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ES2455126T3 - Secuencias Cy.5 de virus adeno-asociados (AAV), vectores que las contienen y uso de las mismas. - Google Patents

Secuencias Cy.5 de virus adeno-asociados (AAV), vectores que las contienen y uso de las mismas. Download PDF

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ES2455126T3
ES2455126T3 ES10178970T ES10178970T ES2455126T3 ES 2455126 T3 ES2455126 T3 ES 2455126T3 ES 10178970 T ES10178970 T ES 10178970T ES 10178970 T ES10178970 T ES 10178970T ES 2455126 T3 ES2455126 T3 ES 2455126T3
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ES
Spain
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aav
seq
aav2
sequences
clone
Prior art date
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ES10178970T
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English (en)
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Guangping Gao
James M. Wilson
Mauricio Alvira
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University of Pennsylvania Penn
Original Assignee
University of Pennsylvania Penn
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Publication date
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Abstract

Un virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV que comprende AAVcy.5 vp1 que comprende aminoácidos 1 a 728 de SEQ ID Núm. 103 o una secuencia que es al menos un 95% idéntica con la misma; y un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV y un gen heterólogo enlazado operativamente a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula anfitrión.

Description

Secuencias Cy.5 de virus adeno-asociados (AAV), vectores que las contienen y uso de las mismas.
Antecedentes de la invención
Un virus adeno-asociado (AAV), un miembro de la familia Parvovirus, es un pequeño virus icosaédrico, sin envoltura, con genomas de ADN lineal de cadena simple de 4,7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV está asignado al género, Dependovirus, dado que el virus fue descubierto como contaminante en poblaciones purificadas de adenovirus. El ciclo de vida del AAV incluye una fase latente en la que los genomas de AAV, tras la infección, son el sitio específicamente integrado en los cromosomas anfitrión, y una fase infecciosa en la que, a continuación de la infección de adenovirus o bien de virus de herpes simplex, los genomas integrados son posteriormente rescatados, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, amplia gama de infectividad de anfitrión, incluyendo las células no divisoras, y la potencial integración cromosómica específica del sitio, hacen que el AAV sea una herramienta atractiva para transferencia de gen.
Estudios recientes sugieren que los vectores de AAV pueden ser el vehículo preferido para terapia de gen. Hasta la fecha, se han aislado 6 serotipos diferentes de AAVs procedentes de humanos o de primates no humanos (NHP), y han sido bien caracterizados. Entre ellos, el serotipo 2 humano es el primer AAV que fue desarrollado como vector de transferencia de gen; éste ha sido usado ampliamente para experimentos de transferencia de gen eficiente en diferentes tejidos objetivo y modelos de animales. Los ensayos clínicos de la aplicación experimental de vectores basados en AAV2 a algunos modelos de enfermedades humanas, están en curso, e incluyen enfermedades tales como fibrosis quística y hemofilia B.
Lo que resulta deseable son construcciones basadas en AAV para suministro de gen.
Sumario de la invención
La invención proporciona nuevas secuencias Cy.5 de AAV, vectores que las contienen, y métodos de uso de las mismas, según se define en las reivindicaciones anexas.
Estos y otros aspectos de la invención resultarán fácilmente evidentes a partir de la descripción detallada que sigue de la invención.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A a 1AAAR proporcionan un alineamiento de las secuencias de ácido nucleico que codifican al menos las proteínas cap para los serotipos de AAV. Se proporcionan las secuencias de longitud completa que las ITRs, la región rep y la región de cápside, para el nuevo serotipo 7 de AAV [SEQ ID Núm. 1] y para los AAV1 [SEQ ID Núm. 6], AAV2 [SEQ ID Núm. 7] y AAV3 [SEQ ID Núm. 8] previamente publicados. Los serotipos AAV novedosos de AAV8 [SEQ ID Núm. 4] y AAV9 [SEQ ID Núm. 5] son el objeto de solicitudes presentadas simultáneamente. Los otros clones novedosos de la invención proporcionados en este alineamiento incluyen: 42-2 [SEQ ID Núm. 9], 42-8 [SEQ ID Núm. 27], 42-15 [SEQ ID Núm. 28], 42-5b [SEQ ID Núm. 29], 42-1b [SEQ ID Núm. 30]; 42-13 [SEQ ID Núm. 31], 42-3a [SEQ ID Núm. 32], 42-4 [SEQ ID Núm. 33], 42-5a [SEQ ID Núm. 34], 42-10 [SEQ ID Núm. 35], 42-3b [SEQ ID Núm. 36], 42-11 [SEQ ID Núm. 37], 42-6b [SEQ ID Núm. 38], 43-1 [SEQ ID Núm. 39], 43-5 [SEQ ID Núm. 40], 43-12 [SEQ ID Núm. 41], 43-20 [SEQ ID Núm. 42], 43-21 [SEQ ID Núm. 43], 43-23 [SEQ ID Núm. 44], 43-25 [SEQ ID Núm. 45], 44.1 [SEQ ID Núm. 47], 44.5 [SEQ ID Núm. 47], 223.10 [SEQ ID Núm. 48], 223.2 [SEQ ID Núm. 49], 223.4 [SEQ ID Núm. 50], 223.5 [SEQ ID Núm. 51], 223.6 [SEQ ID Núm. 52], 223.7 [SEQ ID Núm. 53], A3.4 [SEQ ID Núm. 54], A3.5 [SEQ ID Núm. 55], A3.7 [SEQ ID Núm. 56], A3.3 [SEQ ID Núm. 57], 42.12 [SEQ ID Núm. 58], 44.2 [SEQ ID Núm. 59]. Las secuencias de nucleótido de las regiones de signatura de AAV10 [SEQ ID Núm. 117], AAV11 [SEQ ID Núm. 118] y AAV12 [SEQ ID Núm. 119] se proporcionan en esta Figura. Se muestran puntos de referencia críticos en las estructuras de los genomas de AAV. Los huecos se han señalado mediante puntos. La ITR 3’ de AAV1 [SEQ ID Núm. 6] se ha mostrado con la misma configuración que en las secuencias publicadas. TRS representa el sitio de resolución terminal. Obsérvese que AAV7 es el único AAV informado que utiliza GTG como codón de iniciación para VP3.
Las Figuras 2A a 2F son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de proteínas de las proteínas de cápside de vp1 de serotipos 1 de AAV [SEQ ID Núm. 64], AAV2 [SEQ ID Núm. 70], AAV3 [SEQ ID Núm. 71], AAV4 [SEQ ID Núm. 63], AAV5 [SEQ ID Núm. 114] y AAV6 [SEQ ID Núm. 65] anteriormente publicados y las nuevas secuencias de la invención, incluyendo: C1 [SEQ ID Núm. 60], C2 [SEQ ID Núm. 61], C5 [SEQ ID Núm. 62], A3-3 [SEQ ID Núm. 66], A3-7 [SEQ ID Núm. 67], A3-4 [S·EQ ID Núm. 68], A3-5 [SEQ ID Núm. 69], 3.3b [SEQ ID Núm. 62], 223.4 [SEQ ID Núm. 73], 223-5 [SEQ ID Núm. 74], 223-10 [SEQ ID Núm. 75], 223-2 [SEQ ID Núm. 76], 223-7 [SEQ ID Núm. 77], 223-6 [SEQ ID Núm. 78], 44-1 [SEQ ID Núm. 79], 44-5 [SEQ ID Núm. 80], 44-2 [SEQ ID Núm. 81], 42-15 [SEQ ID Núm. 84], 42-8 [SEQ ID Núm. 85], 42-13 [SEQ ID Núm. 86], 42-3A [SEQ ID Núm. 87], 42-4 [SEQ ID Núm. 88], 42-5A [SEQ ID Núm. 89], 42-1B [SEQ ID Núm. 90], 42-5B [SEQ ID Núm. 91], 43-1 [SEQ ID Núm. 92], 43-12 [SEQ ID Núm.
93], 43-5 [SEQ ID Núm. 94], 43-21 [SEQ ID Núm. 96], 43-25 [SEQ ID Núm. 97], 43-20 [SE! ID Núm. 99], 24.1 [SEQ ID Núm. 101], 42.2 [SEQ ID Núm. 102], 7.2 [SEQ ID Núm. 103], 27.3 [SEQ ID Núm. 104], 16.3 [SEQ ID Núm. 105],
42.10 [SEQ ID Núm. 106], 42-3B [SEQ ID Núm. 107], 42-11 [SEQ ID Núm. 108], F1 [SEQ ID Núm. 109], F5 [SEQ ID Núm. 110], F3 [SEQ ID Núm. 111], 42-6B [SEQ ID Núm. 112], 42-12 [SEQ ID Núm. 113]. Nuevos serotipos AAV8 [SEQ ID Núm. 95] y AAV9 [SEQ ID Núm. 100] son el objeto de solicitudes de patentes depositadas simultáneamente.
Las Figuras 3A a 3C proporcionan las secuencias de aminoácido de las proteínas rep de AAV7 [SEQ ID Núm. 3].
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a secuencias de ácido nucleico identificadas de acuerdo con los métodos que se describen en la presente memoria. Un virus adeno-asociado de ese tipo es un serotipo novedoso, denominado en la presente memoria serotipo 7 (AAV7). Otros serotipos novedosos de virus adeno-asociados proporcionados en la presente memoria incluyen AAV10, AAV11 y AAV12. Incluso otros serotipos novedosos de AAV identificados conforme a los métodos descritos en la presente memoria, son proporcionados en la presente descripción. Véase el “Listado de Figuras y Secuencias”, que se incorpora aquí por referencia.
También se proporcionan fragmentos de esas secuencias de AAV. Entre los fragmentos de AAV particularmente deseables están las proteínas cap, incluyendo las vp1, vp2, vp3, las regiones hipervariables, las proteínas rep incluyendo las rep 78, rep 68, rep 52, y rep 40, y las secuencias que codifican esas proteínas. Cada uno de esos fragmentos puede ser utilizado fácilmente en una diversidad de sistemas de vector y de células anfitrión. Tales fragmentos pueden ser usados solos, en combinación con otras secuencias o fragmentos de AAV, o en combinación con elementos de otras secuencias virales de AAV o de no AAV. En una realización particularmente deseable, un vector contiene las secuencias cap y/o rep de AAV de la invención.
Según se describe en la presente memoria, los alineamientos se realizan usando cualquiera de una diversidad de Programas de Alineamiento de Secuencia Múltiples disponibles pública o comercialmente, tal como el “Clustal W”, accesibles a través de Servidores Web por Internet. Alternativamente, se usan también las utilidades Vector NTI. También existe un número de algoritmos conocidos en el estado de la técnica que pueden ser usados para medir la identidad de secuencia de nucleótido, incluyendo los contenidos en los programas descritos con anterioridad. Según otro ejemplo, las secuencias de polinucleótido pueden ser comparadas usando Fasta, un programa den GCG Versión 6.1. Fasta proporciona identidad de alineamientos y porcentaje de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico puede ser determinado usando Fasta con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) según se proporciona en GCG Versión 6.1. Se encuentran disponibles programas similares para secuencias de aminoácido, por ejemplo el programa “Clustal X”. Generalmente, se utiliza cualquiera de esos programas en configuraciones por defecto, aunque un experto en la materia puede modificar esas configuraciones según se precise. Alternativamente, un experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o programa de ordenador que proporcione al menos un nivel de identidad o de alineamiento como el proporcionado por los algoritmos y programas referenciados.
La expresión “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando hace referencia a un ácido nucleico, o a un fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea óptimamente con inserciones o supresiones de nucleótido apropiado con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótido en al menos alrededor de un 95 a 99% de las secuencias alineadas. Con preferencia, la homología es sobre la secuencia de longitud completa, o sobre una trama de lectura abierta de la misma, u otro fragmento adecuado que sea al menos de 15 nucleótidos de longitud. Ejemplos de fragmentos adecuados se describen en la presente memoria.
La expresión “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando hace referencia a aminoácidos o a fragmentos de los mismos, indica que, cuando se alinean óptimamente con inserciones o supresiones de aminoácido apropiado con otro aminoácido, existe identidad de secuencia de aminoácido en al menos alrededor de un 95 a 99% de las secuencias alineadas. Con preferencia, la homología es sobre la secuencia de longitud completa, o una proteína de la misma, por ejemplo una proteína cap, una proteína rep, o un fragmento de la misma que sea de al menos 8 aminoácidos, o más deseablemente de al menos 15 aminoácidos de longitud. Ejemplos de fragmentos adecuados se describen en la presente memoria.
Mediante la expresión “altamente conservado” se indica al menos una identidad del 80%, con preferencia una identidad de al menos el 90%, y más preferiblemente una identidad superior al 97%. La identidad puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia recurriendo a algoritmos y programas de ordenador conocidos por los expertos en la materia.
La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” o “idéntico”, en el contexto de las secuencias de ácido nucleico, se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando están alineados para una máxima correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre la longitud completa del genoma, la longitud completa de una secuencia de codificación de gen, o sobre un fragmento de al menos alrededor de 500 a 5.000 nucleótidos, si se desea. Sin embargo, puede desearse también la identidad entre fragmentos más
pequeños, por ejemplo de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, normalmente al menos alrededor de 20 a 24 nucleótidos, al menos alrededor de 28 a 32 nucleótidos, al menos alrededor de 36 o más nucleótidos. De manera similar, el “porcentaje de identidad de secuencia” puede ser determinado fácilmente para secuencias de aminoácido, sobre la longitud completa de una proteína, o un fragmento de la misma. Adecuadamente, un fragmento es al menos de alrededor de 8 aminoácidos de longitud, y puede ser de hasta 700 aminoácidos. Ejemplos de fragmentos adecuados se describen en la presente memoria.
Las secuencias de AAV y los fragmentos del mismo son útiles en la producción de rAAV, y son también útiles como vectores de suministro antisentido, vectores de terapia de gen, o vectores de vacuna. La invención proporciona además moléculas de ácido nucleico, vectores de suministro de gen, y células anfitrión que contienen las secuencias de AAV de la invención.
Según se describe en la presente memoria, los vectores que contienen proteínas de cápside de AAV de la invención son particularmente adecuados para su uso en aplicaciones en las que los anticuerpos neutralizantes disminuyen la efectividad de otros vectores basados en serotipo de AAV, así como de otros vectores virales. Los vectores de rAAV son particularmente ventajosos en terapia genética de administración y repetición de rAAV.
Según se utiliza a través de la presente descripción y de las reivindicaciones, los términos “comprendiendo” e “incluyendo” y sus variantes, incluyen otros componentes, elementos, integrantes, etapas y similares. A la inversa, el término “consistiendo” y sus variantes es exclusivo de otros componentes, elementos, integrantes, etapas y similares.
III.
Nuevos serotipos de AAV
A.
Secuencias de ácido nucleico
Se proporcionan secuencias de ácido nucleico de nuevos serotipos de AAV. Véase, SEQ ID Núm. 1, 9-59, y 117
120. Véase también la Figura 1 y el listado de secuencias.
Para el nuevo serotipo AAV7, las secuencias de longitud completa, incluyendo las ITRs 5’ de AAV, cápside, rep, y las ITRs 3’ de AAV, se proporcionan en SEQ ID Núm. 1.
Para otros nuevos serotipos de AAV de la invención, el fragmento de aproximadamente 3,1 kb aislado contiene secuencias que codifican la proteína de cápside de longitud completa y todas o parte de las secuencias que codifican la proteína rep. Estas secuencias incluyen los clones identificados en lo que sigue.
Para otros nuevos serotipos adicionales de AAV, se proporciona la región de signatura que codifica la proteína de cápside. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico de AAV10 de la invención incluyen las ilustradas en la Figura 1 [Véase, SEQ ID Núm. 117, que abarca 255 bases]. Las secuencias de ácido nucleico de AAV11 incluyen las secuencias de ADN ilustradas en la Figura 1 [Véase, SEQ ID Núm. 118 que abarca 258 bases]. Las secuencias de ácido nucleico de AAV12 de la invención incluyen secuencias de ADN ilustradas en la Figura 1 [Véase, SEQ ID Núm. 119, que consiste en 255 bases]. Usando la metodología descrita con anterioridad se pueden identificar y usar fácilmente otras secuencias de AAV10, AAV11 y AAV12 para una diversidad de propósitos, incluyendo los descritos para el AAV7 y otros serotipos novedosos en la presente memoria.
La Figura 1 proporciona las secuencias de ácido nucleico de AAV de primate no humano (NHP) de la invención en alineamiento con los serotipos de AAV publicados anteriormente, el AAV1 [SEQ ID Núm. 6], el AAV2 [SEQ ID Núm. 7] y el AAV3 [SEQ ID Núm. 8]. Estas nuevas secuencias de NHP incluyen las proporcionas en la Tabla I siguiente, las cuales están identificadas por el número de clon.
Tabla 1 (continuación)
Secuencia Cap de AAV
Número de clon Fuente
Especie
Tejido SEQ ID Núm. (ADN)
Rh-1
Clon 9 (AAV9) Rhesus Corazón 5
Rh-2
Clon 43.1 Rhesus MLN 39
Rh-3
Clon 43.5 Rhesus MLN 40
Rh-4
Clon 43.12 Rhesus MLN 41
Rh.5
Clon 43.20 Rhesus MLN 42
Rh-6
Clon 43.21 Rhesus MLN 43
Rh-7
Clon 43.23 Rhesus MLN 44
Rh-8
Clon 43.25 Rhesus MLN 45
Secuencia Cap de AAV
Número de clon Fuente
Especies
Tejido SEQ ID Núm. (ADN)
Rh-9
Clon 44.1 Rhesus Hígado 46
Rh-10
Clon 44.2 Rhesus Hígado 59
Rh-11
Clon 44.5 Rhesus Hígado 47
Rh-12
Clon 42.1B Rhesus MLN 30
Rh-13
42.2 Rhesus MLN 9
Rh-14
Clon 42.3A Rhesus MLN 32
Rh-15
Clon 42.3B Rhesus MLN 36
Rh-16
Clon 42.4 Rhesus MLN 33
Rh-17
Clon 42.5A Rhesus MLN 34
Rh-18
Clon 42.5B Rhesus MLN 29
Rh-19
Clon 42.6B Rhesus MLN 38
Rh-20
Clon 42.8 Rhesus MLN 47
Rh-21
Clon 42.10 Rhesus MLN 35
Rh-22
Clon 42.11 Rhesus MLN 37
Rh-23
Clon 42.12 Rhesus MLN 58
Rh-24
Clon 42.13 Rhesus MLN 31
Rh-25
Clon 42.15 Rhesus MLN 28
Rh-26
Clon 223.2 Rhesus Hígado 49
Rh-27
Clon 223.4 Rhesus Hígado 50
Rh-28
Clon 223.5 Rhesus Hígado 51
Rh-29
Clon 223.6 Rhesus Hígado 52
Rh-30
Clon 223.7 Rhesus Hígado 53
Rh-31
Clon 223.10 Rhesus Hígado 48
Rh-32
Clon C1 Rhesus Bazo, Duodeno, Riñón & Hígado 19
Rh-33
Clon C3 Rhesus 20
Rh-34
Clon C5 Rhesus 21
Rh-35
Clon F1 Rhesus Hígado 22
Rh-36
Clon F3 Rhesus 23
Rh-37
Clon F5 Rhesus 24
Cy.1
Clon 1.3 Cyno Sangre 14
Cy.2
Clon 13.3B Cyno Sangre 15
Cy.3
Clon 24.1 Cyno Sangre 16
Cy.4
Clon 27.3 Cyno Sangre 17
Cy.5
Clon 7.2 Cyno Sangre 18
Cy.6
Clon 16.3 Cyno Sangre 10
bb.1
Clon 29.3 Babuino Sangre 11
(continuación)
Secuencia Cap de AAV
Número de clon Fuente
Especies
Tejido SEQ ID Núm. (ADN)
bb.2
Clon 29.5 Babuino Sangre 13
Ch.1
Clon A3.3 Chimpancé Sangre 57
Ch.2
Clon A3.4 Chimpancé Sangre 54
Ch.3
Clon A3.5 Chimpancé Sangre 55
Ch.4
Clon A3.7 Chimpancé Sangre 56
Se construyó un nuevo clon de NHP empalmando fragmentos de cápsides de dos adenovirus de chimpancé en una construcción rep de AAV2. El nuevo clon, A3.1, se denomina también Ch.5 [SEQ ID Núm. 20]. Adicionalmente, la presente invención incluye dos secuencias de AAV humano, denominadas H6 [SEQ ID Núm. 25] y H2 [SEQ ID Núm. 26].
Las secuencias de ácido nucleico de AAV de la invención abarcan además la cadena que es complementaria con las cadenas proporcionadas en las secuencias que se proporcionan en la Figura 1 y en el Listado de Secuencias [SEQ ID Núm. 1, 9 – 59, 117 – 120], secuencias de ácido nucleico, así como las secuencias de ARN y de cADN correspondientes a las secuencias proporcionadas en la Figura 1 y en el Listado de Secuencias [SEQ ID Núm. 1, 9 – 59, 117 – 120], y sus cadenas complementarias. También se encuentran incluidas en las secuencias de ácido nucleico de la invención las variantes naturales y las modificaciones de diseño de las secuencias de la Figura 1 y del Listado de Secuencias [SEQ ID Núm. 1, 9 – 59, 117 – 120], y sus cadenas complementarias. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas que son conocidas en el estado de la técnica, metilación, y sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de forma natural con un nucleótido degenerado.
Incluidas además en la presente invención están las secuencias de ácido nucleico que son mayores del 85%, con preferencia de al menos alrededor de un 90%, más preferiblemente de al menos alrededor del 95%, y más preferiblemente de al menos alrededor de un 98 a 99% idénticas u homólogas a las secuencias de la invención, incluyendo la Figura 1 y el Listado de Secuencias [SEQ ID Núm. 1, 9 – 59, 117-120]. Estos términos son según se definen en la presente memoria.
También incluidos dentro de la presente invención están los fragmentos de las nuevas secuencias de AAV identificadas mediante un método que se describe en la presente memoria. Los fragmentos adecuados son de al menos 15 nucleótidos de longitud, y abarcan fragmentos funcionales, es decir, fragmentos que son de interés biológico. En una realización, estos fragmentos son fragmentos de las nuevas secuencias de la Figura 1 y de la Lista de secuencias [SEQ ID Núm. 1, 9-59, 117.120], sus cadenas complementarias, cADN y ARN complementarios de las mismas.
Se proporcionan ejemplos de fragmentos adecuados con respecto a la posición de estos fragmentos en AAV1, AAV2 o AAV7. Sin embargo, usando el alineamiento proporcionado en la presente memoria (obtenido usando el programa Clustal W en configuraciones por defecto), o técnicas similares para generar un alineamiento con otros serotipos novedosos de la invención, un experto en la materia puede identificar fácilmente los codones precisos de inicio y fin de nucleótido para los fragmentos deseados.
Ejemplos de fragmentos adecuados incluyen las secuencias que codifican las tres proteínas variables (vp) de la cápside de AAV que son variantes de empalme alternativas: vp1 [por ejemplo, nt 825 a 3049 de AAV7, SEQ ID Núm. 1]; vp2 [por ejemplo, nt 1234 – 3049 de AAV7, SEQ ID Núm. 1], y vp3 [por ejemplo, nt 1434 – 3049 de AAV7, SEQ ID Núm. 1]. Es apreciable que AAV7 tiene un codón de inicio de GTG inusual. Con excepción de unos pocos genes de limpieza, un codón de inicio de ese tipo no ha sido informado previamente en virus de ADN. Se ha considerado que los codones de inicio para vp1, vp2 y vp3 para otros serotipos de AAV son tales que permiten que el mecanismo celular de la célula anfitrión en los que residen produzcan vp1, vp2 y vp3 en una relación de 10% : 10% : 80%, respectivamente, con el fin de permitir un ensamblaje eficiente del virión. Sin embargo, se ha encontrado que el virión de AAV7 se ensambla eficientemente incluso con este raro codón de inicio de GTG. De ese modo, los inventores prevén que resulta deseable modificar el codón de inicio de la vp3 u otros serotipos de AAV para que contengan este raro codón de inicio de GTG, con el fin de mejorar la eficacia de empaquetamiento, para alterar la estructura del virión y/o para alterar la localización de epítopes (por ejemplo, epítopes de anticuerpo neutralizante) de otros serotipos de AAV. Los codones de inicio pueden ser alterados usando técnicas convencionales que incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio. Así, la presente invención abarca viriones de AAV alterados de cualquier serotipo seleccionado, compuestos por una vp3, y/u opcionalmente, una vp1 y/o una vp2 que tienen codones de inicio alterados en GTG.
Otros fragmentos adecuados de AAV incluyen un fragmento que contiene el codón de inicio para la proteína de cápside de AAV [por ejemplo, nt 468 a 3090 de AAV7, SEQ ID Núm. 1, nt 725 a 3090 de AAV7, SEQ ID Núm. 1, y regiones correspondientes de los otros serotipos de AAV]. Incluso otros fragmentos de AAV7 y de otros nuevos serotipos de AAV identificados usando los métodos descritos en la presente memoria incluyen los que codifican las proteínas rep, incluyendo la rep 78 [por ejemplo, el codón de iniciación 334 de la Figura 1 para AAV7], rep 68 [codón de iniciación nt 334 de la Figura 1 para AAV7], rep 52 [codón de iniciación 1006 de la Figura 1 para AAV7], y rep 40 [codón de iniciación 1006 de la Figura 1 para AAV7]. Otros fragmentos de interés pueden incluir las repeticiones de terminal invertido ITRs 5’ de AAV [nt 1 a 107 de la Figura 1 para AAV7]; las ITRs 3’ de AAV [nt 4704 a 4721 de la Figura 1 para AAV7], secuencias P19, secuencias P40 de AAV, el sitio de enlace rep, y el sitio decidido del terminal (TRS). Incluso otros fragmentos adecuados resultarán fácilmente evidentes para los expertos en la materia. Las regiones correspondientes en los otros nuevos serotipos de la invención pueden ser determinadas fácilmente mediante referencia a la Figura 1, o utilizando técnicas de alineamiento convencionales con las secuencias proporcionadas en la presente memoria.
Adicionalmente a la inclusión de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en las Figuras y en el Listado de Secuencias, la presente invención incluye moléculas y secuencias de ácido nucleico que están diseñadas para expresar las secuencias, proteínas y péptidos de aminoácido de los serotipos de AAV de la invención. De ese modo, la invención incluye secuencias de ácido nucleico que codifican las nuevas secuencias de aminoácido de AAV siguientes: C1 [SEQ ID Núm. 60], C2 [SEQ ID Núm. 61], C5 [SEQ ID Núm. 62], A3-3 [SEQ ID Núm. 66], A3-7 [SEQ ID Núm. 67], A3-4 [SEQ ID Núm. 68], A3-5 [SEQ ID Núm. 69], 3.3b [SEQ ID Núm. 62], 223.4 [SEQ ID Núm. 73], 2235 [SEQ ID Núm. 74], 223-10 [SEQ ID Núm. 75], 223-2 [SEQ ID Núm. 76], 223-7 [SEQ ID Núm. 77], 223-6 [SEQ ID Núm. 78], 44-1 [SEQ ID Núm. 79], 44-5 [SEQ ID Núm. 80], 44-2 [SEQ ID Núm. 81], 42-15 [SEQ ID Núm. 84], 42-8 [SEQ ID Núm. 85], 42-13 [SEQ ID Núm. 86], 42-3A [SEQ ID Núm. 87], 42-4 [SEQ ID Núm. 88], 42-5A [SEQ ID Núm. 89], 42-1B [SEQ ID Núm. 90], 42-5B [SEQ ID Núm. 91], 43-1 [S·EQ ID Núm. 92], 43-12 [SEQ ID Núm. 93], 43-5 [SEQ ID Núm. 94], 43-21 [SEQ ID Núm. 96], 43-25 [SEQ ID Núm. 97], 43-20 [SEQ ID Núm. 99], 24.1 `SEQ ID Núm. 101], 42.4 [SEQ ID Núm. 102], 7.2 [SEQ ID Núm. 103], 27.3 [SEQ ID Núm. 104], 16.3 [SEQ ID Núm. 105], 42.10 [SEQ ID Núm. 106], 42-3B [SEQ ID Núm. 107], 42-11 [SEQ ID Núm. 108], F1 [SEQ ID Núm. 109], F5 [SEQ ID Núm. 110], F3 [SEQ ID Núm. 111], 42-6B [SEQ ID Núm. 112], y/o 42-12 [SEQ ID Núm. 113], y serotipos de AAV artificiales generados usando esas secuencias y/o fragmentos únicos de las mismas.
Según se utiliza en la presente memoria, los serotipos de AAV artificiales incluyen, sin limitación, AAVs con una proteína de cápside que se produce de forma no natural. Tal cápside artificial puede ser generada mediante cualquier técnica adecuada, usando una nueva secuencia de AAV de la invención (por ejemplo, un fragmento de una proteína de cápside de vp1) en combinación con secuencias heterólogas que pueden ser obtenidas a partir de otro serotipo de AAV (conocido o nuevo), porciones no contiguas del mismo serotipo de AAV, a partir de una fuente viral de no AAV, o a partir de una fuente no viral. Un serotipo artificial de AAV puede ser, sin limitación, una cápside de AAV quimérico, una cápside de AAV recombinante, o una cápside de AAV “humanizado”.
B. Secuencias, proteínas y péptidos de aminoácido de AAV
La invención proporciona proteínas y fragmentos de las mismas que son codificadas por las secuencias de ácido nucleico de los nuevos serotipos de AAV identificados en la presente memoria, incluyendo por ejemplo el AAV7 [nt 825 a 3049 de AAV7, SEQ ID Núm. 1] y los otros nuevos serotipos proporcionados en la presente memoria. Así, las proteínas de cápside de los nuevos serotipos de la invención, incluyendo: H6 [SEQ ID Núm. 25], H2 [SEQ ID Núm. 26], 42-2 [SEQ ID Núm. 9], 42-8 [SEQ ID Núm. 27], 42-15 [SEQ ID Núm. 28], 42-5b [SEQ ID Núm. 29], 42-1b [SEQ ID Núm. 30], 42-13 [SEQ ID Núm. 31], 42-3a [SEQ ID Núm. 32], 42-4 [SEQ ID Núm. 33], 42-5a [SEQ ID Núm. 34], 42-10 [SEQ ID Núm. 35], 42-3b [SEQ ID Núm. 36], 42-11 [SEQ ID Núm. 37], 42-6b [SEQ ID Núm. 38], 43-1 [SEQ ID Núm. 39], 43-5 [SEQ ID Núm. 40], 43-12 [SEQ ID Núm. 41], 43-20 [SEQ ID Núm. 42], 43-21 [SEQ ID Núm. 43], 4323 [SEQ ID Núm. 44], 43-25 [SEQ ID Núm. 45], 44.1 [SEQ ID Núm. 47], 44.5 [SEQ ID Núm. 47], 223.10 [SEQ ID Núm. 48], 223.2 [SEQ ID Núm. 49], 223.4 [SEQ ID Núm. 50], 223.5 [SEQ ID Núm. 51], 223.6 [SEQ ID Núm. 52],
223.7 [SEQ ID Núm. 53], A3-4 [SEQ ID Núm. 54], A3.5 [SEQ ID Núm. 55], A3.7 [SEQ ID Núm. 56], A3.3 [SEQ ID Núm. 57], 42.12 [SEQ ID Núm. 58]. Y 44.2 [SEQ ID Núm. 59], pueden ser generadas fácilmente usando técnicas convencionales a partir de tramas de lectura abierta proporcionadas para los clones relacionados con anterioridad.
La invención abarca además serotipos de AAV generados usando secuencias de los nuevos serotipos de AAV de la invención, los cuales son generados usando técnicas sintéticas, recombinantes o de otro tipo, conocidas por el experto en la materia. La invención no se limita a las nuevas secuencias, péptidos y proteínas de aminoácido de AAV expresadas a partir de las nuevas secuencias de ácido nucleico del AAV de la invención y abarca secuencias, péptidos y proteínas de aminoácido generadas mediante otros métodos conocidos en el estado de la técnica, incluyendo por ejemplo síntesis química, mediante otras técnicas sintéticas o mediante otros métodos. Por ejemplo, las secuencias de cualquiera de C1 [SEQ ID Núm. 60], C2 [SEQ ID núm. 61], C5 [SEQ ID Núm. 62], A3-3 [SEQ ID Núm. 66], A3-7 [SEQ ID Núm. 67], A3-4 [SEQ ID Núm. 68], A3-5 [SEQ ID Núm. 69], 3.3b [SEQ ID Núm. 62], 223.4 [SEQ ID Núm. 73], 723-5 [SEQ ID Núm. 74], 223-10 [SEQ ID Núm. 75], 223-2 [SEQ ID Núm. 76], 223-7 [SEQ ID Núm. 77], 223-6 [SEQ ID Núm. 78], 44-1 [SEQ ID Núm. 79], 44-5 [SEQ ID Núm. 80], 44-2 [SEQ ID Núm. 81], 42-15 [SEQ ID Núm. 84], 42-8 [SEQ ID Núm. 85], 42-13 [SEQ ID Núm. 86], 42-3A [SEQ ID Núm. 87], 42-4 [SEQ ID Núm. 88], 42-5A [SEQ ID Núm. 89], 42-1B [SEQ ID Núm. 90], 42-5B [SEQ ID Núm. 91], 43-1 [SEQ ID Núm. 92], 43-12
[SEQ ID Núm. 93], 43-5 [SEQ ID Núm. 94], 43-21 [SEQ ID Núm. 96], 43-25 [SEQ ID Núm. 97], 43-20 [SEQ ID Núm. 99], 24.1 [SEQ ID Núm. 101], 42.2 [SEQ ID Núm. 102], 7.2 [SEQ ID Núm. 103], 27.3 [SEQ ID Núm. 104], 16.3 [SEQ ID Núm. 105], 42.10 [SEQ ID Núm. 106], 42-3B [SEQ ID Núm. 107], 42-11 [SEQ IDE Núm. 108], F1 [SEQ ID Núm. 109], F5 [SEQ ID Núm. 110], F3 [SEQ ID Núm. 111], 42-6B [SEQ ID Núm. 112], y/o 42-12 [SEQ ID Núm. 113] pueden ser generadas fácilmente usando una diversidad de técnicas.
Las técnicas de producción adecuadas son bien conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., “Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio”, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Alternativamente, los péptidos pueden ser sintetizados mediante métodos bien conocidos de síntesis de péptidos de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1962); Stewart and Young, “Síntesis de Péptido de Fase Sólida” (Freeman, San Francisco, 1969), pp. 2762). Estos y otros métodos de producción adecuados están dentro del conocimiento de los expertos en la materia y no son una limitación de la presente invención.
