ES2453106T3 - Métodos de diagnóstico y pronóstico en relación con la enfermedad de Alzheimer - Google Patents

Abstract

Un método para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, que comprende proporcionar una muestra de un derivado de la sangre, donde dicho derivado de la sangre es suero o plasma, obtenido de dicho sujeto; determinar la cantidad de gelsolina presente en dicha muestra; comparar la cantidad de gelsolina presente en dicha muestra con una cantidad de referencia de gelsolina presente en una muestra de un sujeto sano, donde la detección de un nivel de gelsolina en la muestra de dicho sujeto que sea menor que el nivel de gelsolina en la muestra de referencia, indica una mayor probabilidad de enfermedad de Alzheimer en dicho sujeto.

Description

Métodos de diagnóstico y pronóstico en relación con la enfermedad de Alzheimer

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones relacionados con la enfermedad de Alzheimer. En particular, la presente invención proporciona métodos de diagnóstico y medición del pronóstico de la enfermedad de Alzheimer usando proteínas expresadas diferencialmente.

10 Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (EA), la causa más común de demencia en las personas mayores, es una enfermedad neurodegenerativa debilitante que actualmente no tiene cura. Destruye las neuronas en partes del cerebro, 15 principalmente en el hipocampo que es una región implicada en la codificación de los recuerdos. La enfermedad de Alzheimer da lugar a una pérdida progresiva e irreversible de las funciones cognitivas y de la autonomía funcional. Los primeros signos de la EA se pueden confundir con simples olvidos, pero en las personas a las que finalmente se les diagnostica la enfermedad, estos signos iniciales inexorablemente evolucionarán hasta síntomas más graves de deterioro mental. Si bien el tiempo que demora la EA en progresar variará de persona a persona, los signos 20 avanzados incluyen deterioro grave de la memoria, confusión, trastornos del lenguaje, cambios de personalidad y comportamiento, y deterioro del juicio. Las personas con enfermedad de Alzheimer pueden volverse hostiles y poco comunicativas. Como la enfermedad termina en demencia profunda, los pacientes son incapaces de cuidar de sí mismos y a menudo requieren institucionalización o atención profesional en su hogar. Aunque algunos pacientes pueden vivir durante años después de habérseles diagnosticado la enfermedad de Alzheimer, la esperanza media

25 de vida después del diagnóstico es de ocho años.

En el pasado, la EA solo podía ser diagnosticada definitivamente por biopsia cerebral o en la autopsia después de la muerte de un paciente. Estos métodos, que demuestran la presencia de las características lesiones de placa y lesiones de ovillo en el cerebro, aún se consideran el estándar de oro para el diagnóstico de la patología de la EA.

30 Sin embargo, en el escenario clínico raramente se realiza una biopsia de cerebro y el diagnóstico depende de una batería de pruebas neurológicas, psicométricas y bioquímicas, que incluyen la medición de marcadores bioquímicos como las proteínas ApoE y tau o el péptido beta-amiloide en el líquido cefalorraquídeo y la sangre.

Son necesarios mejores biomarcadores para el diagnóstico de la EA y otras demencias. Un marcador biológico que

35 cumpla los requisitos para la prueba de diagnóstico de la EA tendría varias ventajas. Un marcador biológico ideal será aquel que identifique los casos de EA en una etapa muy temprana de la enfermedad, antes de que se observe degeneración en las pruebas de imagenología y neuropatológicas del cerebro. La detección de un biomarcador o un grupo de biomarcadores podría ser el primer indicador para iniciar el tratamiento tan pronto como fuera posible y también de mucho valor para evaluar la eficacia de nuevas terapias, particularmente las que se centran en la

40 prevención de cambios neuropatológicos. Un marcador biológico también sería útil en el seguimiento del avance de la enfermedad.

Los marcadores relacionados con las características patológicas de la EA, como placas y ovillos (A� y tau), han sido los más ampliamente estudiados. Los más prometedores han sido los de los estudios de concentración en el LCR de

45 A�(1-40), A�(1-42) y tau, o la combinación de ambas proteínas, en la EA. Muchos estudios han informado de una disminución de A�(1-42) en el LCR, mientras que la concentración total de proteína A� o A�(1-40) permanece inalterada (Ida, Hartmann et al., 1996; Kanai, Matsubara et al., 1998; Andreasen, Hesse et al. 1999).

Si bien los niveles de A� y tau en el líquido cefalorraquídeo (LCR) son biomarcadores prometedores para el

50 diagnóstico de la EA no muestran dicha utilidad de diagnóstico en líquidos corporales más accesibles. El líquido cefalorraquídeo es difícil de obtener de los pacientes humanos. Su extracción implica generalmente una técnica invasiva seria como punción lumbar que se realiza bajo sedación. Este es un procedimiento altamente especializado y complejo, que requiere personal médico calificado y especialmente entrenado. Además, consume tiempo y puede requerir anestesia, así como extensa cooperación del paciente. Por otra parte, la extracción de líquido

55 cefalorraquídeo es un procedimiento incómodo y a menudo doloroso, siendo el dolor de cabeza prolongado un síntoma común, a lo que se suma el riesgo para el paciente de infección y posible parálisis.

A la luz de las limitaciones del líquido cefalorraquídeo como una muestra clínica de rutina, se afirma un considerable interés en el plasma como fuente de biomarcadores para enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de

60 Alzheimer. WO 06/035237 describe estudios proteómicos que identificaron una serie de proteínas expresadas diferencialmente y describe ciertos métodos para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.

Otros estudios se describen en WO 2006/134390, US 2008/206737 y WO 02/46767.

Sin embargo, sigue siendo el caso que los biomarcadores conocidos en el área como asociados a la enfermedad de Alzheimer han tenido un valor pronóstico limitado o insignificante. Aunque el diagnóstico clínico actual de la enfermedad de Alzheimer basado en los síntomas neurológicos generales y en pruebas de función cognitiva imprecisas es razonablemente sólido, sigue siendo un problema describir y en particular predecir la evolución

5 probable de la enfermedad en pacientes vivos. Por lo tanto, el pronóstico, así como el diagnóstico, sigue siendo un problema en el área, en relación con los pacientes vivos.

La presente invención busca superar los problemas asociados al estado anterior de la técnica.

10 Resumen de la invención

En términos generales la divulgación actual apunta a métodos, reactivos y kits para el diagnóstico y el seguimiento del pronóstico de los pacientes que corren riesgo de padecer, o padecen, la enfermedad de Alzheimer. Más específicamente la divulgación actual describe tres marcadores proteicos cuyos niveles plasmáticos varían, donde el

15 nivel de cada proteína proporciona información sobre un cierto aspecto del riesgo del paciente de padecer la enfermedad, o de la velocidad de avance de una enfermedad de ese tipo. La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a la determinación del marcador proteico gelsolina.

Se describe un método de determinación de la naturaleza o el grado de avance del deterioro cognitivo en la

20 enfermedad de Alzheimer en un sujeto humano o animal, que comprende detectar el nivel de una proteína expresada diferencialmente, identificada por los métodos descritos en este documento, en una muestra de tejido o líquido corporal de dicho sujeto.

Se describe un método para determinar la edad aproximada de inicio de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto

25 humano o animal que corre el riesgo de padecer la enfermedad, que comprende detectar el nivel de un marcador proteico expresado diferencialmente, identificado por los métodos descritos en este documento, en una muestra de tejido o líquido corporal de dicho sujeto.

Se describe un método para determinar el riesgo de un individuo de padecer la enfermedad de Alzheimer, que

30 comprende detectar el nivel de un marcador proteico expresado diferencialmente, identificado por los métodos descritos en este documento, en una muestra de tejido o líquido corporal de dicho sujeto.

Se describe un método para predecir y/o seguir la respuesta al tratamiento de un sujeto con EA, que comprende detectar el nivel de un marcador proteico expresado diferencialmente, identificado por los métodos descritos en este

35 documento, en una muestra de tejido o líquido corporal de dicho sujeto. En este contexto se entiende que el sujeto puede ser un sujeto humano o no humano. Los sujetos no humanos incluyen modelos no vertebrados y vertebrados de la EA por ejemplo modelos de amplificación de genes, knockdown de genes (reducción de su expresión) y transgénicos.

40 En ciertas realizaciones es preferible medir los niveles del biomarcador de la presente invención en muestras para diagnóstico tomadas en serie del mismo paciente. Los cambios en el tiempo en los niveles de los biomarcadores pueden proporcionar información adicional, clínicamente útil, en cuanto a la aparición, la velocidad constante de avance o la respuesta del paciente al tratamiento para la EA.

45 Se describen reactivos y kits útiles en la realización de los métodos.

En particular, es una ventaja específica de la invención que los métodos de diagnóstico y pronóstico impliquen la determinación de marcadores proteicos particulares (biomarcadores) en la sangre. La sangre se obtiene fácil y rápidamente de manera mínimamente invasiva. Además, la extracción de sangre requiere sustancialmente menos

50 formación y calificación médicas que la extracción de líquido cefalorraquídeo, por lo que su obtención es más barata y menos exigente. Además, los riesgos para el paciente pueden ser ventajosamente minimizados o eliminados al basar los métodos de la invención en la detección sanguínea.

Por otra parte, los inventores identifican un grupo definido de biomarcadores que comparten ciertas propiedades, en

55 particular la capacidad de ser detectados en la sangre y de proporcionar indicaciones confiables en cuanto al diagnóstico o pronóstico en relación con la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, la invención proporciona ventajosamente métodos para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y métodos para ayudar a la predicción del pronóstico para los pacientes que tienen la enfermedad de Alzheimer. Los métodos también se pueden aplicar al seguimiento de la eficacia del tratamiento de los pacientes que padecen la enfermedad de

60 Alzheimer mediante lo cual un tratamiento acertado es evidenciado por un movimiento, de retroceso o de regreso, en los niveles plasmáticos del biomarcador a los de un estado de no-Alzheimer.

Específicamente, la presente invención identifica y describe proteínas que se expresan diferencialmente en el plasma de los individuos con la enfermedad de Alzheimer en comparación con su expresión en el estado normal y, en particular, identifica y describe proteínas asociadas a la definición de la edad de inicio y la probable velocidad del deterioro cognitivo en la enfermedad de Alzheimer. Asimismo, la presente invención proporciona métodos para ayudar al diagnóstico y la medición del pronóstico de la enfermedad de Alzheimer usando proteínas expresadas diferencialmente. Aún más, la divulgación actual proporciona reactivos y kits para el seguimiento del diagnóstico y el

5 pronóstico de la enfermedad de Alzheimer.

Por lo tanto la invención proporciona un método para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto que comprende: proporcionar una muestra de un derivado de la sangre, donde dicho derivado sanguíneo es suero o plasma, obtenido de dicho sujeto; determinar la cantidad de gelsolina presente en dicha muestra; comparar 10 la cantidad de gelsolina presente en dicha muestra con una cantidad de referencia de gelsolina presente en una muestra de un sujeto sano, donde la detección de un nivel de gelsolina en la muestra de dicho sujeto que sea menor que el nivel de gelsolina en la muestra de referencia, indica una mayor probabilidad de enfermedad de Alzheimer en dicho sujeto. Se debe entender que la muestra de referencia se puede tomar de un sujeto sano sin relación o puede ser una muestra anterior tomada del mismo sujeto antes de la aparición de los síntomas de la enfermedad de

15 Alzheimer.

La muestra puede consistir en plasma sanguíneo.

Adecuadamente, a dicho plasma sanguíneo se le puede reducir al mínimo el contenido de una o más de las 20 proteínas siguientes: albúmina; transferrina; IgG; IgA; antitripsina o haptoglobina. Dicha reducción es convenientemente previa a los pasos de análisis de los métodos de la invención.

Adecuadamente, a dicho plasma sanguíneo se le puede reducir al mínimo el contenido de cada una de: albúmina; transferrina; IgG; IgA; antitripsina o haptoglobina. 25 Adecuadamente, la proteína se detecta por inmunotransferencia tipo western.

Adecuadamente, la proteína se detecta mediante arreglo de microesferas en suspensión.

30 Adecuadamente, la proteína se detecta mediante arreglo planar.

Adecuadamente, la proteína se detecta por etiquetado isobárico de proteínas. Esta realización implica que todas tengan la misma masa. Esta realización se puede llevar a cabo utilizando un enfoque tipo TMT calibrator.

