción de RA. Del mismo modo, cuando se predice que el sujeto no tiene RA actual o a medio plazo, la terapia inmunosupresora puede reducirse para reducir la posibilidad de DT.

En la reacción práctica de los métodos en cuestión, el RA de un sujeto se monitoriza normalmente después de 60 recibir un injerto o trasplante. El sujeto puede examinarse una o varias veces después de recibir el trasplante, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, bimensualmente, semestralmente, anualmente, etc. En determinadas realizaciones, el sujeto se monitoriza antes de que aparezca un episodio de RA. En otras realizaciones determinadas, el sujeto se monitoriza después de que aparezca un episodio de RA.

65

Los métodos en cuestión pueden emplearse con diversos tipos diferentes de sujetos trasplantados. En muchas realizaciones, los sujetos pertenecen a la clase de mamíferos, incluyendo de los órdenes carnívoros (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas), lagomorfos (por ejemplo conejos) y primates (por ejemplo, seres humanos, chimpancés y monos). En determinadas realizaciones, los animales u hospedadores, es decir, sujetos (denominados también en este documento pacientes) son seres humanos. 5

Los métodos pueden utilizarse para monitorizar diversos tipos diferentes de injertos. Los injertos de interés incluyen, pero sin limitación: corazón, riñón, pulmón, hígado, páncreas, islotes pancreáticos, tejido cerebral, estómago, intestino delgado, intestino grueso, córnea, piel, tráquea, hueso, médula ósea, músculo, vejiga o partes de los mismos, trasplantados. 10

BASES DE DATOS DE PERFILES DE EXPRESIÓN DE GENES DETERMINANTES DE FENOTIPO

También se proporcionan bases de datos de perfiles de expresión de respuestas de RA. Dichas bases de datos comprenderán normalmente perfiles de expresión de tejidos específicos de un receptor de trasplante que son 15 indicativos de uno o más de: un evento de RA a medio plazo (3 a 6 meses), una respuesta de RA en curso, una respuesta de RA anterior y una característica de una respuesta de RA (por ejemplo, una respuesta de RA resistente/sensible a esteroides).

Los perfiles de expresión y las bases de datos de los mismos pueden proporcionarse en diversos medios para 20 facilitar su uso (por ejemplo en un formato accesible al usuario/legible). “Medios” se refiere a una fabricación que contiene la información del perfil de expresión de la presente invención. Las bases de datos de la presente invención pueden registrarse en medios legibles por ordenador, por ejemplo, cualquier medio que pueda leer y al cual pueda acceder directamente un usuario empleando un ordenador. Dichos medios incluyen, pero sin limitación: medios de almacenamiento magnéticos, medios de almacenamiento tales como disquetes, discos duros y cinta magnética; 25 medios de almacenamiento ópticos, tales como CD-ROM; medios de almacenamiento electrónicos tales como RAM y ROM; e híbridos de estas categorías tales cómo medios de almacenamiento magnéticos/ópticos. Un experto en la materia puede apreciar fácilmente como pueden utilizarse cualquiera de los medios legibles por ordenador actualmente conocidos para crear una fabricación que comprenda un registro de la información de las bases de datos actuales. “Registrado” se refiere a un proceso para almacenar información en un medio legible por ordenador, 30 utilizando cualquiera de dichos métodos conocidos en la materia. Puede seleccionarse cualquier estructura de almacenamiento de datos conveniente, basándose en los medios utilizados para acceder a la información almacenada. Para almacenar pueden utilizarse diversos programas y formatos de procesadores de datos, por ejemplo, archivo de texto de procesamiento Word, formatos de bases de datos, etc. Por tanto, las bases de datos del perfil de expresión en cuestión son accesibles al usuario, es decir, los archivos de bases de datos se guardan en un 35 formato legible para el usuario (por ejemplo, un formato legible por ordenador, donde un usuario controla el ordenador).

Como se usa en este documento, “un sistema basado en ordenador” se refiere a medios hardware, medios software y medios de almacenamiento de datos utilizados para analizar la información de la presente invención. El hardware 40 mínimo de los sistemas basados en ordenador de la presente invención comprende una unidad de procesamiento central (CPU), medios de entrada, medios de salida, y medios de almacenamiento de datos. Un experto en la materia puede apreciar fácilmente que uno cualquiera de los sistemas basados en ordenador, actualmente disponibles, son adecuados para su uso en la presente invención. Los medios de almacenamiento de datos pueden comprender cualquier fabricación que comprenda un registro de la presente invención, como se ha descrito 45 anteriormente, o un medio de acceso a la memoria al cual puede acceder dicha fabricación.

Pueden utilizarse diversos formatos estructurales para los medios de entrada y salida para introducir y extraer la información en los sistemas basados en ordenador de la presente invención, por ejemplo, hacia y desde un usuario. Un formato para un medio de salida clasifica perfiles de expresión que poseen diversos grados de similitud con un 50 perfil de expresión de referencia. Dicha presentación proporciona al experto (o usuario) en la matera una clasificación de similitudes e identifica el grado de similitud contenido en el perfil de expresión de ensayo con uno o más perfiles de referencia.

REACTIVOS, SISTEMAS Y KITS 55

También se proporcionan reactivos, sistemas y kits de los mismos para llevar a cabo uno o más de los métodos descritos anteriormente. Los reactivos, sistemas y kits de los mismos en cuestión pueden variar enormemente. Como reactivos de interés se incluyen reactivos diseñados específicamente para su uso en la producción de los perfiles de expresión de genes determinantes de fenotipo AR descritos anteriormente, es decir, un elemento de 60 evaluación de expresión de genes constituido por uno o más reactivos. El término sistema se refiere a un conjunto de reactivos, no obstante compilados, por ejemplo, adquiriendo el conjunto de reactivos en el mismo o diferente proveedor. El término kit se refiere a un conjunto de reactivos proporcionados, por ejemplo, vendidos juntos.

Un tipo de dicho reactivo es una matriz de ácidos nucleicos sonda en la que se representan los genes de interés 65 determinantes del fenotipo. En la técnica se conocen diversos formatos de matrices diferentes, con una amplia

diversidad de diferentes estructuras sonda, composiciones de sustrato y tecnologías de unión (por ejemplo, matrices de transferencia puntual, micromatrices, etc.). Como estructuras de matrices de interés representativas se incluyen las descritas en las Patentes de Estados Unidos Nos 5.143.854; 5.288.644; 5.324.633; 5.432.049; 5.470.710; 5.492.806; 5.503.980; 5.510.270; 5.525.464; 5.547.839; 5.580.732; 5.661.028; 5.800.992; así como en los documentos WO 95/21265; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; EP 373 203 y EP 785 280. 5

En determinadas realizaciones, las matrices incluyen sondas para los genes indicados en la Tabla 1. Las matrices en cuestión pueden incluir solo los genes que se indican en la Tabla 1 o pueden incluir otros genes que no están indicados en la Tabla 1, tales como sondas para genes cuyo patrón de expresión puede utilizarse para evaluar características de trasplante adicionales, incluyendo pero sin limitación: lesión crónica del aloinjerto (rechazo 10 crónico) en la sangre, toxicidad farmacológica inmunosupresora o efectos secundarios adversos que incluyen hipertensión inducida por fármacos; genes asociados con la edad o con el índice de masa corporal que se correlacionan con patología renal o que explican diferencias en la aceptación del injerto relacionadas con la edad del receptor; marcadores de inmunotolerancia en sangre entera; genes encontrados en revisiones bibliográficas con funciones inmunomoduladoras que pueden desempeñar una función en los resultados del trasplante; así como otros 15 genes relacionados con la función de ensayos en matrices, por ejemplo, para evaluar la calidad de la muestra (sesgo 3’ a 5’ en localización de sondas), error de muestreo en estudios basados en biopsias, marcadores de superficie celular y genes normalizantes para calibrar resultados de hibridación; y similar. Cuando las matrices en cuestión incluyen sondas para dichos genes adicionales, en determinadas realizaciones el % en número de genes adicionales que se representa y que no está directa o indirectamente relacionado con el trasplante no supera aproximadamente 20 el 50 %, normalmente no supera aproximadamente el 25 %. En determinadas realizaciones en las que se incluyen genes adicionales, una gran mayoría de genes en el conjunto son genes de caracterización del trasplante, donde por gran mayoría se entiende al menos aproximadamente 75 %, normalmente al menos aproximadamente 80 % y algunas veces al menos aproximadamente 85, 90, 95 % o mayor, incluyendo realizaciones en las que el 100 % de los genes en el conjunto son genes determinantes de fenotipo. Los genes de caracterización de trasplante son 25 genes cuya expresión puede emplearse para caracterizar la función del trasplante de alguna manera, por ejemplo, presencia de rechazo, etc.