Las proteínas particularmente deseables incluyen las proteínas de cápside de AAV, las cuales son codificadas por las secuencias de nucleótido identificadas en lo que antecede, Las secuencias de muchas de las proteínas de cápside de la invención son proporcionadas en un alineamiento en la Figura 2 y/o en el Listado de Secuencias, SEQ ID Núm. 2 y 60 a 115. La cápside de AAV está compuesta por tres proteínas, vp1, vp2 y vp3, las cuales son variantes de empalme alternativas. La secuencia de longitud completa proporcionada en estas Figuras es la de vp1. En base a la numeración de la cápside de AAV7 [SEQ ID Núm. 2], las secuencias de vp2 abarcan los aminoácidos 138 – 737 de AAV7 y las secuencias de vp3 abarcan los aminoácidos 203 – 737 de AAV7. Con esta información, un experto en la materia puede determinar fácilmente la localización de las proteínas vp2 y vp3 para los otros serotipos novedosos de la invención.
Otras proteínas y fragmentos deseables de la proteína de cápside incluyen las regiones constantes y variables, localizadas entre regiones hipervariables (HPV), y las secuencias de las propias regiones HPV. Un algoritmo desarrollado para determinar áreas de divergencia de secuencia en el AAV2 ha producido 12 regiones hipervariables (HVR) de las que 5 se solapan o son parte de las cuatro regiones variables descritas con anterioridad. [Chiorini et al., J. Virol. 73: 1309-19 (1999); Rutledge et al., J. Virol., 72: 309-319]. Usando este algoritmo y/o las técnicas de alineamientos descritas en la presente memora, se determinan la HVRs de los nuevos serotipos de AAV. Por ejemplo, con respecto al número de la vp1 de AAV2 [SEQ ID Núm. 70], las HVRs se localizan como sigue: HVR1, aa 146-152; HVR2, aa 182-186; NVR3, aa 262-264; HVR4, aa 381-383; HVR5, aa 450-474; HVR6, aa 490-495; HVR7, aa 500-504; HVR8, aa 514-522; HVR9, aa 534-555; HVR10, aa 581-594; HVR11, aa 658-667; y HVR12, aa 705
719. Utilizando un alineamiento preparado de acuerdo con métodos convencionales y las nuevas secuencias proporcionadas en la presente memoria [Véase, por ejemplo, la Figura 2], se puede determinar la posición de la HVR en los nuevos serotipos de AAV de la invención. Por ejemplo, utilizando la Figura 2, se puede determinar fácilmente que para la AAV7 [SEQ ID Núm. 2], la HVR1 se localiza en aa 146 152; la HVR2 se localiza en 182-187; la HVR3 se localiza en aa 263-266, la HVR4 se localiza en aa 383-385, la HVR5 se localiza en aa 451-475; la HVR6 se localiza en aa 491-496 de AAV7; la HVR7 se localiza en aa 501-505; la HVR8 se localiza en aa 513-521; la HVR9 se localiza en 533-534: la HVR10 se localiza en aa 583-596; la HVR11 se localiza en aa 660-669; la HVR12 se localiza en aa 707-721. Usando la información proporcionada en la presente memoria, se pueden determinar fácilmente las HVRs para los otros nuevos serotipos de la invención.
Adicionalmente, dentro de la cápside, se han identificado casetes de identidad de aminoácido. Estas casetes son de particular interés, dado que las mismas son útiles en la construcción de serotipos artificiales, por ejemplo reemplazando una casete de HVR1 de un serotipo seleccionado por una casete de HVR1 de otro serotipo. Algunas de estas casetes de identidad se aprecian en la Figura 2. Véase, Figura 2, que la provisión de alineamiento Clustal X, que tiene una regla, ha sido mostrada por debajo de las secuencias, empezando en 1 para la primera posición de residuo. La línea por encima de la regla se utiliza para marcar posiciones fuertemente conservadas. Se utilizan tres caracteres (*, :, ,). “*” indica posiciones que tienen un residuo único, totalmente conservado. “:” indica que un grupo “fuerte” está totalmente conservado. “.” Indica que un grupo “más débil” se ha conservado en su totalidad. Éstos son todos los grupos que puntúan positivamente que se producen en la matriz Gonnet Pam250. Los grupos fuertes se definen como puntuación fuerte >0,5 y los grupos débiles se definen como puntuación débil <0,5.
Adicionalmente, ejemplos de otros fragmentos adecuados de cápsides de AAV incluyen, con respecto a la numeración de AAV2 [SEQ ID Núm. 70], aa 24-42, aa 25-28; aa 81-85; aa 133-165; aa 137-143; aa 154-156; aa 194-208; aa 261-274; aa 262-274; aa 171-173; aa 413-417; aa 449-478; aa 494-525; aa 534-571; aa 581-601; aa 660-671; aa 709-723. Incluso otros fragmentos deseables incluyen, por ejemplo, en AAV7, aminoácidos 1 a 184 de SEQ ID Núm. 2, aminoácidos 199 a 259; aminoácidos 274 a 446; aminoácidos 603 a 659; aminoácidos 670 a 706; aminoácidos 724 a 736; aa 185 a 198; aa 260 a 273; aa 447 a 477; aa 495 a 602; aa 660 a 669; y aa 707 a 723. Incluso otras regiones deseables, basadas en la numeración de AAV7 [SEQ ID Núm. 2], se seleccionan a partir del grupo consistente en aa 185 a 198; aa 260 a 273; aa 447 a 477; aa 495 a 602; aa 660 a 669; y aa 707 a 723. Usando el alineamiento proporcionado en la presente memoria realizado con el uso del programa Clustal X en configuraciones por defecto, o usando otros programas de alineamiento disponibles pública o comercialmente en configuraciones por defecto, un experto en la materia puede determinar fácilmente fragmentos correspondientes de las nuevas cápsides de AAV de la invención.
Otras proteínas deseables son las proteínas rep de AAV [aa 1 a 623 de SEQ ID Núm. 3 para AAV7] y fragmentos funcionales de las mismas, incluyendo por ejemplo aa 1 a 171, aa 172 a 372, aa 373 a 444, aa 445 a 623 de SEQ ID Núm. 3, entre otros. Adecuadamente, tales fragmentos son de al menos 8 aminoácidos de longitud. Véase la Figura
3. Regiones comparables pueden ser identificadas en las proteínas del otro nuevo AAV de la invención, usando las técnicas descritas en la presente memoria y las conocidas en el estado de la técnica. Adicionalmente, se pueden utilizar fácilmente fragmentos de otras longitudes deseadas. Tales fragmentos pueden ser producidos recombinantemente o por otros medios adecuados, por ejemplo mediante síntesis química.
Las secuencias, proteínas y fragmentos de la invención pueden ser producidos mediante cualquier medio adecuado, incluyendo producción recombinante, síntesis química, u otros medios sintéticos. Tales métodos de producción están dentro del conocimiento de los expertos en la materia y no son una limitación de la presente invención.
IV. Producción de rAAV con nuevas cápsides de AAV
La invención abarca serotipos nuevos de AAV, de tipo natural, en donde las secuencias de cuyos serotipos de AAV de tipo natural están libres de ADN y/o de material celular con los virus que se asocian en la naturaleza. En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas que utilizan las nuevas secuencias de AAV de la invención, incluyendo fragmentos de las mismas, para la producción de moléculas útiles en el suministro de un gen heterólogo
o de otras secuencias de ácido nucleico a una célula objetivo.
Las moléculas de la invención que contienen secuencias de un nuevo serotipo de AAV según la invención incluyen cualquier elemento (vector) genético que puede ser suministrado a una célula anfitrión, por ejemplo ADN desnudo, un plásmido, fago, transposón, cósmido, episoma, una proteína en un vehículo de suministro no viral (por ejemplo, un portador a base de lípido), virus, etc., que transfiere las secuencias portadas sobre el mismo. El vector seleccionado puede ser suministrado mediante cualquier método adecuado, incluyendo transfección, electroporación, suministro de liposoma, técnicas de fusión de membrana, gránulos recubiertos de ADN de alta velocidad, infección viral y fusión de protoplasto. Los métodos usados para construir cualquier realización de esta invención son conocidos por los expertos en manipulación de ácido nucleico e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante, y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., “Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.
En una realización, los vectores de la invención contienen secuencias que codifican una nueva cápside de AAV de la invención (por ejemplo, cápside de AAV7, AAV 44-2 (rh. 10), una cápside de AAV10, una cápside de AAV11, una cápside de AAV12), o un fragmento de una o más de esas cápsides de AAV. Alternativamente, los vectores pueden contener la propia proteína de cápside, o un fragmento de la misma.
Opcionalmente, los vectores de la invención pueden contener secuencias que codifican proteínas rep de AAV. Tales secuencias rep pueden ser del mismo serotipo de AAV que esté proporcionando las secuencias cap. Alternativamente, la presente invención proporciona vectores en los que las secuencias rep son procedentes de un serotipo de AAV que difiere del que está proporcionando las secuencias cap. En una realización, las secuencias rep y cap están expresadas a partir de fuentes separadas (por ejemplo, vectores separados, o una célula anfitrión y un vector). En otra realización, esas secuencias rep están expresadas a partir de la misma fuente que las secuencias cap. En esta realización, las secuencias rep pueden ser fusionadas con secuencias cap de un serotipo de AAV diferente para formar un vector de AAV quimérico. Opcionalmente, los vectores de la invención contienen además un minigén que comprende un transgén seleccionado que está flanqueado por ITRs 5’ de AAV y por ITRs 3’ de AAV.
De ese modo, en una realización, los vectores descritos en la presente memoria contienen secuencias de ácido nucleico que codifican una cápside de AAV intacta que puede proceder de un solo serotipo de AAV (por ejemplo, AAV7 u otro nuevo AAV). Alternativamente, estos vectores contienen secuencias que codifican cápsides artificiales que contienen uno o más fragmentos de la cápside de AAV7 (o de otro AAV nuevo) fusionados con proteínas de cápside de AAV heterólogo o no de AAV (o fragmentos de las mismas). Estas proteínas de cápside artificiales se seleccionan a partir de porciones no contiguas de la cápside de AAV7 (o de otro AAV nuevo) o a partir de cápsides de otros serotipos de AAV. Por ejemplo, puede ser deseable modificar las regiones de codificación de una o más de las vp1 de AAV, por ejemplo en una o más de las regiones hipervariables (es decir, HPV1-12), o vp2 y/o vp3. En otro ejemplo, puede ser deseable alterar el codón inicial de la proteína vp3 en GTG. Estas modificaciones pueden consistir en incrementar la expresión, la producción y/o en mejorar la purificación en los sistemas de expresión seleccionados, o para otros objetos deseados (por ejemplo, para cambiar tropismo o alterar epítopes de anticuerpo neutralizante).
Los vectores descritos en la presente memoria, por ejemplo un plásmido, son útiles para una diversidad de propósitos, pero son particularmente adecuados para su uso en la producción de un rAAV que contiene una cápside que comprende secuencias de AAV o un fragmento de las mismas. Estos vectores, incluyendo el rAAV, sus elementos, construcción y usos, se describen con detalle en la presente memoria.
En un aspecto, la invención proporciona un método de generar un virus adeno-asociado recombinante (AAV) que tiene una cápside de serotipo 7 de AAV (u otro nuevo AAV), o una porción de la misma. Este método incluye cultivar una célula anfitrión que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de cápside de serotipo 7
de virus adeno-asociado (AAV) (o de otro AAV nuevo), o un fragmento de la misma, según se define en la presente memoria; un gen rep funcional; un minigén compuesto de, como mínimo, repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV y un transgén; y funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigén en la proteína de cápside de AAV7 (o de otro AAV nuevo).
Los componentes que requieren ser cultivados en la célula anfitrión para empaquetar un minigén de AAV en una cápside de AAV pueden ser proporcionados a la célula anfitrión en trans. Alternativamente, uno cualquiera o más de los componentes requeridos (por ejemplo, el minigén, secuencias rep, secuencias cap, y/o funciones auxiliares) pueden ser proporcionados mediante una célula anfitrión estable que haya sido diseñada para contener uno o más de los componentes requeridos usando métodos conocidos por los expertos en la materia. De manera más adecuada, tal célula anfitrión estable contendrá el (los) componente(s) requerido(s) bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, el (los) componente(s) puede(n) estar bajo el control de un promotor constitutivo. Ejemplos de promotores inducibles y constitutivos adecuados se proporcionan en la presente memoria, en la discusión de elementos reguladores adecuados para su uso con el transgén. En otra alternativa adicional, una célula anfitrión estable seleccionada puede contener el (los) componente(s) seleccionado(s) bajo el control de un promotor constitutivo y otro(s) componente(s) seleccionado(s) bajo el control de uno o más promotores inducibles. Por ejemplo, se puede generar una célula anfitrión estable que sea derivada de células 293 (que contenga funciones auxiliares E1 bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contenga las proteínas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. Otras células anfitrión estables pueden ser generadas por los expertos en la materia.
El minigén, las secuencias rep, las secuencias cap, y las funciones auxiliares requeridas para producir el rAAV de la invención pueden ser suministradas a la célula anfitrión de empaquetamiento en forma de cualquier elemento genético que transfiera las secuencias portadas en el mismo. El elemento genético seleccionado puede ser suministrado por cualquier método adecuado, incluyendo los descritos en la presente memoria. Los métodos usados para construir cualquier realización de la presente invención son conocidos por los expertos en manipulación de ácido nucleico e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante, y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., “Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. De forma similar, los métodos de generación de viriones de rAAV son bien conocidos y la selección de un método adecuado no es una limitación de la presente invención. Véase, por ejemplo, K. Fisher et al., J. Virol., 70: 520-532 (1993) y la Patente US núm. 5.478.745.
A. El minigén
El minigén está compuesto, como mínimo, por un transgén y sus secuencias reguladoras, y por repeticiones de terminal invertido (ITRs) 5’ y 3’ de AAV. Este minigén es el que se empaqueta en una proteína de cápside y se suministra a una célula anfitrión seleccionada.
1. El transgén
El transgén es una secuencia de ácido nucleico, heteróloga respecto a las secuencias de vector que flanquean el transgén, que codifica un polipéptido, una proteína u otro producto de interés. La secuencia de codificación de ácido nucleico está enlazada operativamente a componentes reguladores de una manera que permite transcripción, traducción y/o expresión de transgén en una célula anfitrión.
La composición de la secuencia de transgén dependerá del uso para el que se disponga el vector resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia de transgén incluye una secuencia informadora, cuya expresión produce una señal detectable. Tales secuencias informadoras incluyen, sin limitación, secuencias de ADN que codifican β-lactamasa, βgalactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, quinasa timidina, proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, proteínas de enlace de membrana que incluyen, por ejemplo, CD2, CD4, CD8, la proteína de hemaglutinina de influenza, y otras bien conocidas en el estado de la técnica, para las que existen o pueden ser producidos con medios convencionales anticuerpos de alta afinidad dirigidos a las mismas, y proteínas de fusión que comprenden una proteína enlazada por membrana fusionada apropiadamente con un dominio de etiqueta de antígeno procedente, entre otros, de hemaglutinina o Myc.
Estas secuencias de codificación, cuando se asocian con elementos reguladores que activan su expresión, proporcionan señales detectables con medios convencionales, incluyendo ensayos enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescencia u otros espectrográficos, ensayos de clasificación de célula de activación fluorescente y ensayos inmunológicos, incluyendo el ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) y la inmunohistoquímica. Por ejemplo, cuando la secuencia marcadora es el gen LacZ, se detecta la presencia del vector portador de la señal mediante ensayos sobre actividad de beta-galactosidasa. Cuando el transgén es proteína fluorescente verde o luciferasa, el vector portador de la señal puede ser medido visualmente mediante producción de color o luminosidad en un luminómetro.
Sin embargo, deseablemente, el transgén es una secuencia no marcadora que codifica un producto que es útil en biología y medicina, tal como proteínas, péptidos, ARN, enzimas, o ARNs catalíticos. Las moléculas deseables de ARN incluyen tARN, dsARN, ARN ribosómico, ARNs catalíticos, y ARNs antisentido. Un ejemplo de una secuencia de ARN útil es una secuencia que extinga la expresión de una secuencia objetivada de ácido nucleico en el animal
tratado.
El transgén puede ser usado para corregir o mejorar deficiencias de gen, las cuales pueden incluir deficiencias en las que los genes nominales se expresan a niveles menores que los normales o deficiencias en las que el producto de gen funcional no está expresado. Un tipo preferido de secuencia de transgén codifica una proteína terapéutica o un polipéptido que es expresado en una célula anfitrión. La invención incluye además el uso de múltiples transgenes, por ejemplo para corregir o mejorar un defecto de gen causado por una proteína multi-subunidad. En ciertas situaciones, se puede usar un transgén diferente para codificar cada subunidad de una proteína, o para codificar diferentes péptidos o proteínas. Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica la subunidad de proteína es grande, por ejemplo para una inmunoglobulina, el factor de crecimiento derivado de plaqueta, o una proteína de distrofina. Con el fin de que la célula produzca la proteína multi-subunidad, una célula se infecta con el virus recombinante que contiene cada una de las diferentes subunidades. Alternativamente, diferentes subunidades de una proteína pueden ser codificadas por el mismo transgén. En ese caso, un transgén simple incluye el ADN que codifica cada una de las subunidades, estando el ADN para cada subunidad separado por un sitio de entrada de ribozima interno (IRES). Esto resulta deseable cuando el tamaño del ADN que codifica cada una de las subunidades es pequeño, por ejemplo el tamaño total del ADN que codifica las subunidades y del IRES es menor de cinco kilobases. Como alternativa a un IRES, el ADN puede estar separado por secuencias que codifican un péptido 2A, el cual se auto-escinde en un evento post-traslacional. Véase, por ejemplo, M.L. Donnelly, et al., J. Gen. Virol., 78(Pt 1): 13-21 (Enero 1997); Furler, S., et al., Gene Ther., 8(11): 864-873 (Junio 2001); Klump, H., et al., Gene Ther., 8(10): 811-817 (Mayo 2001). Este péptido 2A es significativamente más pequeño que un IRES, lo que hace que sea muy adecuado para su uso cuando el espacio es un factor limitativo. Sin embargo, el transgén seleccionado puede codificar cualquier producto biológicamente activo u otro producto, por ejemplo un producto deseable para su estudio.
Transgenes adecuados pueden ser fácilmente seleccionados por un experto en la materia. La selección de los transgenes no se considera que sea una limitación de la presente invención.
2. Elementos reguladores
Adicionalmente a los elementos principales identificados con anterioridad para el minigén, el vector incluye también elementos de control convencionales necesarios que están enlazados operativamente al transgén de una manera que permite su transcripción, traducción y/o expresión en una célula transfectada con el vector de plásmido o infectada con el virus producido por la invención. Según se utiliza en la presente memoria, las secuencias “enlazadas operativamente” incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas con el gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.
Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias apropiadas de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de transcripción; señales de procesamiento eficiente de ARN tal como señales de empalme y poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan mARN citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de traducción (es decir, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que potencian estabilidad de proteína; y, cuando se desee, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. Un gran número de secuencias de control de expresión, incluyendo promotores que son naturales, constitutivos, inducibles y/o específicos del tejido, son conocidos en el estado de la técnica y pueden ser utilizados.
Ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor LTRR de virus de sarcoma de Rous (RSV) retroviral (opcionalmente con el potenciador de RSV), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) [véase, por ejemplo, Boshart et al., Célula, 41: 521-530 (1985)], el promotor de SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de β-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK), y el promotor de EF1α [Invitrogen].
Los promotores inducibles permiten regulación de expresión de gen y pueden ser regulados mediante compuestos suministrados exógenamente, factores ambientales tales como la temperatura, o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o en células replicantes solamente. Promotores inducibles y sistemas inducibles están disponibles a partir de una amplia diversidad de fuentes comerciales que incluyen, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito muchos otros sistemas y pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en la materia. Ejemplos de promotores inducibles regulados por promotores suministrados exógenamente incluyen el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc, el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (DEX), el sistema de promotor de polimerasa T7 [documento WO 98/10088], el promotor de insecto de ecdysona [No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1966)], el sistema reprimible por tetraciclina [Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)], el sistema inducible por tetraciclina [Gossen et al., Science, 268: 17661769 (1995), véase también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)], el sistema inducible por RU486 [Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997) y Wang et al., Gene Ther., 4: 432-441 (1997)] y el sistema inducible por rapamicina [Magari et al., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]. Otros tipos más de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son los que se regulan mediante un estado fisiológico específico,
por ejemplo temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o en células replicantes solamente.
En otra realización, se puede usar el promotor natural para el transgén. El promotor natural puede ser preferido cuando se desee que la expresión del transgén mimetice la expresión natural. El promotor natural puede ser usado cuando la expresión del transgén deba ser regulada temporalmente o mediante desarrollo, o de una manera específica del tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una realización adicional, se pueden usar también otros elementos de control de expresión natural, tal como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias de consenso de Kozak, para mimetizar la expresión natural.
Otra realización del transgén incluye un transgén enlazado operativamente a un promotor específico del tejido. Por ejemplo, si se desea una expresión en el músculo esquelético, se debería usar un promotor activo en el músculo. Éstos incluyen los promotores procedentes de genes que codifican la β-actina esquelética, cadena 2A ligera de miosina, distrofina, creatina quinasa del músculo, así como también promotores de músculo sintéticos que presentan actividades más altas que los promotores que se producen de forma natural (véase Li et al., Nat. Bioech., 17: 241245 (1999)). Ejemplos de promotores que son específicos del tejido son conocidos para el hígado (albúmina, Miyatake, et al., J. Virol., 71: 5124-32 (1997); promotor central del virus de la hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther.,
3: 1002-9 (1996); alfafetoproteína (AFP), Arbutnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), osteocalcina ósea (Stein, et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)); sialoproteína ósea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11: 654-64 (1996)), linfocito (CD2, Hansal et al., J. Immunol. 161: 1063-8 (1998); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena de receptor de célula T), neuronal tal como promotor de enolasa específica de neurona (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13: 503-15 (1993)), gen de cadena ligera de neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991)), y el gen vgf específico de neurona (Piccioli et al., Neuron, 15: 373-84 (1995)), entre otros.
Opcionalmente, los plásmidos que portan transgenes terapéuticamente útiles pueden incluir también marcadores o los genes informadores seleccionables pueden incluir secuencias que codifican la resistencia a la geniticina, higromicina o la purimicina, entre otros. Tales genes informadores o marcadores seleccionables (con preferencia, situados fuera del genoma viral que va a ser rescatado) pueden ser usados para señalar la presencia de los plásmidos en células bacterianas, tal como la resistencia a la ampicilina. Otros componentes del plásmido pueden incluir un origen de replicación. Las selecciones de estos y de otros promotores y de elementos de vector son convencionales y muchas de esas secuencias están disponibles [véase, por ejemplo, Sambrook et al., y las referencias citadas en el documento].
La combinación de transgén, promotor/potenciador, e ITRs 5’ y 3’, se menciona como “minigén” para facilidad de la referencia al mismo. Siempre según las enseñanzas de la presente invención, el diseño de tal minigén puede hacerse recurriendo a técnicas convencionales.
3. Suministro del minigén a una célula anfitrión de empaquetamiento
El minigén puede ser portado sobre cualquier vector adecuado, por ejemplo un plásmido, que sea suministrado a una célula anfitrión. Los plásmidos útiles en la presente invención pueden estar diseñados de tal modo que los mismos sean adecuados para la replicación y, opcionalmente, la integración en células procarióticas, en células de mamíferos, o en ambas. Estos plásmidos (u otros vectores portadores de la molécula 3TTR heteróloga de ITR 5’ de AAV) contienen secuencias que permiten la replicación del minigén en eucariotas y/o procariotas y marcadores de selección para esos sistemas. Los genes marcadores o informadores seleccionables pueden incluir secuencias que codifican la resistencia a la geneticina, la higromicina o la purimicina, entre otros. Los plásmidos pueden contener también ciertos genes informadores o marcadores seleccionables que pueden ser usados para señalar la presencia del vector en células bacterianas, tal como resistencia a la ampicilina. Otros componentes del plásmido pueden incluir un origen de replicación y un amplicón, tal como el sistema de amplicón que emplea el antígeno nuclear del virus de Epstein Barr. Este sistema de amplicón, u otros componentes de amplicón similares, permiten una replicación episómica de copia elevada en las células. Con preferencia, la molécula que porta el minigén es transfectada en la célula, donde puede existir transitoriamente. Alternativamente, el minigén (que porta la ITR 5’ de AAV - molécula heteróloga - ITR 3’) puede estar integrado de forma estable en el genoma de la célula anfitrión, ya sea cromosómicamente o ya sea como episoma. En ciertas realizaciones, el minigén puede estar presente en múltiples copias, opcionalmente en concatámeros de cabeza-con-cabeza, cabeza-con-cola o cola-con-cola. Se conocen técnicas de transfección adecuadas y que pueden ser utilizadas fácilmente para suministrar el minigén a una célula anfitrión.
En general, cuando se suministra el vector que comprende los minigenes mediante transfección, el vector es suministrado en una cantidad de alrededor de 5 µg a alrededor de 100 µg de ADN, y con preferencia de alrededor de 10 a alrededor de 50 µg de ADN en aproximadamente 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 1013 células, y con preferencia aproximadamente 105 células. Sin embargo, se pueden ajustar las cantidades relativas de ADN vector en células anfitrión, tomando en consideración factores tales como el vector seleccionado, el método de suministro y las células anfitrión seleccionadas.
B. Secuencias rep y cap
Adicionalmente al minigén, la célula anfitrión contiene las secuencias que activan la expresión de la nueva proteína de cápside de AAV (por ejemplo, de AAV7 u otra nueva cápside de AAV o una proteína de cápside artificial que comprenda un fragmento de una o más de esas cápsides) en la célula anfitrión y secuencias rep del mismo serotipo que las ITRs de AAV encontradas en el minigén. Las secuencias cap y rep de AAV pueden ser obtenidas de forma independiente a partir de una fuente de AAV tal como se ha descrito anteriormente y pueden ser introducidas en la célula anfitrión de una manera conocida por un experto en la materia según se ha descrito con anterioridad. Adicionalmente, cuando se seudotipa una nueva cápside de AAV de la invención, las secuencias que codifican cada una de las proteínas rep esenciales pueden ser suministradas por el mismo serotipo de AAV, o las secuencias que codifican las proteínas rep pueden ser suministradas por diferentes serotipos de AAV (por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 o uno de los nuevos serotipos identificados en la presente memoria). Por ejemplo, las secuencias rep78/68 pueden proceder de AAV2, mientras que las secuencias rep52/40 pueden proceder de AAV1.
En una realización, la célula anfitrión contiene de forma estable la proteína de cápside bajo el control de un promotor adecuado, tal como los que se han descrito en lo que antecede. De manera más preferible, en esta realización, la proteína de cápside es expresada bajo el control de un promotor inducible. En otra realización, la proteína de cápside se suministra a la célula anfitrión en trans. Cuando se suministra a la célula anfitrión en trans, la proteína de cápside puede ser suministrada por medio de un plásmido que contenga las secuencias necesarias para dirigir expresión de la proteína de cápside seleccionada en la célula anfitrión. Más deseablemente, cuando se suministra a la célula anfitrión en trans, el plásmido que porta la proteína de cápside porta también otras secuencias requeridas para el empaquetamiento del rAAV, por ejemplo, las secuencias rep.
En otra realización, la célula anfitrión contiene de forma estable las secuencias rep bajo el control de un promotor adecuado, tal como los que se han descrito en lo que antecede. Más deseablemente, en esta realización, las proteínas rep esenciales se expresan bajo el control de un promotor inducible. En otra realización, las proteínas rep son suministradas a la célula anfitrión en trans. Cuando se suministran a la célula anfitrión en trans, las proteínas rep pueden ser suministradas por medio de un plásmido que contenga las secuencias necesarias para dirigir la expresión de las proteínas rep seleccionadas en la célula anfitrión. Más deseablemente, cuando se suministran a la célula anfitrión en trans, el plásmido que porta la proteína de cápside porta también otras secuencias requeridas para empaquetar el rAAV, por ejemplo las secuencias rep y cap.
Así, en una realización, las secuencias rep y cap pueden ser transfectadas en la célula anfitrión sobre una única molécula de ácido nucleico y existir establemente en la célula a modo de episoma. En otra realización, las secuencias rep y cap están integradas establemente en el genoma de la célula. Otra realización tiene las secuencias rep y cap expresadas transitoriamente en la célula anfitrión. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico útil para tal transfección comprende, desde 5’ hasta 3’, un promotor, un separador opcional intercalado entre el promotor y el sitio de inicio de la secuencia de gen rep, una secuencia de gen rep de AAV, un separador opcional intercalado entre el promotor y el sitio de inicio de la secuencia de gen rep, una secuencia de gen rep de AAV, y una secuencia de gen cap de AAV.
Opcionalmente, las secuencias rep y/o cap pueden ser suministradas sobre un vector que contenga otras secuencias de ADN que van a ser introducidas en las células anfitrión. Por ejemplo, el vector puede contener la construcción de rAAV que comprende el minigén. El vector puede comprender uno o más de los genes que codifican las funciones auxiliares, por ejemplo las proteínas adenovirales E1, E2a, y E4ORF6, y el gen para VAI ARN.
Con preferencia, el promotor usado en la construcción puede ser cualquiera de los promotores constitutivo, inducible
o natural conocidos por un experto en la materia o como se ha discutido en lo que antecede. En una realización, se emplea una secuencia de promotor P5 de AAV. La selección del AAV para proporcionar cualquiera de estas secuencias no limita la invención.
En otra realización preferida, el promotor para rep es un promotor inducible, según se ha discutido en lo que antecede en relación con los elementos reguladores de transgén. Un promotor preferido para expresión rep es el promotor T7. El vector que comprende el gen rep regulado por el promotor T7 y el gen cap, es transfectado o transformado en una célula que expresa ya sea constitutivamente o ya sea induciblemente la polimerasa T7. Véase el documento WO 98/10088, publicado el 12 de Marzo de 1998.
El separador es un elemento opcional en el diseño del vector. El separador es una secuencia de ADN intercalada entre el promotor y el sitio de inicio de ATG de gen rep. El separador puede tener cualquier diseño deseado; es decir, puede ser una secuencia aleatoria de nucleótidos, o alternativamente puede codificar un producto de gen, tal como un gen marcador. El separador puede contener genes que incorporen típicamente sitios de inicio/parada y de poliA. El separador puede ser una secuencia no codificadora de ADN procedente de una procariota o una eucariota, una secuencia repetitiva no codificadora, una secuencia codificadora sin controles transcripcionales o una secuencia codificadora con controles transcripcionales. Dos ejemplos de fuentes de secuencias separadoras son las secuencias en escalera de fago λ o secuencias en escalera de levadura, que están disponibles comercialmente, por ejemplo en Gibco o Invitrogen, entre otros. El separador puede ser de cualquier tamaño suficiente para reducir la expresión de los productos de gen rep78 y rep68, dejando los productos de gen rep52, rep40 y cap expresados a
niveles normales. La longitud del separador puede estar por lo tanto en la gama de aproximadamente 10 bp a aproximadamente 10,0 kbp, con preferencia en la gama de aproximadamente 100 bp a aproximadamente 8,0 kbp. Para reducir la posibilidad de recombinación, el separador es con preferencia menor de 2 kbp de longitud, aunque la invención no está limitada por ello.
Aunque la(s) molécula(s) que proporciona(n) rep y cap puede(n) existir en la célula anfitrión transitoriamente (es decir, mediante transfección), se prefiere que una o ambas de las proteínas rep y cap y el (los) promotor(es) que controla(n) su expresión esté(n) expresado(s) de manera estable en la célula anfitrión, por ejemplo como episoma o mediante integración en el cromosoma de la célula anfitrión. Los métodos empleados para construir realizaciones de la presente invención son técnicas convencionales de ingeniería genética o de ingeniería recombinante tales como las que se han descrito en las referencias anteriores. Mientras que la invención proporciona ejemplos ilustrativos de construcciones específicas, usando la información que se proporciona en la presente memoria un experto en la materia puede seleccionar y diseñar otras construcciones adecuadas usando una opción de separadores, promotores P5, y otros elementos, incluyendo al menos una señal de inicio y de parada traslacional, y la adición opcional de sitios de poliadenilación.
En otra realización de la presente invención, la proteína rep o cap puede ser proporcionada de forma estable por una célula anfitrión.
C. Las funciones auxiliares
La célula anfitrión de empaquetamiento requiere también funciones auxiliares con el fin de empaquetar el rAAV de la invención. Opcionalmente, estas funciones pueden ser suministradas por un herpesvirus. Más deseablemente, cada una de las funciones auxiliares es proporcionada a partir de una fuente de adenovirus humano o de primate no humano, tal como las descritas con anterioridad y/o disponibles a partir de una diversidad de fuentes. Incluyendo la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA (US). En una realización actualmente preferida, la célula anfitrión está dotada de, y/o contiene, un producto de gen E1a, un producto de gen E1b, un producto de gen E2a, y/o un producto de gen E4 ORF6. La célula anfitrión puede contener otros genes adenovirales tales como VAI ARN, pero estos genes no se requieren. En una realización preferida, no se encuentran presentes otros genes de adenovirus en la célula anfitrión.
Mediante “ADN adenoviral que expresa el producto de gen E1a”, se indica cualquier secuencia de adenovirus que codifica E1a o cualquier porción de E1a funcional. El ADN adenoviral que expresa el producto de gen E2a y el ADN adenoviral que expresa los productos de gen E4 ORF6 se definen de forma similar. También están incluidos los alelos cualesquiera u otras modificaciones del gen adenoviral o porción funcional del mismo. Ales modificaciones pueden ser introducidas deliberadamente recurriendo a ingeniería genética o a técnicas mutagénicas para aumentar la función adenoviral de alguna manera, así como las variantes alélicas de las mismas que ocurran de forma natural. Tales modificaciones y métodos para manipular ADN para conseguir esas funciones de gen adenoviral son conocidas por los expertos en la materia.
Los productos de gen de adenovirus E1a, E1b, E2a, y E4ORF6, así como cualesquiera otras funciones auxiliares deseadas, pueden ser proporcionados usando cualquier medio que permita su expresión en una célula. Cada una de las secuencias que codifican esos productos puede estar sobre un vector separado, o uno o más genes pueden estar en el mismo vector. El vector puede ser cualquier vector conocido en el estado de la técnica o descrito en lo que antecede, incluyendo plásmidos, cósmidos y virus. La introducción en la célula anfitrión del vector puede ser lograda con cualquier medio conocido en el estado de la técnica o descrito con anterioridad, incluyendo técnicas de transfección, infección, electroporación, suministro de liposoma, fusión de membrana, gránulos recubiertos de ADN de alta velocidad, infección viral y fusión de protoplasto, entre otros. Uno o más de los genes adenovirales pueden estar integrados establemente en el genoma de la célula anfitrión, expresados establemente como episomas, o expresados transitoriamente. Los productos de gen pueden estar todos expresados transitoriamente, sobre un episoma o integrados establemente, o algunos de los productos de gen pueden estar expresados establemente mientras otros están expresados transitoriamente. Además, los promotores para cada uno de los genes adenovirales pueden ser seleccionados independientemente a partir de un promotor constitutivo, un promotor inductivo o un promotor adenoviral natural. Los promotores pueden ser regulados por un estado fisiológico específico del organismo o de la célula (es decir, mediante el estado de diferenciación o en células replicantes o quiescentes) o mediante factores añadidos exógenamente, por ejemplo.