35 Adecuadamente, la proteína se detecta por etiquetado isotópico de proteínas. Esta realización implica que haya diferentes masas dentro de la misma estructura química. Esta realización se puede llevar a cabo usando un enfoque tipo TMT-SRM. Adecuadamente, se puede utilizar un ensayo de dilución isotópica como AQUA.

Adecuadamente, la proteína se detecta mediante un análisis en espectrómetro de masas.

40 Adecuadamente, la proteína gelsolina se detecta por referencia a uno o más de los péptidos siguientes de la tabla B: SEC. ID Nº: 30, SEC. ID Nº: 31, SEC. ID Nº: 32.

También se describe el uso para aplicaciones de diagnóstico, de pronóstico y terapéuticas relacionadas con la 45 enfermedad de Alzheimer, de un material que reconoce, se une a, o tiene afinidad por, un polipéptido o una variante

o mutante de éste, donde el polipéptido se elige entre gelsolina (SEC. ID Nº: 1), inhibidor C1 de la proteasa (SEC. ID Nº: 2) o ceruloplasmina (SEC. ID Nº: 3).

También se describe el uso según se indicó antes de una combinación de materiales, cada uno de los cuales, 50 respectivamente, reconoce, se une a, o tiene afinidad por, uno o más de dichos polipéptidos o una variante o mutante de éstos.

Adecuadamente, el, o cada, material es un anticuerpo o un chip de anticuerpos.

55 Adecuadamente, el material es un anticuerpo con especificidad por uno o más de dichos polipéptidos o un fragmento, variante o mutante de éstos.

También se describe un dispositivo de análisis para usar en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, que consiste en un sustrato sólido que tiene una posición que contiene un material, que reconoce, se une a, o tiene 60 afinidad por, un polipéptido o un fragmento, variante o mutante de éste, donde el polipéptido se elige entre gelsolina (SEC. ID Nº: 1), inhibidor C1 de la proteasa (SEC. ID Nº: 2), o ceruloplasmina (SEC ID Nº: 3).

Adecuadamente, el sustrato sólido tiene varias posiciones que cada una contiene, respectivamente, un material que reconoce, se une a, o tiene afinidad por, un polipéptido o un fragmento, variante o mutante de éste, donde el polipéptido se elige entre gelsolina (SEC. ID Nº:1), inhibidor C1 de la proteasa (SEC. ID Nº:2) o ceruloplasmina (SEC. ID Nº:3).

Adecuadamente, el material es un anticuerpo o un chip de anticuerpos.

5 Adecuadamente, el dispositivo de análisis descrito antes tiene una única posición direccionable para cada anticuerpo, de modo de permitir una lectura del análisis para cada polipéptido individual o para cualquier combinación de polipéptidos.

10 Adecuadamente, el dispositivo de análisis descrito antes, incluye un anticuerpo para un polipéptido donde el polipéptido se elige entre gelsolina (SEC. ID Nº: 1), inhibidor C1 de la proteasa (SEC. ID Nº: 2) o ceruloplasmina (SEC. ID Nº: 3).

Adecuadamente, el dispositivo de análisis descrito antes tiene además una posición que contiene un material que 15 reconoce, se une a, o tiene afinidad por, la glutatión S-transferasa P.

Adecuadamente, el material es un anticuerpo o un chip de anticuerpos.

También se describe un kit para usar en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer que consiste en un

20 dispositivo de análisis como el descrito, y medios para detectar la cantidad de uno o más de los polipéptidos en una muestra de líquido corporal tomada de un sujeto.

También se describe un kit para usar en la detección del polipéptido gelsolina, donde dicho kit comprende uno o más de los péptidos siguientes de la tabla B: SEC. ID Nº: 30, SEC. ID Nº: 31, SEC. ID Nº: 32.

25 También se describe un kit para usar en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer que comprende uno o más de los péptidos siguientes de la tabla B: SEC. ID Nº: 30, SEC. ID Nº: 31, SEC. ID Nº: 32. Adecuadamente, dicho kit comprende al menos otro péptido más de la tabla B.

30 Adecuadamente, uno o más de dichos péptidos contiene un isótopo pesado. Adecuadamente, uno o más de dichos péptidos contiene varios isótopos pesados. Dichos isótopos pueden consistir en carbono-13 o nitrógeno-15. La ventaja de esta realización es que los isótopos pesados proporcionan una masa diferente a un péptido, por lo demás inalterado, facilitando su detección e identificación.

35 Adecuadamente, uno o más de dichos péptidos contiene una etiqueta (tag) de TMT. Adecuadamente, dicho kit comprende una etiqueta isotópica de TMT adicional, para el etiquetado de un polipéptido de muestra. Convenientemente dicha etiqueta puede consistir en TMT-6.

También se describe un método para determinar el genotipo APOE £4 de un sujeto, donde dicho método comprende 40 determinar el nivel de inhibidor C1 de la proteasa en una muestra de sangre de dicho sujeto.

También se describe un método para predecir la edad de inicio de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, donde dicho método comprende determinar los niveles de ceruloplasmina en una muestra de sangre de dicho sujeto.

45 Biomarcadores

El biomarcador es gelsolina (por ej. SEC. ID Nº: 1). También se describen el inhibidor C1 de la proteasa (también denominado en este documento 'inhibidor C1' o 'inh C1') (por ej. SEC. ID Nº: 2) y la ceruloplasmina (por ej. SEC. ID Nº: 3). Estos marcadores tienen ambos la ventaja de ser detectables en sangre.

50 Por lo tanto, las proteínas biomarcadoras que se demostró en este estudio que son importantes para discriminar sujetos con EA y NDC (controles no dementes), son gelsolina, inhibidor C1 y ceruloplasmina.

La gelsolina se encontró a menores concentraciones en la EA y se correlacionó con el deterioro cognitivo por año. 55 Por lo tanto la gelsolina es un biomarcador esencial según la presente invención.

Las otras dos proteínas que se encontró en el análisis multivariable que eran importantes para discriminar sujetos con EA y NDC fueron el inhibidor C1 y la ceruloplasmina. Las proteínas inhibidor C1 y ceruloplasmina se asociaron a otros parámetros clínicos, por ejemplo, el genotipo APOE £4 y la edad de inicio. Si bien estas últimas proteínas no

60 mostraron una diferencia estadísticamente significativa en los niveles plasmáticos de las proteínas entre sujetos con EA y NDC, se asociaron al genotipo APOE £4 y la edad de inicio, respectivamente, y por lo tanto proporcionan medios para identificar el riesgo de un individuo de padecer la EA o para evaluar la duración de una enfermedad diagnosticada. Por consiguiente, los tres biomarcadores son importantes en el área común del diagnóstico, el pronóstico y el seguimiento del tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Gelsolina

La gelsolina, también denominada factor de despolimerización de la actina (ADF) o brevina, se produce

5 intracelularmente en el citosol y la mitocondria, así como extracelularmente en el plasma sanguíneo. Se sabe que la función principal de esta proteína de 82 kDa de tamaño, es actuar como un regulador clave del ensamblaje de los filamentos de actina y es regulada por Ca2+ (Sun et al., 1999). Curiosamente, una mutación de un solo nucleótido en el gen de la gelsolina, que produce el intercambio de un aminoácido, es la causa de la amiloidosis familiar de tipo finlandés (Levy et al., 1990, Maury et al., 1990). La gelsolina también se ha relacionado a una angiopatía amiloide

10 cerebral de tipo familiar (Kiuru et al., 1999) y se demostró que se une a A de manera dependiente de la concentración (Chauhan et al., 1999, Ji et al., 2008). La gelsolina inhibe la formación de fibrillas de péptidos A y también puede deshacer la fibrillas de A� preformadas (Ray et al., 2000). También se demostró que la gelsolina tiene un papel importante en la inhibición de la citotoxicidad inducida por A al inhibir los cambios mitocondriales apoptóticos (Qiao et al., 2005). Las placas amiloideas son uno de los dos principales hallazgos patológicos en la EA

15 y se han emprendido distintas estrategias para disminuir la carga de placas en el cerebro. Se demostró que la mayor depuración de A� del sistema nervioso central (SNC) mejora la función de la memoria en los seres humanos (Gilman et al., 2005) y disminuye los déficits conductuales en ratones transgénicos (Janus et al., 2000). Una estrategia para lograr esto, también denominada hipótesis del sumidero periférico, es cambiar el equilibrio de A entre el plasma sanguíneo y el SNC a la periferia (Matsuoka et al., 2003), ya sea con inmunización activa o pasiva o a través de

20 otras proteínas de unión a A incluida la gelsolina (Matsuoka et al., 2003). De conformidad con esto, se encontró que la inducción de la expresión periférica de gelsolina plasmática también reduce la A cerebral y se sugirió como un enfoque genético-terapéutico adecuado para la prevención o el tratamiento de la EA (Hirko et al., 2007). Dado que la gelsolina se une a A , reduce la toxicidad de las fibrillas de A� y disminuye la carga de A� en el SNC, es plausible que menores niveles plasmáticos de gelsolina en la EA, como demostramos en este documento,

25 contribuyan a un avance más rápido de la enfermedad.

Cuando el marcador es gelsolina, el nivel sanguíneo de gelsolina se compara adecuadamente con un nivel sanguíneo normal o de referencia de gelsolina. Si se observa que el nivel de gelsolina detectado en los pacientes es menor que el nivel de gelsolina en la muestra normal o de referencia, esto indica una mayor probabilidad de que el

30 paciente tenga la enfermedad de Alzheimer.

Los niveles de gelsolina también se pueden usar de manera ventajosa como predictores de la velocidad del deterioro cognitivo. Específicamente, menores niveles de gelsolina se correlacionan con un mayor nivel de deterioro cognitivo por año. En otras palabras, la medida en que los niveles de gelsolina detectados en la sangre de un

35 paciente son menores a los detectados en una muestra normal o de referencia, se correlaciona con el grado de deterioro cognitivo esperado o previsto, año a año, para ese paciente.

Por otra parte, también se mostró sorprendentemente que los niveles de gelsolina se correlacionan con la velocidad de avance de la enfermedad. En otras palabras, cuanto menores son los niveles de gelsolina encontrados en la

40 sangre de un paciente en comparación con los de una muestra normal o de referencia, mayor es la velocidad de avance de la enfermedad prevista para ese paciente.

Es una ventaja de la invención que en este documento se instruya acerca de marcadores sanguíneos del avance de la enfermedad. Además, es una ventaja de la invención que se puedan usar los niveles sanguíneos de los

45 biomarcadores para predecir la velocidad de avance de la enfermedad en ese paciente.

Inhibidor C1 de la proteasa

El inhibidor C1 (inh C1) de la proteasa plasmática es un inhibidor de la vía del complemento y un miembro de las

50 denominadas serpinas, inhibidores de la serina proteasa. Inh C1 es una proteína de fase aguda y su función principal es la inhibición del sistema del complemento para evitar la activación espontánea. Una deficiencia de inh C1 tiene un papel causal en la aparición de angiodema adquirido y hereditario (Carugati et al., 2001). Se sabe que en la EA, se produce una activación de la vía del complemento ya en etapas muy tempranas (McGeer y McGeer, 2002) y varios de sus componentes, incluido el inh C1 han demostrado estar asociados a las placas amiloides

55 (Veerhuis et al., 1998, Strohmeyer et al., 2002). Recientemente también inh C1 ha sido sugerido como biomarcador de la EA en el plasma de pacientes tratados con rosiglitazona (Akuffo et al., 2008). Sin embargo, el papel de inh C1 en el proceso de la enfermedad sigue siendo confuso, puesto que se demostró que inh C1 y CD59 no inhiben eficazmente la activación del complemento en la EA (Yasojima et al., 1999).

60 Los niveles de inhibidor C1 de la proteasa se pueden utilizar como un indicador del genotipo APOE £4 (APOE épsilon 4). Adecuadamente, los niveles de inhibidor C1 de la proteasa no se utilizan solos en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, sino que más bien se combinan ventajosamente con otros marcadores, o se usan solos para ayudar al diagnóstico de un genotipo APOE £4.