Otro tipo de reactivo que está específicamente adaptado para generar perfiles de expresión de genes determinantes de fenotipo es un conjunto de cebadores específicos de genes que se diseña para amplificar selectivamente dichos 30 genes (utilizando, por ejemplo, una técnica basada en PCR, por ejemplo, RT-PCR en tiempo real). En la patente de Estados Unidos Nº 5.994.076 se describen cebadores específicos de genes y métodos de uso de los mismos. En la invención, todos los genes que incluidos en la Tabla 1 son cebadores en el conjunto. Los conjuntos de cebadores específicos de genes en cuestión pueden incluir solo los genes que se indican en la Tabla 1, o pueden incluir cebadores para genes adicionales que no estén indicados en la Tabla 1, tales como sondas para genes cuyo patrón 35 de expresión puede utilizarse para evaluar características de trasplante adicionales, incluyendo pero sin limitación: lesión crónica del aloinjerto (rechazo crónico) en la sangre; toxicidad farmacológica inmunosupresora o efectos secundarios adversos que incluyen hipertensión inducida por fármacos; genes asociados con la edad o con el índice de masa corporal que se correlacionan con patología renal o que explican diferencias en la aceptación del injerto relacionadas con la edad del receptor; marcadores de inmunotolerancia en sangre entera; genes encontrados en 40 revisiones bibliográficas con funciones inmunomoduladoras que pueden desempeñar una función en los resultados del trasplante; así como otros genes relacionados con la función de ensayos en matrices, por ejemplo, para evaluar la calidad de la muestra (sesgo 3’ a 5’ en localización de sondas), error de muestreo en estudios basados en biopsias, marcadores de superficie celular y genes normalizantes para calibrar resultados de hibridación; y similar. Cuando las matrices en cuestión incluyen sondas para dichos genes adicionales, en determinadas realizaciones el 45 % en número de genes adicionales que se representa y que no está directa o indirectamente relacionado con el trasplante no supera aproximadamente el 50 %, normalmente no supera aproximadamente el 25 %. En determinadas realizaciones en las que se incluyen genes adicionales, una gran mayoría de genes en el conjunto son genes de caracterización del trasplante, donde por gran mayoría se entiende al menos aproximadamente 75 %, normalmente al menos aproximadamente 80 % y algunas veces al menos aproximadamente 85, 90, 95 % o mayor, 50 incluyendo realizaciones en las que el 100 % de los genes en el conjunto son genes determinantes de fenotipo.

Los kits de la invención en cuestión pueden incluir las matrices descritas anteriormente y/o los conjuntos de cebadores específicos de genes. Los kits también pueden incluir uno o más reactivos adicionales empleados en los diversos métodos, tales como cebadores para generar ácidos nucleicos diana, dNTP y/o rNTP, que pueden 55 premezclarse o separarse, uno o más dNTP y/o rNTP excepcionalmente marcados, tal como biotinilados o dNTP con etiquetas Cy3 o Cy5, partículas de oro o plata con diferentes espectros de dispersión, u otro reactivo de marcaje post-síntesis, tal como derivados químicamente activos de colorantes fluorescentes, enzimas, tales como transcriptasas inversas, ADN polimerasas, ARN polimerasas y similares, diversos medios tampón, por ejemplo tampones de hibridación y de lavado, matrices sonda prefabricadas, reactivos de purificación de sondas marcados y 60 componentes como columnas de centrifugación, etc., reactivos de generación y detección de señales, por ejemplo conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina, sustratos quimiofluorescentes o quimioluminiscentes y similares.

Los kits en cuestión también incluyen un elemento determinante de fenotipo, cuyo elemento es, en muchas realizaciones, un perfil de expresión de referencia o control que puede emplearse, por ejemplo, a través de un medio 65 informático adecuado, para realizar una determinación de fenotipo de RA basada en un perfil de expresión de

“entrada”, por ejemplo, que se ha determinado con el elemento de evaluación de genes de expresión descrito anteriormente. Como elementos de determinación de fenotipos representativos se incluyen bases de datos de perfiles de expresión, por ejemplo, perfiles de referencia o control, como se ha descrito anteriormente.

Además de los componentes anteriores, los kits en cuestión también incluirán instrucciones para realizar los 5 métodos en cuestión. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits en cuestión en diversas formas, pudiendo estar una o más de estas en el kit. Una forma en la que pueden estar estas instrucciones es como una información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, en un trozo o trozos de papel en los que se imprime la información, en el envase del kit, en un prospecto de envase, etc. Incluso otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, un disquete, CD, etc., en el que se ha registrado la información. Otro medio más 10 que puede estar presente es una dirección de una página web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio extraído. En los kits puede haber cualquier medio conveniente.

Los siguientes ejemplos se proporcionan a título ilustrativo y no limitativo.

15

Noviembre 2003

EXPERIMENTAL

EJEMPLO I 20

MÉTODOS

Diseño del estudio

25

En este estudio se recogieron datos demográficos y clínicos de los pacientes para todos los receptores proporcionando muestras de sangre periférica. En la Figura 11 y en la Tabla 1 (más adelante) se ofrecen datos de la media  desviación típica de los conjuntos de estudios diferentes (Conjunto de Verificación, Conjunto de Validación 1 y Conjunto de Validación 2). Dentro de cada conjunto de muestras, los fenotipos RA y STA tienen datos demográficos coincidentes. Para investigar el comportamiento de genes basados en sangre para el diagnóstico de 30 RA, se seleccionaron deliberadamente conjuntos de estudios de muestras, independientemente del tiempo post-trasplante, para tener diferentes tiempos medios post-trasplante.

Tabla 1

Micromatriz_Affy

cPCR

Características Clínicas

RA STA Conjunto de Verificación Conjunto de Validación 1 Conjunto de Validación 2

valor p AR STA RA STA valor p RA STA

valor p valor p

(n=31) (n=28) (n=17) (n=17) (n=21) (n=21) (n=32) (n=32)

Receptores

Sexo, % de mujeres

34,3 % 51,4 % 0,1 34,6 % 50 % 0,3 31,6 % 42,9 % 0,5 33,3 % 43,8 % 0,5

Edad media, años

12,0  5,1 10,7  6,2 0,2 11,8  4,7 7,8  6,8 0,1 11,2  5,9 13,5  5 0,2 12,5  6,2 13,9  6,3 0,5

Inmunosupresión, %SE

45,7 % 54,1 % 0,5 46,2 % 50,0 % 0,8 63,1 % 57,1 % 0,7 66,7 % 68,8 % 0,9

Compatibilidad HLA

1,2  1,7 1,4  1,1 0,7 0,8  0,8 0,7  1,1 0,9 1,6  1,6 0,8 1,0 0,1 1,6  1,3 1,8  0,9 0,2

Tiempo post-tsp, meses

34,8  40,7 23,4  31,2 0,1 31,1  39,4 14  22,4 0,1 12,4  17,9 10,6  9 0,7 7,9  5,2 6,5  4,4 0,4

Donantes

Fuente Donante % DVR

60,0 % 62,2 % 0,9 57,7 % 85,7 % 0,1 31,6 % 61,9 % 0,1 55,6 % 75,0 % 0,2

Sexo, % de mujeres

53,1 % 48,7 % 0,7 50,0 % 42,9 % 0,7 31,6 % 57,1 % 0,1 44,4 % 50,0 % 0,7

Edad media, años

34,9  11,3 30,8  11,4 0,1 33,3  10,9 30,6  10,4 0,5 26,4  11,8 31,1  10,9 0,2 22,1  11,7 37  10,8 0,2

Los valores son medias  DT (Desviación Típica). AR, rechazo agudo; STA, estable; SE, sin esteroides; tsp trasplante; DVR, donante vivo relacionado

Este estudio se emprendió como una suma de 3 proyectos (Figura 1): En el primer proyecto, se realizaron análisis de micromatriz transversales de 122 muestras de sangre periférica extraídas como 2,5 ml de muestras de sangre entera (n=106) o como 5 ml de sangre (n=16) por aislamiento de leucocitos de sangre periférica (LSP)7. Las muestras de sangre se extrajeron en un solo momento, sincronizado con una biopsia donde el rechazo agudo10, se confirmó, como presente (60 muestras de RA) o ausente (62 muestras STA). La preparación de las muestras para la 5 hibridación en matrices se realizó siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante.

