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ES2456990T3 - Antagonistas basados en LNA dirigidos al receptor de andrógenos - Google Patents

Antagonistas basados en LNA dirigidos al receptor de andrógenos Download PDF

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ES2456990T3
ES2456990T3 ES08855697.2T ES08855697T ES2456990T3 ES 2456990 T3 ES2456990 T3 ES 2456990T3 ES 08855697 T ES08855697 T ES 08855697T ES 2456990 T3 ES2456990 T3 ES 2456990T3
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Abstract

Un oligómero que tiene una secuencia de nucleótidos contiguos de un total de 10 - 30 nucleótidos, en el que dicha secuencia de nucleótidos contiguos es al menos 80% homóloga al complemento inverso de una región correspondiente de un gen o ARNm del receptor de andrógenos de mamífero, en el que dicho oligómero comprende al menos una unidad de LNA, y en el que la secuencia de nucleótidos contiguos comprende al menos nucleótidos contiguos que son 100% idénticos a una correspondiente región de SEQ ID NO 94 o SEQ ID NO 58.

Description

Antagonistas basados en LNA dirigidos al receptor de andrógenos
5 Campo de la invención
La presente descripción proporciona compuestos, composiciones y métodos para modular la expresión del receptor de andrógenos. En particular, esta invención se refiere a compuestos oligómeros (oligómeros), que se dirigen al ARNm del receptor de andrógenos en una célula, que conducen a una expresión reducida del receptor de andrógenos. La reducción de la expresión del receptor de andrógenos es beneficiosa para una variedad de trastornos médicos, tales como el cáncer, en particular el cáncer de próstata o cáncer de mama.
Casos relacionados
15 Esta solicitud reivindica el beneficio de conformidad con 35 U.S.C. 119(e) de la solicitud provisional de EE.UU. de número de serie 60/990.125 presentada el 26 de noviembre de 2007.
Antecedentes
El receptor de andrógenos (AR) es un tipo de receptor nuclear que es activado por la unión de cualquiera de las hormonas androgénicas testosterona o dihidrotestosterona. La función principal del receptor de andrógenos es un factor de transcripción de unión al ADN que regula la expresión génica. Sin embargo, el receptor de andrógenos también tiene funcionales adicionales independientes de la unión al ADN. El receptor de andrógenos está muy estrechamente relacionado con el receptor de progesterona, y las progestinas en dosis más altas pueden bloquear
25 el receptor de andrógenos.
Aunque en seres humanos el gen del AR es una copia sencilla y se encuentra en el cromosoma X en la posición Xq11-12, el propio receptor existe en dos isoformas (A y B). AR-A es una proteína de 87 kDa que carece de los 187 primeros aminoácidos (truncado N-terminal). La isoforma AR-B es la versión de longitud completa de 110 kDa.
La unión del andrógeno al receptor de andrógenos induce un cambio conformacional en el receptor, dando como resultado una disociación de las proteínas de choque térmico, dimerización y transporte desde el citosol al núcleo celular donde el dímero del receptor de andrógenos se une a secuencias específicas de ADN, denominadas elementos de respuesta a hormonas. Dependiendo de la interacción con otras proteínas nucleares, la expresión de
35 los genes de control de AR, aumentan o disminuyen la transcripción de genes específicos, tales como el factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-1).
Los receptores de andrógenos también pueden tener actividades citoplasmáticas aunque con proteínas de transducción de señales en el citoplasma. La unión de andrógenos a receptores de andrógenos citoplasmáticos puede producir cambios rápidos en la función celular independientes de la transcripción génica, por ejemplo transporte de iones, así como tener influencia indirecta en la transcripción génica, por ejemplo mediando otras rutas de transducción de señales, influyendo así en la actividad de otros factores de transcripción.
Se ha indicado en varias enfermedades la expresión en exceso del receptor de andrógenos, o la expresión de genes
45 del receptor de andrógenos mutados, tales como el cáncer, incluyendo el cáncer de próstata y el cáncer de mama, así como otros trastornos tales como enfermedad relacionada con poliglutamato (Monks y col., PNAS 2 de noviembre 2007, publicado en línea), alopecia, hiperplasia prostática benigna, atrofia espinal y muscular y enfermedad de Kennedy.
El documento WO 97/11170 publica un método para tratar un paciente al que se ha diagnosticado que tiene hiperplasia prostática benigna o un cáncer de próstata, que comprende administrar un oligonucleótido de sentido contrario que hibrida selectivamente con el ARNm del receptor de andrógenos. Se describen 3 secuencia de oligonucleótido de sentido contrario de entre 27-29 nucleótidos.
55 Los documentos US 6.733.776 y EP 0692972 publican un método para tratar la alopecia androgénica aplicando liposomas que comprenden un ácido nucleico de sentido contrario que hibrida con un gen del receptor de andrógenos. No se proporcionan moléculas de sentido contrario con secuencias específicas y dirigidas al receptor de andrógenos.
El documento US 2005/0164970 publica un método para tratar el cáncer de próstata usando complejos de ARNip dirigidos al ARNm del receptor de andrógenos.
El documento WO 2005/027833 publica un método para tratar el cáncer de próstata que comprende administrar al paciente un morfolino-oligonucleótido de entre 12-40 subunidades de morfolino de longitud.
65 El documento WO 2001/083740 publica un compuesto de sentido contrario que tiene una cadena principal de
morfolino no cargada de entre 18 a 20 unidades contiguas que se dirige al receptor de andrógenos humano.
Los compuestos de sentido contrario de morfolino funcionan a través de la unión al ácido nucleico diana para bloquear el acceso al ARNm por otras moléculas, tales como moléculas implicadas en el empalme o inicio de la 5 traducción de ARNm.
El documento US 7.067.256 publica un ribozima que parece que media la inactivación del receptor de andrógenos. Se proporciona una molécula de ARN de 19 nucleótidos de sentido contrario a una región correspondiente del ARNm del receptor de andrógenos.
Sin embargo, a pesar de la aplicación de ARNip, compuestos de morfolino de sentido contrario y ribozimas, ninguno de los inhibidores de receptores de andrógenos anteriores ha tenido éxito en la regulación en defecto eficaz del receptor de andrógenos in vivo y con dosis farmacológicamente aceptables.
15 En un aspecto de ejemplo, la presente invención proporciona una nueva clase de antagonistas de receptor de andrógenos que se ha seleccionado basándose en la química del uso de LNA, y/o por la selección de sitios diana particularmente eficaces en el ARNm del receptor de andrógenos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un oligómero que tiene una secuencia de nucleótidos contiguos de un total de 1030 nucleótidos, en el que dicha secuencia de nucleótidos contiguos es al menos 80% homóloga al complemento inverso de una región correspondiente de un gen o ARNm de receptor de andrógenos de mamífero, en el que dicho oligómero comprende al menos una unidad de LNA; y en el que la secuencia de nucleótidos contiguos comprende al
25 menos 10 nucleótidos contiguos que son 100% idénticos a la región correspondiente de SEQ ID NO 94 o SEQ ID NO 58.
En un otro aspecto, la presente invención proporciona un conjugado que comprende el oligómero de acuerdo con la presente invención, y al menos un resto no nucleótido o no polinucleótido unido covalentemente a dicho oligómero.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el oligómero de acuerdo con la presente invención, o el conjugado de acuerdo con la presente invención, y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
35 La presente invención proporciona, en un aspecto adicional, el oligómero de acuerdo con la presente invención, o el conjugado de acuerdo con la presente invención, para usar como un medicamento, tal como para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno médico como se describe en el presente documento, tal como un trastorno hiperproliferativo, tal como el cáncer.
La presente invención proporciona, en otro aspecto, el uso de un oligómero de acuerdo con la presente invención, o un conjugado como se define en el presente documento, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno médico como se describe en el presente documento, tal como un trastorno hiperproliferativo, tal como el cáncer.
45 En otro aspecto, la presente invención proporciona un método in vitro para inhibir el receptor de andrógenos en una célula que expresa el receptor de andrógenos, comprendiendo dicho método administrar un oligómero de acuerdo con la presente invención, o un conjugado de acuerdo con la presente invención, a dicha célula de modo que inhiba al receptor de andrógenos en dicha célula.
La descripción proporciona un oligómero de entre 10 - 50, tal como 10 - 30 nucleótidos de longitud que comprende una secuencia de nucleótidos contiguos de un total de entre 10 - 50, tal como 10 - 30 nucleótidos, en el que dicha secuencia de nucleótidos contiguos es al menos 80% (por ejemplo, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%) homóloga a una región correspondiente al complemento inverso de un ácido nucleico que codifica un receptor de andrógenos de mamífero, tal como un gen o ARNm de receptor de andrógenos de mamífero, tal como la SEQ ID NO: 1 o variantes
55 naturales de la misma. Así, por ejemplo, el oligómero hibrida con una molécula de ácido nucleico monocatenario que tiene la secuencia de una parte (correspondiente) de la SEQ ID NO: 1.
La descripción proporciona un conjugado que comprende el oligómero de acuerdo con la descripción, y al menos un resto no nucleótido o no polinucleótidos unido covalentemente a dicho oligómero.
La descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende el oligómero o el conjugado de acuerdo con la descripción, y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La descripción proporciona el oligómero o el conjugado de acuerdo con la descripción, para usar como un
65 medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno médico como se describe en el presente documento, tal como un trastorno hiperproliferativo, tal como el cáncer.
La descripción proporciona el uso de un oligómero o el conjugado de acuerdo con la descripción, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno médico como se describe en el presente documento, tal como un trastorno hiperproliferativo, tal como el cáncer.
5 La descripción proporciona un método para tratar una enfermedad o un trastorno médico como se describe en el presente documento, tal como un trastorno hiperproliferativo, tal como el cáncer, comprendiendo dicho método administrar un oligómero, un conjugado o una composición farmacéutica de acuerdo con la descripción a un paciente que padece, o es probable que padezca dicha enfermedad o trastorno médico.
La descripción proporciona un método para inhibir el receptor de andrógenos en una célula que expresa el receptor de andrógenos, comprendiendo dicho método administrar un oligómero o un conjugado de acuerdo con la descripción a dicha célula, para así realizar la inhibición del receptor de andrógenos en dicha célula.
15 La descripción proporciona un oligómero de entre 10-50 bases nitrogenadas de longitud, que comprende una secuencia de bases nitrogenadas contiguas de un total de entre 10-50 bases nitrogenadas, en el que dicha secuencia de bases nitrogenadas contiguas es al menos 80% homóloga a una región correspondiente de un ácido nucleico que codifica un receptor de andrógenos de mamífero.
La descripción proporciona un oligómero de entre 10-50 bases nitrogenadas de longitud, que comprende una secuencia de bases nitrogenadas contiguas de un total de entre 10-50 bases nitrogenadas, en el que dicha secuencia de bases nitrogenadas contiguas es al menos 80% idéntica al complemento inverso de una región diana de un ácido nucleico que codifica un receptor de andrógenos de mamífero.
25 La descripción proporciona además un conjugado que comprende el oligómero de acuerdo con la descripción, tal como un conjugado que, además de la secuencia de bases nitrogenadas del oligómero comprende al menos un resto no nucleótido o no polinucleótido (“resto conjugado”) unido covalentemente al oligómero de la descripción.
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un oligómero o conjugado de la invención, y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La descripción además proporciona un oligómero de acuerdo con la descripción, para usar en medicina.
La descripción además proporciona el uso del oligómero de la descripción para fabricar un medicamento para el
35 tratamiento de una o más de las enfermedades mencionadas en el presente documento, tal como una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: cáncer tal como cáncer de mama o cáncer de próstata, alopecia, hiperplasia prostática benigna, atrofia espinal y muscular, enfermedad de Kennedy y enfermedad relacionada con poliglutamato.
La descripción proporciona además un oligómero de acuerdo con la descripción, para usar para el tratamiento de una o más enfermedades mencionadas en el presente documento, tal como una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: cáncer tal como cáncer de mama o cáncer de próstata, alopecia, hiperplasia prostática benigna, atrofia espinal y muscular, enfermedad de Kennedy y enfermedad relacionada con poliglutamato.
45 También se proporcionan composiciones farmacéuticas y otras que comprenden un oligómero de la descripción. Además, se proporcionan métodos para la regulación en defecto de la expresión de AR en células o tejidos, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos, in vitro o in vivo, con uno o más de los oligómeros, conjugados o composiciones de la descripción.
También se describen métodos de tratamiento de un animal no humano o un ser humano, que se sospecha que tiene o que es propenso a tener (susceptible) una enfermedad o afección, asociado con la expresión, o la expresión en exceso del AR, por administración a dicho animal o ser humano de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los oligómeros, conjugados o composiciones farmacéuticas de la descripción. Además, se proporcionan métodos para el uso de oligómeros para la inhibición de la expresión de AR, y para el tratamiento de
55 enfermedades asociadas con la actividad de AR.
La descripción proporciona un método para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: cáncer tal como cáncer de mama o cáncer de próstata, alopecia, hiperplasia prostática benigna, atrofia espinal y muscular, enfermedad de Kennedy y enfermedad relacionada con poliglutamato, comprendiendo el método administrar (una cantidad eficaz de) uno o más oligómeros de la descripción, conjugados o una composición farmacéutica de los mismos, a un paciente que lo necesite.
La descripción proporciona un método para inhibir o reducir la expresión del receptor de andrógenos en una célula o un tejido, tal como por regulación en defecto, comprendiendo el método la etapa de poner en contacto dicha célula o
65 tejido con una cantidad eficaz de uno o más oligómeros de la descripción, o conjugados, o composiciones farmacéuticas de los mismos, de modo que se inhiba o reduzca la expresión del receptor de andrógenos.
La descripción proporciona, en algunas realizaciones, un oligómero que consiste en 10 a 30 monómero contiguos, en el que los monómeros adyacentes están unidos covalentemente con un grupo fosfato o un grupo fosforotioato, en el que dicho oligómero comprende una primera región de al menos 10 monómeros contiguos; en el que al menos un
5 monómero de dicha primera región es un análogo de nucleósido; en el que la secuencia de dicha primera región es al menos 80% idéntica al complemento inverso de la región diana mejor alineada de un gen de receptor de andrógenos de mamíferos o un ARNm de receptor de andrógenos de mamífero.
En un aspecto, el oligómero de la descripción se selecciona del grupo que consiste en:
5'-A·sMeC·sMeC·sa·sa·sg·st·st·st·sc·st·st·sc·sA·sG·sMeC-3' (SEQ ID NO: 58), y
5'-MeC·sMeC·sMeC·sa·sa·sg·sg·sc·sa·sc·st·sg·sc·sA·sG·sA-3' (SEQ ID NO: 77);
15 en los que las letras mayúsculas indican monómeros beta-D-oxi-LNA y las letras minúsculas indican monómeros de ADN, el subíndice “s” indica una unión fosforotioato, y MeC indica un monómero beta-D-oxi-LNA que contiene una base 5-metilcitosina.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Se evaluó en los oligonucleótidos presentados en la tabla 3 su potencial para inactivar el ARNm del receptor de andrógenos en concentraciones de 1, 4 y 16 nM en células MCF7, 24 h después de transfección usando la PCR en tiempo real. Todos los resultados se normalizaron respecto a la GAPDH y la inhibición del ARNm del AR se muestra como porcentaje del control no tratado. Los resultados mostrados son una media de tres experimentos
25 independientes.
Figura 2. Se evaluó en los oligonucleótidos presentados en la tabla 3 su potencial para inactivar el ARNm del receptor de andrógenos en concentraciones de 1, 4 y 16 nM en células A549, 24 h después de transfección usando la PCR en tiempo real. Todos los resultados se normalizaron respecto a la GAPDH y la inhibición del ARNm del AR se muestra como porcentaje del control no tratado. Los resultados mostrados son una media de tres experimentos independientes.
Figura 3. Alineamiento de secuencias de la secuencia de ARNm del receptor de andrógenos humano (nº de acceso en Genbank: NM_000044) y la secuencia de ARNm del receptor de andrógenos de ratón (nº de acceso en Genbank:
35 NM_0134769).
Figura 4. Localización de las regiones diana preferidas el ARNm del AR humano (ADNc) dirigida por oligómeros de acuerdo con la descripción. Aunque se han mostrado sitios diana de oligómeros de 16 unidades, en algunas realizaciones, estas regiones diana pueden comprender 4 bases adicionales 5’ o 3’ de las regiones mostradas, es decir, son regiones diana de hasta 24 nucleótidos contiguos.
Figura 5. SEQ ID NO: 1 receptor de andrógenos de Homo sapiens (receptor de dihidrotestosterona; feminización testicular; atrofia muscular espinal y bulbar; enfermedad de Kennedy) (AR), variante transcrito 1, ARNm (nº de acceso en Genbank NM_000044).
45 Figura 6. SEQ ID NO 81: secuencia de ARNm de receptor de andrógenos de ratón.
Figura 7. SEQ ID NO 82: secuencia de ARNm de receptor de andrógenos de mono Rhesus.
Figura 8. SEQ ID NO 83: secuencia de aminoácidos de la proteína del receptor de andrógenos de Homo sapiens.
Figura 9. SEQ ID NO 84: secuencia de aminoácidos de la proteína del receptor de andrógenos de ratón.
Figura 10. SEQ ID NO 85: secuencia de aminoácidos de la proteína del receptor de andrógenos de mono Rhesus.
55 Figura 11. ARNm de AR en LNCaP, 24 h después de transfección
Figura 12. ARNm de AR en A549, 24 h después de transfección
Figura 13. Ensayo de proliferación celular - A549, transcurso del tiempo después de transfección
Figura 14. Ensayo de proliferación celular - transcurso del tiempo después de transfección
Figura 15. Actividad de caspasa 3/7 en células LNCaP, 24, 48 ó 72 después de transfección.
65 Figura 16. Actividad de caspasa 3/7 en células A549, 24, 48 ó 72 después de transfección.
Figura 17. PSA medio en el plasma después de tratamiento con oligómero in vivo.
Figura 18. Inhibición in vivo del crecimiento tumoral 5
Descripción detallada de la invención
El oligómero
10 La presente descripción usa compuestos oligómeros (denominados en el presente documento oligómeros), para usar en la modulación de la función de moléculas de ácido nucleico que codifican el receptor de andrógenos de mamífero, tal como el ácido nucleico del receptor de andrógenos mostrado en la SEQ ID NO 1, y variantes naturales de dichas moléculas de ácido nucleico que codifican el receptor de andrógenos de mamífero. El término “oligómero” en el contexto de la presente descripción, se refiere a una molécula formada por unión covalente de dos o más
15 nucleótidos (es decir, un oligonucleótido). En el presente documento, cada nucleótido individual, tal como los nucleótidos presentes en el oligómero de la descripción, también se pueden denominar “monómero” o “unidad”. En dichas realizaciones, el oligómero consiste o comprende una secuencia de nucleótidos contiguos de entre 10 – 30 nucleótidos de longitud (es decir, comprende o consiste en 10 – 30 monómeros unidos covalentemente).