Ceruloplasmina

La ceruloplasmina, también conocida como ferroxidasa, es la principal proteína transportadora de cobre de la sangre y desempeña también un papel en el metabolismo del hierro. Se ha atribuido a la deficiencia de cobre el ser una de 5 las causas de la EA y ha sido ampliamente estudiada y revisada (Gaggelli et al., 2006). Se estudiaron los niveles de ceruloplasmina en sangre (Giometto et al., 1988, Hye et al., 2006, Kessler et al., 2006), LCR (Loeffler et al., 1994) y tejido cerebral (Connor et al., 1993, Loeffler et al., 1996, Loeffler et al., 2001) con resultados diferentes. En nuestro estudio, se estableció una correlación significativa (positiva) de los niveles de ceruloplasmina con la edad de inicio. Debido a su función principal en el transporte de cobre y la correlación observada con la edad de inicio, el

10 desequilibrio de cobre parece tener un impacto fundamental en la aparición y el curso de la EA.

Se describe el uso de los niveles de ceruloplasmina para ayudar al diagnóstico o la predicción de la edad de inicio de la enfermedad de Alzheimer. En particular se da a conocer una correlación positiva entre los niveles de ceruloplasmina y la edad de inicio de la enfermedad de Alzheimer. Adecuadamente, los niveles de ceruloplasmina

15 no se usan solos para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Convenientemente, los niveles de ceruloplasmina se pueden usar en combinación con otros marcadores para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, o preferentemente los niveles de ceruloplasmina se usan solos para ayudar a predecir la edad de inicio de la enfermedad de Alzheimer en un paciente en particular.

20 Combinaciones

La invención se puede aplicar como parte de un grupo de biomarcadores para proporcionar un diagnóstico o pronóstico más sólido. Por otra parte, la invención se puede aplicar como parte de un grupo de biomarcadores con el fin de proporcionar un panorama más completo de la etapa de la enfermedad o los desenlaces posibles para un

25 determinado paciente.

Al menos la gelsolina y opcionalmente el inhibidor C1 de la proteasa o la ceruloplasmina se analizan adecuadamente en un grupo más amplio de marcadores de conformidad con la presente invención.

30 Más adecuadamente, al menos dos entre gelsolina, inhibidor C1 de la proteasa y ceruloplasmina se analizan convenientemente, en un grupo más amplio de marcadores de conformidad con la presente invención que al menos incluye gelsolina.

Convenientemente, cuando se analizan dos marcadores, estos marcadores son gelsolina y el inhibidor C1 de la

35 proteasa. Esto permite ayudar a un diagnóstico de la enfermedad, junto con una indicación del genotipo APOE £4 ("APOE épsilon 4"), como en un formato de un solo ensayo, evitando ventajosamente realizar una prueba de genotipificación independiente para Apo£4.

Adecuadamente, cuando se analizan dos marcadores esos marcadores son gelsolina y ceruloplasmina. Esto ofrece

40 la ventaja de ayudar a predecir la edad de inicio para un paciente en particular y de ayudar al diagnóstico de si ese paciente ya tenía, o no, la enfermedad. Por lo tanto, si se encuentra que los niveles de gelsolina son normales, pero los niveles de ceruloplasmina indican una edad de inicio particular, entonces se puede indicar convenientemente el reanálisis o el seguimiento de ese paciente basándose en el resultado del ensayo combinado de gelsolina y ceruloplasmina.

45 Cuando se analizan dos marcadores, esos marcadores pueden ser el inhibidor C1 de la proteasa y ceruloplasmina. No se espera que esta combinación proporcione una indicación directa del diagnóstico de un estado patológico. Esta combinación ofrece la ventaja de proporcionar información descriptiva y predictiva acerca de un paciente, que puede ser útil para evaluar el riesgo para ese paciente en particular. Además, cuando se utiliza esta combinación de

50 marcadores, se evitan ventajosamente los problemas de la ayuda psicológica relacionada con un diagnóstico positivo de la enfermedad Alzheimer. Por otra parte, podría ser útil emplear esta combinación de marcadores para una detección previa, por ejemplo para proporcionar una indicación de la predisposición a, o la probabilidad de, padecer una enfermedad, y se podría programar la realización de una prueba diagnóstica completa a los pacientes en un momento futuro adecuado, dependiendo de las indicaciones de los resultados combinados de ceruloplasmina

55 e inhibidor C1 de la proteasa.

Convenientemente, cuando se analizan más de dos biomarcadores, esos biomarcadores consisten en gelsolina, inhibidor C1 de la proteasa y ceruloplasmina. Esta combinación maximiza ventajosamente la cantidad de información proporcionada a un paciente por un determinado análisis.

60 Por supuesto, el lector experto podrá apreciar que los biomarcadores específicos de la presente invención se pueden combinar ventajosamente con otros marcadores conocidos en el área. Por supuesto, dichos grupos extendidos que comprenden los biomarcadores específicos tratados en este documento pretenden ser abarcados por la invención. La selección de otros marcadores conocidos para las pruebas en dicha realización del grupo la puede llevar a cabo un lector experto según las fuentes apropiadas. En este contexto, otros biomarcadores se pueden relacionar con la EA, con otras condiciones neurológicas para las que se requiere un diagnóstico diferencial de la EA, o con otras enfermedades comúnmente asociadas a los pacientes con enfermedad de Alzheimer o cuyos síntomas semejan los de la EA. Uno de dichos conjuntos de marcadores adicionales relacionados con la EA se

5 proporciona en WO 06/035237.

Por lo tanto, un grupo preferido de marcadores se compone de al menos

gelsolina (número de referencia Swiss prot P06396; SEC. ID Nº: 1); y una o más proteínas elegidas entre:

10 inhibidor C1 de la proteasa (SEC. ID Nº: 2) ceruloplasmina (SEC. ID Nº: 3) clusterina (número de referencia SwissProt P10909; SEC. ID Nº: 4) complemento c3 (P01024; SEC. ID Nº: 5) componente amiloide P sérico (P02743; SAP; SEC. ID Nº: 6)

15 alfa-2 macroglobulina (P01023; A2M; SEC. ID Nº: 7) gamma-fibrinógeno (P02679; SEC. ID Nº: 8) factor H del complemento (P08603; CFH; SEC. ID Nº: 9) apolipoproteína E (P02649; ApoE; SEC. ID Nº: 10).

20 Se describe un método para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, que comprende analizar al menos dos entre gelsolina, inhibidor C1 de la proteasa y ceruloplasmina en una muestra de sangre de dicho sujeto. Adecuadamente, los niveles de cada uno de gelsolina, inhibidor C1 de la proteasa y ceruloplasmina, se analizan en una muestra de sangre de dicho sujeto.

25 Adecuadamente, dicho sujeto es un ser humano.

Adecuadamente, dicho sujeto es un mamífero no humano.

Adecuadamente, dicho sujeto es un roedor. 30 Muestra

La muestra puede ser cualquier tejido que se pueda obtener de un sujeto que se sospecha que tiene la EA o corre riesgo de padecer la EA. En el contexto de los seres humanos es preferible que la muestra sea un líquido corporal. 35 Más preferentemente la muestra es sangre. Se prefiere aún más que la muestra sea plasma sanguíneo.

En particular, cuando el biomarcador que se está analizando consiste en uno o más de gelsolina, inhibidor C1 de la proteasa o ceruloplasmina, entonces convenientemente, se excluye específicamente el líquido cefalorraquídeo como muestra. Por supuesto, en otras realizaciones de la invención que implican evaluar otros biomarcadores, se puede

40 analizar el líquido cefalorraquídeo como parte de un análisis más amplio.

La muestra puede contener una sustancia derivada de la sangre como plasma. Un técnico con experiencia puede llevar a cabo fácilmente la preparación del plasma a partir de sangre entera, por ejemplo mediante eliminación por centrifugación de las células presentes en la sangre entera.

45 El plasma se puede obtener de manera relativamente fácil y puede reflejar los sub-proteomas de otros órganos, incluido el cerebro. Ambos tipos de análisis propuestos, grupos de proteínas y proteómicos en gel, se han utilizado previamente en suero y plasma para identificar posibles biomarcadores con cierto éxito (Hye et al., 2006, Ray et al., 2007, Baranowska-Bik et al., 2008), pero a nuestro leal saber y entender no se han utilizado previamente análisis

50 proteómicos que no fueran en gel, en la búsqueda de marcadores plasmáticos de la EA.

Uno de los problemas con el análisis proteómico con espectrometría de masas del plasma sanguíneo, es el enorme rango dinámico de las proteínas plasmáticas. Los niveles de proteína abarcan un extraordinario rango de 10 órdenes de magnitud, lo que hace la investigación de las proteínas poco abundantes casi imposible (Anderson y Anderson, 55 2002, Jacobs et al., 2005). Los ajustes instrumentales de LC/MS/MS, donde se eligen para la fragmentación los picos más prominentes en un periodo de tiempo corto, no permiten la identificación y cuantificación de las proteínas poco abundantes del plasma sin fraccionar, debido a la gran abundancia de seroalbúmina y otras proteínas. Esto se refleja en un bajo número de proteínas identificadas. Un enfoque para reducir el rango dinámico es agotar las muestras de las proteínas más abundantes, y en este caso ejemplificamos este enfoque mediante una columna de

60 inmunoafinidad para eliminar albúmina, transferrina, IgG, IgA, antitripsina y haptoglobina. El número de proteínas identificables y cuantificables se pudo aumentar considerablemente y se compararon los niveles relativos de proteínas entre diferentes muestras.

Por lo tanto, más convenientemente, la muestra de acuerdo con la invención puede ser plasma procesado. Por ejemplo, se puede procesar el plasma para eliminar las proteínas muy abundantes y así aumentar el número de proteínas detectables, o aumentar la posibilidad de detectar proteínas presentes en concentraciones absolutas bajas. Las técnicas para el agotamiento de proteínas muy abundantes del plasma son bien conocidas en el área. En particular, se puede utilizar convenientemente un sistema de eliminación por afinidad múltiple para procesar el

5 plasma para análisis. Los sistemas de ejemplo se describen en la sección de ejemplos de esta solicitud.

Además, la muestra puede contener adecuadamente proteínas plasmáticas. En esta realización, el plasma se puede procesar como se describe en este documento, y después se puede someter a cromatografía de exclusión por tamaño, intercambio de tampón, u otros tratamientos de ese tipo para llegar a una muestra que contenga las

10 proteínas de dicho plasma, el cual puede ofrecer ventajas como un comportamiento superior en los instrumentos analíticos.

El principio fundamental de las propiedades de la muestra, cualquiera sea la forma particular que tome, es que sean,

o deriven, de la sangre.

15 Muestra de referencia

La muestra de referencia es adecuadamente una muestra de un sujeto que no padece, ni se sospecha que padece, la enfermedad de Alzheimer. Más adecuadamente, la muestra de referencia es de un sujeto sano. Idealmente ésta 20 se procesa y analiza de la misma manera que las muestras en análisis. Sin embargo, esto puede no ser práctico o deseable en cuyo caso la muestra de referencia puede ser considerada como un valor de referencia determinado previamente para un sujeto sano, como una abundancia o concentración de (por ejemplo) gelsolina para un individuo sano normal. Idealmente la muestra o valor de referencia esta emparejada por sexo y adecuadamente emparejada por edad, más convenientemente emparejada por antecedentes genéticos o étnicos u otros criterios

25 como los que se aplican habitualmente en el emparejamiento de las muestras clínicas con los controles, y en la medida en que los niveles plasmáticos del biomarcador adecuado dependan de dichos factores. Convenientemente, la muestra de referencia puede ser una muestra previa tomada del mismo sujeto antes del inicio de la enfermedad de Alzheimer.

30 Detección

Una proteína marcadora puede tener su expresión modulada, es decir, cuantitativamente aumentada o disminuida, en pacientes con enfermedad de Alzheimer. El grado en el cual la expresión difiere en el estado normal versus los estados patológicos (o estados avanzados versus estados tempranos) solo necesita ser lo suficientemente grande 35 para ser visualizado mediante técnicas estándar de caracterización, como la coloración con plata de los geles 2Delectroforéticos, la medición de iones peptídicos representativos mediante etiquetado isobárico de masas y espectrometría de masas o métodos de detección inmunológicos como inmunotransferencia tipo western, enzimoinmunoanálisis de absorción (ELISA) o radioinmunoanálisis. Otros técnicas estándar de caracterización de ese tipo mediante las cuales se pueden visualizar las diferencias de expresión son bien conocidas por los expertos

40 en el área. Éstas incluyen separaciones cromatográficas sucesivas de fracciones y comparaciones de los picos, electroforesis capilar, separaciones usando redes de microcanales, por ejemplo en un microchip, y métodos de espectrometría de masas que incluyen monitoreo de reacciones múltiples (MRM) y TMT calibrator (Dayton et al. 2009).

