[go: up one dir, main page]

ES2471458T3 - Polip�ptidos de direccionado específico a células diana de Otx2 - Google Patents

Polip�ptidos de direccionado específico a células diana de Otx2 Download PDF

Info

Publication number
ES2471458T3
ES2471458T3 ES10704386.1T ES10704386T ES2471458T3 ES 2471458 T3 ES2471458 T3 ES 2471458T3 ES 10704386 T ES10704386 T ES 10704386T ES 2471458 T3 ES2471458 T3 ES 2471458T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
otx2
polypeptide
neurons
cells
target cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10704386.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Alain Prochiantz
Ariel Di Nardo
Marine Beurdeley
Takao K. Hensch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ecole Normale Sup Rieure
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure de Paris
Original Assignee
Ecole Normale Sup Rieure
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure de Paris
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ecole Normale Sup Rieure, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Ecole Normale Superieure de Paris filed Critical Ecole Normale Sup Rieure
Application granted granted Critical
Publication of ES2471458T3 publication Critical patent/ES2471458T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03001—Alkaline phosphatase (3.1.3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/64—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/383—Nerve cells, e.g. dendritic cells, Schwann cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/58—Adhesion molecules, e.g. ICAM, VCAM, CD18 (ligand), CD11 (ligand), CD49 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/08—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system
    • C12N2502/085—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system eye cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G01N2800/168—Glaucoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Polipéptido de direccionado celular, caracterizado porque se define mediante la secuencia B1B2X1B3B4X2B5X3X4X5X6B6X7X8X9 (SEC ID nº 1), en la que: B1, B2, B3, B4, B5 y B6 representan, independientemente, arginina o lisina; X1 y X8 representan, independientemente, asparginina o glutamina; X2 representa ácido aspártico o ácido glutámico; X3, X4 y X6 representan, independientemente, treonina o serina; X5 representa fenilalanina, tirosina o triptófano; X7 representa alanina o glicina; X9 representa leucina, isoleucina o valina. y porque cuando se pone en presencia de células retinianas, se une específicamente a las neuronas ganglionares y a las neuronas bipolares.