D. Células anfitrión y líneas de células de empaquetamiento
La propia célula anfitrión puede ser seleccionada a partir de cualquier organismo biológico, incluyendo las células procarióticas (por ejemplo, bacterianas), y las células eucarióticas, incluyendo células de insectos, células de levadura y células de mamíferos. Las células anfitrión particularmente deseables se eligen entre cualesquiera especies de mamíferos, incluyendo sin limitación células tales como A549, WEHI,3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, Hela, células 293 (que expresan E1 adenoviral funcional), Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2 y fibroblasto primario, células de hepatocito y de mioblasto derivadas de mamíferos incluyendo el ser humano, el mono, el ratón, la rata, el conejo y el hámster. La selección de las especies de mamíferos que proporcionan las células no es una limitación de la presente invención; ni lo es el tipo de
mamífero, es decir, fibroblasto, hepatocito, células tumoral, etc. Las células más deseables no portan ningún gen de adenovirus distinto de E1, E2a, y/o E4 ORF6; ni contienen ningún otro gen de virus que pudiera dar como resultado una recombinación homóloga de un virus contaminante durante la producción de rAAV; y están capacitadas para infección o transfección de ADN y expresión del ADN transfectado. En una realización preferida, la célula anfitrión es una que tiene rep y cap transfectadas establemente en la célula.
Una célula anfitrión útil en la presente invención es una célula anfitrión transformada establemente con las secuencias que codifican rep y cap, y que es transfectada con el adenovirus E1, E2a, y E4ORF6 ADN y una construcción portadora del minigén según se ha descrito en lo que antecede. También se pueden emplear de forma similar las líneas celulares que expresan rep y/o cap estables, tal como B-50 (PCT/US98/19463), o las que se describen en la Patente U.S. núm. 5.658.785. Otra célula anfitrión deseable contiene el ADN adenoviral mínimo que sea suficiente para expresar E4 ORF6. Incluso otras líneas celulares pueden ser construidas usando las nuevas secuencias rep de AAV y las nuevas secuencias cap de AAV de la invención.
La preparación de una célula anfitrión conforme a la presente invención incluye técnicas tales como ensamblaje de secuencias de ADN seleccionadas. Este ensamblaje puede ser llevado a cabo utilizando técnicas convencionales. Tales técnicas incluyen clonación de cADN y genómica,, la cuales son bien conocidas y están descritas en Sambrook et al., citado anteriormente, el uso de secuencias de oligonucleótido solapantes del adenovirus y de los genomas de AAV, combinadas con reacción de cadena de polimerasa, métodos sintéticos, y cualesquiera otros métodos que proporcionen la secuencia de nucleótido deseada.
La introducción de las moléculas (como plásmidos o virus) en la célula anfitrión puede ser también llevada a cabo usando técnicas conocidas por el experto en la materia y discutidas a través de la descripción. En una realización preferida, se usan técnicas de transfección estándar, por ejemplo transfección de CaPO4 o electroporación, y/o infección por vectores híbridos de adenovirus/AAV en líneas celulares tales como la línea de células de riñón embriónico humano HEK 293 (una línea celular de riñón humano que contiene genes E1 de adenovirus funcional que proporciona proteínas E1 que actúan en trans).
Estos nuevos vectores basados en AAV que son generados por un experto en la materia, son beneficiosos para el suministro de gen a células anfitrión seleccionadas y para pacientes de terapia genética puesto que no se han encontrado anticuerpos neutralizantes para el AAV7 en la población humana. Además, estudios recientes muestran que no hay anticuerpos neutralizantes en poblaciones de mono cyno y de chimpancé, y menos de un 15% de reactividad cruzada de AAV7 en monos Rhesus, las especies a partir de las cuales se aisló el serotipo. Un experto en la materia puede preparar fácilmente otros vectores virales de rAAV que contengan las proteínas de cápside de AAV7 proporcionadas en la presente memoria usando un diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la materia. Se puede preparar de forma similar otros vectores virales adicionales de rAAV que contengan secuencia de AAV7 y cápsides de AAV de otro serotipo. Ventajas similares son conferidas por los vectores basados en el otro nuevo AAV de la invención.
Por lo tanto, un experto en la materia podrá entender fácilmente que las secuencias de AAV7 de la invención pueden ser adaptadas fácilmente para su uso en esos y en otros sistemas de vector viral para suministro de gen in vitro, ex vivo o in vivo. De forma similar, un experto en la materia puede seleccionar fácilmente otros fragmentos del nuevo genoma de AAV de la invención para su uso en una diversidad de sistemas de vector de rAAV y no de rAAV. Tales sistemas de vectores pueden incluir, por ejemplo, lentivirus, retrovirus, poxvirus, virus de vacunas, y sistemas adenovirales, entre otros. La selección de esos sistemas de vectores no es una limitación de la presente invención.
De ese modo, la invención proporciona además vectores generados durante las secuencias de ácido nucleico y de aminoácido del nuevo AAV de la invención. Tales vectores son útiles para una diversidad de propósitos, incluyendo el suministro de moléculas terapéuticas y para su uso en regímenes de vacuna. Particularmente deseables para el suministro de moléculas terapéuticas son los AAV recombinantes que contienen cápsides del nuevo AAV de la invención. Estas, u otras, construcciones de vector que contienen las nuevas secuencias de AAV de la invención pueden ser usadas en regímenes de vacunas, por ejemplo para el co-suministro de una citoquina, o para el suministro del propio inmunógeno.
V. Virus recombinantes y usos de los mismos
Usando las técnicas que se describen en la presente memoria, un experto en la materia puede generar un rAAV que tenga una cápside de un nuevo serotipo de la invención, o una nueva cápside que contenga uno o más nuevos fragmentos de un serotipo de AAV identificado por el método de la invención. En una realización, se puede usar una cápside de longitud completa procedente de un único serotipo, por ejemplo el AAV7 [SEQ ID Núm. 2]. En otra realización se puede generar una cápside de longitud completa que contenga uno o más fragmentos de un nuevo serotipo de la invención fusionados en una trama con secuencias de otro serotipo de AAV seleccionado. Por ejemplo, un rAAV puede contener una o más nuevas secuencias de región hipervariable de un serotipo de AAV de la invención. Alternativamente, serotipos únicos de AAV de la invención pueden ser usados en construcciones que contengan otras secuencias virales o no virales.
Resultará bien evidente para un experto en la materia una realización en la que ciertos serotipos de la invención
serán particularmente muy adecuados para determinados usos. Por ejemplo, vectores basados en cápsides de AAV7 de la invención son particularmente adecuados para su uso en el músculo; mientras que vectores basados en cápsides de rh.10 (44-2) de la invención son particularmente adecuados para su uso en el pulmón. Los usos de tales vectores no están por tanto limitados, y un experto en la materia puede utilizar esos vectores para el suministro a otros tipos de células, tejidos u órganos. Además, los vectores basados en otras cápsides de la invención pueden ser usados para el suministro en esas u otras células, tejidos u órganos.
A. Suministro de transgén
Un método para el suministro de un transgén a un anfitrión incluye transfectar o infectar una célula anfitrión seleccionada con un vector generado con las secuencias del AAV de la invención. Los métodos para el suministro son bien conocidos por los expertos en la materia y no son una limitación de la presente invención.
Un método deseable para el suministro mediado por AAV de un transgén a un anfitrión incluye transfectar o infectar una célula anfitrión seleccionada con un vector viral recombinante que contiene un transgén seleccionado bajo el control de secuencias que dirigen expresión del mismo y proteínas de cápside de AAV.
Opcionalmente, se puede ensayar primero con una muestra del anfitrión en cuanto a presencia de anticuerpos en un serotipo de AAV seleccionado. Una diversidad de formatos de ensayo para detectar anticuerpos neutralizantes son bien conocidos por los expertos en la materia. La selección de un ensayo de ese tipo no es una limitación de la presente invención. Véase, por ejemplo, Fisher et al., Nature Med., 3(3): 306-312 (Marzo de 1997), y W.C. Manning et al., Human Gene Therapy, 9: 477-485 (1 de Marzo de 1998). Los resultados de este ensayo pueden ser usados para determinar qué vector de AAV que contiene proteínas de cápside de un serotipo particular es el preferido para el suministro, por ejemplo en virtud de la ausencia de anticuerpos neutralizantes específicos para ese serotipo de cápside.
En un aspecto de este método, el suministro de vector con proteínas de cápside de AAV puede preceder o seguir al suministro de un gen por medio del vector con una proteína de cápside de AVV de un serotipo diferente. De forma similar, el suministro de vector con otras proteínas de una nueva cápside de AAV puede preceder o seguir al suministro de un gen por medio de un vector con una proteína de cápside de AAV de serotipo diferente. De ese modo, el suministro a través de vectores de rAAV puede ser usado para repetir suministro de gen a una célula anfitrión seleccionada. Deseablemente, los vectores de rAAV administrados posteriormente portan el ismo transgén que el primer vector de rAAV, pero los vectores administrados posteriormente contienen proteínas de cápside de serotipos que difieren del primer vector. Por ejemplo, si un primer vector tiene proteínas de cápside de AAV7 [SEQ ID Núm. 2], los vectores administrados posteriormente pueden tener proteínas de cápside seleccionadas entre otros serotipos, incluyendo AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV6, AAV10, AAV11, y AAV12, o cualquiera de las otras nuevas cápsides de AAV identificadas en la presente memoria incluyendo, sin limitación: A3.1, H2, H6, C1, C2, C5, A3-3, A3-7, A3-4, A3-5, 3.3b, 223.4, 223.5, 223-10, 223-2, 223-7, 223-6, 44-1, 44-5, 44-2, 42-15, 42-8, 42-13, 42-3A, 42-4, 42-5A, 42-1B, 42-5B, 43-1, 43-12, 43-5, 43-21, 43-25, 43-20, 24.1, 42.2, 7.2, 27.3, 16.3, 42.10, 42-3B, 42-11, F1, F5, F3, 42-6B, y/o 42-12.
Los vectores recombinantes descritos anteriormente pueden ser suministrados a células anfitrión de acuerdo con métodos publicados. El rAAV, preferentemente suspendido en un portador fisiológicamente compatible, puede ser administrado a un paciente mamífero humano o no humano. Un experto en la materia puede seleccionar fácilmente portadores adecuados en vista de la indicación para el que esté dirigido el virus de transferencia. Por ejemplo,, un portador adecuado incluye solución salina, que puede ser formulada con una diversidad de soluciones tampón (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Otros ejemplos de portadores incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y agua. La selección del portador no es una limitación de la presente invención.
Nocionalmente, las composiciones de la invención pueden contener, adicionalmente al rAAV y al (a los) portador(es), otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tal como conservantes, o estabilizadores químicos. Ejemplos de conservantes adecuados incluyen clorobutanol, sorbato potásico, ácido sórbico, dióxido de azufre, propil galato, parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol, paraclorofenol. Los estabilizadores químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.
Los vectores virales son administrados en cantidades suficientes para transfectar las células y para proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión de gen para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos, o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, que pueden ser determinados por expertos en las prácticas médicas. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, el suministro directo al órgano seleccionado (por ejemplo, suministro intraportal al hígado), oral, inhalación (incluyendo el suministro intranasal e intratraqueal), intraocular, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intradérmico, y otras rutas de administración parenteral. Se pueden combinar rutas de administración, si se desea.
Las dosificaciones del vector viral dependerán principalmente de factores tales como la condición que va a ser tratada, la edad, el peso y el estado de salud del paciente, y pueden por lo tanto varar entre los pacientes. Por ejemplo, una dosificación humana terapéuticamente efectiva del vector viral está por lo general comprendida en la gama de alrededor de 1 ml a alrededor de 100 ml de solución que contenga concentraciones de entre alrededor de 1 x 10 9 a 1 x 1016 genomas de vector viral. Una dosificación humana preferida puede ser de alrededor de 1 x 1015 a 1 x 1016 genomas de AAV. La dosificación se ajustará a un equilibrio del beneficio terapéutico frente a los efectos colaterales, y tales dosificaciones pueden variar dependiendo de la aplicación terapéutica para la se emplee el vector recombinante. Los niveles de expresión del transgén pueden ser monitorizados para determinar la frecuencia de dosificación resultante en vectores virales, preferentemente vectores de AAV que contengan el minigén. Opcionalmente, se pueden usar regímenes de dosificación similares a los descritos con motivos terapéuticos a efectos de inmunización usando las composiciones de la invención.
Ejemplos de productos terapéuticos y de productos inmunogénicos para su suministro mediante vectores contenedores de AAV de la invenci9ón, se proporcionan en lo que sigue. Estos vectores pueden ser usados para una diversidad de regímenes terapéuticos o de vacuna, según se describe en la presente memoria. Adicionalmente, esos vectores pueden ser suministrados en combinación con uno o más de otros vectores o ingredientes activos en un régimen terapéutico y/o de vacuna deseado.
B. Transgenes terapéuticos
Los productos terapéuticos útiles codificados por el transgén incluyen hormonas y factores de crecimiento y diferenciación que incluyen, sin limitación, insulina, glucagón, hormona del crecimiento (GH), hormona paratiroidea (PTH), factor de liberación de hormona del crecimiento (GRF), hormona de estimulación de folículo (FSH), hormona leutinizante (LH), gonadotropina coriónica humana (hCG), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblasto acídico (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor α de crecimiento de transformación (TGFα), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores I y II de crecimiento de insulina (IGF-I e IGF-II), uno cualquiera de la superfamilia del factor � de crecimiento de transformación incluyendo TGF �, activinas, inhibinas, o cualquiera de las proteínas morfogénicas óseas (BMP) BMPs 1-15, uno cualquiera de la familia de factores de crecimiento de la heregluína,/neurogluína/ARIA/factor de diferenciación neu (NDF), factor de crecimiento nérveo (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 y NT-4/5, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de línea celular glial (GDNF), neurturina, agrina, una cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netrina-1 y netrina-2, factor de crecimiento de hepatocito (HGF), efrinas, noggin, proteína de erizo y tirosina hidroxilasa.
Otros productos útiles de transgén incluyen proteínas que regulan el sistema inmune incluyendo, sin limitación, citoquinas y linfoquinas tales como trombopoyetina (TPO), interleuquinas (IL) IL-1 a IL-25 (incluyendo IL.2, IL-4, IL12 e IL-18), proteína quimioatrayente de monocito, factor inhibitorio de leucemia, factor estimulante de colona de granulocito-macrofago, ligando Fas, factores α, � de necrosis tumoral, interferonas α, � y γ, factor de crecimiento de cepa, ligando flk-2/flt-3. Los productos de gen producidos por el sistema inmune son útiles en la invención. Éstos incluyen, sin limitaciones, inmunoglobulinas IgG, IgM, IgD e IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple, receptores de células T, receptores de células T quiméricas, receptores de células T de cadena simple, moléculas MHC de clase I y de clase II, así inmunoglobulinas y moléculas MHC de diseño. Los productos de gen útiles incluyen también proteínas reguladoras de complemento tales como proteínas reguladoras de complemento, proteína cofactor de membrana (MCP), factor acelerante de decaimiento (DAF), CRI, CF2 y CD59.
Otros productos de gen útiles adicionales incluyen uno cualquiera de los receptores para las hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, linfoquinas, proteínas reguladoras y proteínas de sistema inmune. La invención abarca receptores para regulación de colesterol, incluyendo el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDL), el receptor de la lipoproteína de alta densidad (HDL), el receptor de la lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), y el receptor carroñero. La invención abarca también productos de gen tales como miembros de la familia de la superfamillia del receptor de hormona esteroide incluyendo receptores glucocorticoides y receptores de estrógeno, receptores de vitamina D y otros receptores nucleares. Adicionalmente, los productos de gen útiles incluyen factores de transcripción tales como jun, fos, max, mad, factor de respuesta de suero (SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD y miogenina, proteínas que contienen ETS-box, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, proteínas de enlace de CCAAT-bos, interferón, factores de regulación (IRF-1), proteína de tumor de Wilms, proteína de enlace ETS, STAT, proteínas de enlace de GATA-box, por ejemplo GATA-3, y la familia bifurcada de proteínas de hélice alada.
Otros productos de gen útiles incluyen carbamoil sintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato liasa, fumarilacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, alfa- antitripsina, glucosa-6-fosfatasa, profobilinógeno desaminasa, factor VIII, factor IX, cistationa beta-sintasa, cetoacido descaboxilasa de cadena ramificada, albúmina, isovaleril-coA deshidrogenasa, propionil CoA carboxilasa, metil maolinil CoA mutasa, glutaril CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvato carboxilato, fosforilasa hepática, fosforilasa quinada, glicina descarboxilasa, H- proteína, T- proteína, una secuencia reguladora de transmembrana de fibrosis cística
(CFTR), y una secuencia de cADN cistrofina. Incluso otros productos de gen útiles incluyen enzimas tales como las que son útiles en terapia de sustitución de enzima, lo cual es útil en una diversidad de condiciones resultantes de la actividad deficiente de la enzima. Por ejemplo, las enzimas que contienen manosa-6-fosfato pueden ser utilizadas en terapias para enfermedades de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, un gen adecuado incluye la glucoronidasa codificante (GUSB)).
Otros productos de gen útiles incluyen polipéptidos que se generan de forma natural, tal como polipéptidos quiméricos o híbridos que tienen una secuencia de aminoácido de ocurre de forma no natural que contiene inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácido. Por ejemplo las inmunoglobulinas diseñadas de cadena simple pueden ser útiles en determinados pacientes inmunocomprometidos. Otros tipos de secuencias de gen que ocurren de forma no natural incluyen moléculas antisentido y ácidos nucleicos catalíticos, tal como ribozimas, que pueden ser usadas para reducir la sobreexpresión de un objetivo.
La reducción y/o la modulación de expresión de un gen es particularmente deseable para el tratamiento de condiciones hiperproliferantes caracterizadas por células hiperproliferantes, como son los cánceres y la psoriasis. Los polipéptidos objetivo incluyen aquellos polipéptidos que son producidos exclusivamente, o a nieles más altos´, en células hiperproliferantes en comparación con células normales. Los antígenos objetivo incluyen polipéptidos codificados por oncogenes tales como myb, myc, fyn y el gen de traslocación bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Adicionalmente a productos oncógenos como antígenos objetivo, los polipéptidos objetivo para tratamientos anticáncer y regímenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos hechos mediante linfomas de células B y regiones variables de receptores de células T de linfomas de células T que, en algunas realizaciones, se usan también como antígenos objetivo para enfermedad autoinmune. Otros polipéptidos asociados a tumor pueden ser usados como polipéptidos objetivo tal como polipéptidos que se encuentran a aniveles más altos en células tumorales incluyendo el polipéptido reconocido por el anticuerpo monoclonal 17-1A y polipéptidos de enlace de folato.
Otros polipéptidos y proteínas terapéuticos adecuados incluyen aquellos que pueden ser útiles para tratar dolencias individuales procedentes de enfermedades y desórdenes autoinmunes que confieren una respuesta protectora inmune frente a objetivos que se asocian con autoinmunidad incluyendo receptores celulares y células que producen “anticuerpos auto-dirigidos”. Las enfermedades autoinmunes mediadas por células T incluyen la artritis reumatoide (RA), la esclerosis múltiple (MS), el síndrome de Sjögren, la sarcoidosis, la diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM), la tiroiditis autoinmune, la artritis reactiva, la espondilitis anquilosante, el escleroderma, la polimioisitis, la dermamiositis, la psoriasis, la vasculitis, la granulomatosis de Wegener, la enfermedad de Crohn, y la colitis ulcerosa. Cada una de esas enfermedades se caracteriza por receptores de células T (TCRs) que enlazan con antígenos endógenos y que inician la cascada inflamatoria asociada a enfermedades autoinmunes.
C. Transgenes inmunogénicos
Alternativamente, o adicionalmente, los vectores de la invención pueden contener secuencias de AAV de la invención y un transgén que codifica un péptido, polipéptido o proteína que induce una respuesta inmune a un inmunógeno seleccionado. Por ejemplo, se pueden seleccionar inmunógenos a partir de una diversidad de familias virales. Ejemplos de familias virales deseables frente a las que puede ser deseable una respuesta inmune incluyen la familia picomavirus, la cual incluye el género de los rinovirus, los cuales son responsables de alrededor de un 50% de los casos del resfriado común; el género de los enterovirus, los cuales incluyen los poliovirus, coxackievirus, ecovirus y enterovirus humanos tales como el virus de la hepatitis A; y el género de .los aftovirus, que son responsables de enfermedades de los pies y la boca, principalmente en animales no humanos. Dentro de la familia de virus de los picomavirus, los antígenos objetivo incluyen el VP1, VP2, VP3, VP4 y VPG. Otra familia viral incluye la familia calcivirus, la cual abarca el grupo de virus Norwalk, los cuales son un importante agente causante de gastroenteritis epidémica. Otra familia viral adicional deseable para su uso en la objetivación de antígenos para inducir respuestas inmunes en humanos y animales no humanos, es la familia togavirus, la cual incluye los géneros alfavirus, los cuales incluyen el virus de Sindbis, el virus de Ross River, y el virus de encefalitis Venezuelan, Eastern & Western Equina, y el rubivirus, incluyendo el virus de la Rubeola. La familia flaviviridae incluye el dengue, la fiebre amarilla, la encefalitis japonesa, la encefalitis de San Luis, y los virus de la encefalitis transmitida por garrapatas. Otros antígenos objetivo pueden ser generados a partir de la Hepatitis C o de la familia coronavirus, la cual incluye un número de virus no humanos tales como el virus de la bronquitis infecciosa (aves de corral), el virus gastroentérico transmisible porcino (cerdo), el virus de la encefalomielitis de hemaglutinina porcina (cerdo), el virus de la peritonitis infecciosa porcina (gatos), el coronavirus entérico felino (gatos), el coronavirus canino (perro), y los coronavirus respiratorios humanos, los cuales pueden causar el resfriado común y/o hepatitis no A, B o C. Dentro de la familia coronavirus, los antígenos objetivo incluyen el E1 (también llamado proteína M o matriz), E2 (también llamado proteína S o de Spike), glicoproteína E3 (también llamado HE o hemaglutina-elterosa, no presente en todos los coronavirus), o N (nucleocápside). Incluso otros antígenos pueden ser objetivados contra la familia rhabdovirus, la cual incluye los géneros vasculovirus (por ejemplo, el Virus de Estomatitis Vesicular), y el lissavirus general (por ejemplo, rabias). Dentro de la familia rhabdovirus, los antígenos adecuados pueden ser deducidos de la proteína G o de la proteína N. La familia flavoviridae, la cual incluye los virus de la fiebre hemorrágica tal como el virus Marburg yel Ébola pueden ser una fuente adecuada de antígenos. La familia paramixovirus incluye el virus de parainfluenza Tipo 1, el virus de parainfluenza Tipo 3, el virus de parainfluenza bovina Tipo 3, el rubulavirus (virus de las paperas,
virus de parainfluenza Tipo 2, virus de parainfluenza Tipo 4, virus de enfermedad de Newcastle (pollos), peste bovina, morvilivirus, que incluye el sarampión y el moquillo canino, y el pneumovirus, que incluye el virus sincitial respiratorio. El virus de influenza se clasifica dentro de la familia ortomixovirus y es una fuente adecuada de antígeno (por ejemplo, la proteína HA, la proteína N1). La familia bunyavirus incluye el género bunyavirus (encefalitis de California, La Crosse), flebovirus (Fiebre del Valle del Rift), hantavirus (el puramala es un virus de la fiebre hemahagin), nairovirus (enfermedad de la oveja de Nairobi), y varios bungavirus no asignados. La familia arenavirus proporciona una fuente de antígenos frente a LCM y al virus de la fiebre de Lassa. La familia reovirus incluye los géneros reovirus, rotavirus (que causa la gastroenteritis aguda en niños), orbivirus, y cultivirus (fiebre de la Garrapata de Colorado, Lebombo (humanos) encefalosis equina, lengua azul).
La familia retrovirus incluye la subfamilia oncovirinal que abarca enfermedades humanas y animales tales como el virus de la leucemia felina, HTLVI y HTLVII, lentivirinal (que incluye el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS), el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), el virus de la anemia infecciosa equina, y espumavirinal). Entre el VIH y el VIS, se han descrito muchos antígenos adecuados y pueden ser fácilmente seleccionados. Ejemplos de antígenos adecuados de VIH y de VIS incluyen, sin limitación, las proteínas gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat y Rev, así como varios fragmentos de las mismas. Adicionalmente, se han descrito una diversidad de modificaciones de estos antígenos. Los antígenos adecuados para este propósito son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede seleccionar una secuencia que codifique las proteínas gag, pol, Vif y Vpr, Env, Tat y Rev, entre otras proteínas. Véase, por ejemplo, la proteína gag modificada que se describe en la Patente US 5.972.596. Véase, también, las proteínas de VIH y VIS descritas por D.H. Barouch et al., J. Virol., 75(5): 2462-2467 (Marzo de 2001), y por R.R. Amara, et al., Science, 292: 69-74 (6 de Abril de 2001). Estas proteínas o subunidades de las mismas puede ser suministradas solas o en combinación, por medio de vectores separados o de un único vector.
La familia papovavirus incluye la subfamilia poliomavirus (virus BKU y JCU) y la subfamilia papilomavirus (asociados con cánceres o con la progresión maligna del papiloma). La familia adenovirus incluye virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que causan enfermedad respiratoria y/o enteritis. La familia parvovirus felino (enteritis felina), panleucopeniavirus felino, parvovirus canino y parvovirus porcino. La familia herpesvirus incluye la subfamilia alfaherpesvirus, la cual abarca el género simplexvirus (HSVI, HSVII), varicelovirus (pseudo-rabias, varicela zóster) y la subfamilia betaherpesvirus, la cual incluye el género citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la subfamilia gammaherpesvirus, la cual incluye el género linfocriptovirus, EBV (linfoma Burkitts), rinotraqueitis infecciosa, virus de la enfermedad de Marek, y radinovirus. La familia poxvirus incluye la subfamilia cordopoxvirinae, la cual abarca el género ortopoxvirus (Variola (Smallpox) y Vaccinia (Cowpox), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, sulpoxvirus, y la subfamilia entomopoxvirinae. La familia hepadnavirus incluye el virus de la Hepatitis
B. Un virus no clasificado que puede ser una fuente adecuada de antígenos, el virus de Hepatitis delta. Otras fuentes virales adicionales pueden incluir el virus de la enfermedad bursal infecciosa aviar y el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino. La familia alfavirus incluye el virus de arteritis equina y varios virus de encefalitis.
La presente invención puede abarcar también inmunógenos que son útiles para inmunizar un animal humano o no humano frente a otros patógenos incluyendo las bacterias, los hongos, microorganismos parasíticos o parásitos multicelulares que infectan vertebrados humanos y no humanos, o procedentes de células cancerígenas o de células tumorales. Ejemplos de bacteria patógenas incluyen los cocos patogénicos gram-positivos que incluyen los neumococos; estafilococos, y estreptococos. Los cocos patogénicos gram-positivos incluyen el meningococcus, gonococcus. Los bacilos patogénicos entéricos gram-negativos incluyen enterobacteriaceae, pseudomonas, acinetobacteria y elkenella; meloidosis; salmonella; shigella; hemófilos; moraxella; H. ducreyi (que causa el cancroide); brucella; Franisella tularensis (que causa tularemia); yersinia (pasteurella); estreptobacillus moniliformis y spirillum; los bacilos Gram-positivos incluyen listeria monocitogenes; ersipelothrix rhusiopathiae; Corynebacterium diphteria (difteria); cólera; B. anthracis (ántrax); donovanosis (granuloma inguinal), y bartonellosis. Las enfermedades causadas por bacterias anaeróbicas patogénicas incluyen tétanos, botulismo, otra clostridia; tuberculosis; lepra y otras micobacterias. Las enfermedades espiroquetales patógenicas incluyen la sífilis; trepanematosas; sífilis pian, pinta y endémica; y leptopirosis. Otras infecciones causadas por bacterias patógenas más altas y hongos patogénicos incluyen actinomicosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidiyodomicosis; candidiasis, aspergilosis, y mucomicosis; esporotricosis; paracoccidiyodomicosis, petrielidosis, torulopsosis, micemota y coromicosis; y dermatofitosis. Las infecciones ricketsiales incluyen la fiebre del tifus, la fiebre manchada de las Montañas Rocosas, la fiebre Q, y la Ricketsialpox. Ejemplos de micoplasma y de infecciones clamidiales incluyen; micoplasma pneumoniae; linfogranuloma venereum; psitacosis; e infecciones clamidiales perinatales. Las eucariotas patogénicas abarcan protozoos patogénicos y helmintos e infecciones producidas por los mismos que incluyen: amebiasis; malaria; leishmaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; Pneumocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babesiosis; giardisis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; nematodos; trematodos o flukes; e infecciones de cestodo (tenia).
Muchos de esos organismos y/o toxinas producidas por los mismos han sido identificados por los Centros para el Control de Enfermedades (CDC), Departamento de Salud y Servicios Humanos, USA), como agentes que tienen potencial para su uso en ataques biológicos. Por ejemplo, algunos de esos agentes biológicos incluyen: Bacillus anthracis (ántrax), Clostridium botulinum y su toxina (botulismo), Yersinia pestis (plaga), variola major (viruela), Francisella tularensis (tularemia), y fiebre hemorrágica viral, todas las cueles están actualmente clasificadas como
agentes de Categoría A; Coxiella burnetti (fiebre Q); Brucella species (brucelosis), Burkholderia mallei (muermo), Ricinus communis y su toxina (toxina de ricino), Clostridium parafringens y su toxina (toxina épsilon), Staphylococcus species y sus toxinas (enterotoxina B), todas las cuales están actualmente clasificadas como agentes de Categoría B, y virus Nipan y antavirus, los cuales están actualmente clasificados como agentes de Categoría C. Adicionalmente, otros organismos, que están clasificados de esa manera o que están clasificados de manera diferente, pueden ser identificados y/o usados para tales propósitos en el futuro. Será fácil entender que los vectores virales y otras construcciones descritas en la presente memoria son útiles para el suministro de antígenos a partir de otros organismos, virus, sus toxinas u otros subproductos, los cuales impedirán y/o tratarán infección u otras reacciones adversas con esos agentes biológicos.
La administración de los vectores de la invención para el suministro de inmunógenos contra la región variable de las células T provoca una respuesta inmune que incluye CTLs para eliminar esas células T. En artritis reumatoide (RA), varias regiones variables específicas de receptores de células T (TCRs) que están involucradas en la enfermedad, han sido caracterizadas. Estos TCRs incluyen V-3, V-14, V-17 y Vα-17. Por lo tanto, el suministro de una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos uno de esos polipéptidos provocará una respuesta inmune que objetivará células T involucradas en RA. En esclerosis múltiple (MS), varias regiones variables específicas de TCRs que están involucradas en la enfermedad han sido caracterizadas. Estos TCRs incluyen V-7 y Vα-10. De ese modo, el suministro de una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos uno de esos polipéptidos provocará una respuesta inmune que objetivará células T involucradas en MS. En escleroderma, varias regiones variables específicas de TCRs que están involucradas en la enfermedad, han sido caracterizadas. Estos CRs incluyen V-6, V8, V-14 y Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28 y Vα-12. Por lo tanto, el suministro de una molécula de ácido nucleico que codifique al menos uno de esos polipéptidos, provocará una respuesta inmune que objetivará células T involucradas en escleroderma.
Opcionalmente, se pueden suministrar vectores que contienen secuencias de AAV de la invención usando un régimen de sensibilización y refuerzo. Una diversidad de tales regímenes han sido descritos en la técnica y pueden ser seleccionados fácilmente. Véase, por ejemplo, el documento WO 00/11140, publicado el 2 de Marzo de 2000.
Tales regímenes de sensibilización y refuerzo incluyen típicamente la administración de un vector basado en ADN (por ejemplo, un plásmido) para sensibilizar el sistema respecto a una segunda administración, más fuerte, con un antígeno tradicional, tal como una proteína o un virus recombinante portador de las secuencias que codifican dicha antígeno. En una realización, la invención proporciona un método de sensibilización y refuerzo de una respuesta inmune respecto a un antígeno seleccionado mediante el suministro de un vector de ADN plásmido portador de dicho antígeno, seguido por un reforzamiento, por ejemplo con un vector que contiene secuencias de AAV de la invención.
En una realización, el régimen de sensibilización-refuerzo incluye la expresión de multiproteínas procedentes del vehículo de sensibilización y/o refuerzo. Véase, por ejemplo, R.R. Amara, Science, 292: 69-74 (6 de Abril de 2001) que describe un régimen de multiproteína para expresión de subunidades de proteína útiles para generar una respuesta inmune frente al VIH y al VIS. Por ejemplo, un primer ADN puede suministrar la Gag, Pol, Vif, VPX y Vpr y Env, Tat, y Rev a partir de una transcripción simple. Alternativamente, se suministra la Gag, Pol y HIN/V-1 Env de VIS.
Sin embargo, los regímenes de sensibilización y refuerzo no se limitan a la inmunización respecto a VIH o al suministro de esos antígenos. Por ejemplo, la sensibilización puede incluir el suministro con un primer vector de chimpancé de la invención seguido de un refuerzo con un segundo vector de chimpancé, o con una composición que contiene el propio antígeno en forma de proteína. En un ejemplo, el régimen de sensibilización y refuerzo puede proporcionar una respuesta protectora inmune al virus, la bacteria u otro organismo a partir del cual se derive el antígeno. En otra realización deseada, el régimen de sensibilización y refuerzo proporciona un efecto terapéutico que puede ser medido usando ensayos convencionales para la detección de la presencia de la condición para la que se está administrando la terapia.
La vacuna de sensibilización puede ser administrada en diversos sitios del cuerpo de una manera dependiente de la dosis, la cual depende del antígeno al que está siendo objetivada la respuesta inmune deseada. La invención no se limita a la cantidad o al sitio de la(s) inyección(es) o al portador farmacéutico. En cambio, la etapa de sensibilización abarca regímenes de tratamiento que incluyen una dosis única o una dosificación que se administra cada hora, cada día, cada semana o cada mes, o cada año. Como ejemplo, los mamíferos pueden recibir una o dos inyecciones de sensibilización que contienen entre alrededor de 10 µg a alrededor de 50 µg de plásmido en el portador. Una cantidad de sensibilización deseable o dosificación de la composición de vacuna de ADN de sensibilización está comprendida en la gama de entre alrededor de 1 µg a alrededor de 10.000 µg de la vacuna de ADN. Las dosificaciones pueden variar desde alrededor de 1 µg a 1000 µg de ADN por k de peso corporal. La cantidad o el sitio de inyección se selecciona deseablemente en base a la identidad y a la condición del mamífero que está siendo vacunado.