45 Las separaciones cromatográficas se pueden llevar a cabo por cromatografía líquida de alto rendimiento como se describe en la bibliografía de Pharmacia, donde el cromatograma se obtiene en forma de una gráfica de absorbancia de la luz a 280 nm frente al tiempo de separación. Entonces, el material que da picos incompletamente resueltos se vuelve a cromatografiar y así sucesivamente.

50 La electroforesis capilar es una técnica que se describe en numerosas publicaciones, por ejemplo en la bibliografía "Total CE Solutions" provista por Beckman con su sistema P/ACE 5000. La técnica depende de la aplicación de un potencial eléctrico a través de la muestra contenida en un pequeño tubo capilar. El tubo tiene una superficie cargada como un vidrio de silicato cargado negativamente. Los iones de carga opuesta (en este caso, iones positivos) son atraídos a la superficie y luego migran al electrodo adecuado de la misma polaridad que la superficie (en este caso,

55 el cátodo). En este flujo electroosmótico (EOF) de la muestra, los iones positivos se mueven más rápido, seguidos de material sin cargar e iones con carga negativa. Por lo tanto, las proteínas se separan esencialmente según la carga que lleven.

Las redes de microcanales actúan de algún modo como tubos capilares y se pueden formar por fotoablación de un

60 material polimérico. En esta técnica, se utiliza un láser UV para generar pulsos luminosos de alta energía que son despedidos en ráfagas sobre polímeros con características de absorción UV adecuadas, por ejemplo, tereftalato o policarbonato de polietileno. Los fotones incidentes rompen los enlaces químicos con un espacio confinado, llevando a un aumento de la presión interna, mini-explosiones y expulsión del material seccionado, dejando atrás huecos que forman microcanales. El material de los microcanales logra una separación basada en EOF, como para la electroforesis capilar. Es adaptable a la forma de microchip, donde cada chip tiene su propio inyector de muestra, columna de separación y detector electroquímico: véase J. S. Rossier et al., 1999, Electrophoresis 20: páginas 727

731.

5 Otros métodos incluyen realizar un ensayo de unión para la proteína marcadora. Se puede usar razonablemente cualquier agente de unión específico. Preferentemente el agente de unión está etiquetado. Preferentemente el ensayo es un inmunoensayo, especialmente entre el biomarcador y un anticuerpo que reconoce la proteína, particularmente un anticuerpo etiquetado. Puede ser un anticuerpo contra toda, o parte de, la proteína marcadora, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un antisuero policlonal antihumano de alta especificidad para la proteína

10 marcadora.

Cuando el ensayo de unión es un inmunoensayo, se puede llevar a cabo midiendo el grado de interacción entre la proteína y el anticuerpo. Se puede usar cualquier método de inmunoensayo conocido. Se prefiere un ensayo sándwich. En un ensayo sándwich de ejemplo, un primer anticuerpo para la proteína marcadora se une a la fase 15 sólida, por ejemplo al pocillo de una placa de microtitulación de plástico, y se incuba con la muestra y con un segundo anticuerpo etiquetado específico para la proteína que se va a analizar. Alternativamente se puede usar captura de un anticuerpo. En este caso, se permite que la muestra de prueba se una a una fase sólida y después se agrega el anticuerpo anti-proteína marcadora y se permite que se una. Después de eliminar por lavado el material sin unir, la cantidad de anticuerpo unido a la fase sólida se determina utilizando un anticuerpo secundario etiquetado,

20 anti-el primer anticuerpo.

En otra realización, se lleva a cabo un ensayo competitivo entre la muestra y una proteína marcadora etiquetada o un péptido derivado de ella, donde estos dos antígenos compiten por una cantidad limitada del anticuerpo antiproteína marcadora unido a un soporte sólido. La proteína marcadora etiquetada, o su péptido, se puede preincubar

25 con el anticuerpo de la fase sólida, mediante lo cual la proteína marcadora de la muestra desplaza parte de la proteína marcadora, o su péptido, unida al anticuerpo.

En otra realización, se permite que los dos antígenos compitan en una única incubación conjunta con el anticuerpo. Luego de eliminar por lavado del soporte el antígeno sin unir, se determina la cantidad de etiqueta unida al soporte y

30 se mide la cantidad de proteína en una muestra por comparación con curvas de titulación estándar establecidas previamente.

El agente de unión en el ensayo de unión puede ser un agente de unión específico etiquetado, por ejemplo, un anticuerpo u otro agente de unión específico. Generalmente el agente de unión estará él mismo etiquetado, pero

35 alternativamente se puede detectar mediante una reacción secundaria en la cual se genera una señal, por ejemplo a partir de otra sustancia etiquetada.

La etiqueta puede ser una enzima. El sustrato para la enzima puede ser, por ejemplo, formador de color, fluorescente o quimioluminiscente.

40 Se puede usar una forma amplificada de ensayo, mediante la cual se produce una "señal" potenciada a partir de un nivel relativamente bajo de proteína a ser detectado. Una forma particular de inmunoensayo amplificado es un ensayo quimioluminiscente potenciado. Convenientemente, el anticuerpo se etiqueta con peroxidasa de rábano, que participa en una reacción quimioluminiscente con luminol, un sustrato de peróxido y un compuesto que aumenta la

45 intensidad y la duración de la luz emitida, usualmente 4-yodofenol o ácido 4-hidroxicinámico.

Otra forma de inmunoensayo amplificado es inmuno-PCR. En esta técnica el anticuerpo se une covalentemente a una molécula de ADN arbitrario que comprende cebadores de PCR mediante lo cual el ADN con el anticuerpo unido a él es amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa. Véase E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids

50 Research 23: 522-529 (1995). La señal se lee como antes.

El tiempo requerido para el ensayo se puede reducir mediante el uso de un inmunoensayo turbidimétrico rápido, potenciado con micropartículas, como el tipo realizado por M. Robers et al., "Development of a rapid microparticleenhanced turbidimetric immunoassay for plasma fatty acid-binding protein, an early marker of acute myocardial

55 infarction", Clin. Chem. 1998;44:1564-1567

Debería ser posible la automatización total de cualquier inmunoensayo contemplado en un analizador de química clínica ampliamente utilizado como el sistema COBAS™ MIRA Plus de Hoffmann-La Roche, descrito por M.Robers et al. supra, o el sistema AxSYM™ de Abbott Laboratories, y ser aplicada al diagnóstico clínico de rutina de la

60 enfermedad de Alzheimer.

También se contempla en la invención el uso de (i) un arreglo de anticuerpos o 'chip' o un arreglo de microesferas en suspensión, capaces de detectar una o más proteínas que interaccionan con ese anticuerpo.

Un chip de anticuerpos, arreglo de anticuerpos o microarreglo de anticuerpos es un arreglo de elementos únicos direccionables sobre una superficie sólida continua, mediante el cual en cada elemento único direccionable se inmoviliza un anticuerpo con especificidad definida por un antígeno de manera de permitirle la posterior captura del antígeno diana y la detección subsiguiente de la magnitud de dicha unión. Cada elemento único direccionable está

5 separado en la superficie sólida de todos los otros elementos únicos direccionables de modo que la unión y la detección de los antígenos específicos no interfiera con ninguno de esos elementos únicos direccionables adyacentes.

Un "arreglo de microesferas en suspensión" es una suspensión acuosa de una o más partículas distintas

10 identificables, donde cada partícula contiene características codificantes referentes a su tamaño y color o señal fluorescente y para el cual todas las microesferas de una combinación particular de dichas características codificantes están recubiertas con un anticuerpo con una especificidad definida por un antígeno, de manera de permitirles la posterior captura del antígeno diana y la detección subsiguiente de la magnitud de dicha unión. Ejemplos de dichos arreglos se puede encontrar en www.luminexcorp.com donde se describe la aplicación del

15 arreglo de microesferas en suspensión xMAP® en el sistema Luminex® 100™.

Alternativamente, la muestra para diagnóstico se puede someter a etiquetado isobárico de masas y LC-MS/MS como se describe en este documento. Un ejemplo de las maneras preferidas de llevar a cabo el etiquetado isobárico de proteínas se indica en la sección de ejemplos de esta solicitud.

20 El etiquetado isobárico de proteínas que utiliza etiquetas de masas en tándem ha demostrado previamente ser capaz de determinar los niveles relativos de proteínas de una manera muy exacta (Thompson et al., 2003, Dayon et al., 2008). Además, se han publicado numerosos informes en los últimos años que utilizan iTRAQ para el etiquetado de proteínas en diversos tejidos y líquidos (Aggarwal et al., 2006). Especialmente para el descubrimiento de

25 biomarcadores en diversas afecciones, iTRAQ ha demostrado ser una herramienta muy adecuada y se ha utilizado en investigación del cáncer (Maurya et al., 2007, Garbis et al., 2008, Matta et al., 2008, Ralhan et al., 2008) y la diabetes (Lu et al., 2008) así como en la búsqueda de biomarcadores en trastornos neurodegenerativos (Abdi et al.2006) aunque en el LCR.

30 Monitoreo de Reacciones Múltiples Seleccionadas (mSRM o MRM)

MRM es el tipo de escaneo con el ciclo de servicio más alto y se usa para monitorear una o más transiciones iónicas específicas a alta sensibilidad. Aquí, Q1 se fija en la m/z parental específica (Q1 no está escaneando), la energía de colisión se fija para producir el fragmento cargado de diagnóstico óptimo de ese ión padre y Q3 se fija para la m/z

35 específica de ese fragmento. Sólo se detectarán iones con esta exacta transición. Históricamente utilizado para cuantificar moléculas pequeñas como metabolitos de fármacos, el mismo principio se puede aplicar a péptidos, ya sea residuos endógenos o aquellos producidos a partir de la digestión enzimática de las proteínas. Otra vez, históricamente los experimentos se realizaron con espectrómetros de masas de triple cuadrupolo pero la reciente introducción de diseños de instrumentos híbridos, que combinan cuadrupolos con trampas de iones, permite llevar a

40 cabo experimentos similares y mejorados. El instrumento QTRAP 4000 por lo tanto, permite realizar la cuantificación de péptidos y biomoléculas a muy alta especificidad y sensibilidad mediante monitoreo de reacciones múltiples (MRM). Esto es en gran parte debido al uso de la celda de colisión LINAC®, que permite posteriormente entrelazar muchos escaneos MRM en un experimento para detectar la presencia de muchos iones específicos (hasta 100 iones diferentes) en una mezcla compleja. En consecuencia en la actualidad es factible medir y cuantificar múltiples

45 péptidos de muchas proteínas en una sola separación cromatográfica. El área bajo el pico de MRM LC se usa para cuantificar la cantidad de analito presente. En un experimento de cuantificación típico, se genera una curva de concentración estándar para los analitos de interés. Después cuando la muestra desconocida se corre en condiciones idénticas, la concentración del analito en la muestra desconocida se puede determinar usando el área de pico y la curva de concentración estándar.

50 La muestra para diagnóstico se puede someter a análisis por MRM en un espectrómetro de masas con trampa de iones. Basándose en los perfiles de espectrometría de masas de las proteínas marcadoras descritas, se identifican a continuación péptidos trípticos únicos con masas específicas y secuencias de aminoácidos conocidas que poseen buenas características ionizantes. Después espectrómetro de masas se programa para examinar específicamente

55 péptidos de la masa y la secuencia específicas e informar su intensidad relativa de señal. Usando MRM es posible examinar hasta 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 100 proteínas marcadoras diferentes en una sola corrida de LC-MS. Las intensidades de los péptidos MRM de los biomarcadores específicos de la presente invención en la muestra para diagnóstico, se comparan con las encontradas en las muestras de sujetos sin EA lo que permite hacer el diagnóstico o el pronóstico de la EA.

60 El ensayo de MRM se puede hacer más verdaderamente cuantitativo mediante el uso de estándares de referencia internos que consisten en péptidos sintéticos de cuantificación absoluta (AQUA) correspondientes al péptido MRM de la proteína marcadora, donde uno o más átomos han sido sustituidos por un isótopo estable como carbono-13 o nitrógeno-15 y donde dichas sustituciones hacen que el péptido AQUA tenga una diferencia de masa definida respecto a la forma natural, más ligera, del péptido MRM derivado de la muestra para diagnóstico. Comparando la intensidad iónica relativa de los péptidos MRM y AQUA nativos se puede determinar así la concentración verdadera de la proteína parental en la muestra para diagnóstico. Se proporcionan métodos generales de cuantificación absoluta mediante dichos métodos de dilución isotópica en Gerber, Scott A, et al. "Absolute quantification of proteins

5 and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS" PNAS, 10 de junio de 2003. Vol 100. Nº 12. pp. 6940-6945.

