ES2469367T3 - 1-(5-Terc-butil-2-fenil-2H-pirazol-3-il)-3-[2-fluoro-4-(1-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-iloxi)-fenil]-urea y compuestos relacionados y su uso en terapia - Google Patents

Abstract

Un compuesto seleccionado entre los compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos:**Fórmula** en la que -J- es independientemente: o**Fórmula** y en la que -R es independientemente: -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -I; y en la que -R se sitúa en posiciones meta- o para- en el anillo fenilo.

Description

1-(5-Terc-butil-2-fenil-2H-pirazol-3-il)-3-[2-fluoro-4-(1-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-iloxi)-fenil]urea y compuestos relacionados y su uso en terapia 5

Solicitud relacionada

La presente solicitud est� relacionada con la solicitud de patente de Estados Unidos número 61/300.085 presentada el 1 de febrero de 2010.

10 Campo técnico

La presente invención se refiere, en líneas generales, al campo de compuestos terapéuticos, y más específicamente, a determinados compuestos (por comodidad, denominados conjuntamente en el presente

15 documento “compuestos IP”), que, entre otras cosas, son útiles en el tratamiento del cáncer, por ejemplo, cáncer caracterizado por (por ejemplo, dirigido por) RAS mutante (“cáncer RAS mutante”). La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos y al uso de dichos compuestos y composiciones en el tratamiento del cáncer, por ejemplo cáncer RAS mutante.

20 Antecedentes

En el presente documento se citan diversas patentes de publicaciones para describir y presentar más a fondo la invención y el estado de la técnica al cual pertenece la misma.

25 A lo largo de esta memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones indicadas más adelante, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entender� que la palabra “comprende”, y variaciones tales como “que comprende” y “comprendiendo”, implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas indicados pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.

30 Debe observarse que, como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “uno”, “una”, “el” y “la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto dictamine claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a un “vehículo farmacéutico” incluye mezclas de dos o más de dichos vehículos, y similar.

35 En el presente documento, los intervalos a menudo se expresan como de “aproximadamente” un valor particular y/o a “aproximadamente” otro valor particular. Cuando se expresa dicho intervalo, otra realización incluye desde un valor particular y/o al otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso de la palabra precedente “aproximadamente”, se entender� que el valor particular forma otra realización.

40 La presente descripción incluye información que puede ser útil en el entendimiento de la presente invención. No es una admisión que cualquier información proporcionada en el presente documento sea técnica anterior o relevante con respecto a la invención actualmente reivindicada, o que cualquier publicación específica o implícitamente citada sea técnica anterior.

45 Cáncer y RAS

Las proteínas RAS son pequeñas proteínas que se unen al nucleótido guanina que est�n secuencia abajo de receptores de factores de crecimiento, citocinas y hormonas. Estos receptores de superficie celular activan proteínas 50 denominadas factores intercambiadores de nucleótido de guanina (GNEF), que reemplazan GDP por GTP en proteínas RAS, estimulando la activación RAS. Otras proteínas, denominadas proteínas activadoras de GTPasa (GAP), estimulan la actividad GTPasa intrínseca de RAS, promoviendo de este modo la hidrólisis de GTP y restituyendo a RAS a su estado inactivo unido a GDP. RAS activado se une a diversas proteínas efectoras, que incluyen la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), la familia RAF de proteína quinasas y el factor intercambiador de

55 nucleótido de guanina RaI. Estos efectores a su vez regulan la actividad de las rutas de se�alizaci�n que controlan la proliferaci�n, senescencia, supervivencia y diferenciación celular. Existen tres genes RAS en mamíferos denominados HRAS, KRAS y NRAS y realizan funciones solapantes pero no conservadas.

Las proteínas RAS son también importantes en el cáncer. Un 20-30 % de los tumores humanos llevan mutaciones

60 somáticas con ganancia de función en uno de los genes RAS. Más habitualmente esto implica los codones para glicina 12 (G12), glicina 13 (G13) y glutamina 61 (Q61) y estas mutaciones deterioran, a través de mecanismos diferentes, la actividad GTPasa intrínseca de RAS estimulada por GAP, reteniéndola en el estado activo unida a GTP y permitiéndola promover la tumorog�nesis. Véase, por ejemplo Downward, 2003; Young et al., 2009; y Bos, 1989.

Tabla 1 Frecuencia de Mutaciones RAS en Diferentes Tipos de C�nceres

Tipo de Tumor

Frecuencia

Pancre�tico

90 %

Tiroideo (papilar indiferenciado)

60 %

Tiroideo (Folicular)

55 %

Colorrectal

45 %

Seminoma

45 %

S�ndrome mielodispl�sico (SMD)

40 %

Adenocarcinoma pulmonar (no microc�tico)

35 %

H�gado

30 %

Leucemia miel�gena aguda (LMA)

30 %

Melanoma

15 %

Vejiga urinaria

10 %

Ri��n

10 %

RAS y BRAF

Las proteínas RAS activas activan diversos efectores secuencia abajo, incluyendo las proteínas de la familia RAF. Hay tres proteínas RAF, ARAF, BRAF y CRAF. La proteína RAF activada fosforila y activa una segunda proteína quinasa denominada MEK, que después fosforila y activa una tercera proteína quinasa denominada ERK. ERK fosforila una multitud de sustratos citos�licos y nucleares, regulando de este modo procesos celulares tales como proliferaci�n, supervivencia, diferenciación y senescencia.

La proteína BRAF es importante en cáncer, porque est� mutada en aproximadamente el 2 % de los c�nceres humanos, particularmente en melanoma (43 % de casos), cáncer tiroideo (45 %), cáncer de ovario (10 %) y cáncer colorrectal (13 %). Por otro lado, en el cáncer humano son muy raras las mutaciones ARAF y CRAF. Sin embargo, especialmente en células cancerosas, el RAS oncog�nico no se�aliza a través de BRAF, sino que en cambio se�aliza exclusivamente a través de CRAF para activar MEK.

Se han descrito más de 100 mutaciones diferentes en BRAF en cáncer, pero una sola mutación (una sustitución de ácido glut�mico por valina en la posición 600) representa aproximadamente el 90 % de las mutaciones que se producen. Este mutante activa 500 veces BRAF y permite que estimule la se�alizaci�n constitutiva de ERK y NFkB, estimulando la supervivencia y proliferaci�n. Por consiguiente, V600EBRAF puede transformar células, tales como fibroblastos y melanocitos. La inhibición de V600EBRAF en células cancerosas inhibe la proliferaci�n celular e induce apoptosis in vitro, e in vivo suprime el crecimiento de células tumorales, validando a V600EBRAF como un agente terapéutico.

En la inmensa mayoría de c�nceres, las mutaciones BRAF y RAS son mutuamente exclusivas. Esto proporciona pruebas genéticas que sugieren que estas proteínas est�n en la misma ruta y que dirigen los mismos procesos en células cancerosas. Sin embargo, existen claras diferencias entre las funciones de BRAF oncog�nico y RAS oncog�nico en células cancerosas. En primer lugar, RAS activa diversas rutas, mientras que se sabe que BRAF solo activa la ruta MEK/ERK. Como consecuencia, las células mutantes BRAF son más dependientes de la se�alizaci�n MEK/ERK y por eso son considerablemente más sensibles a inhibidores de BRAF o MEK; en comparación con células en las que est� mutado RAS. Véase, por ejemplo, Garnett et al., 2004; Wellbrock et al., 2004; Gray-Schopfer et al., 2007; Solit et al., 2006.

Compuestos relacionados

Niculescu-Duvaz et al., 2006 (documento WO 2006/043090 A1), describen las siguientes clases de compuestos en las páginas 41 y 43 del mismo. Los compuestos se describen como inhibidores de BRAF útiles para el tratamiento del cáncer, especialmente cáncer BRAF mutante.

Adem�s, Niculescu-Duvaz et al., 2006 proporcionan los siguientes ejemplos:

Niculescu-Duvaz et al., 2007 (documento WO 2007/125330 A1), describen las siguientes clases de compuestos en las páginas 57 y 58 del mismo. Los compuestos se describen como inhibidores de BRAF útiles para el tratamiento del cáncer, especialmente cáncer BRAF mutante.

Adem�s, Niculescu-Duvaz et al., 2007 proporcionan los siguientes compuestos:

La presente invención proporciona compuestos alternativos, que se caracterizan por una combinación particular de motivos estructurales, y que proporcionan actividad sorprendente e inesperada (por ejemplo, actividad contra 5 c�nceres RAS mutantes), por ejemplo, en comparación con uno o más de los compuestos conocidos estructuralmente relacionados.

Aunque se conocen compuestos estructuralmente relacionados como inhibidores de BRAF, no se habría previsto que los compuestos reivindicados fuesen activos contra c�nceres RAS mutantes. 10

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la estructura química de diversos compuestos de la presente invención: AA-01, AA-02, AA03, y AA-04. 15 La Figura 2 muestra la estructura química de diversos compuestos de la presente invención: BB-01 y BB-02.

La Figura 3 muestra la estructura química de diversos compuestos de comparación: XX-01, XX-02, XX-03, y XX

04.

20 La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 (Inhibición de Crecimiento medio) de cada una de una serie de líneas celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 del compuesto AA

01. La serie de líneas celulares es (a) un panel de líneas celulares BRAF mutantes (mutBRAF): WM266.4,

A375M, UACC62; (b) un panel de líneas celulares RAS mutantes (mutRAS): SW620, HCT116, y WM1361; y (c) 25 un panel de líneas celulares BRAF y RAS de tipo silvestre (wtBRAFT/RAS): SKMEL23, KM12, y BT474.

La Figura 5 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 del compuesto BB-01. La serie de líneas celulares es como se indica en la Figura 4.

30 La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 del compuesto BB-02. La serie de líneas celulares es como se indica en la Figura 4.

35 La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 para el compuesto de comparación XX-01. La serie de líneas celulares es como se indica en la Figura 4.

La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas 40 celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 para el compuesto de comparación XX-02. La serie de líneas celulares es como se indica en la Figura 4.

La Figura 9 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 para el compuesto de comparación XX-03. La serie 45 de líneas celulares es como se indica en la Figura 4.

La Figura 10 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 para el compuesto de comparación XX-04. La serie de líneas celulares es como se indica en la Figura 4.

50 La Figura 11 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular RAS mutante SW620, para el tratamiento con el compuesto AA-01 y para controles.

La Figura 12 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular RAS mutante SW620, para el tratamiento con el compuesto BB-02 y para controles.

La Figura 13 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular BRAF mutante A375, para el tratamiento con el compuesto AA-01 y para controles.

La Figura 14 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular BRAF mutante A375, para el tratamiento con el compuesto BB-02 y para controles.

La Figura 15 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular RAS mutante SW620, para el tratamiento con el compuesto de comparación XX-01 y para controles.

La Figura 16 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular RAS mutante SW620, para el tratamiento con el compuesto de comparación XX-02 y para controles.

La Figura 17 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular RAS mutante SW620, para el tratamiento con el compuesto de comparación XX-03 y para controles.

La Figura 18 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular RAS mutante SW620, para el tratamiento con el compuesto de comparación XX-04 y para controles.

La Figura 19 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular BRAF mutante A375, para el tratamiento con el compuesto de comparación XX-02 y para controles.

Sumario de la invención

Un aspecto de la invención se refiere a determinados compuestos (por comodidad, denominados conjuntamente en el presente documento “compuestos IP”), como se describe en el presente documento.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende un compuesto IP, como se describe en el presente documento, y un vehículo o diluyente farmac�uticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención se refiere a métodos de preparación de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende la etapa de mezclar un compuesto IP, como se describe en el presente documento, y un vehículo o diluyente farmac�uticamente aceptable.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto IP, como se describe en el presente documento, para su uso en un método de tratamiento por terapia en el organismo de un ser humano o de un animal.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto IP, como se describe en el presente documento, en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento.

En una realización, el tratamiento es tratamiento del cáncer.

En una realización, el cáncer es cáncer tumoral sólido.

En una realización, el cáncer es cáncer pancreático, cáncer tiroideo (por ejemplo, folicular; papilar indiferenciado), cáncer colorrectal; seminoma; síndrome mielodispl�sico (SMD); cáncer de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma pulmonar); cáncer de hígado; leucemia (por ejemplo leucemia miel�gena aguda (LMA)); melanoma; cáncer de vejiga; cáncer de ri��n, cáncer de ovario, cáncer de conducto biliar o glioma.

En una realización, el cáncer es cáncer pancreático. En una realización, el cáncer es cáncer tiroideo. En una realización, el cáncer es cáncer colorrectal. En una realización, el cáncer es seminoma. En una realización, el cáncer es síndrome mielodispl�sico (SMD). En una realización, el cáncer es cáncer de pulmón. En una realización, el cáncer es adenocarcinoma pulmonar. En una realización, el cáncer es cáncer de hígado. En una realización, el cáncer es leucemia. En una realización, el cáncer es leucemia miel�gena aguda (LMA). En una realización, el cáncer es melanoma. En una realización, el cáncer es cáncer de vejiga. En una realización, el cáncer es cáncer de ri��n. En una realización, el cáncer es cáncer de mama.

En una realización, el cáncer es cáncer de ovario. En una realización, el cáncer es cáncer de conducto biliar. En una realización, el cáncer es glioma.

5 En una realización, el cáncer es cáncer RAS mutante (por ejemplo, cáncer pancreático RAS mutante, etc.).

En una realización, el cáncer se caracteriza por, o también se caracteriza por, células madre cancerosas.

En una realización, el tratamiento también comprende tratamiento con uno o más agentes terapéuticos o terapias 10 adicionales, por ejemplo, uno o más agentes o terapias contra el cáncer

Tambi�n se describe en el presente documento un kit que comprende (a) un compuesto IP, como se describe en el presente documento, proporcionado preferentemente como una composición farmacéutica y en un recipiente adecuado y/o con un envasado adecuado; y (b) instrucciones para su uso, por ejemplo, instrucciones por escrito

15 sobre cómo administrar el compuesto.

Como apreciar� un experto en la técnica, otro aspecto de la invención también se referir� a características y realizaciones preferidas de un aspecto de la invención.

20 Descripción detallada de la invención

Compuestos

La presente invención se refiere a determinados compuestos que est�n estructuralmente relacionados con los 25 siguientes compuestos:

1-(5-terc-butil-2-fenil-2H-pirazol-3-il)-3-[2-fluoro-4-(1metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-iloxi)fenil]-urea

1-(5-terc-butil-2-fenil-2H-pirazol-3-il)-3-[4-(1-metil-2-oxo2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-iloxi)-naftalen-1-il]urea

A diferencia de los compuestos conocidos, los compuestos de la presente invención se caracterizan por una combinación particular de motivos estructurales, específicamente:

(A)

un motivo 1-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-iloxi:

(B)

un resto de unión 2-fluoro-fen-1,4-di-ilo o un motivo de unión naft-1,4-di-ilo:

(C)

un motivo 1-(5-terc-butil-2-fenil-2H-pirazol-3-il)-ureilo, en el que el grupo fenilo lleva opcionalmente un meta o para sustituyente:

Ninguno de los compuestos conocidos tiene todos estos tres motivos. Adicionalmente, estudios de comparación con compuestos (incluyendo compuestos conocidos) demuestran que, de manera sorprendente e inesperada, los

10 compuestos que tienen estos tres motivos (es decir, los compuestos reivindicados) tienen sustancialmente mejor actividad contra c�nceres RAS mutantes, que los compuestos de comparación que carecen de uno o más de estos motivos.

Por tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y

15 solvatos de los mismos, farmac�uticamente aceptables (denominados conjuntamente en el presente documento “compuestos IP”):

en la que -J-es independientemente:

20 o

y en la que -R es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -I; y en la que -R se sitúa meta-o para-en el anillo fenilo.

25 En una realización, el compuesto se selecciona entre compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos, en la que -RA es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -I, y en la que -RA se sitúa meta-o para-en el anillo fenilo:

En una realización, el compuesto se selecciona entre compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos, en la que -RA es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -

I:

5 En una realización, el compuesto se selecciona entre compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos, en la que -RA es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -

I:

10 En una realización, -RA es independientemente -H, -Me, -F o -Cl. En una realización, -RA es independientemente -H o -Me. En una realización, -RA es independientemente -H. En una realización, -RA es independientemente -Me. En una realización, -RA es independientemente -F o -Cl.