La unidad de dosificación de la acuna de ADN adecuada para el suministro del antígeno al mamífero se describe en la presente memoria. La vacuna de ADN se prepara para su administración siendo suspendida o disuelta en un
portador farmacéutica o fisiológicamente aceptada tal como solución salina isotónica, solución de sales isotónicas, u otras formulaciones que resultarán evidentes para los expertos en una administración de ese tipo. El portador apropiado resultará evidente para los expertos en la materia y dependerá en gran parte de la ruta de administración. Las composiciones de la invención pueden ser administradas a un mamífero de acuerdo con las rutas descritas con anterioridad, en una formulación de liberación sostenida usando un polímero biocompatible biodegradable, o mediante suministro en el sitio usando micelas, geles y liposomas.
Opcionalmente, la etapa de sensibilización de esta invención incluye también administrar con la composición de vacuna de ADN de sensibilización, una cantidad adecuada de un adyuvante, tal como se ha definido en la presente memoria.
Con preferencia, se administra una composición de sensibilización alrededor de 2 a alrededor de 27 semanas después de la administración de la vacuna de ADN de sensibilización al sujeto mamífero. La administración de la composición de refuerzo se realiza usando una cantidad efectiva de una composición de vacuna de refuerzo que contiene, o que es capaz de suministrar, el mismo antígeno que el administrado por la vacuna de ADN de sensibilización. La composición de refuerzo puede estar compuesta por un vector viral recombinante derivado de la misma fuente viral o de otra fuente. Alternativamente, la “composición de refuerzo” puede ser una composición que contenga el mismo antígeno que el codificado en la vacuna de ADN de sensibilización, pero en forma de proteína o de péptido, cuya composición induce una respuesta inmune en el anfitrión. En otra realización, la composición de vacuna de refuerzo incluye una composición que contiene una secuencia de ADN que codifica el antígeno ajo el control de una secuencia reguladora que dirige la expresión en una célula de mamífero, por ejemplo vectores tales como los vectores bactrianos o virales bien conocidos. Los requisitos principales de la composición de vacuna de refuerzo son que el antígeno de la composición de vacuna sea el mismo antígeno, o un antígeno reactivo cruzado, que el codificado por la vacuna de ADN.
De manera adecuada, los vectores de la invención son también adecuados para su uso en regímenes que usan vectores de no AAV así como proteínas, péptidos, y/u otros compuestos terapéuticos o inmunogénicos biológicamente útiles. Estos regímenes son particularmente adecuados para el suministro de gen a efectos terapéuticos y para inmunización, incluyendo inducción de inmunidad protectora. Tales usos resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia.
Además, un vector según la invención proporciona un vehículo eficiente de transferencia de gen que puede suministrar un transgén seleccionado a una célula anfitrión seleccionada in vivo o ex vivo incluso cuando el organismo tenga anticuerpos neutralizantes respecto a uno o más serotipos de AAV. En una realización, el vector (por ejemplo, un rAAV) y las células se mezclan ex vivo; las células infectadas son cultivadas usando metodologías convencionales; y las células transducidas son re-infundidas en el paciente. Además, los vectores de la invención pueden ser usados también para la producción de un producto de gen deseado in vitro. Para la producción in vitro, un producto deseado (por ejemplo, una proteína) puede ser obtenido a partir de un cultivo deseado a continuación de la transfección de células anfitrión con rAAV que contienen la molécula que codifica el producto deseado y cultivando el cultivo celular bajo condiciones que permiten expresión. El producto expresado puede entonces ser purificado y aislado, según se desee. Técnicas adecuadas para transfección, cultivo celular, purificación y aislamiento, son conocidas por los expertos en la materia.
Los ejemplos que siguen ilustran varios aspectos y realizaciones de la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: amplificación PCR, clonación y caracterización de nuevas secuencias de AAV
Tejidos procedentes de primates no humanos fueron seleccionados para secuencias de AAV usando un método PCR basado en oligonucleótidos en regiones altamente conservadas de AAVs conocidos. Un tramo de secuencia de AAV que abarca 2886 a 3143 bp de AAV1 [SEQ ID Núm. 6], fue seleccionado como amplicón PCR en el que una región hipervariable de la proteína de cápside (Cap) que es única para cada serotipo de AAV conocido, que se denomina en la presente memoria “región de signatura”, está flanqueada por secuencias conservadas. En análisis posterior, la región de signatura se mostró localizada entre residuos conservados que se extienden a la región 3 hipervariable.
Un estudio inicial de sangre periférica de un número de especies de primates no humanos, reveló AAV detectable en un subconjunto de animales procedentes de especies tales como macacos Rhesus, macacos cynomólogos, chimpancés y babuinos. Sin embargo, no existieron secuencias de AAV en algunas otras especies probadas, incluyendo los macacos japoneses, los macacos de cola de cerdo y los monos ardilla. Un análisis más extensivo de distribución vectorial, fue realizado en tejidos de monos Rhesus de la Universidad de Pennsylvania y en colonias Tulane recuperadas por necropsia. Esto reveló secuencias de AAV a través de una amplia matriz de tejidos.
A. Amplificación de una región de signatura de AAV
Las secuencias de ADN de los AAV1-6 y de los AAVs aislados a partir de ganso y pato, fueron alineadas entre sí usando “Clustal W” en configuraciones por defecto. El alineamiento para los AAV1-6, y la inclusión de la información para el nuevo AAV7, se proporciona en la Figura 1.Se compararon similitudes de secuencia AAVs.
En la línea de estudio, una región de 257 bp que abarca del 2886 bp al 3143 bp del AAV1 [SEQ ID Núm. 6], y la región correspondiente en los genomas de genomas de los AAV2-6 [Véase la Figura 1], fue identificada por los 5 inventores. Esta región se localiza con el gen de cápside de AAV y tiene secuencias altamente conservadas entre ambos extremos 5’ y 3’ y es una secuencia relativamente variable en su mitad. Adicionalmente, esta región contiene un sitio de enzima de restricción de Draill (CACCACGTC, SEQ ID Núm. 15]. Los inventores han encontrado que esta región sirve como signatura específica para cada tipo conocido de ADN de AAV. En otras palabras, a continuación de reacciones PCR, digestión con endonucleasas que son específicas para cada uno de los serotipos conocidos y
10 análisis por electroforesis de gel, las regiones pueden ser usadas para identificar definitivamente el ADN amplificado como procedente del serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6 o de otro serotipo.
Los sensibilizadores fueron diseñados, validados y las condiciones PCR optimizadas con controles de ADN de AAV1, 2 y 5. Los sensibilizadores se basaron en las secuencias de AAV2: sensibilizador 5’, 1S:bp 2867-2891 de AAV2 [SEQ ID Núm. 7] y sensibilizador 3’, 18aa, bp 3095-3121 de AAV2 [SEQ ID Núm. 7].
15 Los ADNs celulares procedentes de diferentes tejidos incluyendo sangre, cerebro, hígado, pulmón, testículos, etc., de diferentes monos Rhesus, fueron estudiados utilizando la estrategia descrita con anterioridad. Los resultados revelados por los ADNs de diferentes tejidos de esos monos dieron lugar a fuertes amplificaciones PCR. Otros análisis de restricción de productos PCR indicaron que fueron amplificados a partir de secuencias de AAV diferentes de cualquier secuencia de AAV publicada.
20 Productos PCR (de alrededor de 255 bp de tamaño) procedentes de ADNs de una diversidad de tejidos de mono, han sido clonados y secuenciados. El estudio bioinformático de esas nuevas secuencias de AAV indicó que las mismas eran nuevas secuencias de AAV de gen de cápside y distintas cada una de las otras. La Figura 1 incluye en el alineamiento las nuevas regiones de signatura de AAV para AAV10-12 [SEQ ID Núm. 117, 118 y 119, respetivamente]. Se realizaron múltiples análisis de alineamiento de secuencia usando el programa Clustal W (1.81).
25 El porcentaje de identidad de secuencia entre las regiones de signatura de genomas de AAV 1-7 y de AAV 10-12, se proporciona a continuación.
Tabla 1. Secuencias para análisis
Secuencia #
Serotipo de AAV Tamaño (bp)
1
AAV1 258
2
AAV2 255
3
AAV3 255
4
AAV4 246
5
AAV5 258
6
AAV6 258
7
AAV7 258
10
AAV10 255
11
AAV11 258
12
AAV12 255
Tabla 3. Alineamiento por parejas (Porcentaje de identidad)
AAV2
AAV3 AAV4 AAV5 AAV6 AAV7 AAV10 AAV11 AAV12
AAV1
90 90 81 76 97 91 93 94 93
AAV2
93 79 78 90 90 93 93 92
AAV3
80 76 90 92 92 92 92
(continuación)
AAV4
76 81 84 82 81 79
AAV5
75 78 79 79 76
AAV6
91 92 94 94
AAV7
94 92 92
AAV10
95 93
AAV11
94
Se aislaron y secuenciaron más de 300 clones que contenían nuevas secuencias de serotipo de AAV que abarcan la región de 257 bp seleccionada. El análisis bioinformático de estos 300+ clones sugiere que esta región de 257 bp es crítica en cuanto a servir como un buen marcador o secuencia de signatura para un aislamiento y una identificación rápidos del nuevo serotipo de AAV.
B. Uso de la región de signatura para amplificación PCR
La región de signatura de 257 bp fue usada como anclaje PCR para extender amplificaciones PCR a 5’ del genoma para cubrir la región de unión de genes rep y cap (1398 bp – 3143 bp, SEQ ID Núm. 6) y 3’ del genoma para obtener la secuencia de gen cap completa (2866 bp – 4600 bp, SEQ ID Núm. 6). Se llevaron a cabo amplificaciones PCR usando condiciones estándar, incluyendo desnaturalización a 95 ºC durante 0,5-1 minuto, recociendo a 60-65 ºC durante 0,5-1 minuto y extensión a 72 ºC durante 1 minuto por kb con un número total de ciclos de amplificación comprendido en la gama de 28 a 42.
Usando las secuencias alineadas según se ha descrito en “A”, otras dos regiones relativas conservadas fueron identificadas en la secuencia situadas en los extremos 3’ y 5’ de genes rep en la región de 257 bp y en la secuencia corriente abajo del fragmento de 257 bp pero antes de la ITR 3 del AAV. Se diseñaron dos conjuntos de nuevos sensibilizadores y las condiciones PCR fueron optimizadas para la recuperación de la cápside completa y de una parte de las secuencias rep de nuevos serotipos de AAV. Más específicamente, para la amplificación 5’, el sensibilizador 5’, el AV1Ns, fue GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC [nt 1398-1423 de AAV1, SEQ ID Núm. 6] y el sensibilizador 3’ fue 18aa, identificado anteriormente. Para la amplificación 3’, el sensibilizador 5’ fue 1s, identificado anteriormente, y el sensibilizador 3’ fue AV2Las, TCGTTTCAGTTGAACTTTGGTCTCTGCG [nt 44354462 de AAV2, SEQ ID Núm. 7].
En esas amplificaciones PCR, la región de 257 bp fue utilizada como anclaje de PCR y marcador para generar fragmentos de solapamiento para construir un gen de cápside completo por fusión en el sitio DraIII en la región de signatura a continuación de la amplificación de los fragmentos de extensión 5’ y 3’ según se describe en la presente memoria. Más en particular, para generar el gen cap de AAV7 intacto, los tres productos de amplificación (a) las secuencias de la región de signatura; (b) la secuencia de la extensión 5’, y (c) las secuencias de la extensión 3’ fueron clonadas en una cadena principal de plásmido pCR4-Topo [Invitrogen] de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, los plásmidos fueron digestados con DraIII y recombinados para formar un gen cap intacto.
En esta línea de trabajo, se aislaron y analizaron alrededor del 80% de secuencias de cápside. Otro nuevo serotipo, el AAV9, fue descubierto también a partir del Mono #2.
Usando las condiciones PCR descritas con anterioridad, la porción restante de la secuencia de gen rep para AAV7 se aisló y se clonó usando los sensibilizadores que amplifican 108 bp a 1461 bp del genoma de AAV (calculado en base a la numeración de AAV2, SEQ ID Núm. 7). Este clon es secuenciado para la construcción de un genoma de AAV7 completo sin ITRs.
C. Amplificación directa de fragmento Cap de 3.1 kb
Para amplificar directamente un fragmento cap de longitud completa de 3,1 kb a partir de ADNs de tejido de NHP y de sangre, otras dos regiones altamente conservadas fueron identificadas en genomas de AAV para su uso en amplificación PCR de fragmentos grandes. Se seleccionó un sensibilizador en el interior de una región conservada situada en la mitad del gen rep (AV1ns: 5’ GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC 3’ nt 1398-1423 de SEQ ID Núm. 6) en combinación con el sensibilizador 3’ situado en otra región conservada corriente abajo del gen cap (Av2cas: 5’ CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA 3’, SEQ ID Núm. 7) para amplificación de fragmentos cap de longitud completa. Los productos PCR fueron clonados con Topo de acuerdo con las direcciones del fabricante (Invitrogen) y se realizó análisis de secuencia por parte de Qiagengenomics (Qiagengenomics, Seattle, WA) con una precisión > 99,9 %. Se aisló y se caracterizó un total de 50 clones de cápside. Entre ellos, 37 clones fueron
derivados de tejidos de macaco Rhesus (rh. 1 – rh. 37), 6 clones procedentes de macacos cynomólogos (cy-1 – cy.6), 2 clones procedentes de babuinos (bb. 1 y bb. 2), y 5 clones de chimpancés (ch. 1 . ch. 5).
Para descartar la posibilidad de que la diversidad de secuencia dentro de la nueva familia de AAV no sea un artefacto del PCR, tal como un empalme de gen mediado por PCR por extensión de solapamiento entre diferentes plantillas de ADN parcial con secuencias homólogas, el resultado de un proceso de recombinación en bacterias, se llevó a cabo una serie de experimentos bajo idénticas condiciones para amplificación de VP1 usando ADNs celulares totales. En primer lugar, los plásmidos de AAV7 y AAV8 intactos fueron mezclados a igual relación molar, seguido de diluciones serie. Las mezclas diluidas en serie se usaron como plantillas para amplificación PCR de fragmentos de VP1 de 3.1 kb usando sensibilizadores universales e idénticas condiciones de PCR a las que se usaron para amplificaciones de ADN para ver si se generaban algunos productos PCR híbridos. La mezcla fue transformada en bacterias y los transformantes aislados para buscar clones híbridos posiblemente derivados del proceso de recombinación en células bacterianas. En un experimento diferente, se restringieron los plásmidos de AAV7 y AAV8 con Map I, Ava I y Hael, todos los cuales interrumpieron tanto múltiples veces genomas en diferentes posiciones, mezclaron las digestiones en diferentes combinaciones y las usaron para amplificación PCR de fragmentos de VP1 bajo las mismas condiciones para comprobar si algunos productos PCR podían ser generados por medio de extensión de secuencia de solapamiento de secuencias de AAV parciales. En otro experimento, una mezcla de fragmento purificado de gel 5’ de VP1 de AAV7 de 1,5 kb y fragmento 3’ de VP1 de AAV8 de 1,7 kb con solapamiento en la región de signatura, fue diluida en serie y usada para amplificación PCR en presencia y en ausencia de 200 ng de ADN celular extraído de una línea celular de mono que estaba libre de secuencias de AAV mediante análisis TaqMan. Ninguno de esos experimentos demostró producción eficiente de secuencia de solapamiento mediada por PCR bajo las condiciones de la amplificación cap de ADN genómico (datos no mostrados). Como confirmación adicional, se diseñaron 3 pares de sensibilizadores, los cuales estaban situados en diferentes HVRs, y eran específicos de secuencia respecto a las variantes del clon 42s de macaco Rhesus F953, en diferentes combinaciones para amplificar fragmentos más cortos de ADN del nodo linfático mesentérico (MLN) procedente de F953 a partir de los cuales se aisló el clon 42s. Todas las variaciones de secuencia identificadas en clones cap de longitud completa fueron encontradas en estos fragmentos más cortos (datos no representados).
Ejemplo 2: Virus adeno-asociados sometidos a evolución sustancial en primates durante infecciones naturales
El análisis de secuencia de aislados de AAV seleccionados revelo divergencia a través del genoma que está más concentrado en regiones hipervariables de las proteínas de cápside. Los datos epidemiológicos indican que todos los serotipos conocidos son endémicos para los primates, aunque el aislamiento de aislados clínicos ha estado restringido a AAV2 y AAV3 procedentes de hisopos anales y de garganta de lactantes humanos, y a AAV5 procedente de una verruga condilomatosa humana. No se han asociado secuelas clínicas conocidas a infección de AAV.
En un intento de entender mejor la biología de AAV, se usaron primates no humanos como modelos para caracterizar las secuelas de infecciones naturales. Los tejidos procedentes de primates no humanos fueron examinados en cuanto a secuencias de AAV usando el método PCR de la invención basado en oligonucleótidos para regiones altamente conservadas de AAVs conocidos (véase el Ejemplo 1). Un tramo de secuencia de AAV que se extiende desde 2886 hasta 3143 bp de AAV1 [SEQ ID Núm. 6] fue seleccionado como amplicón PCR en el que las secuencias conservadas están flanqueadas por una región hipervariable que es única para cada serotipo de AAV conocido, denominada en la presente memoria “región de signatura”.
Un estudio inicial de sangre periférica de un número de especies de primates no humanos incluyendo monos Rhesus, monos cynomólogos, chimpancés y babuinos, puso de relieve AAV detectable en un subconjunto de animales de todas las especies. Se realizó un análisis más extensivo de distribución vectorial en tejidos de monos Rhesus de la Universidad de Pennsylvania y en colonias Tulane recuperadas en necropsia. Esto reveló secuencia de AAV a través de una amplia extensión de tejidos.
Las secuencias de signatura amplificadas fueron subclonadas en plásmidos los transformantes individuales fueron sometidos a análisis de secuencia. Esto puso de relieve una variación sustancial en cuanto a secuencia de nucleótido de clones derivados de diferentes animales. La variación en la secuencia de signatura fue observada también en clones obtenidos en el interior de animales individuales. Los tejidos cultivados procedentes de dos animales en los que fueron identificadas secuencias de signatura única (es decir, colon de 98E044 y corazón de 98E056) fueron caracterizadas además por expansión de la secuencia amplificada por PCR usando oligonucleótidos para secuencias altamente conservadas. De esta manera, se reconstruyeron estructuras pro-virales completas para genomas virales a partir de ambos tejidos según se ha descrito en la presente memoria. Estos pro-virus difieren de los otros AAVs conocidos con divergencia de secuencia más grande observada en regiones del gen cap.
Se realizaron experimentos adicionales para confirmar que las secuencias de AAV residentes en tejido de primate no humano representaban genomas pro-virales de virus infeccioso que es susceptible de ser rescatado y formar viriones. El ADN genómico del tejido de hígado del animal 98E056, del que se detectó signatura de AAV8, fue digestado con una endonucleasa que no tiene sitio dentro de la secuencia de AAV, y transfectado en células 293 con un plásmido que contiene un genoma suprimido E1 de serotipo 5 de adenovirus humano como fuente de
funciones auxiliares. El lisato resultante se hizo pasar sobre células 293 una vez, y el lisato fue recuperado y analizado en cuanto a la presencia de proteínas cap de AA usando un anticuerpo policlonal de reacción amplia respecto a proteínas cap, y en cuanto a presencia y abundancia de secuencias de ADN procedentes del pro-virus de AAV amplificado en PCR del que derivó el AAV8. La transfección de ADN de corazón restringido en endonucleasa y el plásmido auxiliar de adenovirus produjeron altas cantidades de virus AAV8 según se demostró mediante la detección de proteínas cap por análisis de mancha Western y la presencia de 104 genomas de vector de AAV8 por célula 293. Los lisatos fueron generados a partir de una preparación a gran escala y el AAV fue purificado por sedimentación de cesio. La preparación purificada mostró estructuras icosaédricas de 26 nm que se mostraron idénticas a las del serotipo 2 de AAV. La transfección con el auxiliar de adenovirus sólo no produjo proteínas o genomas de AAV, descartando la contaminación como fuente del AAV rescatado.
Para caracterizar mejor la variación inter e intra animal de secuencia de signatura de AAV, los tejidos seleccionados fueron sometidos a PCR extendido para amplificar tramas de lectura abierta de cap completa.
Los fragmentos resultantes fueron clonados en plásmidos bacterianos y los transformantes individuales fueron aislados y totalmente secuenciados. Este análisis incluyó los nodos linfáticos mesentéricos de tres monos Rhesus (Tulane/V223 – 6 clones; Tulane/T612 – 7 clones; Tulane/F953 – 14 clones), hígado de dos monos Rhesus (Tulane/V251 – 3 clones; Penn/00E033 -3 clones), bazo de un mono Rhesus (Penn/97E043 – 3 clones), corazón de un mono Rhesus (IHGT/98E046 – 1 clon) y sangre periférica procedente de un chimpancé (New Iberia/X133 – 5 clones), seis macacos cynomólogos (Charles River/A1378, A3099, A3388, A3442, A2821, A3242 – 6 clones en total) y un babuino (SFRB/8644 – 2 clones). De los 50 clones que fueron secuencias procedentes de 15 animales diferentes, 30 fueron considerados no redundantes en base al hallazgo de al menos 7 diferencias de aminoácidos entre unos y otros. Los clones de VP1 no redundantes se han numerado secuencialmente según fueron aislados, con un prefijo que indica la especie de primate no humano a partir del cual fueron extraídos. Las relaciones estructurales entre esos 30 clones no redundantes y los 8 serotipos de AAV previamente descritos, fueron determinadas usando el programa Splits Tree [Huson, D.H. Splits Tree: análisis y visualización de datos de evolución. Bioinformatics 14, 68-73 (1998)] con implementación del método de descomposición por corte. El análisis representa homoplasia entre un conjunto de secuencias en una red en forma de árbol, en vez de un árbol de bifurcación. La ventaja es la de permitir la detección de agrupaciones que son el resultado de convergencia y mostrar relaciones filogenéticas incluso cuando están distorsionadas por eventos paralelos. Se requerirá una búsqueda filogenética extensiva con el fin de elucidar la evolución de AAV, mientras que la intención de la presente memoria es agrupar los diferentes clones según su similitud de secuencia.
Para confirmar que las nuevas secuencias VP1 derivaban de genomas virales infecciosos, el ADN celular procedente de tejidos con una alta abundancia de ADN viral fue restringido con una endonucleasa que no se escindiría en el interior del AAV, y transfectado en células 293, seguido de infección con adenovirus. Esto dio como resultado el rescate y amplificación de genomas de AAV procedente de ADN de tejidos de dos animales diferentes (datos no representados).
Las secuencias de VP1 de los nuevos AAVs fueron caracterizadas además con respecto a la naturaleza y localización de variación de secuencia de aminoácido. La totalidad de los 30 clones de VP1 que demostraron diferenciarse entre sí en más de un 1% de divergencia de aminoácido produjeron 12 regiones hipervariables (HVR) de 5 solapamientos o son parte de las 4 regiones variables descritas con anterioridad [Kotin, citado anteriormente; Rutledge, citado anteriormente]. Los picos proximales de tres pliegues contienen la mayor parte de la variabilidad (HVR5-10). De manera interesante, los bucles localizados en el eje de 2 y 5 pliegues, muestran también una variación intensa. Las HVRs 1 y 2 ocurren en la porción terminal N de la proteína de cápside que no se resuelve en la estructura de rayos X que sugiere que el término N de la proteína VP1 está al descubierto en la superficie del virión.
Se usó PCR en tiempo real para cuantificar secuencias de AAV a partir de tejidos de 21 monos Rhesus usando sensibilizadores y sondas en regiones altamente conservadas de rep (un conjunto) y cap (dos conjuntos) de AAVs conocidos. Cada punto de datos representa análisis de ADN del tejido procedente de un animal individual. Esto confirmó la amplia distribución de secuencias de AAV, aunque la distribución cuantitativa fue diferente entre animales individuales. La fuente de animales y de historial previo o de tratamientos no parece tener influencia en la distribución de secuencias de AAV en macacos Rhesus. Los tres conjuntos diferentes de sensibilizadores y sondas usados para cuantificar AAVs proporcionaron resultados consistentes. Los niveles más altos de AAV fueron encontrados consistentemente en nodos linfáticos mesentéricos a una media de 0,01 copias por genoma diploide para 13 animales que eran positivos. El hígado y el bazo también contenían una abundancia elevada de ADN de virus. Existieron ejemplos de AAV muy alto, tal como en el corazón del macaco Rhesus 98E056., bazo de macaco Rhesus 97E043, e hígado de macaco Rhesus RQ4407, lo que mostró 1,5, 3 y 20 copias de secuencia de AAV por genoma diploide, respectivamente. Niveles relativamente bajos de ADN viral fueron observados en células mononucleares sanguíneas periféricas, sugiriendo que los datos en el tejido no son debidos a componentes sanguíneos residentes (datos no representados). Debe apreciarse que este método no tendría necesariamente que capturar todos los AAVs residentes en los primates no humanos puesto que la detección requiere una alta homología tanto para los oligonucleótidos como para la sonda PCR en tiempo real. Los tejidos procedentes de animales con una elevada abundancia de ADN de AAV, fueron analizados adicionalmente en cuanto a estado
molecular del ADN, mediante técnicas de hibridación de ADN, y su distribución celular, mediante hibridización in situ.
La clase de variación de secuencia revelada en fragmentos pro-virales aislados a partir de diferentes animales y en el interior de los tejidos de los mismos animales, es reminiscente de la evolución de ocurre para muchos virus de ARN durante pandemias o incluso dentro de la infección de un individuo. En algunas situaciones, la noción de un virus de tipo natural ha sido sustituida por la existencia de enjambres de cuasi-especies que evolucionan como resultado de replicación rápida y de mutaciones en presencia de presión selectiva. Un ejemplo es la infección por VIH, que evoluciona en respuesta a presión inmunológica y farmacológica. Varios mecanismos contribuyen a una alta tasa de mutaciones en virus de ARN, incluyendo la capacidad de lectura de baja fidelidad y de falta de prueba de la transcriptasa reversa y la recombinación no homóloga y homóloga.
La evidencia para la formación de cuasi-especies de AAV fue ilustrada en este estudio mediante secuenciación sistemática de múltiples fragmentos pro-virales clonados. De hecho, no se podían encontrar secuencias idénticas en el interior de clones extendidos cualesquiera, aislados entre, o dentro de, animales. Un mecanismo importante para esta evolución de secuencia parece ser una alta tasa de recombinación homóloga entre un número más limitado de virus parenterales. El resultado neto es un extenso intercambio de regiones hipervariables de la proteína cap que conduce a una matriz de chimeneas que podrían tener diferentes tropismos y especificidades serológicas (es decir, la capacidad de dejar escapar respuestas inmunológicas especialmente en lo que se refiere a anticuerpos neutralizantes). Los mecanismos mediante los que podría ocurrir la recombinación homóloga, no están claros. Una posibilidad es que las cadenas + y – de diferentes genomas de AAV de cadena simple se recuecen durante la replicación según se ha descrito mediante una alta multiplicidad de infecciones con recombinantes de AAV. No está claro si otros mecanismos contribuyen a secuenciar la evolución de infecciones de AAV. La tasa global de mutación que ocurre durante la replicación de AAV parece ser relativamente baja y los datos no sugieren frecuencias altas de errores de replicación. Sin embargo, se han descrito redisposiciones sustanciales del genoma de AAV durante infección lítica que conducen a la formación de partículas de interferencia defectuosas. Con independencia del mecanismo que conduce a divergencia de secuenciación, con pocas excepciones, las estructuras vp1 de las cuasiespecies se mantienen intactas sin cambios estructurales ni mutaciones sin sentido que sugieran que la selección competitiva de virus con el perfil de aptitud más favorable contribuye a la dinámica de la población.
Estos estudios tienen implicaciones en varias áreas de la biología y de la medicina. El concepto de evolución viral rápida, que se creía antiguamente que era una propiedad limitada a los virus de ARN, debe ser considerado en virus de ADN, los cuales han sido convencionalmente caracterizados mediante ensayos serológicos. Debe considerarse importante en términos de parvovirus desarrollar un nuevo método para describir aislados de virus que capturen la complejidad de su estructura y biología, tal como el VIH, que se consideran con categoría de familias generales o estructura y función similares, denominados Clados. Una estrategia alternativa consiste en seguir categorizando aislados con respeto a criterios de especificidad y desarrollo serológicos para describir variantes dentro de los grupos serológicos.
Ejemplo 3: Vectorología de genomas de AAV recombinantes equipados con ITRs de AAV2 usando plásmidos quiméricos que contienen genes rep de AAV 2 y nuevos genes cap de AAV para estudios de transferencia serológica y de gen en diferentes modelos animales
Las construcciones quiméricas de empaquetamiento se generan por fusión de secuencias rep de AAV2 con secuencias cap de nuevos serotipos de AAV. Estas construcciones quiméricas de empaquetamiento se utilizan, inicialmente, para seudotipar genomas de AAV recombinantes portadores de ITRs de AAV2 mediante transfección triple en células 293 usando plásmido auxiliar Ad5. Estos vectores seudotipados se utilizan para evaluar el comportamiento en estudios serológicos basados en transducción y evaluar eficacia de transferencia de gen de nuevos serotipos de AAV en diferentes modelos animales incluyendo NHP y roedores, con anterioridad a que los virus intactos e infecciosos de esos nuevos serotipos sean aislados.
A. pAAV2GFP
El plásmido de AAV2 contiene las ITRs de AAV2 y proteína fluorescente verde expresada bajo el control de un promotor constitutivo. Este plásmido contiene los siguientes elementos: las ITRs de AAV2, un promotor CMV, y las secuencias de codificación de GFP.
B. Clonación de plásmido trans
Para construir el plásmido trans quimérico para la producción de vectores de AAV7 seudotipados recombinantes, el plásmido p5E18 (Xiao, et cl., 1999, J. Virol. 73: 3994-4003) fue digestado parcialmente con Xho I para linealizar el plásmido en el sitio Xho I en la posición de 3169 bp solamente. Los extremos cortos del Xho I fueron rellenados a continuación y ligados de nuevo. Este plásmido p5E18 modificado fue restringido con Xba I y Xho I en una digestión completa para extraer la secuencia de gen cap de AAV2 y reemplazado por un fragmento de SpeI/Xho I de 2267 bp que contenía el gen cap de AAV7 que fue aislado del plásmido pCRAAV7 6-5+15-4.
El plásmido resultante contiene las secuencias rep de AAV2 para Rep78/68 bajo el control del promotor P5 de AAV2, y las secuencias rep de AAV2 para Rep52/40 bajo el control del promotor P19 de AAV2. Las secuencias de
cápside de AAV7 están bajo el control del promotor P40 de AAV2, el cual se localiza dentro de las secuencias Rep. Este plásmido contiene además un espaciador 5’ de la rep ORF.
C. Producción de rAAV seudotipado
Las partículas de rAAV (vector de AAV2 en cápside de AAV7) son generadas usando un método libre de adenovirus. De forma resumida, el plásmido cis (plásmido pAAV2.1 IacZ que contiene ITRs de AAV2), y el plásmido trans pCRAAV7 6-5+15-4 (que contiene la rep de AAV2 y la cap de AAV7) y un plásmido auxiliar, respectivamente, fueron co-transfectados en células 293 en una relación de 1:1:2 mediante precipitación de fosfato de calcio.
Para la construcción de los plásmidos auxiliares pAd, se compró plásmido pBG10 en Microbix (Canadá). Un fragmento RsrII que contenía L2 y L3, fue suprimido del pBHG10, dando como resultado el primer plásmido auxiliar, pAdLF13. El plásmido AdLF1 fue construido clonando el fragmento Asp700/SaII con una supresión PmeI/SgfI, aislamiento del pBHG10, en Bluescript. MLP, L2, L2 y L3 fueron suprimidos en el pAdLF1. Otras supresiones de un fragmento NruI de 2,3 kb y, a continuación, de un fragmento RsII/NruII de 0,5 kb, generaron plásmidos auxiliares pAdLF5 y pAdLF6. El plásmido auxiliar, denominado pLF6, proporciona las funciones auxiliares esenciales de E2a y E4 ORF6 no proporcionadas por la célula auxiliar de expresión de E1, pero está suprimido de proteínas de cápside adenovirales y de regiones E1 funcionales.
Típicamente, 50 µg de ADN (cis: trans: auxiliar) fueron transfectados en un plato de cultivo de tejido. Las células 293 fueron cultivadas 72 horas post transfección, sonicadas y tratadas con desoxicolato de sodio al 0,5% (37 ºC durante 10 minutos). Los lisatos celulares fueron sometidos a dos rondas de un gradiente de CsCl. Se recogieron fracciones pico que contienen vector rAAV, se acumularon y se dializaron frente a PBS.
Ejemplo 4: Creación de clones infecciosos que portan nuevos serotipos de AAV intactos para estudio de virología básica en humanos y líneas celulares derivadas de NHP, y evaluación de patogénesis de nuevos serotipos en NHP y otros modelos animales
Para conseguir este objetivo, se emplea el sistema walker de genoma para obtener secuencias terminales 5’ y 3’ (ITRs) y la construcción completa de clones que contienen genomas de nuevos serotipos de AAV intactos.
De forma resumida, Utilizando un Kit Universal Genome Walker [Clontech] comercialmente disponible, ADNs genómicos procedentes de tejidos de monos o de líneas celulares que se identifican como positivas en cuanto a la presencia de secuencia de AAV7, son digestados con endonucleasas Dra I, EcoR V, Pvu II y Stu I y ligados a Adaptador Walker de Genoma para generar 4 Librerías Walker de Genoma (GWLs) individuales. Usando ADNs procedentes de GWLs como plantillas, el AAV7 y las secuencias genómicas adyacentes podrán ser amplificadas en PCR mediante el sensibilizador 1 del adaptador (AP1, proporcionado en el kit), y un sensibilizador 1 específico de AAV7, seguido de un PCR jerarquizado que usa el sensibilizador 2 de adaptador (AP2) y otro sensibilizador 2 específico de AAV7, siendo ambos internos al primer conjunto de sensibilizadores. Los productos PCR principales para el PCR jerarquizado son clonados y caracterizados mediante análisis de secuenciación.