20 En diferentes realizaciones, el compuesto de la descripción no comprende ARN (unidades). En diferentes realizaciones, los compuestos de acuerdo con la descripción son moléculas lineales o se sintetizan como una molécula lineal. El oligómero en dichas realizaciones, es una molécula monocatenaria, y típicamente no comprende regiones cortas, por ejemplo de al menos 3, 4 ó 5 nucleótidos contiguos, que son complementarias de otra región dentro del mismo oligómero (es decir, formas bicatenarias); en relación con esto, en algunas realizaciones el
25 oligómero no es (esencialmente) bicatenario. En algunas realizaciones, el oligómero esencialmente no es bicatenario, tal como que no es un ARNip. En diferentes realizaciones, el oligómero de la descripción pude consistir enteramente en la región de nucleótidos contiguos. Por lo tanto, el oligómero no es sustancialmente autocomplementario. El ARNip comprende 2 secuencias de ARN cortas complementarias (o unidades de bases nitrogenadas equivalentes), tal como entre 21 y 23 nucleótidos de longitud, típicamente con segmentos
30 protuberantes en cada extremo 3’ de 2 nucleótidos. Con el fin de potenciar la absorción in vivo, los ARNip se pueden conjugar, tal como conjugar con un esterol, tal como un grupo colesterol (típicamente en el extremo 3’ o 5’ de una o ambas de las cadenas).
La descripción proporciona además secuencias diana en el ARNm o gen del AR, o una variante alélica del mismo,
35 en particular las que corresponden a las SEQ ID NOS: 2-22, en las que los oligonucleótidos de sentido contrario que corresponden a dichas secuencias diana son capaces de regular en defecto el AR. Por ejemplo, las secuencias diana que corresponden a las secuencias de oligonucleótidos de sentido contrario de SEQ ID NOS: 2-22, respectivamente, se muestran en la figura 4 (en negrita y subrayado, con las correspondientes oligo de SEQ ID NOS indicadas anteriormente). Las secuencias variantes, por ejemplo, pero sin limitar a variantes alélicas (tales como un
40 gen de (AR) presentes en el locus génico Xq11-12) de dichas secuencias diana también están dentro del alcance de la descripción. Una secuencia variante puede tener una homología de secuencia de al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95% con una secuencia diana en el AR. Típicamente, un oligómero de la descripción correspondiente a
45 dichas secuencias variantes todavía es capaz de regular en defecto el AR.
También se describen diseños específicos de oligonucleótidos de LNA, por ejemplo los mostrados en las SEQ ID NOS 44 - 80. Los oligómeros de la invención se considera que son potentes inhibidores del ARNm del receptor de andrógenos y de la expresión de proteínas.
La diana
El receptor de andrógenos de mamífero se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en receptor de andrógenos humano o de ratón. Preferiblemente, el receptor de andrógenos de mamífero es el receptor de
55 andrógenos humano, tal como el receptor de andrógenos codificado por el ácido nucleico mostrado en la SEQ ID NO 1. En la siguiente tabla se muestran genes del receptor de andrógenos de mamífero (dianas) adicionales y sus correspondientes proteínas:
Números de acceso en Genbank - Ácido nucleico (secuencia de ARNm/ADNc)
Números de acceso en Genbank - Polipéptido (deducido)
Humano
NM_000044 NP_000035
Ratón
NM_013476 NP_038504
Mono Rhesus
NM_001032911 NP_001028083
Debe reconocerse que el gen del receptor de andrógenos en seres humanos muestra un grado de variación alélica, y varios de los polimorfismos reconocidos que los números de acceso en GenBank descritos antes para ácidos nucleicos se refieren a secuencias de ADNc y no a secuencias de ARNm de por sí. La secuencia de un ARNm
5 maduro se puede obtener directamente de la correspondiente secuencia de ADNc por sustitución de las bases timina (T) por bases uracilo (U).
Debe reconocerse que el gen del receptor de andrógenos en seres humanos muestra un grado de variación alélica, y varios de los polimorfismos están asociados con fenotipos de enfermedad (Mooney y col., NAR 15; 31(8) 2003). Por ejemplo, una expansión CAG que se repite está asociada con el trastorno de expansión de poliglutamina, se han identificado otras variantes alélicas caracterizadas que incluyen una repetición del trinucleótido (GGC)n y polimorfismos de un solo nucleótido R726L, T887A y L710H, y se ha mostrado que los dos últimos están correlacionados para potenciar la promiscuidad del receptor AR por otros ligandos esteroideos. En una realización, n puede estar en el intervalo entre 5 y 31. Las repeticiones CAG de menos de 22 se han asociado con un riesgo
15 mayor de cáncer de próstata en hombres afroamericanos, y por lo tanto, esto puede ser una variante alélica.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es una variante alélica del AR que comprende uno o más polimorfismos de un solo nucleótido, incluyendo R726L, T887A y L710H.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, la diana es una variante alélica del AR que comprende una repetición de trinucleótido (CAG)n, o repetición de trinucleótido (GGC)n.
El ácido nucleico que codifica el receptor de andrógenos de mamíferos, en una realización preferida es la secuencia de ADNc del receptor de andrógenos humano mostrada como SEQ ID NO 1 y/o la secuencia de ADNc del receptor
25 de andrógenos de ratón mostrada como SEQ ID NO 81, o variantes alélicas de las mismas. El oligómero de acuerdo con la invención es un oligonucleótido de sentido contrario.
Por lo tanto, “la diana” del oligómero de acuerdo con la invención es el ARNm del receptor de andrógenos. Cuando se introduce en la célula que expresa el gen del receptor de andrógenos, el oligómero da como resultado la reducción del nivel de ARNm del receptor de andrógenos, dando como resultado la reducción del nivel de expresión del receptor de andrógenos en la célula.
Se sabe que el receptor de andrógenos regula la expresión de varios genes, tales como un gen seleccionado del grupo que consiste en proteína quinasa C-delta (PRKCD), glutatión S-transferasa zeta 2 (GSTT2), receptor de
35 potencial transitorio de canal catiónico, subfamilia V, miembro 3 (TRPV3), pirrolina-5-carboxilato reductasa 1 (PYCR1) o ornitina aminotransferasa (OAT); dichos genes se denominan dianas del receptor de andrógenos en el presente documento, y como tales, en algunas realizaciones, los oligómeros de acuerdo con la invención se pueden usar para modular la expresión de una o más dianas del receptor de andrógenos en una célula que expresa, o que es capaz de expresar (es decir, en el caso de alivio de la represión (por el AR) de la diana del receptor de andrógenos en una célula) dicha diana del receptor de andrógenos.
Los oligómeros que se dirigen al ARNm del receptor de andrógenos pueden hibridar con cualquier sitio a lo largo del ácido nucleico ARNm diana, tal como la región líder 5’ no traducida, exones, intrones y cola 3’ no traducida. Sin embargo, se prefiere que los oligómeros que se dirigen al ARNm del receptor de andrógenos hibriden con la forma
45 de ARNm maduro del ácido nucleico diana.
Adecuadamente, el oligómero de la invención es capaz de regular en defecto la expresión del gen del receptor de andrógenos. En relación con esto, el oligómero de la invención puede realizar la inhibición del receptor de andrógenos, típicamente en un mamífero tal como una célula humana. En algunas realizaciones, los oligómero de la invención se unen al ácido nucleico diana y realizan la inhibición de la expresión de al menos 10% o 20% comparado con el nivel de expresión normal, más preferiblemente al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de inhibición comparado con el nivel de expresión normal (tal como inmediatamente antes de la administración del oligómero). En algunas realizaciones, dicha modulación se observa cuando se usa una concentración entre 0,04 y 25 nM, tal como entre 0,8 y 20 nM del compuesto de la invención. En la misma o una
55 realización diferente, la inhibición de la expresión es menos de 100%, tal como menos de 98% de inhibición, menos de 95% de inhibición, menos de 90% de inhibición, menos de 80% de inhibición, tal como menos de 70% de inhibición. La modulación del nivel de expresión se puede determinar midiendo los niveles de proteínas, por ejemplo, por métodos tales como SDS-PAGE seguido de transferencia Western usando anticuerpos adecuados dirigidos contra la proteína diana. Alternativamente, la modulación de los niveles de expresión se puede determinar midiendo los niveles de ARNm, por ejemplo, por transferencia Northern o RT-PCR cuantitativa. Cuando se mide a través de los niveles de ARNm, el nivel de regulación en defecto cuando se usa una dosificación adecuada, tal como una concentración entre 0,04 y 25 nM, tal como entre 0,8 y 20 nM, en algunas realizaciones, típicamente está en un nivel de entre 10-20% los niveles normales en ausencia del compuesto de la invención.
65 Por lo tanto, la descripción proporciona un método de regulación en defecto o inhibición de la expresión de la proteína y/o ARNm del receptor de andrógenos en una célula que expresa la proteína y/o ARNm del receptor de andrógenos, comprendiendo dicho método administrar o poner en contacto el oligómero o conjugado de acuerdo con la invención (adecuadamente en una cantidad eficaz) con dicha célula para regular en defecto o inhibir la expresión de la proteína y/o ARNm del receptor de andrógenos en dicha célula. De forma adecuada, la célula es una célula de mamífero tal como una célula humana. En algunas realizaciones, la administración o el contacto se pueden
5 producir in vitro. En algunas realizaciones, la administración o el contacto se pueden producir in vivo.
La expresión “ácido nucleico diana”, como se usa en el presente documento, se refiere al ADN o ARN que codifica el polipéptido del receptor de andrógenos de mamífero, tal como el receptor de andrógenos humano, tal como la SEQ ID NO: 1. Los ácidos nucleicos que codifican el receptor de andrógenos o variantes naturales de los mismos, y los 10 ácidos nucleicos ARN derivados de los mismos, son preferiblemente ARNm, tal como pre-ARNm, aunque preferiblemente ARNm maduro. En algunas realizaciones, cuando se usa por ejemplo para investigación o diagnósticos, el “ácido nucleico diana” puede ser un ADNc o un oligonucleótido sintético derivado de los ácidos nucleicos ADN o ARN diana anteriores. El oligómero de acuerdo con la invención, preferiblemente es capaz de hibridar con el ácido nucleico diana. Se reconocerá que la SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ADNc, y como tal
15 corresponde a la secuencia diana de ARNm maduro, aunque el uracilo está sustituido por timidina en las secuencias de ADNc.
La expresión “variante natural del mismo” se refiere a variantes de la secuencia de ácido nucleico del polipéptido del receptor de andrógenos que existen de forma natural dentro del grupo taxonómico definido, tal como mamífero, tal 20 como ratón, mono y preferiblemente ser humano. Típicamente, cuando se hace referencia a “variantes naturales” de un polipéptido, la expresión también puede abarcar cualquier variante alélica del ADN genómico que codifica el receptor de andrógenos que se encuentra en el cromosoma X: 66,68 – 66,87 Mb por translocación o duplicación cromosómica, y el ARN, tal como el ARNm derivado del mismo. Las “variantes naturales” también pueden incluir variantes derivadas del empalme alternativo del ARNm del receptor de andrógenos. Cuando se hace referencia a
25 una secuencia de polipéptido específica, por ejemplo, la expresión también incluye formas naturales de la proteína que, por lo tanto, puede ser procesada, por ejemplo, por modificaciones co- o postraduccionales, tales como escisión de péptido señal, escisión proteolítica, glicosilación, etc.
Secuencias de oligómeros
30 Los oligómeros comprenden o consisten en una secuencia de nucleótidos contiguos que corresponde al complemento inverso de una secuencia de nucleótidos presente en la SEQ ID NO: 1. Por lo tanto, el oligómero puede comprender o consistir en o ser una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 2 22 y 86 - 106, en el que dicho oligómero (o parte de nucleótidos contiguos del mismo) puede tener opcionalmente 1,
35 2 ó 3 apareamientos erróneos frente a dicha secuencia seleccionada.
El oligómero puede comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos contiguos que es totalmente complementaria (perfectamente complementaria) de la región equivalente de un ácido nucleico que codifica un receptor de andrógenos de mamífero (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Por lo tanto, el oligómero puede comprender o
40 consistir en una secuencia de nucleótidos de sentido contrario.
Sin embargo, en algunas realizaciones, el oligómero puede tolerar 1, 2, 3 ó 4 (o más) apareamientos erróneos, cuando hibrida con la secuencia diana y unirse todavía suficientemente con la diana para mostrar el efecto deseado, es decir, la regulación en defecto de la diana. Los apareamientos erróneos pueden compensarse, por ejemplo, por
45 una mayor longitud de la secuencia de nucleótidos del oligómero y/o un mayor número de análogos de nucleótidos, tales como LNA, presentes en la secuencia de nucleótidos.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contiguos comprende no más de 3, tal como no más de 2 apareamientos erróneos cuando hibrida con la secuencia diana, tal como la región correspondiente de un ácido 50 nucleico que codifica un receptor de andrógenos de mamífero.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contiguos comprende no más de un solo apareamiento erróneo cuando hibrida con la secuencia diana, tal como la correspondiente región de un ácido nucleico que codifica un receptor de andrógenos de mamíferos.
55 La secuencia de nucleótidos de los oligómeros de la descripción o la secuencia de nucleótidos contiguos preferiblemente es al menos 80% homologa a una secuencia correspondiente seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 2 - 22 y 86 - 106, tal como al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96% homóloga, tal como 100% homóloga (idéntica).
60 La secuencia de nucleótidos de los oligómeros de la descripción o la secuencia de nucleótidos contiguos preferiblemente es al menos 80% homologa a un complemento inverso de una secuencia correspondiente presente en la SEQ ID NO: 1, tal como al 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96% homóloga, al menos 97% homóloga, al menos 98% homóloga, al menos 99%
65 homóloga, tal como 100% homóloga (idéntica).
La secuencia de nucleótidos de los oligómeros de la descripción o la secuencia de nucleótidos contiguos preferiblemente es al menos 80% complementaria de una subsecuencia presente en la SEQ ID NO: 1, tal como al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96% complementaria, al menos 97% complementaria, al menos 98% complementaria, al menos 99%
5 complementaria, tal como 100% complementaria (perfectamente complementaria).
En algunas realizaciones, el oligómero (o parte de nucleótidos contiguos del mismo) se selecciona de, o comprende, una de las secuencias seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, en las que dicho oligómero (o parte de nucleótidos contiguos del mismo) puede comprender opcionalmente 1, 2 ó 3 apareamientos erróneos cuando se compara con la secuencia.
En algunas realizaciones, el oligómero (o parte de nucleótidos contiguos del mismo) se selecciona de, o comprende, una de las secuencias seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95,
15 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 y 106, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, en las que dicho oligómero (o parte de nucleótidos contiguos del mismo) puede comprender opcionalmente 1, 2 ó 3 apareamientos erróneos cuando se compara con la secuencia.
Otros oligómeros preferidos incluyen una secuencia de nucleótidos (contiguos), tal como una secuencia de 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de longitud, que tienen una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia del grupo que consiste en las SEQ ID No 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, y 22, en los que dicho oligómero (o parte de nucleótidos contiguos del mismo) puede comprender opcionalmente 1, 2 ó 3 apareamientos erróneos frente a dicha secuencia seleccionada.
25 En algunas realizaciones, la subsecuencia puede consistir en 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ó 29 nucleótidos contiguos, tal como entre 12 -22, tal como entre 12-18 nucleótidos. Adecuadamente, en algunas realizaciones, la subsecuencia tiene la misma longitud que la secuencia de nucleótidos contiguos del oligómero de la invención.
Sin embargo, se reconoce que en algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos del oligómero puede comprender nucleótidos 5’ o 3’ adicionales, tales como, independientemente, 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos adicionales 5’ y/o 3’ que no son complementarios de la secuencia diana. En relación con esto, el oligómero de la descripción, en algunas realizaciones, pude comprender una secuencia de nucleótidos contiguos que está flanqueada 5’ y/o 3’ por nucleótidos adicionales. En algunas realizaciones, los nucleótidos 5’ o 3’ adicionales son nucleótidos naturales, tales
35 como ADN o ARN. En algunas realizaciones, los nucleótidos 5’ o 3’ adicionales pueden representar la región D como se menciona en el contexto de oligómeros oligómero con huecos en el presente documento.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, tal como la SEQ ID NO: 44, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3, tal como la SEQ ID NO: 45, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
45 En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4, tal como la SEQ ID NO: 46, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, tal como la SEQ ID NO: 47, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de
55 nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6, tal como la SEQ ID NO: 48, 49 ó 50, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 7, tal como la SEQ ID NO: 51, 52 ó 53, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 8, tal como la SEQ ID NO: 54, 55 ó 56, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
65 En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 9, tal como la SEQ ID NO: 57, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de 5 nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 10, tal como la SEQ ID NO: 58, 59 ó 60, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, tal como la SEQ ID NO: 61, o una subsecuencia de al menos 10 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, tal como la SEQ ID NO: 62, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
15 En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 13, tal como la SEQ ID NO: 63, 64 ó 65, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
20 En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 14, tal como la SEQ ID NO: 66, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de 25 nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 15, tal como la SEQ ID NO: 67, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 16, tal como la SEQ ID NO: 68, o una subsecuencia de al menos 10 30 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 17, tal como la SEQ ID NO: 69, 70 ó 71, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
35 En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 18, tal como la SEQ ID NO: 72, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
40 En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 19, tal como la SEQ ID NO: 73, 74 ó 75, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste en o comprende una secuencia de 45 nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 20, tal como la SEQ ID NO: 76, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 21, tal como la SEQ ID NO: 77, 78 ó 79, o una subsecuencia de al 50 menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la descripción consiste o comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 22, tal como la SEQ ID NO: 80, o una subsecuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, tal como 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos contiguos de la misma.
55 Cuando se determina la “homología” entre los oligómeros de la descripción (o secuencia de nucleótidos contiguos) y el ácido nucleico que codifica el receptor de andrógenos de mamífero o el complemento inverso del mismo, tal como se describe en el presente documento, la determinación de la homología se puede hacer por un simple alineamiento con la correspondiente secuencia de nucleótidos del compuesto de la descripción y la correspondiente región del
60 ácido nucleico que codifica el receptor de andrógenos de mamífero (o ácido nucleico diana), o el complemento inverso del mismo, y la homología se determina contando el número de bases que se alinean y dividiendo entre el número total de nucleótidos contiguos en el compuesto de la descripción, y multiplicando por 100. En dicha comparación, si existen huecos, es preferible que dichos huecos sean simplemente apareamientos erróneos en lugar de regiones donde el número de nucleótidos dentro del hueco difiere entre la secuencia de nucleótidos de la
65 descripción y el ácido nucleico diana.