15 En una realización, -RA es independientemente -F. En una realización, -RA es independientemente -Cl.

En una realización, el compuesto se selecciona entre el siguiente compuesto (es decir, AA-01), y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables del mismo: En una realización, el compuesto se selecciona entre el siguiente compuesto (es decir, AA-02), y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables del mismo:

En una realización, el compuesto se selecciona entre el siguiente compuesto (es decir, AA-03), y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables del mismo:

En una realización, el compuesto se selecciona entre el siguiente compuesto (es decir, AA-04), y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables del mismo:

En una realización, el compuesto se selecciona entre compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos, en la que -RB es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -I, y en la que -RB se sitúa meta-o para-en el anillo fenilo:

En una realización, el compuesto se selecciona entre compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos, en la que -RB es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -

I:

y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos, en la que -RB es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -I:

10 En una realización, -RB es independientemente -H, -Me, -F o -Cl. En una realización, -RB es independientemente -H o -Me. En una realización, -RB es independientemente -H. En una realización, -RB es independientemente -Me. En una realización, -RB es independientemente -F o -Cl.

15 En una realización, -RB es independientemente -F. En una realización, -RB es independientemente -Cl.

En una realización, el compuesto se selecciona entre el siguiente compuesto (es decir, BB-01), y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables del mismo:

En una realización, el compuesto se selecciona entre el siguiente compuesto (es decir, BB-02), y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables del mismo:

Combinaciones

Tambi�n se aprecia que ciertas características de la invención que, por claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas también puedan proporcionarse en combinación en una única realización. En cambio, diversas características de la invención que, por brevedad, se describen en el contexto de una única realización también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinaci�n adecuada. Todas las combinaciones de las realizaciones referentes a los grupos químicos representados por las variables (por ejemplo -J-, -R, -RA, -RB, etc.) se incluyen específicamente por la presente invención y se desvelan en este documento como si cada una y cada combinación se desvelaran individual y explícitamente, hasta el punto de que tales combinaciones incluyen compuestos que son compuestos estables (es decir, compuestos que pueden aislarse, caracterizarse y probarse para actividad biológica). Además, todas las subcombinaciones de los grupos químicos enumerados en las realizaciones que describen tales variables, también se incluyen específicamente por la presente invención y se desvelan en este documento como si cada una y cada dicha subcombinaci�n de grupos químicos se desvelaran explícitamente en este documento.

Formas Sustancialmente Purificadas

Un aspecto de la presente invención pertenece a compuestos IP, como se describe en este documento, en una forma sustancialmente purificada y/o en una forma sustancialmente libre de contaminantes.

En una realización, el compuesto est� en una forma sustancialmente purificada y/o en una forma sustancialmente libre de contaminantes.

En una realización, el compuesto est� en una forma sustancialmente purificada con una pureza de al menos el 50 % en peso, por ejemplo, al menos el 60 % en peso, por ejemplo, al menos el 70 % en peso, por ejemplo, al menos el 80 % en peso, por ejemplo, al menos el 90 % en peso, por ejemplo, al menos el 95 % en peso, por ejemplo, al menos el 97 % en peso, por ejemplo, al menos el 98 % en peso, por ejemplo, al menos el 99 % en peso.

A menos que se especifica, la forma sustancialmente purificada se refiere al compuesto en cualquier forma estereoisom�rica. Por ejemplo, en una realización, la forma sustancialmente purificada se refiere a una mezcla de estereois�meros, es decir, purificada con respecto a otros compuestos. En una realización, la forma sustancialmente purificada se refiere a un estereois�mero.

En una realización, el compuesto esta en una forma sustancialmente libre de contaminantes en la que los contaminantes representan no más del 50 % en peso, por ejemplo, no más del 40 % en peso, por ejemplo, no más del 30 % en peso, por ejemplo, no más del 20 % en peso, por ejemplo, no más del 10 % en peso, por ejemplo, no más del 5 % en peso, por ejemplo, no más del 3 % en peso, por ejemplo, no más del 2 % en peso, por ejemplo, no

m�s del 1 % en peso. A menos que se especifique, los contaminantes se refieren a otros compuestos, es decir, distintos de los estereois�meros. En una realización, los contaminantes se refieren a otros compuestos y otros estereois�meros.

Is�meros

Ciertos compuestos pueden existir en una o más formas geométricas, ópticas, enantiom�ricas, diasteriom�ricas, epim�ricas, atr�picas, estereoisom�ricas, tautom�ricas, conformacionales o anom�ricas particulares, incluyendo, pero sin limitación, formas cis y trans; formas E y Z; formas c, t y r, formas endo y exo; formas R, S y meso; formas D y L; formas d y l; formas (+) y (-) ; formas ceto, enol y enolato; formas syn y anti; formas sinclinal y anticlinal; formas ! y ∀; formas axiales y ecuatoriales; formas de barco, silla, giro, sobre y mediasilla; y combinaciones de las mismas, denominadas colectivamente en lo sucesivo en este documento como quot;is�merosquot; (o quot;formas isom�ricasquot;).

Cabe señalar que se excluyen específicamente del término quot;is�merosquot;, como se usa en este documento, los isómeros estructurales (o constitucionales) (es decir, isómeros que difieren en las conexiones entre átomos en lugar de simplemente por la posición de los átomos en el espacio). Por ejemplo, una referencia a un grupo terc-butilo, C(CH3)3, no se interpretar� como una referencia a su isómero estructural, iso-butilo, -CH2CH(CH3)2-. De forma análoga, una referencia a para-clorofenilo no se interpretar� como una referencia a su isómero estructural, metaclorofenilo.

Cabe señalar que se incluyen específicamente en el término quot;is�meroquot; compuestos con una o más sustituciones isot�picas. Por ejemplo, H puede estar en cualquier forma isot�pica, incluyendo 1H, 2H (D) y 3H (T); C puede estar en cualquier forma isot�pica, incluyendo 12C, 13C y 14C; O puede estar en cualquier forma isot�pica, incluyendo 16O y18O; y similares.

A menos que se especifique otra cosa, una referencia a un compuesto particular incluye todas estas formas isom�ricas, incluyendo mezclas de las mismas.

Sales

Puede ser conveniente o deseable preparar, purificar y/o manejar una sal correspondiente del compuesto, por ejemplo, una sal farmac�uticamente aceptable. Se analizan ejemplos de sales farmac�uticamente aceptables en Berge y col., 1977, quot;Pharmaceutically Acceptable Salts,quot; J. Pharm. Sci., Vol. 66, p�gs. 1-19.

Por ejemplo, si el compuesto es cati�nico, o tiene un grupo funcional que puede ser cati�nico (por ejemplo, -NHpuede ser -NH2+-), entonces puede formarse una sal con un ani�n adecuado. Los ejemplos de aniones inorgánicos adecuados incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de los siguientes ácidos inorgánicos: clorhídrico, bromh�drico, yodh�drico, sulfúrico, sulfuroso, nítrico, nitroso, fosf�rico y fosforoso.

Los ejemplos de aniones orgánicos adecuados incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de los siguientes ácidos orgánicos: 2-acetoxibenzoico, acético, asc�rbico, asp�rtico, benzoico, canforsulf�nico, cinn�mico, cítrico, ed�tico, etanodisulf�nico, etanosulf�nico, fum�rico, gluchept�nico, gluc�nico, glut�mico, glic�lico, hidroximaleico, hidroxinaftaleno carbox�lico, iseti�nico, l�ctico, lactobi�nico, l�urico, maleico, m�lico, metanosulf�nico, m�cico, oleico, ox�lico, palm�tico, pamoico, pantot�nico, fenilac�tico, fenilsulf�nico, propi�nico, pir�vico, salicílico, esteárico, succ�nico, sulfan�lico, tartárico, toluenosulf�nico y val�rico.

Los ejemplos de aniones orgánicos polim�ricos adecuados incluyen, pero sin limitación, los obtenidos a partir de los siguientes ácidos polim�ricos: ácido t�nico, carboximetil celulosa.

A menos que se especifique otra cosa, una referencia a un compuesto particular también incluye formas salinas del mismo.

Hidratos y Solvatos

Puede ser conveniente o deseable para preparar, purificar y/o manipular un solvato correspondiente del compuesto. El término quot;solvatoquot; se usa en este documento en el sentido convencional para referirse a un complejo de soluto (por ejemplo, compuesto, sal de compuesto) y un disolvente. Si el disolvente es agua, el solvato puede denominarse convenientemente como un hidrato, por ejemplo, un mono-hidrato, un di-hidrato, un tri-hidrato, etc.

A menos que se especifique otra cosa, una referencia a un compuesto particular también incluye formas solvato e hidrato del mismo.

S�ntesis Química

En este documento se describen procedimientos para la síntesis química de compuestos de la presente invención. Estos y/o otros procedimientos ya conocidos pueden modificarse y/o adaptarse de formas conocidas para facilitar la

s�ntesis de compuestos adicionales dentro del alcance de la presente invención. Se proporcionan descripciones de métodos y procedimientos de laboratorio generales, útiles para la preparación de los compuestos descritos en este documento, en Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry, 5� Edición, 1989, (Editores: Furniss, Hannaford, Smith y Tatchell) (publicado por Longmann, Reino Unido).

5 Se describen procedimientos para la síntesis de compuestos de piridina en particular en Heterocyclic Chemistry, 3� Edición, 1998, (Editores: Joule, Mills y Smith) (publicado por Chapman & Hall, Reino Unido).

Los compuestos IP descritos en este documento pueden prepararse a través de los intermedios (2). Estos

10 intermedios pueden prepararse a partir de un material de partida disponible en el mercado, 2-amino-3-nitro-4cloropiridina (1), y 3-fluoro-4-aminofenol (R1 es -H y R2 es -F) o 4-amino-1-naftol (R1 y R2 juntos son -CH=CH-). Después, los intermedios (2) se protegen selectivamente en el grupo amino, por ejemplo como un BOC, para proporcionar los intermedios (3).

15 Esquema 1

Los intermedios (3) también pueden obtenerse directamente a partir 2-amino-3-nitro-4-cloropiridina (1) y 3-fluoro-4aminofenol N-BOC-protegido o 4-amino-1-naftol N-BOC-protegido.

Esquema 2

El grupo nitro de los intermedios protegidos (3) puede reducirse a un grupo amino con Pd/C y formiato am�nico o hidrógeno, o con NiCl2 y NaBH4, para dar los intermedios diamino (4).

Esquema 3

Los intermedios (8), alquilados en N3 (con respecto al anillo de piridina), pueden prepararse a partir de los intermedios (4). El grupo 3-amino más nucle�filo en los intermedios (4) se convierte en carbamato de etilo, para

5 proporcionar los intermedios (5), y el grupo BOC se retira con TFA para proporcionar los intermedios (6). La desprotonaci�n del protón de carbamato ácido con NaH da un ani�n en N3 que se alquila para proporcionar los intermedios (7). La ciclaci�n de los intermedios (7), en presencia de base, proporciona los intermedios correspondientes (8).

10 Esquema 4

Los intermedios (8) se hacen reaccionar con 3-terc-butil-5-isocianato-1-aril-1H-pirazoles para proporcionar las ureas correspondientes. Los isocianatos respectivos pueden obtenerse por la reacción de aminas con fosgeno, trifosgeno

15 o sus derivados, o por la conversión de los ácidos carbox�licos correspondientes en acil azidas con, por ejemplo, difenil fosforil azida seguido de transposición de Curtius. El grupo arilo en el pirazol puede estar, por ejemplo, sin sustituir o sustituido (por ejemplo, meta o para-sustituido) con un grupo alquilo (por ejemplo, -Me) o un átomo de halógeno (por ejemplo, -F, -Cl, -Br, -I).

Esquema 5

Composiciones

5 Un aspecto de la presente invención pertenece a una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende un compuesto IP, como se describe en este documento, y un vehículo, diluyente o excipiente farmac�uticamente aceptable.

10 En una realización, la composición comprende adicionalmente uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4) agentes terapéuticos adicionales, como se describe en este documento.

Otro aspecto de la presente invención pertenece a un procedimiento para preparar una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende mezclar un compuesto IP, como se describe en este documento, y 15 un vehículo, diluyente o excipiente farmac�uticamente aceptable.

Otro aspecto de la presente invención pertenece a un procedimiento para preparar una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende mezclar un compuesto IP, como se describe en este documento; uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4) agentes terapéuticos adicionales, como se describe en este documento; y un

20 vehículo, diluyente o excipiente farmac�uticamente aceptable.

Usos

Los compuestos descritos en el presente documento son útiles, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer, por 25 ejemplo, cáncer RAS mutante.

Para evitar dudas, la expresión “cáncer RAS mutante”, se usa en el presente documento para referirse a cáncer que se caracteriza por (por ejemplo, dirigido por) RAS mutante, por ejemplo, por una o más mutaciones (por ejemplo, mutaciones de ganancia de función) en uno de los genes RAS (es decir HRAS, KRAS, y NRAS). Como se ha

30 indicado en el presente documento, las mutaciones RAS más comunes implican codones para uno o más de glicina 12 (G12), glicina 13 (G13) y glutamina 61 (Q61).

Uso en métodos de terapia

35 Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto IP, como se describe en el presente documento, para su uso en un método de tratamiento por terapia del organismo del ser humano o de un animal.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto IP, como se describe en el presente documento, en combinación con uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4) agentes terapéuticos adicionales, como se describe en el 40 presente documento, para su uso en un método de tratamiento por terapia del organismo del ser humano o de un animal.

Uso en la preparación de medicamentos

45 Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto IP, como se describe en el presente documento, en la preparación de un medicamento para su uso en tratamiento.

En una realización, el medicamento comprende el compuesto IP.

50 Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto IP, como se describe en el presente documento, y a uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4) agentes terapéuticos adicionales, como se describe en el presente documento, en la preparación de un medicamento para su uso en tratamiento.

En una realización, el medicamento comprende el compuesto IP y uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4) agentes terapéuticos adicionales.

Afecciones tratadas

En una realización, el tratamiento es tratamiento del cáncer.

En una realización, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer microc�tico de pulmón, cáncer no microc�tico de pulmón, cáncer gastrointestinal, cáncer de estómago, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer tiroideo, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer de pr�stata, cáncer testicular, cáncer de hígado, cáncer de ri��n, carcinoma de células renales, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de cerebro, glioma, sarcoma, osteosarcoma, cáncer de hueso, cáncer nasofaríngeo (por ejemplo, cáncer de cabeza, cáncer de cuello), cáncer de piel, cáncer escamoso, sarcoma de Kaposi, melanoma, melanoma maligno, linfoma o leucemia.

En una realización, el cáncer es:

un carcinoma, por ejemplo, un carcinoma de la vejiga, mama, colon/recto (por ejemplo, carcinomas colorrectales tales como adenocarcinoma de colon y adenoma de colon), de ri��n, epid�rmico, de hígado, de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma, cáncer microc�tico de pulmón y carcinomas no microc�ticos de pulmón), cáncer de esófago, de vesícula biliar, de ovario, de páncreas (por ejemplo, carcinoma pancreático exocrino), de estómago, de útero, tiroideo, de pr�stata, de piel (por ejemplo, carcinoma de células escamosas); un tumor hematopoy�tico de linaje linfoide, por ejemplo, leucemia, leucemia linfoc�tica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células pilosas o linfoma de Burkett; un tumor hematopoy�tico de linaje mieloide, por ejemplo, leucemias miel�genas agudas y crónicas, síndrome mielodispl�sico o leucemia promieloc�tica; un tumor de origen mesenquimal, por ejemplo fibrosarcoma o rabdomiosarcoma; un tumor del sistema nervioso central o periférico, por ejemplo astrocitoma, neuroblastoma, glioma o schwanoma, melanoma, seminoma; teratocarcinoma; osteosarcoma; xenoderma pigmentoso; queratoacantoma; cáncer folicular tiroideo o sarcoma de Kaposi.

En una realización, el cáncer es cáncer tumoral sólido.

En una realización, el cáncer es cáncer pancreático; cáncer tiroideo (por ejemplo, folicular; papilar indiferenciado); cáncer colorrectal; seminoma; síndrome mielodispl�sico (SMD); cáncer de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma pulmonar); cáncer de hígado; leucemia (por ejemplo leucemia miel�gena aguda (LMA)); melanoma; cáncer de vejiga; cáncer de ri��n, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de conducto biliar o glioma.