Description

Polip�ptidos de direccionado específico a células diana de Otx2.
La presente invención se refiere a unos polip�ptidos que permiten el direccionado específico de una molécula de interés a células diana de la homeoprote�na Otx2 y, en particular, de las neuronas ganglionares y de las neuronas bipolares retinianas.
La retina es la capa celular que cubre el fondo del ojo. Contiene diferentes tipos de neuronas, cuya función es captar la energía luminosa y transformarla en señal nerviosa, y también contiene células gliales.
Esquem�ticamente, la retina comprende tres capas principales de neuronas: las neuronas fotorreceptoras (conos y bastones), las neuronas bipolares y las neuronas ganglionares; otras neuronas, las neuronas amacrinas y las neuronas horizontales desempeñan un papel regulador. Las neuronas fotorreceptoras reaccionan con la luz, y la señal que generan es transmitida por medio de neuronas bipolares, a las neuronas ganglionares, cuyos axones constituyen las fibras nerviosas del nervio óptico, asegurando el envío de la información al cerebro.
La degeneración de las neuronas retinianas est� implicada en diversas retinopat�as. As�, la degeneración de las neuronas fotorreceptoras esta implicada en ciertas patologías, tales como la retinitis pigmentaria o la degeneración macular. En otras patologías, tales como el glaucoma, son principalmente las neuronas ganglionares las que est�n afectadas.
La Otx2 (Orthodenticle homolog 2) es una homeoprote�na que contiene un homeodominio de tipo bicoide (SIMEONE y otros, Embo J, 12, 2735-47, 1993). Pertenece a la familia de las homeoprote�nas Otx, que desempeñan un papel fundamental en el desarrollo del cerebro durante la embriog�nesis (ACAMPORA y otros, Prog Neurobiol, 64, 69-95, 2001; SIMEONE y otros, Curr Opin Genet Dev, 12, 409-15, 2002).
Con ocasión de trabajos anteriores, el equipo de inventores ha puesto en evidencia el efecto positivo de una homeoprote�na, Otx2 (Orthodenticle homolog 2) sobre la supervivencia de las neuronas ganglionares retinianas. Estos resultados se detallan en la solicitud PCT WO/2009/106767.
Se ha demostrado también que la Otx2 desempeñaba un papel en el desarrollo postnatal de la corteza cerebral, y en particular en su plasticidad. La Otx2, que es sintetizada a nivel de la retina, es transportada hasta la corteza cerebral visual, en la que es capturada por las neuronas parvalb�minas de la corteza cerebral visual, lo que induce su maduración, y conlleva, en primer lugar, la apertura y a continuación, poco tiempo después, el cierre del periodo crítico de plasticidad (SUGIYAMA y otros, Cell, 134, 508-20, 2008).
Un periodo crítico de plasticidad es una fase del desarrollo postnatal representada por un intervalo de tiempo de duración limitada (variable según la especie animal, y según la función sensorial en cuestión), durante el cual los estímulos sensoriales son capaces de modificar la organización funcional de las zonas corticales correspondientes.
Al llevar a cabo sus investigaciones, los inventores han descubierto que en la retina, la Otx2 se fijaba específicamente a las neuronas ganglionares y a las neuronas bipolares, y han identificado la región de la Otx2 responsable de esta fijación. Han demostrado además que esta misma región era también responsable del direccionado de la Otx2 hacia las neuronas parvalb�minas de la corteza cerebral visual, interactuando con la red perineuronal de proteoglicanos de sulfato de condroitina, que recubre estas neuronas, y que permitía, entrando en competición con la proteína Otx2 end�gena capturada por las neuronas parvalb�minas, inhibir esta captura. Esta inhibición conlleva el retorno de estas neuronas a un estado inmaduro, permitiendo la reapertura de la fase crítica de plasticidad.
La región responsable del direccionado de la Otx2 de sus células diana est� constituida por una secuencia pept�dica de 15 amino�cidos. Los inventores han constatado además que este polip�ptido, aislado, poseía la misma especificidad de fijación que la proteína Otx2 entera.
La presente invención tiene por objeto un polip�ptido de direccionado celular aislado definido por la secuencia B1B2X1B3B4X2B5X3X4X5X6B6X7X8X9 (SEC ID n� 1), en la que:
B1, B2, B3, B4, B5 yB6 representan, independientemente, arginina o lisina; X1 yX8 representan, independientemente, asparginina o glutamina; X2 representa ácido asp�rtico o ácido glut�mico; X3, X4 yX6 representan, independientemente, treonina o serina; X5 representa fenilalanina, tirosina o tript�fano; X7 representa alanina o glicina; X9 representa leucina, isoleucina o valina.
Este polip�ptido, en presencia de células retinianas, se une específicamente a las neuronas ganglionares y a las neuronas bipolares.
Unos modos de realización preferidos de la presente invención son polip�ptidos en los que:
-
al menos uno de los amino�cidos B1, B3, B4, B5 yB6 es una arginina; y/o -B2 es una lisina; y/o -al menos uno de los amino�cidos X1 yX8 es una glutamina; y/o -X2 es un ácido glut�mico; y/o -al menos uno de los amino�cidos X3 X4 yX6 es una treonina; y/o -X5 es una fenilalanina; y/o -X7 es una alanina; y/o -X9 es una leucina.
Seg�n un modo de realización particularmente preferido de un polip�ptido de direccionado celular conforme a la invención, éste est� definido por la secuencia siguiente: RKQRRERTTFTRAQL (SEC ID n� 2).
Los amino�cidos que constituyen un polip�ptido conforme a la invención, pueden ser amino�cidos naturales, de la serie L. Se puede sustituir también todo o parte de estos amino�cidos por sus isómeros de la serie D, a fin de aumentar la estabilidad del polip�ptido in vivo. Los amino�cidos, de la serie L o de la serie D, pueden también, llegado el caso, estar encadenados según una secuencia inversa de la secuencia SEC ID n� 1 o de la secuencia SEC ID n� 3, indicadas anteriormente.
La presente invención tiene también por objeto la utilización de un polip�ptido de direccionado celular conforme a la invención, para permitir el direccionado específico de una carga de interés de células diana de la Otx2.
Como ejemplos de células diana de la Otx2 se citarán, además de las neuronas ganglionares y de las neuronas bipolares retinianas ya mencionadas anteriormente, las neuronas recubiertas de una red perineuronal de proteoglicanos de sulfato de condroitina, que incluyen, en particular, neuronas que expresan la parvalb�mina (neuronas PV) localizadas en particular en la corteza cerebral visual. Otras células diana de la Otx2 son unas neuronas del cerebro medio, en particular las neuronas dopamin�rgicas de la sustancia negra y del área tegmental ventral, y sus dianas sinápticas.
Otras células dianas de la Otx2 pueden fácilmente ser identificadas con la ayuda de un polip�ptido de direccionado conforme a la invención, por ejemplo asociando dicho polip�ptido a un marcador, poniendo en contacto dicho polip�ptido marcado con una muestra de un tejido o de un órgano a ensayar, y detectando, en dicha muestra, la presencia o la ausencia de células que fijan dicho polip�ptido y, en caso de presencia de células que fijan dicho polip�ptido, su localización.
Se designa bajo el término general de: "carga" cualquier molécula o complejo molecular que se desea dirigir a una célula diana.
Las cargas que pueden ser transportadas por polip�ptidos de direccionado celular conformes a la invención, pueden ser de naturaleza muy variada: puede tratarse de moléculas químicas, de macromoléculas, tales como, por ejemplo, unas proteínas o ácidos nucleicos, o partículas tales como los liposomas, nanopart�culas o partículas virales o pseudovirales. Puede tratarse de marcadores destinados a permitir la detección y/o la localización de células diana de la Otx2 en un tejido o un órgano, o de principios activos que se desea dirigir específicamente a las células diana de la Otx2.
Si se desea obtener no solamente el direccionado de la carga de interés de la célula diana, sino también su entrada en esta, se puede asociar ventajosamente un polip�ptido de direccionado celular conforme a la invención, con un polip�ptido transductor.
Los polip�ptidos transductores son polip�ptidos que comprenden una secuencia denominada "dominio de transducci�n", que les confiere la capacidad de penetrar en el interior de una célula viva, independientemente de la presencia de transportadores o de receptores específicos.