Las expresiones “correspondiente a” y “corresponde a” se refieren a la comparación entre la secuencia de nucleótidos del oligómero o secuencia de nucleótidos contiguos (una primera secuencia) y la secuencia de nucleótidos contiguos equivalente de una secuencia adicional seleccionada de i) una subsecuencia del complemento inverso de del ácido nucleico diana, tal como el ARNm que codifica la proteína del receptor de andrógenos, tal como 5 la SEQ ID NO: 1, y/o ii) la secuencia de nucleótidos proporcionada el en presente documento tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 2 - 22 y 86 - 106, o subsecuencias de las mismas. Los análogos de nucleótidos se comparan directamente con sus nucleótidos equivalentes o correspondientes. Una primera secuencia que corresponde a una secuencia adicional de i) o ii) típicamente es idéntica a esa secuencia a lo largo de la longitud de la primera secuencia (tal como la secuencia de nucleótidos contiguos), o como se describe en el presente
10 documento, en algunas realizaciones es al menos 80% homóloga a una secuencia correspondiente, tal como al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96% homóloga, al menos 97% homóloga, al menos 98% homóloga, al menos 99% homóloga, tal como 100% homóloga (idéntica).
15 Las expresiones el “análogo de nucleótido correspondiente” y el “nucleótido correspondiente” se pretende que indiquen que el nucleótido en el análogo de nucleótido y el nucleótido natural son idénticos. Por ejemplo, cuando una unidad de 2-desoxirribosa del nucleótido está unida a una adenina, el “correspondiente análogo de nucleótido” contiene una unidad de pentosa (diferente de la 2-desoxirribosa) unida a la adenina.
20 Longitud
Los oligómeros comprenden o consisten en una secuencia de nucleótidos contiguos de un total de entre 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos contiguos de longitud.
25 En algunas realizaciones, los oligómeros comprenden o consisten en una secuencia de nucleótidos contiguos de un total de entre 10 - 22, tal como 12 - 18, tal como 13 -17 ó 12 - 16, tal como 13, 14, 15, 16 nucleótidos contiguos de longitud.
En algunas realizaciones, los oligómeros comprenden o consisten en una secuencia de nucleótidos contiguos de un 30 total de 10, 11, 12, 13 ó 14 nucleótidos contiguos de longitud.
En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la invención consta de no más de 22 nucleótidos, tal como no más de 20 nucleótidos, tal como no más de 18 nucleótidos, tal como 15, 16 ó 17 nucleótidos. En algunas realizaciones, el oligómero de la invención comprende menos de 20 nucleótidos.
Análogos de nucleótidos
El término “nucleótido” como se usa en el presente documento, se refiere a un glucósido que comprende un resto de azúcar, un resto de base y un grupo fosfato unido covalentemente y cubre tanto nucleótidos naturales, tales como
40 ADN o ARN, preferiblemente ADN, como nucleótidos no naturales que comprenden restos de azúcar y/o base modificados, que también se denominan “análogos de nucleótidos” en el presente documento.
Los nucleótidos no naturales incluyen nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, tales como nucleótidos bicíclicos o nucleótidos 2’-modificados, tales como nucleótidos 2’-sustituidos.
45 “Análogos de nucleótidos” son variantes de nucleótidos naturales tales como nucleótidos de ADN o ARN, en virtud de modificaciones en el resto de azúcar y/o base. Los análogos en principio podrían ser simplemente “silenciosos” o “equivalentes” a los nucleótidos naturales en el contexto del oligonucleótido, es decir, no tener efecto funcional de la forma en la que funciona el oligonucleótido para inhibir la expresión de genes diana. Dichos análogos “equivalentes”
50 pueden, no obstante, ser útiles si, por ejemplo, son más fáciles o más baratos de fabricar, o son más estables en las condiciones de almacenamiento o fabricación, o representan un marcador o etiqueta. Sin embargo, preferiblemente, los análogos tendrán un efecto funcional en la forma en la que funciona el oligómero para inhibir la expresión; por ejemplo produciendo una mayor afinidad de unión a la diana y/o mayor resistencia a nucleasas intracelulares y/o mayor facilidad de transporte en la célula. Los ejemplos específicos de análogos de nucleósidos se describen por
55 ejemplo, en Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 y Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, y en el esquema 1:
ESQUEMA 1
10 Por lo tanto, el oligómero puede comprender o consistir en una secuencia simple de nucleótidos naturales, preferiblemente 2’-desoxinucleótidos (denominado aquí en general “ADN”), pero también son posibles ribonucleótidos (denominados aquí en general “ARN”), o una combinación de dichos nucleótidos naturales y uno o más nucleótidos no naturales, es decir, análogos de nucleótidos. Dichos análogos de nucleótidos pueden potenciar de forma adecuada la afinidad del oligómero por la secuencia diana.
15 Los ejemplos de análogos de nucleótidos adecuados y preferidos se proporcionan en el documento PCT/DK2006/000512 o son referencia en el mismo.
La incorporación de análogos de nucleótidos que potencian la afinidad en el oligómero, tal como LNA o azúcares 2’
20 sustituidos, permite reducir el tamaño del oligómero que se une específicamente, y también puede reducir el límite superior al tamaño del oligómero antes de que tenga lugar la unión no específica o aberrante.
En algunas realizaciones, el oligómero comprende al menos 2 análogos de nucleótidos. En algunas realizaciones, el oligómero comprende 3-8 análogos de nucleótidos, por ejemplo, 6 ó 7 análogos de nucleótidos. En las realizaciones
25 mucho más preferidas, al menos uno de dichos análogos de nucleótidos es un ácido nucleico bloqueado (LNA); por ejemplo, al menos 3 o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6 o al menos 7 u 8, de los análogos de nucleótidos pueden ser LNA. En algunas realizaciones, todos los análogos de nucleótidos pueden ser LNA.
Se reconocerá que cuando se hace referencia a un patrón de secuencia de nucleótidos o una secuencia de
30 nucleótidos preferida, que consiste solo en nucleótidos, los oligómeros de la invención que se definen por esta secuencia pueden comprender un análogo de nucleótido correspondiente en lugar de uno o más de los nucleótidos presentes en dicha secuencia, tal como unidades de LNA u otros análogos de nucleótidos, que aumentan la estabilidad/Tm de la forma bicatenaria del oligómero/forma bicatenaria diana (es decir, análogos de nucleótidos que potencian la afinidad).
35 En algunas realizaciones, cualquier apareamiento erróneo entre la secuencia de nucleótidos del oligómero y la secuencia diana se encuentra preferiblemente en regiones fuera de los análogos de nucleótidos que potencian la afinidad, tal como la región B como se denomina en el presente documento, y/o la región D como se denomina en el presente documento, y/o en el sitio no modificado tal como nucleótidos de ADN en el oligonucleótido, y/o en
40 regiones que son 5’ o 3’ respecto a la secuencia de nucleótidos contiguos.
Los ejemplos de dicha modificación del nucleótido incluyen modificar el resto de azúcar para proporcionar un grupo 2’-sustituyente o para producir una estructura de puente (ácido nucleico bloqueado) que potencia la afinidad de unión y también puede proporcionar mayor resistencia a nucleasa.
45 Un análogo de nucleótido preferido es el LNA, tal como oxi-LNA (tal como beta-D-oxi-LNA y alfa-L-oxi-LNA), y/o amino-LNA (tal como beta-D-amino-LNA y alfa-L-amino-LNA) y/o tio-LNA (tal como beta-D-tio-LNA y alfa-L-tio-LNA) y/o ENA (tal como beta-D-ENA y alfa-L-ENA). El más preferido es el beta-D-oxi-LNA.
5 En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos presentes dentro del oligómero de la invención (tal como en regiones A y C mencionadas en el presente documento) se seleccionan independientemente, por ejemplo, de: unidades de 2'-O-alquil-ARN, unidades de 2'-amino-DNA, unidades de 2'-fluoro-ADN, unidades de LNA, unidades de ácido arabino-nucleico (ANA), unidades de 2'-fluoro-ANA, unidades de HNA, unidades de INA (ácido nucleico intercalante - Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002, 30:4918-4925), y unidades de 2'-MOE. En algunas
10 realizaciones existe solamente uno de los tipos anteriores de análogos de nucleótidos presentes en el oligómero de la invención, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo.
En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos son 2'-O-metoxietil-ARN (2'-MOE), monómeros 2'-fluoro-ADN
o análogos de nucleótidos de LNA, y como tal, el oligonucleótido de la invención puede comprender análogos de
15 nucleótidos que se seleccionan independientemente de estos 3 tipos de análogos, o puede comprender un solo tipo de análogo seleccionado de los 3 tipos. En algunas realizaciones, al menos uno de dichos análogos de nucleótido es 2'-MOE-ARN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 unidades de nucleótido 2'-MOE-ARN. En algunas realizaciones, al menos uno de dichos análogos de nucleótido es 2'-fluoro-ADN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 unidades de nucleótido 2'-fluoro-ADN.
20 En algunas realizaciones, el oligómero de acuerdo con la invención comprende al menos una unidad de ácido nucleico bloqueado (LNA), tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 unidades LNA, tal como entre 3 y 7 o de 4 a 8 unidades de LNA, o 3, 4, 5, 6 ó 7 unidades de LNA. En algunas realizaciones, todos los análogos de nucleótidos son LNA. En algunas realizaciones, el oligómero puede comprender tanto beta-D-oxi-LNA, como una o más de las siguientes
25 unidades de LNA: tio-LNA, amino-LNA, oxi-LNA, y/o ENA en las configuraciones beta-D o alfa-L, o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, todas las unidades citosina del LNA son 5'-metilcitosina. En algunas realizaciones de la invención, el oligómero puede comprender tanto unidades de LNA como de ADN. Preferiblemente, el total combinado de unidades de LNA y ADN es 10-25, preferiblemente 10-20, incluso más preferiblemente 12-16. En algunas realizaciones de la invención, la secuencia de nucleótidos del oligómero, tal como
30 la secuencia de nucleótidos contiguos consiste en al menos un LNA y el resto de las unidades de nucleótidos son unidades de ADN. En algunas realizaciones, el oligómero comprende solo análogos de nucleótido de LNA y nucleótidos naturales (tales como ARN o ADN, lo más preferiblemente nucleótidos de ADN), opcionalmente con uniones internucleótidos modificadas tales como fosforotioato.
35 El término “base nitrogenada” se refiere al resto de base de un nucleótido y cubre tanto las variantes naturales como las no naturales. Por lo tanto, “base nitrogenada” cubre no solo los heterociclos de purina y pirimidina conocidos sino también los análogos heterocíclicos y tautómeros de los mismos.
Los ejemplos de bases nitrogenadas incluyen, pero no se limitan a adenina, guanina, citosina, timidina, uracilo,
40 xantina, hipoxantina, 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina, y 2-cloro-6-aminopurina.
En algunas realizaciones, al menos una de las bases nitrogenadas presente en el oligómero es una base nitrogenada modificada seleccionada del grupo que consiste en 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5
45 bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina.
LNA
El término “LNA” se refiere a un análogo de nucleótido bicíclico, conocido como “ácido nucleico bloqueado”. Se
50 puede referir a un monómero de LNA, o cuando se usa en el contexto de un “oligonucleótido de LNA” se refiere a un oligonucleótido que contiene uno o más de dichos análogos de nucleótidos bicíclicos.
El LNA usado en los compuestos oligonucleótidos de la invención preferiblemente tiene la estructura de la fórmula general I
55 en la que:
5 X se selecciona de -O-, -S-, -N(RN*)-, -C(R6R6*)-;
B se selecciona de hidrógeno, alcoxi C1-4 opcionalmente sustituido, alquilo C1-4 opcionalmente sustituido, aciloxi C1-4 opcionalmente sustituido, bases nitrogenadas, intercalantes de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores y ligandos;
10 P designa la posición radical para una unión internucleótidos con un monómero sucesivo, o un grupo 5' terminal, tal como un unión internucleótidos o grupo 5' terminal que incluye opcionalmente el sustituyente R5 o es igualmente aplicable al sustituyente R5*;
15 P* designa un unión internucleótidos con un monómero precedente, o un grupo 3' terminal;
R4* y R2* juntos indican un birradical que consiste en 1-4 grupos/átomos seleccionados de -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, y >C=Z,
20 en los que Z se selecciona de -O-, -S-, y -N(Ra)-, y Ra y Rb se selecciona cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-12 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-12 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi C1-12, alcoxi(C2-12)-alquilo, alqueniloxi C2-12, carboxi, alcoxi(C1-12)-carbonilo, alquil(C1-12)-carbonilo, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y di(alquil C1-6)amino, carbamoilo, mono- y di(alquil C1-6)-amino
25 carbonilo, amino-alquil(C1-6)-aminocarbonilo, mono- y di(alquil C1-6)amino-alquil(C1-6)-aminocarbonilo, alquil(C1-6)carbonilamino, carbamido, alcanoiloxi C1-6, sulfono, alquilsulfoniloxi C1-6, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio C1-6, halógeno, intercalantes de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores y ligandos, donde el arilo y heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos y donde dos sustituyentes geminales Ra y Rb juntos pueden designar metileno (=CH2) opcionalmente sustituido, y
30 cada uno de los sustituyentes R1*, R2, R3, R5, R5*, R6 y R6*, que están presentes, se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-12 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-12 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi C1-12, alcoxi(C2-12)-alquilo, alqueniloxi C2-12, carboxi, alcoxi(C1-12)-carbonilo, alquil(C1-12)-carbonilo, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y di(alquil C1-6)amino, carbamoilo, mono- y di(alquil C1-6)-amino
35 carbonilo, amino-alquil(C1-6)-aminocarbonilo, mono- y di(alquil C1-6)amino-alquil(C1-6)-aminocarbonilo, alquil(C1-6)carbonilamino, carbamido, alcanoiloxi C1-6, sulfono, alquilsulfoniloxi C1-6, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio C1-6, halógeno, intercalantes de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores y ligandos, donde el arilo y heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos, y donde dos sustituyentes geminales juntos pueden designar oxo, tioxo, imino, o metileno opcionalmente sustituido, o
40 juntos pueden formar un birradical espiro que consiste en una cadena de alquileno de 1-5 átomos de carbono que está opcionalmente interrumpida y/o terminada por uno o más heteroátomos/grupos seleccionados de -O-, -S-, y -(NRN)- donde RN se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4, y donde dos sustituyentes adyacentes (no geminales) pueden designar un enlace adicional que da como resultado un doble enlace; y RN*, cuando está presente y no está implicado en un birradical, se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4; y sales básicas y sales de adición de ácido de
45 los mismos.
En algunas realizaciones R5* se selecciona de H, -CH3, -CH2-CH3,- CH2-O-CH3, y -CH=CH2.
En algunas realizaciones, R4* y R2* juntos designan un birradical seleccionado de -C(RaRb)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-O-,
50 -C(RaRb)-C(RcRd)-C(RcRf)-O-, -C(RaRb)-O-C(RcRd)-, -C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-C(RcRd)C(ReRf)-, -C(Ra)=C(Rb)-C(RCRd)-, -C(RaRb)-N(Rc), -C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re), -C(RaRb)-N(Rc)-O-, y -C(RaRb)-S-, -C(RaRb)-C(RCRd)-S-, en los que Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf se selecciona cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-12 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-12 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi C1-12, alcoxi(C2-12)-alquilo, alqueniloxi C2-12, carboxi, alcoxi(C1-12)-carbonilo, alquil(C1-12)
55 carbonilo, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y di(alquil C1-6)amino, carbamoilo, mono- y di(alquil C1-6)-amino-carbonilo, aminoalquil(C1-6)-aminocarbonilo, mono-y di(alquil C1-6)amino-alquil(C1-6)-aminocarbonilo, alquil(C1-6)-carbonilamino, carbamido, alcanoiloxi C1-6, sulfono, alquilsulfoniloxi C1-6, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio C1-6, halógeno, intercalantes de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos
5 indicadores y ligandos, donde el arilo y heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos y donde dos sustituyentes geminales Ra y Rb juntos pueden designar metileno (=CH2) opcionalmente sustituido.
En una realización adicional R4* y R2* juntos designan un birradical (grupo bivalente) seleccionado de -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-N(CH3)-, -CH2-CH2-O-, -CH2-CH(CH3)-, - CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH210 CH2-O, -CH2-CH2-CH(CH3)-, -CH=CH-CH2-, -CH2-O-CH2-O-, -CH2-NH-O-, -CH2-N(CH3)-O-, -CH2-O-CH2-, -CH(CH3)-O-, -CH(CH2-O-CH3)-O-.
Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos se pueden encontrar en la orientación R o S.
15 Preferiblemente, el LNA usado en el oligómero de la invención comprende al menos una unidad de LNA de acuerdo con cualquiera de las fórmulas
20 en las que Y es -O-, -O-CH2- ,-S-, -NH-, o N(RH); Z y Z* se seleccionan independientemente entre una unión internucleótidos, un grupo terminal o un grupo protector; B constituye un resto de base de nucleótido natural o no natural, y RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4.
Las unidades de LNA específicamente preferidas se muestran en el esquema 2: 25
ESQUEMA 2
5 El término “tio-LNA” comprende un nucleótido bloqueado en el que Y en la fórmula general anterior se selecciona de S o -CH2-S-. Tio-LNA puede estar en cualquiera de las configuraciones beta-D y alfa-L.
El término “amino-LNA” se refiere a un nucleótido bloqueado en el que Y en la fórmula general anterior se selecciona de -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, y -CH2-N(R)- donde R se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4. Amino-LNA puede
10 estar en cualquiera de las configuraciones beta-D y alfa-L.
El término “oxi-LNA” se refiere a un nucleótido bloqueado en el que Y en la fórmula general anterior representa –Oo -CH2-O-. Oxi-LNA puede estar en cualquiera de las configuraciones beta-D y alfa-L.
15 El término “ENA” se refiere a un nucleótido bloqueado en el que Y en la fórmula general anterior es -CH2-O- (donde el átomo de oxígeno de -CH2-O- está unido a la posición 2’ con respecto a la base B).
En una realización preferida, el LNA se selecciona de beta-D-oxi-LNA, alfa-L-oxi-LNA, beta-D-amino-LNA y beta-D-tio-LNA, en particular beta-D-oxi-LNA.
20 Reclutamiento de RNasa
Es un hecho reconocido que un compuesto oligómero puede funcionar por degradación no mediada por RNasa de un ARNm diana, tal como por impedimento estérico de la traducción, o por otros métodos, sin embargo, los 25 oligómeros preferidos de la invención son capaces de reclutar na endorribonucleasa (RNasa), tal como una RNasa
H.
Es preferible que el oligómero, o la secuencia de nucleótidos contiguos, comprenda una región de al menos 6, tal como al menos 7 unidades de nucleótidos consecutivos, tal como al menos 8 o al menos 9 unidades (restos) de 30 nucleótidos consecutivos, incluyendo 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 nucleótidos consecutivos, que cuando esté en forma bicatenaria con el ARN complementario diana sea capaz de reclutar RNasa. La secuencia contigua que es capaz de reclutar RNasa puede ser la región B como se menciona en el contexto de un oligómero con huecos como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el tamaño de la secuencia contigua que es capaz de reclutar RNAsa, tal como la región B, puede ser mayor, tal como 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20
35 unidades de nucleótidos.