En este experimento, los sensibilizadores que cubren el fragmento de 257 bp u otro fragmento de signatura de un genoma de AAV genérico, se utilizan para amplificación PCR de ADNs celulares extraídos de líneas celulares derivadas de humanos y de NHP para identificar y caracterizar secuencias de AAV latentes. Los genomas de AAV latentes identificados son rescatados de las líneas de células positivas usando adenovirus auxiliares de diferentes cadenas y cepas.
Para aislar clones de AAV infecciosos a partir de líneas celulares derivadas de NHP, se obtiene una línea celular deseada a partir de ATCC y se analiza mediante PCR para identificar el amplicón de 257 bp, es decir, la región de signatura de la invención. El producto PCR de 257 bp es clonado y serotipado mediante análisis de secuenciamiento. Para estas líneas celulares que contienen la secuencia de AAV7, las células son infectadas con SV-15, un adenovirus de simio adquirido en ATCC, Ad5 humano, o transfectadas con una construcción de plásmido que alberga los genes Ad humanos que son responsables de las funciones auxiliares de AAV. A 48 horas post infección o de la transfección, las células son cultivadas y el ADN Hirt se prepara para la clonación de genoma de AAV7 siguiendo Xiao et al., 1999, J. Virol., 73: 3994-4003.
Ejemplo 5 – Producción de vectores de AAV
Se empleó una estrategia de seudotipado similar a la del ejemplo 3 para el AAV1/7, para producir vectores de AAV2 empaquetados con proteínas de cápside de AAV1, AAV5 y AAV8. De forma resumida, se empaquetaron genomas de AAV recombinante equipados con ITRs de AAV2 mediante transfección triple de células 293 con plásmido cis, plásmido auxiliar de adenovirus y una construcción de empaquetamiento quimérica en la que el gen rep de AAV2 se fusionó con genes cap de nuevos serotipos de AAV. Para crear construcciones de empaquetamiento quiméricas, se extirpó el sitio Xho I del plásmido p5E 18 a 3169 bp y el plásmido modificado fue restringido con Xba I y Xho I en una digestión completa para retirar el gen cap de AAV2 y reemplazarlo con un fragmento de Spe I/Xho I de 2267 bp que contiene el gen cap de AAV8 [Xiao, W., et al., (1999), J. Virol. 73, 3994-4003]. Se usó una estrategia de clonación similar para la creación de plásmidos de empaquetamiento quiméricos de AAV2/1 y AAV2/5. Todos los vectores
recombinantes fueron purificados mediante el método de sedimentación de CsCl2 estándar excepto para el AAV2/2, el cual fue purificado mediante cromatografía de heparina de simple etapa.
Se determinaron títulos de copia de genoma (GC) de vectores de AAV mediante análisis de TaqMan usando sondas y sensibilizadores que objetivan la región SV40 poly A según se ha descrito anteriormente [Gao, G. et al., (2000) Hum Gene Ther 11, 2079-91].
Se construyeron vectores para cada serotipo para un número de estudios in vitro e in vivo. Ocho casetes de transgén diferentes fueron incorporados en los vectores y se produjeron viriones recombinantes para cada serotipo. La recuperación de virus, basada en copias de genoma, se ha resumido en la Tabla 4 que sigue. Las producciones de vector fueron altas para cada serotipo sin diferencias consistentes entre serotipos. Los datos que se presentan en la tabla son producciones medias de copias de genoma con desviación estándar x 1013 de lotes de producción múltiple de 50 transfecciones de placa (150 mm).
Tabla 4. Producción de vectores recombinantes
AAV2/1
AAV2/2 AAV2/5 AAV2/7 AAV2/8
CMV LacZ
7,30 + 4,33 (n = 9) 4,49 + 2,89 (n = 6) 5,19 + 5,19 (n = 8) 3,42 (n = 1) 0,87 (n = 1)
CMV EGFP
6,43 + 2,42 (n = 2) 3,39 + 2,42 (n = 2) 5,55 + 6,49 (n = 4) 2,98 + 2,66 (n = 2) 3,74 + 3,88 (n = 2)
TBG LacZ
4,18 (n = 1) 0,23 (n = 1) 0,704 + 0,43 (n = 2) 2,16 (n = 1) 0,532 (n = 1)
AIb A1AT
4,67 + 0,75 (n = 2) 4,77 (n = 1) 4,09 (n = 1) 5,04 (n = 1) 2,02 (n = 1)
CB A1AT
0,567 (n = 1) 0,438 (n = 1) 2,82 (n = 1) 2,78 (n = 1) 0,816 + 0,679 (n = 2)
TBG rhCG
8,51 + 6,65 (n = 6) 3,47 + 2,09 (n = 5) 5,26 + 3,85 (n = 49 6,52 + 3,08 (n = 4) 1,83 + 0,98 (n = 5)
TBG cFIX
1,24 + 1,29 (n = 3) 0,63 + 0,394 (n = 6) 3,74 + 2,48 (n = 7) 4,05 (n = 1) 15,8 + 15,0 (n = 5)
Ejemplo 6 – Análisis serológicco de vectores seudotipados
Ratones C57BL/6 fueron inyectados con vectores de diferentes serotipos de vectores AAVCBA1AT intramuscularmente (5 x 1011 GC) y se recogieron muestras de suero 34 días más tarde. Para comprobar la actividad neutralizante y de neutralización cruzada de los sueros respecto a cada serotipo de AAV, los sueros fueron analizados en base a un ensayo de anticuerpo neutralizante [Gao, G.P., et al., (1996), J. Virol. 70, 8934-43]. Más específicamente, la presencia de anticuerpos neutralizantes fue determinada averiguando la capacidad del suero para inhibir transducción de células 84-31 mediante virus informadores (AAVCMVEGFP) de serotipos diferentes. Específicamente, el virus informador AAVCMVEGFP de cada serotipo [en multiplicidad de infección (MOI) que conduce a una transducción del 90% de células indicadoras] fue pre-incubado con suero inactivado con calor procedente de animales que recibieron diferentes serotipos de AAV o de ratón naïve. Tras 1 hora de incubación a 37 ºC, los virus fueron añadidos a células 84-31 en 96 placas de pocillo durante 48 ó 72 horas, dependiendo del serotipo del virus. La expresión de GFP fue medida con Fluorolmagin (Molecular Dynamics) y cuantificada mediante Image Quant Software. Los títulos de anticuerpo neutralizante fueron informados como dilución más alta de suero que inhibió la transducción hasta menos del 50%.
La disponibilidad de vectores de expresión de GFP simplificó el desarrollo de un ensayo respecto a anticuerpos neutralizantes que estuvo basado en la inhibición de transducción en una línea celular permisiva (es decir, células 293 que expresan de manera estable E4 a partir de Ad5). Los sueros para los serotipos de AAV seleccionados fueron generados por inyección intramuscular de los virus recombinantes. Se evaluó la neutralización de transducción de AAV mediante diluciones de 1:20 y 1:80 de los antisueros (Véase la Tabla 5 que sigue). Los antisueros para AAV1, AAV2, AAV5 y AAV6 neutralizaron la transducción del serotipo respecto al que se generó el antisuero (AAV5 y AAV8 en menor extensión que el AAV1 y el AAV2), pero no respecto al otro serotipo (es decir, no existió evidencia de neutralización cruzada que sugiera que el AAV8 es realmente el único serotipo).
Tabla 5. Análisis serológico de nuevos serotipos de AAV
% de infección sobre células 84-31 con virus AAVCMVEGFP:
AAV2/1
AAV2/2 AAV2/5 AAV2/7 AAV2/8
Dilución de suero:
Dilución de suero: Dilución de suero: Dilución de suero: Dilución de suero:
Sueros
Vector de Inmunización 1/20 1/80 1/20 1/80 1/20 1/80 1/20 1/80 1/20 1/80
Grupo 1
AAV2/1 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100
Grupo 2
AAV2/2 100 100 0 0 100 100 100 100 100 100
Grupo 3
AAV2/5 100 100 100 100 16,5 16,5 100 100 100 100
Grupo 4
AAV2/7 100 100 100 100 100 100 61,5 100 100 100
Grupo 5
AAV2/8 100 100 100 100 100 100 100 100 26,3 60
Se analizaron sueros humanos de 52 sujetos normales respecto a neutralización frente a serotipos seleccionados. No se encontró ninguna muestra de suero que neutralizara el AAV2/7 y el AAV2/8, mientras que los vectores de AAV2/2 y AAV2/1 fueron neutralizados en un 20% y un 10% de suero, respectivamente. Una fracción de IgG acumulada humana que representa una recogida de 60.000 muestras individuales, no neutralizó el AAV2/7 ni el AAS2/8, mientras que los vectores de AAV2/2 y AAV2/1 fueron neutralizados en títulos de suero iguales a 1/1280 y 1/640, respectivamente.
Ejemplo 7 - Evaluación in vivo de diferentes serotipos de vectores de AAV
En este estudio, 7 genomas de AAV recombinante, AAV2CBhAIAT, AAV2IbhAIAT, AAV2CMVrhCG, AAV2TBGrhCG, AAV2TBGcFIX, AAV2CMVLacZ y AAV2TBGLacZ fueron empaquetados con proteínas de cápside de serotipos diferentes. En la totalidad de las 7 construcciones, casetes de minigén estuvieron flanqueadas con ITRs de AAV2. Genes de cADNs de α-antitripsina (AIAT) [Xiao, W., et al., (1999) J. Virol., 73, 3994-4003], -subunidades de hormona coriogonadotrópica (CG) de mono Rhesus [Zoltick, P.W. & Wilson, J.M. (2000), Mol. Ther. 2, 657.9], factor IX canino [Wrang, et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94, 11563-6], y -galactosidasa bacteriana (es decir, Lac Z), fueron usados como genes informadores. Para transferencia de gen dirigida al hígado, ya sea promotor de gen de albúmina (Alb) de ratón [Xiao, W. (1999), citado anteriormente] o ya sea promotor de gen de globulina de enlace de hormona tiroidea humana (TBG) [Wrang (1997), citado anteriormente] se usó para activar expresión específica del hígado de genes informadores. En experimentos de transferencia de gen dirigida al músculo, se empleó promotor reciente de citomegalovirus (CMV) o promotor de -actina de pollo con protenciador de CMV (CB) para dirigir expresión de los informadores.
Para transferencia de gen dirigida al músculo, se inyectaron vectores en la parte anterior de la tibia derecha de ratones desnudos NCR de 4-6 semanas de edad o ratones C57BL/6 [Taconic, Germantown, NY]. En estudios de transferencia de gen dirigida al hígado, los vectores fueron infundidos intraportalmente en ratones desnudos NCR de 7-9 semanas de edad o C57BL/6 (Taconic, Germantown, NY). Se recogieron muestras de suero intraorbitalmente en diferentes instantes de tiempo tras la administración del vector. Se cultivaron tejidos de músculo y de hígado en diferentes momentos de tiempo para crioseccionamiento y manchado histoquímico Xgal a partir de animales que recibieron los vectores LacZ. Para el experimento de readministración, ratones C56BL/6 recibieron inicialmente vectores de AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/7 y 2/BCBAIAT intramuscularmente y seguido para expresión de gen de AIAT durante 7 semanas. Los animales fueron tratados después con AAV2/8TBGcFIX intraportalmente y estudiados en cuanto a expresión de gen cFIX.
Se realizaron ensayos basados en ELISA para cuantificar niveles de suero de proteínas hAIAT, rhCG y cFIX según se ha descrito anteriormente [Gao, G.P., et al., (1996), J. Virol. 70, 8934-43; Zoltick, P.W. & Wilson, J.M. (2000), Mol. Ther. 2, 657-9; Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11563-6]. Los experimentos fueron completados cuando los animales fueron sacrificados para cultivo de tejidos del músculo y de hígado para extracción de ADN y análisis cuantitativo de copias de genoma de vectores presentes en tejidos objetivo por TaqMan usando el mismo conjunto de sensibilizadores y sondas que en la titulación de preparaciones de vector [Zhang, Y., et al., (2001), Mol. Ther. 3, 697-707].
El comportamiento de los vectores basados en los nuevos serotipos, fue evaluado en modelos de murina de transferencia de gen dirigida al músculo y al hígado, y se comparó con los vectores basados en los serotipos conocidos AAV1, AA2 y AAV5. Los vectores que expresaron proteína secretadas (alfa-antitripsina (A1AT) y gonadotropina coriónica (CG)) fueron usados para cuantificar eficacias de transducción relativas entre diferentes serotipos mediante análisis ELISA de sueros. La distribución celular de la transducción dentro del órgano objetivo fue evaluada usando vectores de expresión LacZ e histoquímica X-gal.
El comportamiento de los vectores de AAV en el músculo esquelético, fue analizado a continuación de inyección
directa en los músculos tibiales anteriores. Los vectores contenían el mismo genoma basado en AAV2, con el gen de CMV inmediatamente anterior o con un promotor de -actina potenciado de CMV que activa expresión del transgén. Los estudios previos indicaron que los ratones C57BL/6 competentes inmunes inducen respuestas humorales limitadas a la proteína A1AT humana cuando se expresa a partir de vectores de AAV [Xiao, W., et al., (1999), J. Virol. 73, 3994-4003].
En cada mancha, el vector AAV2/1 produjo los niveles más altos de A1AT y el vector AAV2/2 los más bajos, con los vectores AAV2/7 y AAV2/8 mostrando niveles de expresión intermedios. Los niveles de pico de CG a los 28 días después de la inyección de ratones nu/nu NCR mostró los niveles más altos a partir de AAV2/7 y los más bajos a partir de AAV2/2, con los AAV2/8 y AAV2/1 entre los anteriores. La inyección de vectores lacZ de AAV2/1 y de AA2/7 produjo expresión de gen en sitios de inyección en todas las fibras musculares, siendo las fibras positivas de lazC sustancialmente más bajas las observadas con AAV2/2 y AAVs/8. Estos datos indican que la eficacia de transducción con vectores de AAV2/7 en el músculo esquelético es similar a la obtenida con AAV2/1, la cual es la más eficiente en el músculo esquelético de los serotipos descritos con anterioridad [Xiao, W. (1999), citado anteriormente; Chao, H., et al., (2001), Mol. Ther. 4, 217-22; Chao, H., et al., (2000), Mol. Ther. 2, 619-23].
Se usaron modelos similares de murina para evaluar transferencia de gen dirigida al hígado. Se indujeron dosis idénticas de vector basado en copias de genoma en las venas portal de ratones que fueron posteriormente analizados en cuanto a expresión del transgén. Cada vector contenía un genoma basado en AAV2 que usaba promotores específicos del hígado descritos con anterioridad (es decir, albúmina o globulina de enlace de hormona tiroidea) para activar expresión del transgén. Más en particular, se usaron casetes de minigén TBGCG para transferencia de gen dirigida al músculo y al hígado, respectivamente. Los niveles de rhCG fueron definidos como unidades relativas (Rus x 103). Los datos procedían de ensayar muestras de suero recogidas el día 28, después de la administración del vector (4 animales por grupo). Según se muestra en la Tabla 3, el impacto de las proteínas de cápside sobre la eficacia de transducción de vectores AIAT en ratones nu/nu y C57BL/6 y de vectores CG en ratones C57BL/6, fue consistente. (Véase la Tabla 6).
Tabla 6. Expresión de l-unidad de Gonadotropina Coriónica de Mono Rhesus (rhCG)
Vector Músculo Hígado
AAV2/1 4,5 + 2,1 1,6 + 1,0
AAV2 0,5 + 0,1 0,7 + 0,3
AAV2/5 ND* 4,8 + 0,8
AAV2/7 14,2 + 2,4 8,2 + 4,3
AAV2/8 4,0 + 0,7 76,0 + 22,8
* No determinado en este experimento ______________________________________________________________________________
En todos los casos, los vectores AAV2/8 produjeron los niveles más latos de expresión de transgén que estuvieron en una gama de 16 a 110 más altos que los obtenidos con vectores AAV2/2; la expresión de los vectores AAV2/5 y AAV2/7 fue intermedia, siendo la del AAV2/7 más alta que la del AAV2/5. El análisis de secciones de hígado manchadas X-Gal de animales que recibieron los vectores lacZ correspondientes mostraron una correlación entre el número de células transducidas y los niveles globales de expresión de transgén. ADNs extraídos de hígados de ratones C57BL/6 que recibieron los vectores A1AT fueron analizados en cuanto a abundancia de ADN de vector usando tecnología PCR en tiempo real.
La cantidad de ADN de vector encontrado en el hígado 56 días después de la inyección estuvo correlacionada con los nieles de expresión de transgén (Véase la Tabla 7). Para este experimento, se usó un conjunto de sonda y de sensibilizadores que objetivan la región SV40 polyA del genoma de vector para TaqMan. Los valores mostrados son medias de tres animales individuales con desviaciones estándar. Los animales fueron sacrificados en el día 56 para cultivar tejidos de hígado para extracción de ADN. Estos estudios indican que el AAV8 es el vector más eficiente para transferencia de gen dirigida al hígado debido a cantidades incrementadas de hepatocitos transducidos.
Tabla 7 – Análisis PCR en tiempo real respecto a abundancia de vectores de AAV en hígado de ratón nu/nu a continuación de la inyección de 1 x 1011 copias de genoma de vector
Vectores AAV/Dosis Copias de genoma por célula
AAV2/1AlbAIAT 0,6 + 0,36 AAV2AlbAIAT 0,003 + 0,001 AAV2/5AlbAIAT 0,83 + 0,64 AAV2/7AlbAIAT 2,2 + 1,7 AAV2/BAlbAIAT 18 + 11
Los datos serológicos descritos en lo que antecede sugieren que el vector AAV2/8 no podría ser neutralizado in vivo a continuación de la inmunización con otros serotipos. Ratones C57BL/6 recibieron inyecciones intraportal de vector de AAV2/8 que expresan factor IX canino (1011 copias de genoma) 56 días después de que los mismos recibieran inyecciones intramusculares de vectores A1AT de serotipos diferentes. Se obtuvieron niveles altos de expresión de factor IX 14 día después de la infusión de AAV2/8 en animales naïve (17 + 2 µg/ml, n=4) que no fueron significativamente diferentes de los que se observaron en animales inmunizados con AAV2/1 (31 + 23 µg/ml, n=4), AAV2/2 (16 µg/ml, n=2), y AAV2/7 (12 µg/ml, n=2). Esto contrasta con lo que se observó en animales inmunizados con AAVs/8 que fueron infundidos con el vector de factor IX de AAV2/8 en el que no se observó ningún factor IX detectable (< 0,1 µg/ml, n=4).
Los oligonucleótidos en regiones conservadas del gen cap, amplificaron secuencias procedentes de monos Rhesus que representaban AAVs únicos. Se encontraron secuencias idénticas de signatura cap en múltiples tejidos procedentes de monos Rhesus derivados de al menos dos colonias diferentes. Las tramas de lectura abierta rep y cap de longitud completa, fueron aisladas y secuenciadas a partir de fuentes simples. Solamente las tramas de lectura abierta cap de los nuevos AAVs fueron necesarias para evaluar su potencial como vectores puesto que los vectores con las cápsides de AAV7 o de AAV8 se generaron usando las ITRs y la rep de AAV2. Esto también simplificó la comparación de diferentes vectores puesto que el genoma de vector real es idéntico entre serotipos de vector diferentes. De hecho, las producciones de vectores recombinantes generadas usando esta alternativa no difieren ente serotipos.
Los vectores basados en AAV7 y AAV8 parecen ser inmunológicamente distintos (es decir, no son neutralizados por anticuerpos generados contra otros serotipos). Además, los sueros procedentes de humanos no neutralizan transducción por vectores AAV7 y AAV8, lo que constituye una ventaja sustancial sobre AAVs derivados de humanos actualmente en desarrollo para los que porción significativa de la población humana tiene inmunidad preexistente que es neutralizante [Chirmule, N., et al., (1999), Gene Ther. 6, 1574-83].
El tropismo de cada nuevo vector es favorable para aplicaciones in vivo. Los vectores de AAV2/7 parecen transducir músculo esquelético tan eficientemente como el AAV2/1, el cual es el serotipo que confiere el nivel de transducción más alto en el músculo esquelético de los AAVs de primate comprobados hasta la fecha [Xiao, W., citado anteriormente; Chou (2001), citado anteriormente, y Chou (2000), citado anteriormente]. De manera importante, el AAV2/8 proporciona una ventaja sustancial sobre los otros serotipos en términos de eficacia de transferencia de gen respecto al hígado que hasta ahora ha sido relativamente decepcionante en términos de las cantidades de hepatocitos transducidos de manera estable. Las bases para la eficacia mejorada del AAV2/8 no están claras, aunque presumiblemente se deben a la captación a través de un receptor diferente que es más activo sobre la superficie basolateral de los hepatocitos. Esta eficacia mejorada será muy útil en el desarrollo de transferencia de gen dirigida al hígado donde el número de células transducidas es crítico, tal como en desórdenes del ciclo de urea y en hipercolesterolemia familiar.
Por lo tanto, la presente invención proporciona una nueva alternativa para aislar nuevos AAVs en base a recuperación PCR de secuencias genómicas. Las secuencias amplificadas fueron incorporadas fácilmente en vectores y comprobadas en animales. La falta de inmunidad pre-existente al AAV7 y el tropismo favorable de los vectores para el músculo, indican que el AAV7 es adecuado para su uso como vector en terapia de gen humano y otras aplicaciones in vivo. De forma similar, la falta de inmunidad pre-existente respecto a los serotipos de AAV de la invención, y sus tropismos, hace que los mismos sean útiles durante el suministro de moléculas terapéuticas y de otras moléculas útiles.
Ejemplo 9 – Estudios de tropismo del tejido
En el diseño de un esquema de alto análisis funcional completo para las nuevas construcciones de AAV, se seleccionó un promotor no específico del tejido y altamente activo, se seleccionó el promotor C8 (el promotor de actina de pollo potenciado en CMV) para activar un gen informador detectable y cuantificable, el gen α anti-tripsina humano. De ese modo, solamente se necesita construir un vector por cada nuevo clon de AAV para estudios de transferencia de gen que objetivan 3 tejidos diferentes: el hígado, el pulmón y el músculo, para analizar el tropismo de tejido de una construcción de AAV particular. La tabla que sigue resume datos generados a partir de 4 nuevos vectores de AAV en los estudios de tropismo del tejido (AAVCBA1AT), a partir de los cuales se encontró que un nuevo clon de cápside de AAV, el 44.2, era un vehículo muy potente de trasferencia de gen en la totalidad de los 3 tejidos con un gran resultado en el tejido pulmonar en particular. La Tabla 8 recoge los datos obtenidos (en µg de A1AT/ml de suero) en el día 14 del estudio.
Tabla 8
Vector
Tejido Objetivo
Pulmón
Hígado Músculo
AAV2/1
ND ND 45 + 11
AAV2/5
0,6 + 0,2 ND ND
AAV2/8
ND 84 + 30 ND
AAV2/rh.2 (43.1)
14 + 7 25 + 7,4 35 + 14
AAV2/rh.10 (44.2)
23 + 6 53 + 19 46 + 11
AAV2/rh.13 (44.2)
3,5 + 2 2 + 0,8 3,5 + 1,7
AAV2/rh.21 (42.10)
3,1 + 2 2 + 1,4 4,3 + 2
Un par de experimentos adicionales fueron realizados para confirmar el tropismo superior de AAV 44.2 en tejido
10 pulmonar. En primer lugar, el minigén CC10hA1AT portado por el vector de AAV para expresión específica del pulmón seudotipado con cápsides de nuevos AAVs, fue suministrado a animales deficientes inmunes (NCR desnudo) en igual volumen (50 µl de cada una de las preparaciones originales sin dilución) por medio de inyecciones intratraqueales según se dispone en la tabla que sigue. En la Tabla 9, 50 µl de cada preparación original por ratón, NCR Desnudo, límite de detección > 0,033 µg/ml, día 28.
15 Tabla 9
Vector
GC total en 50 µl de vector µg de A1AT/ml con 50 µl de vector µg de A1AT/ml con 1 x 1011 de vector Transferencia de gen relativa en comparación con rh.10 (clon 44.2)
2/1
3 x 1012 2,6 + 0,5 0,09 + 0,02 2,2
2/2
5,5 x 1011 <0,03 <0,005 <0,1
2/5
3,6 x 1012 0,65 + 0,16 0,02 + 0,004 0,5
2/7
4,2 x 1012 1 + 0,53 0,02 + 0,01 0,5
2/8
7,5 x 1011 0,9 + 0,7 0,12 + 0,09 2,9
2/ch.5 (A.3.1)
9 x 1012 1 + 0,7 0,01 + 0,008 0,24
2/rh.8 (43.25)
4,6 x 1012 26 + 21 0,56 + 0,46 13,7
2/rh.10 (44.2)
2,8 x 1012 115 + 38 4,1 + 1,4 100
2/rh.13 (42.2)
6 x 1012 7,3 + 0,8 0,12 + 0,01 2,9
2/rh.21 (42.10)
2,4 x 1012 9 + 0,9 0,38 + 0,04 9,3
2/rh.22 (42.11)
2,6 x 1012 6 + 0,4 0,23 + 0,02 5,6
2/rh.24 (42.13)
1,1 x 1011 0,4 + 0,3 0,4 + 0,3 1
Los vectores fueron administrados también a animales competentes inmunes (C57BL/6) en iguales copias de genoma (1 x 1011 GC) que las mostradas en la tabla 10. (1 x 1011 GC por animal, C57BL/6, día 14, límite de detección > 0,033 µg/ml)
20 Tabla 10
Vector de AAV
µg de A1AT/ml con 1 x 1011 de vector Transferencia de gen relativa en comparación con rh.10 (clon 44.2)
2/1
0,076 + 0,031 2,6
2/2
0,1 + 0,09 3,4
2/5
0,0840 + 0,33 2,9
(continuación)
2/7
0,33 + 0,01 11
2/8
1,92 + 1,3 2,9
2/ch.5 (A.3.1)
0,048 + 0,004 1,6
2/rh.8 (43.25)
1,7 + 0,7 58
2/rh.10 (44.2)
2,93 + 1,7 100
2/rh.13 (42.2)
0,45 + 0,15 15
2/rh.21 (24.10)
0,86 + 0,32 29
2/rh.22 (42.11)
0,38 + 0,18 13
2/rh.24 (42.1q3)
0,3 + 0,19 10
Los datos procedentes de ambos experimentos confirmaron el importantísimo tropismo del clon 44-2en transferencia de gen dirigida al pulmón.
5 De forma interesante, el comportamiento del clon 44.2 en transferencia de gen dirigida al hígado y al músculo fue también excepcional, cercano al del mejor transductor del hígado, el AAV8, y del mejor transductor del músculo, el AAV1, sugiriendo que este nuevo AAV tiene alguna significación biológica intrigante.
Para estudiar las propiedades serológicas de estos nuevos AAVs, se crearon vectores AAVGFP seudotipados para inmunización de conejos y transducción in vitro de células 84-31 en presencia y en ausencia de antisueros frente a
10 diferentes cápsides. Los datos se resumen a continuación.
Tabla 11a. Ensayo NAB-cruzado en células 8431 y coinfección de adenovirus (Adv). Infección en células 8431 (coinfectadas con Adv) con:
109 GC
109 GC 109 GC 1010 GC
rh.13
rh.21 rh.22 Rh.24
Suero de conejo inmunizado con:
AAV2/42.2 AAV2/42.10 AAV2/42.11 AAV2/42.13
AAV2/1
1/20 1/20 1/20 Sin NAB
AAV2/2
1/640 1/1280 1/5120 Sin NAB
AAV2/5
Sin NAB 1/40 1/160 Sin NAB
AAV2/7
1/81920 1/81920 1/40960 1/640
AAV2/8
1/640 1/640 1/320 1/5120
Ch.5 AAV2/A3
1/20 1/160 1/640 1/640
rh.8 AAV2/43.25
1/20 1/20 1/20 1/320
rh.10 AAV2/44.2
Sin NAB Sin NAB Sin NAB 1/5120
rh.13 AAV2/42.2
1/5120 1/5120 1/5120 Sin NAB
rh.21 AAV2/42.10
1/5120 1/10240 1/5120 1/20
rh.2 AAV2/42.11
1/20480 1/20480 1/40960 Sin NAB
rh.24 AAV2/42.13
Sin NAB 1/20 1/20 1/5120
Tabla 1b. Ensayo NAB-cruzado en células 8431 y coinfección de Adv. Infección en células 8431 (coinfectadas con Adv), con:
109 GC
1010 GC 1010 GC 109 GC 109 GC
rh.12
ch.5 rh.8 rh.10 rh.20
Suero de conejo inmunizado con:
AAV2/42.1 B AAV2/A3 AAV2/43.25 AAV2/44.2 AAV2/42.8.2
AAV2/1
Sin NAB 1/20480 Sion NAB 1/80 ND
AAV2/2
1/20 Sin NAB Sin NAB Sin NAB ND
AAV2/5
Sin NAB 1/320 Sin NAB Sin NAB ND
(continuación)
AAV2/7
1/2560 1/640 1/160 1/81920 ND
AAV2/8
1/10240 1/2560 1/2560 1/81920 ND
ch.5 AAV2/A3
1/1280 1/10240 ND 1/5120 1/320
rh.8 AAV2/43.25
1/1280 ND 1/20400 1/5120 1/2560
rh.10 AAV2/44.2
1/5120 ND ND 1/5120 1/5120
rh.13 AAV2/42.2
1/20 ND ND Sin NAB 1/320
rh.21 AAV2/42.10
1/20 ND ND 1/40 1/80
rh.22 AAV2/42.11
Sin NAB ND ND ND Sin NAB
rh.24 AAV2/42.13
1/5120 ND ND ND 1/2560
Tabla 12
Título de sueros de conejo
Vector
Título d21 Título tras refuerzo
ch.5
AAV2/A3 1/10.2400 1/40.960
rh.8
AAV2/43.25 1/20.400 1/163.840
rh.10
AAV2/44.2 1/10.240 1/527.680
rh.13
AAV2/42.2 1/5.120 1/20.960
rh21
AAV2/42.10 1/20.400 1/81.920
rh.22
AAV2/42.11 1/40.960 ND
rh.24
AAV2/42.13 1/5.120 ND
Tabla 13a. Infección en células 8431 (coinfectadas con ADV) con GFP
109 GC/pocillo
109 GC/pocillo
109 GC/pocillo
109 GC/pocillo
109 GC/pocillo
109 GC/pocillo
ch.5
AAV2/1
AAV2/2 AAV2/5 AAV2/7 AAV2/8 AAV2/A3
# GFU/campo
128 >200 95 56 13 1
83
>200 65 54 11 1
Tabla 13b. Infección en células 8431 (coinfectadas con Adv) con GFP
109 GC/pocillo
109 GC/pocillo 109 GC/pocillo 109 GC/pocillo 109 GC/pocillo 109 GC/pocillo 109 GC/pocillo
rh.8
rh.10 rh.13 rh.21 rh.22 rh.24 rh.12
AAV2/43.25
AAV2/44.2 AAV2/42.2 AAV2/42.10 AAV2/42.11 AAV2/42.13 AAV2/42.1B
# GFU/campo
3 13 54 62 10 3 18
2
12 71 60 14 2 20
48
47 16 3 12

Ejemplo 10 – Modelo de ratón de hipercolesterolemia familiar
10 El experimento que sigue demuestra que la construcción AAV2/7 de la invención suministra el receptor de LDL y expresa el receptor de LDL en una cantidad suficiente para reducir los niveles de colesterol del plasma y de triglicéridos en modelos animales de hipercolesterolemia familiar.
A. Construcción de vector
Se construyeron vectores de AAV empaquetados con proteínas de cápside de AAV7 o AAV8 usando una estrategia
de seudotipado [Huldinger M., et al., J. Virol. 2001; 75: 6199-6203]. Genomas de AAV recombinante don repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2 fueron empaquetados mediante triple transfección de células 293 con el plásmido cis, el plásmido auxiliar de adenovirus y una construcción quimérica de empaquetamiento una fusión de los cápsides de los nuevos serotipos de AAV con el gen rep de AAV2. El plásmido de empaquetamiento quimérico fue construido según se ha descrito anteriormente [Hildinger et al., citado con anterioridad]. Los vectores recombinantes fueron purificados mediante el método de sedimentación de CsCl2 estándar. Para determinar el TaqMan producido (Applied Biosystems), se realizó el análisis usando sondas y sensibilizadores que objetivan la región SV40 poly (A) de los vectores [Gao GP et al., Hum. Gene. Ther., 10 de Octubre de 2000; 11 (15): 2079-91]. Los vectores resultantes expresan el transgén bajo el control del promotor de gen de globulina (TBG) de enlace de hormona tiroidea humana.
B. Animales
Se compraron ratones deficientes de receptor de LDL sobre la base del C57BL/6 en el Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) y se mantuvieron como colonia de sangrado. Los ratones tuvieron acceso sin restricción al agua y a una Dieta Western alta en grasa (alto % de colesterol) que empezó tres semanas antes de la inyección del vector. En el día -7 y también en el día 0, se obtuvo sangre mediante sangría retroorbital y se evaluó el perfil de lípido. Los ratones fueron divididos aleatoriamente en siete grupos. El vector fue inyectado por medio de una inyección intraportal según se ha descrito anteriormente [Chen SJ et al., Mol. Therapy 2000; 2(3), 256-261]. De forma resumida, los ratones fueron anestesiados con cetamina y xilazina. Se realizó una laparotomía y la vena de dejó al descubierto. Usando una aguja 30g, se inyectó directamente en la vena portal la dosis apropiada de vector diluido en 100 µl de PBS. Se aplicó presión al sitio de la inyección para asegurar una detención de la sangría. La herida de la piel se cerró y se vendó y los ratones fueron monitorizados cuidadosamente para el siguiente día. Se realizaron sangrías semanales a partir del día 14 después de la transferencia de gen dirigida al hígado para medir los lípidos de la sangre. Dos animales de cada grupo fueron sacrificados en los momentos de tiempo de la semana 6 y la semana 12 después de la inyección del vector, para examinar el tamaño de placa ateroesclerótica así la expresión de receptor. Los ratones restantes fueron sacrificados en la semana 20 para la medición de placa la determinación de la expresión de transgén.
Tabla 14
Vector
dosis n
Grupo 1
AAV2/7 – TBG-hLDLr 1 x 1012 gc 12
Grupo 2
AAV2/7 – TBG-hLDLr 3 x 1011 gc 12
Grupo 3
AAV2/7 – TBG-hLDLr 1 x 1011 gc 12
Grupo 4
AAV2/8 – TBG-hLDLr 1 x 1012 gc 12
Grupo 5
AAV2/8 – TBG-hLDLr 3 x 1011 gc 12
Grupo 6
AAV2/8 – TBG-hLDLr 1 x 1011 gc 12
Grupo 7
AAV2/7 – TBG-LacZ 1 x 1011 gc 16
C. Análisis de lipoproteína del suero y de la función del hígado
Se obtuvieron muestras de sangre procedentes del plexo retroorbital después de un período de ayuno de 6 horas. El suero fue separado del plasma por centrifugación. Las cantidades de lipoproteínas del plasma y de transaminasas del hígado fueron detectadas usando un analizador químico clínico automatizado (ACE, Schiapparelli Biosystems, Alpha Wassemann).