Un gran número de polip�ptidos transductores son conocidos por s� mismos. Como ejemplos no limitativos, se citarán: las penetratinas, que son polip�ptidos derivados de la tercera hélice de un homeodominio; los polip�ptidos derivados de la proteína Tat de HIVI, y en particular del fragmento 48-60 de dicha proteína; las poliargininas; los polip�ptidos derivados de la proteína VP22 de HSV; polip�ptidos derivados de una secuencia señal conjugada con una secuencia de localización nuclear; los transportadores que se derivan de una fusión entre una porción de un neurop�ptido, la galanina y un polip�ptido de veneno de avispa.
La presente invención tiene también por objeto un polip�ptido aislado que contiene un polip�ptido de direccionado celular conforme a la invención y un polip�ptido transductor.
Este polip�ptido puede ser un fragmento aislado de la Otx2, que comprende la totalidad del homeodominio, y los 2 amino�cidos que preceden inmediatamente a éste. Este fragmento puede también ser suprimido de una parte de la secuencia del homeodominio provisto de la secuencia de direccionado conforme a la invención, y se conserva al menos la tercera hélice del homeodominio.
Puede también tratarse de un polip�ptido quimérico que asocia un polip�ptido de direccionado celular conforme a la invención con un polip�ptido transductor heter�logo. En este ámbito, los polip�ptidos transductores preferidos son los de la familia de las penetratinas. As�, se puede asociar un polip�ptido de direccionado celular conforme a la invención, con un fragmento de homeodominio de una homoprote�na distinta de la Otx2, que comprende al menos la tercera hélice de dicho homeodominio, o bien con derivados de penetratina tales como los descritos, por ejemplo, en las solicitudes PCT WO 00/01417 o WO 00/29427.
La presente invención tiene asimismo por objeto unas composiciones que comprenden un polip�ptido de direccionado celular conforme a la invención, eventualmente asociado con un polip�ptido transductor, unido a una carga.
La unión entre el polip�ptido de direccionado celular conforme a la invención y la carga puede efectuarse de diferentes maneras, conocidas en s� mismas, según particularmente la naturaleza de la carga en cuestión, y las modalidades de utilización consideradas. Generalmente, el polip�ptido de direccionado celular (eventualmente fusionado con un polip�ptido transductor) y la carga se asociarán de manera covalente, llegado el caso por medio de un brazo espaciador, por ejemplo un enlazador pept�dico. Pueden también estar asociados de manera no covalente, por medio de interacciones iónicas o hidrófobas; en este caso, el polip�ptido de direccionado puede estar unido a una molécula, capaz de unirse de manera no covalente a la carga. Esta molécula puede ser, en particular, un polip�ptido transductor, tal como una penetratina, capaz de unirse por interacciones hidrófobas a una carga que posee uno o varios dominios hidrófobos, tal como se describe en la solicitud PCT WO 04/069279.
Seg�n un modo de realización particular de una composición conforme a la invención, dicha composición se presenta en forma de un polip�ptido quimérico, que comprende un polip�ptido de direccionado celular conforme a la invención, unido con una o varias secuencias polipept�dicas que constituyen la carga, y eventualmente con un polip�ptido transductor. El orden en el que est�n dispuestos el polip�ptido de direccionado celular, el polip�ptido transductor y las secuencias polipept�dicas que constituyen la carga no es crítico.
A título de ejemplos no limitativos de polip�ptidos quiméricos conforme a la invención, se citarán unos polip�ptidos quiméricos que comprenden un polip�ptido de direccionado celular conforme a la invención, un polip�ptido transductor, una o varias secuencias de regulaci�n de la transcripción y/o una o varias secuencias de regulaci�n de la traducción. El término polip�ptido quimérico se utiliza aquí en un sentido habitual, para designar polip�ptidos que asocian secuencias de origen diferentes, lo que excluye por lo tanto las proteínas Otx2 nativas.
Numerosas secuencias de regulaci�n de la transcripción o de regulaci�n de la traducción son conocidas en s� mismas.
Como ejemplos, se citarán:
-
secuencias de activación de la transcripción tales como, por ejemplo, el trans-activador VP16 del virus HSP (virus del herpes simple);
-
secuencias de represión de la transcripción, tales como la de Engrailed (que corresponde, por ejemplo, a los amino�cidos 1-298 de la proteína Engrailed de Drosophila melanogaster (GenBank AAA65478);
-
secuencias de regulaci�n (en particular de activación) de la traducción, tales como sitios de unión de elF4E que se detectaron, por ejemplo, en numerosas homeoprote�nas (véase, por ejemplo, TOPISIROVIC & BORDEN, Histol. Histopathol., 20, 1275-1284, 2005), entre ellas la Otx2.
Los polip�ptidos quiméricos conformes a la invención se pueden obtener mediante diferentes métodos bien conocidos en s� mismos, en particular por síntesis pept�dica o mediante las técnicas clásicas de ingeniería genética.
Polip�ptidos quiméricos conformes a la invención, que comprenden un polip�ptido de direccionado celular, un polip�ptido transductor, una o varias secuencias de regulaci�n de la transcripción y/o una o varias secuencias de regulaci�n de la traducción, pueden ser utilizados en las mismas aplicaciones que la proteína Otx2 nativa, y en particular para aumentar la supervivencia de las células diana de la Otx2. As�, se pueden utilizar en particular para prevenir o tratar la degeneración de las neuronas ganglionares y/o de las neuronas bipolares retinianas, que intervienen en particular en el glaucoma, as� como en diversas neuropatías ópticas, genéticas o vasculares, por ejemplo la retinitis pigmentaria o las lesiones del nervio óptico. Son también utilizables en el ámbito del tratamiento de algunas enfermedades neurodegenerativas (tales como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple o la enfermedad del Parkinson). Generalmente, estos polip�ptidos quiméricos se pueden utilizar en dichas aplicaciones según las mismas modalidades que las descritas para la Otx2 en la solicitud PCT WO/2009/106767.
Para la aplicación de la presente invención, basta con poner dicho polip�ptido quimérico en contacto con las células diana; en efecto, éste penetra en ellas gracias a la secuencia de internalizaci�n proporcionada por el polip�ptido transductor. De manera preferida, dicha puesta en contacto se efectúa a una concentración de dicho polip�ptido quimérico de 0,5 a 10 nM, ventajosamente de 1 a 5 nM, y de manera particularmente ventajosa de 1,5 a 3 nM.
In vitro, basta con añadir dicho polip�ptido quimérico al medio de cultivo de las neuronas. In vivo, se puede administrar por diferentes vías, localmente, en particular por inyección o infusión en el humor vítreo, o en el espacio suborbital, o en forma de colirio, o de pomada oft�lmica. Se puede administrar también con la ayuda de un dispositivo de liberación controlada, por ejemplo en forma de implante intraocular. Llegado el caso, se puede administrar de manera sist�mica, por ejemplo por inyección intravenosa.
Las dosis de polip�ptido quimérico a administrar in vivo para obtener la concentración deseada en contacto con las células diana, pueden ser fácilmente determinadas y adaptadas por el experto en la técnica en función, en particular, de las modalidades de administración consideradas.
Se puede efectuar también esta puesta en contacto poniendo las células diana en presencia de células transformadas para expresar o sobreexpresar, y segregar dicho polip�ptido quimérico. In vitro, esto puede efectuarse por co-cultivo de estas células transformadas con las células. In vivo, se puede, por ejemplo, injertar en la retina células transformadas para expresar o sobreexpresar, y segregar dicho polip�ptido quimérico.
Se puede también, llegado el caso, asociar dicho polip�ptido quimérico con uno o varios principios activos terapéuticos, en administración conjunta o separada.