El documento EP 1222309 proporciona métodos in vitro para determinar la actividad de RNasaH, que se pueden usar para determinar la capacidad para reclutar RNasaH. Un oligómero se considera capaz de reclutar RNasaH si, cuando está provisto del ARN complementario diana, tiene una tasa inicial, medida en pmol/l/min de al menos 1%,
40 tal como al menos 5%, tal como al menos 10% o menor que 20% del único oligonucleótido de ADN equivalente, sin sustituciones en 2', con grupos de unión fosforotioato entre todos los nucleótidos en el oligonucleótido, usando la metodología proporcionada en los ejemplos 91-95 del documento EP 1222309.
En algunas realizaciones, un oligómero se considera esencialmente incapaz de reclutar RNasaH si, cuando está
45 provisto del ARN complementario diana, y RNasaH, la tasa inicial de RNasaH, medida en pmol/l/min, es menor que 1%, tal como menor que 5%, tal como menor que 10% o menor que 20% de la tasa inicial determinada usando el único oligonucleótido de ADN equivalente, sin sustituciones en 2', con grupos de unión fosforotioato entre todos los nucleótidos en el oligonucleótido, usando la metodología proporcionada en los ejemplos 91-95 del documento EP 1222309.
50 En otras realizaciones, un oligómero se considera capaz de reclutar RNasaH si, cuando está provisto del ARN complementario diana, y RNasaH, la tasa inicial de RNasaH, medida en pmol/l/min, es al menos 20%, tal como al menos 40%, tal como al menos 60%, tal como al menos 80% de la tasa inicial determinada usando el único oligonucleótido de ADN equivalente, sin sustituciones en 2', con grupos de unión fosforotioato entre todos los
55 nucleótidos en el oligonucleótido, usando la metodología proporcionada en los ejemplos 91-95 del documento EP
1222309.
Típicamente, la región del oligómero que forman las unidades de nucleótidos consecutivos, que cuando está en una forma bicatenaria con el ARN complementario diana es capaz de reclutar RNasa, consiste en unidades de 5 nucleótidos que forman una cadena bicatenaria de tipo ADN/ARN con el ARN diana, e incluye tanto unidades de ADN como unidades de LNA que están en la configuración alfa-L, siendo particularmente preferido alfa-L-oxi-LNA.
El oligómero de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que comprende tanto nucleótidos como análogos de nucleótidos, y puede estar en la forma de un oligómero con huecos (gapmer), un oligómero de cabeza (headmer) o un oligómero mixto (mixmer).
Un oligómero de cabeza se define por un tramo contiguo de análogos de nucleótidos que no reclutan RNasas en el extremo 5' seguido por un tramo contiguo de ADN o unidades de nucleótidos modificadas reconocibles y escindibles por la RNAsa hacia el extremo 3' (tal como al menos 7 de dichos nucleótidos), y un oligómero de cola (tailmer) se
15 define por un tramo contiguo de ADN o nucleótidos modificados reconocibles y escindibles por la RNasa en el extremo 5' (tal como al menos 7 de dichos nucleótidos), seguido por un tramo contiguo de análogos de nucleótidos que no reclutan RNasas hacia el extremo 3'. Otros oligómeros "quiméricos" de acuerdo con la invención, denominados oligómeros mixtos consisten en una composición alternada de ADN o nucleótidos modificados reconocibles y escindibles por la RNasa y análogos de nucleótidos que no reclutan RNasa. Algunos análogos de nucleótidos pueden ser capaces también de mediar la unión y escisión por RNasaH. Puesto que a-L-LNA recluta actividad de RNasaH en cierto grado, podrían requerirse huecos más pequeños de ADN o nucleótidos modificados reconocibles y escindibles por la RNasa para la construcción del oligómero con huecos, y podría introducirse más flexibilidad en la construcción del oligómero mixto.
25 Diseño del oligómero con huecos
Preferiblemente, el oligómero de la invención es un oligómero con huecos. Un oligómero con huecos es un oligómero que comprende un tramo contiguo de nucleótidos que es capaz de reclutar una RNasa, tal como RNasaH, tal como una región de al menos 6 ó 7 nucleótidos de ADN, denominada en el presente documento región B, en el que la región B está flanqueada tanto en 5' como en 3' por regiones de análogos de nucleótidos que potencian la afinidad, tal como entre 1 y 6 análogos de nucleótidos en 5' y 3' respecto al tramo de nucleótidos contiguos que es capaz de reclutar RNasa; estas regiones se denominan regiones A y C respectivamente.
Preferiblemente, el oligómero con huecos comprende una secuencia de (poli)nucleótidos de fórmula (de 5' a 3'), A-B
35 C, u opcionalmente A-B-C-D o D-A-B-C, en la que: la región A (región 5') consiste en o comprende al menos un análogo de nucleótido, tal como al menos una unidad de LNA, tal como entre 1-6 análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA; y la región B consiste en o comprende al menos 5 nucleótidos consecutivos que son capaces de reclutar RNasa (cuando está en forma bicatenaria con una molécula de ARN complementario, tal como el ARNm diana), tales como nucleótidos de ADN; y la región C (región 3') consiste en o comprende al menos un análogo de nucleótido, tal como al menos una unidad de LNA, tal como entre 1 y 6 análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA; y la región D, cuando está presente, consiste en o comprende 1, 2 ó 3 unidades de nucleótido, tales como nucleótidos de ADN.
En algunas realizaciones, la región A consiste en 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 análogos de nucleótidos, tales como unidades de
45 LNA, tal como entre 2-5 análogos de nucleótidos, tal como 2-5 unidades de LNA, tales como 3 ó 4 análogos de nucleótidos, tal como 3 ó 4 unidades de LNA; y/o la región C consiste en 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA, tal como 2- 5 análogos de nucleótidos, tal como 2-5 unidades de LNA, tal como 3 ó 4 análogos de nucleótidos, tal como 3 ó 4 unidades de LNA.
En algunas realizaciones, B consiste en o comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 nucleótidos consecutivos que son capaces de reclutar RNasa, o entre 6-10, o entre 7-9, tal como 8 nucleótidos consecutivos que son capaces de reclutar RNasa. En algunas realizaciones, la región B consiste en o comprende al menos una unidad de nucleótido de ADN, tal como 1-12 unidades de ADN, preferiblemente entre 4-12 unidades de ADN, más preferiblemente entre 6-10 unidades de ADN, tal como entre 7-10 unidades de ADN, y lo más preferiblemente 8, 9 ó 10 unidades de ADN.
55 En algunas realizaciones, la región A consiste en 3 ó 4 análogos de nucleótidos, tales como LNA, la región B consiste en 7, 8, 9 ó 10 unidades de ADN, y la región C consiste en 3 ó 4 análogos de nucleótidos, tales como LNA. Dichos diseños incluyen (A-B-C) 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3, y pueden incluir además la región D, que puede tener 1 ó 2 unidades de nucleótidos, tales como unidades de ADN.
Se describen diseños adicionales de oligómero con huecos en el documento WO 2004/046160.
La solicitud provisional de EE.UU. 60/977409, se refiere a oligómeros con huecos “cortos” (shortmer) que, en algunas realizaciones pueden ser el oligómero con huecos de acuerdo con la presente invención.
65 En algunas realizaciones, el oligómero consiste en una secuencia de nucleótidos contiguos de un total de 10, 11, 12, 13 ó 14 unidades de nucleótidos, en el que la secuencia de nucleótidos contiguos es de fórmula (5'-3'), A-B-C, u opcionalmente A-B-C-D o D-A-B-C, en las que: A consiste en 1, 2 ó 3 unidades de análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA; B consiste en 7, 8 ó 9 unidades de nucleótidos contiguos que son capaces de reclutar RNasa cuando están en forma bicatenaria con una molécula de ARN complementario (tal como un ARNm diana); y
5 C consiste en 1, 2 ó 3 unidades de análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA. Cuando está presenté, D consiste en una sola unidad de ADN.
En algunas realizaciones, A consiste en 1 unidad de LNA. En algunas realizaciones, A consiste en 2 unidades de LNA. En algunas realizaciones, A consiste en 3 unidades de LNA. En algunas realizaciones, C consiste en 1 unidad 10 de LNA. En algunas realizaciones, C consiste en 2 unidades de LNA. En algunas realizaciones, C consiste en 3 unidades de LNA. En algunas realizaciones, B consiste en 7 unidades de nucleótidos. En algunas realizaciones, B consiste en 8 unidades de nucleótidos. En algunas realizaciones, B consiste en 9 unidades de nucleótidos. En algunas realizaciones, B comprende entre 1-9 unidades de ADN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 unidades de ADN. En algunas realizaciones, B consiste en unidades de ADN. En algunas realizaciones, B comprende al menos una 15 unidad de LNA que está en la configuración alfa-L, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 unidades de LNA en la configuración alfa-L. En algunas realizaciones, B comprende al menos una unidad de alfa-L-oxi-LNA, o en las que todas las unidades de LNA en la configuración alfa-L son unidades de alfa-L-oxi-LNA. En algunas realizaciones, el número de nucleótidos presentes en A-B-C se selecciona del grupo que consiste en (unidades de análogos de nucleótidos - región B – unidades de análogos de nucleótidos): 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1,
20 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4; o 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-4; o, 1-10-1, 1-10-2, 2-10-1, 210-2, 1-10-3, 3-10-1. En algunas realizaciones, el número de nucleótidos en A-B-C se selecciona del grupo que consiste en: 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4 y 4-7-3. En algunas realizaciones, tanto A como C consisten en 2 unidades de LNA cada uno, y B consiste en 8 ó 9 unidades de nucleótidos, preferiblemente unidades de ADN.
Uniones internucleótidos
Las expresiones “grupo de unión” o “unión internucleótidos” se pretende que indiquen un grupo capaz de acoplar covalentemente entre sí dos nucleótidos, dos análogos de nucleótidos y un nucleótido y un análogo de nucleótido, 30 etc. Los ejemplos específicos y preferidos incluyen grupos fosfato y grupos fosforotioato.
El nucleótido del oligómero de la invención o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo están acoplados entre sí mediante grupos de unión. De forma adecuada, cada nucleótido está unido al nucleótido 3’ adyacente por un grupo de unión.
35 Las uniones internucleótidos adecuadas incluyen las listadas en el documento PCT/DK2006/000512. Por ejemplo, las uniones internucleótidos listadas en el primer párrafo de la página 34 del documento PCT/DK2006/000512.
En algunas realizaciones, se prefiere modificar la unión internucleótidos de su fosfodiéster normal a uno que es más 40 resistente al ataque de nucleasa, tal como fosforotioato o boranofosfato, siendo escindidos estos dos por RNasa H, y también permiten que la ruta de inhibición de sentido contrario reduzca la expresión del gen diana.
Pueden ser preferidas las uniones internucleótidos que contienen azufre (S) adecuadas. También son preferidas las uniones internucleótidos fosforotioato, en particular para la región de huecos (B) de los oligómeros con huecos. Las 45 uniones fosforotioato también se pueden usar para las regiones flanqueadoras (A y C, y para la unión de A o C a D, y dentro de la región D, según sea adecuado).
Sin embargo, las regiones A, B y C pueden comprender uniones internucleótidos distintas de fosforotioato, tales como uniones fosfodiéster, en particular, por ejemplo, cuando el uso de análogos de nucleótidos protege las uniones 50 internucleótidos dentro de las regiones A y C de la degradación por endonucleasa, tal como cuando las regiones A y C comprenden nucleótidos de LNA.
Las uniones internucleótidos en el oligómero pueden ser fosfodiéster, fosforotioato o boranofosfato, para así permitir la escisión por RNasa H del ARN diana. Se prefiere el fosforotioato, para la mejor resistencia a nucleasas y otras 55 razones, tales como la facilidad de fabricación.
En un aspecto del oligómero de la invención, los nucleótidos y/o análogos de nucleótidos están unidos entre sí mediante grupos fosforotioato.
60 Se reconoce que la inclusión de uniones fosfodiéster, tal como 1 ó 2 uniones, en un oligómero por lo demás con fosforotioato, en particular entre o adyacente a unidades de análogos de nucleótidos (típicamente en la región A y/o C) puede modificar la biodisponibilidad y/o biodistribución de un oligómero, véase el documento WO 2008/053314.
En algunas realizaciones, tales como las realizaciones mencionadas antes, cuando sea adecuado y no se indique 65 específicamente, todos los demás grupos de unión son fosfodiéster o fosforotioato, o una mezcla de los mismos.
En algunas realizaciones, todos los grupos de uniones internucleótidos son fosforotioato. Cuando se hace referencia a secuencias de oligonucleótidos de oligómeros con huecos específicas, tales como las proporcionadas en el presente documento, se entenderá que, en diferentes realizaciones, cuando las uniones son uniones fosforotioato, se pueden usar uniones alternativas, tales como las descritas en el presente documento, por ejemplo, se pueden
5 usar uniones fosfato (fosfodiéster), en particular para uniones entre análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA. Igualmente, cuando se hace referencia a secuencias de oligonucleótidos de oligómeros con huecos específicas, tales como las proporcionadas en el presente documento, cuando los retos C están indicados como citosina modificada con 5’-metilo, en diferentes realizaciones, una o más de las C presentes en el oligómero pueden ser restos C no modificados, en algunas realizaciones.
Compuestos oligómeros
Los oligómeros de la descripción se pueden seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en: 22-43 y 44 a 80.
15 Conjugados
En el contexto de esta descripción, el término "conjugado" indica una molécula heterogénea formada por la unión covalente ("conjugación") del oligómero como se describe en el presente documento a uno más restos no nucleótidos o no polinucleótidos. Los ejemplos de los restos no nucleótidos o no polinucleótidos incluyen agentes
20 macromoleculares tales como proteínas, cadenas de ácidos grasos, restos de azúcar, glucoproteínas, polímeros, o combinaciones de los mismos. Las proteínas típicamente pueden ser anticuerpos para una proteína diana. Los polímeros típicos pueden ser polietilenglicol.
Por consiguiente, en diversas realizaciones, el oligómero de la invención puede comprender tanto una región de
25 polinucleótido, que consiste típicamente en una secuencia de nucleótidos contiguos, como una región adicional de no nucleótidos. Cuando se hace referencia al oligómero de la invención que consiste en una secuencia de nucleótidos contiguos, el compuesto pude comprender componentes no nucleótidos, tales como un componente conjugado.
30 En diferentes realizaciones de la invención, el compuesto oligómero está unido a ligandos/conjugados, que se pueden usar, por ejemplo para aumentar la absorción celular de compuestos oligómeros. El documento WO 2007/031091 proporciona ligandos y conjugados adecuados.
La invención proporciona también un conjugado que comprende el compuesto de acuerdo con la invención como se
35 describe en el presente documento, y al menos un resto no nucleótido o no polinucleótido unido covalentemente a dicho compuesto. Por tanto, en diferentes realizaciones en las que el compuesto de la invención consiste en una secuencia especificada de nucleótidos o ácido nucleico, como se describe en el presente documento, el compuesto también puede comprender al menos un resto no nucleótido o no polinucleótido (por ejemplo que no comprende uno
o más nucleótidos o análogos de nucleótidos) unido covalentemente a dicho compuesto.
40 La conjugación (con un resto conjugado) puede potenciar la actividad, la distribución celular o la absorción celular del oligómero de la invención. Dichos restos incluyen, pero no se limitan a anticuerpos, polipéptidos, restos lipídicos tales como un resto colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo hexil-s-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo dodecanodiol o residuos undecilo, un fosfolípido, por ejemplo di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di
45 o-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, un ácido adamantano-acético, un resto palmitilo, un resto octadecilamina o resto hexilamino-carbonil-oxicolesterol.
Los oligómeros de la invención también se pueden conjugar con sustancias fármaco activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.
50 En algunas realizaciones, el resto conjugado es un esterol, tal como colesterol.
En diferentes realizaciones, el resto conjugado comprende o consiste en un polímero cargado positivamente, tal como péptidos cargados positivamente de, por ejemplo, entre 1 - 50, tales como 2 - 20, tal como 3 - 10 restos de
55 aminoácido de longitud, y/o un poli(óxido de alquileno) tal como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol - véase el documento WO 2008/034123. Adecuadamente, el polímero con carga positiva, tal como un poli(óxido de alquileno) puede estar unido al oligómero de la invención por un conector tal como el conector liberable descrito en el documento WO 2008/034123.
60 A modo de ejemplo, se pueden usar los siguientes restos de conjugados en los conjugados de la invención:
Oligómeros activados
5 La expresión "oligómero activado", como se usa en el presente documento, se refiere a un oligómero de la invención que está unido covalentemente (es decir, funcionalizado) a al menos un resto funcional que permite la unión covalente del oligómero a uno o más restos conjugados, es decir, restos que no son ellos mismos ácidos nucleicos o monómeros, para formar los conjugados descritos en el presente documento. Típicamente, un resto funcional comprenderá un grupo químico que es capaz de unirse covalentemente al oligómero por ejemplo por un grupo 3'
10 hidroxilo o el grupo NH2 exocíclico de la base adenina, un espaciador que es preferiblemente hidrófilo y un grupo terminal que es capaz de unirse a un resto conjugado (por ejemplo, un grupo amino, sulfhidrilo o hidroxilo). En algunas realizaciones, este grupo terminal no está protegido, por ejemplo, es un grupo NH2. En otras realizaciones, el grupo terminal está protegido, por ejemplo, por cualquier grupo protector adecuado tal como los descritos en "Protective Groups in Organic Synthesis" por Theodora W. Greene y Peter G.M. Wuts, 3ª edición (John Wiley &
15 Sons, 1999). Los ejemplos de grupos protectores de hidroxilo adecuados incluyen ésteres tales como éster acetato, grupos aralquilo tales como bencilo, difenilmetilo, o trifenilmetilo, y tetrahidropiranilo. Los ejemplos de grupos protectores de amino adecuados incluyen bencilo, alfa-metilbencilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, benciloxicarbonilo, terc-butoxicarbonilo, y grupos acilo tales como tricloroacetilo o trifluoroacetilo. En algunas realizaciones, el resto funcional es autoescindible. En otras realizaciones, el resto funcional es biodegradable. Véase, por ejemplo, la
20 patente de EE.UU. nº 7.087.229.
En algunas realizaciones, los oligómeros de la invención están funcionalizados en el extremo 5' con el fin de permitir la unión covalente del resto conjugado al extremo 5' del oligómero. En otras realizaciones, los oligómeros de la invención pueden estar funcionalizados en el extremo 3'. En otras realizaciones más, los oligómeros de la invención
25 pueden estar funcionalizados a lo largo de la cadena principal o en el resto de la base heterocíclica. En otras realizaciones más, los oligómeros de la invención pueden estar funcionalizados en más de una posición seleccionada independientemente del extremo 5', el extremo 3', la cadena principal y la base.