Las muestras se hibridaron con una de las 3 plataformas de micromatriz: Affymetrix (n=75, la matriz 54K HGU133Plus2), Agilent (n=26, matriz 44K Whole Human Genome oligo) o la matriz de ADNc Lymphochip (n=21, clones 32K ADNc). En cada plataforma de micromatriz se aplicaron métodos apropiados de detección y 10 normalización de sondas. En Métodos Complementarios (véase más adelante) se proporcionan detalles de preparación de muestras, hibridación y análisis de matrices 11 12 13 14. Todos los archivos de datos de micromatrices se encuentran disponibles en GEO con el Nº de Acceso GSE14067.

En el segundo proyecto, se realizó análisis de C-PCR para verificar y validar genes seleccionados de los estudios de 15 matriz del proyecto 1. La expresión del ARN mensajero para los genes candidatos seleccionado se midió en cada muestra de sangre por C-PCR utilizando productos de ensayo de expresión de genes TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se seleccionaron 32 genes para la verificación por C-PCR (véase Métodos Complementaros/Criterios de Selección de Genes Candidatos para C-PCR) en 34 muestras (17 RA, 17 STA; Conjunto de Verificación) previamente utilizadas para micromatriz, dejadas con una cantidad y calidad adecuada de 20 ARN residual. De los 32 genes, se seleccionaron los 10 genes más significativos para la validación posterior en 42 muestras independientes (21 RA, 21 STA; Conjunto de Validación 1) y un conjunto adicional de 64 muestras independientes (32 RA, 32 STA; Conjunto de Validación 2). Se aplicaron diversos modelos de clasificación 15 incluyendo análisis discriminativo lineal, 5 modelos Bayesianos diferentes, perceptron multicapa y modelos de regresión logística (multinomial y lineal) para los valores de expresión del conjunto de 10 genes obtenidos del 25 Conjunto de Validación 1. Cada uno de estos modelos se construyó utilizando el Conjunto de Validación 1 y se ensayaron en el Conjunto de Validación 2 para evaluar sus sensibilidades, especificidades y precisiones. Un modelo de regresión logística multinomial que utilizaba 5 de los 10 genes del conjunto produjo el mejor comportamiento global. En las Figuras 7 a 10 se proporciona la lista de cebadores de cada uno de los 10 genes, sus ID de sondas ABI correspondientes, la expresión de los 10 genes más significativos por C-PCR y las comparaciones de todos los 30 modelos de clasificación utilizados.

En el tercer proyecto, se aplicó el modelo de diagnóstico de RA de 5 genes para un modelo de predicción de RA en 40 pacientes a los que se había extraído muestras de sangre periférica en serie, extraídas antes (preRA; n=27 muestras) y/o después (postRA; n=30 muestras) de un episodio de RA. Se realizó análisis longitudinal por C-PCR de 35 5 genes en muestras de sangre preRA relacionadas, extraídas 1 a 6 meses antes del episodio de RA, para calcular la predicción de lesión de RA, incluso en el momento de función de injerto no alterada. Estas fueron las únicas muestras en el estudio que no estaban relacionadas con biopsias de injerto. Se realizó un análisis similar en muestras postRA extraídas 1 a 6 meses después del tratamiento del episodio de RA (relacionadas con biopsias de injerto realizadas para examinar la resolución de RA) para investigar el efecto de la inmunosupresión intensificada 40 en la firma del conjunto de 5 genes (Figura 1).

En la siguiente ecuación se muestra un primer modelo de regresión logística utilizando el conjunto de 5 genes:

45

En la siguiente ecuación se muestra un segundo modelo de regresión logística utilizando un conjunto de 5 genes mínimo:

50

En la siguiente ecuación se muestra el modelo de regresión logístico utilizando un conjunto de 5 genes mínimo basándose en las muestras Stanford:

En cada ecuación anterior,  es la probabilidad prevista de una muestra determinada que pertenece a una de las clases (RA o STA). Se seleccionó el umbral  = 0,5 para la mejor sensibilidad y especificidad, basándose en la Curva Característica Operativa del Receptor (ROC) para determinar si la clase predictiva era un fenotipo RA o AST. 5 El modelo se ensayó en el Conjunto de Validación 1 y después volvió a validarse en el Conjunto de Validación 2, para una clasificación verdadera de RA. La precisión del modelo se ensayó evaluando la sensibilidad, especificidad, valor de predicción positivo (VPP) y valor de predicción negativo (VPN) en el conjunto de ensayo (Conjunto de Validación 2). Finalmente, después de confirmar la solidez del modelo para el diagnóstico de RA, el modelo se utilizó para predecir la probabilidad de RA en muestras de sangre relacionadas, extraídas secuencialmente antes y 10 después de RA.

Análisis estadísticos y bioinformáticos

Se utilizó el ensayo de la t de Student para establecer el significado de las diferencias de expresión génica entre las 15 de RA y STA por C-PCR. Todas las diferencias se consideraron estadísticamente significativas para la tasa de descubrimientos falsos (TDF) < 10 %. Los datos se extrajeron sobre las 18 variables demográficas y clínicas siguientes en todas las muestras procesadas para estudios de validación por C-PCR: tiempo post-trasplante, edad del receptor, sexo del receptor, sexo del donante, fuente donante, edad del donante, citomegalovirus/CMV, virus de Epstein-Barr/viremia VEB y virus BK/viremia VBK en el muestreo, infección bacteriana simultánea, presencia de 20 anticuerpos específicos del donante (AED) o anticuerpos reactivos al panel (ARP), uso de terapia de inducción, mantenimiento del uso de esteroides, uso de diferentes fármacos inhibidores de calcineurina (FK506 o ciclosporina A/CSA), uso de diferentes antimetabolitos (micofenolato mofetil/MMF o azatioprina/AZA), el recuento de glóbulos blancos (WBC) y los niveles de hematocrito (HCT) en el momento de la toma de muestras de sangre (Figura 11). Se proporcionaron datos para muestras SNSO1 por PPD (David Ikle). Se utilizó la correlación de Pearson y el ensayo 25 de la t, según sea apropiado, para determinar cualquier influencia de los 18 parámetros como posibles factores de confusión para la expresión del conjunto de 5 genes (Figura 12). Dado que la mayoría de las muestras tenían biopsias relacionadas para la evaluación, las muestras se dividieron en 2 grupos de acuerdo con los grados de puntuación de Banff (1=puntuaciones Banff 1A; 2=puntuaciones Banff 1B); C4d+ se determinó si 10 % de capilares peritubulares (CPT) tuvieron depósitos C4d (Figura 14). 30

La trascendencia biológica del conjunto de 525 genes de plataforma cruzadas se evaluó utilizando el sistema de clasificación PANTHER (http(colon)//www(dot)pantherdb(dot)org) y el Análisis de la Ruta Ingenuity (IPA; http(colon)//www(dot)ingenui-ty(dot)com) (véanse las Figuras 16 y 17). En Métodos Complementarios se proporciona más información. 35

RESULTADOS

Genes significativos para RA en sangre periférica por Análisis de Micromatriz de Plataformas Cruzadas

40

Los datos de micromatriz generados de 3 plataformas de matriz se compararon en cruzado mapeando productos de transcripción comunes y solapantes con nombres de genes de la Organización del Genoma Humano (HUGO). Dado que cada plataforma de matriz utiliza diferentes conjuntos de genes, que se representan utilizando diferentes ID de sonda, se utilizó AILUN (http(colon)//ailun(dot)stanford(dot)edu)12 para reanotar los identificadores (ID) de sonda con los nombres de genes HUGO actuales, que identificaron 10.357 genes comunes que se compartían a largo de las 3 45 plataformas. Se aplicó análisis de micromatriz significativo (SAM11) no relacionado de dos clases, supervisado, con un umbral de significado común de tasa de descubrimientos falsos <10 % para cada uno de los 3 listados de matriz con reanotaciones. Se identificaron 9710 genes en las matrices de Affymetrix, 8642 genes en las matrices de Agilent y 2805 genes en las matrices de ADNc dado que en RA se expresaban diferencialmente de modo significativo. A pesar del gran número de genes significativos en cada plataforma, solo 525 genes se expresaron diferencialmente 50 en las 3 plataformas (Figura 5), independientemente del procedimiento de extracción de las muestras de sangre.