D. Detección de expresión de transgén
La expresión del receptor de LDL fue evaluada mediante mancha de inmuno-fluorescencia y mancha Western. Para Mancha Western, el tejido de hígado congelado fue homogeneizado con solución tampón para lisis (20 mM Tris, pH 7,4, 130 mM NaCl, 1% Triton X 100, inhibidor de proteinasa (completo, libre de EDTA, Roche, Mannheim, Alemania). La concentración de proteína se determinó usando el Kit de Reactivo de En sayo de Micro Proteína BCA (Pierce, Rockford. IL). Se redisolvieron 40 µg de proteína en Tris-HCl Ready Gels al 4-15% (Biorad, Hércules, CA), y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen). Para generar anticuerpos de receptor anti-hLDL, un conejo fue inyectado intravenosamente con una preparación de AdhLDLr (1 x 1013 GC). Cuatro semanas más tarde, se obtuvo el suero de conejo y se usó para mancha Western. Se usó una dilución de 1:100 del suero como anticuerpo principal seguido de IgG anti-ratón conjugada por HRP y de una detección quimioluminiscente de ECL (Kit ECL de Detección de Mancha Western, Amersham, Arlington Heights, IL).
E. Inmunocitoquimica
Para la determinación de expresión de receptor de LDL en secciones de hígado congeladas, se llevaron a cabo
análisis de inmunohistoquímica. Secciones de criostato de 10 µm fueron, ya sea fijadas en acetona durante 5 minutos, o ya sea no fijadas. Se obtuvo bloqueo por medio de un período de incubación de 1 hora con un 10% de suero de cabra. Las secciones fueron incubadas a continuación durante una hora con anticuerpos primarios a temperatura ambiente. Un LDL anti-humano de anticuerpo policlonal de conejo (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) fue utilizado diluido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones fueron lavadas con PBS, e incubadas con IgG anti-ratón de cabra con fluoresceína diluida a 1:100 (Sigma, St Louis, Mo). Finalmente, se examinaron muestras bajo microscopio Nikon Microphot-FXA de fluorescencia. En todos los casos, la incubación fue seguida de un lavado extenso con PBS. Los controles negativos consistieron en pre-incubación con PBS, omisión del anticuerpo primario, y sustitución del anticuerpo primario por un anticuerpo de control no inmune emparejado con el isotipo. Se realizaron los tres tipos de controles mencionados anteriormente para cada experimento el mismo día.
F. Eficacia de transferencia de gen
Se obtuvo tejido de hígado tras sacrificar el ratón en los momentos de tiempo designados. El tejido fue congelado en nitrógeno líquido y almacenado a -80 ºC hasta su procesamiento adicional. Se extrajo ADN del tejido del hígado usando un Mini Kit de ADN QIAamp (QIAGEN GmbH, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se evaluaron copias de genoma de vectores de AAV del tejido del hígado usando análisis Taqman con la utilización de sondas y de sensibilizadores frente a la cola poly(A) de SV40 según se ha descrito con anterioridad.
G. Medición de placa ateroesclerótica
Para la cuantificación de las placas ateroescleróticas en la aorta de ratón, los ratones fueron anestesiados (10% de cetamina y de xilazina, ip), abiertos por el pecho y el sistema arterial perfundido con solución salida tamponada de fosfato helada a través del ventrículo izquierdo. La aorta fue cultivada a continuación cuidadosamente, hendida a lo largo de la línea media ventral desde el arco aórtico hacia abajo, hasta la arterias femorales, y se fijó en formalina. Las placas ateroescleróticas ricas en lípido fueron manchadas con Sudan IV (Sigma, Alemania) y la aorta fue enclavada en plano sobre una superficie de cera negra. La imagen fue capturada con una videocámara en color Sony DXC-960 MD. El área de la placa, así como de la superficie aórtica completa se determinó usando Sistemas de Obtención de Imágenes de Fase 3 (Media Cybernetics).
I. Evaluación de acumulación de lípido en el hígado.
Se realizó un Manchado Rojo de Aceite de secciones de hígado congelado para determinar la acumulación de lípido. Las secciones de hígado congelado fueron aclaradas brevemente en agua destilada, seguido de una incubación de 2 minutos en propileno glicol absoluto. Las secciones fueron manchada a continuación en solución roja de aceite (0,5% en propileno glicol) durante 16 horas seguido de contramanchado con solución de hematoxilina de Mayer durante 30 segundos y montaje en solución de jalea de glicerina caliente.
Para la cuantificación del colesterol del hígado y del contenido de triglicéridos, se homogeneizaron secciones de hígado y se incubaron en cloroformo/metanol (2:1) durante la noche. Tras la adición de H2SO4 al 0,005% y centrifugación durante 10 minutos, se recogió la capa inferior de cada muestra, se dividió en dos porciones alícuotas y se secó bajo nitrógeno. Para la medición del colesterol, los lípidos secos de la primera porción alícuota fueron disueltos en Triton X-100 al 1% en cloroformo. Una vez disuelta, la solución fue secada bajo nitrógeno. Tras la disolución de los lípidos en ddH2O y la incubación durante 30 minutos a 37 ºC, se midió la concentración total de colesterol usando un Kit de Colesterol Total (Wako Diagnostics). Para segunda porción alícuota, los líquidos secados fueron disueltos en KOH alcohólico e incubados a 60 ºC durante 30 minutos. A continuación, se añadió 1M MgCl2, seguido por incubación sobre hielo durante 10 minutos y centrifugación a 14.000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante fue finalmente evaluado respecto a los triglicéridos (Wako Diagnostics).
Todos los vectores seudotipados en una cápside de AAVs/8 o de AAV2/7 redujeron el colesterol total, LDL, y los triglicéridos en comparación con el control. Esos vectores de prueba también corrigieron el fenotipo de hipercolesterolemia de una manera dependiente de la dosis. Se observó una reducción en el área de placa para los ratones de AAV2/8 y AAV2/7 en ratones tratados en la primera prueba (2 meses), y se observó que el efecto persistió durante la duración del experimento (6 meses).
Ejemplo 10 – Expresión de factor IX funcional y corrección de hemofilia
A. Ratones Knock-Out
Se averiguó la expresión de factor IX funcional canino (FIX) en ratones con hemofilia B. Los vectores con cápsides de AAV1, AAV2, AAV5, AAV7 o AAV8, fueron construidos para suministrar ITR 5’ de AAV2 – promotor específico del hígado [LSP] – FIX canino – elemento post-regulador de hepatitis de marmota americana (WPRE) – ITR 3’ de AAV2. Los vectores fueron construidos según se ha descrito en Wang et al., 2000, Molecular Therapy 2: 154-158), usando las cápsides apropiadas.
Se generaron ratones knock out según se ha descrito en Wang et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11563
11566. Este modelo mimetiza de forma muy cercana los fenotipos de hemofilia B en los humanos.
Se suministraron vectores de diferentes serotipos (AAV), AAV2, AAV5, AAV7 y AAV8, a modo de inyección intraportal única en el hígado de ratones C57B1/6 hemofílicos adultos en una dosis de 1x1011 GC/ratón para los cinco serotipos diferentes, y un grupo recibió un vector AAV8 a una dosis más baja, de 1x1010 GC/ratón. El grupo de control fue inyectado con 1x1011 GC de AAVs/8 TBG LacZ3. Cada grupo contiene 5-10 ratones machos y hembras. Los ratones fueron sangrados bi-semanalmente después de la administración del vector.
1. ELISA
Se determinó la concentración de FIX canino en el plasma del ratón mediante un ensayo ELISA específico para factor 1X canino, realizado esencialmente según ha sido descrito por Axelrod et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 5173-5177 con modificaciones. El factor IX anti-canino de oveja (Enzyme Research Laboratories) fue usado como anticuerpo principal y el factor IX anti-canino de conejo (Enzyme Research Laboratories) fue usado como anticuerpo secundario. Empezando a las dos semanas siguientes a la inyección, se detectaron niveles de plasma incrementados de cFIX para todos los vectores. Los niveles incrementados fueron sostenidos a niveles terapéuticos durante la duración del experimento, es decir, hasta 12 semanas. Los niveles terapéuticos se consideran que son un 5% de los niveles normales, es decir, alrededor de 259 ng/ml.
Los niveles más altos de expresión fueron observados para las construcciones de AAV2/8 (en 1011) y de AAV2/7, con niveles cFIX de niveles de superfisiología sostenida (diez veces más altos que el nivel normal). Los nieles de expresión para AAV2/8 (1011) fueron aproximadamente 10 veces más altos que los observados para el AAV2/2 y el AAV2/8 (1010). Los niveles de expresión más bajos, aunque todavía por encima de la gama terapéutica, fueron observados para el AAV2/5.
2. Ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) in vitro
La actividad funcional del factor IX en plasma de los ratones FIX knock-out fue determinada mediante un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada in vitro (aPTT). Se recogieron muestras de sangre de ratón a partir del plexo retro-orbital en un volumen de solución tampón de citrato a 1/10. El ensayo aPTT se realizó según ha sido descrito por Wang et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94: 11563-11566.
Los tiempos de coagulación en el aPTT sobre muestras de sangre de todos los ratones inyectados con el vector, estuvieron dentro de la gama normal (aproximadamente 60 segundos) cuando se midió a las dos semanas de la post-inyección, y los tiempos de coagulación se mantuvieron en una gama normal o más corta de lo normal durante el período de estudio (12 semanas).
SE observaron tiempos de coagulación sostenidos más bajos en animales que recibieron AAV2/8 (1011) y AAV2/7. En la semana 12, el AAV2 indujo también tiempos de coagulación similares a los del AAV2/8 y del AAV2/7. Sin embargo, este tiempo de coagulación rebajado no fue observado para el AV2/2 hasta la semana 12, mientras que los tiempos de coagulación rebajados (en la gama de 25 – 40 segundos) fueron observados para el AAV2/8 y el AAV2/7 al comienzo de la semana dos.
El manchado inmuno-histoquímico de los tejidos del hígado cultivados a partir de alguno de los ratones tratados, se está llevando a cabo actualmente. Se han manchado positivamente alrededor de un 70-80% de hepatocitos para el FIX canino en el ratón inyectad con vector AAV2/8.cPIX.
B. Perros con hemofilia B
Los perros que tienen una mutación puntual en el dominio catalítico del gen F.IX, el cual, de acuerdo con los estudios de modelación, parece hacer que la proteína sea inestable, adolecen de hemofilia B [Evans et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 66: 10095-10099). Una colonia de tales perros ha sido mantenida durante más de dos décadas en la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill. Los parámetros homeostáticos de esos perros han sido bien descritos e incluyen la ausencia de antígeno de F.IX de plasma, tiempos totales de coagulación sanguínea superiores a 60 minutos, mientras que en los perros normales es de 6-8 minutos, y tiempo prolongado de tromboplastina parcial activada de 50-80 segundos, mientras que en los perros normales son de 13-28 segundos. Estos perros experimentan hemorragias espontáneas recurrentes. Típicamente, los episodios de sangrado significativo son gestionados por una única infusión intravenosa de 10 ml/kg de plasma canino normal; ocasionalmente, las infusiones se repiten según se requiera para el control de la sangría.
Cuatro perros fueron inyectados intraportalmente con AAV.cFIX de acuerdo con el plan que sigue. Un primer perro recibe una inyección única con AAV2/2.cFIX a una dosis de 3,7 x 1011 copias de genoma (CG)/kg. Un segundo perro recibe una primera inyección de AAV2/2.cFIX (2,8 x 1011 GC/kg), seguido de una segunda inyección con AAV2/7.cFIX (2,3 x 1013 GC/kg) en el día 1180. Un tercer perro recibe una inyección única con AAV2/2.cFIX a una dosis de 4,6 x 1012 CG/kg. El cuarto perro recibe una inyección con AAV2/2.cFIX (2,8 x 1012 GC/kg) y una inyección en el día 995 con AAV2/7.cFIX (5 x 1012 GC/kg).
El abdomen de los perros con hemofilia fue abierto quirúrgica y asépticamente bajo anestesia general y se
administró una única infusión de vector en la vena portal. Los animales están protegidos frente a hemorragias en el período peri-operativo mediante administración intravenosa de plasma canino. El perro fue sedado, entubado para inducir anestesia general, y el abdomen afeitado y preparado. Una vez que el abdomen estuvo abierto, se movió el bazo hacia el campo operativo. La vena esplénica fue localizada y se realizó una sutura floja proximal a una pequeña incisión realizada en la vena. Se insertó rápidamente una aguja en la vena, a continuación la sutura se aflojó y se roscó una cánula 5 F en una posición intravenosa cercana a la vena portal, en una posición intravenosa cercana a la bifurcación de la vena portal. Una vez que la hemostasia fue asegurada y el globo del catéter se infló, se inyectaron aproximadamente 5,0 ml de vector diluido en PBS en la vena portal a intervalos de 5 minutos. La infusión de vector fue seguida por una infusión de 5,0 ml de solución salina. El globo se desinfló a continuación, la cánula se retiró y se aseguró la hemostasia venosa. El bazo fue re-colocado a continuación, los vasos sangrantes fueron cauterizados y la herida de la operación se cerró. Se retiró la intubación del animal que había tolerado bien el procedimiento quirúrgico. Se analizaron muestras de sangre según se ha descrito [Wang et al., 2000, Molecular Therapy 2: 154-158].
Los resultados que mostraron corrección o corrección parcial, han sido anticipados para el AAV2/7.
Aunque la invención ha sido descrita con referencia a realizaciones particularmente preferidas, se apreciará que se pueden realizar modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones.
Listado de secuencias
<110> Los fideicomisarios de la Universidad de Pennsylvania
<120> Un método de detección y/o identificación de secuencias de virus adeno-asociado (AAV), secuencias y aislamiento de nuevas secuencias identificadas en el mismo
<130> RTM/12090/1/2
<150> EP 02797050.8
<151>
<150> US 60/350.607
<151>
<150> US 60/341.117
<151>
<150> US 60/377.066
<151>
<150> US 60/386.675
<151>
<160> 120
<170> Patentin versión 3.2
<210> 1
<211> 4721
<212> AND
<213> serotipo 7 de virus adeno-asociado
<400> 1
<210> 2
<211> 737
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo 7 de virus adeno-asociado
<400> 2
<210> 3
<211> 623
<212> PRT
<213> proteína rep de serotipo 7 de virus adeno-asociado
<400> 3
<200> 4
<211> 4393
<212> ADN
<213> serotipo 8 de virus adeno-asociado
<400> 4
<210> 5
<211> 4385
<212> ADN
<213> serotipo 9 de virus adeno-asociado
<400> 5
<210> 6
<211> 4718
<212> ADN
<213> serotipo 1 de virus adeno-asociado
<400> 6
<210> 7
<211> 4675
<212> ADN
<213> serotipo 2 de virus adeno-asociado
<400> 7
<210> 8
<211> 4726
<212> ADN
<213> serotipo 3 de virus adeno-asociado
<400> 8
<210> 9
<211> 3098
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.2
<400> 9 <210> 10
<211> 3098
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, 16.3
<400> 10
<210> 11
<211> 3121
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 29,3
<400> 11
<210> 12
<211> 3121
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 29.4
<400> 12 <210> 13
<211> 3121
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 29.5
<400> 13
<210> 14
<211> 3131
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 1-3
<400> 14
<210> 15
<211> 3127
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 13-3b
<400> 15 <210> 16
<211> 3106
<212> ADN <213 nuevo serotipo de AAV, clon 24-1
<400> 16
<210> 17
<211> 3102
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 27-3
<400> 17
<210> 18
<211> 3106
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 7-2
<400> 18 <210> 19
<211> 3105
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon C1
<400> 19
<210> 20
<211> 3105
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon C3
<400> 20
<210> 21
<211> 3105
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon C5
<400> 21
<210> 22
<211> 3094
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon F1
<400> 22
<210> 23
<211> 3095
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon F3
<400> 23
<210> 24
<211> 3095
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon F5
<400> 24
<210> 25
<211> 3142
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon H6
<400> 25
<210> 26
<211> 3075
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon H2
<400> 26
<210> 27
<211> 3128
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.8
<400> 27 <210> 28
<211> 3128
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.15
<400> 28
<210> 29
<211> 3197
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.5b
<400> 29
<210> 30
<211> 2501
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.1b
<400> 30 <210> 31
<211> 3113
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.13
<400> 31
<210> 32
<211> 3113
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.3a
<400> 32 <210> 33
<211> 2504
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.4
<400> 33 <210> 34
<211> 3106
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.5a
<400> 34 <210> 35 <211> 2489
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.10
<400> 35 <210> 36
<211> 2495
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.3b
<400> 36 <210> 37
<211> 3098
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.11
<400> 37
<210> 38
<211> 3276
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.6a
<400> 38
<210> 39
<211> 3084
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 43.1
<400> 39 <210> 40
<211> 2370
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 43.5
<400> 40
<210> 41
<211> 3123
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 43.13
<400> 41 <210> 42
<211> 3122
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 43.20
<400> 42
<210> 43
<211> 3117
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 43.21
<400> 43
<210> 44
<211> 3121
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 43.23
<400> 44 <210> 45
<211> 3122
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 43.25
<400> 45
<210> 46
<211> 3128
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 44.1
<400> 46
<210> 47
<211> 3128
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 44.5
<400> 47
<212> ADN 5 <213> nuevo serotipo de AAV, clon 223.10
<220>
<221> misc_feature
<222> (1302) .. (1302)
<223> puede ser a, c, g o t
<400> 48
<210> 49
<211> 1933
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 223.2
<400> 49 <210> 50
<211> 1933
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 223.4
<400> 50 <210> 51
<211> 1933
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 223.5
<400> 51 <210> 52
<211> 1933
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 223.6
<400> 52 <210> 53
<211> 1933
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 223.7
<400> 53 <210> 54
<211> 3123
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon A3.4
<400> 54
<210> 55
<211> 3113
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon ¡3.5
<400> 55 <210> 56
<211> 3122
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon A3.7
<400> 56
<210> 57
<211> 3123
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon A3.3
<400> 57
<210> 58
<211> 2969
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 42.12
<400> 58 <210> 59
<211> 3129
<212> ADN
<213> nuevo serotipo de AAV, clon 44.2
<400> 59
<210> 60
<211> 733
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon C1VP1
<400> 60
<210> 61
<211> 733
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon C2VP1
<400> 61
<210> 62
<211> 733
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon C5VP1@2
<400> 62
<210> 63
<211> 734
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon AAV4VP1
<400> 63
<210> 64
<211> 736
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon AAV1
<400> 64
<210> 65
<211> 736
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon AAV6P1
<400> 65
<210> 66
<211> 735
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon A3.3
<400> 66
<210> 67
<211> 735
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon A3.7
<400> 67
<210> 68
<211> 735
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon A3.4
<400> 68
<210> 69
<211> 735
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon A3.5
<400> 69
<210> 70
<211> 735 <212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon AAV2
<400> 70
<210> 71
<211> 736
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon AAV3
<400> 71
<210> 72
<211> 737
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 3.3bVP1
<400> 72
<210> 73
<211> 644
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 223-4
<400> 73
<210> 74
<211> 644
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 223.5
<400> 74
<210> 75
<211> 644
<212> PRT 5 <213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 223.10
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (434) .. (434)
<223> puede ser cualquier aminoácido
10 <400> 75
<210> 76
<211> 644
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 223.2
<400> 76
<210> 77
<211> 644
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 223.7
<400> 77
<210> 78
<211> 644
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 223.6
<400> 78
<210> 79
<211> 738
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 44.1
<400> 79
<210> 80
<211> 738
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 44.5
<400> 80
<210> 81
<211> 738
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 44.2
<400> 81
<210> 82
<211> 738
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 29.3VP1
<400> 82
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<211> 738
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 29.5VP1
<400> 83
<210> 84
<211> 738
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 42.15
<400> 84
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<211> 738
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 42.8
<400> 85
<210> 86
<211> 733
<212> PRT
<213> aminoácido de serotipo de AAV, clon 42.13
<400> 86
<210> 87
<211> 733
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 42.3A
<400> 87
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<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 42.4
<400> 88
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<211> 731
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 42.5A
<400> 89
<210> 90
<211> 733
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 42.1B
<400> 90
<210> 91
<211> 738
<212> PRT
<213> proteína de cápside d3e serotipo de AAV, clon 42.5B
<400> 91
<210> 92
<211> 738
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 43.1
<400> 92
<210> 93
<211> 738
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 43.12
<400> 93
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<211> 738
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 43.5
<400> 94
<210> 95
<211> 738
<212>
PRT
<212>
proteína de cápside de serotipo de AAV, clon AAV8
<400> 95
<210> 96
<211> 736
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 43.21
<400> 96
<210> 97
<211> 736
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo d AAV, clon 43.25
<400> 97
<210> 98
<211> 736
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 43.23
<400> 98
<210> 99
<211> 736
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 43.20
<400> 99
<210> 100
<211> 736
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon AAV9
<400> 100
<210> 101
<211> 728
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 24.1
<400> 101
<210> 102
<211> 728
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 42.2 REAL
<400> 102
<210> 103
<211> 728
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 7.2VP1
<400> 103
<210> 104
<211> 728 <212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 27.3VP1
<400> 104
<210> 105
<211> 728
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 16.3VP1
<400> 105
<210> 106
<211> 728
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 42.10
<400> 106
<210> 107
<211> 728
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 42.3B
<400> 107
<210> 108
<211> 728
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 42.11
<400> 108
<210> 109
<211> 729
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon F1VP1
<400> 109
<210> 110
<211> 729
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon F5VP1@3
<400> 110
<210> 111
<211> 729
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon F3VP1
<400> 111
<210> 112
<211> 735
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 42.6B
<400> 112
<210> 113
<211> 685
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon 42.12
<400> 113
<210> 114
<211> 724
<212> PRT
<213> proteína de cápside de serotipo de AAV, clon AAV5CAP
<400> 114
<210> 115
<211> 9
<212> ADN 5 <213> sitio de enzima de restricción DraIII
<400> 115 caccacgtc 9
<210> 116
<211> 28 10 <212> ADN
<213> AV2cas
<400> 116 cgcagagacc aaagttcaac tgaaacga 28
<210> 117 15 <211> 255
<212> ADN
<213> serotipo 10 de virus adenoasociado
<400> 117
20 <210> 118
<211> 258
<212> ADN
<213> serotipo 11 de virus adenoasociado
<400> 118
<210> 119
<211> 255
<212> ADN
<213> serotipo 12 de virus adenoasociado
<400> 119
<210> 120
<211> 2205
<212> ADN
<213> serotipo de virus adenoasociado, clon A3.1vp1
10 <400> 120

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1.- Un virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV que comprende AAVcy.5 vp1 que comprende aminoácidos 1 a 728 de SEQ ID Núm. 103 o una secuencia que es al menos un 95% idéntica con la misma; y un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV y un gen heterólogo enlazado operativamente a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula anfitrión.
  2. 2.- El AAV según la reivindicación 1, en el que la proteína AAVcy.5 vp1 comprende la secuencia de aminoácidos 1 a 728 de SEQ ID Núm. 103.
  3. 3.- El AAV según la reivindicación 1, en el que las ITRs son del AAV2.
  4. 4.- Una proteína de cápside aislada que comprende una proteína AAVcy.5 seleccionada en el grupo consistente en:
    proteína de cápside vp1, aminoácidos (aa) 1 a 728 de SEQ ID Núm. 103;
    proteína de cápside vp2, aa 138 a 728 de SEQ ID Núm. 103, y
    proteína de cápside vp3, aa 197 a 728 de SEQ ID Núm. 103.
  5. 5.- Un virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV que comprende al menos AAVcy.5 vp3 que comprende la secuencia de aa de 197 a 728 de SEQ ID Núm. 103 o una secuencia al menos un 95% idéntica con la misma; y un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV y un gen heterólogo enlazado operativamente a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula anfitrión.
  6. 6.- El AAV según la reivindicación 5, en el que la proteína de AAVcy.5 vp3 comprende la secuencia de aminoácidos 197 a 728 de SEQ ID Núm. 103.
  7. 7.- Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína según la reivindicación 4.
  8. 8.- Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 7, en la que dicha molécula es un plásmido.
  9. 9.- Una molécula de ácido nucleico aislada según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en la que dicha molécula comprende además un gen rep de AAV funcional.
  10. 10.- Un método de generación de un virus adenoasociado (AAV) recombinante que comprende una cápside de serotipo de AAV, que comprende las etapas de cultivar un célula anfitrión que contiene: (a) un molécula según la reivindicación 7, que codifica una cápside de virus adenoasociado; (b) un gen rep funcional; (c) un minigén que comprende repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV y un transgén; y (d) funciones auxiliareis suficientes para permitir el empaquetamiento del minigén en la proteína de cápside de AAV.
  11. 11.- Una célula anfitrión transfectada con un virus adenoasociado según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 ó 6, o una molécula de ácido nucleico aislada según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
  12. 12.- Una composición que comprende un AAV según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 ó 6, y un portador fisiológicamente compatible.
  13. 13.- Una composición que comprende una molécula según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 y un portador fisiológicamente compatible.
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Families Citing this family (622)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4645697A (en) 1996-09-11 1998-04-02 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Aav4 vector and uses thereof
WO1999061601A2 (en) 1998-05-28 1999-12-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Aav5 vector and uses thereof
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US7718354B2 (en) 2001-03-02 2010-05-18 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US20040121311A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
SG168422A1 (en) 2001-11-13 2011-02-28 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
ES2526341T3 (es) * 2001-12-17 2015-01-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Secuencias de serotipo 9 de virus adeno-asociado (AAV), vectores que las contienen, y usos de las mismas
JP4810062B2 (ja) * 2001-12-17 2011-11-09 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）血清型８の配列
EP1359217B1 (en) 2002-04-29 2006-12-13 The Trustees of The University of Pennsylvania Method for direct rescue and amplification of integrated viruses from cellular DNA of tissues
US7419817B2 (en) 2002-05-17 2008-09-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography
US7220577B2 (en) * 2002-08-28 2007-05-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Modified AAV
EP1578399A4 (en) 2002-12-06 2007-11-28 Isis Pharmaceuticals Inc Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US8046171B2 (en) 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8927269B2 (en) 2003-05-19 2015-01-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Avian adenoassociated virus and uses thereof
PL2357189T3 (pl) * 2003-06-19 2017-08-31 Genzyme Corporation Wiriony AAV o zmniejszonej immunoreaktywności i ich zastosowanie
US9233131B2 (en) * 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
AU2010201278B2 (en) * 2003-09-01 2012-11-15 Academisch Medisch Centrum AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis
NZ545656A (en) * 2003-09-01 2009-02-28 Amc Amsterdam AAV vectors for in vivo gene therapy of rheumatoid arthritis
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8242254B2 (en) 2003-09-11 2012-08-14 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
EP3910063A1 (en) * 2003-09-30 2021-11-17 The Trustees of The University of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor
AU2011250849B2 (en) * 2003-09-30 2013-09-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor
WO2005056807A2 (en) * 2003-12-04 2005-06-23 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Bovine adeno-associated viral (baav) vector and uses thereof
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
ES2361000T3 (es) * 2004-04-28 2011-06-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Suministro secuencial de moléculas inmunogénicas mediante administraciones de un adenovirus y de un virus adeno-asociado.
JP2007535541A (ja) 2004-04-28 2007-12-06 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ｅ４欠失アデノウイルス初回免疫およびｅ１欠失アデノウイルス追加免疫を用いる免疫化方式
JP4810533B2 (ja) 2004-05-24 2011-11-09 アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド ディジタルスレショルド化による選択的イオン濾過作用を用いた質量分光測定法
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
WO2006073496A2 (en) * 2004-07-30 2006-07-13 Targeted Genetics Corporation Recombinant aav based vaccine methods
US7309589B2 (en) * 2004-08-20 2007-12-18 Vironix Llc Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing
WO2006135400A2 (en) 2004-08-24 2006-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of recombinant organisms
EA200700807A1 (ru) * 2004-10-05 2007-08-31 Мерц Фарма Гмбх Унд Ко. Кгаа Новые циклические и ациклические пропеноны для лечения заболеваний цнс
US8182992B2 (en) 2005-03-03 2012-05-22 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious viruses
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
EP3409296A1 (en) 2005-04-07 2018-12-05 The Trustees of the University of Pennsylvania Method of increasing the function of an aav vector
WO2006119432A2 (en) * 2005-04-29 2006-11-09 The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes
WO2007014045A2 (en) 2005-07-21 2007-02-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
EP1957678B1 (en) * 2005-11-28 2012-06-13 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious contaminant viruses
EP2007795B1 (en) 2006-03-30 2016-11-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid proteins
JP5268890B2 (ja) 2006-04-28 2013-08-21 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ａａｖの規模適応性の製造方法
PL2044199T3 (pl) * 2006-07-25 2013-04-30 Celladon Corp Przedłużony, podawany z prądem krwi, nasierdziowy, wieńcowy wlew wektorów wirusowych na bazie wirusów towarzyszących adenowirusom, zawierający SERCA2a do terapii genowej
WO2008143627A2 (en) 2006-09-14 2008-11-27 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
JP5680304B2 (ja) 2007-02-23 2015-03-04 アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド 迅速な法医学的ｄｎａ分析法
US9725485B2 (en) 2012-05-15 2017-08-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy
EP3492596A1 (en) 2007-04-09 2019-06-05 University of Florida Research Foundation, Inc. Raav vector compositions having tyrosine-modified capsid proteins and methods for use
US9611302B2 (en) 2007-04-09 2017-04-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. High-transduction-efficiency RAAV vectors, compositions, and methods of use
WO2008151023A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
EP2058401A1 (en) * 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
EP2910637A1 (en) 2008-05-20 2015-08-26 University of Florida Research Foundation, Inc. Vectors for delivery of light-sensitive proteins and methods of use
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
EP2349549B1 (en) 2008-09-16 2012-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, and system
WO2010033625A1 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and related computer program products and methods
EP2347254A2 (en) 2008-09-16 2011-07-27 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
WO2010093943A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
ES2724122T3 (es) 2009-04-30 2019-09-06 Univ Pennsylvania Composiciones para dirigir células de las vías respiratorias de conducción que comprenden construcciones de virus adenoasociado
WO2010138263A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
WO2010143761A1 (ko) * 2009-06-12 2010-12-16 (주)바이오니아 미지시료 내 감염성 미생물을 신속하게 검출하는 방법
WO2011008972A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Systems for bioagent identification
WO2011008971A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
WO2011041502A1 (en) 2009-10-01 2011-04-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav vectors expressing sec1o for treating kidney damage
US9890408B2 (en) 2009-10-15 2018-02-13 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
WO2011126808A2 (en) 2010-03-29 2011-10-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
US9272053B2 (en) 2010-04-23 2016-03-01 University Of Massachusetts AAV-based treatment of cholesterol-related disorders
EP3540055A1 (en) 2010-04-23 2019-09-18 University of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
CA2833905C (en) 2010-04-23 2019-09-10 University Of Massachusetts Multicistronic expression constructs
US9309534B2 (en) 2010-07-12 2016-04-12 Universidad Autonoma De Barcelona Gene therapy composition for use in diabetes treatment
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
EP2699688A1 (en) 2011-04-20 2014-02-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens
US9226976B2 (en) 2011-04-21 2016-01-05 University Of Massachusetts RAAV-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies
LT3254703T (lt) 2011-04-22 2020-05-25 The Regents Of The University Of California Adenoasocijuoto viruso virionai su variantine kapside ir jų panaudojimo būdai
EP2748185A1 (en) * 2011-08-24 2014-07-02 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University New aav capsid proteins for nucleic acid transfer
US20130136729A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-30 University of Virginia Patent Foundation, d/b/a University of Virginia Licensing & Ventures Group Compositions and methods for targeting and treating diseases and injuries using adeno-associated virus vectors
CN104520428B (zh) * 2012-02-17 2018-09-21 费城儿童医院 将基因转移到细胞、器官和组织的aav载体组合物和方法
WO2013130393A1 (en) * 2012-02-28 2013-09-06 Cornell University Aav-directed persistent expression of an anti-nicotine antibody gene for smoking cessation
WO2013154744A1 (en) * 2012-04-13 2013-10-17 Cornell University Development of a highly efficient second generation nicotine-conjugate vaccine to treat nicotine addiction
US10294281B2 (en) 2012-05-15 2019-05-21 University Of Florida Research Foundation, Incorporated High-transduction-efficiency rAAV vectors, compositions, and methods of use
US12358954B2 (en) 2012-05-15 2025-07-15 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Capsid-modified rAAV vector compositions and methods therefor
EP2692868A1 (en) 2012-08-02 2014-02-05 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue
DK2954051T3 (da) 2013-02-08 2019-07-08 Univ Pennsylvania Modificeret kapsid til genoverførsel til behandling af nethinden
PL2956477T5 (pl) 2013-02-15 2024-05-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Zoptymalizowany gen czynnika viii
US8957044B2 (en) 2013-03-01 2015-02-17 Wake Forest University Health Sciences Systemic gene replacement therapy for treatment of X-linked myotubular myopathy (XLMTM)
JP6591956B2 (ja) 2013-03-15 2019-10-16 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ｍｐｓ１を治療するための組成物および方法
US9719106B2 (en) 2013-04-29 2017-08-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof
WO2014194132A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
PH12016500162B1 (en) 2013-07-22 2024-02-21 Childrens Hospital Philadelphia Variant aav and compositions, methods and uses for gene trnsfer to cells, organs, and tissues
EP3099333B8 (en) * 2014-01-31 2020-12-30 Temple University of the Commonwealth System of Higher Education Bag3 as a target for therapy of heart failure
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
WO2015127128A2 (en) 2014-02-19 2015-08-27 University Of Massachusetts Recombinant aavs having useful transcytosis properties
SI3116900T1 (sl) 2014-03-09 2021-02-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Sestavki uporabni pri zdravljenju pomanjkanja ornitin transkarbamilaze(OTC)
CA2942776C (en) 2014-03-17 2023-01-24 Adverum Biotechnologies, Inc. Polyneucleotide cassette and expression vector for expression of a gene in cone cells using truncated m-opsin promoter
JP6756700B2 (ja) 2014-03-18 2020-09-16 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 筋萎縮性側索硬化症を処置するためのｒＡＡＶベースの組成物および方法
UA120050C2 (uk) 2014-03-21 2019-09-25 Джензайм Корпорейшн Генна терапія для лікування пігментного ретиніту
EP2933335A1 (en) 2014-04-18 2015-10-21 Genethon A method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases
WO2015164778A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 The Trustees Of The University Of Pennysylvania Ldlr variants and their use in compositions for reducing cholesterol levels
JP6983511B2 (ja) 2014-04-25 2021-12-17 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 脳中の転移乳癌および他の癌を処置するための方法および組成物
EP3134522B1 (en) 2014-04-25 2021-10-06 University of Massachusetts Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products
ES2833230T3 (es) 2014-05-13 2021-06-14 Univ Pennsylvania Composiciones que comprenden AVV que expresan construcciones y usos de doble anticuerpo del mismo
US10689653B2 (en) 2014-06-03 2020-06-23 University Of Massachusetts Compositions and methods for modulating dysferlin expression
EP3151866B1 (en) 2014-06-09 2023-03-08 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
EP2960336A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Genethon Efficient systemic treatment of dystrophic muscle pathologies
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
JP6619758B2 (ja) 2014-07-03 2019-12-11 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 疾患を処置するためのｇｌｓ１阻害薬
EP4012035B1 (en) 2014-09-16 2024-11-06 Genzyme Corporation Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma
ES3011359T3 (en) 2014-09-16 2025-04-07 Genzyme Corp Adeno-associated viral vectors for treating myocilin (myoc) glaucoma
JP6842410B2 (ja) 2014-10-03 2021-03-17 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 新規の高効率ライブラリーにより同定されるａａｖベクター
WO2016054554A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted aavs
RU2738421C2 (ru) 2014-10-21 2020-12-14 Юниверсити Оф Массачусетс Варианты рекомбинантных aav и их применения
KR20170096998A (ko) 2014-11-05 2017-08-25 보이저 테라퓨틱스, 인크. 파킨슨병의 치료를 위한 aadc 폴리뉴클레오티드
WO2016077689A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
WO2016077687A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
EP3242945B1 (en) 2015-01-07 2021-09-01 Universitat Autònoma de Barcelona Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes
MX2017009336A (es) 2015-01-16 2017-11-15 Voyager Therapeutics Inc Polinucleótidos dirigidos al sistema nervioso central.