En algunas realizaciones, los oligómeros activados de la invención se sintetizan por incorporación durante la síntesis
30 de uno o más monómeros que se unen covalentemente a un resto funcional. En otras realizaciones, los oligómeros activados de la invención se sintetizan con monómeros que no se han funcionalizado, y el oligómero se funcionaliza tras completarse la síntesis. En algunas realizaciones, los oligómeros se funcionalizan con un éster impedido que contiene un conector aminoalquilo, en el que la parte alquilo tiene la fórmula (CH2)w, en el que w es un número entero en el intervalo de 1 a 10, preferiblemente aproximadamente 6, en el que la parte alquilo del grupo alquilamino
35 puede ser de cadena lineal o cadena ramificada, y en el que el grupo funcional está unido al oligómero por un grupo éster (-O-C (O)-(CH2)wNH).
En otras realizaciones, los oligómeros están funcionalizados con un éster impedido que contiene un conector (CH2)wsulfhidrilo (SH), en el que w es un número entero en el intervalo de 1 a 10, preferiblemente aproximadamente 6, en
40 el que la parte alquilo del grupo alquilamino puede ser de cadena lineal o de cadena ramificada, y en el que el grupo funcional está unido al oligómero por un grupo éster (-O-C(O)-(CH2)wSH).
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos activados con sulfhidrilo están conjugados con restos polímeros tales como polietilenglicol o péptidos (por formación de un enlace disulfuro).
45 Los oligómeros activados que contienen ésteres impedidos como se ha descrito antes se pueden sintetizar por cualquier método conocido en la materia, y en particular por los métodos descritos en la publicación PCT nº WO 2008/034122 y los ejemplos en la misma.
50 En otras realizaciones más, los oligómeros de la invención se funcionalizan introduciendo grupos sulfhidrilo, amino o hidroxilo en el oligómero mediante un reactivo de funcionalización sustancialmente como se describe en las patentes de EE.UU. nº 4.962.029 y 4.914.210, es decir, un reactivo sustancialmente lineal que tiene una fosforamidita en un extremo unida a través de una cadena espaciadora hidrófila al extremo opuesto que comprende un grupo sulfhidrilo, amino o hidroxilo protegido o no protegido. Dichos reactivos reaccionan en primer lugar con los grupos hidroxilo del
55 oligómero. En algunas realizaciones, dichos oligómeros activados tienen un reactivo de funcionalización acoplado a un grupo 5'-hidroxilo del oligómero. En otras realizaciones, los oligómeros activados tienen un reactivo de funcionalización acoplado a un grupo 3'-hidroxilo. En otras realizaciones más, los oligómeros activados de la invención tienen un reactivo de funcionalización acoplado a un grupo hidroxilo en la cadena principal del oligómero. En otras realizaciones más, el oligómero de la invención se funcionaliza con más de uno de los reactivos de funcionalización como se describen en las patentes de EE.UU. nº 4.962.029 y 4.914.210. Se describen métodos de
5 síntesis de dichos reactivos de funcionalización e incorporación de los mismos en monómeros u oligómeros en las patentes de EE.UU. nº 4.962.029 y 4.914.210.
En algunas realizaciones, el extremo 5' de un oligómero unido en fase sólida se funcionaliza con un derivado de dienil-fosforamidita, seguido de conjugación del oligómero desprotegido con, por ejemplo un aminoácido o péptido por una reacción de cicloadición de Diels-Alder.
En diferentes realizaciones, la incorporación de monómeros que contienen modificaciones del azúcar en 2', tales como un azúcar sustituido con 2'-carbamato o un azúcar 2'-(O-pentil-N-ftalimido)-desoxirribosa en el oligómero facilita la unión covalente de restos conjugados a los azúcares del oligómero. En otras realizaciones, se prepara un
15 oligómero con un conector que contiene amino en la posición 2' de uno o más monómeros usando un reactivo tal como, por ejemplo, 5'-dimetoxitritil-2'-O-(e-ftalimidilaminopentil)-2'-desoxiadenosina-3'-N,N-diisopropil-cianoetoxifosforamidita. Véase, por ejemplo, Manoharan, y col., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171.
En otras realizaciones más, los oligómeros de la invención pueden tener restos funcionales que contienen amina en la base nitrogenada, incluyendo en los grupos amino N6 de la purina, en el N2 exocíclico de la guanina, o en las posiciones N4 ó 5 de la citosina. En diferentes realizaciones, dicha funcionalización se puede conseguir usando en la síntesis del oligómero un reactivo comercial que está ya funcionalizado.
Algunos restos funcionales están disponibles en el comercio, por ejemplo, están disponibles restos de unión
25 heterobifuncionales y homobifuncionales en Pierce Co. (Rockford, Ill.). Otros grupos de unión disponibles en el comercio son los reactivos 5'-Amino-Modifier C6 y 3'-Amino-Modifier, ambos disponibles en Glen Research Corporation (Sterling, Va.). El reactivo 5'-Amino-Modifier C6 está disponible también en ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.) como Aminolink-2, y 3'-Amino-Modifier está disponible también de Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.).
Composiciones
El oligómero de la invención se puede usar en formulaciones y composiciones farmacéuticas. Adecuadamente, dichas composiciones comprenden un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable. El
35 documento PCT/DK2006/000512 proporciona diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables adecuados y preferidos. Las dosis, formulaciones, vías de administración, composiciones, formas farmacéuticas, combinaciones con otros agentes terapéuticos, y formulaciones de profármaco adecuados se proporcionan también en PCT/DK2006/000512.
Aplicaciones
Los oligómeros de la invención se pueden usar como reactivos de investigación, por ejemplo, para diagnósticos, terapéutica y profilaxis.
45 En investigación, dichos oligómeros se pueden usar para inhibir específicamente la síntesis de la proteína del receptor de andrógenos (típicamente por degradación o inhibición del ARNm y de esta forma prevención de la formación de la proteína) en células y animales experimentales, facilitando así el análisis funcional de la diana o una evaluación de su utilidad como diana para intervención terapéutica.
En diagnóstico, los oligómeros se pueden usar para detectar y cuantificar la expresión del receptor de andrógenos en células y tejidos por transferencia Northern, hibridación in situ o técnicas similares.
Para terapéutica, un animal o un ser humano, que se sospecha que tienen una enfermedad o trastorno que se puede tratar por modulación de la expresión del receptor de andrógenos, se trata por administración de compuestos
55 de sentido contrario de acuerdo con esta invención, adecuadamente en una cantidad eficaz. Se proporcionan además métodos de tratamiento de un mamífero, tal como el tratamiento de un ser humano, que se sospecha que tiene o es propenso a una enfermedad o afección asociada con la expresión del receptor de andrógenos, por administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más oligómeros o composiciones de la invención.
La composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede usar para el tratamiento de afecciones asociadas con niveles anómalos del receptor de andrógenos, tal como cáncer, tal como cáncer de próstata o de mama.
65 La composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede usar para el tratamiento de la alopecia, hiperplasia prostática benigna, atrofia espinal y muscular y enfermedad de Kennedy, o enfermedad relacionada con poliglutamato.
Se reconocerá que el tratamiento mencionado en el presente documento puede ser profiláctico.
5 Las dosificaciones, formulaciones, vías de administración, composiciones, formas farmacéuticas, combinaciones con otros agentes terapéuticos, y formulaciones de profármaco adecuados se proporcionan también en el documento PCT/DK2006/000512, aunque hay que reconocer que los aspectos de PCT/DK2006/000512 que solo son aplicables específicamente al tratamiento del cáncer, pueden no ser adecuados en las composiciones terapéuticas/farmacéuticas y métodos de la presente descripción.
10 La descripción también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto o un conjugado como se describe en el presente documento, o un conjugado y diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables. El documento PCT/DK2006/000512 proporciona diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables adecuados y preferidos.
15 El oligómero, un conjugado o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se administran típicamente en una cantidad eficaz.
La invención también proporciona el uso del compuesto o conjugado de la descripción como se describe para la 20 fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno como se menciona en el presente documento, o para un método para el tratamiento de un trastorno como se menciona en el presente documento.
La descripción también proporciona un método para tratar un trastorno como se menciona en el presente documento, comprendiendo dicho método administrar un compuesto de acuerdo con la invención como se describe 25 en el presente documento, y/o un conjugado de acuerdo con la invención y/o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, a un paciente que lo necesite.
Composición farmacéutica que comprende más de un principio activo
30 La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede comprender además otros principios activos incluyendo los que se indican como útiles para el tratamiento del cáncer, tal como cáncer de próstata o cáncer de mama, en particular agentes usados en terapia antiandrógenos convencional.
Una de dichas clases de compuestos son los antiandrógenos no esteroideos (NSAA), que bloquean la unión de 35 andrógenos en el sitio del receptor.
Los análogos de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH-A) suprimen la producción testicular de andrógenos a niveles de castración.
40 Los NSAA, tales como CASODEX, cuando se usan con un LHRH-A como parte de una terapia de bloqueo combinado de andrógenos, ayudan a inhibir el crecimiento de células de cáncer de próstata. En una realización, la presente descripción proporciona una terapia de bloqueo combinado de andrógenos, caracterizada porque la terapia comprende administrar la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, y un agente NSAA y/o LHRH-A, que se puede administrar antes, durante o después de la administración de la composición farmacéutica de la
45 invención.
La descripción también proporciona un kit de partes en la que una primera parte comprende el oligómero, el conjugado y/o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención y una parte adicional comprende el antiandrógeno no esteroideo y/o un análogo de hormona liberadora de la hormona luteinizante. Por lo tanto, se
50 prevé que el kit de partes se puede usar en un método de tratamiento, como se menciona en el presente documento, donde el método comprende administrar tanto la primera parte como la parte adicional, sea de forma simultánea o una después de otra.
Indicaciones médicas
55 Los oligómeros y otras composiciones de acuerdo con la invención se pueden usar para el tratamiento de afecciones asociadas con el exceso de expresión o la expresión de una versión mutada del AR. Científicos destacados en el campo han sugerido que la intervención farmacéutica con AR dará lugar a opciones terapéuticas contra el cáncer de próstata o de mama.
60 Afecciones adicionales que se pueden asociar con niveles anómalos del receptor de andrógenos, y que por lo tanto se pueden tratar usando las composiciones, conjugados y compuestos de acuerdo con la invención, incluyen trastornos seleccionados del grupo que consiste en cáncer tal como cáncer de mama o cáncer de próstata, alopecia, hiperplasia prostática benigna, atrofia espinal y muscular, enfermedad de Kennedy y enfermedad relacionada con
65 poliglutamato.
En una realización, las afecciones que se pueden asociar con niveles anómalos del receptor de andrógenos, y que por lo tanto se pueden tratar usando las composiciones, conjugados y compuestos de acuerdo con la invención, incluyen trastornos seleccionados del grupo que consiste en cáncer, tal como cáncer de mama o cáncer de próstata.
5 La descripción proporciona además el uso de un compuesto de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar todas y cada una de las afecciones descritas en el presente documento.
Expuesto en general, un aspecto de la descripción se dirige a un método de tratamiento de un mamífero que padece
o es susceptible de padecer afecciones asociadas con niveles anómalos del receptor de andrógenos, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligómero dirigido al AR que comprende una o más unidades de LNA.
Un aspecto interesante de la descripción se dirige al uso de un oligómero (compuesto) como se define en el presente documento, o como conjugado como se define en el presente documento, para preparar un medicamento
15 para el tratamiento de una afección de acuerdo con lo anterior.
Los métodos de la descripción se usan preferiblemente para el tratamiento o profilaxis contra enfermedades causadas por niveles anómalos del receptor de andrógenos.
Además, la descripción abarca un método para prevenir o tratar una enfermedad que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligómero modulador del receptor de andrógenos a un ser humano que necesite dicha terapia. La descripción comprende además el uso de un periodo corto de administración de un compuesto oligonucleótidos modulador del receptor de andrógenos.
25 En una realización de la invención, el oligómero (compuesto) está unido a un ligando o conjugado. Por ejemplo, con el fin de aumentar la absorción celular del oligómero, en algunas realizaciones el conjugado es un esterol, tal como colesterol.
Los oligómeros de la invención también se pueden conjugar con fármacos activos, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.
Expuesto de forma alternativa, la descripción se dirige además a un método para tratar niveles anómalos del receptor de andrógenos, comprendiendo dicho método administrar un oligómero de la invención, o un conjugado de la invención o una composición farmacéutica de la invención a un paciente que lo necesite, y comprendiendo
35 además la administración de un agente quimioterapéutico adicional. Dicha administración adicional puede ser tal que dicho agente quimioterapéutico adicional se conjuga con el compuesto de la invención, está presente en la composición farmacéutica o se administra en una formulación separada.
La invención también se refiere a un oligómero, una composición o un conjugado como se define en el presente documento, para usar como un medicamento.
La descripción se refiere además al uso de un compuesto, composición o un conjugado como se define en el presente documento, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de los niveles anómalos del receptor de andrógenos o expresión de formas mutantes del AR (tal como variantes alélicas, tales como las
45 asociadas con una o más de las enfermedades mencionadas en el presente documento).
Además, la descripción se refiere a un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o afección seleccionada de cáncer tal como cáncer de mama o cáncer de próstata, alopecia, hiperplasia prostática benigna, atrofia espinal y muscular, enfermedad de Kennedy y enfermedad relacionada con poliglutamato, comprendiendo el método la etapa de administrar una composición farmacéutica como se define en el presente documento al sujeto que lo necesite.
Además, la descripción se refiere a métodos de regulación de genes, y sus respectivos ARNm y productos de proteínas, que son modulados por el receptor de andrógenos (es decir, dianas del receptor de andrógenos) tales
55 como genes, ARNm y/o proteínas seleccionadas del grupo que consiste en proteína quinasa C-delta (PRKCD), glutatión S-transferasa zeta 2 (GSTT2), receptor de potencial transitorio de canal catiónico, subfamilia V, miembro 3 (TRPV3), pirrolina-5-carboxilato reductasa 1 (PYCR1) u ornitina aminotransferasa (OAT). Dependiendo del receptor de andrógenos diana, la modulación puede producir una mayor expresión o actividad del receptor de andrógenos diana o menor expresión o actividad.
Realizaciones
Las siguientes realizaciones de la presente descripción se pueden usar en combinación con otras realizaciones descritas en el presente documento.
1. Un oligómero de entre 10-50 bases nitrogenadas de longitud que comprende una secuencia de bases nitrogenadas contiguas de un total de entre 10-50 bases nitrogenadas, en el que dicha secuencia de bases nitrogenadas contiguas es al menos 80% homóloga a una región correspondiente de un ácido nucleico que codifica un receptor de andrógenos de mamífero.
5 2. El oligómero de acuerdo con la realización 1, en el que dicho oligómero comprende al menos una unidad de LNA.
3. El oligómero de acuerdo con la realización 1 ó 2, en el que la secuencia de bases nitrogenadas contiguas no comprende más de 3, tal como no más de 2 apareamientos erróneos con la correspondiente región de un ácido nucleico que codifica un receptor de andrógenos de mamífero.
4. El oligómero de acuerdo con la realización 3, en el que dicha secuencia de bases nitrogenadas contiguas no comprende más de un solo apareamiento erróneo con la correspondiente región de un ácido nucleico que codifica un receptor de andrógenos de mamífero.
15 5. El oligómero de acuerdo con la realización 4, en el que dicha secuencia de bases nitrogenadas contiguas no comprende apareamientos erróneos (es decir, es complementaria a) la correspondiente región de un ácido nucleico que codifica un receptor de andrógenos de mamífero.
6. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-5, en el que la secuencia de bases 20 nitrogenadas del oligómero consiste en la secuencia de bases nitrogenadas contiguas.
7. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-6, en el que el ácido nucleico que codifica un receptor de andrógenos de mamífero es la secuencia de nucleótidos del receptor de andrógenos humano tal como la SEQ ID No 1, o una variante alélica natural de la misma.
8. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-7, en el que la secuencia de bases nitrogenadas contiguas es complementaria a una región correspondiente tanto de la secuencia de ácido nucleico del receptor de andrógenos humano como de la secuencia de ácido nucleico del receptor de andrógenos de mamíferos no humanos, tal como la secuencia de ácido nucleico del receptor de andrógenos de ratón.
9. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 8, en el que la secuencia de bases nitrogenadas contiguas comprende una subsecuencia contigua de al menos 7 restos de bases nitrogenadas que, cuando está en una forma bicatenaria con el ARN diana del receptor de andrógenos complementario, es capaz de reclutar RNasaH.
10. El oligómero de acuerdo con la realización 9, en el que la secuencia de bases nitrogenadas contiguas comprende una subsecuancia contigua de al menos 8, al menos 9 o al menos 10 restos de bases nitrogenadas que, cuando está en una forma bicatenaria con el ARN diana del receptor de andrógenos complementario, es capaz de reclutar RNasaH.
11. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 9 ó 10, en el que dicha subsecuencia contigua tiene al menos 9 o al menos 10 bases nitrogenadas de longitud, tal como al menos 12 bases nitrogenadas o al menos 14 bases nitrogenadas de longitud, tal como 14, 15 ó 16 restos de bases nitrogenadas que, cuando está en una forma bicatenaria con el ARN diana del receptor de andrógenos complementario, es capaz de reclutar RNasaH.
12. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-11, en el que dicho oligómero está conjugado con uno o más compuestos que no son bases nitrogenadas.
13. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-12, en el que dicho oligómero tiene una 50 longitud de entre 10-22 bases nitrogenadas.
14. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-13, en el que dicho oligómero tiene una longitud de entre 12-18 bases nitrogenadas.
55 15. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-14, en el que dicho oligómero tiene una longitud de 14, 15 ó 16 bases nitrogenadas.
16. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-15, en el que dicha secuencia de bases
nitrogenadas contiguas corresponde a una secuencia de nucleótidos contiguos presente en una secuencia de ácido 60 nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 86-106.
17. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-16, en el que el oligómero o la secuencia de bases nitrogenadas contiguas comprende, o se selecciona de una secuencia de bases nitrogenadas correspondiente presente en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO
65 2-22.
18.
El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-17, en el que dicha secuencia de bases nitrogenadas contiguas comprende al menos un análogo de nucleótido que potencia la afinidad.
19.
El oligómero de acuerdo con la realización 18, en el que dicha secuencia de bases nitrogenadas contiguas
5 comprende un total de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 análogos de nucleótidos que potencian la afinidad, tal como entre 5 y 8 análogos de nucleótidos que potencian la afinidad.
20.
El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-19, que comprende al menos un análogo de nucleótido que potencia la afinidad, en el que el resto de las bases nitrogenadas se seleccionan del grupo que consiste en nucleótidos de ADN y nucleótidos de ARN, preferiblemente nucleótidos de ADN.
21.