En una realización, el cáncer es cáncer pancreático. En una realización, el cáncer es cáncer tiroideo. En una realización, el cáncer es cáncer colorrectal. En una realización, el cáncer es seminoma. En una realización, el cáncer es síndrome mielodispl�sico (SMD). En una realización, el cáncer es cáncer de pulmón. En una realización, el cáncer es adenocarcinoma pulmonar. En una realización, el cáncer es cáncer de hígado. En una realización, el cáncer es leucemia. En una realización, el cáncer es leucemia miel�gena aguda (LMA). En una realización, el cáncer es melanoma. En una realización, el cáncer es cáncer de vejiga. En una realización, el cáncer es cáncer de ri��n. En una realización, el cáncer es cáncer de mama. En una realización, el cáncer es cáncer de ovario. En una realización, el cáncer es cáncer de conducto biliar. En una realización, el cáncer es glioma.

En una realización, el cáncer es cáncer RAS mutante (por ejemplo, cáncer pancreático RAS mutante, etc.).

En una realización, el cáncer se caracteriza por, o también se caracteriza por, células madre cancerosas.

El efecto anticanceroso puede producirse a través de uno o más mecanismos, incluyendo, pero sin limitación, la regulaci�n de la proliferaci�n celular, la inhibición de la progresión del ciclo celular, la inhibición de la angiog�nesis (la formación de nuevos vasos sanguíneos), la inhibición de metástasis (la propagación de un tumor desde su origen), la inhibición de la migración celular (la propagación de células cancerosas a otras partes del organismo), la inhibición de la invasión (la propagación de células tumorales en estructuras normales vecinas adyacentes), o la

promoci�n de la apoptosis (muerte celular programada). Los compuestos de la presente invención pueden usarse en el tratamiento de los c�nceres descritos en el presente documento, independientemente de los mecanismos indicados en el presente documento.

5 Tratamiento

El término “tratamiento”, como se usa en el presente documento en el contexto de tratar una afección, se refiere generalmente a tratamiento y terapia, tanto de ser un humano como de un animal (por ejemplo, en aplicaciones veterinarias), en el que se consigue algún efecto terapéutico deseado, por ejemplo, la inhibición del progreso de la

10 afección, e incluye una reducción en la velocidad del progreso, una detención en la velocidad del progreso, alivio de síntomas de la afección, mejoría y cura de la afección. También se incluye el tratamiento como una medida profiláctica (por ejemplo profilaxis). Por ejemplo, el uso en pacientes que aún no han desarrollado la afección, pero que est�n en riesgo de desarrollarla, se incluye en el término “tratamiento”.

15 Por ejemplo, tratamiento incluye la profilaxis del cáncer, la reducción de la frecuencia del cáncer, la reducción de la gravedad del cáncer, el alivio de los síntomas del cáncer, etc.

La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz”, como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un compuesto, o un material, composición o forma de dosificación que comprende un compuesto, que es eficaz para

20 producir algún efecto terapéutico deseado, acorde con una proporción de beneficio/riesgo razonable, cuando se administra de acuerdo con un régimen de tratamiento deseado.

Terapias de combinación

25 El término “tratamiento” incluye tratamientos de combinación y terapias, en los que dos o más tratamientos o terapias se combinan, por ejemplo, de manera secuencial o simultánea. Por ejemplo, los compuestos descritos en el presente documento pueden también usarse en terapias de combinación, por ejemplo, junto con otros agentes, por ejemplo, agentes citot�xicos, agentes anticancerosos, etc. Como ejemplos de tratamientos y terapias se incluyen, pero sin limitación, quimioterapia, (la administración de agentes activos incluyendo, por ejemplo, fármacos,

30 anticuerpos (por ejemplo, como una inmunoterapia), prof�rmacos (por ejemplo, como una terapia fotodin�mica, GDEPT, ADEPT, etc.); cirugía; radioterapia; terapia fotodin�mica, terapia g�nica y dietas controladas.

Por ejemplo, puede ser beneficioso combinar el tratamiento con un compuesto como se describe en el presente documento, con uno o más agentes (por ejemplo, 1, 2, 3, 4) distintos o terapias que regulen el crecimiento o la

35 supervivencia o la diferenciación celular mediante un mecanismo diferente, por tanto tratando diversos rasgos característicos de desarrollo de cáncer.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto como se describe en el presente documento, en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, como se describe a continuación.

40 La combinación particular se realizaría a criterio del m�dico quien seleccionaría las dosificaciones usando su conocimiento general común y los regímenes de dosificación conocidos por un facultativo con experiencia.

Los agentes (es decir, el compuesto descrito en el presente documento, más uno o más agentes distintos) pueden

45 administrarse simultánea o secuencialmente, y pueden administrarse en programas de dosificación que varían individualmente y mediante vías diferentes. Por ejemplo, cuando se administran secuencialmente, los agentes pueden administrarse a intervalos poco distantes (por ejemplo, durante un periodo de 5 a 10 minutos) o a intervalos más prolongados (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o más horas de diferencia, e incluso periodos de diferencia más largos cuando se requiera) siendo equiparable el régimen de dosificación exacto con las propiedades del agente (o

50 agentes) terapéutico.

Los agentes (es decir, el compuesto descrito en el presente documento, más uno o más agentes distintos) pueden formularse juntos en una forma de dosificación sencilla, o como alternativa, los agentes individuales pueden formularse por separado y presentarse juntos en la forma de un kit, opcionalmente con instrucciones para su uso.

55 Otros usos

Los compuestos IP descritos en el presente documento también pueden usarse como parte de ensayo in vitro, por ejemplo, para determinar si es posible que un hospedador candidato se beneficie del tratamiento con el compuesto

60 en cuestión.

Los compuestos IP descritos en el presente documento también pueden usarse como un patrón, por ejemplo, en un ensayo, para identificar otros compuestos, otros agentes anticancerosos, etc.

65 Kits

En el presente documento también se describe un kit que comprende (a) un compuesto IP como se describe en el presente documento, o una composición que comprende un compuesto IP como se describe en el presente documento, por ejemplo, preferentemente proporcionado en un recipiente adecuado y/o con un envasado adecuado y (b) instrucciones para su uso, por ejemplo, instrucciones por escrito sobre cómo administrar el compuesto o composición.

En una realización, el kit comprende adicionalmente uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4) agentes terapéuticos adicionales, como se describe en el presente documento.

Las instrucciones por escrito también pueden incluir un listado de indicaciones para las que el ingrediente activo es un tratamiento adecuado.

V�as de administración

El compuesto IP, o la composición farmacéutica que comprende el compuesto IP, puede administrarse a un sujeto mediante cualquier vía de administración conveniente, bien de manera sist�mica/periférica o típica (es decir, en el sito de acción deseado).

Las vías de administración incluyen, pero sin limitación, la administración oral (por ejemplo, por ingestión); bucal, sublingual; transd�rmica (incluyendo, por ejemplo, mediante un parche, emplaste, etc.); transmucosa (incluyendo, por ejemplo, mediante un parche, emplaste, etc.); intranasal (por ejemplo, mediante pulverización nasal, gotas o a partir de un atomizador o un dispositivo de administración de polvo seco); ocular (por ejemplo, mediante gotas oculares); pulmonar (por ejemplo, mediante terapia por inhalaci�n o insuflaci�n usando, por ejemplo, un aerosol, por ejemplo, a través de la boca o la nariz); rectal (por ejemplo, mediante supositorios o enemas), vaginal (por ejemplo, mediante pesarios), parenteral, por ejemplo, por inyección, incluyendo inyección subcutánea, intrad�rmica, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intracardiaca, intratecal, intraespinal, intracapsular, subcapsular, intraorbital, intraperitoneal, intratraqueal, subcuticular, intraarticular, subaracnoidea, e intraesternal, mediante implante de un depósito o reserva, por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular.

El sujeto/paciente

El sujeto/paciente puede ser un cordado, un vertebrado, un mamífero, un mamífero placentario, un marsupial (por ejemplo, un canguro, un vomb�tido), un roedor (por ejemplo, una cobaya, un h�mster, una rata, un ratón), murino (por ejemplo, un ratón ), un lagomorfo (por ejemplo, un conejo), aviar (por ejemplo, un pájaro), canino (por ejemplo, un perro), felino (por ejemplo, un gato), equino (por ejemplo, un caballo), porcino (por ejemplo, un cerdo), ovino (por ejemplo, una oveja), bovino (por ejemplo, una vaca), un primate, simio (por ejemplo, un mono o un mico), un mono (por ejemplo, mono tití, babuino), un macaco (por ejemplo, gorila, chimpancé, orangután, gib�n) o un ser humano.

Adicionalmente, el sujeto/paciente puede ser cualquiera de sus formas de desarrollo, por ejemplo, un feto.

En una realización preferida, el sujeto/paciente es un ser humano.

Formulaciones

Aunque es posible administrar el compuesto IP en solitario, se prefiere que est� presente como una formulación farmacéutica (por ejemplo, una composición, una preparación, un medicamento) que comprenda al menos un compuesto IP, como se describe en el presente documento, junto con uno o más ingredientes distintos farmac�uticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, vehículos, diluyentes, excipientes, adyuvantes, cargas, tampones, conservantes, antioxidantes, lubricantes, estabilizantes, solubilizantes, tensioactivos (por ejemplo, agentes humectantes), agentes enmascaradores, agentes colorantes, agentes sapor�feros y agentes edulcorantes farmac�uticamente aceptables. La formulación también puede comprender otros agentes activos, por ejemplo, otros agentes terapéuticos o profilácticos.

Por tanto, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas, como se define anteriormente, y métodos de preparación de una composición farmacéutica que comprende mezclar al menos un compuesto IP, como se describe en el presente documento, junto con uno o más ingredientes distintos farmac�uticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, vehículos, diluyentes, excipientes, etc. Si se formula como unidades individuales (por ejemplo, comprimidos, etc.) cada unidad contiene una cantidad predeterminada (dosificación) del compuesto.

La expresión “farmac�uticamente aceptable”, como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos, ingredientes, materiales, composiciones, formas de dosificación, etc., que est�n dentro del ámbito del buen criterio m�dico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos del sujeto en cuestión (por ejemplo, ser humano) sin exceso de toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, en consonancia con una proporción razonable de beneficio/riesgo. Cada vehículo, diluyente, excipiente, etc. también ha de ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con el resto de los ingredientes de la formulación.

Los vehículos, diluyentes, excipientes, etc. adecuados pueden encontrarse en textos farmacéuticos convencionales, por ejemplo Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18� edición, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5� edición, 2005.

Las formulaciones pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Dichos métodos incluyen la etapa de asociar el compuesto con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima el compuesto con vehículos (por ejemplo, vehículos líquidos, vehículos sólidos finamente divididos, etc.) y después dando forma al producto, si fuera necesario.

La formulación puede preparase para proporcionar una liberación rápida o lenta; inmediata, retardada, programada o sostenida; o una combinación de las mismas.

Las formulaciones pueden estar adecuadamente en forma de líquidos, soluciones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), suspensiones (por ejemplo acuosas, no acuosas), emulsiones (por ejemplo, aceite en agua, agua en aceite), elixires, jarabes, electuarios, colutorios, gotas, comprimidos (incluyendo, por ejemplo, comprimidos recubiertos), gránulos, polvos, pastillas para chupar, pastillas, cápsulas (incluyendo, por ejemplo, cápsulas de gelatina dura y blanda), obleas, píldoras, ampollas, bolos, supositorios, pesarios, pigmentos, geles, pastas, pomadas, cremas, lociones, aceites, espumas, pulverizaciones, nebulizaciones o aerosoles.

Las formulaciones pueden proporcionarse adecuadamente como un parche, un emplaste adhesivo, un vendaje, un apósito o similar que se impregna con uno o más compuestos y opcionalmente uno o más ingredientes farmac�uticamente aceptables, incluyendo, por ejemplo, potenciadores de penetraci�n, filtración y absorción. Las formulaciones también pueden proporcionarse adecuadamente en forma de un depósito o reserva.

El compuesto puede disolverse en, suspenderse en, o mezclarse con, uno o más ingredientes farmac�uticamente aceptables distintos. El compuesto puede presentarse en un liposoma u otra micropart�cula que se diseña para conducir el compuesto, por ejemplo, a componentes sanguíneos o a uno o más órganos.

Las formulaciones adecuadas para administración oral (por ejemplo, mediante ingestión) incluyen líquidos, soluciones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), suspensiones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), emulsiones (por ejemplo, aceite en agua, agua en aceite), elixires, jarabes, electuarios, comprimidos, gránulos, polvos, cápsulas, obleas, píldoras, ampollas, bolos.

Las formulaciones adecuadas para administración bucal incluyen colutorios, pastillas para chupar, pastillas, as� como parches, emplastes adhesivos, depósitos y reservas. Las pastillas para chupar comprenden normalmente el compuesto en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto. Las pastillas normalmente comprenden el compuesto en una matriz inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga. Los colutorios comprenden normalmente el compuesto en un vehículo líquido adecuado.

Las formulaciones adecuadas para administración sublingual incluyen comprimidos, pastillas para chupar, pastillas, cápsulas y píldoras.

Las formulaciones adecuadas para administración transmucosa oral incluyen líquidos, soluciones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), suspensiones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), emulsiones (por ejemplo, aceite en agua, agua en aceite), colutorios, pastillas para chupar, pastillas, as� como parches, emplastes adhesivos, depósitos y reservas.

Las formulaciones adecuadas para administración transmucosa no oral incluyen líquidos, soluciones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), suspensiones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), emulsiones (por ejemplo, aceite en agua, agua en aceite), supositorios, pesarios, geles, pastas, pomadas, cremas, lociones, aceites, as� como parches, emplastes adhesivos, depósitos y reservas.

Las formulaciones adecuadas para administración transd�rmica incluyen geles, pastas, pomadas, cremas, lociones y aceites as� como parches, emplastes adhesivos, vendajes, apósitos, depósitos y reservas.

Los comprimidos pueden prepararse por medios convencionales, por ejemplo, por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos fabricados por compresión pueden prepararse comprimiendo el compuesto en una máquina adecuada en una forma fluida, tal como, un polvo o gránulos opcionalmente mezclados con uno o más aglutinantes (por ejemplo povidona, gelatina, goma arábiga, sorbitol, tragacanto, hidroxipropilmetil celulosa); cargas o diluyentes (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina, hidrógeno fosfato cálcico), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice); disgregantes (por ejemplo almidón glicolato sádico, povidona reticulada, carboximetil celulosa sádica reticulada); agentes tensioactivos o dispersantes o humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sádico); conservantes (por ejemplo, metil p-hidroxibenzoato, propil p-hidroxibenzoato, ácido s�rbico); aromatizantes, agentes potenciadores del sabor y edulcorantes. Los

comprimidos moldeados pueden prepararse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Opcionalmente, los comprimidos pueden revestirse o ranurarse y pueden formularse de manera que se proporcione una liberación lenta o controlada del compuesto en su interior usando, por ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa en diversas proporciones para proporcionar el perfil de liberación deseado. Los comprimidos pueden proporcionarse opcionalmente con un recubrimiento, por ejemplo, que afecta a la liberación, por ejemplo, un recubrimiento ent�rico, para proporcionar la liberación en partes del intestino distintas del estómago.

Las pomadas se preparan normalmente a partir del compuesto y una base de pomada paraf�nica o miscible en agua

Las cremas se preparan normalmente a partir del compuesto y una base de crema de aceite en agua. Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos aproximadamente el 30 % p/p de un alcohol polih�drico, es decir, un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo, tales como, propilenglicol, butan-1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol y mezclas de los mismos. Las formulaciones típicas pueden incluir deseablemente un compuesto que potencie la absorción o penetraci�n del compuesto a través de la piel u otras áreas afectadas. Ejemplos de dichos potenciadores de penetraci�n d�rmicos incluyen dimetilsulf�xido y análogos relacionados.

Las emulsiones se preparan normalmente a partir del compuesto y una fase oleaginosa, que opcionalmente puede comprender simplemente un emulsionante (también conocido como emulgente) o puede comprender una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o con ambas cosas, una grasa y un aceite. Preferentemente, se incluye un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lip�filo que actúa como un estabilizante. También es preferible incluir tanto un aceite como una grasa. En su conjunto, el emulsionante (o emulsionantes) con o sin estabilizante (o estabilizantes) constituye la denominada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y/o grasa constituye la denominada base de pomada emulsionante que forma la fase oleaginosa dispersa de las formulaciones de crema.