En algunos casos, si bien es deseable utilizar estándares dopados de isótopos para proporcionar una cuantificación absoluta, en un experimento de SRM no es posible utilizar el enfoque AQUA descrito antes. En esos casos es posible utilizar un par de etiquetas (tag) isotópicas de masas, es decir dos etiquetas con idéntica estructura química 10 pero diferentes niveles de sustituciones isotópicas, donde cada una da una masa única. Usando dos formas de etiquetas de masas en tándem® (TMT), que difieran en la masa en 5 Da, es posible etiquetar péptidos de referencia sintéticos estándar SRM con una etiqueta ligera antes de mezclar para formar una referencia universal para todos los péptidos destinatarios de un ensayo. Cada muestra de un paciente se somete después a digestión con tripsina y los péptidos resultantes se etiquetan con una etiqueta de TMT pesada. Después se agrega a la muestra una alícuota

15 de los péptidos de referencia etiquetados con TMT para obtener una concentración final de péptidos de referencia que sea adecuada para el rango que se desea medir en la muestra del paciente. Luego la muestra con agregado de cantidades conocidas se somete a un ensayo SRM de dilución isotópica estándar y las concentraciones de los péptidos SRM de la muestra del paciente se calculan mediante comparación de las intensidades iónicas de la forma pesada con las de las concentraciones conocidas de la forma más ligera.

20 Una forma alternativa de análisis basado en MS para la cuantificación relativa o absoluta de péptidos regulados, identificados como posibles biomarcadores, es el método de TMT calibrator desarrollado por Proteome Sciences plc. Cantidades conocidas de péptidos sintéticos que representan fragmentos trípticos de los posibles biomarcadores con buen comportamiento MS/MS se etiquetan con cuatro de los seis reactivos del conjunto TMT6 de etiquetas

25 isobáricas de masas (TMT-128 a TMT-131) y se mezclan en determinadas proporciones. Esto permite diseñar e implementar rápidamente una curva de calibración multipuntos que refleje las concentraciones fisiológicas y/o modificadas por la enfermedad. Posteriormente, una muestra para diagnóstico tomada de un paciente que padece o se sospecha que padece la EA se etiqueta con TMT6-126 y la mezcla de calibración se agrega a la muestra de estudio. Durante el análisis MS/MS de péptidos individuales, se producen los iones reporteros etiquetados con TMT6

30 de los péptidos de calibración y se usan para establecer una curva de calibración. Después, la cantidad absoluta del péptido en la muestra de estudio se deriva fácilmente leyendo la intensidad del ion TMT6126 en la curva de calibración. Se puede obtener más información sobre ensayos TMTcalibrator del sitio web de Proteome Sciences (www.proteomics.com).

35 Un método preferido de diagnóstico comprende realizar un ensayo de unión para la proteína marcadora. Se puede utilizar cualquier contraparte de unión razonablemente específica. Preferentemente la contraparte de unión está etiquetada. Preferentemente el ensayo es un inmunoensayo, especialmente entre el marcador y un anticuerpo que reconoce la proteína, especialmente un anticuerpo etiquetado. Puede ser un anticuerpo producido contra toda o parte de ella, muy preferentemente un anticuerpo monoclonal o un antisuero policlonal antihumano de alta

40 especificidad por la proteína marcadora.

Por lo tanto, las proteínas marcadoras descritas antes son útiles para producir los anticuerpos correspondientes que se pueden utilizar para detectar el aumento o la disminución en la concentración de las proteínas marcadoras presentes en una muestra para diagnóstico. Dichos anticuerpos se pueden producir mediante cualquiera de los

45 métodos bien conocidos en el campo del inmunodiagnóstico.

Los anticuerpos pueden ser anti-cualquier estado biológicamente interesante de la proteína. Así, por ejemplo, se pueden producir contra la forma no glucosilada de una proteína que existe en el organismo en una forma glucosilada, contra una forma más madura de una proteína precursora, por ej. menos su secuencia señal, o contra

50 un péptido que acarrea un epítopo adecuado de la proteína marcadora.

La muestra se puede tomar de cualquier tejido corporal válido, especialmente líquido corporal, de un sujeto mamífero o no mamífero, pero preferentemente sangre, plasma, suero u orina. Otros líquidos corporales utilizables incluyen el líquido cefalorraquídeo (LCR), el semen y las lágrimas. Preferentemente el sujeto es una especie

55 mamífera como un ratón, rata, cobayo, perro o primate. Muy preferentemente el sujeto es un ser humano.

El inmunoensayo preferido se lleva a cabo midiendo la magnitud de la interacción proteína/anticuerpo. Se puede usar cualquier método de inmunoensayo conocido. Se prefiere un ensayo sándwich. En este método, un primer anticuerpo para la proteína marcadora se une a la fase sólida, por ejemplo al pocillo de una placa de microtitulación

60 de plástico, y se incuba con la muestra y con un segundo anticuerpo etiquetado específico para la proteína que se va a analizar. Alternativamente se puede usar un ensayo de captura de anticuerpos. En este caso, se permite que la muestra de prueba se una a una fase sólida y después se agrega el anticuerpo anti-proteína marcadora y se permite que se una. Después de eliminar por lavado el material sin unir, la cantidad de anticuerpo unido a la fase sólida se determina utilizando un anticuerpo secundario etiquetado, anti-el primer anticuerpo.

12 En otra realización, se realiza un ensayo competitivo entre la muestra y una proteína marcadora etiquetada o un péptido derivado de ella, donde estos dos antígenos compiten por una cantidad limitada del anticuerpo anti-proteína marcadora unido a un soporte sólido. La proteína marcadora etiquetada, o su péptido, se puede preincubar con el

5 anticuerpo de la fase sólida, mediante lo cual la proteína marcadora de la muestra desplaza parte de la proteína marcadora, o su péptido, unida al anticuerpo.

En otra realización, se permite que los dos antígenos compitan en una única incubación conjunta con el anticuerpo. Luego de eliminar por lavado del soporte el antígeno sin unir, se determina la cantidad de etiqueta unida al soporte y 10 se mide la cantidad de proteína en una muestra por comparación con curvas de titulación estándar establecidas previamente.

La etiqueta es preferentemente una enzima. El sustrato para la enzima puede ser, por ejemplo, formador de color, fluorescente o quimioluminiscente.

15 La contraparte de la unión en el ensayo de unión es preferentemente una contraparte de unión específica etiquetada, pero no necesariamente un anticuerpo. Generalmente la contraparte de la unión estará ella misma etiquetada, pero alternativamente se puede detectar mediante una reacción secundaria en la cual se genera una señal, por ejemplo a partir de otra sustancia etiquetada.

20 Es altamente preferible usar una forma amplificada del ensayo, mediante lo cual se produce una “señal” potenciada a partir de un nivel relativamente bajo de proteína a ser detectado. Una forma particular de inmunoensayo amplificado es un ensayo quimioluminiscente potenciado. Convenientemente, el anticuerpo se etiqueta con peroxidasa de rábano, que participa en una reacción quimioluminiscente con luminol, un sustrato de peróxido y un

25 compuesto que aumenta la intensidad y la duración de la luz emitida, usualmente 4-yodofenol o ácido 4hidroxicinámico.

Otra forma preferida de inmunoensayo amplificado es inmuno-PCR. En esta técnica el anticuerpo se une covalentemente a una molécula de ADN arbitrario que comprende cebadores de PCR mediante lo cual el ADN con 30 el anticuerpo unido a él es amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa. Véase E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 23: 522-529 (1995). La señal se lee como antes.

El uso de un inmunoensayo turbidimétrico rápido, potenciado con micropartículas, como el tipo realizado por M. Robers et al., "Development of a rapid microparticle-enhanced turbidimetric immunoassay for plasma fatty acid

35 binding protein, an early marker of acute myocardial infarction", Clin. Chem. 1998;44:1564-1567, disminuyó significativamente el tiempo del ensayo. Por consiguiente, debería ser posible la automatización total de cualquier inmunoensayo contemplado en un analizador de química clínica ampliamente utilizado como el sistema COBAS™ MIRA Plus de Hoffmann-La Roche, descrito por M.Robers et al. supra, o el sistema AxSYM™ de Abbott Laboratories, y ser aplicada al diagnóstico clínico de rutina de la enfermedad de Alzheimer.

40 Alternativamente, la muestra para el diagnóstico se puede someter a electroforesis en gel bidimensional para obtener un gel teñido en el cual la posición de la proteína marcadora es conocida y la intensidad relativa de la tinción de las manchas adecuadas en el gel, se puede determinar por densitometría y comparar con un control correspondiente o gel comparativo.

45 En otra realización la muestra para diagnóstico se puede someter a análisis utilizando un espectrómetro de masas como el monitoreo de reacciones múltiples (MRM) en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo o en determinados tipos de espectrómetros de masas con trampa de iones. Para cada proteína expresada diferencialmente es posible identificar un conjunto de péptidos trípticos con masa específica (masa parental) y

50 secuencia de aminoácidos conocida y que luego de la fragmentación liberan fragmentos de masa específica (masa de fragmentos) que son únicas para cada proteína. La detección de la masa de un fragmento de un ion padre de masa definida se conoce como transición.

La identificación de dichos péptidos proteotípicos se puede hacer basándose en los perfiles de la espectrometría de

55 masas de las proteínas expresadas diferencialmente vistos durante el descubrimiento de los biomarcadores, o se pueden diseñar in silico mediante algoritmos predictivos conocidos por los expertos. Después el espectrómetro de masas se programa para examinar específicamente solo las transiciones específicas de masa parental y masa de fragmentos seleccionadas para cada proteína e informa su intensidad de señal relativa. Usando MRM es posible examinar hasta 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 100 proteínas marcadoras diferentes en una sola corrida de LC-MS.

60 La abundancia relativa de los péptidos proteotípicos para cada proteína marcadora en la muestra para diagnóstico se compara con las encontradas en muestras de sujetos sin demencia lo que permite realizar el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Alternativamente se puede hacer una comparación con niveles de proteínas de muestras anteriores del mismo paciente lo que permite la evaluación pronóstica de la etapa o la velocidad de avance de la enfermedad de Alzheimer en ese paciente.

En otra realización de la invención el ensayo de MRM se puede hacer más verdaderamente cuantitativo mediante el uso de estándares de referencia internos que consisten en péptidos sintéticos de cuantificación absoluta (AQUA) correspondientes al péptido proteotípico de la proteína marcadora donde uno o más átomos han sido sustituidos por 5 un isótopo estable como carbono-13 o nitrógeno-15 y donde dichas sustituciones hacen que el péptido AQUA tenga una diferencia de masa definida respecto el péptido proteotípico nativo derivado de la muestra para diagnóstico. Una vez que se han producido péptidos AQUA equivalentes para cada péptido proteotípico de los biomarcadores de la enfermedad de Alzheimer expresados diferencialmente, se pueden mezclar para formar un estándar de referencia que después se agrega en cantidades conocidas en la digestión tríptica de la muestra del paciente. La muestra 10 combinada se somete después a un análisis programado en espectrómetro de masas en el cual se detecta la intensidad de las transiciones requeridas de los péptidos nativos y AQUA. Comparando la intensidad iónica relativa de los péptidos nativos de la muestra y de los péptidos de referencia AQUA agregados en cantidades conocidas, se puede determinar la concentración verdadera de la proteína parental en la muestra para diagnóstico. Se proporcionan métodos generales de cuantificación absoluta en Gerber, Scott A, et al. "Absolute quantification of

15 proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS" PNAS, 10 de junio de 2003. Vol 100. Nº 12. pp. 69406945.