El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-20, en el que el oligómero comprende una secuencia de bases nitrogenadas de fórmula, en la dirección de 5’ a 3’, A-B-C y opcionalmente de fórmula A-B-C-D, en las que:
15 A consiste en o comprende al menos un análogo de nucleótido, tal como 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 análogos de nucleótidos, preferiblemente entre 2-5 análogos de nucleótidos, preferiblemente 2, 3 ó 4 análogos de nucleótidos, lo mas preferiblemente 2, 3 ó 4 análogos de nucleótidos consecutivos y:
B consiste en o comprende al menos 5 bases nitrogenadas consecutivas que son capaces de reclutar RNasaH (cuando está en forma bicatenaria con una molécula de ARN complementario, tal como el ARNm diana del AR), tal como bases nitrogenadas de ADN, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 bases nitrogenadas consecutivas que son capaces de reclutar RNasaH, o entre 6-10, o entre 7-9, tal como 8 bases nitrogenadas consecutivas que son capaces de reclutar RNAsaH, y
25 C consiste en o comprende al menos un análogo de nucleótido, tal como 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 análogos de nucleótidos, preferiblemente entre 2-5 análogos de nucleótidos, tal como 2, 3 ó 4 análogos de nucleótidos, lo más preferiblemente 2, 3 ó 4 análogos de nucleótidos consecutivos, y:
D cuando está presente, consiste en o comprende, preferiblemente consiste en uno o más nucleótidos de ADN, tal como entre 1-3 o 1-2 nucleótidos de ADN.
22. Los oligómeros de acuerdo con la realización 21, en los que la región A consiste en o comprende 2, 3 ó 4
análogos de nucleótidos consecutivos. 35
23.
El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 21-22, en el que la región B consiste en o comprende 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos de ADN consecutivos o bases nitrogenadas equivalentes, que son capaces de reclutar RNasaH cuando está en forma bicatenaria con un ARN complementario, tal como el ARNm diana del receptor de andrógenos.
24.
El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 21-23, en el que la región C consiste en o comprende 2, 3 ó 4 análogos de nucleótidos consecutivos.
25. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 21-24, en el que la región D consiste en, 45 cuando está presente, 1 ó 2 nucleótidos de ADN.
26. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 21-25, en el que:
A consiste en o comprende 3 análogos de nucleótidos contiguos;
B consiste en o comprende 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos de ADN contiguos o bases nitrogenadas equivalentes que son capaces de reclutar RNAsaH cuando está en una forma bicatenaria con un ARN complementario, tal como el ARNm diana del receptor de andrógenos;
55 C consiste en o comprende 3 análogos de nucleótidos contiguos;
D consiste en, cuando está presente, 1 ó 2 nucleótidos de ADN.
27. El oligómero de acuerdo con la realización 26, en el que la secuencia de bases nitrogenadas contiguas consiste en 10, 11, 12, 13 ó 14 bases nitrogenadas, y en el que;
A consiste en 1, 2 ó 3 análogos de nucleótidos contiguos;
B consiste en 7, 8 ó 9 nucleótidos de ADN contiguos o bases nitrogenadas equivalentes que son capaces de reclutar
65 RNAsaH cuando están en forma bicatenaria con un ARN complementario, tal como el ARNm diana del receptor de andrógenos;
C consiste en 1, 2 ó 3 análogos de nucleótidos contiguos;
D consiste en, cuando está presente, 1 nucleótido de ADN. 5
28.
El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 21-27, en el que B comprende al menos una base nitrogenada de LNA que está en la configuración alfa-L, tal como alfa-L-oxi-LNA.
29.
El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-28, en el que el o los análogos de nucleótidos
10 se seleccionan independiente o colectivamente del grupo que consiste en: unidades de ácido nucleico bloqueado (LNA); unidades de 2’-O-alquil-ARN; unidades de 2’-OMe-ARN, unidades de 2’-amino-ADN, unidades de 2’-fluoro-ADN, unidades de PNA, unidades de HNA y unidades de INA.
30. El oligómero de acuerdo con la realización 29, en el que todos los análogos de nucleótidos son unidades de 15 LNA.
31. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-30, que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 unidades de LNA, tal como entre 2 y 8 unidades de nucleótidos de LNA.
20 32. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 29-31, en el que los LNA se seleccionan independientemente de oxi-LNA, tio-LNA, y amino-LNA, en cualquiera de las configuraciones beta-D y alfa-L, o combinaciones de las mismas.
33. El oligómero de acuerdo con la realización 32, en el que los LNA son todos beta-D-oxi-LNA. 25
34.
El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 21-33, en el que los análogos de nucleótidos o bases nitrogenadas de las regiones A y C son beta-D-oxi-LNA.
35.
El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-34, en el que al menos una de las bases
30 nitrogenadas presente en el oligómero es una base nitrogenada modificada seleccionada del grupo que consiste en 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina, y 2-cloro-6-aminopurina.
36. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-35, en el que dicho oligómero hibrida con un 35 ARNm de receptor de andrógenos de mamífero correspondiente con una Tm de al menos 50 ºC.
37. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-36, en el que dicho oligómero hibrida con un ARNm de receptor de andrógenos de mamífero correspondiente con una Tm no superior a 80 ºC.
40 38. El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-37, en el que las uniones internucleósidos se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: fosfodiéster, fosforotioato y boranofosfato.
39. El oligómero de acuerdo con la realización 38, en el que el oligómero comprende al menos una unión
internucleósidos fosforotioato. 45
40. El oligómero de acuerdo con la realización 39, en el que la unión internucleósidos adyacente a o entre unidades de ADN o ARNm o en la región B, son uniones fosforotioato.
41. El oligómero de acuerdo con la realización 39 ó 40, en el que las uniones entre al menos un par de análogos de 50 nucleótidos consecutivos es una unión fosfodiéster.
42. El oligómero de acuerdo con la realización 39 ó 40, en el que todas las uniones entre análogos de nucleótidos consecutivos son uniones fosfodiéster.
55 43. El oligómero de acuerdo con la realización 42, en el que todas las uniones internucleósidos son uniones fosforotioato.
44. Un conjugado que comprende el oligómero de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-43 y al menos
un restos no nucleótido o no polinucleótido unido covalentemente a dicho compuesto. 60
45. Una composición farmacéutica que comprende un oligómero como se define en cualquiera de las realizaciones 1-43, o un conjugado como se define en la realización 44, y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
65 46. Una composición farmacéutica de acuerdo con 45, en la que el oligómero está constituido como un profármaco.
47. Una composición farmacéutica de acuerdo con la realización 45 ó 46, que además comprende un agente terapéutico adicional seleccionado del grupo que consiste en: antiandrógenos no esteroideos y análogos de la hormona liberadora de hormona luteinizante.
5 48. Uso de un oligómero como se define en una cualquiera de las realizaciones 1-43, o un conjugado como se define en la realización 44, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en: cáncer tal como cáncer de mama o cáncer de próstata, alopecia, hiperplasia prostática benigna, atrofia espinal y muscular, enfermedad de Kennedy y enfermedad relacionada con poliglutamato.
49. Un oligómero como se define en una cualquiera de las realizaciones 1-43, o un conjugado como se define en la realización 44, para usar en el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en: cáncer tal como cáncer de mama o cáncer de próstata, alopecia, hiperplasia prostática benigna, atrofia espinal y muscular, enfermedad de Kennedy y enfermedad relacionada con poliglutamato.
50.
Un método para tratar una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en:
cáncer tal como cáncer de mama o cáncer de próstata, alopecia, hiperplasia prostática benigna, atrofia espinal y muscular, enfermedad de Kennedy y enfermedad relacionada con poliglutamato, comprendiendo dicho método administrar un oligómero como se ha definido en una de las realizaciones 1-43, o un conjugado como se ha definido en la realización 44, o una composición farmacéutica como se ha definido en una cualquiera de las realizaciones 4547, a un paciente que lo necesite.
51.
Un método para tratar un cáncer tal como cáncer de próstata o cáncer de mama, comprendiendo dicho método
25 administrar un oligómero como se ha definido en una de las realizaciones 1-43, o un conjugado como se ha definido en la realización 44, o una composición farmacéutica como se ha definido en una cualquiera de las realizaciones 4547, a un paciente que lo necesite.
52. Un método para reducir o inhibir la expresión de receptor de andrógenos en una célula o un tejido, comprendiendo el método la etapa de poner en contacto dicha célula o tejido con un compuesto como se ha definido en una de las realizaciones 1-43, o un conjugado como se ha definido en la realización 44, o una composición farmacéutica como se ha definido en una cualquiera de las realizaciones 45-47, de modo que se reduce o inhibe la expresión del receptor de andrógenos.
35 Un método para modular la expresión de un gen que es regulado por el receptor de andrógenos (es decir, un receptor de andrógenos diana) en una célula que expresa dicho gen, comprendiendo dicho método la etapa de poner en contacto dicha célula o tejido con un compuesto como se ha definido en una de las realizaciones 1-43, o un conjugado como se ha definido en la realización 44, o una composición farmacéutica como se ha definido en una cualquiera de las realizaciones 45-47, de modo que se modula la expresión del receptor de andrógenos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Síntesis de monómero
45 Los bloques estructurales de monómeros del LNA y derivados se prepararon siguiendo procedimientos publicados y referencias citadas en los mismos; véase el documento WO 07/031081 y las referencias citadas en el mismo.
Ejemplo 2: Síntesis de oligonucleótidos
Los oligonucleótidos se sintetizaron de acuerdo con el método descrito en el documento WO 07/031081. La tabla 1 muestra ejemplos de secuencias de oligonucleótidos de sentido contrario de la descripción. Las tablas 2 y 3 muestran ejemplos de oligonucleótidos (oligos) de sentido contrario de la descripción.
Ejemplo 3: Diseño de oligonucleótidos
55 De acuerdo con la presente invención, se diseñaron una serie de oligonucleótidos diferentes para dirigirse a diferentes regiones del ARNm del receptor de andrógenos humano (número de acceso en GenBank NM_000044, SEQ ID NO: 1).
Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos de sentido contrario de la descripción: Las SEQ ID NOS: 2-22 son secuencias de oligos diseñadas para dirigirse al ARNm del receptor de andrógenos humano.
SEQ ID NO
Secuencia (5'-3') Longitud (bases) Sitio diana NM_000044
SEQ ID NO: 2
GAGAACCATCCTCACC 16 1389-1404
SEQ ID NO: 3
GGACCAGGTAGCCTGT 16 1428-1443
SEQ ID NO: 4
CCCCTGGACTCAGATG 16 1881-1896
SEQ ID NO: 5
GCACAAGGAGTGGGAC 16 1954-1969
SEQ ID NO: 6
GCTGTGAAGAGAGTGT 16 2422-2437
SEQ ID NO: 7
TTTGACACAAGTGGGA 16 2663-2678
SEQ ID NO: 8
GTGACACCCAGAAGCT 16 2813-2828
SEQ ID NO: 9
CATCCCTGCTTCATAA 16 2975-2990
SEQ ID NO: 10
ACCAAGTTTCTTCAGC 16 3008-3023
SEQ ID NO: 11
CTTGGCCCACTTGACC 16 3263-3278
SEQ ID NO: 12
TCCTGGAGTTGACATT 16 3384-3399
SEQ ID NO: 13
CACTGGCTGTACATCC 16 3454-3469
SEQ ID NO: 14
CATCCAAACTCTTGAG 16 3490-3505
SEQ ID NO: 15
GCTTTCATGCACAGGA 16 3529-3544
SEQ ID NO: 16
GAAGTTCATCAAAGAA 16 3594-3609
SEQ ID NO: 17
AGTTCCTTGATGTAGT 16 3616-3631
SEQ ID NO: 18
TTGCACAGAGATGATC 16 3809-3824
SEQ ID NO: 19
GATGGGCTTGACTTTC 16 3845-3860
SEQ ID NO: 20
CAGGCAGAAGACATCT 16 3924-3939
SEQ ID NO: 21
CCCAAGGCACTGCAGA 16 3960-3975
SEQ ID NO: 22
GCTGACATTCATAGCC 16 3114-3129
SEQ ID NO: 86
TGGGGAGAACCATCCTCACCCTGC 24 1385-1408
SEQ ID NO: 87
TCCAGGACCAGGTAGCCTGTGGGG 24 1424-1447
SEQ ID NO: 88
TGTTCCCCTGGACTCAGATGCTCC 24 1877-1990
SEQ ID NO: 89
TGGGGCACAAGGAGTGGGACGCAC 24 1950-1973
SEQ ID NO: 90
TTCGGCTGTGAAGAGAGTGTGCCA 24 2418-2441
SEQ ID NO: 91
CGCTTTTGACACAAGTGGGACTGG 24 2659-2682
SEQ ID NO: 92
CATAGTGACACCCAGAAGCTTCAT 24 2809-2832
SEQ ID NO: 93
GAGTCATCCCTGCTTCATAACATT 24 2971-2994
SEQ ID NO: 94
GATTACCAAGTTTCTTCAGCTTCC 24 3004-3027
SEQ ID NO: 95
AGGCCTTGGCCCACTTGACCACGT 24 3259-3282
SEQ ID NO: 96
AGCATCCTGGAGTTGACATTGGTG 24 3380-3403
SEQ ID NO: 97
GACACACTGGCTGTACATCCGGGA 24 3450-3473
SEQ ID NO: 98
GAGCCATCCAAACTCTTGAGAGAG 24 3486-3509
SEQ ID NO: 99
CAGTGCTTTCATGCACAGGAATTC 24 3525-3548
SEQ ID NO: 100
ATTCGAAGTTCATCAAAGAATTTT 24 3590-3613
SEQ ID NO: 101
ATCGAGTTCCTTGATGTAGTTCAT 24 3612-3635
SEQ ID NO: 102
GCACTTGCACAGAGATGATCTCTG 24 3805-3828
SEQ ID NO: 103
AATAGATGGGCTTGACTTTCCCAG 24 3841-3864
SEQ ID NO: 104
ATAACAGGCAGAAGACATCTGAAA 24 3920-3943
SEQ ID NO: 105
ATTCCCCAAGGCACTGCAGAGGAG 24 3956-3979
SEQ ID NO: 106
ATGGGCTGACATTCATAGCCTTCA 24 3110-3133
unidades de análogos de nucleótidos y el subíndice “s” representa unión fosforotioato. Las letras minúsculas representan unidades de nucleótidos. La ausencia de “s” (si hay) indica enlace fosfodiéster.
SEQ ID NO
Secuencia (5'-3')
SEQ ID NO: 23
5'-G·SA·SG·Sa·Sa·Sc·Sc·Sa·St·Sc·Sc·St·Sc·ST·SA·SC·SC-3'
SEQ ID NO: 24
5'-G·SG·SA·Sc·Sc·Sa·Sg·Sg·St·Sa·Sg·Sc·Sc·ST·SG·ST-3'
SEQ ID NO: 25
5'-C·SCSC·SC·St·Sg·Sg·Sa·Sc·St·Sc·Sa·Sg·SA·ST·SG-3'
SEQ ID NO: 26
5'-G·SC·SA·Sc·Sa·Sa·Sg·Sg·Sa·Sg·St·Sg·Sg·SG·SA·SC-3'
SEQ ID NO: 27
5'-G·SC·ST·Sg·St·Sg·Sa·Sa·Sg·Sa·Sg·Sa·Sg·ST·SG·ST-3'
SEQ ID NO: 28
5'-T·ST·ST·Sg·Sa·Sc·Sa·Sc·Sa·Sa·Sg·St·Sg·SG·SG·SA-3'
SEQ ID NO: 29
5'-G·ST·SG·Sa·Sc·Sa·Sc·Sc·Sc·Sa·Sg·Sa·Sa·SG·SG·ST-3'
SEQ ID NO: 30
5'-C·SA·ST·Sc·Sc·Sc·St·Sg·Sc·St·St·Sc·Sa·ST·SA·SA-3'
SEQ ID NO: 31
5'-A·SC·SC·Sa·Sa·Sg·St·St·St·Sc·St·St·Sc·SA·SG·SC-3'
SEQ ID NO: 32
5'-C·ST·ST·Sg·Sg·Sc·Sc·Sc·Sa·Sc·St·St·Sg·SA·SC·SC-3'
SEQ ID NO: 33
5'-T·SC·SC·St·Sg·Sg·Sa·Sg·St·St·Sg·Sa·Sc·SA·ST·ST-3'
SEQ ID NO: 34
5'-C·SA·SC·St·Sg·Sg·Sc·StSg·St·Sa·ST·SC·SC-3'
SEQ ID NO: 35
5'-C·SA·ST·Sc·Sc·Sa·Sa·Sa·St·Sc·St·St·SG·SA·SG-3'
SEQ ID NO: 36
5'-G·SC·ST·St·St·Sc·Sa·St·Sg·Sc·Sa·Sc·Sa·SG·SG·SA-3'
SEQ ID NO: 37
5'-G·SA·SA·Sg·St·St·Sc·Sa·St·Sc·Sa·Sa·Sa·SG·SA·SA-3'
SEQ ID NO: 38
5'-A·SG·ST·St·Sc·Sc·St·St·Sg·Sa·St·Sg·St·SA·SG·ST-3'
SEQ ID NO: 39
5'-T·ST·SG·Sc·Sa·Sc·Sa·Sg·Sa·Sg·Sa·St·Sg·SA·ST·SC-3'
SEQ ID NO: 40
5'-G·SA·ST·Sg·Sg·Sg·Sc·St·St·Sg·Sa·Sc·St·ST·ST·SC-3'
SEQ ID NO: 41
5'-C·SA·SG·Sg·Sc·Sa·Sg·Sa·Sa·Sg·Sa·Sc·Sa·ST·SC·ST·ST-3'
SEQ ID NO: 42
5'-C·SC·SC·Sa·Sa·Sg·Sg·Sc·Sa·Sc·St·Sg·Sc·SA·SG·SA-3'
SEQ ID NO: 43
5'-GSCS TSgS aScS aS tS tS cS aS tS aS GS GS CS C-3'
Ejemplo 4: Modelo in vivo: Cultivo celular
5 El efecto de los oligonucleótidos de sentido contrario en la expresión del ácido nucleico diana se puede ensayar en cualquiera de una variedad de tipos de células, con la condición de que el ácido nucleico diana esté presente en niveles medibles. La diana puede ser expresada de forma endógena o por transfección transitoria o estable de un ácido nucleico que codifica dicha diana. El nivel de expresión del ácido nucleico diana se puede determinar de forma
10 rutinaria usando, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, PCR en tiempo real, ensayos de protección de ribonucleasa. Los siguientes tipos de células se proporcionan con propósito ilustrativo, pero se pueden usar de forma rutinaria otros tipos de células, con la condición de que la diana sea expresada en el tipo de célula elegido.
Las células se cultivaron en medio adecuado como se describe más adelante, y se mantuvieron a 37 ºC con 95-98 15 % de humedad y 5 % de CO2. Se hicieron pases de las células de forma rutinaria 2-3 veces por semana.
A549 La línea de células de cáncer de pulmón humano A5439 se cultivó en DMEM (Sigma) + suero bovino fetal al 10 % (FBS) + Glutamax I 2 mM + gentamicina (25 μg/ml).
20 MCF7 La línea de células de cáncer de mama humano MCF7 se cultivó en EagleMEM (Sigma) + suero bovino fetal al 10 % (FBS) + Glutamax I 2 mM + 1xNEAA + gentamicina (25 μg/ml).