Los emulgentes y estabilizantes de emulsión adecuados incluyen Tween 60, Span 80, alcohol cetoestear�lico, alcohol mirist�lico, monoestearato de glicerilo y lauril sulfato sádico. La elección de aceites o grasas adecuados para la formulación se basa en conseguir las propiedades cosm�ticas deseadas, ya que la solubilidad del compuesto en la mayoría de los aceites posiblemente a usar en formulaciones de emulsiones farmacéuticas debe ser muy baja. Por tanto, la crema debe ser preferentemente una crema no grasienta, que no manche y un producto que pueda lavarse con consistencia adecuada para impedir que se salga de los tubos u otros envases. Pueden usarse ésteres de alquilo mono o dib�sicos de cadena lineal o ramificada, tales como diisoadipato, isocetil estearato, di�ster de propilenglicol de ácidos grasos de coco, isopropil miristato, decil oleato, isopropil palmitato, butil estearato, 2-etilhexil palmitato o una mezcla de ésteres de cadena ramificada conocidos como Crodamol CAP, prefiriéndose los tres últimos ésteres. Estos pueden usarse solos o en combinación dependiendo de las propiedades requeridas. Como alternativa, pueden usarse lípidos de elevado punto de fusión tales como parafina blanda y/o parafina líquida u otros aceites minerales.

Las formulaciones adecuadas para administración intranasal, en las que el vehículo es un líquido, incluyen, por ejemplo, pulverización nasal, gotas nasales o mediante administración por aerosol a través de un nebulizador, que incluye soluciones acuosas u oleaginosas del compuesto.

Las formulaciones adecuadas para administración intranasal, en las que el vehículo es un sólido, incluyen, por ejemplo, las que se presentan como un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 500 micrómetros que se administra de manera en la que se toma el rape, es decir, por inhalaci�n rápida a través de las fosas nasales desde un recipiente con el polvo mantenido cerca de la nariz.

Las formulaciones adecuadas para administración pulmonar (por ejemplo, mediante terapia por inhalaci�n o insuflaci�n) incluyen las que se presentan como un pulverizador en aerosol desde un envase presurizado, con el uso de un propulsor adecuado, tal como diclorofluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, di�xido de carbono u otros gases adecuados.

Las formulaciones adecuadas para administración ocular incluyen gotas oculares en las que el compuesto se disuelve o se suspende en un vehículo adecuado, especialmente en un disolvente acuoso para el compuesto.

Las formulaciones adecuadas para administración rectal que pueden prepararse como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, aceites naturales o templados, ceras, grasas, polioles semil�quidos o líquidos, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato, o como una suspensión o solución para el tratamiento por enema.

Las formulaciones adecuadas para administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones pulverizadoras que contienen, además del compuesto, vehículos tales como los conocidos en la técnica, apropiados.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral (por ejemplo, mediante inyección), incluyen líquidos estériles, acuosos o no acuosos, isot�nicos, sin pir�genos (por ejemplo, soluciones, suspensiones), en las que el compuesto se disuelve, se suspende o se proporciona de otra manera (por ejemplo, en un liposoma u otra micropart�cula). Dichos líquidos también pueden contener otros ingredientes farmac�uticamente aceptables, tales como antioxidantes, tampones, conservantes, estabilizantes, bacteriost�ticos, agentes de suspensión, agentes espesantes y solutos que hacen que la formulación sea isot�nica con la sangre (u otros líquidos corporales importantes) del receptor al cual se destina. Como ejemplos de excipientes se incluyen, por ejemplo, agua, alcoholes, polioles, glicerol, aceites vegetales, y similares. Como ejemplos de vehículos isot�nicos adecuados para su uso en dichas formulaciones se incluyen Inyección de Cloruro Sádico, Solución de Ringer o Inyección de Ringer Lactada. Normalmente, la concentración del compuesto en el líquido es de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 10 #g/ml, por ejemplo de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 1 #g/ml. Las formulaciones pueden presentarse en envases monodosis o multidosis herméticamente cerrados, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden conservarse en un estado criodesecado (liofilizado) que solo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección provisional pueden prepararse a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.

Dosificaci�n

Un experto en la técnica apreciar� que las dosificaciones apropiadas de los compuestos IP, y composiciones que comprenden los compuestos IP, pueden variar de un paciente a otro. La determinación de la dosificación óptima generalmente implicar� el equilibrio del nivel del beneficio terapéutico frente a cualquier riesgo o efecto secundario perjudicial. El nivel de dosificación seleccionado depender� de diversos factores que incluyen, pero sin limitación, la actividad del compuesto IP particular, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreci�n del compuesto IP, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación, la gravedad de la afección y la especie, sexo, edad, peso, estado, salud general e historial m�dico anterior del paciente. La cantidad de compuesto IP y la vía de administración se realizarán finalmente según el criterio del m�dico, veterinario o facultativo, aunque generalmente la dosificación se seleccionar� para conseguir concentraciones locales en el lugar de acción que consigue el efecto deseado sin causar efectos secundarios perjudiciales o daño sustancial.

La administración puede efectuarse en una dosis, de manera continua o intermitente (por ejemplo, en dosis divididas a intervalos apropiados) a lo largo del ciclo de tratamiento. Los métodos para determinar los medios y dosificaciones de administración más eficaces son bien conocidos por los expertos en la técnica y variarán con la formulación usada para terapia, con la finalidad de la terapia, con la célula (o células) diana que vaya a tratarse, y con el sujeto que vaya a tratarse. Pueden realizarse administraciones sencillas o múltiples con el nivel de dosis y patrón que seleccione el m�dico, veterinario o facultativo tratante.

En general, una dosis adecuada del compuesto IP est� en el intervalo de aproximadamente 10 #g a aproximadamente 250 mg (más normalmente de aproximadamente 100 #g a aproximadamente 25 mg) por kilogramo de peso corporal del sujeto al día. Cuando el compuesto es una sal, un éster, una amida, un prof�rmaco o similar, la cantidad administrada se calcula basándose en el compuesto precursor y lo mismo el peso real a usar aumenta proporcionalmente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar la presente invención y pretenden limitar el alcance de la invención, como se describe en este documento.

S�ntesis Química

Todos los materiales de partida, reactivos y disolventes para reacciones fueron de calidad para reactivo y se usaron como se compraron. Los disolventes de cromatograf�a fueron de calidad para HPLC y se usaron sin purificación adicional. Las reacciones se controlaron por análisis de cromatograf�a en capa fina (TLC) usando placas de capa fina de gel de sílice 60 F-254 de Merck. La cromatograf�a ultrarrápida se realizó en gel de sílice 60 de Merck (0,0150,040 mm) o en columnas de gel de sílice Isolute Flash Si y Si II desechables. El análisis por TLC preparativa se realizó en placas de TLC previamente recubiertas de Macherey-Nagel [809 023] SIL G-25 UV254 o en placas de TLC preparativa previamente recubiertas de Analtech [2015], 2000 #m con UV254. Los análisis por LCMS se realizaron en un sistema de HPLC Micromass LCT/Water's Alliance 2795 con una columna Discovery 5 #m, C18, 50 mm x 4, 6 mm de d.i. de Supelco a una temperatura de 22 �C usando los siguientes sistemas de disolventes: Disolvente A: metanol; Disolvente B: ácido f�rmico al 0,1 % en agua a un caudal de 1 ml/min. Gradiente partiendo del 10 % de A/90 % de B de 0-0,5 minutos, después del 10 % de A/90 % de B al 90 % de A/10 % de B de 0,5 minutos a 6,5 minutos y continuando al 90 % de A/10 % de B hasta 10 minutos. A partir de 10-10,5 minutos, el gradiente se invirtió al 10 % de A/90 % en el que las concentraciones permanecieron hasta 12 minutos. La detección UV fue a 254 nm y la ionizaci�n fue electropulverizaci�n de i�n positivo o negativo. El intervalo de barrido de peso molecular es 501000. Las muestras se suministraron como 1 mg/ml en DMSO o metanol con 3 #l inyectado en un llenado de bucle

parcial. Los espectros de RMN se registraron en DMSO-d6 en un espectrómetro Bruker Advance 500 MHz. Síntesis 1 2-Fluoro-4-hidroxifenilcarbamato de terc-butilo

Se a�adi� 4-amino-3-fluorofenol (10,61 g, 83,5 mmol) a una mezcla fundida de Boc2O (18,29 g, 83,8 mmol) e InCl3 (188 mg, 0,85 mmol) a 35 �C. La mezcla de color negro se agit� a 35 �C durante 2 horas, tiempo durante el cual se convirtió en un aceite de color negro espeso. Después, la mezcla se diluyó con EtOAc (200 ml) y H2O (200 ml) y la agitaci�n continu� durante 10 minutos. Las capas se separaron y la capa orgánica se lav� con H2O (3 x 200 ml), se secó (MgSO4), se filtr� y se concentr� a sequedad. El aceite de color negro resultante se disolvió de nuevo en CH2Cl2 (50 ml) y se cargó sobre una columna de gel de sílice. La eluci�n con EtOAc al 5 ∃ 7 % en CH2Cl2 produjo el compuesto del título en forma de un sólido cristalino de color amarillo claro.

Rendimiento: 16,7 g (90 %). 1H RMN (DMSO-d6), % (ppm), J (Hz): 1,42 (s, 9H, C(CH3)3), 6,50-6,57 (m, 2H, ArH), 7,11-7,21 (m, 1H, ArH), 8,45 (s a, 1H, OH), 9,63 (s, 1H, NHBoc); 13C RMN (DMSO-d6), % (ppm), J (Hz): 28,0, 78,6, 102,7 (d, JFH = 22,2). 110,8 (d, JFH = 2,7), 117,1 (d, JFH = 12,6), 127,2, 153,7, 155,5 (d, JFH = 11,3), 156,1 (d, JFH = 246); 19F-RMN (DMSO-d6), % (ppm): -121,6; LC-MS (3,94 min): m/z calc. para C11H14FNO3 [M-C(CH3)3]+: 172,0; observado: 172,0.

S�ntesis 2

4-(2-Amino-3-nitropiridin-4-iloxi)-2-fluorofenilcarbamato de terc-butilo (3a)

Se a�adi� DMSO seco (20 ml) a NaH (1,029 g de una dispersi�n al 60 % en aceite mineral, 25,7 mmol) en un matraz de fondo redondo en una atmósfera de argón. Después de 5 minutos, se a�adi� en tres porciones 2-fluoro-4hidroxifenilcarbamato de terc-butilo sólido (5,59 g, 24,6 mmol), dando una solución de color oscuro, que, después de 15 minutos de agitaci�n a temperatura ambiente, se trat� con 4-cloro-3-nitropiridin-2-amina (4,23 g, 24,4 mmol) de inmediato. La solución de color rojo oscuro se calentó a 110 �C durante 1 hora y se dej� enfriar a temperatura ambiente. A la solución se le añadieron posteriormente EtOAc (150 ml) y H2O (200 ml) y la capa orgánica se aisl�. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron una vez con NaHCO3 saturado (150 ml), se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron a sequedad para dar un sólido de color amarillo brillante. Este material se us� en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Rendimiento: 8,68 g (98 %). 1H RMN (DMSO-d6), % (ppm), J (Hz): 1,46 (s, 9H, C(CH3)3), 6,08 (d, 1H, 3JHH = 5,5, PyrH), 7,01 (m, 1H, ArH), 7,18 (s a, 2H, NH2), 7,22 (m, 1H, ArH), 7,67 (m, 1H, ArH), 8,04 (d, 1H, 3JHH = 5,5, PyrH), 9,03 (s, 1H, NHBoc); 19F-RMN (DMSO-d6), % (ppm): -120,7; LC-MS (4,72 min): m/z calc. para C16H17FN4O5 [M+H+]: 365,0; observado: 365,0.

S�ntesis 3

4-(2,3-Diaminopiridin-4-iloxi)-2-fluorofenilcarbamato de terc-butilo (4a) Se a�adi� Pd/C (1,09 g) a una solución de color amarillo de 4-(2-amino-3-nitropiridin-4-iloxi)-2-fluorofenilcarbamato de terc-butilo (3a) (6,20 g, 17,0 mmol) en EtOAc/EtOH (90/150 ml) y la mezcla de color negro se agit� en una

5 atmósfera de nitrógeno durante 5 horas y se filtr� sobre Celite. El filtrado de color pardo oscuro se concentr� a sequedad, se disolvió de nuevo en CH2Cl2 (20 ml) y se cargo sobre una columna de gel de sílice. Los productos se eluyeron con EtOAc y las fracciones que contenían el compuesto del título se evaporaron a sequedad. El aceite de color naranja se disolvió en CH2Cl2 y se a�adi� una cantidad equivalente de hexano. La solución se concentr� a sequedad para dar una espuma de color naranja.

10 Rendimiento: 4,30 g (76 %). 1H RMN (DMSO-d6), % (ppm), J (Hz): 1,45 (s, 9H, C(CH3)3), 4,47 (s, 2H, NH2), 5,61 (s, 2H, NH2), 6,09 (d, 1H, 3JHH = 5,5, PyrH), 6,76 (m, 1H, ArH), 6,87 (m, 1H, ArH), 7,28 (d, 1 H, 3JHH = 5,5, PyrH), 7,47 (m, 1 H, ArH), 8,82 (s, 1 H, NHBoc); 13C RMN (DMSO-d6), % (ppm), J (Hz): 28,0, 79,1, 104,4, 105,9 (d, JFH = 23,1), 113,4 (d, JFH = 3,1), 120,3, 121,5 (d, JFH = 12,2), 126,1, 135,7, 146,2, 150,5, 153,1 (d, JFH = 10,1), 153,3, 155,1 (d,

15 JFH = 248); 19F-RMN (DMSO-d6), % (ppm): -120,7; LC-MS (2,69 min): m/z calc. para C16H20FN4O3 [M+H+]: 335,2; observado: 335,3.

S�ntesis 4

20 4-(4-N-(terc-butoxicarbonil)-amino-3-fluorofenoxi)-2-aminopiridin-3-il-carbamato de etilo (5a)

Se disolvió 4-(4-N-(terc-butoxicarbonil)-amino-3-fluorofeniloxi)-2,3-diaminopiridina (4a) (2,5 g, 7,5 mmol) en THF seco (50 ml) en agitaci�n, se a�adi� piridina (1,2 ml, 15 mmol) y la solución se enfri� a 0 �C. Se a�adi� de una vez cloroformiato de etilo (0,77 ml, 8,0 mmol). Después de 30 minutos, la mezcla de reacción se dej� alcanzar la

25 temperatura ambiente y se agit� durante 24 horas más. El disolvente se evapor� al vacío y el residuo se repartió entre DCM y Na2CO3 acuoso saturado. La capa orgánica se lav� con H2O, se secó sobre MgSO4 y se evapor�. El residuo se purificó por cromatograf�a en columna (gradiente de eluyente de DCM a EtOAc) para proporcionar el compuesto del título en forma de una espuma.

30 Rendimiento: 1,13 g, 37 %. 1H RMN %: 1,17 (t, 3H, CH3,Et, J = 7,1 Hz), 1,45 (s, 9H, tBu), 4,02 (c, 2H, J = 7,1, CH2,Et), 5,89 (s, 2H, NH2,Py,2), 5,98 (d, 1H, J = 5,7, HPy), 6,83 (d, 1H, Harom), 6,96 (d, 1H, Harom), 7,55 (t, 1H, Harom), 7,73 (d, 1H, J = 5,7, HPy), 8,29 (s a, 1H, NHPy3), 9,39 (s, 1 H, NHBoc).

S�ntesis 5

35 4-(4-Amino-3-fluorofenoxi)-2-aminopiridin-3-il-carbamato de etilo (6a) Se disolvió 4-(4-N-(terc-butoxicarbonil)-amino-3-fluorofenoxi)-2-aminopiridin-3-il-carbamato de etilo (5a) (1,13 g, 2,8 mmol) en TFA (8 ml), se añadieron unas gotas de agua y la mezcla de reacción se agit� durante 2 horas a temperatura ambiente. El TFA se evapor�, el residuo se disolvió en agua (20 ml), se neutralizó con Na2CO3 acuoso

5 saturado y se extrajo con DCM (2 x 20 ml). La capa orgánica se secó y se evapor� para proporcionar el compuesto del título.