Verificación y validación por C-PCR (Conjunto de Validación 1)

Se seleccionaron 32 genes para verificación inicial por C-PCR en 34 muestras (17 RA, 17 STA) que también se 55 habían utilizado en los estudios de micromatriz. A partir de estos datos, los 10 genes más significativos (q < 10 %) se validaron adicionalmente en 42 muestras de sangre independientes (Conjunto de Validación 1; 21 RA, 21 STA). Los factores de cambio de expresión de estos 10 genes más significativos coincidían con datos de matriz, con los mismos factores de cambio de dirección y una mayor señal por C-PCR que por micromatriz (Figura 1) y separación de las muestras en fenotipos RA o STA por agrupamiento no supervisado de datos de expresión para el conjunto de 60 10 genes por C-PCR (Figura 2). Los datos de expresión individuales de cada gen y de cada muestra se muestran en

la Figura 6B. Para los 3 genes seleccionados de la bibliografía de RA, la expresión por C-PCR de FOXP3 16 y GRZYB 17 18 aumentó en RA en comparación con muestras de sangre STA (p=0,001, p=0,03 respectivamente) (Figura 7), incluso aunque estos genes no estaban entre el listado de genes significativos de las micromatrices de Affymetrix y tanto PFN1 19 como GRZYB estaban inversamente regulados negativamente en RA en la plataforma de ADNc y Agilent respectivamente, sin diferencia estadística por C-PCR entre muestras de RA y STA. Por tanto 5 ninguno de estos 3 genes se utilizó para estudios posteriores de validación cruzada.

Validación cruzada (Conjunto de Validación 2) y Modelo de Predicción para Clasificación de RA

Un modelo de regresión logística multinominal, que demostró el mejor comportamiento de los 10 modelos de 10 clasificación ensayados (detalles en la Figura 10), dio como resultado un modelo de 5 genes mínimo para la predicción de RA con una alta confianza mostrada por puntuación ROC =95,2 %, cuando se ensayó en datos de C-PCR de las 64 muestras independientes en el Conjunto de Validación 2. La expresión en el conjunto de 5 genes muestra una excelente separación de las clases de RA y STA (Figura 3), con una alta puntuación de predicción de RA con una sensibilidad del 100 %, una especificidad del 93,6 %, un valor predictivo positivo (VPP) del 94,1 % y un 15 valor predictivo negativo (VPN) del 100 %. La única clasificación errónea estaba relacionada con 2 muestras STA. Las dos muestras STA mal clasificadas desarrollaron RA clínico a los 4 y 7 meses después del muestreo inicial de este estudio, lo que sugiere que la predicción de RA del ensayo de 5 genes puede ser más fuerte que la calculada por el modelo de predicción.

20

Evaluación de factores de confusión demográficos, clínicos y de biopsia para el conjunto de 5 genes para diagnóstico de RA

Para examinar si algún factor de confusión inicial, o durante el muestreo, demográfico, clínico o inmunosupresor podía dirigir la segregación de la puntuación de predicción del conjunto de 5 genes para RA, los coeficientes de 25 correlación de Pearson calculados para datos extraídos de 18 factores de confusión diferentes (Figura 11), mostraron efectos sin factores de confusión sobre la expresión del conjunto de 5 genes (máximo |r| = 0,27) (Figuras 12 y 13). Mediante el ensayo de t, DUSP1 y PSEN1 tuvieron una mayor expresión (p<0,01) en pacientes con AED positivos. De manera similar, también se examinó si el grado o tipo de rechazo tenía una influencia sobre la expresión del conjunto de 5 genes (Figura 14). No se encontró correlación entre la predicción de probabilidad de RA 30 por el conjunto de 5 genes y puntuaciones de Banff (r=-0,13), rechazo celular frente a humoral (r=0,07) y presencia o ausencia de C4d+ peritubular (r=0,2) (Figura 14). Estos datos confirman que la expresión coordinada del conjunto de 5 genes en sangre periférica puede diagnosticar RA con una alta confianza, independientemente de las diferencias en cuanto a las características de los pacientes y elecciones de inmunosupresión normalmente utilizadas, duración del rechazo o el mecanismo subyacente de lesión por rechazo. 35

Predicción de lesión de RA anterior a disfunción por injerto y biopsias clínicamente indicadas

Se aplicó el modelo de regresión de RA construido en muestras transversales, en 27 muestras de sangre preRA (extraídas secuencialmente 1 a 6 meses antes de un episodio de AR confirmado, anterior a cualquier disfunción 40 clínica de injerto), como parte del protocolo de muestreo en serie de sangre después del trasplante. De manera adicional, también se realizó el perfil de 70 muestras de sangre en serie de 58 pacientes STA exclusivos, que no tuvieron ningún RA, extraídas en el momento de las biopsias de protocolo en los meses 1, 3, 6, 12 y 24 post-trasplante por C-PCR para el conjunto de 5 genes para predicción de RA. Como se muestra en la Figura 4, la firma de 5 genes de muestras STA que se extrajeron a diversos momentos post-trasplante permaneció “estable”, con 45 puntuaciones de predicción de RA bajas y con pocos cambios en las puntuaciones de expresión a lo largo del post-trasplante (Figura 4A). Sin embargo, en el grupo de pacientes RA (Figura 4B; pacientes preRA, RA y postRA), el nivel de expresión del conjunto de 5 genes es un nivel significativamente más alto (p<0,001) en pacientes rechazadores (puntuaciones de predicción de RA > 50 % en todos los pacientes RA, frente a <20 % en todos los pacientes STA), incluso 6 meses antes de un episodio de RA. Este hallazgo sugiere que los pacientes que 50 experimentan episodios de RA después del trasplante tienen un perfil de inmunoactivación en su sangre periférica que puede medirse cuantitativamente bien antes de un episodio de RA clínicamente importante y documentado con biopsia. Cabe destacar que la puntuación de predicción de RA para muestras de sangre examinadas en los 3 meses del episodio de rechazo es equivalente a la muestra extraída en el momento de RA (Figura 4B), proporcionando una posible ventana para intensificar la inmunosupresión para mitigar o tratar el RA precoz y/o instigar una biopsia más 55 precoz. Cuando el tratamiento de inmunosupresión se intensifica en el RA (bolo de esteroides o timoglobulina en este estudio), hay una reducción rápida de la firma de 5 genes durante los 3 meses siguientes, independientemente del fármaco para el tratamiento de RA (Figura 4B). La Figura 15 proporciona probabilidades de RA medias junto con errores típicos y eliminaciones de creatitina calculadas 20 para cada grupo de muestras.

60

ANÁLISIS

La biopsia de trasplante es el patrón de oro actual para el diagnóstico de RA pero está limitado por su naturaleza invasiva, por la dificultad para obtener muestras múltiples, y a menudo identificar RA solo en presencia de lesión tisular avanzada y disfunción clínica de injerto. Actualmente no se dispone de ensayos sanguíneos fiables para 65 diagnosticar y predecir el RA, dado que muchos factores de confusión clínicos, incluyendo la sobre-representación

de genes de globina en muestras de sangre entera, dirigen cambios de expresión 7 y en el pasado, la identificación sólida de biomarcadores de RA basados en sangre había estado obstaculizada por el pequeño tamaño de la muestra, varianza experimental7, infecciones simultáneas y la heterogeneidad molecular subyacente de lesión tisular por rechazo.

5

Como se ha demostrado anteriormente, se ha identificado un conjunto de genes altamente riguroso cuya evaluación de expresión en una muestra de paciente con trasplante (por ejemplo, sangre periférica) puede utilizarse para monitorizar una respuesta de RA. Este método de evaluación de conjuntos de genes confirma diferentes factores de confusión precisos múltiples trasversales, tales como diferencias en la preparación de muestras, datos demográficos del receptor y donante, edad del receptor, tiempo post-trasplante, uso de inmunosupresión o infección simultánea. 10 Se ha validado un conjunto mínimo de 5 genes para el diagnóstico de RA no invasivo en 152 muestras de sangre independientes. La expresión del conjunto de 5 genes es suficiente para la predicción de RA comprobado por biopsia con altos niveles de confianza incluso 3 meses antes de disfunción clínica del injerto. De manera adicional, la expresión del conjunto de 5 genes está regulada diferencialmente en rechazadores, en comparación con no rechazadores, hasta 7 meses antes de un episodio de RA comprobado por biopsia, indicando que la regulación 15 diferencial del conjunto de 5 genes en sangre puede utilizarse como un baremo para la inmunoactivación y valoración del riesgo para RA futuro. Dado que la firma de 5 genes se “normaliza” con niveles más próximos a los observados en pacientes STA no rechazadores con intensificación de inmunosupresión, las mediciones en serie de este conjunto de genes puede servir como un barómetro “inmunitario” para definir” un umbral de inmunoactivación del paciente individual para la predicción de RA muchos meses antes de una disfunción clínica del injerto. Esta es 20 una etapa importante y crítica contra la individualización de regímenes inmunosupresores en un receptor de trasplante.