Ejemplo 5: Modelo in vitro: Tratamiento con oligonucleótido+ de sentido contrario
25 Las líneas celulares listadas en el ejemplo 4 se trataron con oligonucleótido usando la formulación de liposoma catiónico LipofectAMINE 2000 (Gibco) como vehículo de transfección. Las células se sembraron en placas de cultivo celular de 6 pocillos (NUNC) y se trataron hasta 80-90% de confluencia. Las concentraciones de oligos usadas estaban en el intervalo de 1 nM a 16 nM de concentración final. La formulación de complejos de oligo-lípido se llevó a cabo esencialmente como describe el fabricante usando OptiMEM (Gibco) exento de suero y una concentración
30 final de lípido de LipofectAMINE 2000 5 μg/ml. Las células se incubaron a 37ºC durante 4 h y el tratamiento se detuvo por separación del medio de cultivo que contenía oligo. Las células se lavaron y se añadió medio que contenía suero. Después del tratamiento con oligo, las células se dejaron recuperar durante 20 h antes de recogerlas para analizar el ARN.
5 Ejemplo 6: Modelo in vitro: Extracción de ARN y síntesis de ADNc
Aislamiento de ARN total y síntesis de la primera cadena
El ARN total se extrajo de células transfectadas como se ha descrito antes y usando el kit Qiagen RNeasy (Qiagen nº de catálogo 74104) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La síntesis de la primera cadena se llevó a cabo usando los reactivos de transcriptasa inversa de Ambion de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para cada muestra se ajustaron 0,5 μg de ARN total a (10,8 μl) con H2O exenta de RNasa y se mezclaron con 2 μl de decámeros aleatorios (50 μM) y 4 μl de mezcla de dNTP (2,5 mM cada dNTP) y se calentaron a 70 °C durante 3
15 min, después de lo cual las muestras se enfriaron rápidamente sobre hielo. Después de enfriar las muestras sobre hielo, se añadieron a cada muestra 2 μl de 10x tampón RT, 1 μl de transcriptasa inversa MMLV (100 U/μl) y 0,25 μl de inhibidor de RNasa (10 U/μl), seguido de incubación a 42ºC durante 60 min, inactivación por calor de la enzima a 95ºC durante 10 min y después la muestra se enfrió a 4ºC.
Ejemplo 7: Modelo in vitro: Análisis de la inhibición por oligonucleótidos de la expresión del receptor de andrógenos por PCR en tiempo real
La modulación de sentido contrario de la expresión del receptor de andrógenos se puede ensayar en una variedad de formas conocidas en la materia. Por ejemplo, se pueden cuantificar los niveles de ARNm del receptor de
25 andrógenos, por ejemplo, por análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva, o PCR en tiempo real. Actualmente se prefiere la PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis del ARN se puede llevar a cabo en el ARN celular total o el ARNm.
Los métodos de aislamiento de ARN y análisis de ARN tales como el análisis de transferencia Northern son rutinarios en la materia, y se enseñan, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.
La (PCR) cuantitativa en tiempo real se puede llevar a cabo convenientemente usando el sistema de detección de PCR en tiempo real disponible en el comercio Multi-color, disponible en Applied Biosystem.
35 Análisis por PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm del receptor de andrógenos
El contenido de la muestra del ARNm del receptor de andrógenos se cuantificó usando el receptor de andrógenos humano ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagents (Applied Biosystems, nº de catálogo Hs00171172_m1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cantidad de ARNm de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se usó como control endógeno para la normalización de cualquier variación en la preparación de la muestra.
El contenido en la muestra de ARNm de GADPH humano se cuantificó usando la GADPH humana de ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagents (Applied Biosystems nº de catálogo 4310884E) de acuerdo con las
45 instrucciones del fabricante.
La PCR cuantitativa en tiempo real es una técnica bien conocida en la materia y se enseña, por ejemplo, en Heid y col. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994.
PCR en tiempo real: El ADNc a partir de la síntesis de la primera cadena llevada a cabo como se ha descrito en el ejemplo 6, se diluyó 2-20 veces, y se analizó por PCR cuantitativa en tiempo real usando Taqman 7500 FAST o 7900 FAST de Applied Biosystems. Los cebadores y la sonda se mezclaron con 2 x mezcla maestra para PCR Taqman Fast Universal PCR (2x) (Applied Biosystems nº de catálogo 4364103) y se añadieron a 4 μl de ADNc hasta un volumen final de 10 μl. Cada muestra se analizó por duplicado. El ensayo de diluciones de 2 veces de un ADNc
55 que se había preparado con material purificado a partir de una línea celular que expresa el ARN de interés, generó curvas patrón para todos los ensayos. Se usó H2O estéril en lugar de ADNc para el control que no es molde. Programa de la PCR: 95 ºC durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ºC, 3 s, 60 ºC, 20-30 s. Las cantidades relativas de la secuencia de ARNm diana se determinaron a partir del ciclo umbral calculado usando el software de Applied Biosystems Fast System SDS Versión 1.3.1.21 o Software SDS Versión 2.3.
Ejemplo 8: Análisis in vitro: Inhibición de sentido contrario de la expresión del ARNm del receptor de andrógenos humano por compuestos oligonucleótidos
Se evaluó en los oligonucleótidos presentados en la tabla 3 su potencial para inactivar el ARNm del receptor de 65 andrógenos, en concentraciones 1, 4 y 16 nM (véase las figuras 1 y 2).
Tabla 3: Inhibición de sentido contrario de la expresión del ARNm del receptor de andrógenos humano por oligonucleótidos: Los datos en la tabla 3 se presentan como porcentaje de regulación en defecto respecto a células transfectadas con testigo con 16 nM. Las letras minúsculas representan unidades de ADN, las letras mayúsculas en negrita representan unidades de β-D-oxi-LNA. Todos las C de LNA son 5'-metil-C. El subíndice "s" representa unión fosforotioato.
Sustancia de ensayo
Secuencia (5'-3') Porcentaje de inhibición del receptor de andrógenos-MCF7 Porcentaje de inhibición del receptor de andrógenos -A549
SEQ ID NO: 44
5'-G·SA·SG·Sa·Sa·Sc·Sc·Sa·St·Sc·Sc·St·Sc·SA·SC·SC-3' 80-1 63,8
SEQ ID NO: 45
5'-G·SG·SA·Sc·Sc·Sa·Sg·Sg·St·Sa·Sg·Sc·Sc·ST·SG·ST-3' 89,0 88,2
SEQ ID NO: 46
5'-C·SC·SC·Sc·St·Sg·Sg·Sa·Sc·St·Sc·Sa·Sg·SA·ST·SG-3' 89,4 82,8
SEQ ID NO: 47
5'-G·SC·SA·Sc·Sa·Sa·Sg·Sg·Sa·Sg·St·Sg·Sg·SG·SA·SC-3' 83,1 77,7
SEQ ID NO: 48
5'-G·SC·ST·Sg·St·Sg·Sa·Sa·Sg·Sa·Sg·Sa·Sg·ST·SG·ST-3' 93,8 96,7
SEQ ID NO: 49
5'-C·ST·SG·St·Sg·Sa·Sa·Sg·Sa·Sg·Sa·Sg·ST·SG-3 n.d. n.d.
SEQ ID NO: 50
5'-T·SG·St·Sg·Sa·Sa·Sg·Sa·Sg·Sa·SG·ST·S-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 51
5'-T·ST·ST·Sg·Sa·Sc·Sa·Sc·Sa·Sa·Sg·St·Sg·SG·SsG·SA-3' 96,9 95,5
SEQ ID NO: 52
5'-T·ST·SG·Sa·Sc·Sa·Sc·S'sa·Ssa·Ssg·Sst·Ssg·SG·SG-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 53
5'-T·SG·Sa·Sc·Sa·Sc·Sa·Sa·Sg·St·SG·SG-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 54
5'-G·ST·SG·Sa·Sc·Sa·Sc·Sc·Sc·Sa·Sg·Sa·Sa·SG·SC·ST-3' 95,4 98,3
SEQ ID NO: 55
5'-T·SG·SA·Sc·Sa·Sc·Sc·Sc·Sa·Sg·Sa·Sa·SG·SC-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 56
5'- G·SA·Sc·Sa·Sc·Sc·Sc·Sa·Sg·Sa·SA·SG-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 57
5'-C·SA·ST·Sc·Sc·Sc·St·Sg·Sc·St·St·Sc·Sa·ST·SA·SA-3' 89,5 88,9
SEQ ID NO: 58
5'-A·SC·SC·Sa·Sa·Sg·St·St·St·Sc·St·St·Sc·SA·SG·SC-3' 95,6 98,9
SEQ ID NO: 59
5'-C·SC·SA·Sa·Sg·St·St·St·Sc·St·St·Sc·SA·SG-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 60
5'-C·SA·Sa·Sg·St·St·St·Sc·St·St·SC·SA-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 61
5'-C·ST·ST·Sg·Sg·Sc·Sc·Sc·Sa·Sc·St·St·Sg·SA·SC·SC-3' 86,7 93,3
SEQ ID NO: 62
5'-T·SC·SC·St·Sg·Sg·Sa·Sg·St·St·Sg·Sa·Sc·SA·ST·ST-3' 81,3 93,0
SEQ ID NO: 63
5'-C·SA·SC·St·Sg·Sg·Sc·St·Sg·St·Sa·Sc·Sa·ST·SC·SC-3' 90,9 98,4
SEQ ID NO: 64
5'-A·SC·ST·Sg·Sg·Sc·St·Sg·St·Sa·Sc·Sa·ST·SC-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 65
5'-C·ST·Sg·Sg·Sc·St·Sg·St·Sa·Sc·SA·ST-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 66
5'-C·SA·ST·Sc·Sc·Sa·Sa·Sa·Sc·St·Sc·St·St·SG·SA·SG-3' 79,8 95,3
SEQ ID NO: 67
5'-G·SC·ST·St·St·Sc·Sa·St·Sg·Sc·Sa·SG·SG·SA-3' 83,5 97,0
SEQ ID NO: 68
5'-G·SA·SA·Sg·St·St·Sc·Sa·St·Sc·Sa·Sa·Sa·SG·SA·SA-3' 88,2 85,6
SEQ ID NO: 69
5'-A·SG·ST·St·Sc·Sc·St·St·Sg·Sa·St·Sg·St·SA·SG·ST-3' 92,7 94,0
SEQ ID NO: 70
5'-G·ST·ST·Sc·Sc·St·St·Sg·Sa·St·Sg·ST·SA·SG-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 71
5'-T·ST·Sc·Sc·St·St·Sg·Sa·St·Sg·ST·SA-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 72
5'-T·ST·SG·Sc·Sa·Sc·Sa·Sg·Sa·Sg·Sa·St·Sg·SA·ST·Sc-3' 79,2 90,4
SEQ ID NO: 73
5'-G·SA·ST·Sg·Sg·Sg·Sc·St·St·Sg·Sa·Sc·St·ST·ST·SC-3' 91,1 97,3
SEQ ID NO: 74
5'-A·ST·Sg·Sg·Sg·Sc·St·St·Sg·Sa·Sc·St·ST·ST-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 75
5'-T·SG·Sg·Sg·Sc·St·St·Sg·Sa·Sc·ST·ST-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 76
5'-C·SA·SG·Sg·Sc·Sa·Sg·Sa·Sa·Sg·Sa·Sc·Sa·ST·SC·ST-3' 85,9 94,3
SEQ ID NO: 77
5'-C·SC·SC·Sa·Sa·Sg·Sg·Sc·Sa·Sc·St·Sg·Sc·SA·SG·SA-3' 93,0 98,5
SEQ ID NO: 78
5'-C·SC·SA·Sa·Sg·Sg·Sc·Sa·Sc·St·Sg·Sc·SA·SG-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 79
5'-C·SA·Sa·Sg·Sg·Sc·Sa·Sc·St·Sg·SC·SA-3' n.d. n.d.
SEQ ID NO: 80
5'- GS CS TS gS aS cS aS tS tS cS aS tS aS GS CS C-3' n.d. n.d.
Como se muestra en la tabla 3, los oligonucleótidos de SEQ ID NO: 48, 51, 54, 58, 63, 69, 73 y 77 en concentración 16 nM demostraron más de 90% de inhibición de la expresión del ARNm del receptor de andrógenos en células A549 y MCF7 en estos experimentos, y por lo tanto son preferidos. También son preferidos los oligonucléotidos
5 basados en las secuencias oligo de sentido contrario ilustradas, por ejemplo, variando la longitud (más corto o más largo) y/o el contenido de base nitrogenada (por ejemplo, el tipo y/o la proporción de unidades de análogos), que también proporciona una buena inhibición de la expresión del receptor de andrógenos.
Ejemplo 9: Análisis in vivo: Inhibición de sentido contrario de la expresión hepática del ARNm del receptor de 10 andrógenos de ratón por compuestos oligonucleótidos
Se administró a ratones sin pelo por vía i.v. q3dx4 con oligonucleótido 100 mg/kg (tamaño del grupo 5 ratones). Los oligonucleótidos de sentido contrario (SEQ ID: 48, SEQ ID: 51, SEQ ID: 58, SEQ ID: 63, SEQ ID: 77) se disolvieron en disolución salina tamponada con fosfato al 0,9%. Los animales se sacrificaron 24 h después de la última 15 dosificación y se tomaron muestras de tejido hepático y se almacenaron en RNAlater hasta la extracción del ARN y análisis por QPCR. El ARN total se extrajo y se midió la expresión del ARNm del AR en las muestras de hígado por QPCR como se describe en el ejemplo 7 usando un ensayo de QPCR de AR de ratón (catálogo Mm01238475_m1, Applied Biosystems). Los resultados se normalizaron respecto a la GAPDH de ratón (nº de catálogo 4352339E, Applied Biosystems) y la inactivación génica se cuantificó con respecto a controles tratados con disolución salina.
20 Los datos en la tabla 4 se presentan como porcentaje de la regulación en defecto con respecto a animales tratados con disolución salina.
Tabla 4. Inactivación de la expresión de ARNm de AR in vivo
Compuesto
Hígado (% KD)
Disolución salina
0
SEQ ID: 51 100 mg/kg
65,0+/-12,6
SEQ ID: 58 100 mg/kg
95,2+/-1,0
SEQ ID: 77 100 mg/kg
91,9+/-3,9
25 Como se muestra en la tabla 4, los oligonucleótidos de SEQ ID NO: 58 y 77 en concentración de 100 mg/kg demostraron más de 90% de inhibición de la expresión del ARNm del receptor de andrógenos en células de hígado de ratón en estos experimentos, y por lo tanto son preferidos.
Ejemplo 10: Análisis in vitro: inhibición de sentido contrario del ARNm del receptor de andrógenos humano
30 Medición de las células viables que proliferan (ensayo de MTS)
Se sembraron células de cáncer de próstata LNCaP y de cáncer de pulmón A549 hasta una densidad de 150.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección. Las células A549 se cultivaron en 35 DMEM (Sigma) + suero bovino fetal al 10% (FBS) + Glutamax I 2 mM + gentamicina (25 μg/ml), mientras que las células LNCaP se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma) + suero bovino fetal al 10% (FBS) + Glutamax I 2 mM + gentamicina (25 μg/ml). Al día siguiente se separó el medio seguido de la adición de 1,2 ml de OptiMEM que contenía Lipofectamine2000 5 μg/ml (Invitrogen). Las células se incubaron durante 7 min antes de añadir 0,3 ml de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM. Las concentraciones finales de oligonucleótidos eran 4 y 16 nM. Después de 40 4 h de tratamiento, se separó el medio y las células se tripsinizaron y se sembraron hasta una densidad de 5000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos transparente (Scientific Orange nº 1472030100) en 100 μl de medio. Las células viables se midieron en los tiempos indicados por adición de 10 μl de compuesto de tetrazolio [3-(4,5dimetil-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna; MTS] y un reactivo de acoplamiento de electrones (etosulfato de fenazina; PES) (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega).
45 Las células viables se midieron a 490 nm en un Powerwave (Biotek Instruments). Las DO490 nm se representaron gráficamente frente a tiempo/h. (Véase la figura 13 y figura 14). Como se muestra en la figura 13 y figura 14, los oligonucleótidos de SEQ ID NO: 58 y 77 inhiben el crecimiento de células de cáncer tanto de próstata LNCaP como de pulmón A549, y por lo tanto son preferidos.
50 Ejemplo 11: Análisis in vitro: Actividad de caspasa 3/7 por la inhibición de sentido contrario del ARNm del receptor de andrógenos humano
Se sembraron células de cáncer de próstata LNCaP y de cáncer de pulmón A549 hasta una densidad de 150.000
células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección. Las células A549 se cultivaron en DMEM (Sigma) + suero bovino fetal al 10% (FBS) + Glutamax I 2 mM + gentamicina (25 μg/ml), mientras que las células LNCaP se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma) + suero bovino fetal al 10% (FBS) + Glutamax I 2 mM + gentamicina (25 μg/ml). Al día siguiente se separó el medio seguido de la adición de 1,2 ml de OptiMEM que 5 contenía Lipofectamine2000 5 μg/ml (Invitrogen). Las células se incubaron durante 7 min antes de añadir 0,3 ml de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM. Las concentraciones finales de oligonucleótidos eran 4 y 16 nM. Después de 4 h de tratamiento, se separó el medio y las células se tripsinizaron y se sembraron hasta una densidad de 5000 por células por pocillo en una placa blanca de 96 pocillos (Nunc) en 100 μl de medio. La actividad de la caspasa 3/7 se midió en los tiempos indicados añadiendo 100 μl Caspase-Glo 3/7 (Pomega). La actividad de la caspasa 3/7 se
10 midió usando un luminómetro. Las actividades de caspasa 3/7 se midieron en 3 tiempos de medición diferentes 14 h, 48 h y 72 h. (Véase la figura 15 y figura 16). Como se muestra en la figura 15 y figura 16, los oligonucleótidos de SEQ ID NO: 58 y 77 inducen la actividad de caspasa 3/7 en células de cáncer tanto de próstata LNCaP como de pulmón A549, y por lo tanto son preferidos.
15 Ejemplo 12: Análisis in vitro: inhibición de sentido contrario de la expresión de ARNm del receptor de andrógenos por compuestos oligonucleótidos en células de cáncer de próstata LNCaP y línea celular de cáncer de pulmón A549.
Se evaluó el potencial de los oligonucleótidos para inactivar el ARNm del receptor de andrógenos en concentraciones 0,5, 1, 2, 4, 8 y 16 nM (véase la figura 11). Se sembraron células de cáncer de próstata LNCaP y de 20 cáncer de pulmón A549 hasta una densidad de 150.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección. Las células A549 se cultivaron en DMEM (Sigma) + suero bovino fetal al 10% (FBS) + Glutamax I 2 mM + gentamicina (25 μg/ml), mientras que las células LNCaP se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma) + suero bovino fetal al 10% (FBS) + Glutamax I 2 mM + gentamicina (25 μg/ml). Al día siguiente se separó el medio seguido de la adición de 1,2 ml de OptiMEM que contenía Lipofectamine2000 5 μg/ml (Invitrogen). Las células se incubaron 25 durante 7 min antes de añadir 0,3 ml de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM. Las concentraciones finales de oligonucleótido eran 0,5, 1, 2, 4, 8 y 16 nM. Las células se lavaron y se añadió medio que contenía suero. Después del tratamiento con oligo, las células se dejaron recuperar durante 20 h antes de recogerlas para el análisis de ARN. El procedimiento para el aislamiento del ARN, la síntesis de ADNc y qPCR eran como se han descrito en el ejemplo 3, 6 y 7. Como se muestra en las figuras 11 y 12, los oligonucleótidos de SEQ ID NO: 58 y 77 eran potentes en la
30 inactivación de la expresión del ARNm del AR tanto en la línea celular de cáncer de pulmón A549 como en la línea celular de cáncer de próstata 22RV1 dependiente del receptor de andrógenos.