Rendimiento: 730 mg, 86 %. 1H RMN %: 1,17 (t, 3H, J = 7,1, CH3,Et), 4,05 (c, 2H, J = 7,0, CH2,Et), 5,04 (s, 2H, NH2,Ph), 5,71 (s, 2H, NH2,Py), 5,86 (d, 1H, J = 5,7, HPy), 6,64 (d, 1H, Harom), 6,73-6,82 (m, 2H, Harom), 7,68 (d, 1 H, J = 5,7, HPy), 10 8,23 (s a, 1H, NHPy3). LC-MS: m/z 307 ([M+H]+, 100).

S�ntesis 6

4-(4-amino-3-fluorofenoxi)-2-aminopiridin-3-il-metil-carbamato de etilo (7a)

15 Se disolvió 4-(4-amino-3-fluorofenoxi)-2-aminopiridin-3-il-carbamato de etilo (6a) (480 mg, 1,6 mmol) en THF seco (8 ml) y se enfri� a 0 �C. Se a�adi� hidruro sádico (al 60 % en aceite mineral, 80 mg, 2,0 mmol), y la mezcla de reacción se agit� durante 40 minutos a 0 �C. Se a�adi� yoduro de metilo (130 #l, 1,8 mmol) a 0 �C. El baño de hielo se retir�, y la mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 18 horas. El disolvente se evapor� y el residuo se 20 repartió entre DCM y agua destilada. La capa orgánica se secó y se evapor�, y el residuo se lav� con éter diet�lico para proporcionar el compuesto del título en forma de un sólido de color pardo.

Rendimiento: 322 mg, 63 %; 1H RMN %: 1,09 (t, 3H, J = 7,0, CH3,Et), 3,00 (s, 3H, CH3N), 3,90-4,10 (m, 2H, CH2,Et), 5,07 (s, 2H, NH2,Ph), 5,87 (d, 1H, HPy), 6,03 (s, 2H, NH2,Py), 6,63 (t, 1H, Harom), 6,77-6,81 (m, 2H, Harom), 7,75 (d, 1H, 25 HPy).

S�ntesis 7

7-(4-Amino-3-fluorofenoxi)-1-N-metil-1H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona (8a)

30 Se suspendió 4-(4-amino-3-fluorofenoxi)-2-aminopiridin-3-il-metil-carbamato de etilo (7a) (320 mg, 1,0 mmol) en una solución de EtONa en EtOH (4 ml), obtenida a partir de la disolución de sodio (480 mg, 21 mmol) en etanol (9 ml). La suspensión se calentó por irradiación de microondas durante 1 hora (100 �C, 100 W). La mezcla se enfri� a temperatura ambiente y el disolvente se evapor�. El residuo se disolvió en agua y se acidific� con AcOH a pH 4. El 35 precipitado formado se recuper� por filtración, para proporcionar el compuesto del título.

Rendimiento: 188 mg, 67 %. 1H RMN %: 3,46 (s, 3H, CH3N), 5,11 (s, 2H, NH2), 6,35 (d, 1H, J = 5,9, HPy), 6,77-6,82 (m, 2H, Harom,), 6,99 (d, 1H, Harom), 7,76 (d, 1H, J = 6,0, HPy), 11,54 (s, 1 H, NHPy).

S�ntesis 8

1-(3-Terc-butil-1-fenil-1H-pirazol-5-il)-3-(2-fluoro-4-(1-N-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7iloxi)fenil)urea (AA-01)

10 Se disolvió 3-terc-butil-1-fenil-1H-pirazol-5-amina (550 mg, 1,8 mmol) en CH2Cl2 (25 ml) y se a�adi� un volumen equivalente de NaHCO3 saturado (ac.). La mezcla bifásica se agit� y se enfri� a 0 �C con un baño de hielo/agua. Después de 10 minutos, se añadieron 2 equiv. de una solución 1,9 M de fosgeno en tolueno. La mezcla se agit� vigorosamente durante 10 minutos, la capa orgánica se aisl�, se lav� con H2O, se secó (MgSO4) y se concentr� para

15 dar aproximadamente 5 ml. Esta solución se a�adi� a una solución de la 7-(4-amino-3-fluorofenoxi)-1-N-metil-1Himidazo[4,5-b)]piridin-2(3H)-ona (8a) (200 mg, 1,4 mmol) en THF. La solución se agit� durante 15 horas a temperatura ambiente, los disolventes se evaporaron y el residuo sólido se lav� con Et2O y CH2Cl2 para proporcionar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco.

20 Rendimiento: 200 mg, 53 %. 1H RMN, %: 1,28 (s, 9H, terc-Bu), 3,42 (s, 3H, CH3), 6,39 (s, 1H, HPyz,4), 6,49 (d, 1H, J = 5,9, HPy,5), 6,99 (dd, 1H, J = 1,6, 9,0, Harom), 7,21 (dd, 1H, J = 11,9, 2,7, Harom), 7,40-7,45 (m, 1H, Harom), 7,50-7,58 (m, 4H, Harom), 7,81 (d, 1H, J = 5,9, HPy,6), 8,10 (t, 1H, J = 9,1, Harom), 8,80 (s, 1H, NHurea), 8,93 (s, 1H, NHurea), 11,63 (s a, 1H, NHPy,2). LC-MS: m/z 516 ([M]+, 100). HRMS (EI): m/z calc. para C27H27N7O3 ([M+H]+): 516,2154; observado: 516,2152.

25 Síntesis 9

1-(3-Terc-butil-1-p-tolil-1H-pirazol-5-il)-3-(2-fluoro-4-(1-N-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7iloxi)fenil)urea (AA-02)

30 El compuesto del título se prepar� a partir de 3-terc-butil-1-p-tolil-1H-pirazol-5-amina (458 mg, 2 mmol) y 7-(4-amino3-fluorofenoxi)-1-N-metil-1H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona (8a) (110 mg, 0,4 mmol) mediante el mismo

35 procedimiento que se ha descrito para (AA-01), en forma de un sólido de color blanquecino.

Rendimiento: 150 mg, 71 %. 1H RMN, %: 1,27 (s, 9H, terc-Bu), 2,38 (s, 3H, Ph-CH3), 3,42 (s, 3H, N-CH3), 6,37 (s, 1 H, HPyz,4), 6,49 (d, 1H, J = 5,9, HPy,5), 6,96 (dd, 1H, Harom), 7,20 (d, 1H, Harom), 7,34 (d, 2H, J = 8,3, Harom), 7,39 (d, 2H, J = 8,4, Harom), 7,81 (d, 1 H, J = 5,9, HPy,6), 8,11 (t, 1H, Harom), 8,74 (s, 1H, NHurea), 8,92 (s, 1H, NHurea), 11,61 (s a,

40 1H, NHPy,2). LC-MS: m/z 530 ([M+H]+, 100).

S�ntesis 10

1-(3-Terc-butil-1-(4-clorofenil)-1H-pirazol-5-il)-3-(2-fluoro-4-(1-N-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7iloxi)fenil)urea (AA-03)

El compuesto del título se prepar� a partir de 3-terc-butil-1-(4-clorofenil)-1H-pirazol-5-amina (375 mg, 1,5 mmol) y 7(4-amino-3-fluorofenoxi)-1-N-metil-1H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona (8a) (150 mg, 0,55 mmol) mediante el mismo 10 procedimiento que se ha descrito para (AA-01 ), en forma de un sólido de color blanquecino.

Rendimiento: 190 mg, 63 %. 1H RMN, %: 1,28 (s, 9H, terc-Bu), 3,42 (s, 3H, CH3), 6,39 (s, 1H, HPya,4), 6,49 (d, 1H, J = 5,9, HPy,5), 6,96 (dd, 1H, 9,0, Harom),7,21 (d, 1H, Harom), 7,57 (d, 2H, J = 9,0, Harom), 7,60 (d, 2H, J = 8,9, Harom), 7,81 (d, 1H, J = 5,9, HPy,6), 8,08 (t, 1H, Harom), 8,80 (s, 1 H, NHurea), 8,89 (s, 1 H, NHurea), 11,63 (s a, 1H, NHPy,2). LC-MS:

15 m/z 549 ([M]+, 100).

S�ntesis 11

�cido 3-terc-butil-1-(3-fluorofenil)-1H-pirazol-5-carbox�lico 20

En un matraz de fondo redondo (secado en una estufa) se suspendieron ácido (3-fluorofenil)bor�nico (224 mg, 1,6 mmol), pirazol-5-carboxilato de etil-3-t-butilo (320 mg, 1,6 mmol), acetato de cobre (355 mg, 1,9 mmol) y piridina

25 seca (158 #l, 1,9 mmol) en agitaci�n vigorosa y una atmósfera de argón en 10 ml de DMF seca. A la mezcla de reacción, se le añadieron 300 mg de un tamiz molecular de 4 � y la suspensión se agit� durante 20 horas a temperatura ambiente. La suspensión se diluyó con 20 ml de AcOEt, se lav� con agua (2 x 20 ml), después con 20 ml de una solución conc. de NaHCO3 y 20 ml de salmuera, se secó (MgSO4) y se evapor� al vacío. Se obtuvo un aceite espeso (520 mg) que se us� en la siguiente etapa sin purificación.

30 El aceite se disolvió en 10 ml de EtOH y se añadieron 3 ml de una solución de NaOH (2 M) en agitaci�n, y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 30 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se ajust� a pH 4 (con AcOH) y se extrajo con 20 ml de AcOEt. La capa orgánica se lav� con agua (2 x 20 ml), se secó y se evapor� al vacío. Se obtuvo un sólido (457 mg). El sólido se purificó en Biotage usando 3:1 de

35 ciclohexano:AcOEt para proporcionar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco.

Rendimiento: 166 mg (40 %). 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6): % 1,30 (s, 9H), 6,95 (s, 1H, Hpyr), 8,59 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 7,25-7,32 (m, 1H, Harom), 7,35 (d, 1H, J = 9,9 Hz, Harom), 7,47-7,52 (m, 1H, Harom), 13,22 (s, 1H, H�cido). HRMS: (M+H)+ calc. para C14H15FN2O2, 262,1118, observado: 262,1117.

40 Síntesis 12

1-(3-Terc-butil-1-(3-fluorofenil)-1H-pirazol-5-il)-3-(2-fluoro-4-(1-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7iloxi)fenil)urea (AA-04)

Se disolvió ácido 3-terc-butil-1-(3-fluorofenil)-1H-pirazol-5-carbox�lico (393 mg, 1,5 mmol) en DMF seca (8 ml) y se a�adi� trietilamina (209 #l, 1,5 mmol). La solución se enfri� a 0 �C, y se a�adi� difenilfosforil azida (323 #l, 1,5

5 mmol). La mezcla de reacción se agit� durante 30 minutos a 0 �C seguido de 1 hora a temperatura ambiente. Se a�adi� 7-(4-amino-3-fluorofenoxi)-1-N-metil-1H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona (8a) (140 mg, 0,5 mmol), y la mezcla de reacción se calentó a 110 �C durante 1 hora. La solución se enfri�, se diluyó con AcOEt (100 ml) y se extrajo con agua y salmuera. La capa orgánica se secó y se evapor�, y el residuo se recogió en DCM. El sólido restante se recuper� por filtración para proporcionar el compuesto del título.

10 Rendimiento: 25 mg, 9 %. 1H RMN, %: 1,28 (s, 9H, terc-Bu), 3,41 (s, 3H, CH3), 6,40 (s, 1H, HPyz,4), 6,49 (d, 1H, J = 6,1, Hpy,5), 6,96-7,02 (m, 1H, Harom), 7,19-7,26 (m, 2H, Harom), 7,36-7,44 (m, 2H, Harom), 7,58 (t, 1H, Harom), 7,81 (d, 1H, J = 5,9, HPy,6), 8,06 (t, 1H, J = 9,1, Harom), 8,83 (s, 1H, NHurea), 8,92 (s, 1H, NHurea), 11,64 (s a, 1H, NHPy,2). LC-MS: m/z 533 ([M]+, 100).

15 Síntesis 13

4-(2-Amino-3-nitropiridin-4-il-oxi)naftalen-1-il-carbamato de terc-butilo (3b)

20 El compuesto del título se prepar� a partir de 4-hidroxinaftalen-1-ilcarbamato de terc-butilo (Regan, J. y col., J. Med. Chem., 2002, Vol. 45, N� 14, pág. 2994) (3,9 g, 15 mmol) mediante el mismo procedimiento que se ha descrito para el compuesto (3a).

Rendimiento: 5,4 g, 90 %, tras la recristalizaci�n en diclorometano. 1H RMN (DMSO-d6), % (ppm), J (Hz): 1,52 (s, 9H,

25 C(CH3)3), 5,80 (d, 1H, J = 5,7, PyrH), 7,26 (s, 2H, NH2), 7,38 (d, 1H, J = 8,3, ArH, Naph), 7,58-7,69 (m, 3H, ArH, Naph), 7,86-7,89 (m, 1H, ArH, Naph), 7,93 (d, 1H, J = 5,5, PyrH), 8,14-8,17 (m, 1H, ArH, Naph), 9,36 (s, 1 H, NHBoc).

S�ntesis 14

30 4-(2,3-Diaminopiridin-4-il-oxi)naftalen-1-il-carbamato de terc-butilo (4b)

El compuesto del título se prepar� a partir de 4-(2-amino-3-nitropiridin-4-il-oxi)naftalen-1-il-carbamato de terc-butilo (3b) (0,50 g, 1,26 mmol) mediante el mismo procedimiento que se ha descrito para el compuesto (4a) en forma de 5 un sólido de color pardo.

Rendimiento: 0,38 g (82 %). 1H RMN (DMSO-d6), % (ppm), J (Hz): 1,55 (s, 9H, C(CH3)3), 4,63 (s, 2H, NH2), 5,66 (s, 2H, NH2), 5,92 (d, 1H, J = 5,6, PyrH), 7,05 (d, 1H, J = 8,3, ArH,Naph), 7,24 (d, 1H, J = 5,5, PyrH), 7,54 (d, 1H, J = 8,3, ArH, Naph), 7,60-7,65 (m, 2H, ArH, Naph), 8,07-8,12 (m, 2H, ArH, Naph), 9,22 (s, 1H, NHBoc).

10 Síntesis 15

4-(4-N-Boc-aminonaftalen-1-il-oxi)-3-N-aminocarbamoiletil-2-amino-piridina (5b)

Se disolvieron 4-(4-N-Boc-aminonaftalen-1-il-oxi)-2,3-diaminopiridina (4b) (500 mg, 1,4 mmol) y la piridina (222 #l, 2,7 mmol) en THF seco (8 ml) en agitaci�n vigorosa a 0 �C. A esta solución se le a�adi� de una vez el cloroformiato de etilo (136 ml, 1,5 mmol). Se dej� que la mezcla de reacción alcanzara la temperatura ambiente y se agit� durante

20 10 horas más. El disolvente se evapor� al vacío y el residuo se repartió entre EtOAc y una solución de Na2CO3. La capa orgánica se lav� (20 ml de salmuera), se secó (MgSO4) y se evapor� para proporcionar un residuo sólido. Después de la purificación por LC (columna Isolute, Flash Si II, 50 g/170 ml; eluyente: EtOAc), se obtuvo el compuesto deseado.

25 Rendimiento: 475 mg, 75 %. 1H RMN %: 1,14-1,21 (m, 3H, CH3), 1,50 (s, 9H, tBu), 4,04-4,10 (m, 2H, CH2), 5,66 (d, 1 H, J = 5,7, HPy), 5,84 (s, 2H, NH2), 7,15 (d, 1H, J = 8,1, Harom), 7,49-7,60 (m, 3H, Harom), 7,62 (d, 1 H, J = 5,7, HPy), 7,98-8,04 (m, 1 H, Harom), 8,07 (d, 1H, J = 8,5, Harom), 8,40 (s, 1H, NHcarb), 9,22 (s, 1H, NHBoc) LC-MS: m/z 440 [(M + H)+, 100]. HRMS (EI): m/z calc. para C23H27N4O5 [(M + H)+]: 439,1981; observado 439,1979.