Polip�ptidos de direccionado celular conformes a la invención pueden también ser utilizados para inhibir la fijación de la Otx2 a sus células diana, y en particular a las neuronas parvalb�minas recubiertas de una red perineuronal de proteoglicanos de sulfato de condroitina, para permitir restaurar su plasticidad. Se pueden utilizar as� para el tratamiento de enfermedades que resultan del desarrollo defectuoso durante el periodo crítico de plasticidad, de una región del cerebro que contiene las células diana en cuestión. A título de ejemplo, pueden ser utilizados en el ámbito del tratamiento de la ambliop�a, o en el ámbito del tratamiento de enfermedades neurol�gicas y psiquiátricas, tales como los trastornos ansiosos, el síndrome de estr�s post-traumático, as� como la psicosis maniaco-depresiva o la esquizofrenia. Se pueden utilizar también en el ámbito de la restauración de la plasticidad fisiológica y morfológica en patologías o accidentes vasculares que llevan a la pérdida de neuronas.
Para inhibir la fijación de la Otx2 a sus células diana, el polip�ptido de direccionado celular conforme a la invención se utilizar� para obtener, al contacto con dichas células diana, una concentración de dicho polip�ptido al menos 10 veces superior, preferentemente de 100 a 1000 veces superior a la concentración de la Otx2. Típicamente, dicho polip�ptido podr� utilizarse a una concentración de 1 a 10 !M, ventajosamente de 10 a 100 !M, y de manera particularmente ventajosa, de 100 a 1000 !M.
Para la utilización in vivo con el fin de inhibir la fijación de la Otx2 a sus células diana, dicho polip�ptido de direccionado se administrar� preferentemente de forma local, por ejemplo mediante mini-bomba osm�tica implantada en el cerebro.
Las dosis de polip�ptidos quiméricos a administrar in vivo para obtener la concentración deseada en contacto con las células diana, pueden fácilmente ser determinadas y adaptadas por el experto en la técnica en función, particularmente, de las modalidades de administración consideradas.
Polip�ptidos de direccionado celular conformes a la invención pueden también ser utilizados para cribar otras moléculas capaces de fijarse específicamente a las células diana de la Otx2.
En este ámbito, la presente invención tiene por objeto un procedimiento de cribado de moléculas capaces de fijarse específicamente a células dianas de la Otx2, en los mismos sitios de fijación que la Otx2, caracterizado porque comprende:
-
la puesta en presencia de un polip�ptido de direccionado celular conforme a la invención, de células diana de la Otx2 y de células que no fijan la Otx2, y de cada molécula a ensayar;
-
la selección de las moléculas capaces de inhibir la fijación de dicho polip�ptido de direccionado celular a las células diana de la Otx2, y que no se fijan a las células que no fijan la Otx2.
De manera ventajosa, dicho procedimiento se realiza en presencia, al mismo tiempo, de células diana de la Otx2 y de células que no fijan la Otx2, por ejemplo sobre una sección de retina.
La presente invención se entender� mejor con la ayuda del complemento de descripción siguiente, que se refiere a ejemplos no limitativos que ilustran la identificación de un polip�ptido de direccionado conforme a la invención y la puesta en evidencia de su especificidad de direccionado.
EJEMPLO 1. IDENTIFICACIÓN DE UNA SECUENCIA DE DIRECCIONADO DE LA OTX2 A LAS NEURONAS GANGLIONARES Y BIPOLARES RETINIANAS.
Durante experimentos anteriores (véase la solicitud PCT/FR 2009/000031, del 9 de enero de 2009) se ha observado que la Otx2 inyectada en el ojo se concentraba esencialmente en las neuronas ganglionares retinianas (RCG).
A fin de investigar si un dominio de direccionado celular estaba presente en la secuencia de la Otx2, se han construido proteínas quiméricas que comprenden un dominio fosfatasa alcalina acoplado a la proteína Otx2 entera o a diferentes fragmentos de esta proteína.
Se han construido las proteínas de fusión siguientes:
-
Fosfatasa alcalina-Otx2 entera (AP-Otx2)
-
Fosfatasa alcalina-región terminal C + homeodominio de Otx2 (AP-Ct-Otx2)
-
Fosfatasa alcalina-región terminal N + homeodominio de Otx2 (AP-Nt-Otx2)
-
Fosfatasa alcalina-homeodominio de Otx2 (AP-Hd-Otx2)
Las secuencias que codifican para la proteína Otx2 humana o los fragmentos ensayados se clonaron en el vector pAPtag 5 (GenHunter), en fase con la secuencia que codifica para la fosfotasa alcalina. Las diferentes construcciones realizadas est�n esquematizadas en la figura 1.
Leyendas de la figura 1: sec. señal: p�ptido señal de la fosfatasa alcalina; Fosfatasa alcalina: fosfatasa alcalina, Nt: región N-terminal de la Otx2 (amino�cidos 1-37); Hd: homeodominio de la Otx2 (amino�cidos 38-97); Ct: región Cterminal de la OTx2 (amino�cidos 98-289); 6xHis: etiqueta polihistidina.
Se transfectaron células HEK 293 cultivadas en cajas de cultivo de 10 cm de diámetro con 10 !g de cada uno de los vectores construidos, previamente purificado con la ayuda de Lipofectamine 2000 (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se incubaron durante 48 horas en DMEM/F12, completado con el 10% de suero de bovino fetal (SVF). Se recogió el sobrenadante, se centrifug� a 100 x g durante 5 minutos y se conserv� a -80�C. Este sobrenadante se utiliza sin purificación para ensayar la fijación de las proteínas quiméricas sobre secciones de retina.
Para efectuar el ensayo de fijación, se fijan unas secciones en criostato (20 !m) de retinas frescas congeladas durante 8 minutos en 100% de metanol enfriado, y después se lavan 3 veces en un tampón fosfato (PBS) con 4 mM de MgCl2.
Las secciones son incubadas en un tampón PBS, 4 mM MgCl2, más el 10% de SVF durante 1 hora a temperatura ambiente (TA).
Para la fijación, los sobrenadantes que contienen las proteínas de fusión ensayadas son diluidos a un veinteavo en PBS, e incubados durante 2 horas a temperatura ambiente.
Las secciones son entonces lavadas 5 veces en PBS, 4 mM de MgCl2, y se fijan entonces los ligandos unidos durante 2 minutos (60% de acetona, 4% de PFA, 20 mM de Hepes pH7).
Despu�s de 3 lavados en PBS, las secciones se calientan a 65�C durante 2 horas en PBS para inactivar las fosfatasas end�genas. Las secciones son entonces lavadas 2 veces en PBS antes de la revelación de la actividad fosfatasa alcalina (preincubaci�n de 5 minutos de las secciones en 100 mM de Tris, pH 9,5, 100 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, seguida por la adición de NBT/BCIP (Promega)).
Los resultados obtenidos con las proteínas de fusión AP-Nt-Otx2 y AP-Hd-Otx2 se ilustran en la figura 2.
Leyenda de la figura 2:
A: Marcado obtenido con la proteína de fusión AP-Nt-Otx2.
B: Marcado obtenido con la proteína de fusión AP-Hd-Otx2. CP: células del epitelio pigmentario retiniano; Cb: células bipolares; RCG: células ganglionares. Estos resultados muestran que la proteína de fusión que comprende el dominio N-terminal de la Otx2 y su
homeodominio se fija específicamente sobre las RGCs y las células bipolares, mientras que la proteína de fusión que contiene sólo el homeodominio no se fija a ninguna de las células retinianas.
Se sintetizaron polip�ptidos biotinilados que corresponden a diferentes fragmentos de la porción de dominio Nterminal + homeodominio de Otx2 y se ensay� su fijación sobre unas secciones de retinas, preparadas como se ha descrito anteriormente. La incubaci�n de los p�ptidos con las secciones de retina se efectu� en las mismas condiciones que las descritas anteriormente, después se incubaron las secciones que llevan los p�ptidos fijados con estreptavidina marcada con fosfatasa alcalina, y se detect� la actividad fosfatasa alcalina, tal como se ha descrito anteriormente.
Uno de los p�ptidos ensayados (RK-Otx2), que corresponde a la secuencia RKQRRERTTFTRAQL (SEC ID n� 2) posee la misma especificidad de fijación que las proteínas de fusión AP-Otx2 y AP-Nt-Otx2.
Se efectuaron entonces mutaciones en este polip�ptido. Uno de los mutantes (AA-Otx2), en el que dos amino�cidos básicos (RK) son cambiados por dos amino�cidos neutros (AA), y que responde por lo tanto a la secuencia AAQRRERTTFTRAQL (SEC ID n� 3), no presenta ninguna fijación a las células retinianas.
Estos resultados son ilustrados en la figura 3.
Leyenda de la figura 3:
A: marcado obtenido con el p�ptido RK-Otx2.
B: marcado obtenido con el p�ptido AA-Otx2.