REFERENCIAS

25

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children derived from body length and plasma creatinine. Pediatrics 1976; 58(2): 259-63.

MÉTODOS COMPLEMENTARIOS

Pacientes y muestras 5

Se recogieron 274 muestras únicas de sangre periférica de 274 receptores pediátricos y adultos jóvenes de aloinjerto de riñón en la Universidad de Stanford (n=193) y otros centros SNS01 (n=81) (del 2002 al 2007). Todas las muestras de sangre se obtuvieron en el momento de biopsias de injerto de protocolo o indicadas clínicamente relacionadas que se utilizaron para categorizar la muestra como rechazo agudo (RA; n=109) 1, o estable, si había 10 ausencia de RA u otra patología considerable (STA, n=108).

El diagnóstico de rechazo agudo lo confirmó un solo patólogo (NK) en la re-evaluación de todas las muestras, antes de su inclusión en este estudio. Las muestras RA se obtuvieron antes del tratamiento de intensificación para rechazo. También se extrajeron 57 muestras secuenciales adicionales antes de RA (preRA, n=27) y después de RA (postRA, n=30) y también se recogieron muestras de sangre post-trasplante en serie de un subconjunto de pacientes 15 STA (n=70). Todos los sujetos dieron su consentimiento con total conocimiento de causa. El estudio lo aprobó la Stanford Institutional Review Board y cada uno de los centros SNS01 del Institutional Review Board.

Recogida de muestras, extracción de ARN, preparación e hibridación de dianas de micromatriz

20

Las muestras de sangre periférica se recogieron en forma de sangre entera (n=106) o de leucocitos de sangre periférica (LSP; n=16). Todas las muestras SNSO1 se recogieron como sangre entera; las muestras de Stanford se recogieron como LSP entre el 2002 y 2004 y como sangre entera o LSP, entre el 2004 y 2007.

Para el ARN total extraído de sangre entera, se recogieron 2,5 ml de sangre periférica en Tubos de ARN de Sangre 25 PAXgene™ (PreAnalytiX, Qiagen) y se procesaron utilizando el Kit de ARN de Sangre PAXgene (PreAnalytiX, Qiagen). Para el ARN extraído de leucocitos, se recogieron 5 -10 ml de sangre entera en tubos de heparina sódica. Los leucocitos se recuperaron por separación inicial de los glóbulos blancos por centrifugación y lisis de eritrocitos 2. La ARN se extrajo utilizando el Kit® RNeasy Midi (Qiagen Inc, Valencia, CA). La concentración de ARN se midió utilizando NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) y la integridad del ARN se evaluó con el 30 Bioanalizador Agilent 2100 utilizando Nano Microplacas de ARN (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). El ARN se conservó a una temperatura de -80 ºC hasta su uso posterior para micromatriz y C-PCR.

Las preparaciones de las muestras para las hibridaciones de matriz Affymetrix y Agilent se realizaron utilizando el protocolo T7 (T7), que emplea síntesis de ARNc de un ciclo utilizando el Cebador T7-Oligo (dT). Para los matrices 35 Affymetrix, se utilizó un total de 2 g de ARN total para la síntesis de ARNc como producto final siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARNc se hibridó en las Matrices Plus 2.0 U133 del Genoma Humano GeneChip® (Affymetrix Inc. Santa Clara, CA). Se utilizaron 100 ng de ARN total para la hibridación en la matriz Agilent siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARNc amplificado y purificado se incorporó con colorante Cy5 (muestra de ensayo) o colorante Cy3 (referencia común igual a la utilizada en la matriz de ADNc), la mezcla de dos muestras 40 marcadas se aplicó sobre la Micromatriz Oligo del Genoma Humano Completo Agilent 44k o 4x44k. Se procesaron micromatrices3 de ADNc , que contenían 32.000 clones de ADNc (12.400 genes únicos conocidos), utilizando protocolos establecidos, utilizando 2 ug de ARN en cada canal contra una referencia común (grupo de ARN de líneas tumorales múltiples). Las micromatrices Affymeterix y de ADNc hibridadas se escanearon utilizando GenePix 4000 (Axon Instruments, Union City, CA) y con el paquete informático GenePix Pro se analizaron imágenes 45 fluorescentes. Los portaobjetos Agilent se escanearon utilizando un escáner de micromatriz de ADN Agilent.

Análisis de perfil de expresión de genes

Se utilizaron diferentes criterios para la detección de sondas para diferentes plataformas de matriz. Para la matriz 50 Affymetrix HG133plus2.0, los datos de matriz originales se normalizaron a Cuartil-Cuartil utilizando el programa informático dChip (DNA-Chip Analyzer, www(dot)dchip(dot)org) después se calcularon las intensidades y la calidad del nivel de las sondas y se midieron incluyendo intensidad media, porcentaje de valores atípicos de conjuntos de sondas y porcenjaje de valores atípicos de sondas sencillas. Para la Agilent44k, se aplicó un límite para valor absoluto del canal rojo log2/canal verde >0,5 para al menos una matriz; los datos se normalizaron en GeneSpring. 55 Para la matriz de ADNc Lymphochip, se utilizó una intensidad media del canal 1/medios de intensidad de fondo >1,5 y/o una intensidad media normalizada del canal 2/ medios de intensidad de fondo >1,5 se utilizaron. Los datos se normalizaron en la Base de Datos de Micromatriz Stanford (Stanford). Todos los valores de expresión génica se transformaron a log2 para análisis posterior. Se mapearon genes únicos a través de todas las plataformas basándose en el mapeo de productos de transcripción (conjuntos de sondas) con los nombres de los genes de la 60 Organización del Genoma Humano (HUGO).

PCR cuantitativa (C-PCR) en tiempo real

Las sondas utilizadas para la C-PCR se seleccionaron para Refsec ID para cada gen de Applied Biosystems (ABI). 65 El listado de sondas utilizadas se muestra en la Figura 6A. Primero el ADNc se transcribió a partir de 500 ng de ARN

total en 11 ul y se desnaturalizó en 1 ul de dNTP 10 mM y 1 ul de 300 ng/ul de hexámeros al azar a 65 ºC durante 15 minutos. Se añadieron 7 ul de la mezcla de C-PCR [4 ul 5 x tampón de unión, 1ul de DTT 0,1 M, 1 ul de SuperScript III RT (Invitrogen), 1 ul de RNasa OUT (Invitrogen)] al tubo de ARN desnaturalizado a una concentración final de 20 ul. La reacción RT se realizó en un ciclador térmico de PCR a 50 ºC durante 60 minutos, a 72 ºC durante 15 minutos seguido de la adición de 1 ul de RNasa H durante 30 minutos a 37 ºC para digerir el molde de ARN restante. La C-5 PCR se realizó siguiendo el protocolo del fabricante con modificación. El ADNc se diluyó a 1,25 ng/ul. Se realizaron reacciones de RT-PCR cuantitativas en placas de 384 pocillos en un volumen de 10 l que contenía 4 l de ADNc (5 ng), 1 l de sonda TaqMAN y 5 l de tampón de mezcla maestra de expresión génica 2x (ABI, Foster City, CA). Las reacciones de C-PCR se desarrollaron en un detector de secuencias ABI 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) en condiciones de ciclo (10 minutos a 95 ºC, 40 ciclos de 15 s a 95 ºC, 30 s a 60 ºC) recomendadas por el 10 fabricante. La cantidad relativa de expresión de ARN se calculó utilizando un método CT comparativo. Los valores de expresión se normalizaron con ARN ribosomal 18S y muestras de control (Stratagene Universal RNA) en la placa.