30 Síntesis 16

4-(4-Aminonaftalen-1-il-oxi)-3-N-aminocarbamoiletil-2-amino-piridina (6b)

Se disolvió 4-(4-N-Boc-aminonaftalen-1-il-oxi)-3-N-aminocarbamoiletil-2-aminopiridina (5b) (475 mg, 1,05 mmol) en 5

TFA seco (10 ml) en agitaci�n vigorosa a 0 �C. Se dej� que la solución alcanzara temperatura ambiente y se agit� durante 2 horas más. El TFA se evapor� al vacío y el residuo oleoso se repartió entre EtOAc y una solución de Na2CO3. La capa orgánica se lav� (20 ml de salmuera), se secó (MgSO4) y se evapor� para proporcionar un residuo sólido.

Rendimiento: 346 mg, 97 %. 1H RMN 8%: 1,19-1,26 (m, 3H, CH3), 4,07-4,13 (m, 2H, CH2), 5,57 (d, 1H, J = 5,7, HPy), 5,77 (s, 4H, 2 x NH2), 6,66 (d, 1H, J = 8,1, Harom), 6,97 (d, 1H, J = 8,1, Harom), 7,37-7,45 (m, 2H, Harom), 7,55 (d, 1H, J = 5,7, HPy), 7,76-7,86 (s a, 1 H, Harom), 8,09-8,12 (m, 1H, Harom), 8,36 (s, 1H, NHcarb). LC-MS: m/z 339 [(M+H)+, 100]. HRMS (EI): m/z calc. para C18H19N4O3 [(M+H)+, 100]: 339,1457; observado 339,1459.

S�ntesis 17

4-(4-Aminonaftalen-1-il-oxi)-3-N-metil-N-aminocarbamoiletil-2-amino-piridina (7b)

Se disolvió 4-(4-aminonaftalen-1-il-oxi)-3-N-aminocarbamoiletil-2-amino-piridina (6b) (350 mg, 1,04 mmol) en THF seco (8 ml) en agitaci�n vigorosa a 0 �C y argón. A esta solución se le a�adi� NaH (dispersi�n al 60 % en aceite mineral) (45 mg, 1,14 mmol). Después de 40 minutos, se a�adi� MeI (66 ml, 0,91 mmol) a 0 �C. Se dej� que la mezcla de reacción alcanzara la temperatura ambiente y se agit� durante 10 horas más. El disolvente se evapor� al vacío y el residuo se recogió de nuevo en 20 ml de EtOAc. La solución se lav� con salmuera (2 x 20 ml), se secó y se evapor� a sequedad. El residuo se tritur� con Et2O y se filtr� para dar el compuesto del título en forma de un sólido.

Rendimiento: 238 mg, 65 %. 1H RMN %: 1,12-1,29 (m, 3H, CH3), 3,14 (s, 3H, CH3), 4,05-4,16 (m, 2H, CH2), 5,53 (d, 1H, J = 5,8, HPy), 5,75 (s, 2H, NH2), 6,01 (s, 2H, NH2), 6,66 (d, 1H, J = 8,1, Harom), 6,96 (d, 1H, J = 8,1, Harom), 7,377,43 (m, 2H, Harom), 7,57 (d, 1H, J = 5,8, HPy), 7,59-7,64 (m, 1H, Harom), 8,11-8,15 (m, 1H, Harom). LC-MS: m/z 353 ([M+H]+, 100). HRMS (EI): m/z calc. para C19H21N4O3 ([M+H]+): 353,1614; observado 353,1610.

S�ntesis 18

7-(4-Aminonaftalen-1-il-oxi)-1-N-metil-1H-imidazo[4,5-b]piridina-2(3H)-ona (8b)

Se suspendieron 230 mg (0,65 mmol) 4-(4-aminonaftalen-1-il-oxi)-3-N-metil-N-aminocarbamoiletil-2-aminopiridina (7b) en 5,0 ml de una solución 1,0 M de EtONa en EtOH. La suspensión se sometió a microondas (150 W, 100 �C) durante 45 minutos. Después de un periodo de refrigeración, la mezcla de reacción se evapor� a sequedad, se recogió en 20 ml H2O, el pH se ajust� a 4,5 (AcOH), precipitando el compuesto del título.

Rendimiento: 167 mg, 84 %. 1H RMN %: 3,61 (s, 3H, CH3), 5,79 (s, 2H, NH2), 6,10 (d, 1H, J = 5,9, HPy), 6,68 (d, 1H, J = 8,1, Harom), 7,10 (d, 1H, J = 8,1, Harom), 7,43-7,48 (m, 2H, Harom), 7,64 (d, 1H, J = 5,8, HPy), 7,74-7,81 (m, 1H, Harom), 8,12-8,17 (m, 1H, Harom), 11,57 (s, 1H, NHPy). LC-MS: m/z 307 ([M+H]+, 100). HRMS (EI): m/z calc. para C17H25N4O2 ([M+H]+): 307,1195; observado 307,1188.

S�ntesis 19

1-(3-terc-butil-1-fenil-1H-pirazol-5-il)-3-(4-(1-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-iloxi)naftalen-1-il)urea

(BB-01)

El compuesto del título se prepar� a partir de 3-terc-butil-1-fenil-1H-pirazol-5-amina (0,18 mmol) y 7-(4aminonaftalen-1-il-oxi)-1-N-metil-1H-imidazo[4,5-b]piridina-2(3H)-ona (8b) (50 mg, 0,16 mmol) mediante el mismo 5 procedimiento que se ha descrito para (AA-01), en forma de un sólido de color blanquecino.

Rendimiento: 87 mg, 98 %. 1H RMN, % 1,29 (s, 9H, terc-Bu), 3,53 (s, 3H, CH3), 6,29 (d, 1H, J = 5,9, HPy,5), 6,40 (s, 1H, Hpyr), 7,24 (d, 1H, J = 8,3, Harom), 7,43 (t, 1H, J = 7,0 Hz), 7,54-7,63 (m, 5H), 7,66 (t, 1H, J = 8,2, Harom), 7,74 (d, 1 H, J = 5,9, HPy,6), 7,86 (d, 2H, J = 8,3, Harom), 8,05-8,10 (m, 1H), 8,77 (s, 1 H, NHUrea), 9,07 (s, 1H, NHurea), 11,64 (s,

10 1H, NHPy,2). LC-MS: Fr = 8,25 min; m/z 548,2 (M+, 100). HRMS (EI): m/z calc. para C31H30N7O3 ([M+H]+): 548,2410; observado: 548,2404.

S�ntesis 20

15 1-(1-N-p-tolil-3-terc-butil-pirazol-5-il)-3-(4-(2-oxo-2,3-dihidro-1-N-metil-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-il-oxi)naftalen-1

il)urea (BB-02)

El compuesto del título se prepar� a partir de 3-terc-butil-1-p-tolil-1H-pirazol-5-amina (35 mg, 0,15 mmol) y 7-(4aminonaftalen-1-il-oxi)-1-N-metil-1H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona (8b) (40 mg, 0,13 mmol) mediante el mismo 20 procedimiento que se ha descrito para (AA-01), en forma de un sólido de color blanquecino.

Rendimiento: 52 mg, 71 %. 1H RMN, %: 1,28 (s, 9H, terc-Bu), 2,40 (s, 3H, CH3), 3,53 (s, 3H, CH3), 6,29 (d, 1H, J = 5,9, HPy,5), 6,39 (s, 1H, Hpyr), 7,24 (d, 1H, J = 8,4, Harom), 7,36 (d, 2H, J = 8,2, Harom), 7,45 (d, 2H, J = 8,2, Harom), 7,60 (t, 1H, J = 7,5, Harom), 7,67 (t, 1H, J = 7,6, Harom), 7,74 (d, 1H, J = 5,9, HPy,6), 7,87 (d, 1H, J = 8,3, Harom), 8,07 (d, 2H, J

25 = 8,3, Harom), 8,71 (s, 1H, NHurea). 9,06 (s, 1H, NHurea). 11,65 (s, 1 H, NHPy3). LC-MS: Fr = 5,23 min; m/z 562,2 ([M+H]+, 100). HRMS (EI): m/z calc. para C32H32N7O3 ([M+H]+): 562,2561; observado: 562,2566.

(Referencia) Síntesis 21

30 2-Fluoro-4-(2-(metilamino)-3-nitropiridin-4-iloxi)fenilcarbamato de terc-butilo Se disolvió 2-fluoro-4-hidroxifenilcarbamato de terc-butilo (3,25 g, 14,4 mmol) en DMSO (25 ml) y la solución se agit� en una atmósfera de argón durante 20 minutos. Se a�adi� en porciones hidruro sádico (al 60 % en aceite mineral, 580 mg, 14,4 mmol) y la solución de color oscura se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora. Se a�adi� de una vez 4-cloro-N-metil-3-nitropiridin-2-amina (2,7 g, 14,4 mmol) disuelta en DMSO (5 ml) y la solución de cloro rojo se

5 agit� a 50 �C durante 2 horas. La solución se enfri�, se vertió sobre hielo picado (200 g) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 ml). Las fases orgánicas se lavaron con salmuera, se secaron y se evaporaron para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo.

Rendimiento: 5,3 g, 90 %. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) %: 1,47 (s, 9H, terc-Bu) 2,93 (d, J = 4,5 Hz, CH3N), 6,08 (d,

10 J = 5,7 Hz, 1H, Hpy), 7,00 (m, 1H, Harom), 7,22 (m, 1H, Harom), 7,55 (c, J = 4,5 Hz, 1H, NHCH3), 7,66 (m, 1H, Harom), 8,14 (d, J = 5,7 Hz, 1H, 1H, Hpy), 9,04 (s a, 1H, NH). LC-MS: m/z 378,3 ([M+H]+, 100).

(Referencia) Síntesis 22

15 4-(3-Amino-2-(metilamino)piridin-4-iloxi)-2-fluorofenilcarbamato de terc-butilo

Se disolvió 2-fluoro-4-(2-(metilamino)-3-nitropiridin-4-iloxi)fenilcarbamato de terc-butilo (5,3 mg, 14 mmol) en etanol

20 absoluto (600 ml) y se hidrogen� en un cartucho de Pd al 10 %/C a través de un aparato H-Cube, para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo.

Rendimiento: 4,88 g (rendimiento cuantitativo). 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) %: 1,44 (s, 9H, terc-Bu), 2,85(d, 3H, J = 4,5 Hz, CH3N), 4,51 (s a, 2H, NH2), 5,94 (m, 1 H, CH3NH), 6,10 (d, 1H, J = 5,6 Hz, Hpy), 6,72 (m, 1 H, Harom), 6,85 (m,

25 1H, Harom), 7,37 (d, 1H, J = 5,6 Hz, Hpy), 7,44 (m, 1 H, Harom), 8,87 (s a, 1 H, NH). LC-MS: m/z 348,4 ([M+H]+, 100).

(Referencia) Síntesis 23

2-Fluoro-4-(3-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-iloxi)fenilcarbamato de terc-butilo

A una solución enfriada con hielo de 4-(3-amino-2-(metilamino)piridin-4-iloxi)-2-fluorofenilcarbamato de terc-butilo (4,9 g, 14 mmol) en THF (150 ml) y piridina (10 ml) en una atmósfera de argón, se a�adi� una solución de trifosgeno (4,45 g, 15 mmol) en THF (75 ml) durante 2 horas a través de un embudo de decantación. La solución se agit�

35 durante 2 horas a 0 �C seguido de 4 horas a temperatura ambiente, y después se calentó a reflujo durante una noche. Después de un periodo de refrigeración, la solución se filtr�, se evapor� y se sometió a cromatograf�a en un aparato Biotage (columna 25+M, eluyente 1/1 de DCM/EtOAc) para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco.

40 Rendimiento: 2,05 g, 40 %. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) %: 1,47 (s, 9H, terc-Bu), 3,32 (s, 3H, CH3N), 6,53 (d, 1H, J = 5,9 Hz, Hpy), 6,94 (m, 1H, Harom), 7,15 (m, 1H, Harom), 7,60 (m, 1H, Harom), 7,89 (d, 1H, J = 5,9 Hz, Hpy), 8,97 (s, 1 H, NH), 11,46 (s, 1H, NH). LC-MS: m/z 375,1 ([M+H)+, 100).

(Referencia) Síntesis 24

7-(4-Amino-3-fluorofenoxi)-3-metil-1H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona

Una solución de 2-fluoro-4-(3-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-iloxi)fenilcarbamato de terc-butilo (2,18 g, 5,8 mmol) en TBAF 1 M en THF (41 ml) se calentó a reflujo durante una noche en una atmósfera de argón.

5 La solución se enfri� y se evapor� y se a�adi� agua (20 ml), después de lo cual se form� un precipitado. El precipitado se filtr�, se lav� con agua y se secó para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanquecino.

Rendimiento: 1,37 g, 86 %. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6): % 3,29 (s, 3H, CH3N), 5,17 (s, 2H, NH2), 6,35 (d, 1H, J =

10 5,94 Hz, Hpy), 6,74-6,83 (m, 2H, Harom), 6,99 (m, 1H, Harom), 7,81 (d, 1H, J = 5,94 Hz, Hpy), 11,44 (s, 1H, NH). LC-MS: m/z 275,1 ([M+H]+, 100).

(Referencia) Síntesis 25

15 7-(4-amino-3-fluorofenoxi)-1,3-dimetil-1H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona

A una solución de 7-(4-amino-3-fluorofenoxi)-3-metil-1H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona (100 mg, 0,365 mmol) en THF (4 ml) a 0 �C en una atmósfera de argón se le a�adi� en una porción NaH (16,77 mg, 0,419 mmol). La solución resultante se agit� durante 20 minutos y se a�adi� yodometano (0,025 ml, 0,401 mmol). Después de 1 hora, se

20 a�adi� agua, y la solución se evapor� y se extrajo con DCM (3 x 20 ml) para dar el compuesto del título.

Rendimiento: 80 mg, 0,278 mmol, 76 %. 1H RMN (CDCl3), %: 3,51 (s, 3H, Me), 3,66 (s, 3H, Me), 6,40 (d, 1H, J = 6,0, Harom,Py), 6,74 (ddd, 1H, J = 8,6, 2,5, 1,0, Harom,FPh), 6,83 (m, 2H, Harom,FPh), 7,87 (d, 1H, J = 6,0, Harom,Py). LC-MS: Fr = 2,60 min; m/z 289,1 ([M+H]+, 90).

25 (Referencia) Síntesis 26

1-(1-N-p-tolil-3-terc-butil-pirazol-5-il)-3-(4-(2-oxo-2,3-dihidro-1-N-metil-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-il-oxi)fenil)urea (XX02)

30 El compuesto del título se prepar� usando 3-terc-butil-1-p-tolil-1H-pirazol-5-amina (43,7 mg, 0,19 mmol) y 7-(4aminofeniloxi)-1-N-metil-1H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona (Niculescu-Duvaz, D. y col., J. Med. Chem., 2009, Vol.

52, N� 8, pág. 2255) (40 mg, 0,16 mmol) mediante el mismo procedimiento que se ha descrito para (AA-01), en forma de un sólido de color blanco.

Rendimiento: 62 mg, 76 %. 1H RMN, %: 1,27 (s, 9H, terc-Bu), 2,37 (s, 3H, CH3), 3,44 (s, 3H, CH3), 6,35 (d, 1H, J =

5 5,9, HPy,5), 6,39 (s, 1H, Hpyr), 7,11 (d, 2H, J = 9,0, Harom), 7,33 (d, 2H, J = 8,3, Harom), 7,39 (d, 2H, J = 8,3, Harom), 7,47 (d, 2H, J = 9,0, Harom), 7,78 (d, 1H, J = 5,9, HPy,6), 8,32 (s, 1H, NHurea), 9,08 (s, 1H, NHurea), 11,59 (s, 1H, NHPy3). LC-MS: Fr = 5,14 min; m/z 511 ([M+H]+, 100). HRMS (EI): m/z calc. para C28H30N7O3 ([M+H]+): 512,2405; observado: 512,2405.

10 (Referencia) Síntesis 27

1-(3-Terc-butil-1-fenil-1H-pirazol-5-il)-3-(4-(1,3-dimetil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-iloxi)-2

fluorofenil)urea (XX-03)

15 El compuesto del título se prepar� a partir de 3-terc-butil-1-fenil-1H-pirazol-5-amina (130 mg, 0,60 mmol) y 7-(4amino-3-fluorofenoxi)-1,3-dimetil-1H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona (100 mg, 0,35 mmol) mediante el mismo procedimiento que se ha descrito para (AA-01 ), en forma de un polvo de color amarillo.