CP: células del epitelio pigmentario retiniano; Cb: células bipolares; RCG: células ganglionares.
Estos resultados muestran que el p�ptido RK-Otx2 se fija, tal como AP-Nt-Otx2, sobre las células ganglionares y bipolares. Sin embargo, no se observa ninguna fijación con el p�ptido AA-Otx2. Otro p�ptido (RA-Otx2), en el que el dip�ptido RK est� sustituido por RA, se fija sólo muy débilmente sobre las células ganglionares y bipolares (resultados no mostrados).
A fin de verificar que el p�ptido RK-Otx2 poseía la misma especificidad de fijación que AP-Nt-Otx2, se ensay� la capacidad de los polip�ptidos RK-Otx2 y AA-Otx2 para antagonizar la fijación de AP-Nt-Otx2. El ensayo de fijación de AP-Nt-Otx2 sobre secciones de retinas, se efectu� tal como se ha descrito anteriormente, excepto que la incubaci�n del sobrenadante que contiene AP-Nt-Otx2 se efectu� en presencia de 2 !g/ml de p�ptido RK-Otx2 o del p�ptido AA-Otx2).
Los resultados se ilustran en la figura 4.
Leyenda de la figura 4:
A: fijación de AP-Nt-Otx2 en presencia del p�ptido RK-Otx2.
B: fijación de AP-Nt-Otx2 en presencia del p�ptido AA-Otx2.
CP: células del epitelio pigmentario retiniano; Cb: células bipolares; RCG: células ganglionares.
Estos resultados muestran que el p�ptido RK-Otx2 bloquea la fijación de AP-Nt-Otx2 a las células bipolares y a las células ganglionares, mientras que el p�ptido AA-Otx2 no tiene ningún efecto sobre esta fijación.
EJEMPLO 2: EFECTO DE UN POLIP�PTIDO QUIMÉRICO QUE ASOCIA UN FRAGMENTO DE LA OTX2 QUE CONTIENE LA SECUENCIA DE DIRECCIONADO CELULAR CON UN DOMINIO HETER�LOGO DE ACTIVACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN, SOBRE LA SUPERVIVENCIA DE LAS NEURONAS GANGLIONARES RETINIANAS.
Se ha demostrado anteriormente (véase la solicitud PCT/FR 2009/000031, de 9 de enero de 2009) que la Otx2 protegía las neuronas ganglionares retinianas contra los efectos tóxicos de N-metil-D-aspartato (NMDA).
Se ha construido genéticamente y producido por síntesis bacteriana un polip�ptido quimérico, fusionando el dominio N-terminal de la Otx2 y su homeodominio (amino�cidos 1-97 de la Otx2), con el dominio trans-activador VP16 del virus del herpes (MLGDGDSPGPGFTPHDSAPYGALDMADFEFEQMFTDALGIDEYGG, SEC ID n� 4).
Unos ratones C57 B16 han recibido en el ojo derecho 1 !l de tampón de inyección (PBS o NaCl 9%) que contiene bien 1 mM de NMDA, o bien 1 mM de NMDA adicionado de 30 ng del polip�ptido quimérico, y en el ojo izquierdo el mismo volumen de tampón de inyección, sin aditivo.
La supervivencia de las neuronas ganglionares se determin� midiendo el nivel de expresión de Brain 3A (Brn3A), un factor de transcripción que, en la retina, est� específicamente expresado en las neuronas ganglionares (XIANG y otros, J. Neurosci., 15, 4762-4785, 1995).
Al final de 4 días, se sacrifican los animales, se extraen las retinas, y se extrae el ARNm.
El nivel de expresión del ARNm de Brn3A se determin� mediante RT-PCR cuantitativa, utilizando el gen de la hipoxantina fosforibosiltransferasa (HPRT) como gen de referencia, y se calcul� la relación entre la expresión del ARNm de Brn3A en el ojo derecho y en el ojo izquierdo.
Los resultados se ilustran en la figura 5. En la abscisa, se indican los aditivos utilizados; en la ordenada, se indica la relación entre las cantidades de ARNm Brn3A (normalizadas con respecto a ARNm HPRT) en el ojo derecho y en el ojo izquierdo.
Estos resultados muestran que NMDA, administrado solo, disminuye significativamente (en aproximadamente el 60%) la cantidad de neuronas ganglionares, y que la adición de 30 ng de polip�ptido quimérico protege eficazmente las neuronas ganglionares contra los efectos tóxicos de NMDA.
EJEMPLO 3: UNIÓN DE OTX2 A CÉLULAS DIANA DE LA CORTEZA CEREBRAL
La interacción con las células de la corteza cerebral de las proteínas de fusión AP-Otx2, AP-Nt-Otx2, AP-Hd-Otx2, y AP-HdAA-Otx2 (variante de AP-Nt-Otx2, en el que el doblete de amino�cidos RK se sustituyó por el doblete AA), solas (sobrenadante de cultivo diluido a 1/20), o en presencia de la Otx2 entera (1 !g/ml), o de p�ptidos RK-Otx2 o AA-Otx2 (2 �g/ml), se ensay� sobre unas secciones en criostato de cerebros de ratones adultos, utilizando el protocolo descrito en el ejemplo 1 anterior.
Los resultados se ilustran en la figura 6.
Leyenda de la figura 6: A-D, barra de escala 500 �m; (A) AP-Nt-Otx2; (B) AP (fosfatasa alcalina sola); (C) AP-Nt-Otx2 en presencia de la Otx2 entera; (D) AP-Hd-Otx2; E-H, barra de escala 100 �m; (E) AP-Nt-Otx2; (F) AP-HdAA-Otx2; (G) AP-Nt-Otx2 en presencia de RK-Otx2 (H) AP-Nt-Otx2 en presencia de AA-Otx2.
Estos resultados muestran que AP-Nt-Otx2 se une a unas células corticales, que comprenden las de la corteza cerebral visual; sin embargo, no se observa ninguna unión con AP, AP-Hd-Otx2, o AP-HdAA-Otx2. Además, la Otx2 entera as� como RK-Otx2, pero no AA-Otx2, bloquean la unión de AP-Nt-Otx2 a sus células diana.
Los glicosaminoglicanos (GAG) y, en particular, los proteoglicanos de sulfato de condroitina, son un constituyente esencial de la matriz extracelular (red perineuronal) que rodean las neuronas parvalb�minas de la corteza cerebral visual. La colocación de esta red perineuronal coincide con el final del periodo crítico de plasticidad; constituye un factor principal de la pérdida de plasticidad cortical que aparece al final de este periodo crítico, y se ha demostrado que la destrucción de esta red perineuronal por tratamiento con condroitinasa-ABC permitía restaurar esta plasticidad (PIZZORUSSO y otros, Science, 298, 1248-51, 2002).
Para determinar que la red perineuronal asociada a las neuronas parvalb�minas estaba implicada en la unión entre AP-Nt-Otx2 y sus células diana, se ensay� la fijación de AP-Otx2 sobre unas secciones en criostato de cerebros de ratones adultos fijados en metanol, y después incubados durante 24 horas en presencia de condroitinasa ABC (2 U/ml) en un tampón que contiene 50 mM de Tris [pH 8,0], 40 mM de acetato de sodio, 0,1% de BSA y unos inhibidores de proteasas. Paralelamente, las secciones, tratadas o no con condroitinasa ABC, se incubaron con 0,01 mg/ml de lectina Wisteria floribunda agglutinin (WFA; Sigma-Aldrich) que se fija a los GAGs de la red perineuronal, marcada con FITC.
Los resultados se ilustran en la figura 7.
Leyenda de la figura 7: (A) y (B) marcado con WFA; (C) y (D) incubaci�n en presencia de AP-Otx2; (A) y (C) secciones no tratadas; (B) y (D) secciones tratadas con condroitinasa ABC.
Estos resultados muestran que el tratamiento con condroitinasa ABC, que destruye los GAGs de la red perineuronal abole también la fijación de AP-Nt-Otx2.
Parece, por lo tanto, que son los GAGs de la red perineuronal asociada a las neuronas parvalb�minas los que llevan el sitio de fijación de AP-Nt-Otx2.
EJEMPLO 4: BLOQUEO IN VIVO DE LA TRANSFERENCIA END�GENA DE OTX2 POR EL P�PTIDO RK-OTX2
Como se mostr� anteriormente, el p�ptido RK-Otx2 puede bloquear in vitro la unión de Otx2 a sus células diana. Se ensay� si este efecto se producía también in vivo.
Con este objetivo, el p�ptido RK-Otx2 (0,25 mg/ml), el p�ptido AA-Otx2 (0,25 mg/ml), o un tampón PBS, asociados al ácido polisi�lico (0,25 mg/ml, para permitir la difusión de los p�ptidos y evitar su fijación no específica sobre neuronas que expresan en su superficie el ácido polisi�lico) se infusionaron lentamente (1 !l/h) durante 7 días en la corteza cerebral visual derecha de ratones adultos, con la ayuda de minibombas osm�ticas (Alzet 1003D, Alza) conectadas a unas c�nulas implantadas estereot�xicamente (HENSCH y otros, Science, 282, 1504-8, 1998; FAGIOLINI & HENSCH, Nature, 404, 183-6, 2000). Al final de la infusión, los ratones son perfundidos con el 4% de PFA, y se efectúan unos cortes de cerebro (25 !m) para estudiar la localización de la Otx2 y la del p�ptido RK-Otx2. La Otx2 se visualiza con la ayuda de un anticuerpo monoclonal de rata anti-Otx2 diluido al 1/200 (SUGIYAMA y otros, Cell, 134, 508-20, 2008), seguido de un anticuerpo de asno anti-rata marcado con Alexa 488 (Molecular Probes) diluido al 1/2000. El p�ptido RK-Otx2 se visualiza con la ayuda de estreptavidina marcada con Cy5.
Las células que expresan la Otx2 se contaron sobre una superficie de 700x350 !m, que engloba las capas II/III y IV de la zona binocular de la corteza cerebral visual.