Diseño del estudio

15

Este estudio se emprendió como una suma de 3 proyectos (Figura 1): En el primer proyecto, se realizaron análisis de micromatriz transversales de 122 muestras de sangre periférica extraídas como 2,5 ml de muestras de sangre entera (n=106) en Tubos de ARN de Sangre PAXgene™ (PreAnalytiX, Qiagen), o como 5 ml de sangre en tubos de heparina sódica (n=16) para el aislamiento de leucocitos de sangre periférica (LSP). Para este análisis las muestras de sangre se extrajeron en un solo momento, sincronizado con una biopsia donde el rechazo agudo se confirmó 20 como presente (60 muestras de RA) o ausente (62 muestras STA). Las muestras se hibridaron con una de las 3 plataformas de micromatriz: Affymetrix (n=75, la matriz 54K HGU133Plus2), Agilent (n=26, matriz 44K Whole Human Genome oligo) o la matriz de ADNc Lymphochip (n=21, clones 32K de ADNc). Los datos de micromatriz generados de las 3 plataformas de matriz se compararon en cruzado mapeando productos de la transcripción comunes y solapantes con los nombres de los genes de la Organización del Genoma Humano (HUGO). El listado de genes 25 significativos en cada plataforma se identificó utilizando Análisis Significativo de Micromatriz (SAM, 4) con un umbral de significado común de una tasa de descubrimiento falsos (TDS) de <10 %. Se identificaron 525 genes comunes que se expresaron diferencialmente de modo significativo en RA en las 3 plataformas.

En el segundo proyecto, se seleccionaron 32 genes para verificación por C-PCR (véase la sección Criterios de 30 Selección de Genes Candidatos) en 34 muestras previamente utilizadas en la micromatriz (Conjunto de Verificación). De los 32 genes analizados por C-PCR, se seleccionaron los 10 genes más significativos para validación posterior en 42 muestras independientes (Conjunto de Validación 1) y 64 muestras independientes adicionales (32 RA, 32 STA; Conjunto de Validación 2). Se aplicaron diversos modelos de clasificación incluyendo análisis discriminativo lineal, 5 modelos Bayesianos diferentes, perceptron multicapa y modelos de regresión 35 logística (multinomial y lineal) del conjunto de 10 genes en el Conjunto de Validación 1. Cada uno de estos modelos se aplicó a un conjunto independiente de 64 muestras (Conjunto de Validación 2) para evaluar sus sensibilidades especificidades y precisiones. Un modelo de regresión logística multinomial que utilizaba 5 de los 10 genes del conjunto produjo el mejor comportamiento global.

40

En el tercer proyecto, se aplicó el modelo de diagnóstico de RA de 5 genes, para predecir RA en 30 pacientes de los que se habían recogido muestras de sangre periférica en serie, recogidas antes (n=27 muestras) y después (n=30 muestras) del episodio de RA. Se realizó análisis longitudinal de C-PCR de 5 genes en muestras de sangre relacionadas recogidas de 1 a 6 meses antes del episodio de RA para calcular la predicción de lesión de RA, incluso en el momento de función de injerto no alterada. Estas fueron las únicas muestras del estudio que no estaban 45 relacionadas con biopsias de injerto. Se realizó un análisis similar en muestras recogidas de 1 a 6 meses después del tratamiento del episodio de RA (relacionadas con biopsias de injerto realizadas para examinar la resolución de RA) para investigar el efecto de la inmunosupresión intensificada en la firma del conjunto de 5 genes (Figura 1).

Proyecto 1 – Descubrimiento de genes específicos de RA a través de plataformas de micromatriz múltiples 50

Perfil de expresión de genes de muestras de sangre periférica a través de 3 plataformas de micromatriz

De las 274 muestras únicas de sangre periférica, 103 muestras únicas (47 RA, 56 STA) se hibridaron en 122 micromatrices (60 RA, 62 STA) de 3 plataformas diferentes. De las 103 muestras de sangre periférica, 75 se 55 hibridaron en micromatrices Affymetrix HG U133 plus 2.0, 26 en micromatrices Agilent y 21 en micromatrices de ADNc. 17 muestras se hibridaron en 2 o más plataformas con fines de control de calidad. Para las muestras que se hibridaron en más de una plataforma, las correlaciones representativas de plataformas cruzadas fueron las siguientes, r= 0,6 entre la de ADNc y Agilent, r=0,8 entre la de Affymetrix y Agilent (véase referencia cruzada de muestras y ensayos mostrados en la Figura 18). 60

Análisis significativo de micromatrices

Se aplicó análisis significativo de micromatriz (SAM 4) para identificar genes expresados diferencialmente para RA en las 3 plataformas. Todos los valores de expresión génica se transformaron a log2 antes del análisis SAM. Como 65 un umbral en todas las plataformas se utilizó la tasa de descubrimientos falsos (TDF) < 10 %. Utilizando este umbral

se identificaron 5285 genes en la matriz Affymetrix, 8642 genes en la matriz Agilent y 2805 genes en las micromatrices de ADNc como genes de significado en RA expresados diferencialmente (Figura 5). Dado que cada plataforma de matriz utiliza diferentes conjuntos de genes, que se representan utilizando diferentes ID de sonda, se utilizó AILUN (http(colon)//ailun(dot)stanford(dot)edu)5 para reanotar los identificadores (ID) de sonda con los ID de Entrez Gene actuales. Utilizando los ID de Entrez Gene, se identificaron 525 genes que se expresaron 5 diferencialmente en las 3 plataformas (Figura 5). A la misma TDF, la plataforma de ADNc parecía tener el último número de genes RA significativos, cuando se comparó con las plataformas Affymetrix y Agilent (datos no mostrados).

Aunque estos estudios muestran que las comparaciones de matriz de plataforma cruzada de fenotipos 10 seleccionados cuidadosamente, es una estrategia poderosa para identificar firmas específicas de genes, una parte de los genes solapantes en todas las plataformas muestra un factor de cambio opuesto en las 3 plataformas, lo que sugiere que puede haber posibles problemas con los ID de clones en las plataformas de matriz 6 7. Los genes más fiables seleccionados para la validación en este estudio fueron los que tuvieron el mismo factor de cambio en las 3 plataformas. Además de seleccionar genes candidatos para el análisis de micromatriz para validación, se incluyeron 15 P3 de la caja forkhead (FOXP3), Perforina (PFN1) y Granzima B (GRZYB) 8 9 10, dado que previamente se indicó que estos genes estaban aumentados en RA en sangre.

Proyecto 2 – Verificación y validación de genes específicos de RA por PCR

20

Criterios de selección de genes candidatos para C-PCR

El objetivo de este segundo proyecto del estudio era verificar los resultados obtenidos del primer proyecto utilizando C-PCR, e identificar un conjunto de genes más pequeño que podría utilizarse para estudios de validación posteriores para biomarcadores de sangre específicos de RA. Se seleccionaron 32 genes de los 525 genes solapantes 25 basándose en los siguientes criterios: i) se seleccionaron 12 genes como genes de trascendencia biológica y expresión diferencial en las 3 plataformas (genes regulados positivamente: IFNGR1, RNF130, PBEF1, ITGAX, RYBP, CFLAR, PSEN1; genes regulados negativamente: NKTR, GOLGA8A, IL32, MCM7 y NFATC3), ii) se seleccionaron 17 genes con trascendencia biológica y con expresión diferencial en al menos 2 plataformas con factor de cambio > 1,5 y q < 3 % (genes regulados positivamente: DUSP1, SLP1, IL8RAP, STAT3, F2RL1, FCGR1A, 30 IL6R, PTPRC, STAT1, IL1 RAP, TLR8, TNFAIP6; genes regulados negativamente: MAPK9, PHLDA1, PTPN11, ZP70, PLCG1), iii) se seleccionaron 3 genes basándose en datos publicados a priori sobre su potencial como biomarcadores de RA basados en sangre; perforina o PFN1 11, granZima B o GRZYB 10 11 y el gen P3 de la caja forkhead, FOXP3 8.

35

Verificación por C-PCR

La expresión de los 32 genes en RA se verificó utilizando productos de Ensayo de Expresión Génica TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) en 34 muestras (Conjunto de Verificación; 17 RA, 17 STA). Estas muestras se habían procesado previamente en una o más matrices, y se seleccionaron muestras basándose solo en los criterios 40 de que la muestra restante tenía una cantidad y calidad de ARN adecuada. En la Figura 6 se proporciona el listado de cebadores de cada uno de los 10 genes y sus correspondientes ID sonda de ABI. La expresión de los 10 genes más significativos se muestra en la Figura 6B. Para cada gen, no se generó señal fluorescente por estos ensayos cuando se utilizó ADN genómico como molde, lo que confirma que el ensayo solo midió ARNm.