Rendimiento: 15 mg, 8 %. 1H RMN (CDCl3), %: 1,39 (s, 9H, terc-Bu), 3,48 (s, 3H, Me), 3,59 (s, 3H, Me), 6,47 (d, 1H, J

20 = 5,9, Harom,Py), 6,49 (s, 1H, HPyz,4), 6,85 (dd, 1H, J = 11,1, 2,5, Harom,FPh), 6,89 (d, 1H, J = 9,0, Harom,FPh), 7,31 (t, 1H, J = 7,7, Harom,Ph), 7,42 (t, 2H, J = 7,7, Harom,Ph), 7,50 (d, 2H, J = 7,9, Harom,Ph), 7,92 (d, 1H, J = 5,9, Harom,Py), 8,15 (t, 1H, J = 8,9, Harom,FPh). LC-MS: Fr = 2,78 min; m/z 530 ([M+H]+, 90). HRMS (EI): m/z calc. para C28H29FN7O3 ([M+H]+): 530,2310; observado: 530,2326.

25 (Referencia) Síntesis 28

1-(5-Terc-butil-2-fenil-2H-pirazol-3-il)-3-[4-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-iloxi)-fenil]-urea (XX-01)

30 El compuesto del título se obtuvo usando procedimientos conocidos, como se muestra, por ejemplo, en la Síntesis 61 en Niculescu-Duvaz y col., 2006.

(Referencia) Síntesis 29

35 1-[5-terc-Butil-2-(4-fluoro-fenil)-2H-pirazol-3-il]-3-[4-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]piridin-7-iloxi)-fenil]-urea (XX04) El compuesto del título se obtuvo usando procedimientos conocidos, como se muestra, por ejemplo, en la Síntesis 79 en Niculescu-Duvaz y col., 2006.

5 Métodos biológicos

M�todos biológicos -Ensayo A -Ensayo DELFIA quinasa

Los compuestos se ensayaron por un ensayo quinasa realizado de acuerdo con el siguiente protocolo. 10 Se prepararon los siguientes reactivos:

Tamp�n quinasa DELFIA (DKB):

Tabla 2

Reactivo

Concentración de reserva Volumen por ml (#l) Volumen por placa de 10 ml (#l)

MOPS 20 mM pH 7,2

0,2 M 100 1000

EGTA 0,5 M pH 8,0

0,5 M 10 100

MgCl2 10 mM

1M 10 100

∀-mercaptoetanol al 0,1 %

- 1 10

∀-glicerofosfato 25 mM

0,5 M 50 500

Agua

100 % 829 8290

MOPS = ácido 3-[N-morfolino] propanosulf�nico (Sigma M3183). EGTA = ácido etilenglicol bis(2-aminoetileter)-N,N,N’,N’-tetraac�tico (Sigma E3889).

DKB1 (DKB con proteína B-RAF y MEK):

Combinar 4950 #l deDKB y 50 #l de 2,5 mg/ml de reserva GST-MEK (para proporcionar 1 mg de MEK por 40 #l). Después añadir 22,5 #l de B-RAF para dar -0,2 #l de B-RAF por 40 #l.

20 DKB2 (DKB con proteína MEK):

Combinar 4950 #l de DKB y 50 #l de 2,5 mg/ml de reserva GST-MEK (para proporcionar 1 mg de MEK por 40 ml). Usar 500 #l de esto para el vector apagado (BO, Blow Out) y control vector vacío (VV).

25 ATP:

Reserva 100 mM, diluir a 500 #M para dar 100 #M de concentración final en el ensayo.

30 Inhibidores (Compuestos de ensayo):

Reserva 100 mM diluir a 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01, 0,003, 0,001, 0,0003, y 0,0001 mM en DMSO en placa farmacol�gica, obteniéndose una concentración de 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01, 0,003, y 0,001 #Men el ensayo.

Anticuerpo primario:

Fosfo-MEK1/2 CST N� 9121S diluido 1:1000 en tampón de ensayo (AB, Assay Buffer) DELFIA Preincubar el anticuerpo en el AB durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de su uso.

Anticuerpo secundario:

Anticuerpo secundario de conejo marcado con europio Perkin Elmer N� AD0105 diluido 1:1000 en tampón de ensayo (AB) DELFIA. Preincubar el anticuerpo en el AB durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de su uso. (Los anticuerpos primarios y secundarios se incubaron juntos).

Tween:

Tween 20 al 0,1 % en agua.

Tamp�n de ensayo:

Tamp�n de ensayo DELFIA Perkin Elmer N� 4002-0010.

Soluci�n de potenciación:

Soluci�n de potenciación DELFIA Perkin Elmer N� 4001-0010.

Placas de ensayo:

Placa negra de 96 pocillos revestida con glutati�n Perbio N� 15340. Procedimiento:

1.

Prebloquear los pocillos con leche al 5 % en TBS durante 1 hora.

2.

Lavar los pocillos 3 x con TBS 200 #l

3.

Poner en la placa 40 #l de DKB1 para todos los inhibidores (compuestos de ensayo), control DMSO, y opcionalmente otros compuestos control.

4.

Poner en la placa 40 #l de DKB2 para pocillos BO y VV.

5.

Añadir inhibidores (compuestos de ensayo) a 0,5 #l por pocillo de acuerdo con la distribución de placa deseada.

6.

A�adir 0,5 #l de DMSO a los pocillos control con vehículo.

7.

A�adir 2 #l de B-RAF a pocillos BO y VV.

8.

Preincubar con inhibidores (compuestos de ensayo) durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitaci�n.

9.

A�adir 10 #l de 500 #M de reserva de ATP, en DKB, para dar una concentración de ensayo de 100 #M.

10.

Sellar las placas con TopSeal e incubar a temperatura ambiente con agitaci�n durante 45 minutos.

11.

Lavar las placas 3 x con 200 #l de Tween 20 al 0,1 %/agua para finalizar la reacción.

12.

A�adir 50 #l por pocillo de mezcla de anticuerpo e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitaci�n.

13.

Lavar las placas 3 x con 200 #l de Tween 20 al 0,1 %/agua.

14.

A�adir 100 #l de solución de potenciación DELFIA por pocillo, cubrir en papel de aluminio, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitaci�n.

15.

Leer en un lector Victor usando un protocolo Europio.

Los valores del blanco (Vector Vacío) se restan de todos los valores. Los controles de DMSO se establecen como actividad al 100 % y los puntos de ensayo (la respuesta) se calculan como un porcentaje del control de DMSO. Los datos se representan usando el programa inform�tico Graphpad Prism y se calcula una línea de regresión no lineal usando una ecuación de respuesta a dosis sigmoidal de pendiente variable:

Y = Inferior + [Superior -Inferior ] / [ 1 + 10^((LogCE50 -X) * Pendiente de ladera) ]

en la que X es el logaritmo de concentración e Y es la respuesta. La IC50 (Concentración Inhibidora media) generada por este procedimiento es la concentración del fármaco que produce un valor de fluorescencia de control en porcentaje intermedio entre la saturación y el nivel de efecto cero. Normalmente se realizan tres ensayos independientes y se indica la IC50 media.

M�todos biológicos -Ensayo B-Ensayo fosfo-ERK basado en células

Los compuestos se ensayaron usando un ensayo basado en células que se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo.

D�a 0:

Poner en la placa 16.000 células WM266.4 BRAF mutantes /pocillo en medio 99 #l en una placa de 96 pocillos.

D�a 1:

1.

A�adir 1 #l de inhibidor (compuesto de ensayo) a las células (total 1 #l de solución).

2.

Incubar las células con el compuesto de ensayo durante 6 horas a 37 �C.

3.

Aspirar la solución de todos los pocillos.

4.

Fijar las células con 100 #l de formaldeh�do al 4 %/Tritón X-100 al 0,25 % PBS por pocillo.

5.

Incubar la placa durante 1 hora a 4 �C.

6.

Aspirar la solución fijadora y añadir 300 #l de TBS por pocillo.

7.

Dejar la placa durante una noche a 4 �C.

D�a 2:

1.

Lavar la placa 2 x con 200 #l de PBS por pocillo.

2.

Bloquear con 100 #l de leche deshidratada al 5 % en TBS.

3.

Incubar la placa durante 20 minutos a 37 �C.

4.

Lavar la placa 2 x con tween al 0,1 %/H2O.

5.

A�adir a cada pocillo 50 #l de 3 #g/ml de anticuerpo primario pERK (Sigma M8159), diluido en leche en polvo al 5 %/TBS.

6.

Incubar la placa durante 2 horas a 37 �C.

7.

Lavar la placa 3 x con tween al 0,1 %/H2O.

8.

A�adir a cada pocillo 50 #l de 0,45 #g/ml de anticuerpo secundario anti-ratón marcado con Europio (Perkin Elmer).

9.

Incubar la placa durante 1 hora a 37 �C.

10.

Lavar la placa 3 x con tween al 0,1 %/H2O.

11.

A�adir a cada pocillo 100 #l de solución potenciadora (Perkin Elmer).

12.

Dejar la placa durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente antes de agitarla cuidadosamente.

13.

Leer la Fluorescencia Resuelta en Tiempo del Europio en un lector Victor 2.

14.

Lavar la placa 2 x con tween al 0,1 %/H2O.

15.

Medir la concentración de proteína con BCA (Sigma) añadiendo 200 #l de solución por pocillo.

16.

Incubar la placa durante 30 minutos a 37 �C.

17.

Leer los niveles de absorbancia a 570 nm en un lector de placa.

Obs�rvese que los recuentos del Europio se normalizan para niveles de proteína dividiendo los recuentos entre la absorbancia.

Los valores para el blanco (sin células) se restan de todos los valores. Los controles con DMSO se establecen como actividad al 100 % y los puntos de ensayo (la respuesta) se calculan como un porcentaje del control de DMSO. Los datos se representan usando un programa inform�tico Graphpad Prism y se calcula una línea de regresión no lineal usando una ecuación de respuesta a dosis sigmoidal de pendiente variable:

Y = Inferior + [Superior -Inferior ] / [ 1 + 10^((LogCE50 -X) * Pendiente de ladera) ]

en la que X es el logaritmo de concentración e Y es la respuesta. La IC50 generada por este procedimiento es la concentración del fármaco que produce un valor de fluorescencia de control en porcentaje intermedio entre la saturación y el nivel de efecto cero. Normalmente se realizan tres ensayos independientes y se indica la IC50 media.

M�todos biológicos -Ensayo C -ensayo de proliferaci�n de células SRB (SRB GI50)

Se cultivaron líneas celulares (por ejemplo, las líneas celulares de melanoma WM266.4 y A375M; la línea celular de carcinoma colorrectal SW620) rutinariamente en DMEM o RPMI1640 complementado con suero bovino fetal al 10 % a 37 �C en una atmósfera saturada con agua con CO2 al 10 %. Los cultivos se mantuvieron en fase de crecimiento exponencial subcultivando antes de que hubiesen llegado a confluencia (intervalos de 3-5 días). Se prepararon suspensiones de células sencillas recogiendo un matraz de cultivo de tejido de 80 cm2 con 5 ml de EDTA tripsina comercial. Después de 5 minutos, las células separadas se mezclaron con 5 ml de medio de cultivo totalmente complementado y se sedimentaron por centrifugaci�n (1000 rpm durante 7 minutos). Después de aspirar el sobrenadante, el sedimento celular se volvió a suspender en 10 ml de medio reciente y las células se disgregaron completamente extrayendo el volumen completo hacia arriba y hacia abajo 5 veces a través de una aguja de calibre

19. La concentración de las células se determin� usando un hemocit�metro (dilución 1/10). Se prepar� un volumen adecuado para proporcionar al menos un exceso de 2 veces para el número de ensayos a realizar, normalmente 100-200 ml, diluyendo la suspensión celular a 10.000-40.000/ml, y se dispensaron 100 #l/pocillo en placas de 96 pocillos usando una bomba perist�ltica programable de 8 canales, proporcionando 1000-4000 células/pocillo, dejando blanco en la columna 12. Las placas volvieron a llevarse a la incubadora durante 24 horas para permitir que las células volviesen a unirse.

Los compuestos a ensayar se prepararon a 10 mM en DMSO. Se diluyeron alícuotas (24 #l) en 1,2 ml de medio de cultivo proporcionando 200 #M y 10 diluciones en serie de 3 x realizadas transfiriendo 80 #l a 160 #l. A los pocillos se añadieron alícuotas (100 #l) de cada dilución, usando una pipeta de 8 canales, realizando as� una dilución final adicional 2 x y proporcionando dosis que variaban de 100 #M a 0,005 #M. La columna 11 solo recibió medio de cultivo plano. Cada compuesto se ensay� por cuadriplicado, siendo cada copia el promedio de cuatro pocillos.

Despu�s de 5 días de crecimiento adicionales, las placas se vaciaron y las células se fijaron en ácido tricloroac�tico al 10 % durante 30 minutos a 4 �C. Después de aclararon cuidadosamente con agua corriente, las placas se secaron y se tiñeron añadiendo 50 #l de una solución de sulforrodamina-B al 0,1 % en ácido acético al 1 %, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se ech� el colorante y las placas se aclararon cuidadosamente con un flujo de ácido acético al 1 %, eliminando as� el colorante no unido y se secaron. El colorante unido se incorpor� a la solución añadiendo 100 #l de tampón Tris pH 8, seguido de 10 minutos en un agitador de placa (aproximadamente 500 rpm). En cada pocillo se determin� la absorbancia a 540 nm (que es proporcional al número de células presentes) usando un lector de placa.

Despu�s realizar el promedio de los valores blanco en la columna 12 esto se rest� de todos los valores y los resultados se expresaron como un porcentaje del valor no tratado (columna 11). Los 10 valores as� obtenidos (por cuadruplicado) se representaron frente al logaritmo de la concentración de fármaco y se analizaron por regresión no lineal con una ecuación logística de cuatro parámetros, estableciendo limitaciones si se sugieren por inspección. La GI50 generada por este procedimiento es la concentración del fármaco que produce una A540 de control en porcentaje intermedio medio entre la saturación y el nivel de efecto cero.

M�todos Biológicos -Estudios de Xenoinjerto

Se inocularon células de carcinoma colorrectal humano SW620 (RAS mutante, 7 x 107) o células de melanoma humano A375M (BRAF mutante, 107) por vía subcutánea en suspensión (0,2 ml) en el costado derecho de ratas atómicas Crl:CD1-Foxn1nu hembra. Los grupos se asignaron para el tratamiento después de asignación estratificada de volúmenes tumorales. El tratamiento con el compuesto de ensayo comenzó entre los días 11-14 después de la administración de las células. Por sonda, se administr� una suspensión (DMSO:agua, 1:19, v/v a 10 ml/kg). Los animales control recibieron una dosis similar de vehículo (DMSO: agua, 1:19, v/v). El tratamiento con el compuesto de ensayo continu� una vez al día durante 24 dosis.

Datos Biológicos -Datos de Ensayo

Los datos de diversos compuestos de la presente invención, as� como de diversos compuestos de comparación, se resumen en la siguiente tabla. Valores más bajos de IC50/GI50 indican mayor fuerza.

Tabla 3

Ensayo A

Ensayo B Ensayo C Ensayo C Ensayo C

BRAF

pERK SRB SRB SRB

-

WM266.4 WM266.4 A375M SW620

C�digo

IC50 (mM) IC50 (mM) GI50 (mM) GI50 (mM) GI50 (mM)

AA-01

0,27 0,26 0,052 0,138 0,167

Tabla 3

Ensayo A

Ensayo B Ensayo C Ensayo C Ensayo C

BRAF

pERK SRB SRB SRB

AA-02

0,197 0,020 0,057

AA-03

0,302 0,060 0,121

BB-01

0,25 0,019 0,008 0,052 1,6

BB-02

2,28 0,026 0,016 0,101 1,685

XX-01

0,094 0,62 0,39 1,13 0,84

XX-02

0,20 0,09 0,066 0,25 0,45

XX-03

1,09 0,12 0,033 0,247 6,83

XX-04

0,24 0,20 0,020 0,307 2,72

En el ensayo enzim�tico BRAF realizado in vitro (Ensayo A), los compuestos de la presente invención ( 0,2 -2,3 #M) y los compuestos de comparación (&0,1 -1,1 #M) tuvieron valores similares de IC50 BRAF.

5 En el ensayo basado en células pERK realizado in vitro (Ensayo B), los compuestos de la presente invención (-0,02 -0,26 #M) y los compuestos de comparación ( 0,1 -0,6 #M) tuvieron valores similares de IC50 pERK.