Aún en otra realización más de la invención se puede realizar una cuantificación absoluta utilizando un ensayo TMT-SRM. Se etiquetan péptidos de referencia sintéticos estándar SRM correspondientes al péptido proteotípico de la 20 proteína marcadora con una etiqueta ligera de TMT que no tenga sustituciones de isótopos (etiqueta ligera) antes de mezclar para formar una referencia universal para todas las proteínas marcadoras de un ensayo. Cada muestra de un paciente se somete después a digestión con tripsina y los péptidos resultantes se etiquetan con la etiqueta de TMT que tiene cinco sustituciones isotópicas (etiqueta pesada). Después una alícuota de los péptidos de referencia etiquetados con TMT ligera se agrega a la muestra etiquetada con TMT pesada para obtener una concentración final

25 de péptidos de referencia que sea adecuada para el rango que se desea medir en la muestra del paciente. Luego la muestra con agregado de cantidades conocidas se somete a un ensayo SRM de dilución del isótopo estándar y las concentraciones de los péptidos SRM de la muestra del paciente se calculan mediante comparación de las intensidades iónicas de la forma pesada con las de las concentraciones conocidas de la forma más ligera.

30 Independientemente del método elegido para medir la proteína marcadora, el diagnóstico y el pronóstico de la enfermedad de Alzheimer no necesariamente requieren un paso de comparación de la concentración de la o las proteínas marcadoras con una muestra de control o de referencia, sino que se puede llevar a cabo con respecto a un valor de referencia predeterminado que se sabe que representa la presencia, o una etapa, de la enfermedad.

35 La invención se puede utilizar para determinar la etapa o la velocidad de avance de la demencia en la enfermedad de Alzheimer, si se desea, por referencia a los resultados obtenidos antes en el mismo paciente o por referencia a los valores estándar que se consideran típicos de la etapa o la velocidad de avance de la enfermedad. De esta manera, la invención se puede utilizar para determinar si, por ejemplo, después del tratamiento del paciente con un medicamento o sustancia con potencial terapéutico, la enfermedad ha avanzado o no, o la velocidad de avance de la

40 enfermedad se ha modificado. El resultado puede dar lugar a un pronóstico sobre el desenlace de la enfermedad.

La divulgación incluye además el uso con fines de diagnóstico (y por lo tanto posiblemente pronóstico) o terapéuticos de un material de contraparte que reconoce a, se une a, o tiene afinidad por, una proteína marcadora especificada antes. Así, por ejemplo, se pueden utilizar en el tratamiento anticuerpos para las proteínas marcadoras,

45 apropiadamente humanizados en caso necesario. El material de contraparte será generalmente un anticuerpo y se utilizará en cualquier formato compatible con el ensayo, convenientemente un formato inmovilizado, por ejemplo, como microesferas o un chip. Cada material de contraparte se etiquetará o será capaz de interaccionar con una etiqueta.

50 La divulgación incluye además un kit para usar en un método de diagnóstico y seguimiento del pronóstico de la enfermedad de Alzheimer, que comprende un material de contraparte, como el descrito antes, en un formato compatible con el ensayo, según se describió antes, para la interacción con una proteína marcadora presente en una muestra para diagnóstico.

55 También se contempla en la invención el uso de (i) un chip de anticuerpos o un arreglo de chips, o un arreglo de microesferas en suspensión capaces de detectar una o más proteínas expresadas diferencialmente en la enfermedad de Alzheimer.

El método puede comprender además determinar un tratamiento eficaz para tratar la enfermedad de Alzheimer.

60 En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento mediante el uso de un agente que restaurará la expresión de una o más proteínas expresadas diferencialmente en la enfermedad de Alzheimer a la encontrada en el estado normal, para prevenir la aparición o el avance de la enfermedad de Alzheimer. Preferentemente, la expresión de la proteína se restaura a la del estado normal.

14 En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método mediante el cual el patrón de proteínas expresadas diferencialmente en una muestra de tejido o de líquido corporal de un individuo con la enfermedad de Alzheimer se usa para predecir el tratamiento más adecuado y eficaz para aliviar dicha enfermedad.

5 También se proporciona un método de evaluación de un agente para determinar su utilidad en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende:

(a) obtener una muestra de un tejido apropiado tomada de, o representativa de, un sujeto que tiene los síntomas de 10 la enfermedad de Alzheimer, que ha sido tratado con el agente que se está evaluando;

(b)

determinar la presencia, la ausencia o el grado de expresión de la proteína o proteínas expresadas diferencialmente en el tejido del, o representativo del, sujeto tratado; y,

(c)

seleccionar o rechazar el agente en función de la medida en que éste cambia la expresión, la actividad o la

cantidad de la proteína o proteínas expresadas diferencialmente en el sujeto tratado que tiene los síntomas de la 15 enfermedad de Alzheimer.

Preferentemente, el agente se selecciona si convierte la expresión de la proteína expresada diferencialmente a la de un sujeto normal. Más preferentemente, el agente se selecciona si convierte la expresión de la proteína o proteínas en la del sujeto normal.

20 También se proporciona un método de evaluación de un agente para determinar su utilidad en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende:

(a) obtener en el tiempo muestras de un tejido o líquido corporal apropiado tomadas de, o representativas de, un

25 sujeto que tiene los síntomas de la enfermedad de Alzheimer, que ha sido tratado con el agente que se está evaluando;

(b) determinar la presencia, la ausencia o el grado de expresión de una proteína o proteínas expresadas

diferencialmente en dichas muestras; y, 30

(c) determinar si el agente afecta al cambio con el paso del tiempo en la expresión de la proteína expresada diferencialmente en el sujeto tratado que tiene los síntomas de la enfermedad de Alzheimer.

La muestras tomadas en el tiempo se pueden tomar a intervalos de semanas, meses o años. Por ejemplo, las 35 muestras se pueden tomar a intervalos mensuales, bimestrales, trimestrales, cuatrimestrales, semestrales, cada ocho meses o cada doce meses.

Un cambio en la expresión con el paso del tiempo puede ser un aumento o una disminución en la expresión, en comparación con el nivel inicial de expresión en las muestras del sujeto y/o en comparación con el nivel de 40 expresión en las muestras de un sujeto normal. El agente se elige si desacelera o detiene el cambio de expresión con el paso del tiempo.

En los métodos de evaluación descritos antes, los sujetos que tienen niveles diferenciales de expresión de la proteína comprenden: 45

(a)

sujetos normales y sujetos que tienen la enfermedad de Alzheimer; y,

(b)

sujetos que tienen los síntomas de la enfermedad de Alzheimer que no han sido tratados con el agente, y sujetos que tienen la enfermedad de Alzheimer que han sido tratados con el agente.

50 Diagnóstico y pronóstico

El término "diagnóstico", según se usa en este documento, incluye la provisión de cualquier información relativa a la existencia, inexistencia o probabilidad de EA en un paciente. Incluye además la provisión de información sobre el tipo o la clasificación del trastorno o de los síntomas que son o pueden ser experimentados en relación con la

55 misma. Abarca el pronóstico del curso médico de la afección. Incluye además información relativa a la edad de aparición.

Los métodos descritos en este documento son útiles tanto para el diagnóstico como para el pronóstico de la EA. Se puede indicar la enfermedad de Alzheimer si uno o más marcadores están presentes a mayores o menores 60 concentraciones.

Tratamiento

Se entenderá que en lo que se refiere al tratamiento, el tratamiento incluye cualquier medida adoptada por el médico para aliviar el efecto de la EA en un paciente. Por lo tanto, aunque la reversión del daño o la eliminación del daño o de los efectos de la EA es un objetivo deseable, el tratamiento eficaz también incluirá todas las medidas capaces de lograr la reducción en el grado del daño o en la gravedad de los efectos o en el avance.

5 La presente divulgación también puede proporcionar un método de tratamiento mediante el uso de un agente que restaurará la expresión de una o más proteínas expresadas diferencialmente en la enfermedad de Alzheimer a la expresión encontrada en el estado normal, para prevenir la aparición o el avance de la EA. Preferentemente, la expresión de la proteína se restaura a la del estado normal.

10 La presente divulgación también proporciona un método mediante el cual se usa el patrón de proteínas expresadas diferencialmente en una muestra de un individuo con EA para predecir el tratamiento más adecuado y eficaz para aliviar el daño neurológico y/o la demencia.

Métodos de ensayo

15 También se proporciona un método de evaluación de un agente para determinar su utilidad en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende:

(a) obtener una muestra de, o representativa de, un sujeto que tiene la EA, que ha sido tratado con el agente que se 20 va está evaluando;

(b) determinar la presencia, la ausencia o el grado de expresión de una proteína o proteínas marcadoras como las dadas a conocer en este documento en la muestra del, o representativa del, sujeto tratado; y,

25 (c) seleccionar o rechazar el agente en función de la medida en que éste cambia la expresión, la actividad o la cantidad de la proteína o proteínas marcadoras en el sujeto tratado que tiene los síntomas de la enfermedad de Alzheimer.

Preferentemente, el agente se selecciona si convierte la expresión de la proteína expresada diferencialmente a la de

30 un sujeto normal. Más preferentemente, el agente se selecciona si convierte la expresión de la proteína o proteínas en la del sujeto normal.

También se proporciona un método de evaluación de un agente para determinar su utilidad en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende:

(a) obtener en el tiempo muestras de, o representativas de, un sujeto que tiene los síntomas de la EA, que ha sido tratado con el agente que se está evaluando;

(b) determinar la presencia, la ausencia o el grado de expresión de una proteína o proteínas marcadoras como las 40 dadas a conocer en este documento en dichas muestras; y,

(c) determinar si el agente afecta al cambio con el paso del tiempo en la expresión de la proteína marcadora en el sujeto tratado que tiene los síntomas de la enfermedad de Alzheimer.

45 La muestras tomadas en el tiempo se pueden tomar a intervalos de semanas, meses o años. Por ejemplo, las muestras se pueden tomar a intervalos mensuales, bimestrales, trimestrales, cuatrimestrales, semestrales, cada ocho meses o cada doce meses.

Un cambio en la expresión con el paso del tiempo puede ser un aumento o una disminución en la expresión, en

50 comparación con el nivel inicial de expresión en las muestras del sujeto y/o en comparación con el nivel de expresión en las muestras de un sujeto normal. El agente se elige si desacelera o detiene el cambio de expresión con el paso del tiempo.

En los métodos de evaluación descritos antes, los sujetos que tienen niveles diferenciales de expresión de proteínas 55 comprenden:

(a)

sujetos normales y sujetos que tienen los síntomas de la enfermedad de Alzheimer; y,

(b)

sujetos que tienen los síntomas de la enfermedad de Alzheimer que no han sido tratados con el agente, y sujetos que tienen la enfermedad de Alzheimer que han sido tratados con el agente.

60 Anticuerpos

Los anticuerpos contra las proteínas marcadoras dados a conocer en este documento se pueden producir por métodos conocidos. Estos métodos de producir anticuerpos incluyen vacunar a un mamífero (ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con la proteína. Los anticuerpos se pueden obtener de los animales vacunados usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en el área y evaluar, preferentemente utilizando la unión del anticuerpo al antígeno de interés. El aislamiento de los anticuerpos o de las células productoras de anticuerpos de un animal puede ir acompañado del sacrificio del animal.

5 Como una alternativa o un complemento a la vacunación de un mamífero con una proteína, se puede obtener un anticuerpo específico para la proteína de una colección, producida recombinantemente, de dominios variables de inmunoglobulina expresados, por ejemplo utilizando el bacteriófago lambda o bacteriófagos filamentosos que presentan dominios de unión de inmunoglobulina funcionales en sus superficies; véase por ejemplo WO92/01047.

10 La colección puede ser sin exposición previa (naive), que se construye a partir de las secuencias obtenidas de un organismo que no ha sido vacunado con la proteína, o puede ser una construida usando secuencias obtenidas de un organismo que ha sido expuesto al antígeno de interés.

Los anticuerpos se pueden unir o producir contra cualquier estado biológicamente interesante de la proteína Así, por

15 ejemplo, se pueden producir contra la forma no glucosilada de una proteína que existe en el organismo en una forma glucosilada, contra una forma más madura de una proteína precursora, por ej. menos su secuencia señal, o contra un péptido que acarrea un epítopo adecuado de la proteína marcadora.

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, y pueden ser anticuerpos multiespecíficos (incluidos

20 biespecíficos), quiméricos o humanizados. Los anticuerpos utilizados en la presente invención se pueden modificar de varias maneras. De hecho, el término "anticuerpo" debe interpretarse que abarca cualquier sustancia de unión que tenga un dominio de unión con la especificidad necesaria. Por lo tanto, la divulgación abarca fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluidas las moléculas sintéticas y las moléculas cuya forma imita a la de un anticuerpo que le permite unirse a un antígeno o epitopo.