Los resultados se ilustran en la figura 8.
Leyendas de la figura 8:
A-E: infusión de RK-Otx2 (barra de escala =100 �m) A, B: detección del p�ptido RK-Otx2; A: hemisferio control; B: hemisferio infusionado. C, D: Detección de Otx2; C: hemisferio control; D: hemisferio infusionado.
E: Cuantificación de las células que expresan la Otx2; barras negras: hemisferio control; barras grises: hemisferio infusionado. F-J: infusión de AA-Otx2 (barra de escala = 100 �m) F, G: detección del p�ptido AA-Otx2; A: hemisferio control; B: hemisferio infusionado. H, I: Detección de la Otx2; H: hemisferio control; I: hemisferio infusionado.
J: Cuantificación de las células que expresan la Otx2; barras negras: hemisferio control; barras grises: hemisferio infusionado; * p <0,005, Ensayo t de Student por series emparejadas; las barras de error representan el error tipo de la media.
Estos resultados muestran que la infusión del p�ptido RK-Otx2 en la corteza cerebral visual durante 7 días reduce significativamente el número de células que expresan la Otx2, sin embargo, en el caso del p�ptido AA-Otx2 se observa solamente una reducción débil, no significativa, del número de células que expresan la Otx2.
Se ha verificado, mediante marcado con Sytox green, que la infusión no tenía efecto en s� misma sobre el número de células. Para asegurar que la disminución del número de células que expresan la Otx2 no se debe a la muerte de las células, se efectu� una infusión de este p�ptido según el protocolo descrito anteriormente, y se midió el número de células que expresan la Otx2 8 días después del final de la infusión. En estas condiciones, se detecta sólo, 8 días después del final de la infusión, cantidades muy débiles de p�ptido RK-Otx2, y el número de células que expresan la Otx2 en el hemisferio tratado es restaurado a nivel del hemisferio de control.
EJEMPLO 5: RESTAURACIÓN DE LA PLASTICIDAD CORTICAL POR EL P�PTIDO RK-OTX2
Los ejemplos del p�ptido RK-Otx2 sobre la plasticidad de la corteza ocular se compararon con los de la condroitinasa-ABC, conocida por permitir la restauración de esta plasticidad (PIZZORUSSO y otros, Science, 298, 1248-51, 2002).
El p�ptido RK-Otx2 o el p�ptido AA-Otx2 se infusionaron en ratones adultos (por lo tanto después del cierre del periodo crítico de plasticidad), tal como se ha descrito en el ejemplo 4 anterior. Se inyect� la condroitinasa-ABC, o el tampón de inyección (agua desionizada + 0,1% de SAB) (0,4 !l para cada inyección) en 3 sitios que rodean la corteza cerebral visual (AP lambda, LM 1,5 mm; AP lambda, 4,0 mm; AP + 1,5 mm; LM 2,5 mm) a dos profundidades diferentes (300 y 500 �m).
Despu�s de la infusión de p�ptidos o la inyección de condroitinasa-ABC, los ratones son sometidos a una privación monocular durante 4 días, y las respuestas a los estímulos visuales se miden después por electrofisilog�a unitaria extracelular. Los registros electrofisiol�gicos se efectúan bajo anestesia nembutal/anestesia clorprotixeno usando técnicas estándares (GORDON & STRYKER, J Neurosci, 16, 3274-86, 1996; MATAGA y otros, Neuron, 44, 103141, 2004). Se efectuaron de 5 a 7 registros unitarios por cada ratón, de los dos lados del eje mediolateral de la corteza cerebral visual primaria, para cubrir la zona monocular y la zona binocular, y evitar unos sesgos de muestreo. Se atribuyeron unos resultados de dominancia celular a las respuestas celulares, utilizando un sistema de clasificación en 7 puntos (WIESEL & HUBEL, J Neurophysiol, 26, 978-93, 1963) (GORDON & STRYKER, J Neurosci, 16, 3274-86, 1996). La dominancia ocular en la zona binocular se calcul� para cada ratón según un índice de sesgo controlateral (CBI), determinado de la siguiente manera:
(CBI): [(n1-n7+2/3(n2-n6) + 1/3(n3-n5)+N]/2N,
en la que N = número total de células y nx = número de células que corresponden a un resultado de dominancia ocular de x.
Esta media ponderada del sesgo en favor de uno u otro ojo puede variar entre 0, para una dominancia ipsilateral completa, y 1 para una dominancia controlateral completa.
Adem�s, se efectuaron unos cortes frontales de los cerebros de los ratones tratados, como se ha descrito en el ejemplo 4 anterior, a fin de determinar la influencia del p�ptido RK-Otx2 sobre las neuronas parvalb�minas. Los cortes se marcaron bien con WFA, como se ha descrito en el ejemplo 3, o bien con la ayuda de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-parvalb�mina (1/500, Sigma-Aldrich), que fue revelado con la ayuda de un anticuerpo de asno anti-ratón, marcado con Cy3. Las células marcadas se cuantificaron tal como se ha descrito en el ejemplo 4.
Los resultados se ilustran en la figura 9.
Leyendas de la figura 9:
A: índice de sesgo controlateral después de la infusión del p�ptido RK-Otx2 (RK) o del p�ptido AA-Otx2 (AA), o después de la inyección de condroitinasa-ABC (chABC) o de tampón de inyección solo (Veh). B-E: marcado con WFA (B y C) y expresión de la parvalb�mina (D y E) en la región supragranular de la corteza cerebral visual del hemisferio infusionado con el p�ptido RK (C y E), y del hemisferio no infusionado (barra de escala = 100 !m).
F: cuantificación de las células marcadas con WFA y de las células que expresan la parvalb�mina después de la infusión del p�ptido RK-Otx2 (RK) o del p�ptido AA-Otx2 (AA); barras negras: hemisferio control; barras grises; hemisferio infusionado; *p<0,05, Ensayo t de Student por series emparejadas; las barras de error representan el error tipo de la media.
Estos resultados muestran que la privación monocular induce una dominancia ocular (disminución del índice de sesgo contralateral de 0,7 a 0,57) en los ratones adultos tratados por el p�ptido RK-Otx2, como en los tratados por la condroitinasa-ABC (chABC), con la diferencia de los ratones tratados con el tampón de inyección o el p�ptido AA-Otx2.
Paralelamente, la infusión del p�ptido RK-Otx2 (pero no la del p�ptido AA-Otx2) disminuye la expresión de los sitios de unión de la WFA, as� como de la parvalb�mina. El número de células positivas para la parvalb�mina disminuye un 56,2%, y el de las células rodeadas por unos sitios de unión del WFA disminuye un 51,3%.
Se resalta de estos resultados que el bloqueo de la transferencia de Otx2 por el p�ptido RK-otx provoca la inhibición de la expresión de la parvalb�mina, as� como una destrucción de la red perineuronal similar a la provocada por la condroitinasa-ABC. Resulta de ello un retorno de las neuronas parvalb�minas a un estado inmaduro, similar al observado habitualmente durante el periodo crítico, y este estado inmaduro permite la reapertura del periodo crítico, y la restauración de la plasticidad que est� asociada a ello.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE ECOLE NORMALE SUPERIEURE PROCHIANTZ, Alain DI NARDO, Ariel BEURDELEY, Marine
<120> POLIP�PTIDOS DE DIRECCIONADO ESPECÍFICO A CÉLULAS DIANAS DE OTX2
<130> MJP/11-F644/235WO
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> P�ptido de direccionado
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)..(1)
<223> Lys <220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Arg
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3)..(3)
<223> Asn
<220>
<221> VARIANTE
<222> (4)..(4)
<223> Lys
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5)..(5)
<223> Lys
<220>
<221> VARIANTE
<222> (6)..(6)
<223> Asp
<220>
<221> VARIANTE
<222> (7)..(7)
<223> Lys
<220>
<221> VARIANTE
<222> (8)..(8)
<223> Ser
<220>
<221> VARIANTE
<222> (9)..(9)
<223> Ser
<220>
<221> VARIANTE
<222> (10)..(10)
<223> Tyr
<220>
<221> VARIANTE
<222> (10)..(10)
<223> Trp
<220>
<221> VARIANTE
<222> (11)..(11)
<223> Ser
<220>
<221> VARIANTE
<222> (12)..(12)
<223> Lys
<220>
<221> VARIANTE
<222> (13)..(13)
<223> Gly
<220>
<221> VARIANTE
<222> (14)..(14)
<223> Asn
<220>
<221> VARIANTE
<222> (15)..(15)
<223> Ile
<220>
<221> VARIANTE
<222> (15)..(15)
<223> Val
<400> 1
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> P�ptido de direccionado
<400> 2
<210> 3
<211> 15
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> P�ptido de direccionado: mutante inactivo
<400> 3
<210> 4
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial 25 <220>
<223> Dominio transactivador VP16
<400> 4