45

Se utilizó ARN ribosomal 18s para ARN endógeno y control de calidad de ADNc. Se seleccionó 18s como un gen de control, sobre la base de que este gen tenía expresión génica relativamente constante en la muestras de RA y entre muestras de RA y STA en experimentos de matriz. Para controlar posibles variaciones entre las PCR realizadas en diferentes días, la expresión de todos los genes también se evaluó en ARN de Referencia Humana Universal para cada proceso de C-PCR. Los ensayos eran muy reproducibles, con un coeficiente de variación menor de 0,18 entre 50 6 procesos para cada gen evaluado en el ARN de Referencia Humana Universal. Se realizó C-PCR en una placa de 384 pocillos, realizando cada medición de expresión de genes por duplicado. La cantidad relativa de expresión de ARN se calculó utilizando un método CT comparativo.

Además de verificar los resultados de micromatriz, otro objetivo del proyecto 2 fue refinar la selección de un conjunto 55 de genes riguroso más pequeño, que podría utilizarse como biomarcadores validados para RA en muestras de pacientes independientes. De los 32 genes verificados por C-PCR se seleccionaron los 10 genes más significativos. Se utilizó el ensayo de la t de Student para establecer el significado de las diferencias de expresión génica entre muestras RA y STA por C-PCR. Todas las diferencias se consideraron estadísticamente significativas para p < 0,05. Las diferencias de expresión significativa de estos 10 genes se validaron después en RA, por C-PCR, en 42 60 muestras independientes (Conjunto de Validación 1; 21 RA, 21 STA) (Figura 8).

Modelos de clasificación para RA

Para averiguar el mejor modelo de clasificación para un conjunto de genes mínimo para diagnóstico de RA en 65 sangre, se aplicaron 10 modelos de clasificación diferentes al conjunto de 10 genes 12. Los modelos de clasificación

utilizados incluían Clasificación Mediante Regresión, variantes de modelos Bayesianos (Bayes Virgen, Bayes Multinomial/Virgen, RedBayes, etc.), perceptrón multicapa, regresión logística (multinomial y lineal) y optimización mínima secuencial. Cada uno de estos modelos se capacitó utilizando los datos de C-PCR para el conjunto de Validación 1 y se revalidaron utilizando los datos de C-PCR de 64 muestras independientes (Conjunto de Validación 2; 32 RA, 32 STA) (Figura 9). De los 10 modelos de clasificación, el modelo de regresión logística multinomial 5 utilizando 5 genes (DUSP1, MAPK9, NKTR, PBEF1, PSEN1) funcionó mejor (sensibilidad = 100 %, especificidad = 93,8 %, VPP = 94,1 %1, VPN = 100 %). La figura 10 proporciona comparaciones de todos los modelos de clasificación utilizados.

En la siguiente ecuación se muestra un primer modelo de regresión logística utilizando el conjunto de 5 genes: 10

En la segunda ecuación se muestra un segundo modelo de regresión logística utilizando un conjunto mínimo de 5 genes: 15

En la siguiente ecuación se muestra el modelo de regresión logística utilizando un conjunto mínimo de 5 genes mínimo basándose en las muestras Stanford: 20

En cada ecuación anterior,  es la probabilidad prevista. Basándose en la Curva Característica Operativa del Receptor (ROC), se seleccionó un límite de  = 0,5 para determinar si la clase predictiva era un fenotipo de RA o 25 AST.

Búsqueda de la influencia de factores de confusión demográficos y clínicos en el conjunto de 5 genes

Se recogieron datos sobre 18 variables demográficas y clínicas en todas las muestras procesadas para estudios de 30 validación por C-PCR. Se proporcionaron datos para muestras SNSO1 por PPD (Brandon Graham, Jason Berg, David Ikle). Se estudiaron las 18 variables siguientes: tiempo post-trasplante, edad del receptor, sexo del receptor, sexo del donante, fuente del donante, edad del donante, citomegalovirus/CMV, virus de Epstein-Barr/viremia VEB y virus BK/viremia VBK en el muestreo, infección bacteriana simultánea, presencia de anticuerpos específicos del donante (AED) o anticuerpos reactivos a panel (ARP), uso de terapia de inducción, uso de mantenimiento de 35 esteroides, uso de diferentes fármacos inhibidores de calcineurina (FK506 o ciclosporina A/CSA), uso de diferentes antimetabolitos (micofenolato mofetil/MMF o azatioprina/AZA), el recuento de glóbulos blancos (WBC) y los niveles de hematocrito (HCT) en el momento de la toma de muestras de sangre (Figura 11). Se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson para determinar cualquier influencia de los 18 parámetros clínicos diferentes como posibles factores de confusión para la expresión del conjunto de 5 genes (Figura 12). Este análisis mostró que la 40 expresión del conjunto de 5 genes para el diagnóstico de RA, no estaba afectada por ninguno de los 18 factores de confusión examinados (máximo |r| = 0,27). De manera adicional, se realizó ensayo de la t para 13 factores de confusión clínicos con valores categóricos (sexo del receptor, sexo del donante, fuente del donante, basado en esteroides frente a sin esteroides, viremia CMV, viremia VEB, viremia BK, infección bacteriana, AED, ARP, uso de terapia de inducción o no, uso de FK506 frente a CSA, uso de MMF frente a AZA). 45

Búsqueda de la influencia de gravedad de RA (puntuaciones BANFF), tipo de RA (rechazo humoral o celular), C4d peritubular positivo en RA, sobre la expresión del conjunto de 5 genes

A continuación, se examinó cualquier asociación entre las puntuaciones de Banff, la presencia de C4d+/- peritubular 50 en la biopsia y la presencia de rechazo humoral o celular, y la expresión del conjunto de 5 genes para diagnóstico AR. Dado que la mayoría de las muestras tenían biopsias relacionadas para evaluación, las muestras se dividen en 2 grupos de acuerdo con los grados de puntuación de Banff (1=puntuación de Banff 1A; 2=puntación de Banff 1B);

la presencia de C4d+ se determinó si había 10 % de capilares peritubulares (CPT) que tenían depósitos C4d. No se encontró correlación entre la predicción de probabilidad de RA por el conjunto de 5 genes y las puntuaciones de Banff (r=-0,13), rechazo humoral frente a celular (r=0,07) y la presencia o ausencia de C4d+ peritubular (r=0,2) (Figura 14).

5

Proyecto 3 – Predicción de lesión de RA por el conjunto de 5 genes, antes de biopsia de injerto indicada y disfunción de injerto

El objetivo del tercer proyecto en este estudio era ensayar si el modelo con el conjunto de 5 genes podía predecir la aparición de RA, antes de cualquier disfunción de injerto o biopsia indicada. Se aplicó el modelo de regresión a 10 muestras secuencialmente recogidas de 1 a 6 meses antes y después de un episodio de RA comprobado por biopsia. Las muestras se agruparon en las siguientes categorías: i) muestras recogidas de 3 a 6 meses antes de la aparición de RA, ii) muestras recogidas de 0 a 3 meses antes de RA, iii) muestras recogidas en el momento de RA, iv) muestras recogidas de 0 a 3 meses después del episodio de RA, v) muestras recogidas de 3 a 6 meses después del episodio de RA. La Figura 15 proporciona probabilidades medias de RA junto con errores típicos y eliminaciones 15 de creatinina calculadas 13 para cada grupo de muestras.

Análisis de trascendencia biológica del conjunto de 5 genes

Para examinar los procesos biológicos clave que pudiesen ejercer influencia sobre el transcriptoma periférico en RA, 20 se aplicó el conjunto de 525 genes específicos de RA en plataformas cruzadas para el análisis de trascendencia biológica utilizando el sistema de clasificación PANTHER (http(colon)//www(dot)pantherdb(dot)org). Estas rutas moleculares sugieren tránsito/transporte activo de proteínas y metabolismo de lípidos en rutas clave implicadas en inmunidad, ciclo celular, apoptosis y diferenciación. El Análisis de la Ruta Ingenuity (http(colon)//www(dot)ingenuity(dot)com) muestra que estos genes estimulan rutas canónicas implicadas en 25 apoptosis y están regulados por la ruta JAK/STAT (Figura 16).

REFERENCIAS PARA MÉTODOS COMPLEMENTARIOS

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9. Dugre FJ, Gaudreau S, Belles-Isles M, Houde I, Roy R. Cytokine and cytotoxic molecule gene expression determined in peripheral blood mononuclear cells in the diagnosis of acute renal rejection. Transplantation 2000; 70(7): 1074-80.

10. Simon T, Opelz G, Wiesel M, Ott RC, Susal C. Serial peripheral blood perforin and granzyme B gene expression measurements for prediction of acute rejection in kidney graft recipients. Am J Transplant 2003; 3(9): 50 1121-7.