25 Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos, capaces de unirse a un antígeno u otra contraparte de la unión, son el fragmento Fab que consta de los dominios VL, VH, CI y CH1; el fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH1; el fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; el fragmento dAb que consta de un dominio VH; las regiones CDR aisladas y los fragmentos F(ab') 2, un fragmento bivalente que incluye

30 dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra. También están incluidos los fragmentos Fv de una sola cadena.

Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos se puede generar por técnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, pero no exclusivamente, los fragmentos F(ab') 2 que se pueden producir

35 mediante digestión con pepsina de la molécula del anticuerpo y los fragmentos Fab que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos de F(ab') 2. Alternativa, se pueden construir colecciones de expresión de Fab (Huse, et al., 1989, Science 246: 1275-1281) para permitir una rápida y fácil identificación de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada.

40 La expresión "anticuerpo monoclonal" según se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos con la excepción de las posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en menor cantidad. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir por el método descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature, 256:495, 1975 o se pueden producir por métodos recombinantes, véase

45 Cabilly et al, patente de los Estados Unidos Nº 4,816,567, o Mage y Lamoyi en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 79-97, Marcel Dekker Inc, Nueva York, 1987.

En el método del hibridoma, un ratón u otro huésped animal apropiado, se vacuna con el antígeno por vía subcutánea, intraperitoneal o intramuscular para obtener los linfocitos que producen o son capaces de producir los

50 anticuerpos que se unirán específicamente a las nanopartículas utilizadas para la vacunación. Alternativamente, se pueden inmunizar linfocitos in vitro. Después los linfocitos se fusionan con las células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, como polietilenglicol, para formar un hibridoma, véase Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986).

55 Los hibridomas, preparados de esta manera se pueden sembrar y cultivar en un medio de cultivo adecuado que contenga preferentemente una o más sustancias que inhiben la multiplicación o la supervivencia de las células de mieloma originales. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas contendrá usualmente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"); sustancias que evitan la multiplicación de las células deficientes

60 en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son las que se fusionan eficazmente, soportan un nivel de expresión del anticuerpo estable, elevado, por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio como el medio HAT.

Después se analiza el medio de cultivo en el cual se cultivan los hibridomas para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína. Preferentemente, la especificidad de la unión se determina mediante un enzimoinmunoanálisis de absorción (ELISA). Los anticuerpos monoclonales utilizados en la invención

5 son los que se unen específicamente a la proteína.

En una realización preferida de la divulgación, el anticuerpo monoclonal tendrá una afinidad mayor que una afinidad micromolar o mayor (es decir, una afinidad mayor que 10-6 mol) según lo determinado, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard, véase Munson & Pollard, Anal. Biochem., 107:220, 1980.

10 Después que se identifican los hibridomas que producen anticuerpos neutralizantes de la especificidad y afinidad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitantes y se cultivan por métodos estándar. Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado de Dulbecco y el medio RPMI-1640. Además, los hibridomas se pueden cultivar in vivo como tumores ascíticos en un

15 animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, del líquido ascítico o del suero, por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales como, por ejemplo, cromatografía con proteína A-Sefarosa, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o

20 cromatografía de afinidad.

El ácido nucleico que codifica los anticuerpos monoclonales utilizados en la invención se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos bien conocidos en el área, por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que sean capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos

25 murinos. Los hibridomas utilizados en la invención son una fuente preferida del ácido nucleico que codifica los anticuerpos o sus fragmentos. Una vez aislado, el ácido nucleico se liga en vectores de expresión o clonación, que después son transinfectados en células huésped, que pueden ser cultivadas de modo que los anticuerpos monoclonales se produzcan en el cultivo de la célula huésped recombinante.

30 Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente divulgación puede estar sujeto a mutaciones genéticas u otros cambios. Los expertos entenderán además que un anticuerpo monoclonal se puede someter a la tecnología de recombinación del ADN para producir otros anticuerpos, anticuerpos humanizados o moléculas quiméricas que retengan la especificidad del anticuerpo original. Dichas técnicas pueden implicar introducir ADN que codifica la región variable de la inmunoglobulina, o las regiones determinantes de

35 complementariedad (CDR), de un anticuerpo en las regiones constantes, o las regiones constantes además de las regiones marco, de una inmunoglobulina diferente. Véase, por ejemplo, EP 0 184 187 A, GB 2 188 638 A o EP 0 239 400 A. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en EP 0 120 694 A y EP 0 125 023 A.

Un anticuerpo contra una proteína marcadora descrito en este documento se unirá a dicha proteína.

40 Preferentemente, dicho anticuerpo se une específicamente a dicha proteína. Mediante “específico” se quiere dar a entender que el anticuerpo se une a dicha proteína con una afinidad significativamente mayor que la que presenta por otras moléculas.

Descripción detallada de la invención

45 La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo, en la cual el diagnóstico definitivo solo se puede hacer post mortem y en la cual los biomarcadores más prometedores hasta el momento se encuentran en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Un marcador sanguíneo, más accesible que el líquido cefalorraquídeo, tiene aplicación industrial y utilidad como auxiliar del diagnóstico, así como aplicaciones de

50 detección selectiva en la población.

Pueden existir diferencias en las proteínas plasmáticas entre pacientes con EA y controles no dementes (NDC). En los ejemplos, utilizamos etiquetado isobárico de masas para comparar los niveles plasmáticos de proteínas en pacientes con EA de deterioro lento y rápido, así como en sujetos NDC en un enfoque aleatorio (shotgun) 55 proteómico diseñado cuidadosamente. Las muestras de plasma se emparejaron por edad, género y deterioro cognitivo (cambio en la puntuación MMSE por año) y luego se agruparon para el análisis. La cuantificación relativa posterior y el análisis estadístico generaron una lista de las posibles proteínas capaces de distinguir los grupos de EA de los de NDC. Se validaron las proteínas elegidas mediante análisis de inmunotransferencia tipo western en un conjunto más amplio de muestras de 90 sujetos con probable EA y 50 sujetos NDC, en total. En esta cohorte, los 60 pacientes con EA presentaron niveles plasmáticos de gelsolina significativamente menores en comparación con los sujetos NDC. Además, los niveles de gelsolina se correlacionaron con la velocidad de avance de la enfermedad y fueron significativamente diferentes entre los pacientes con EA de deterioro lento y rápido. Además, se encontró que los niveles de inhibidor C1 de la proteasa estaban asociados al genotipo APOE £4 y los menores niveles de ceruloplasmina se correlacionaban con una edad de inicio más temprana. La gelsolina es, debido a su asociación

con la velocidad de avance de la EA, así como debido a su interacción informada con � amiloide (A�), un marcador sólido de la EA. Por otra parte, la gelsolina se puede incluir además ventajosamente en un grupo de biomarcadores, por ejemplo para usar en el seguimiento de la respuesta al tratamiento o en ensayos clínicos de fármacos.

5 Por lo tanto, damos a conocer la detección de gelsolina como un marcador sustituto del avance de la enfermedad de Alzheimer. En los ejemplos, esto se demuestra usando marcaje isobárico de proteínas. Este es un método de detección de ejemplo, pero en principio se puede emplear cualquier método adecuado de detección. Las ventajas particulares de esta técnica específica se demuestran más detalladamente a continuación en la sección de los ejemplos.

10 Además, es una enseñanza clave que se encuentran menores niveles plasmáticos de gelsolina en la enfermedad de Alzheimer y que demuestran estar asociados a la velocidad de avance de la enfermedad.

Demostramos, en algunas realizaciones, cómo una combinación de etiquetado isobárico de masas junto con

15 métodos más convencionales para la validación puede proporcionar información útil en el desarrollo de un biomarcador de la EA.

Se encontró que varias proteínas se producen en diferentes niveles en el plasma de sujetos con EA en comparación con NDC y se correlacionan con la velocidad de avance de la enfermedad o que se asocian con otros parámetros

20 clínicos como el genotipo de ApoE o la edad de inicio.

Definiciones

El término “anticuerpo” incluye antisuero policlonal, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos como

25 fragmentos Fab de una sola cadena, y anticuerpos elaborados por ingeniería genética. Los anticuerpos pueden ser quiméricos o de una única especie.

El término "proteína marcadora" o "biomarcador" incluye todas las formas biológicamente interesantes de la proteína identificada, incluidas las modificaciones post-traducción. Por ejemplo, la proteína marcadora puede estar presente

30 en el tejido corporal en forma glucosilada, fosforilada, multimérica o precursora.

El término “control” se refiere a un sujeto humano normal, es decir uno que no padece la enfermedad de Alzheimer.

La terminología “mayor/menor concentración.... en comparación con una muestra de control” no implica que se lleve

35 a cabo realmente un paso de comparación, puesto que en muchos casos será evidente para los técnicos con experiencia que la concentración es anormalmente alta o baja. Además, cuando se están siguiendo progresivamente las etapas de la EA, o cuando se está siguiendo el curso de un tratamiento, la comparación se puede hacer con la concentración observada previamente en el mismo sujeto en una etapa anterior de evolución de la enfermedad, o en una etapa anterior del tratamiento o antes de que el tratamiento haya comenzado. El término “diagnóstico” según se

40 usa en este documento, incluye determinar si un paciente tiene la enfermedad de Alzheimer y puede también incluir determinar la etapa a la cual ha avanzado (o regresado en el curso del tratamiento). El diagnóstico puede servir como base de un pronóstico sobre el desenlace futuro para el paciente.

La expresión “tejido corporal válido” o “tejido apropiado” significa cualquier tejido en el cual se puede esperar

45 razonablemente que la proteína marcadora se acumule en relación con la enfermedad de Alzheimer. Puede ser una muestra de líquido cefalorraquídeo o una muestra de sangre o un derivado de la sangre como plasma o suero.

La expresión “arreglo de anticuerpos” o “microarreglo de anticuerpos” significa un arreglo de elementos únicos direccionables sobre una superficie sólida continua, mediante el cual en cada elemento único direccionable se

50 inmoviliza un anticuerpo con especificidad definida por un antígeno de manera de permitirle la posterior captura del antígeno diana y la detección subsiguiente de la magnitud de dicha unión. Cada elemento único direccionable está separado en la superficie sólida de todos los otros elementos únicos direccionables de modo que la unión y la detección de los antígenos específicos no interfiera con ninguno de esos elementos únicos direccionables adyacentes.

55 La expresión "arreglo de microesferas en suspensión" significa una suspensión acuosa de una o más partículas distintas identificables, donde cada partícula contiene características codificantes referentes a su tamaño y color o señal fluorescente y para el cual todas las microesferas de una combinación particular de dichas características codificantes están recubiertas con un anticuerpo con una especificidad definida por un antígeno de manera de

60 permitirles la posterior captura del antígeno diana y la detección subsiguiente de la magnitud de dicha unión. Ejemplos de dichos arreglos se pueden encontrar en www.luminexcorp.com donde se describe la aplicación del arreglo de microesferas en suspensión xMAP® en el sistema Luminex® 100™.

La expresión “análisis en espectrómetro de masas” significa una medición cuantitativa de un analito diana usando el método de monitoreo de reacciones múltiples en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo con trampa de iones.

El término 'mutante' de un biomarcador como un polipéptido biomarcador utilizado en la invención debe tener su

5 significado normal en el área. Los mutantes se denominan a veces "variantes" o "alelos". La clave es detectar biomarcadores como los que se han establecido en este documento. Los marcadores pueden poseer variaciones individuales en forma de mutaciones o variantes alélicas entre los individuos que se están estudiando. Por consiguiente puede haber cierto grado de desviación de las SEC. ID Nº de ejemplo provistas en este documento. Las SEC. ID Nº provistas en este documento son para asistir al lector con experiencia en la identificación y el trabajo

10 con los polipéptidos/biomarcadores de la divulgación y no pretenden ser una definición restringida e inflexible de los polipéptidos individuales que se están analizando. Por lo tanto, se esperará la detección de diferencias de secuencia menores entre las SEC. ID Nº: provistas y las secuencias reales de los biomarcadores polipeptídicos dentro de los límites de la variación normal entre sujetos. Esto no debe afectar el funcionamiento de la invención.

15 El término «comprende» (contiene, consiste en, consta de) se debe entender que tiene su significado normal en el área, es decir, que incluye la característica o grupo de características establecidas, pero que el término no excluye que otra característica o grupo de características también esté presente.