En el ensayo basado en células SRB realizado in vitro (Ensayo C), para las líneas celulares BRAF mutantes WM266.4 y A375M, los compuestos de la presente invención (WM266.4: & 0,01 -0,12 #M; A375M: &0,05 -0,14 #M)

10 y los compuestos de comparación (WM266.4: & 0,02 -0,4 #M; A375M: & 0,25 -1,1 #M) tuvieron valores similares de GI50. Cabe destacar que, BB-01 fue el más fuerte (con un valor de GI50 más bajo: WM266.4, 0,008 #M; A375M, 0,052 #M) y XX-01 fue el menos fuerte (con un valor de GI50 más alto: WM266.4, 0,39 #M; A375M, 1,13 #M).

En el ensayo basado en células SRB realizado in vitro (Ensayo C), para la línea celular RAS mutante SW620, los 15 compuestos de la presente invención (SW620: & 0,17 -1,6 #M) y los compuestos de comparación (SW620: -0,45 -7 #M) tuvieron valores de GI50similares.

Sin embargo, obsérvese, basándose en los datos de RAS mutante in vitro, cabría esperar que XX-01 y XX-02 tuviesen mejor eficacia terapéutica que BB-02, en el estudio de xenoinjerto de SW620 de RAS mutante in vivo.

20 De manera similar, basándose en los datos de RAS mutante in vitro, cabría esperar que XX-02 tuviese una eficacia terapéutica similar a la de AA-01, en el estudio de xenoinjerto de SW620 de RAS mutante in vivo.

Bas�ndose en los datos de RAS mutante in vitro, no cabría esperar que los compuestos reivindicados 25 (especialmente AA-01 y BB-02) fuesen sustancialmente más eficaces que los compuestos de comparación (XX-01, XX-02, XX-03, XX-04), en el estudio de xenoinjerto de SW620 de RAS mutante in vivo.

Datos Biológicos -Datos de selectividad de BRAF/RAS/tipo natural (Wild Type, wt)

30 Los datos de diversos compuestos de la presente invención, as� como de diversos compuestos de comparación se ilustran en las Figuras 4 a 10, como se ha descrito anteriormente. Los datos ilustran la selectividad, o ausencia de selectividad, de las líneas celulares BRAF mutante o RAS mutante.

La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas 35 celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 del compuesto AA-01. La serie de líneas celulares es

(a) un panel de líneas celulares BRAF mutantes (mutBRAF): WM266.4, A375M, UACC62; (b) un panel de líneas celulares RAS mutantes (mutRAS): SW620, HCT116, y WM1361; y (c) un panel de líneas celulares BRAF y RAS de tipo silvestre (wtBRAFT/RAS): SKMEL23, KM12, y BT474.

40 La Figura 5 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 del compuesto BB-01. La serie de líneas celulares es como se indica en la Figura 4.

La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas 45 celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 del compuesto BB-02. La serie de líneas celulares es como se indica en la Figura 4.

La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 para el compuesto de comparación XX-01. La serie de líneas celulares es como se indica en la Figura 4.

La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 para el compuesto de comparación XX-02. La serie de líneas celulares es como se indica en la Figura 4.

La Figura 9 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 para el compuesto de comparación XX-03. La serie de líneas celulares es como se indica en la Figura 4.

La Figura 10 es un gráfico de barras que muestra la proporción de la GI50 de cada una de una serie de líneas celulares con respecto a la GI50 de la línea celular WM266.4 para el compuesto de comparación XX-04. La serie de líneas celulares es como se indica en la Figura 4.

Bas�ndose en estos datos in vitro, no cabría esperar que los compuestos reivindicados (especialmente AA-01 y BB02) fuesen sustancialmente más eficaces que los compuestos de comparación (XX-01, XX-02, XX-03, XX-04), en el estudio de xenoinjerto de SW620 de RAS mutante in vivo.

Datos Biológicos -Datos de Xenoinjerto

Los datos de xenoinjerto de los diversos compuestos de la presente invención as� como de los diversos compuestos de comparación se ilustran en las Figuras 11-19.

La Figura 11 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular RAS mutante SW620, para el tratamiento con el compuesto AA-01 y para controles.

Los datos demuestran que el compuesto AA-01 reduce sustancialmente el volumen tumoral durante el periodo de tiempo del estudio (por ejemplo, un factor de aproximadamente 3), en comparación con el control, para esta línea celular de carcinoma colorrectal RAS mutante.

La Figura 12 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular RAS mutante SW620, para el tratamiento con el compuesto BB-02 y para controles.

Los datos demuestran que el compuesto BB-02 reduce sustancialmente el volumen tumoral durante el periodo de tiempo del estudio (por ejemplo, un factor de aproximadamente 1,5), en comparación con el control, para esta línea celular de carcinoma colorrectal RAS mutante.

La Figura 13 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular BRAF mutante A375, para el tratamiento con el compuesto AA-01 y para controles.

Los datos demuestran que el compuesto AA-01 reduce sustancialmente el volumen tumoral durante el periodo de tiempo del estudio (por ejemplo, un factor de aproximadamente 2,5), en comparación con el control, para esta línea celular de melanoma.

La Figura 14 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular BRAF mutante A375, para el tratamiento con el compuesto BB-02 y para controles.

Los datos demuestran que el compuesto BB-02 reduce sustancialmente el volumen tumoral sobre la escala en el tiempo del estudio (por ejemplo, un factor de aproximadamente 1,5), en comparación con el control, para esta línea celular de melanoma BRAF mutante.

La Figura 15 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular RAS mutante SW620, para el tratamiento con el compuesto de comparación XX-01 y para controles.

Los datos demuestran que el compuesto de comparación XX-01 tuvo un efecto relativamente pequeño, en comparación con el control, para esta línea celular de carcinoma colorrectal RAS mutante.

La Figura 16 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular RAS mutante SW620, para el tratamiento con el compuesto de comparación XX-02 y para controles.

Los datos demuestran que el compuesto de comparación XX-02 tuvo un efecto relativamente pequeño, en comparación con el control, para esta línea celular de carcinoma colorrectal RAS mutante.

La Figura 17 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular RAS mutante SW620, para el tratamiento con el compuesto de comparación XX-03 y para controles.

Los datos demuestran que el compuesto de comparación XX-03 tuvo un efecto relativamente pequeño, en 5 comparación con el control, para esta línea celular de carcinoma colorrectal RAS mutante.

La Figura 18 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular RAS mutante SW620, para el tratamiento con el compuesto de comparación XX-04 y para controles.

10 Los datos demuestran que el compuesto de comparación XX-04 tuvo un efecto relativamente pequeño, en comparación con el control, para esta línea celular de carcinoma colorrectal RAS mutante.

La Figura 19 es un gráfico de volumen tumoral relativo en función del tiempo (días) de xenoinjertos de ratón de la línea celular BRAF mutante A375, para el tratamiento con el compuesto de comparación XX-02 y para controles.

15 Los datos demuestran que el compuesto de comparación XX-02 es al menos hasta cierto grado eficaz, en comparación con el control, para esta línea celular de melanoma BRAF mutante.

Las proporciones de volumen tumoral (para tratamiento) con respecto a volumen tumoral (para control) (T/C) para

20 los xenoinjertos de SW620 de RAS mutante se muestran en la siguiente tabla. Una proporción T/C más baja indica una mayor eficacia. Mientras que todos los compuestos de comparación tienen proporciones T/C que indican poca o ninguna eficacia, los dos compuestos reivindicados AA-01 y BB-02 tienen proporciones T/C que demuestran eficacia estadísticamente significativa.

Tabla 4

C�digo

Proporción de: volumen Tumoral (Tratamiento) / Volumen Tumoral (Control) (xenoinjerto de SW620 RAS mutante)

AA-01

0,34

BB-02

0,66

XX-01

gt;1

XX-02

0,95

XX-03

0,97

XX-04

0,87

25 Los datos de los compuestos reivindicados demuestran que, los compuestos reivindicados no son solo eficaces como inhibidores de BRAF y contra tumores BRAF mutantes (por ejemplo, xenoinjertos de la línea celular de melanoma BRAF mutante A375M; Figura 13 y Figura 14), sino que, sorprendentemente y de manera inesperada, los compuestos reivindicados también son eficaces contra tumores RAS mutantes (por ejemplo, xenoinjertos de la línea

30 celular de carcinoma colorrectal RAS mutante SW620; Figuras 11 y 12). La actividad sorprendente e inesperada de los compuestos reivindicados contra tumores RAS mutantes no podría predecirse a partir de su actividad inhibidora BRAF conocida o esperada.

Los datos de los compuestos de comparación demuestran que, aunque los compuestos de comparación son hasta

35 cierto grado eficaces contra tumores BRAF mutantes (por ejemplo, xenoinjertos de la línea celular de melanoma BRAF mutante A375M; Figura 19), tienen efecto relativamente pequeño contra tumores RAS mutantes (por ejemplo, xenoinjertos de la línea celular de carcinoma colorrectal RAS mutante SW620; Figuras 15, 16, 17 y 18).

La descripción anterior ha descrito los principios, las realizaciones preferidas y los modos de funcionamiento de la

40 presente invención. Sin embargo, la invención no debe interpretarse como limitada a las realizaciones particulares indicadas. En cambio, las realizaciones anteriormente descritas deben considerarse como ilustrativas en lugar de limitativas.

Referencias

45 En el presente documento se citan diversas patentes y publicaciones para describir y analizar de un modo más completo la invención y el estado de la técnica a la cual pertenece la invención. A continuación se proporcionan todas las citas bibliográficas de estas referencias.

50 Bos, 1989, “ras oncogenes in human cancer: a review”, Cancer Res., Vol. 49, páginas 4682-4689. Downward, 2003, “Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy”, Nat. Rev. Cancer, Vol. 3, páginas 11-22.

Garnett et al., 2004, “Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene”, Cancer Cell, Vol. 6, páginas 313-319. Gray-Schopfer et al., 2007, “Melanoma biology and new targeted therapy”, Nature, Vol. 445, páginas 851-857. Niculescu-Duvaz et al., 2006, “Imidazo[4,5-b]pyridine-2-one and oxazolo[4,5-b]pyridine-2-one compounds and analoges thereof as therapeutic compounds”, publicación de solicitud de patente internacional número WO

5 2006/043090 A1 publicada el 27 de abril de 2006. Niculescu-Duvaz et al., 2007, “Imidazo[4,5-b]pyridine-2-one and oxazolo[4,5-b]pyridine-2-one compounds and analoges thereof as cancer therapeutic compounds”, publicación de solicitud de patente internacional número WO 2006/043090 A1 publicada el 8 de noviembre de 2007. Niculescu-Duvaz et al., 2009, “Aryl-quinolyl compounds and their use”, publicación de solicitud de patente

10 internacional número WO 2006/043090 A1 publicada el 29 de octubre de 2009. Solit et al., 2006, “BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition”, Nature, Vol. 439, páginas 358-362. Springer et al., 2009, “Pyrido[2,3-b]pyrazine-8-substituted compounds and their use”, publicación de solicitud de patente internacional número WO 2006/043090 A1 publicada el 25 de junio de 2009. Wellbrock et al., 2004, “The RAF proteins take centre stage”, Nature Reviews Molecular Cell Biology, Vol. 5,

15 páginas 875-885. Young et al., 2009, “Ras signaling and therapies”, Adv. Cancer Res., Vol. 102, páginas 1-17.

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto seleccionado entre los compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos:

   5 en la que -J-es independientemente:

   o

   y en la que -R es independientemente: -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -I; 10 y en la que -R se sitúa en posiciones meta-o para-en el anillo fenilo.
2. 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado entre compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos:

   15 en la que -RA es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -I; y en la que -RA se sitúa en posiciones meta-o para-en el anillo fenilo.

3. 3.

   Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, seleccionado entre compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos:

4. 4.

   Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, seleccionado entre compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos:

   20 en la que -RA es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -I.

   en la que -RA es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -I. 5
5. 5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado entre compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos:

   en la que -RB es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -I; 10 y en la que -RB se sitúa en posiciones meta-o para-en el anillo fenilo.
6. 6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, seleccionado entre compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos:

   15 en la que -RB es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -I.
7. 7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, seleccionado entre compuestos de la siguiente fórmula, y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables de los mismos:

   en la que -RB es independientemente -H, -Me, -F, -Cl, -Br o -I.
8. 8. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que -RA, si est� presente, y -RB, 5 si est� presente, son independientemente -H.
9. 9. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que -RA, si est� presente, y -RB, si est� presente, son independientemente -Me.

   10 10. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que -RA, si est� presente, y -RB, si est� presente, son independientemente -F.
10. 11. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que -RA, si est� presente, y -

    RB, si est� presente, son independientemente -Cl. 15
11. 12. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, seleccionado entre el siguiente compuesto y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables del mismo:

    20 13. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, seleccionado entre el siguiente compuesto y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables del mismo:
12. 14. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, seleccionado entre el siguiente compuesto y sales, hidratos y 25 solvatos farmac�uticamente aceptables del mismo:

13. 15.

    Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, seleccionado entre el siguiente compuesto y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables del mismo:

14. 16.

    Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, seleccionado entre el siguiente compuesto y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables del mismo:

15. 17.

    Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, seleccionado entre el siguiente compuesto y sales, hidratos y solvatos farmac�uticamente aceptables del mismo:

    15 18. Una composición que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, y un vehículo, diluyente o excipiente farmac�uticamente aceptables.

16. 19.

    Un método de preparación de una composición que comprende mezclar un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, y un vehículo, diluyente o excipiente farmac�uticamente aceptables.

17. 20.

    Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para su uso en un método de tratamiento por terapia en el organismo de un ser humano o de un animal.

18. 21.

    Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para su uso en un método de tratamiento del cáncer.

19. 22.

    Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para su uso en un método de tratamiento de cáncer RAS mutante.

20. 23.

    Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para su uso en un método de tratamiento de:

    c�ncer pancreático; cáncer tiroideo (por ejemplo, folicular; papilar indiferenciado); cáncer colorrectal; seminoma; síndrome mielodispl�sico (SMD); cáncer de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma pulmonar); cáncer de hígado; leucemia (por ejemplo leucemia miel�gena aguda (LMA)); melanoma; cáncer de vejiga; cáncer de ri��n, cáncer de mama; cáncer de ovario; cáncer de conducto biliar o glioma.

21. 24.

    Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para su uso en un método de tratamiento de:

    c�ncer pancreático RAS mutante; cáncer tiroideo RAS mutante (por ejemplo, folicular; papilar indiferenciado); cáncer colorrectal RAS mutante; seminoma RAS mutante; síndrome mielodispl�sico (SMD) RAS mutante; cáncer de pulmón RAS mutante (por ejemplo, adenocarcinoma pulmonar); cáncer de hígado RAS mutante; leucemia RAS mutante (por ejemplo leucemia miel�gena aguda (LMA)); melanoma RAS mutante; cáncer de vejiga RAS mutante; cáncer de ri��n RAS mutante, cáncer de mama RAS mutante; cáncer de ovario RAS mutante; cáncer de conducto biliar RAS mutante o glioma RAS mutante.

22. 25.

    Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

23. 26.

    Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer RAS mutante.

24. 27.

    Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de:

    c�ncer pancreático; cáncer tiroideo (por ejemplo, folicular; papilar indiferenciado); cáncer colorrectal; seminoma; síndrome mielodispl�sico (SMD); cáncer de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma pulmonar); cáncer de hígado; leucemia (por ejemplo leucemia miel�gena aguda (LMA)); melanoma; cáncer de vejiga; cáncer de ri��n, cáncer de mama; cáncer de ovario; cáncer de conducto biliar o glioma.

25. 28.

    Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de:

    c�ncer pancreático RAS mutante; cáncer tiroideo RAS mutante (por ejemplo, folicular; papilar indiferenciado); cáncer colorrectal RAS mutante; seminoma RAS mutante; síndrome mielodispl�sico (SMD) RAS mutante; cáncer de pulmón RAS mutante (por ejemplo, adenocarcinoma pulmonar); cáncer de hígado RAS mutante; leucemia RAS mutante (por ejemplo leucemia miel�gena aguda (LMA)); melanoma RAS mutante; cáncer de vejiga RAS mutante; cáncer de ri��n RAS mutante, cáncer de mama RAS mutante; cáncer de ovario RAS mutante; cáncer de conducto biliar RAS mutante o glioma RAS mutante.