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Polip�ptido de direccionado celular, caracterizado porque se define mediante la secuencia B1B2X1B3B4X2B5X3X4X5X6B6X7X8X9 (SEC ID n� 1), en la que:
    B1, B2, B3, B4, B5 yB6 representan, independientemente, arginina o lisina; X1 yX8 representan, independientemente, asparginina o glutamina; X2 representa ácido asp�rtico o ácido glut�mico; X3, X4 yX6 representan, independientemente, treonina o serina; X5 representa fenilalanina, tirosina o tript�fano; X7 representa alanina o glicina; X9 representa leucina, isoleucina o valina.
    y porque cuando se pone en presencia de células retinianas, se une específicamente a las neuronas ganglionares y a las neuronas bipolares.
  2. 2.
    Polip�ptido de direccionado celular, según la reivindicación 1, caracterizado porque:
    -al menos uno de los amino�cidos B1, B3, B4, B5 yB6 es una arginina; y/o -B2 es una lisina; y/o -al menos uno de los amino�cidos X1 yX8 es una glutamina; y/o -X2 es un ácido glut�mico; y/o -al menos uno de los amino�cidos X3 X4 yX6 es una treonina; y/o -X5 es una fenilalanina; y/o -X7 es una alanina; y/o -X9 es una leucina.
  3. 3.
    Polip�ptido de direccionado celular, según la reivindicación 2, caracterizado porque est� definido por la secuencia siguiente: RKQRRERTTFTRAQL (SEC ID n� 2).
  4. 4.
    Polip�ptido que contiene un polip�ptido de direccionado celular, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un polip�ptido transductor.
  5. 5.
    Composición que comprende un polip�ptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, unido a una carga de interés.
  6. 6.
    Composición, según la reivindicación 5, caracterizada porque est� constituida por un polip�ptido quimérico que contiene un polip�ptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y uno o varios polip�ptidos que constituyen la carga.
  7. 7.
    Composición, según la reivindicación 6, caracterizada porque dicho polip�ptido quimérico contiene: -un polip�ptido según la reivindicación 4, y -una carga que comprende una o varias secuencias de regulaci�n de la transcripción y/o una o varias secuencias
    de regulaci�n de la traducción.
  8. 8.
    Utilización de un polip�ptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para el direccionado específico in vitro de una carga de interés de unas células dianas de Otx2.
  9. 9.
    Polip�ptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para una utilización de diagnóstico o terapéutica que permite el direccionado específico de una carga de interés de unas células dianas de Otx2.
  10. 10.
    Utilización de un polip�ptido, según la reivindicación 4, para el direccionado específico in vitro de una carga de interés de unas células diana de Otx2 y la internalizaci�n de dicha carga en dichas células.
  11. 11.
    Polip�ptido, según la reivindicación 4, para una utilización de diagnóstico o terapéutica que permite el direccionado específico de una carga de interés de unas células dianas de Otx2, y la internacionalizaci�n de dicha carga en dichas células.
  12. 12.
    Utilización de una composición, según la reivindicación 7, para aumentar in vitro la supervivencia de las células diana de Otx2.
  13. 13.
    Composición, según la reivindicación 7, para la utilización como medicamento para prevenir o tratar la degeneración de células diana de Otx2.
  14. 14.
    Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 8, 10 � 12, caracterizada porque dichas células diana de Otx2 son neuronas ganglionares o neuronas bipolares retinianas.
  15. 15.
    Polip�ptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la utilización como medicamento que inhibe la fijación de Otx2 a las neuronas parvalb�minas, para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre la ambliop�a, los trastornos ansiosos, el síndrome del estr�s post-traumático, la psicosis maniaco-depresiva y la esquizofrenia.
ES10704386.1T 2009-01-19 2010-01-19 Polip�ptidos de direccionado específico a células diana de Otx2 Active ES2471458T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0900217A FR2941230B1 (fr) 2009-01-19 2009-01-19 Polypeptides d'adressage specifique a des cellules-cibles d'otx2
FR0900217 2009-01-19
PCT/FR2010/000045 WO2010081975A1 (fr) 2009-01-19 2010-01-19 Polypeptides d'adressage specifique a des cellules-cibles d'otx2