IL296391B2 (en) 2015-01-20 2024-06-01 Genzyme Corp Analytical ultracentrifugation for characterization of recombinant viral particles
US20180030096A1 (en) 2015-02-03 2018-02-01 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant aav1, aav5, and aav6 capsid mutants and uses thereof
WO2016130600A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
CR20170407A (es) 2015-02-10 2017-11-14 Genzyme Corp Mejora del suministro de partículas virales al cuerpo estriado y al córtex
MA40819B1 (fr) 2015-02-10 2020-04-30 Genzyme Corp Variant d'arni
WO2016131009A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 University Of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
KR20170137730A (ko) 2015-03-02 2017-12-13 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 망막 추상체에 폴리뉴클레오타이드의 유리체 내 전달을 위한 조성물 및 방법
WO2016145217A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Recombinant glut1 adeno-associated viral vector constructs and related methods for restoring glut1 expression
WO2016154344A1 (en) 2015-03-24 2016-09-29 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
TWI707951B (zh) 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
US11020443B2 (en) 2015-04-23 2021-06-01 University Of Massachusetts Modulation of AAV vector transgene expression
US11046955B2 (en) 2015-04-24 2021-06-29 University Of Massachusetts Modified AAV constructs and uses thereof
US20180110877A1 (en) 2015-04-27 2018-04-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania DUAL AAV VECTOR SYSTEM FOR CRISPR/Cas9 MEDIATED CORRECTION OF HUMAN DISEASE
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
EP3307310A2 (en) 2015-05-13 2018-04-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-mediated expression of anti-influenza antibodies and methods of use thereof
MX2017014665A (es) 2015-05-16 2018-04-24 Genzyme Corp Edicion de genes de mutaciones intronicas profundas.
CA2990193A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 The Children's Hospital Of Philadelphia Modified factor ix, and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues
WO2017015637A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 Duke University High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
HK1256909A1 (zh) 2015-08-06 2019-10-04 宾夕法尼亚大学 Glp-1和其在用於治疗代谢疾病的组合物中的用途
KR102699944B1 (ko) 2015-08-25 2024-09-13 듀크 유니버시티 Rna-가이드된 엔도뉴클레아제를 이용하는 게놈 조작에서 특이성을 개선하는 조성물 및 방법
CN108137664B (zh) 2015-08-31 2021-11-26 宾夕法尼亚州大学信托人 用于治疗伴侣动物的aav-epo
AU2016326627B2 (en) 2015-09-24 2022-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Composition and method for treating complement-mediated disease
PT3356390T (pt) * 2015-09-28 2021-04-21 Univ Florida Métodos e composições para vetores virais que se evadem a anticorpos
US11273227B2 (en) 2015-10-09 2022-03-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful in treating Stargardt's disease and other ocular disorders
WO2017066497A2 (en) 2015-10-13 2017-04-20 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
WO2017070516A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 University Of Massachusetts Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors
DK3364997T5 (da) 2015-10-22 2024-09-30 Univ Massachusetts Aspartoacylase genterapi til behandling af canavans sygdom
EP3368054A4 (en) 2015-10-28 2019-07-03 Voyager Therapeutics, Inc. REGULATORY EXPRESSION USING THE ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV)
EP3368563A1 (en) 2015-10-28 2018-09-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Intrathecal administration of adeno-associated-viral vectors for gene therapy
HK1254836A1 (zh) 2015-10-30 2019-07-26 Nbe-Therapeutics Ag 抗-ror1抗体
US10983110B2 (en) 2015-12-02 2021-04-20 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of AAV neutralizing antibodies
FR3044926B1 (fr) 2015-12-09 2020-01-31 Genethon Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine
ES2918998T3 (es) 2015-12-11 2022-07-21 Univ Pennsylvania Método de purificación escalable para AAVrh10
EP3387138B1 (en) 2015-12-11 2022-01-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav9
WO2017100674A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav1
EP3387117B1 (en) 2015-12-11 2022-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav8
CN115957350A (zh) 2015-12-11 2023-04-14 宾夕法尼亚州大学信托人 用于治疗家族性高胆固醇血症的基因疗法
RU2762747C2 (ru) 2015-12-14 2021-12-22 Зе Трастис Оф Зе Юниверсити Оф Пенсильвания Генная терапия офтальмологических нарушений
JP7061067B2 (ja) 2015-12-14 2022-04-27 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア クリグラー・ナジャー症候群の処置のための組成物
CN108603199A (zh) 2015-12-15 2018-09-28 建新公司 用于治疗粘脂贮积症ii型的腺伴随病毒载体
SG11201804664XA (en) 2015-12-22 2018-07-30 Univ Texas Salt forms and polymorphs of (r)-1-(4-(6-(2-(4-(3,3-difluorocyclobutoxy)-6-methylpyridin-2-yl) acetamido) pyridazin-3-yl)-2-fluorobutyl)-n-methyl-1h-1,2,3-triazole-4-carboxamide
BR112018014615A2 (pt) 2016-01-20 2018-12-11 The Scripps Research Institute composições de anticorpo para ror1 e métodos relacionados
PT3411478T (pt) 2016-02-01 2022-09-13 Bioverativ Therapeutics Inc Genes do fator viii otimizados
EP3411059A4 (en) 2016-02-02 2019-10-16 University Of Massachusetts METHOD FOR INCREASING THE EFFECTIVENESS OF THE SYSTEMIC DELIVERY OF AVV GENES TO THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM
EP3411488A1 (en) 2016-02-03 2018-12-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type i
WO2017139643A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 University Of Massachusetts Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization
US10729789B2 (en) * 2016-03-01 2020-08-04 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for adeno-associated virus mediated gene expression in myofibroblast-like cells
EP3440210A4 (en) 2016-04-05 2019-11-27 University of Massachusetts COMPOSITIONS AND METHOD FOR SELECTIVELY INHIBITING THE EXPRESSION OF GRAINYHEAD LIKE PROTEIN
WO2017180587A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
US20190127713A1 (en) 2016-04-13 2019-05-02 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
WO2017180936A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for treatment of wet age-related macular degeneration
IL305449B1 (en) 2016-04-15 2025-09-01 Univ Pennsylvania Gene therapy for the treatment of mucocutaneous type ii diabetes
WO2017180861A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsulvania Gene therapy for treating hemophilia b
WO2017181105A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating metabolic imbalance
US11091776B2 (en) * 2016-04-15 2021-08-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania AAV8 mutant capsids and compositions containing same
KR102450833B1 (ko) 2016-04-15 2022-10-05 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 혈우병 a 치료용 유전자 요법
US11401527B2 (en) 2016-04-17 2022-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful for prophylaxis of organophosphates
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
GB201608046D0 (en) * 2016-05-09 2016-06-22 Cambridge Entpr Ltd And Syndey Children S Hospitals Network Randwick And Westmead Incorporating The Treatment of complement-mediated disorders
MX2018013463A (es) 2016-05-13 2019-07-04 4D Molecular Therapeutics Inc Capsides variantes de virus adenoasociados y metodos de uso de las mismas.
BR112018073472A2 (pt) 2016-05-18 2019-08-27 Voyager Therapeutics Inc composições e métodos de tratamento da doença de huntington
CA3024448C (en) 2016-05-18 2025-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. MODULATING POLYNUCLEOTIDES
WO2017212929A1 (ja) * 2016-06-08 2017-12-14 ソニー株式会社 撮像制御装置および方法、並びに車両
WO2017218852A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 University Of Massachusetts Recombinant adeno-associated viruses for delivering gene editing molecules to embryonic cells
MX2019000221A (es) 2016-07-05 2020-02-07 Univ Massachusetts Suministro genetico de sfasl mediado por aav2 como una terapia neuro-protectora en el glaucoma.
CN110191954B (zh) 2016-07-08 2024-05-14 宾夕法尼亚州大学信托人 用于治疗涉及rdh12的病症和疾病的方法和组合物
EP4275747A3 (en) 2016-07-19 2024-01-24 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
WO2018022511A1 (en) 2016-07-25 2018-02-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions comprising a lecithin cholesterol acyltransferase variant and uses thereof
EP3491008A2 (en) 2016-07-26 2019-06-05 BioMarin Pharmaceutical Inc. Novel adeno-associated virus capsid proteins
KR20230039779A (ko) 2016-07-29 2023-03-21 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 변이체 캡시드를 갖는 아데노-관련된 바이러스 비리온 및 이의 사용 방법
US11698377B2 (en) 2016-08-15 2023-07-11 Genzyme Corporation Methods for detecting AAV
WO2018035503A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 The Regents Of The University Of California Crispr-cas genome engineering via a modular aav delivery system
JP2019531787A (ja) 2016-08-30 2019-11-07 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 生物医学的ターゲティング及びデリバリーの方法並びにそれを実行するための装置及びシステム
US10457940B2 (en) 2016-09-22 2019-10-29 University Of Massachusetts AAV treatment of Huntington's disease
EP3518985A4 (en) 2016-09-29 2020-08-05 University of Florida Research Foundation, Incorporated AAVRH.10 VARIANTS WITH HOST ANTIBODY EXHAUST CAPACITIES AND MODIFIED TISSUE TARGETING PROPERTIES
US11578340B2 (en) 2016-10-13 2023-02-14 University Of Massachusetts AAV capsid designs
EP3528785A4 (en) 2016-10-19 2020-12-02 Adverum Biotechnologies, Inc. MODIFIED AAV CASPIDS AND USES THEREOF
EP3548065B1 (en) 2016-12-01 2022-11-09 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Pharmaceutical compositions for the treatment of retinal degenerative diseases
WO2018112225A1 (en) * 2016-12-14 2018-06-21 The J. David Gladstone Institutes Methods and compositions for generating a deletion library and for identifying a defective interfering particle (dip)
MX2019007876A (es) * 2016-12-30 2019-10-15 Univ Pennsylvania Terapia genetica para tratar fenilcetonuria.
WO2018136710A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Treatment of krabbe disease with umbilical cord blood transplantion (ucbt) and increased galactocerebrosidase (galc) expression
US11554147B2 (en) 2017-02-20 2023-01-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating familial hypercholesterolemia
US11827906B2 (en) 2017-02-28 2023-11-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clade f vector and uses therefor
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
AU2018229293A1 (en) 2017-02-28 2019-08-29 Janssen Biotech, Inc. Influenza vaccines based on AAV vectors
KR20230093072A (ko) 2017-03-01 2023-06-26 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 안구 장애에 대한 유전자 치료
US11376321B2 (en) 2017-03-02 2022-07-05 Genethon Method for removing anti-AAV antibodies from a blood-derived composition
EP3606544B1 (en) 2017-04-05 2025-06-04 University of Massachusetts Minigene therapy
WO2018189208A1 (en) 2017-04-10 2018-10-18 Genethon Antisense targeting dynamin 2 and use for the treatment of centronuclear myopathies and neuropathies
US11613739B2 (en) 2017-04-14 2023-03-28 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis II with recombinant human iduronate-2-sulfatase (IDS) produced by human neural or glial cells
EP3634986A4 (en) 2017-04-24 2021-09-08 The Trustees of The University of Pennsylvania GENE THERAPY FOR EYE DISORDERS
SG11201909868YA (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
WO2018204786A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
US11859179B2 (en) 2017-05-09 2024-01-02 University Of Massachusetts Methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
CA3061655A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
CN108103058A (zh) * 2017-05-12 2018-06-01 北京五加和分子医学研究所有限公司 一种i型糖尿病的基因治疗药物
AU2018265541B2 (en) 2017-05-12 2023-05-25 University Of Massachusetts Viral vector production
EP3630986A4 (en) 2017-05-31 2021-08-11 The Trustees of The University of Pennsylvania GENE THERAPY FOR TREATMENT OF PEROXISOMAL DISEASES
AU2018281145A1 (en) 2017-06-06 2020-01-02 University Of Massachusetts Self-regulating AAV vectors for safe expression of MeCP2 in rett syndrome
JP7766393B2 (ja) 2017-06-14 2025-11-10 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 眼疾患のための遺伝子療法
US10693918B2 (en) 2017-06-15 2020-06-23 Palo Alto Networks, Inc. Radio access technology based security in service provider networks
US10834136B2 (en) 2017-06-15 2020-11-10 Palo Alto Networks, Inc. Access point name and application identity based security enforcement in service provider networks
US10708306B2 (en) 2017-06-15 2020-07-07 Palo Alto Networks, Inc. Mobile user identity and/or SIM-based IoT identity and application identity based security enforcement in service provider networks
US10721272B2 (en) 2017-06-15 2020-07-21 Palo Alto Networks, Inc. Mobile equipment identity and/or IOT equipment identity and application identity based security enforcement in service provider networks
US10812532B2 (en) 2017-06-15 2020-10-20 Palo Alto Networks, Inc. Security for cellular internet of things in mobile networks
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
US11050789B2 (en) 2017-06-15 2021-06-29 Palo Alto Networks, Inc. Location based security in service provider networks
AU2018288863A1 (en) * 2017-06-22 2020-01-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing regulatory immune cells and uses thereof
CN110461368A (zh) 2017-06-30 2019-11-15 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
AU2018298133A1 (en) 2017-07-06 2020-01-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania AAV9-mediated gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type I
WO2019008157A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 Genethon NOVEL POLYNUCLEOTIDES ENCODING HUMAN FKRP PROTEIN
CA3070087A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
EP3662060A2 (en) 2017-08-03 2020-06-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
SG11202000846WA (en) 2017-08-07 2020-02-27 Nbe Therapeutics Ag Anthracycline-based antibody drug conjugates having high in vivo tolerability
EP3676373A4 (en) * 2017-08-28 2021-06-09 The Regents of The University of California Adeno-associated virus capsid variants and methods of use thereof
DK3684423T5 (da) 2017-09-20 2024-08-26 4D Molecular Therapeutics Inc Adeno-associerede virusvariantcapsider og fremgangsmåder til anvendelse deraf
SG11202002457RA (en) 2017-09-22 2020-04-29 Univ Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii
WO2019060686A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 University Of Massachusetts NEW DUAL EXPRESSION VECTORS OF SOD1 AND USES THEREOF
WO2019060726A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 Genzyme Corporation Variant rnai
CA3075656A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Voyager Therapeutics, Inc. Rescue of central and peripheral neurological phenotype of friedreich's ataxia by intravenous delivery
AU2018346102B2 (en) * 2017-10-03 2023-05-11 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
US12441998B2 (en) 2017-10-12 2025-10-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York SLC2A1 lncRNA as a biologic and related treatments and methods
EP4454654A3 (en) 2017-10-16 2025-02-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2019079240A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
WO2019079496A2 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Regenxbio, Inc. FULLY HUMAN ANTIBODY-BASED THERAPEUTIC AGENTS HAVING POST-TRANSLATION MODIFICATION
EP3697764B1 (en) * 2017-10-18 2025-06-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Gls-1 inhibitors for use in the treatment of cancer
EP3697449A1 (en) 2017-10-18 2020-08-26 REGENXBIO Inc. Treatment of ocular diseases and metastatic colon cancer with human post-translationally modified vegf-trap
JP7184894B2 (ja) 2017-11-27 2022-12-06 ４ディー モレキュラー セラピューティクス インコーポレイテッド アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用
KR20200104864A (ko) 2017-11-30 2020-09-04 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 뮤코다당류증 iiib형에 대한 유전자 요법
JP7389744B2 (ja) 2017-11-30 2023-11-30 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア ムコ多糖症ｉｉｉａ型のための遺伝子療法
MX2020006435A (es) 2017-12-19 2021-02-09 Akouos Inc Administracion de anticuerpos terapeuticos mediada por vector de virus adenoasociado (aav) en el oido interno.
WO2019152843A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for restoring pah gene function and methods of use thereof
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
US11306329B2 (en) 2018-02-19 2022-04-19 City Of Hope Adeno-associated virus compositions for restoring F8 gene function and methods of use thereof
SG11202007942YA (en) 2018-02-27 2020-09-29 Univ Pennsylvania Novel adeno-associated virus (aav) vectors, aav vectors having reduced capsid deamidation and uses therefor
US20210010028A1 (en) 2018-03-06 2021-01-14 Voyager Therapeutics, Inc. Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
KR20200135433A (ko) 2018-03-23 2020-12-02 유니버시티 오브 매사추세츠 골 장애 치료를 위한 유전자 치료제
SG11202009452WA (en) 2018-04-03 2020-10-29 Stridebio Inc Antibody-evading virus vectors
JP2021519581A (ja) 2018-04-03 2021-08-12 ストライドバイオ，インコーポレイテッド 抗体を回避するウイルスベクター
JP7425738B2 (ja) 2018-04-03 2024-01-31 ギンコ バイオワークス インコーポレイテッド 眼組織を標的とするウイルスベクター
US12054724B2 (en) 2018-04-10 2024-08-06 President And Fellows Of Harvard College AAV vectors encoding clarin-1 or GJB2 and uses thereof
JP7575273B2 (ja) 2018-04-16 2024-10-29 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための組成物及び方法
US11981892B2 (en) 2018-04-16 2024-05-14 University Of Massachusetts Compositions and methods for improved gene editing
US11472848B2 (en) 2018-04-27 2022-10-18 University Of Massachusetts AAV capsids identified by in vivo library selection
US12378576B2 (en) 2018-04-27 2025-08-05 Spacecraft Seven, Llc Gene therapy for CNS degeneration
US12365865B2 (en) 2018-04-29 2025-07-22 Regenxbio Inc. Scalable clarification process for recombinant AAV production
WO2019212922A1 (en) 2018-04-29 2019-11-07 Regenxbio Inc. Systems and methods of spectrophotometry for the determination of genome content, capsid content and full/empty ratios of adeno-associated virus particles
CA3098871A1 (en) 2018-05-08 2019-11-14 Rutgers, The State University Of New Jersey Aav-compatible laminin-linker polymerization proteins
EP3790627A2 (en) 2018-05-09 2021-03-17 BioMarin Pharmaceutical Inc. Methods of treating phenylketonuria
TW202005978A (zh) 2018-05-14 2020-02-01 美商拜奧馬林製藥公司 新穎肝靶向腺相關病毒載體
JP2021523914A (ja) 2018-05-15 2021-09-09 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． パーキンソン病を治療するための組成物および方法
TW202015742A (zh) 2018-05-15 2020-05-01 美商航海家醫療公司 投遞腺相關病毒（ａａｖ）之組成物和方法
EP3793686A1 (en) 2018-05-16 2021-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
US20210214749A1 (en) 2018-05-16 2021-07-15 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution
US12163129B2 (en) 2018-06-08 2024-12-10 University Of Massachusetts Antisense oligonucleotides to restore dysferlin protein expression in dysferlinopathy patient cells
EP3806888B1 (en) 2018-06-12 2024-01-31 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
US12060567B2 (en) 2018-06-13 2024-08-13 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered untranslated regions (UTR) for AAV production
US12070702B2 (en) 2018-06-14 2024-08-27 Regenxbio Inc. Anion exchange chromatography for recombinant AAV production
JP7565218B2 (ja) 2018-07-02 2024-10-10 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症および脊髄に関連する障害の治療
GB201811368D0 (en) 2018-07-11 2018-08-29 Ucb Biopharma Sprl Antibody
MX2021000443A (es) 2018-07-12 2021-05-28 Spacecraft Seven Llc Vectores de terapia génica para el tratamiento de la enfermedad de danon.
SG11202100139VA (en) 2018-07-17 2021-02-25 Neuromyon Inc Treatment of neuropathy with dna constructs expressing igf-1 isoforms
US20210355454A1 (en) 2018-07-24 2021-11-18 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing gene therapy formulations
US12188040B2 (en) * 2018-07-30 2025-01-07 Gene Therapy Research Institution Co., Ltd. Method for enhancing gene expression using AAV vector
WO2020028816A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Genzyme Corporation Variant rnai against alpha-synuclein
AU2019319976B2 (en) 2018-08-10 2025-08-14 Regenxbio Inc. Scalable method for recombinant AAV production
SG11202102058UA (en) 2018-08-30 2021-03-30 Tenaya Therapeutics Inc Cardiac cell reprogramming with myocardin and ascl1
US12274733B2 (en) 2018-09-28 2025-04-15 President And Fellows Of Harvard College Cellular reprogramming to reverse aging and promote organ and tissue regeneration
AU2019347666B2 (en) 2018-09-28 2025-10-02 President And Fellows Of Harvard College Cellular reprogramming to reverse aging and promote organ and tissue regeneration
CA3113470A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 President And Fellows Of Harvard College Mutant reverse tetracycline transactivators for expression of genes
JP7528066B2 (ja) 2018-09-28 2024-08-05 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 操作されたプロモータを有するフラタキシン発現コンストラクトおよびその使用方法
PE20211596A1 (es) 2018-10-01 2021-08-18 Univ Pennsylvania Composiciones utiles para tratar la gangliosidosis gm1
AR116569A1 (es) 2018-10-01 2021-05-19 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Terapia génica para tratar la acidemia propiónica
US20210348242A1 (en) 2018-10-04 2021-11-11 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
AU2019354793A1 (en) 2018-10-05 2021-05-13 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acid constructs encoding AAV production proteins
WO2020077165A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
MX2021004213A (es) 2018-10-12 2021-07-16 Genzyme Corp Generacion de pah humana mejorada para el tratamiento de pku grave mediante terapia de sustitucion de genes dirigida al higado.
WO2020081415A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Regenxbio Inc. Method for measuring the infectivity of replication defective viral vectors and viruses
UY38407A (es) 2018-10-15 2020-05-29 Novartis Ag Anticuerpos estabilizadores de trem2
EP3867389A1 (en) 2018-10-15 2021-08-25 Voyager Therapeutics, Inc. Expression vectors for large-scale production of raav in the baculovirus/sf9 system
KR20210082205A (ko) 2018-10-22 2021-07-02 유니버시티 오브 로체스터 레트로바이러스 인테그라제-Cas9 융합 단백질을 이용한 유도된 비상동 DNA 삽입에 의한 게놈 편집
US20210386788A1 (en) 2018-10-24 2021-12-16 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
EP3880823A4 (en) * 2018-11-16 2022-08-17 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus for treating pompe disease
CN113271982B (zh) 2018-11-16 2024-07-30 摩大力斯医疗株式会社 通过靶向肌营养相关蛋白基因来治疗肌营养不良的方法
US12391947B2 (en) 2018-11-29 2025-08-19 University Of Massachusetts Modulation of SPTLC1 via recombinant adeno-associated vectors
WO2020140007A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 University Of Rochester Gene therapy for best1 dominant mutations
US12338450B2 (en) 2019-01-04 2025-06-24 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy constructs for treating Wilson disease
US12371698B2 (en) 2019-01-14 2025-07-29 University Of Rochester Targeted nuclear RNA cleavage and polyadenylation with CRISPR-Cas
US20220064671A1 (en) 2019-01-18 2022-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Methods and systems for producing aav particles
KR20210130158A (ko) 2019-01-31 2021-10-29 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 Aav 캡시드의 전사 의존적 유도 진화를 사용하는 방법
US20220054655A1 (en) 2019-02-22 2022-02-24 University Of Massachusetts Oxr1 gene therapy
KR20210131370A (ko) 2019-02-22 2021-11-02 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 Grn-연관 성인-발병 신경퇴화의 치료를 위한 재조합 아데노-연관 바이러스
EP3931334A1 (en) 2019-02-25 2022-01-05 Novartis AG Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
JP2022520875A (ja) 2019-02-25 2022-04-01 ノバルティス アーゲー Ｂｉｅｔｔｉクリスタリン網膜症を治療するための組成物及び方法
AU2020228028A1 (en) 2019-02-25 2021-09-30 University Of Massachusetts DNA-binding domain transactivators and uses thereof
PE20212072A1 (es) 2019-02-26 2021-10-26 Univ Pennsylvania Composiciones utiles en el tratamiento de la enfermedad de krabbe
US20220047618A1 (en) 2019-02-28 2022-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Adeno-associated virus vectors for the delivery of therapeutics
AU2020241888A1 (en) 2019-03-21 2021-09-30 Ginkgo Bioworks, Inc. Recombinant adeno-associated virus vectors
EP3947427A1 (en) 2019-03-25 2022-02-09 Genethon Production of large-sized quasidystrophins using overlapping aav vectors
CA3135609A1 (en) 2019-04-01 2020-10-08 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
EP4667578A2 (en) 2019-04-03 2025-12-24 REGENXBIO Inc. Gene therapy for eye pathologies
TW202102526A (zh) 2019-04-04 2021-01-16 美商銳進科斯生物股份有限公司 重組腺相關病毒及其用途
HUE064411T2 (hu) 2019-04-11 2024-03-28 Regenxbio Inc Méretkizárásos kromatográfiás módszerek rekombináns adeno-asszociált víruskészítmények jellemzésére
BR112021020668A2 (pt) 2019-04-17 2022-01-11 Codiak Biosciences Inc Composições de exossomos e aav
CN113993552A (zh) 2019-04-19 2022-01-28 再生生物股份有限公司 腺相关病毒载体制剂和方法
SG11202111414RA (en) 2019-04-24 2021-11-29 Regenxbio Inc Fully-human post-translationally modified antibody therapeutics
WO2020219990A1 (en) 2019-04-26 2020-10-29 President And Fellows Of Harvard College Aav vectors encoding mini-pcdh15 and uses thereof
WO2020223236A1 (en) * 2019-04-29 2020-11-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel aav capsids and compositions containing same
EP3962536A1 (en) 2019-04-29 2022-03-09 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing baculoviral infected insect cells (biics) in bioreactors
BR112021021908A2 (pt) 2019-05-03 2022-02-01 Univ Pennsylvania Composições úteis no tratamento da leucodistrofia metacromática
US20240124889A1 (en) 2019-05-07 2024-04-18 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
EP3972610B1 (en) 2019-05-20 2025-09-03 University of Massachusetts Minigene therapy
KR20220011664A (ko) * 2019-05-24 2022-01-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 변형된 바이러스 입자 및 이의 용도
JP7565620B2 (ja) 2019-05-28 2024-10-11 株式会社モダリス Ｄｍｐｋ遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法
EP3987024A4 (en) 2019-06-20 2023-11-01 University Of Massachusetts COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED GENOMIC EDITING
BR112021026866A2 (pt) 2019-07-02 2022-03-03 M6P Therapeutics Composições de vetor e métodos de seu uso para o tratamento de distúrbios do armazenamento lisossômico
WO2021007473A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 Masonic Medical Research Institute Vgll4 with ucp-1 cis-regulatory element and method of use thereof
US20220251567A1 (en) 2019-07-10 2022-08-11 Inserm (Institut National De La Santè Et De La Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
EP3997226A1 (en) 2019-07-11 2022-05-18 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors
AU2020311618B2 (en) 2019-07-11 2025-04-10 Centre Hospitalier Universitaire De Nantes Chemically-modified adeno-associated virus
US10557149B1 (en) * 2019-07-15 2020-02-11 Vigene Biosciences, Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus
US10653731B1 (en) 2019-07-15 2020-05-19 Vigene Biosciences Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency
WO2021016453A1 (en) 2019-07-23 2021-01-28 University Of Rochester Targeted rna cleavage with crispr-cas
WO2021021661A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory element and methods of uses thereof
EP4007814A1 (en) 2019-07-26 2022-06-08 Akouos, Inc. Methods of treating hearing loss using a secreted target protein
WO2021030125A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
EP4013770A4 (en) * 2019-08-14 2023-12-13 University of Florida Research Foundation, Incorporated AAV CAPSID VARIANTS FOR GENE THERAPY
TW202122582A (zh) 2019-08-26 2021-06-16 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
MX2022002366A (es) 2019-08-26 2022-07-19 Regenxbio Inc Tratamiento de la retinopatía diabética con fab anti-vegf completamente humano modificado postraduccionalmente.
EP4022057A1 (en) 2019-08-27 2022-07-06 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of disorders associated with repetitive dna
WO2021046155A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
WO2021046451A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
CN114555814A (zh) 2019-09-13 2022-05-27 罗特格斯新泽西州立大学 Aav相容的层粘连蛋白-连接子聚合蛋白
CN114521143B (zh) 2019-09-19 2025-03-14 吉尼松公司 减轻fkrp心脏毒性的基因治疗表达系统
US11492622B2 (en) 2019-09-26 2022-11-08 Massachusetts Institute Of Technology MicroRNA-based logic gates and uses thereof
WO2021062092A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Trans-activated functional rna by strand displacement and uses thereof
WO2021067389A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
WO2021067598A1 (en) 2019-10-04 2021-04-08 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Methods for improved therapeutic use of recombinant aav
KR20220081365A (ko) 2019-10-07 2022-06-15 리젠엑스바이오 인크. 아데노-연관 바이러스 벡터 약제학적 조성물 및 방법
WO2021076656A1 (en) 2019-10-15 2021-04-22 University Of Massachusetts Rna editor-enhanced rna trans-splicing
WO2021073568A1 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 Wuxi Apptec (Shanghai) Co., Ltd. A novel aav variant
KR20220083714A (ko) 2019-10-17 2022-06-20 스트라이드바이오 인코포레이티드 니만-피크 질환 c형의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 벡터
AU2020384294A1 (en) 2019-11-14 2022-06-02 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of hereditary angioedema with liver-specific gene therapy vectors
US20230016983A1 (en) 2019-11-19 2023-01-19 lNSERM (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ ET DE LA RECHERCHE MÉDICALE) Antisense oligonucleotides and thier use for the treatment of cancer
JP2023503637A (ja) * 2019-11-28 2023-01-31 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド マイクロジストロフィン遺伝子治療コンストラクト及びその使用
EP4072595A1 (en) 2019-12-10 2022-10-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adeno associated virus vectors for the treatment of hunter disease
KR20220128632A (ko) 2019-12-31 2022-09-21 스완바이오 테라퓨틱스 리미티드 개선된 aav-abcd1 구축물 및 부신백질이영양증 (ald) 및/또는 부신척수신경병증 (amn)의 치료 또는 예방을 위한 용도
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
WO2021150570A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis i with fully-human glycosylated human alpha-l-iduronidase (idua)
JP2023512043A (ja) 2020-01-29 2023-03-23 レジェンクスバイオ インコーポレーテッド ムコ多糖症ｉｖａの治療
AU2021214174A1 (en) 2020-01-29 2022-08-18 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis II with recombinant human iduronate-2-sulfatase (IDS) produced by human neural or glial cells
CA3165713A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Andrew Scharenberg Bispecific transduction enhancer
CA3165057A1 (en) 2020-02-02 2021-08-05 James M. Wilson Compositions useful for treating gm1 gangliosidosis
EP4100533A1 (en) 2020-02-07 2022-12-14 University of Rochester Ribozyme-mediated rna assembly and expression
US20230078498A1 (en) 2020-02-07 2023-03-16 University Of Rochester Targeted Translation of RNA with CRISPR-Cas13 to Enhance Protein Synthesis
BR112022015921A2 (pt) 2020-02-14 2022-10-04 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Terapia gênica para tratar o transtorno de deficiência de cdkl5
EP4110931A4 (en) 2020-02-25 2024-03-27 University of Massachusetts Inducible single aav system and uses thereof
JP2023518327A (ja) * 2020-02-25 2023-04-28 チルドレンズ・メディカル・リサーチ・インスティテュート アデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチドおよびベクター
EP4114421A1 (en) 2020-03-02 2023-01-11 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene vector control by cardiomyocyte-expressed micrornas
KR20220160069A (ko) 2020-03-27 2022-12-05 유씨비 바이오파마 에스알엘 자율적 노브 도메인 펩티드
JP2023519344A (ja) 2020-03-27 2023-05-10 ユニバーシティ オブ ロチェスター ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ ｃｒＲＮＡアレイ
EP4127169A1 (en) 2020-03-27 2023-02-08 University of Rochester Targeted destruction of viral rna by crispr-cas13
WO2021202532A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy for treating propionic acidemia
AU2021248577A1 (en) 2020-03-31 2022-09-29 Sichuan Univeristy AAV capsids variants and uses thereof
AR122409A1 (es) 2020-04-03 2022-09-07 Biomarin Pharm Inc Tratamiento de la fenilcetonuria con aav y formulaciones terapéuticas
KR20220167324A (ko) 2020-04-10 2022-12-20 솔라 바이오사이언시즈 엘엘씨 단백질 응집 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2021211753A1 (en) 2020-04-15 2021-10-21 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
WO2021222168A2 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Sola Biosciences Llc Compositions and methods for the treatment of tdp-43 proteinopathies
CN115803064A (zh) 2020-05-12 2023-03-14 宾夕法尼亚州大学信托人 用于drg特异性降低转基因表达的组合物
AU2021271635A1 (en) 2020-05-12 2023-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful in treatment of krabbe disease
EP4165194A2 (en) 2020-05-13 2023-04-19 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss
CA3183171A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating slc26a4-associated hearing loss
WO2021230385A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Astellas Pharma Inc. Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
WO2021247995A2 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating neuropathic pain
JP2023529371A (ja) 2020-06-05 2023-07-10 ソラ・バイオサイエンシズ・エルエルシー シヌクレイノパチーの処置のための組成物および方法
US20230220069A1 (en) 2020-06-17 2023-07-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of gene therapy patients
JP2023530171A (ja) 2020-06-19 2023-07-13 ジェネトン 筋肉内及び心臓内でのｓｇｃｇの適切な発現を可能にする遺伝子療法発現系
US12173307B2 (en) 2020-06-24 2024-12-24 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods for the purification of viral vectors
KR20230050336A (ko) 2020-07-10 2023-04-14 인스티튜트 내셔널 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰 메디칼르 (인 썸) 뇌전증을 치료하기 위한 방법과 조성물
JP2023532806A (ja) 2020-07-10 2023-07-31 ジェネトン 新規の筋肉特異的プロモーター
EP4179097A1 (en) 2020-07-13 2023-05-17 The Trustees of The University of Pennsylvania Compositions useful for treatment of charcot-marie-tooth disease
EP4182455A1 (en) 2020-07-15 2023-05-24 University of Rochester Targeted rna cleavage with dcasl3-rnase fusion proteins
WO2022017630A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Ucl Business Ltd GENE THERAPY VECTOR FOR eEF1A2 AND USES THEREOF
US20230285596A1 (en) 2020-07-27 2023-09-14 Voyager Therapeutics, Inc Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease
EP4189095A1 (en) 2020-07-27 2023-06-07 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
WO2022032153A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
CN116209430A (zh) 2020-08-07 2023-06-02 阿米库斯治疗学公司 囊泡靶向蛋白及其用途
CA3185267A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Spacecraft Seven, Llc Plakophilin-2 (pkp2) gene therapy using aav vector
CN114075610B (zh) * 2020-08-11 2023-11-17 北京荷塘生华医疗科技有限公司 检测野生型腺相关病毒的通用引物及其应用
AU2021325954A1 (en) 2020-08-14 2023-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel AAV capsids and compositions containing same
AR123288A1 (es) 2020-08-19 2022-11-16 Stridebio Inc Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento del síndrome de rett
GB202013194D0 (en) 2020-08-24 2020-10-07 Combigene Ab Gene therapy for lipodystrophy
EP4200429A1 (en) 2020-08-24 2023-06-28 The Trustees of The University of Pennsylvania Viral vectors encoding glp-1 receptor agonist fusions and uses thereof in treating metabolic diseases
JP2023540054A (ja) 2020-08-26 2023-09-21 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ｇｒｎ関連成人発症性神経変性の治療のための組換えアデノ随伴ウイルス
TW202218686A (zh) 2020-09-09 2022-05-16 美商維泰克斯製藥公司 用於治療杜興氏肌肉失養症(duchenne muscular dystrophy)之組合物及方法
CN116323641A (zh) 2020-09-10 2023-06-23 路德维希-马克西米利安慕尼黑大学 工程化的aav载体
US12129287B2 (en) 2020-09-14 2024-10-29 President And Fellows Of Harvard College Recombinant adeno associated virus encoding clarin-1 and uses thereof
EP4213890A1 (en) 2020-09-15 2023-07-26 RegenxBio Inc. Vectorized lanadelumab and administration thereof
EP4214242A1 (en) 2020-09-15 2023-07-26 RegenxBio Inc. Vectorized antibodies for anti-viral therapy
US20230383278A1 (en) 2020-09-18 2023-11-30 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Novel adeno-associated viral (aav) vectors to treat hereditary methylmalonic acidemia (mma) caused by methylmalonyl-coa mutase (mmut) deficiency
WO2022066849A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 University Of Massachusetts Aav vectors encoding nf1 and uses thereof
BR112023003929A2 (pt) 2020-10-01 2023-04-11 Genzyme Corp Cassete de expressão de pah humano para tratamento de pku por terapia de reposição gênica direcionada ao fígado
JP2023545424A (ja) 2020-10-07 2023-10-30 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド ゲル製剤などの脈絡膜上投与用製剤
IL301643A (en) 2020-10-07 2023-05-01 Regenxbio Inc Gene therapy for ocular manifestations of CLN2 disease
MX2023004035A (es) 2020-10-07 2023-07-05 Regenxbio Inc Formulaciones para la administración supracoroidea tales como formulaciones de viscosidad alta.