Ejemplo 13: Efecto del oligonucleótido de sentido contrario en el PSA (figura 17).
35 Se usaron en el estudio ratones atímicos nu/nu macho de 6 a 7 semanas de edad (Harlan Sprague Dawley) que pesaban una media de 27,3±2,4 g. Se suspendieron 10 millones de células de 22RV1 (línea de cáncer de próstata independiente de andrógenos) en PBS (Gibco nº 14190) y Matrigel (BD nº 356234) con una relación 1:1, y se inyectaron por vía subcutánea en cada ratón. Cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de 150-200 mm3, los ratones se dividieron en 9 grupos experimentales. Se inyectaron por vía intravenosa 200 μl de oligo cuando el
40 tamaño medio del tumor alcanzó 152,66±27,97 mm3. Los oligos se dieron cada 3 días durante un total de 5 veces. Los vehículos de control se dieron con el mismo régimen que los oligos. El día 16, los ratones se sacrificaron y se recogió la sangre en tubos con EDTA y se centrifugaron durante 5 min. Después 50 μl de los líquidos sobrenadantes se sometieron a ensayo de PSA usando el kit de ELISA de ALPCO Diagnostics en Salem (PSAHU-L01).
45 Efecto del oligonucleótido de sentido contrario en el crecimiento tumoral (figura 18): se usaron en el estudio de 6 a 7 ratones atímicos nu/nu macho de 6 a 7 semanas de edad (Harlan Sprague Dawley) que pesaban una media de 27,3±2,4 g. Se suspendieron 10 millones de células de 22RV1 (línea de cáncer de próstata independiente de andrógenos) en PBS (Gibco nº 14190) y Matrigel (BD nº 356234) con una relación 1:1, y se inyectaron por vía subcutánea en cada ratón. Cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de 150-200 mm3, los ratones se
50 dividieron en 9 grupos experimentales. Se inyectaron por vía intravenosa 200 μl de oligo cuando el tamaño medio del tumor alcanzó 152,66±27,97 mm3. Los oligos se dieron cada 3 días durante un total de 5 veces. Los vehículos de control se dieron con el mismo régimen que los oligos. Los volúmenes tumorales de cada ratón se determinaron midiendo dos dimensiones con calibres y se calcularon usando la fórmula: volumen tumoral = (longitud x ancho2)/2).
55 Ejemplo 14: Preparación de conjugados de oligómeros con polietilenglicol
Los oligómeros que tienen las secuencias mostradas como SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 63 se funcionalizan en el extremo 5’ por unión de un grupo aminoalquilo, tal como hexan-1-amina bloqueada con un grupo de bloqueo tal como Fmoc, a los grupos 5’-fosfato de los oligómeros, usando la química de fosforamidita rutinaria, oxidación de los
60 compuestos resultantes, desprotección y purificación para lograr los oligómeros funcionalizados, que tienen respectivamente las fórmulas (IA) y (IB):
en las que las letras mayúsculas y negrita representan monómeros de análogos de nucleósidos, las letras minúsculas representan monómeros de ADN, el subíndice “s” representa una unión fosforotioato, y MeC representa 5-metilcitosina.
Una disolución de PEG activado, tal como el mostrado en la fórmula (II):
10 en la que el resto PEG tiene un peso molecular medio de 12.000, y cada uno de los compuestos de fórmula (IA) y (IB) en tampón de PBS, se agitan en recipientes separados a temperatura ambiente durante 12 h. Las disoluciones de reacción se extraen 3 veces con cloruro de metileno y las capas orgánicas combinadas se secan sobre sulfato magnésico y se filtran, y el disolvente se evapora a presión reducida. Los residuos resultantes se disuelven en agua
15 bidestilada y se cargan en una columna de intercambio aniónico. El conector PEG sin reaccionar eluye con el agua y los productos eluyen con disolución de NH4HCO3. Las fracciones que contienen productos puros se mezclan y liofilizan para dar los conjugados de SEQ ID NO: 48 y 63, respectivamente, como se muestra en las fórmulas (IIIA) y (IIIB):
en las que cada uno de los oligómeros de SEQ ID NO: 48 y 63 se une a un polímero PEG que tiene un peso molecular medio de 12.000, por un conector liberable.
25 Las estructuras químicas de los conjugados de polímero PEG que se pueden hacer con oligómeros que tienen las secuencias mostradas en las SEQ ID NO: 51, 58 y 77 usando el proceso descrito antes, se muestran respectivamente en las fórmulas (IVA), (IVB) y (IVC):
en las que las letras mayúsculas negritas representan monómeros de D-oxi-LNA, las letras minúsculas representan monómeros de ADN, el subíndice “s” representa una unión fosforotioato, y MeC representa 5-metilcitosina.
Los oligómeros activados que se pueden usar en este proceso para hacer respectivamente los conjugados mostrados en las fórmulas (IVA), (IVB) y (IVC) tienen las estructuras químicas mostradas en las fórmulas (VA), (VB) y (VC):
Lista de secuencias
<110> Santaris Pharma A/S 15 <120> ANTAGONISTAS BASADOS EN LNA DIRIGIDOS AL RECEPTOR DE ANDRÓGENOS
<130> 1043WO
<150> US 60/990125
<151>
<160> 106 20 <170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4314
<212> ADN
<213> homo sapiens 25 <400> 1
<210> 2
<211> 16
<212> ADN 5 <213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 10 <222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 2 gagaaccatc ctcacc 16
<210> 3 15 <211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 20 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 3 25 ggaccaggta gcctgt 16
<210> 4
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial 30 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
5 <400> 4 cccctggact cagatg 16
<210> 5
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 15 <222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 5 gcacaaggag tgggac 16
<210> 6
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 25 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 6 gctgtgaaga gagtgt 16
<210> 7
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial 35 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 7 tttgacacaa gtggga 16
<210> 8
<211> 16 45 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 8
gtgacaccca gaagct 16 55 <210> 9
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
65 <400> 9 catccctgct tcataa 16
<210> 10
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial 5 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 10 accaagtttc ttcagc 16
<210> 11
<211> 16 15 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 11
cttggcccac ttgacc 16 25 <210> 12
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
35 <400> 12 tcctggagtt gacatt 16
<210> 13
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial;
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
45 <400> 13 cactggctgt acatcc 16
<210> 14
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 55 <222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 14 catccaaact cttgag 16
<210> 15
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 65 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 15
gctttcatgc acagga 16 5 <210> 16
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
15 <400> 16 gaagttcatc aaagaa 16
<210> 17
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 25 <222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 17 agttccttga tgtagt 16
<210> 18
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
35 <400> 18 ttgcacagag atgatc 16
<210> 19
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 45 <222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 19 gatgggcttg actttc 16
<210> 20
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
55 <400> 20 caggcagaag acatct 16
<210> 21
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 65 <222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 21 cccaaggcac tgcaga 16
<210> 22
<211> 16 5 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 22
gctgacattc atagcc 16 15 <210> 23
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
25 <400> 23 gagaaccatc ctcacc 16
<210> 24
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 35 <222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 24 ggaccaggta gcctgt 16
<210> 25
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 45 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 25 cccctggact cagatg 16
<210> 26
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial 55 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 26 gcacaaggag tgggac 16
<210> 27
<211> 16 65 <212> ADN
<213> artificial <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 5 <222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 27 gctgtgaaga gagtgt 16
<210> 28
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 15 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 28 tttgacacaa gtggga 16
<210> 29
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial 25 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 29 gtgacaccca gaagct 16
<210> 30
<211> 16 35 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 30
catccctgct tcataa 16 45 <210> 31
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
55 <400> 31 accaagtttc ttcagc 16
<210> 32
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 65 <222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 32 cttggcccac ttgacc 16
<210> 33
<211> 16 5 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 33
tcctggagtt gacatt 16 15 <210> 34
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
25 <400> 34 cactggctgt acatcc 16
<210> 35
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 35 <222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 35 catccaaact cttgag 16
<210> 36
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 45 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 36 gctttcatgc acagga 16
<210> 37
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial 55 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 37 gaagttcatc aaagaa 16
<210> 38
<211> 16 65 <212> ADN
<213> artificial <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 5 <222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 38 agttccttga tgtagt 16
<210> 39
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 15 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 39 ttgcacagag atgatc 16
<210> 40
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial 25 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 40 gatgggcttg actttc 16
<210> 41
<211> 16 35 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 41
caggcagaag acatct 16 45 <210> 42
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
55 <400> 42 cccaaggcac tgcaga 16
<210> 43
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 65 <222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos 3-10-3 - opcionalmente fosforotioato
<400> 43 gctgacattc atagcc 16
<210> 44
<211> 16 5 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 44
gagaaccatc ctcacc 16 15 <210> 45
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 – totalmente fosforotioato
25 <400> 45 ggaccaggta gcctgt 16
<210> 46
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 35 <222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 46 cccctggact cagatg 16
<210> 47
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 45 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 47 gcacaaggag tgggac 16
<210> 48
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial 55 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 48 gctgtgaaga gagtgt 16
<210> 49
<211> 14 65 <212> ADN
<213> artificial <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 5 <222> (1)..(14)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-9-2 - totalmente fosforotioato
<400> 49 ctgtgaagag agtg 14
<210> 50
<211> 12
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 15 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<223> Oligómero con huecos de LNA 2-8-2 - totalmente fosforotioato
<400> 50 tgtgaagaga gt 12
<210> 51
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial 25 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 51 tttgacacaa gtggga 16
<210> 52
<211> 14 35 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-9-2 - totalmente fosforotioato
<400> 52
ttgacacaag tggg 14 45 <210> 53
<211> 12
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<223> Oligómero con huecos de LNA 2-8-2 - totalmente fosforotioato
55 <400> 53 tgacacaagt gg 12
<210> 54
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 65 <222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 54 gtgacaccca gaagct 16
<210> 55
<211> 14 5 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-9-2 - totalmente fosforotioato
<400> 55
tgacacccag aagc 14 15 <210> 56
<211> 12
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<223> Oligómero con huecos de LNA 2-8-2 - totalmente fosforotioato
25 <400> 56 gacacccaga ag 12
<210> 57
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 35 <222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 57 catccctgct tcataa 16
<210> 58
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 45 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 58 accaagtttc ttcagc 16
<210> 59
<211> 14
<212> ADN
<213> artificial 55 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-9-2 - totalmente fosforotioato
<400> 59 ccaagtttct tcag 14
<210> 60
<211> 12 65 <212> ADN
<213> artificial <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 5 <222> (1)..(12)
<223> Oligómero con huecos de LNA 2-8-2 - totalmente fosforotioato
<400> 60 caagtttctt ca 12
<210> 61
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 15 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 61 cttggcccac ttgacc 16
<210> 62
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial 25 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 62 tcctggagtt gacatt 16
<210> 63
<211> 16 35 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 63
cactggctgt acatcc 16 45 <210> 64
<211> 14
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc feature
<222> (1)..(14)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-9-2 - totalmente fosforotioato
55 <400> 64 actggctgta catc 14
<210> 65
<211> 12
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 65 <222> (1)..(12)
<223> Oligómero con huecos de LNA 2-8-2 - totalmente fosforotioato
<400> 65 ctggctgtac at 12
<210> 66
<211> 16 5 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 66
catccaaact cttgag 16 15 <210> 67
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
25 <400> 67 gctttcatgc acagga 16
<210> 68
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 35 <222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 68 gaagttcatc aaagaa 16
<210> 69
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 45 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 69 agttccttga tgtagt 16
<210> 70
<211> 14
<212> ADN
<213> artificial 55 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-9-2 - totalmente fosforotioato
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-9-2 - totalmente fosforotioato
65 <400> 70 gttccttgat gtag 14
<210> 71
<211> 12
<212> ADN
<213> artificial 5 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<223> Oligómero con huecos de LNA 2-8-2 - totalmente fosforotioato
<400> 71 ttccttgatg ta 12
<210> 72
<211> 16 15 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 72
ttgcacagag atgatc 16 25 <210> 73
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
35 <400> 73 gatgggcttg actttc 16
<210> 74
<211> 14
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 45 <222> (1)..(14)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-9-2 - totalmente fosforotioato
<400> 74 atgggcttga cttt 14
<210> 75
<211> 12
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 55 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<223> Oligómero con huecos de LNA 2-8-2 - totalmente fosforotioato
<400> 75 tgggcttgac tt 12
<210> 76
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial 65 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
5 <400> 76 caggcagaag acatct 16
<210> 77
<211> 16
<212> ADN 10 <213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature 15 <222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 77 cccaaggcac tgcaga 16
<210> 78 20 <211> 14
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero 25 <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-9-2 - totalmente fosforotioato
<400> 78 30 ccaaggcact gcag 14
<210> 79
<211> 12
<212> ADN
<213> artificial 35 <220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12) 40 <223> Oligómero con huecos de LNA 2-8-2 - totalmente fosforotioato
<400> 79 caaggcactg ca 12
<210> 80
<211> 16 45 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220> 50 <221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> Oligómero con huecos de LNA 3-10-3 - totalmente fosforotioato
<400> 80
gctgacattc atagcc 16 55 <210> 81
<211> 2999
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 81
<210> 82
<211> 3175
<212> ADN
<213> Macaca mulatta
<400> 82
<210> 83
<211> 920
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
<210> 84
<211> 899
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 84
<210> 85
<211> 895
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 85
<210> 86
<211> 24
<212> ADN <213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 86 tggggagaac catcctcacc ctgc 24
<210> 87
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 87 tccaggacca ggtagcctgt gggg 24
<210> 88
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 88 tgttcccctg gactcagatg ctcc 24
<210> 89
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 89 tggggcacaa ggagtgggac gcac 24
<210> 90
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 90 ttcggctgtg aagagagtgt gcca 24
<210> 91
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 91 cgcttttgac acaagtggga ctgg 24
<210> 92
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 92 catagtgaca cccagaagct tcat 24
<210> 93
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 93 gagtcatccc tgcttcataa catt 24
<210> 94
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 94 gattaccaag tttcttcagc ttcc 24
<210> 95
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 95 aggccttggc ccacttgacc acgt 24
<210> 96
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 96 agcatcctgg agttgacatt ggtg 24
<210> 97
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 97 gacacactgg ctgtacatcc ggga 24
<210> 98
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 98 gagccatcca aactcttgag agag 24
<210> 99
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 99 cagtgctttc atgcacagga attc 24
<210> 100
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 100 attcgaagtt catcaaagaa tttt 24
<210> 101
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 101 atcgagttcc ttgatgtagt tcat 24
<210> 102
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 102 gcacttgcac agagatgatc tctg 24
<210> 103
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 103 aatagatggg cttgactttc ccag 24
<210> 104
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 104 ataacaggca gaagacatct gaaa 24
<210> 105
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 105 attccccaag gcactgcaga ggag 24
<210> 106
<211> 24
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia de oligómero de LNA/patrón de secuencia de oligómero
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> nucleótido o análogos de nucleótidos - opcionalmente fosforotioato
<400> 106 atgggctgac attcatagcc ttca 24

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un oligómero que tiene una secuencia de nucleótidos contiguos de un total de 10 - 30 nucleótidos, en el que dicha secuencia de nucleótidos contiguos es al menos 80% homóloga al complemento inverso de una región correspondiente de un gen o ARNm del receptor de andrógenos de mamífero, en el que dicho oligómero comprende al menos una unidad de LNA, y en el que la secuencia de nucleótidos contiguos comprende al menos 10 nucleótidos contiguos que son 100% idénticos a una correspondiente región de SEQ ID NO 94 o SEQ ID NO 58.
  2. 2.
    El oligómero de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos contiguos comprende la SEQ ID NO 94 o SEQ ID NO 58.
  3. 3.
    El oligómero de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de nucleótidos contiguos tiene 10 - 22 nucleótidos de longitud.
  4. 4.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia de nucleótidos contiguos tiene 10 - 18 nucleótidos de longitud
  5. 5.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia de nucleótidos contiguos comprende otros análogos de nucleótidos.
  6. 6.
    El oligómero de acuerdo con la reivindicación 5, en el que los análogos de nucleótidos son nucleótidos con azúcar modificado, tal como nucleótidos con azúcar modificado seleccionados del grupo que consiste en: unidades de ácido nucleico bloqueado (LNA); unidades de 2'-O-alquil-ARN, unidades de 2'-OMe-ARN, unidades de 2'-amino-ADN y unidades de 2'-fluoro-ADN.
  7. 7.
    El oligómero de acuerdo con la reivindicación 5, en el que los análogos de nucleótidos son LNA.
  8. 8.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que es un oligómero con huecos.
  9. 9.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que es capaz de regular en defecto la expresión del gen o ARNm del receptor de andrógenos en una célula que expresa el gen o ARNm del receptor de andrógenos.
  10. 10.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el oligómero consiste en:
    5'-A·sMeC·sMeC·sa·sa·sg·st·st·st·sc·st·st·sc·sA·sG·sMeC-3' (SEQ ID NO: 58),
    en el que las letras mayúsculas indican monómeros beta-D-oxi-LNA y las letras minúsculas indican monómeros de ADN, el subíndice “s” indica una unión fosforotioato, y MeC indica un monómero beta-D-oxi-LNA que contiene una base 5-metilcitosina.
  11. 11.
    Un conjugado que comprende el oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y al menos un resto no nucleótido o no polinucleótido unido covalentemente a dicho oligómero.
  12. 12.
    Una composición farmacéutica que comprende el oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o el conjugado de acuerdo con la reivindicación 11, y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
  13. 13.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o el conjugado de acuerdo con la reivindicación 11, para usar como un medicamento, tal como para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno médico como se describe en el presente documento, tal como un trastorno hiperproliferativo, tal como el cáncer.
  14. 14.
    El uso de un oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o un conjugado como se define en la reivindicación 11, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno médico como se describe en el presente documento, tal como un trastorno proliferativo, tal como el cáncer.
  15. 15.
    Un método in vitro para inhibir el receptor de andrógenos en una célula que expresa el receptor de andrógenos, comprendiendo dicho método administrar un oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o un conjugado de acuerdo con la reivindicación 11, a dicha célula para así inhibir el receptor de andrógenos en dicha célula.
ES08855697.2T 2007-11-26 2008-11-26 Antagonistas basados en LNA dirigidos al receptor de andrógenos Active ES2456990T3 (es)

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