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2471458T3 true ES2471458T3 (es) 2014-06-26

Family

ID=41059552

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10704386.1T Active ES2471458T3 (es) 2009-01-19 2010-01-19 Polip�ptidos de direccionado específico a células diana de Otx2

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20120015884A1 (es)
EP (1) EP2387579B1 (es)
JP (1) JP5756024B2 (es)
CA (1) CA2750005C (es)
ES (1) ES2471458T3 (es)
FR (1) FR2941230B1 (es)
WO (1) WO2010081975A1 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2926023B1 (fr) * 2008-01-09 2010-02-26 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'une homoproteine de la famille bicoid pour le traitement du glaucome.
KR102098006B1 (ko) * 2018-02-23 2020-04-07 삼성전자주식회사 외부 객체를 감지하여 무선 전송 전력을 제어하는 방법 및 이를 구현한 전자 장치
EP4263569A1 (en) 2020-12-17 2023-10-25 Sorbonne Universite Polypeptides binding selectively heparin or heparan sulfate glycosaminoglycans and cell-penetrating polypeptides comprising the same

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996016989A1 (en) * 1994-11-28 1996-06-06 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology p53 PROTEINS WITH ALTERED TETRAMERIZATION DOMAINS
GB9814527D0 (en) 1998-07-03 1998-09-02 Cyclacel Ltd Delivery system
IL142869A0 (en) * 1998-11-13 2002-03-10 Cyclacel Ltd Transport vectors
US20110093981A9 (en) * 1999-05-06 2011-04-21 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription in plants and uses thereof for plant improvement
US20080229439A1 (en) * 1999-05-06 2008-09-18 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription in plants and uses thereof for plant improvement
US20020132753A1 (en) * 2000-01-31 2002-09-19 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
FR2810985B1 (fr) * 2000-07-03 2004-12-24 Synt Em Peptides lineaires amphipathiques et les compositions les contenant
CN1342679A (zh) * 2000-09-12 2002-04-03 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——神经发育调控蛋白37.95和编码这种多肽的多核苷酸
US20020142299A1 (en) * 2001-01-09 2002-10-03 Davidson Beverly L. PTD-modified proteins
AU2002345051A1 (en) * 2001-06-12 2002-12-23 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Bace interacting proteins
FR2849603B1 (fr) 2003-01-07 2006-09-08 Centre Nat Rech Scient Composition pour le transport intracellulaire de macromolecules ou particules biologiques
US7858346B2 (en) * 2003-02-03 2010-12-28 Japan Science Technology Agency Regeneration and neogenesis of retinal visual cell-expressing Otx2 protein
JP2008019169A (ja) * 2004-10-25 2008-01-31 Osaka Univ 新規ｐｐａｒ調節剤およびそのスクリーニング方法
US9243226B2 (en) * 2007-02-23 2016-01-26 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Biasing of cells toward retinal, corneal or lens development
FR2926023B1 (fr) * 2008-01-09 2010-02-26 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'une homoproteine de la famille bicoid pour le traitement du glaucome.

Also Published As

Publication number Publication date
CA2750005C (fr) 2018-02-27
WO2010081975A1 (fr) 2010-07-22
FR2941230B1 (fr) 2011-03-18
US20170080060A1 (en) 2017-03-23
FR2941230A1 (fr) 2010-07-23
US10842852B2 (en) 2020-11-24
CA2750005A1 (fr) 2010-07-22
EP2387579B1 (fr) 2014-03-12
JP2012515194A (ja) 2012-07-05
EP2387579A1 (fr) 2011-11-23
JP5756024B2 (ja) 2015-07-29
US20120015884A1 (en) 2012-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2381206T3 (es) Inhibidores peptídicos con permeabilidad celular de la ruta de transducción de la señal JNK
KR101653774B1 (ko) 올리고펩타이드 화합물 및 이의 용도
KR101801454B1 (ko) 환형의 수용체-연관된 단백질(ｒａｐ) 펩티드
Gao et al. TDP-43 specific reduction induced by Di-hydrophobic tags conjugated peptides
PT2060265E (pt) Inibidores peptídicos da via de transdução de sinal da jnk, permeáveis em células
ES2471458T3 (es) Polip�ptidos de direccionado específico a células diana de Otx2
ES2821599A1 (es) Compuestos y metodos para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer
JPH11341988A (ja) セマフォリンｋ１
CN106661086A (zh) 药物递送增强剂
US20200230207A1 (en) Treatment of bone growth disorders
BR112013007557A2 (pt) peptídeos nd2 e seu uso no tratamento de doenças neurológicas
KR20120001964A (ko) 알러지성 질환의 치료 및 예방을 위한 펩타이드
KR20210054542A (ko) 신경 가소성을 유도하기 위한 방법 및 조성물
CN101525602A (zh) 制备抗pink1多克隆抗血清的多肽及其应用
Akhter Isolation of VGF derived neuropeptide receptor
US20230321188A1 (en) Autophagy inducing peptides
JP6984815B2 (ja) 神経変性疾患タンパク質の異常凝集を伴って発症する神経疾患に対する予防又は治療剤、及び上記予防又は治療剤のスクリーニング方法
US20210361742A1 (en) Peptide therapeutics for the treatment of cancer and uses thereof
WO2025168025A1 (zh) 质子泵结合剂及其在制备试剂中的用途
KR20120122999A (ko) 알러지성 질환의 치료 및 예방을 위한 펩타이드
CN116063456A (zh) 靶向pkd2的阻断肽及其在制备治疗多囊肾病药物中的应用
Jin Development of a small alpha-synuclein-knockdown peptide as a potential therapy for Parkinson’s disease
NZ770391B2 (en) Compositions and methods for diagnosis and treatment of cancer
Cheng Identification and Characterization of Novel FE65-interacting Proteins
López del Hoyo Role of Guanylate Cyclase Activating Proteins in photoreceptor cells of the retina in health and disease