JP2023545722A (ja) 2020-10-07 2023-10-31 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 遺伝子治療剤の眼送達のためのアデノ随伴ウイルス
WO2022076750A2 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns or muscle delivery
CA3198368A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Formulations for suprachoroidal administration such as formulations with aggregate formation
US11781156B2 (en) 2020-10-09 2023-10-10 Tenaya Therapeutics, Inc. Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions
KR20230118075A (ko) 2020-10-09 2023-08-10 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 파브리병 치료를 위한 조성물 및 방법
US20230383313A1 (en) 2020-10-18 2023-11-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved adeno-associated virus (aav) vector and uses therefor
AU2021371307A1 (en) 2020-10-28 2023-06-01 Regenxbio, Inc. VECTORIZED ANTI-TNF-α ANTIBODIES FOR OCULAR INDICATIONS
WO2022094157A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Regenxbio Inc. Vectorized anti-cgrp and anti-cgrpr antibodies and administration thereof
WO2022094078A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions useful in treatment of rett syndrome
US20230390418A1 (en) 2020-10-29 2023-12-07 Regenxbio Inc. Vectorized factor xii antibodies and administration thereof
CN116457373A (zh) 2020-10-29 2023-07-18 再生生物股份有限公司 用于眼部适应症的载体化TNF-α拮抗剂
EP4240854A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of dm1 with slucas9 and sacas9
CN112322791B (zh) * 2020-11-27 2023-10-27 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒
MX2023006444A (es) 2020-12-01 2023-08-10 Univ Pennsylvania Composiciones novedosas con motivos dirigidos a tejido específico y composiciones que los contienen.
IL303239A (en) 2020-12-01 2023-07-01 Univ Pennsylvania Compositions and their uses for the treatment of Engelmann syndrome
CR20230228A (es) 2020-12-01 2023-07-18 Akouos Inc Construcciones de anticuerpos anti-vegf y métodos relacionados para el tratamiento de los síntomas asociados al schwannoma vestibular
IL303614A (en) 2020-12-16 2023-08-01 Regenxbio Inc Method of producing a recombinant adeno-associated virus particle
EP4271419A1 (en) 2020-12-29 2023-11-08 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating clrn1-associated hearing loss and/or vision loss
TW202241943A (zh) 2020-12-29 2022-11-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 Tau特異性抗體基因療法組合物、方法及其用途
CN116981697A (zh) 2021-01-14 2023-10-31 森迪生物科学公司 可分泌有效载荷调节
EP4281568A1 (en) 2021-01-21 2023-11-29 RegenxBio Inc. Improved production of recombinant polypeptides and viruses
EP4281559A4 (en) 2021-01-22 2024-12-04 University of Massachusetts Use of novel mirna-binding site cassettes for antigen-presenting cell detargeting of transgene expression by raav gene therapy vectors
AU2022212952A1 (en) 2021-01-27 2023-08-10 Umoja Biopharma, Inc. Lentivirus for generating cells expressing anti-cd19 chimeric antigen receptor
AU2022214429A1 (en) 2021-02-01 2023-09-14 Tern Therapeutics, Llc Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
WO2022173605A2 (en) 2021-02-10 2022-08-18 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis ii with recombinant human iduronate-2-sulfatase (ids)
GB202101958D0 (en) 2021-02-12 2021-03-31 Ucl Business Ltd Gene therapy for dopamine transporter deficiency syndrome
KR20230150836A (ko) 2021-02-26 2023-10-31 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 파브리병 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2022182959A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/slucas9
WO2022182957A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/sacas9
US20240141377A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
US20240141378A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CN117460832A (zh) 2021-03-22 2024-01-26 建新公司 空aav衣壳和完整aav衣壳的尺寸排阻色谱分析
EP4314295A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Nucleotide editing to reframe dmd transcripts by base editing and prime editing
KR20230170022A (ko) 2021-04-12 2023-12-18 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 척수 및 연수 근위축증(sbma) 치료에 유용한 조성물
AU2022261125A1 (en) 2021-04-23 2023-11-23 University Of Rochester Genome editing by directed non-homologous dna insertion using a retroviral integrase-cas fusion protein and methods of treatment
AR125406A1 (es) 2021-04-23 2023-07-12 Univ Pennsylvania Nuevas composiciones con motivos selectivos para el cerebro y composiciones que las contienen
WO2022229851A1 (en) 2021-04-26 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using slucas9 scaffold sequences
JP2024515974A (ja) 2021-04-26 2024-04-11 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ シュタルガルト病（ａｂｃａ４）の遺伝子治療
TW202309293A (zh) 2021-04-26 2023-03-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於治療肌縮蛋白症(dystrophinopathy)之微小肌縮蛋白基因療法給藥
US20240218397A1 (en) 2021-05-04 2024-07-04 Regenxbio Inc. Novel aav vectors and methods and uses thereof
WO2022234519A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences
EP4337267A1 (en) 2021-05-11 2024-03-20 RegenxBio Inc. Treatment of duchenne muscular dystrophy and combinations thereof
WO2022272296A2 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus packaging systems
US20240318157A1 (en) 2021-07-01 2024-09-26 Amicus Therapeutics, Inc. Neurotensin Variants And Tagged Proteins Comprising Neurotensin Or Sortilin Propeptide
WO2023278811A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and related methods
WO2023283649A1 (en) 2021-07-08 2023-01-12 Tenaya Therapeutics, Inc. Optimized expression cassettes for gene therapy
EP4373947A1 (en) 2021-07-19 2024-05-29 New York University Auf1 combination therapies for treatment of muscle degenerative disease
EP4377459A2 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
WO2023010135A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
WO2023018637A1 (en) 2021-08-09 2023-02-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Gene editing of regulatory elements
US20240425820A1 (en) 2021-08-11 2024-12-26 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
EP4384193A2 (en) 2021-08-11 2024-06-19 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
AU2022325232A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
JP2024534772A (ja) 2021-08-11 2024-09-26 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド 同種異系細胞療法用の遺伝子改変細胞
EP4396237A4 (en) 2021-08-31 2025-11-19 Scout Bio Inc Antigen-binding molecules and their uses
EP4399302A2 (en) 2021-09-08 2024-07-17 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 51 for treatment of duchenne muscular dystrophy
PE20241065A1 (es) 2021-09-30 2024-05-13 Akouos Inc Composiciones y metodos para el tratamiento de la perdida de audicion asociada a kcnq4
US20240408240A1 (en) 2021-10-01 2024-12-12 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of hereditary angioedema with aav gene therapy vectors and therapeutic formulations
WO2023056399A1 (en) 2021-10-02 2023-04-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel aav capsids and compositions containing same
CN118202060A (zh) 2021-10-05 2024-06-14 再生生物股份有限公司 用于重组aav生产的组合物和方法
WO2023060113A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
EP4413019A2 (en) 2021-10-07 2024-08-14 RegenxBio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
US20250001006A1 (en) 2021-10-07 2025-01-02 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for targeted delivery
EP4413024A2 (en) 2021-10-08 2024-08-14 SOLA Biosciences LLC Compositions and methods for the treatment of proteopathies
JP2024537178A (ja) 2021-10-08 2024-10-10 ソラ・バイオサイエンシズ・エルエルシー ｐ５３媒介性癌の処置のための組成物および方法
JP2024540987A (ja) 2021-10-21 2024-11-06 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 低免疫細胞
EP4423285A1 (en) 2021-10-28 2024-09-04 RegenxBio Inc. Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof
US20250295807A1 (en) 2021-11-15 2025-09-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
US20250011812A1 (en) 2021-11-23 2025-01-09 University Of Massachusetts Gene therapy for spinal muscular atrophy
WO2023102442A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Jaguar Gene Therapy, Llc Gene therapy methods for treatment of diabetes
WO2023102517A1 (en) 2021-12-02 2023-06-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of fabry disease
KR20240126864A (ko) 2021-12-17 2024-08-21 타팔지 세러퓨틱스 통증 치료에서 사용을 위한 펩티드 및 방법
EP4442698A4 (en) 2021-12-28 2025-10-15 Chengdu Origen Biotechnology Co Ltd MODIFIED AAV CAPSID PROTEIN AND ITS USE
TW202340467A (zh) 2022-01-10 2023-10-16 賓州大學委員會 有用於治療c9orf72介導之病症之組成物及方法
TW202338086A (zh) 2022-01-10 2023-10-01 賓州大學委員會 有用於治療異染性白質失養症之組成物
US20250084129A1 (en) * 2022-01-10 2025-03-13 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Aav5 capsid variants
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
EP4215614A1 (en) 2022-01-24 2023-07-26 Dynacure Combination therapy for dystrophin-related diseases
EP4469584A1 (en) 2022-01-25 2024-12-04 The Trustees of The University of Pennsylvania Aav capsids for improved heart transduction and detargeting of liver
WO2023150142A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Akouos, Inc. Anti-vegf antibody constructs and related methods for treating vestibular schwannoma associated symptoms
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023154693A1 (en) 2022-02-08 2023-08-17 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2023156530A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Lysogene Gene therapy for neurodegenerative diseases
IL315000A (en) 2022-02-17 2024-10-01 Sana Biotechnology Inc Engineered cd47 proteins and uses thereof
EP4490291A1 (en) 2022-03-08 2025-01-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exons for treatment of duchenne muscular dystrophy
EP4490292A1 (en) 2022-03-08 2025-01-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 44, 50, and 53 for treatment of duchenne muscular dystrophy
US20250101382A1 (en) 2022-03-11 2025-03-27 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells and compositions and uses thereof
EP4493226A1 (en) 2022-03-13 2025-01-22 RegenxBio Inc. Modified muscle-specific promoters
US20250213727A1 (en) 2022-03-25 2025-07-03 Regenxbio Inc. Dominant-negative tumor necrosis factor alpha adeno-associated virus gene therapy
EP4504950A1 (en) 2022-04-01 2025-02-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy for diseases with cns manifestations
WO2023196892A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Passive immunization with anti- aav neutralizing antibodies to prevent off-target transduction of intrathecally delivered aav vectors
KR20250007064A (ko) 2022-04-06 2025-01-13 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 Her2 양성 전이성 유방암 및 기타 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
JP2025511883A (ja) 2022-04-06 2025-04-16 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 中枢神経系の加齢を逆行させること
TW202345913A (zh) 2022-04-06 2023-12-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於脈絡膜上投與之調配物諸如凝膠調配物
CN119234040A (zh) 2022-04-06 2024-12-31 建新公司 Dm-1肌强直性营养不良的靶向基因疗法
TW202404651A (zh) 2022-04-06 2024-02-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 用於脈絡膜上投與之調配物諸如形成聚集體之調配物
WO2023196873A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Regenxbio Inc. Pharmaceutical composition comprising a recombinant adeno-associated virus vector with an expression cassette encoding a transgene forsuprachoidal administration
EP4508222A1 (en) 2022-04-11 2025-02-19 Centre National de la Recherche Scientifique Chemically-modified adeno-associated viruses
EP4508062A1 (en) 2022-04-11 2025-02-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
CN119365208A (zh) 2022-04-13 2025-01-24 巴塞罗那自治大学 通过表达klotho蛋白的基因疗法治疗神经肌肉疾病
WO2023201277A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
US20250249127A1 (en) 2022-04-14 2025-08-07 Regenxbio Inc. Gene therapy for treating an ocular disease
WO2023205606A1 (en) 2022-04-18 2023-10-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for enhancing aav therapy and decreasing tropism of aav to the liver
EP4518973A1 (en) 2022-05-03 2025-03-12 RegenxBio Inc. Vectorized anti-tnf-alpha inhibitors for ocular indications
WO2023215806A2 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Regenxbio Inc. Vectorized anti-complement antibodies and complement agents and administration thereof
US20250353883A1 (en) 2022-05-06 2025-11-20 Novartis Ag Novel recombinant aav vp2 fusion polypeptides
AR129441A1 (es) 2022-05-25 2024-08-28 Tafalgie Therapeutics Péptidos y métodos para el tratamiento del dolor
WO2023239627A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Regenxbio Inc. Methods for recombinant aav production
WO2023240236A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders
CN119731321A (zh) 2022-06-24 2025-03-28 图恩疗法股份有限公司 通过靶向基因阻遏减少低密度脂蛋白的组合物、系统和方法
TW202409289A (zh) * 2022-06-27 2024-03-01 美商安斯泰來基因治療股份有限公司 用於治療肌強直性營養不良之組合物及方法
CA3259902A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Voyager Therapeutics, Inc. AAV Capsid Variants and Their Uses
CA3259982A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Indapta Therapeutics, Inc. COMBINATION OF MODIFIED NATURAL KILLER (NK) CELLS AND ANTIBODY THERAPY AND ASSOCIATED METHODS
TW202424201A (zh) 2022-07-06 2024-06-16 美商航海家醫療公司 Ａａｖ殼體變異體及其用途
EP4554967A2 (en) 2022-07-12 2025-05-21 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
EP4558634A1 (en) 2022-07-18 2025-05-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tandem guide rnas (tg-rnas) and their use in genome editing
EP4558149A1 (en) 2022-07-21 2025-05-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating chronic pain disorders
WO2024026377A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Sana Biotechnology, Inc. Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors
CN115354049A (zh) * 2022-07-29 2022-11-18 中国科学院深圳先进技术研究院 一种基因递送系统在将目的基因经静脉注射递送至肝脏的应用
JP2025527658A (ja) 2022-08-24 2025-08-22 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 組換えアデノ随伴ウイルス及びその使用
JP2025529884A (ja) 2022-08-25 2025-09-09 武田薬品工業株式会社 ファブリー病の治療に使用するための組成物
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
UY40442A (es) 2022-09-22 2024-02-15 Biomarin Pharm Inc Tratamiento de la miocardiopatía arritmogénica con vectores de genoterapia con aav
CA3267804A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Dinaqor Ag TREATMENT OF CARDIOMYOPATHY USING AAV GENE THERAPY VECTORS
IL319873A (en) 2022-09-30 2025-05-01 Regenxbio Inc Treatment of eye diseases with recombinant viral vectors containing anti-VEGF FAB
JP2025534666A (ja) 2022-10-11 2025-10-17 リジェネックスバイオ インコーポレイテッド 操作された核酸調節エレメントならびにその使用方法
WO2024105638A1 (en) 2022-11-18 2024-05-23 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Recombinant aav vectors and methods for treatment of hunter syndrome
WO2024130070A2 (en) 2022-12-17 2024-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav capsids with cardiac- and skeletal muscle- specific targeting motifs and uses thereof
EP4634394A2 (en) 2022-12-17 2025-10-22 The Trustees of The University of Pennsylvania Recombinant aav mutant vectors with cardiac and skeletal muscle-specific targeting motifs and compositions containing same
IT202200026595A1 (it) 2022-12-22 2024-06-22 Fond Telethon Ets Nuovi inibitori di regolatori epigenetici
US12252518B2 (en) 2023-01-06 2025-03-18 Life Biosciences, Inc. Methods of treating non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy
CN120752339A (zh) 2023-01-06 2025-10-03 国家医疗保健研究所 静脉内施用用于治疗疼痛的反义寡核苷酸
WO2024151541A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Sana Biotechnology, Inc. Type-1 diabetes autoimmune mouse
WO2024149844A1 (en) 2023-01-12 2024-07-18 Nantes Université Chemically-modified adeno-associated virus
WO2024163683A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Systems, compositions, and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) and x-inactive specific transcript (xist)
WO2024163678A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Fusion proteins and systems for targeted activation of frataxin (fxn) and related methods
WO2024163012A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
AU2024215852A1 (en) 2023-02-03 2025-09-18 Janssen Pharmaceutica Nv Gene therapy vectors for use in parkinson's disease
GB202302480D0 (en) 2023-02-22 2023-04-05 Drishti Discoveries Ltd shRNA for the treatment of disease
CN116286988A (zh) * 2023-03-03 2023-06-23 西咸新区沣厚原创医药科技有限公司 一种稳定表达冠状病毒3cl蛋白酶的腺相关病毒体系、动物模型及构建方法和应用
WO2024192281A2 (en) 2023-03-15 2024-09-19 Regenxbio Inc. Exon skipping gene therapy constructs, vectors and uses thereof
WO2024196855A2 (en) 2023-03-17 2024-09-26 University Of Rochester Ribozyme-mediated rna assembly and expression
WO2024211780A1 (en) 2023-04-07 2024-10-10 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2024215653A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Guide rnas, vectors, and virions for targeting mutations in the pln gene
WO2024215655A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardioprotective bag3 therapies
CN116622908B (zh) * 2023-04-13 2024-02-06 武汉珈创生物技术股份有限公司 快速检测野生型腺相关病毒的引物探针、试剂盒及方法和应用
WO2024216244A2 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Regenxbio Inc. Targeting aav capsids, methods of manufacturing and using same
AR132545A1 (es) 2023-04-26 2025-07-16 Sanofi Sa Líneas celulares hospedadoras y métodos para identificar y usar dichas líneas celulares hospedadoras
WO2024228938A1 (en) * 2023-05-01 2024-11-07 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified aav p5 promoter for improved vector titer and purity
WO2024229309A2 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Manifold Biotechnologies, Inc. Methodsand compositions for high-throughput protein delivery, screening, and detection
WO2024229302A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Sana Biotechnology, Inc. Methods of dosing and administration of engineered islet cells
WO2024233529A2 (en) 2023-05-07 2024-11-14 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2024233791A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 Seelos Therapeutics, Inc. Methods of treating neurodegenerative disorders
WO2024238859A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Regenxbio Inc. Vectorized c5 inhibitor agents and administration thereof
WO2024238867A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Regenxbio Inc. Vectorized anti-complement antibodies and administration thereof
WO2024238853A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Regenxbio Inc. Adeno-associated viruses for ocular delivery of gene therapy
WO2024243236A2 (en) 2023-05-22 2024-11-28 Sana Biotechnology, Inc. Methods of delivery of islet cells and related methods
WO2024241176A1 (en) 2023-05-24 2024-11-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Recombinant aav vectors and methods for treatment of diseases with central nervous system disorders
WO2024243563A1 (en) 2023-05-25 2024-11-28 Juno Therapeutics, Inc. Aav purification method
WO2024258961A1 (en) 2023-06-12 2024-12-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav gene therapy for mucopolysaccharidosis iiib
WO2025007046A1 (en) 2023-06-29 2025-01-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mutant aav with central nervous system targeting motifs and compositions containing same
WO2025008406A1 (en) 2023-07-04 2025-01-09 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
WO2025017168A1 (en) 2023-07-19 2025-01-23 Genethon Novel optimized utrophin micro-genes
WO2025017169A1 (en) 2023-07-20 2025-01-23 Genethon Novel mididystrophins
WO2025035143A1 (en) 2023-08-10 2025-02-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of spinal muscular atrophy
WO2025038430A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2025072604A1 (en) 2023-09-28 2025-04-03 University Of Rochester Rna-editing gene therapy approaches for treating myotonic dystrophy type 1 (dm1)
WO2025075963A1 (en) 2023-10-02 2025-04-10 Regenxbio Inc. Methods and formulations for treating mucopolysaccharidosis ii-associated hearing loss with recombinant human iduronate-2-sulfatase
WO2025080780A1 (en) 2023-10-10 2025-04-17 University Of Rochester Delivery and expression of prime editing crispr systems
WO2025090962A1 (en) 2023-10-25 2025-05-01 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2025090858A1 (en) 2023-10-27 2025-05-01 Biogen Ma Inc. Methods for identifying aav capsid variants with desired characteristics
WO2025102034A1 (en) 2023-11-10 2025-05-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for barth syndrome
WO2025106374A1 (en) 2023-11-13 2025-05-22 Juno Therapeutics, Inc. Aav production method
WO2025106661A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions with cardiac and skeletal musclespecific targeting motifs and uses thereof
WO2025108407A2 (en) 2023-11-23 2025-05-30 Neuexcell Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Gene therapy compositions and methods for treating glioma
WO2025113676A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 Neuexcell Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treating stroke in primates
WO2025129157A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treatment of canavan disease
US20250197862A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Genzyme Corporation ARTIFICIAL microRNAs TARGETING TAU
WO2025137219A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to dystrophia myotonica protein kinase
WO2025147436A1 (en) 2024-01-03 2025-07-10 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2025160429A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting snca
WO2025160434A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting huntington's disease
WO2025188625A1 (en) 2024-03-03 2025-09-12 Passage Bio, Inc. Recombinant adeno-associated virus for treatment of neurodegenerative disorders
WO2025217230A1 (en) 2024-04-08 2025-10-16 Regenxbio Inc. Vectorized anti-complement antibodies and complement agents and administration thereof
WO2025217214A2 (en) 2024-04-08 2025-10-16 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses and uses thereof
WO2025214477A1 (en) 2024-04-12 2025-10-16 Skyline Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Treatment of genetic cardiomyopathies with aav gene therapy vectors
CN118459608B (zh) * 2024-04-26 2025-01-24 泰州博莱得利生物科技有限公司 犬细小病毒特异性免疫制剂、制备方法和应用
WO2025237990A1 (en) 2024-05-14 2025-11-20 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of pulmonary fibrosis
CN118460614B (zh) * 2024-07-05 2025-03-11 凌意(杭州)生物科技有限公司 一种腺相关病毒Cap蛋白的表达框
CN120249230B (zh) * 2025-06-05 2025-11-07 鼐济医药科技(杭州)有限公司 一种用于同时生产多种重组腺相关病毒的方法

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8929110D0 (en) * 1989-12-22 1990-02-28 3I Res Expl Ltd Polypeptides and dna encoding therefor
US5449616A (en) 1990-05-23 1995-09-12 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid encoding dystrophin-associated protein
US5173414A (en) * 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
CA2046745A1 (en) 1991-07-10 1993-01-11 Isaac Neuman Article including a container containing at least one precious stone
US6174666B1 (en) 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US6001650A (en) * 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
JPH11514853A (ja) * 1995-09-08 1999-12-21 ジエンザイム コーポレイション 遺伝子治療のための改良されたａａｖベクター
EP0870044B1 (en) * 1995-12-01 2004-04-14 Crucell Holland B.V. Regulated protein expression in stably transfected mammalian cells
WO1998010087A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
JP2001500015A (ja) 1996-09-06 2001-01-09 トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ｔ７ポリメラーゼを利用する組換えアデノ随伴ウイルスの誘導可能な製造方法
WO1998009657A2 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
US20020037867A1 (en) * 1999-02-26 2002-03-28 James M. Wilson Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
US5866552A (en) * 1996-09-06 1999-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for expressing a gene in the absence of an immune response
CA2264499A1 (en) * 1996-09-06 1998-03-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses
AU4645697A (en) * 1996-09-11 1998-04-02 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Aav4 vector and uses thereof
WO1998024924A1 (en) * 1996-12-05 1998-06-11 Introgene B.V. Genetic modification of primate hemopoietic repopulating stem cells
US6039942A (en) * 1996-12-20 2000-03-21 Novo Nordick A/S Phytase polypeptides
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6251677B1 (en) * 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
EP1015619A1 (en) * 1997-09-19 2000-07-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
AU9774998A (en) 1997-09-19 1999-04-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Method for gene transfer using bcl2 and compositions useful therein
CA2303768C (en) * 1997-09-19 2009-11-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
US6953690B1 (en) 1998-03-20 2005-10-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
ATE286138T1 (de) 1998-03-20 2005-01-15 Univ Pennsylvania Zusammensetzungen und verfahren zur helfer-freien herstellung von rekombinante adeno-assoziierten viren
WO1999061601A2 (en) 1998-05-28 1999-12-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Aav5 vector and uses thereof
US6210663B1 (en) 1998-08-20 2001-04-03 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting
US6759237B1 (en) * 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
DK1127150T3 (da) * 1998-11-05 2007-09-24 Univ Pennsylvania Nucleinsyresekvenser fra det adeno-associerede virus af serotype 1 samt vektorer og værtsceller, der indeholder disse
US6387368B1 (en) * 1999-02-08 2002-05-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
JP4693244B2 (ja) * 1999-03-18 2011-06-01 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法
AU2409200A (en) 1999-06-02 2000-12-28 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Compositions and methods useful for production of recombinant viruses which require helper viruses
WO2001014539A2 (en) * 1999-08-20 2001-03-01 Johns Hopkins University School Of Medicine Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries
EP1218035A2 (en) * 1999-09-29 2002-07-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rapid peg-modification of viral vectors
US6365394B1 (en) * 1999-09-29 2002-04-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
WO2001040455A2 (en) 1999-12-03 2001-06-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for increasing packaging and yields of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals
US6821512B1 (en) 1999-12-03 2004-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for increasing packaging and yield of recombinant adenoviruses using multiple packaging signals
WO2001068888A2 (en) * 2000-03-14 2001-09-20 Neurologix, Inc. Production of chimeric capsid vectors
US6855314B1 (en) 2000-03-22 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells
US6468524B1 (en) * 2000-03-22 2002-10-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services AAV4 vector and uses thereof
WO2001083692A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
CN1293204C (zh) * 2000-08-30 2007-01-03 戴诺生物技术有限公司 等位基因的测定方法
US7749492B2 (en) 2001-01-05 2010-07-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. AAV vectors and methods
US20020159978A1 (en) * 2001-02-06 2002-10-31 James Allen Muscle-directed gene transfer by use of recombinant AAV-1 and AAV-6 virions
SG168422A1 (en) 2001-11-13 2011-02-28 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
ES2526341T3 (es) 2001-12-17 2015-01-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Secuencias de serotipo 9 de virus adeno-asociado (AAV), vectores que las contienen, y usos de las mismas
JP4810062B2 (ja) * 2001-12-17 2011-11-09 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）血清型８の配列
WO2003104392A2 (en) 2001-12-18 2003-12-18 University Of North Carolina At Chapel Hill Improved reagents and methods for producing parvoviruses
US20040002159A1 (en) * 2002-04-05 2004-01-01 Weidong Xiao Methods for the production of chimeric adeno-associated virus (AAV) vectors, compositions of chimeric AAV vectors, and methods of use thereof
EP1359217B1 (en) * 2002-04-29 2006-12-13 The Trustees of The University of Pennsylvania Method for direct rescue and amplification of integrated viruses from cellular DNA of tissues
PL2357189T3 (pl) 2003-06-19 2017-08-31 Genzyme Corporation Wiriony AAV o zmniejszonej immunoreaktywności i ich zastosowanie
EP3910063A1 (en) * 2003-09-30 2021-11-17 The Trustees of The University of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor
WO2006039218A2 (en) 2004-09-30 2006-04-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Perfusion circuit and use therein in targeted delivery of macromolecules
EP3409296A1 (en) 2005-04-07 2018-12-05 The Trustees of the University of Pennsylvania Method of increasing the function of an aav vector
US7788045B2 (en) 2005-09-01 2010-08-31 Meditasks, Llc Systems and method for homeostatic blood states
JP5268890B2 (ja) 2006-04-28 2013-08-21 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ａａｖの規模適応性の製造方法
JP2009102988A (ja) 2007-10-19 2009-05-14 Toyota Motor Corp 内燃機関の燃料噴射装置
AU2009223115B2 (en) 2008-03-14 2015-09-24 Humanzyme, Inc. Recombinant production of authentic human proteins using human cell expression systems
US20090280103A1 (en) 2008-04-04 2009-11-12 Martin Flueck Regulation of muscle repair
US8729041B2 (en) 2008-12-03 2014-05-20 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating hepatic neoplasia
EP3540055A1 (en) 2010-04-23 2019-09-18 University of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
EP2731470B1 (de) 2011-07-15 2017-09-06 Alfred Kärcher GmbH & Co. KG Rotationsbürste und kehrmaschine mit einer rotationsbürste
US9434928B2 (en) 2011-11-23 2016-09-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides
CN104520428B (zh) 2012-02-17 2018-09-21 费城儿童医院 将基因转移到细胞、器官和组织的aav载体组合物和方法
JP6385920B2 (ja) 2012-05-09 2018-09-05 オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティー アデノ随伴ウイルスプラスミド及びベクター
US9819463B2 (en) 2016-02-18 2017-11-14 Huawei Technologies Co., Ltd. Method and apparatus for transmitting data in a wireless communication system
US11827906B2 (en) 2017-02-28 2023-11-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clade f vector and uses therefor

Also Published As

Publication number Publication date
ATE317916T1 (de) 2006-03-15
US11034976B2 (en) 2021-06-15
CA3066428C (en) 2022-05-24
JP2013013414A (ja) 2013-01-24
BR122016004546B8 (pt) 2021-07-27
CA2945734A1 (en) 2003-05-22
SG168422A1 (en) 2011-02-28
CA2756866A1 (en) 2003-05-22
BR0214119A (pt) 2005-06-28
US20210285012A1 (en) 2021-09-16
IL227866A0 (en) 2013-09-30
IL258545B (en) 2019-11-28
CA3066428A1 (en) 2003-05-22
IL233391A (en) 2016-12-29
WO2003042397A3 (en) 2004-02-05
PH12016502583A1 (en) 2017-10-18
US10041090B2 (en) 2018-08-07
BR122016004546B1 (pt) 2016-11-29
CN103555678B (zh) 2018-02-09
IL221602A0 (en) 2012-10-31
JP3958191B2 (ja) 2007-08-15
US11499167B2 (en) 2022-11-15
US20190024117A1 (en) 2019-01-24
ES2258601T3 (es) 2006-09-01
IL234063A (en) 2017-06-29
CN103555676B (zh) 2016-08-31
SG10202108118RA (en) 2021-08-30
NZ600121A (en) 2013-12-20
NO336801B1 (no) 2015-11-02
NO336468B1 (no) 2015-08-31
US20160097040A1 (en) 2016-04-07
PH12014501487B1 (en) 2015-12-07
US20170240921A1 (en) 2017-08-24
US10544432B2 (en) 2020-01-28
MXPA04004600A (es) 2004-08-13
EP1310571A3 (en) 2003-08-13
US11041171B2 (en) 2021-06-22
HK1068925A1 (en) 2005-05-06
NZ532635A (en) 2007-05-31
HU229379B1 (en) 2013-11-28
JP2005525086A (ja) 2005-08-25
CN103555676A (zh) 2014-02-05
US20110263027A1 (en) 2011-10-27
IL270065B1 (en) 2023-06-01
JP2016136953A (ja) 2016-08-04
JP6212142B2 (ja) 2017-10-11
IL213810A0 (en) 2011-07-31
HUP0600229A2 (en) 2006-06-28
US10308958B2 (en) 2019-06-04
CA3159060A1 (en) 2003-05-22
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KR101015854B1 (ko) 2011-02-23
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SG10201912509RA (en) 2020-02-27
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BRPI0214119B1 (pt) 2016-09-27

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