11. Vasconcellos LM, Schachter AD, Zheng XX, et al. Cytotoxic lymphocyte gene expression in peripheral blood leukocytes correlates with rejecting renal allografts. Transplantation 1998; 66(5): 562-6.

12. Witten IH, Frank E. Data Mining: Practical machine learning tools and techniques. 2nd ed. San Francisco: Morgan Kaufmann; 2005. 55

13. Schwartz GJ, Haycock GB, Edelmann CM, Jr., Spitzer A. A simple estimate of glomerular filtration rate in children derived from body length and plasma creatinine. Pediatrics 1976; 58(2):259-63.

EJEMPLO II

60

MÉTODOS

Un total de 40 muestras de sangre periférica equivalentes en cuanto al tiempo e inmunosupresión procedentes de pacientes con trasplante de hígado y corazón se seleccionaron para validación cPCR ABI-TaqMan múltiple en formato de 384 pocillos en el conjunto de 10 genes identificados en el Ejemplo 1. 16 de las muestras eran de 65 pacientes con trasplante de hígado con 8RA y 8 estables sin rechazo (STA) y 24 muestras eran de pacientes con

trasplante de corazón (9RA; 10STA); para el control del factor de confusión de virus, se incluyeron 5 muestras STA con infección por Citomegalovirus (CMV). El significado de la expresión génica diferencial se determinó mediante ensayo de la T, considerando un valor de p<0,05 como significativo.

RESULTADOS 5

Para la misma validación del conjunto de 10 genes en trasplante de hígado, 2 de los 10 genes (PSEN1 y RYBP) eran muy significativos para confirmar diagnóstico de RA en sangre periférica (p=0,05; p=0,04) en comparación con STA; los 8 genes restantes mostraron los mismos factores de cambio de dirección que los observados en trasplante de riñón, sin diferencias estadísticamente significativas entre RA y STA. Se aplicó un modelo de predicción generado 10 a partir del conjunto de 10 genes derivado de sangre periférica de trasplante de riñón (ROC=97,6 %) al conjunto de datos PCR de muestras de hígado para clasificación de RA, y reveló una puntuación de predicción de 86 % de sensibilidad, 75 % de especificidad, 88 % de VPP, 78 % VPN, con 2 RA y 1 STA de las 16 muestras mal clasificadas. Para la validación del conjunto de 10 genes en muestras de corazón, 3 de los 10 genes (CFLAR, ITGAX y NKTR) se expresaron diferencialmente en RA en comparación con STA (p=0,04; p=0,05; p=0,01). Cabe 15 destacar que, 1 de estos 3 genes (CFLAR) muestra factores de cambio significativos en dirección opuesta (p=0,04, factor de cambio=-2,2) como se observa en muestras de RA de riñón previamente (p=0,002, factor de cambio=3,1). Además, 2 de los 3 genes que estaban regulados negativamente de modo significativo en CMV cuando se compararon con RA. No hubo solapamiento en los genes expresados diferencialmente de modo significativo entre hígado y corazón. La identidad de los 10 genes analizados se muestra en el análisis previo con muestras de 20 trasplante de riñón.

CONCLUSIÓN

Para predecir RA en trasplante de hígado puede utilizarse un biomarcador altamente específico y sensible de 10 25 genes derivado y ensayado por análisis de micromatriz de plataformas cruzadas en trasplante de riñón. 2 de los 10 genes se expresaron diferencialmente en RA tanto para hígado como para corazón, pero el no solapamiento de genes regulados diferencialmente de modo significativo entre hígado y corazón sugiere que la lesión por rechazo no comparte rutas biológicas comunes entre diferentes trasplantes de órganos, sino que también presenta especificidad tisular. 30

Los 10 genes ensayados pueden utilizarse para diagnosticar RA en rechazo de trasplante tanto de hígado como de corazón, independientemente del grado de rechazo.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y con ejemplos con el fin de 35 aclarar su comprensión, es fácilmente obvio para los expertos habituales en la materia, a la luz de las explicaciones de esta invención, que pueden realizarse determinados cambios y modificaciones a la misma sin alejarse del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

Por consiguiente, lo anterior ilustra simplemente los principios de la invención. Se apreciará que los expertos en la 40 materia podrán concebir diversas configuraciones que, aunque no se describan explícitamente o se muestren en este documento, representan los principios de la invención y se incluyen en su ámbito. Además, todos los ejemplos e idioma supeditado indicados en este documento pretenden principalmente ayudar al lector a entender los principios de la invención y los conceptos aportados por los autores de la invención para reforzar la técnica y deben considerarse como no limitantes a dichos ejemplos y condiciones específicamente indicados. Además, todas las 45 declaraciones del presente documento que detallan principios, aspectos y realizaciones de la invención, así como sus ejemplos específicos, pretenden incluir equivalentes tanto funcionales como estructurales de los mismos. De manera adicional, se pretende que dichos equivalentes incluyan equivalentes tanto actualmente conocidos como equivalentes desarrollados en el futuro, es decir, cualquier elemento desarrollado que realice la misma función, independientemente de la estructura. Por lo tanto, el ámbito de la presente invención no pretende estar limitado a 50 realizaciones ejemplares mostradas y descritas en este documento. En cambio, el ámbito de la presente invención se representa en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para monitorizar una respuesta de Rechazo Agudo (RA) en un sujeto que ha recibido un aloinjerto de riñón, comprendiendo dicho método:

   5

   (a) evaluar el nivel de expresión de NKTR, MAPK9, PBEF1, PSEN1 y DUSP1 en una muestra del sujeto para obtener un resultado de expresión génica; y

   (b) emplear el resultado de expresión génica para predecir la aparición de una respuesta de RA, diagnosticar una respuesta de RA y/o caracterizar una respuesta de RA;

   10

   en el que un resultado de expresión génica de expresión disminuida de NKTR y MAPK9 y de expresión aumentada de DUSP1, PBEF1 y PSEN1 en dicha muestra del sujeto indica una respuesta de RA.
2. 2. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha etapa de evaluación comprende adicionalmente evaluar el nivel de expresión de uno o más de: CFLAR, RNF-130, IFNGR1, ITGAX y RYBP, en el que un nivel de 15 expresión aumentado de cada uno de CFLAR, RNF-130, IFNGR1, ITGAX y RYBP está asociado con una respuesta de RA.
3. 3. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha etapa de evaluación comprende analizar dicha muestra para un producto de expresión de genes comprendidos en el panel, en el que opcionalmente dicho producto 20 de expresión es un transcripto de ácido nucleico.
4. 4. El método de la Reivindicación 3, en el que dicha etapa de evaluación comprende un ensayo RT-PCR, en el que opcionalmente dicho ensayo RT-PCR es un ensayo RT-PCR cuantitativo.

   25
5. 5. El método de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que dicha muestra es una muestra de sangre.
6. 6. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicho resultado de expresión génica se emplea para predecir la aparición de una respuesta de RA entre 6 y 3 meses por adelantado.

   30
7. 7. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicho método comprende adicionalmente evaluar en dicha muestra de dicho sujeto el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado de las Tablas 3 o 4 para obtener un segundo resultado de expresión génica y emplear dicho segundo resultado de expresión génica para determinar si dicho sujeto tiene un fenotipo tolerante a injerto.

   35
8. 8. Un kit para monitorizar una respuesta de rechazo agudo (R A) en un sujeto que ha recibido un aloinjerto de riñón, comprendiendo dicho kit:

   (a) un cebador específico de genes para cada uno de NKTR, MAPK9, PBEF1, PSEN1 y DUSP1 junto con reactivos para analizar una muestra para un producto de expresión de NKTR, MAPK9, PBEF1, PSEN1 y DUSP1 40 para obtener un resultado de expresión génica; y

   (b) un elemento de determinación de fenotipo que comprende un valor de expresión de referencia para NKTR, MAPK9, PBEF1, PSEN1 y DUSP1 para emplear dicho resultado de expresión génica para predecir la aparición de una respuesta de RA, para diagnosticar una respuesta de RA y/o para caracterizar una respuesta de RA en dicho sujeto, monitorizando de este modo una respuesta de RA en dicho sujeto. 45
9. 9. El kit de la Reivindicación 8 que adicionalmente comprende un cebador específico de genes y uno o más reactivos para evaluar la expresión de uno o más de CFLAR, RNF-130, IFNGR1, ITGAX y RYBP.
10. 10. El kit de la Reivindicación 8, en el que el producto de expresión es un transcripto de ácido nucleico y/o una 50 proteína.