Fragmentos/péptidos

20 Los técnicos apreciarán que los detalles de los biomarcadores analizados en este documento y, en particular las secuencias presentadas para ellos se proporcionan para facilitar su detección. La información importante que se está reuniendo es la presencia o ausencia (o nivel particular) de los biomarcadores en la muestra en estudio. No hay ningún requisito particular de que el polipéptido de longitud completa sea registrado. De hecho, a través de muchos

25 de los modos de detección adecuados de la espectrometría de masas indicados en este documento, la detección tiene lugar analizando fragmentos particulares del polipéptido de interés presentes, los cuales se toman para indicar la presencia del polipéptido biomarcador completo en la muestra. Por lo tanto la invención abarca la detección de fragmentos de los biomarcadores polipeptídicos. Por otra parte, los kits y péptidos de la divulgación pueden comprender fragmentos de los polipéptidos y no necesitan comprender las secuencias completas ejemplificadas en

30 este documento. Convenientemente el fragmento es lo suficientemente largo para permitir su identificación única por espectrometría de masas.

Por consiguiente un fragmento tiene adecuadamente al menos 6 aminoácidos de longitud, adecuadamente al menos 7 aminoácidos de longitud, adecuadamente al menos 8 aminoácidos de longitud, adecuadamente al menos 9

35 aminoácidos de longitud, adecuadamente al menos 10 aminoácidos de longitud, adecuadamente al menos 15 aminoácidos, adecuadamente al menos 25 aminoácidos, adecuadamente al menos 50 aminoácidos, adecuadamente al menos 100 aminoácidos, o adecuadamente la mayoría del polipéptido biomarcador de interés. Convenientemente un fragmento consiste en un fragmento pequeño del polipéptido biomarcador de interés, en tanto sea suficientemente largo para mantener una masa identificable.

40 Homología de secuencia e identidad

Aunque la homología de secuencias también puede considerarse en términos de similitud funcional (es decir, los residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto del presente

45 documento se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia. Las comparaciones de secuencias se pueden realizar a ojo o, más generalmente, con ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente accesibles. Estos programas informáticos disponibles pública y comercialmente pueden calcular el porcentaje de homología (como identidad porcentual) entre dos o más secuencias.

50 Se puede calcular el porcentaje de identidad en secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con otra secuencia y cada aminoácido de una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo por vez. Esto se llama alineamiento "sin espacios (ungapped)". Típicamente, dichos alineamientos sin espacios se realizan solo en un número relativamente corto de residuos (por ejemplo menos de 50 aminoácidos contiguos). Para la comparación de secuencias más largas, se utiliza una puntuación de espacios para

55 producir un alineamiento óptimo para reflejar con exactitud los niveles de identidad en secuencias relacionadas que tienen inserciones o deleciones una con respecto a otra. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit package (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Ejemplos de otros programas que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no exclusivamente, el paquete BLAST, FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403

60 410) y la suite GENEWORKS de herramientas de comparación.

En el contexto del presente documento, se toma una secuencia de aminoácidos homóloga para incluir una secuencia de aminoácidos que sea al menos 40, 50, 60, 70, 80 o 90% idéntica. Más convenientemente se tomará un polipéptido que tenga al menos 90% de identidad de secuencia con el biomarcador de interés como indicativo de la presencia de ese biomarcador; más convenientemente se tomará un polipéptido que sea 95% o más adecuadamente 98% idéntico a nivel de los aminoácidos para indicar la presencia de ese biomarcador. Convenientemente dicha comparación se hace sobre al menos la longitud del polipéptido o fragmento que está siendo analizado para determinar la presencia o ausencia del biomarcador de interés. Más convenientemente la

5 comparación se realiza a lo largo de toda la longitud del polipéptido de interés. Las mismas consideraciones se aplican a las secuencias de nucleótidos de ácidos nucleicos.

Enfermedad de Alzheimer

10 La enfermedad de Alzheimer (EA) es el trastorno neurodegenerativo más común y afecta a más de una de cada ocho personas mayores de 65 años (Blennow et al., 2006). La enfermedad implica grandes cargas financieras y otras para los sistemas de salud nacionales y un biomarcador que ayude al diagnóstico precoz o al seguimiento del avance de la enfermedad sería de gran valor para el desarrollo de nuevos tratamientos y en la práctica clínica. Se han realizado progresos considerables en la búsqueda de biomarcadores con marcadores derivados de las lesiones

15 patológicas conocidas - placas de beta amiloide (A�) (Glenner et al., 1984) y ovillos neurofibrilares (Lee y Trojanowski, 1992) - utilizando diversas técnicas para investigar los cambios bioquímicos en el líquido cefalorraquídeo (LCR), la sangre y otros tejidos y líquidos. Las fuentes más promisorias de biomarcadores en la EA son el LCR o el plasma sanguíneo, porque en comparación con el tejido cerebral, estos líquidos son más fácilmente accesibles y, en el caso del LCR, está en estrecho contacto con el sistema nervioso central (SNC), donde ocurren

20 los cambios bioquímicos claves. Sin embargo, la obtención de LCR a través de una punción lumbar es un procedimiento relativamente invasivo y tener a la mano un biomarcador sanguíneo representaría un avance significativo. Por consiguiente, los inventores se centraron en este objetivo.

La identificación de biomarcadores para la enfermedad de Alzheimer se puede abordar creando perfiles de sangre y

25 muestras de LCR con métodos altamente sensibles para identificar uno o más marcadores, es decir, proteínas, péptidos o metabolitos, capaces de distinguir los sujetos con EA y de control o para proporcionar información acerca del avance de la enfermedad o la respuesta al tratamiento. Los métodos de espectrometría de masas son altamente sensibles y por lo tanto adecuados para la identificación de marcadores en todo tipo de afecciones y se han publicado varios informes que utilizan la denominada proteómica aleatoria (shotgun) con etiquetas isobáricas para

30 analizar el proteoma de muestras de LCR (Abdi et al., 2006, Choe et al., 2007, DayOne et al., 2008) y muestras de sangre (Hergenroeder et al., 2008) para encontrar niveles alterados de proteína en enfermedades particulares o etapas de las enfermedades.

Los inventores llevaron a cabo la comparación de la sangre de pacientes con EA con deterioro lento (SND) y

35 deterioro rápido (FD) con sujetos de control no dementes (NDC). El objetivo fue identificar 1) cambios proteicos entre pacientes SND y FD para marcadores del avance de la enfermedad y 2) cambios entre pacientes con EA y NDC para determinar proteínas, características para el patrón de la enfermedad. La sección de ejemplos presenta los datos de las muestras que fueron investigadas usando etiquetado isobárico de proteínas y espectrometría de masas. Luego los cambios se examinaron y validaron por inmunotransferencia en un conjunto de datos más grande.

40 Métodos alternativos

El lector experto entenderá que las técnicas específicas ejemplificadas en este documento pueden variar si se desea utilizando alternativas fácilmente disponibles para lograr el mismo efecto. Por ejemplo, el análisis de los niveles de

45 gelsolina en una muestra de sangre se puede realizar mediante inmunotransferencias tipo western o por etiquetado isobárico de proteínas o por ELISA o por cualquier otro medio adecuado conocido en el área.

Por lo tanto, en algunas realizaciones la divulgación se refiere a un método que comprende:

50 a) proporcionar una muestra de sangre o una muestra que contenga proteínas derivadas de la sangre, de un sujeto

b) opcionalmente extraer el plasma de dicha sangre

c) opcionalmente procesar dicha sangre o dicho plasma para producir una muestra que contenga proteínas 55 derivadas de dicha sangre o dicho plasma

d) opcionalmente reducir al mínimo el contenido de proteína o proteínas abundantes de dicha sangre o dicho plasma

e) opcionalmente seleccionar por tamaño las proteínas de dicha sangre o dicho plasma

60 f) opcionalmente estabilizar las proteínas de dicha sangre o dicho plasma

g) opcionalmente concentrar las proteínas de dicha sangre o dicho plasma h) opcionalmente ajustar la amortiguación del pH de las proteínas de dicha sangre o dicho plasma

i) analizar la gelsolina en dicha muestra,

5 j) dicho análisis es, convenientemente, determinar la concentración o abundancia de dicho biomarcador, por ejemplo por etiquetado isobárico de proteínas,

k) comparar la concentración o abundancia de dicho biomarcador en la muestra del sujeto con la concentración o abundancia de dicho biomarcador en una muestra de un sujeto sano, o con una muestra/un valor de referencia.

10 Donde cualquier diferencia identificada en (k) indica los resultados establecidos en este documento, por ejemplo la detección de menores niveles de gelsolina en comparación con una muestra de un sujeto sano o una muestra de referencia, indica un aumento de la probabilidad de que el sujeto tenga la enfermedad de Alzheimer.

15 Adecuadamente, la muestra se proporciona in vitro. Los métodos de la invención se llevan a cabo in vitro. La extracción de la muestra no es un paso del método de la invención. De esta manera, la invención no se practica directamente en el organismo del ser humano o el animal.

Otras aplicaciones

20 Se describen varios dispositivos de análisis, kits o materiales que reconocen, se unen a, o tienen afinidad por, un polipéptido. El o los polipéptidos pueden comprender la gelsolina (número de referencia Swiss prot P06396; SEC. ID Nº: 1). El o los polipéptidos pueden comprender una o más proteínas elegidas entre

25 inhibidor C1 de la proteasa (SEC. ID Nº: 2) ceruloplasmina (SEC. ID Nº: 3) clusterina (número de referencia SwissProt P10909; SEC. ID Nº: 4) complemento c3 (P01024; SEC. ID Nº: 5) componente amiloide P sérico (P02743; SAP; SEC. ID Nº: 6)

30 alfa-2 macroglobulina (P01023; A2M; SEC. ID Nº: 7) gamma-fibrinógeno (P02679; SEC. ID Nº: 8) factor H del complemento (P08603; CFH; SEC. ID Nº: 9) apolipoproteina E (SEC. ID Nº:10).

35 Péptidos

Para cualquier polipéptido o conjunto de polipéptidos determinado que se detecte por análisis de espectrometría de masas, el análisis se puede realizar mediante las técnicas MRM mencionadas en este documento. En esta realización, ciertos péptidos únicos y en particular ciertas transiciones son especialmente ventajosas para detectar

40 los péptidos de interés. Éstos se seleccionan usualmente para que sean lo más representativos (o se pueden usar combinaciones como cualquiera o todos los péptidos que dan determinado nivel de representación si múltiples fragmentos/transiciones dan niveles similares). Las transiciones especialmente preferidas utilizadas para el seguimiento son las mencionadas en los ejemplos y/o las figuras adjuntos.

45 En particular, ciertos péptidos son útiles como estándares y/o controles en la realización de ensayos según la invención. Por ejemplo los péptidos siguientes son particularmente útiles para ayudar a la detección de los polipéptidos mencionados en este documento:

TABLA A

ID

Proteína Péptido SEC. ID. Nº:

1

clusterina TLLSNLEEAK SEC. ID Nº: 11

3*

clusterina IDSLLENDR SEC. ID Nº: 12

5

clusterina ALQEYR SEC. ID Nº: 13

6*

clusterina YNELLK SEC. ID Nº: 14

8

complemento c3 FYYIYNEK SEC. ID Nº: 15

9

complemento c3 LVAYYTLIGASGQR SEC. ID Nº: 16

11*

CFH SPDVINGSPISQK SEC. ID Nº: 17

12

CFH IDVHLVPDR SEC. ID Nº: 18

ID

Proteína Péptido SEC. ID. Nº:

13

CFH VGEVLK SEC. ID Nº: 19

14

alfa-2-m AIGYLNTGYQR SEC. ID Nº: 20

15

alfa-2-m TGTHGLLVK SEC. ID Nº: 21

18*

gamma-fibrinógeno YLQEIYNSNNQK SEC. ID Nº: 22

19

gamma-fibrinógeno LDGSVDFK SEC. ID Nº: 23

20

gamma-fibrinógeno VGPEADK SEC. ID Nº: 24

22

SAP VGEYSLYIGR SEC. ID Nº: 25

23

SAP AYSLFSYNTQGR SEC. ID Nº: 26

24

apoE LGPLVEQGR SEC. ID Nº: 27

25

apoE LQAEAFQAR SEC. ID Nº: 28

27*

gelsolina QTQVSVLPEGGETPLFK SEC. ID Nº: 29

29

gelsolina TASDFITK SEC. ID Nº: 30

30

gelsolina AVEVLPK SEC. ID Nº: 31

31

gelsolina HVVPNEVVVQR SEC. ID Nº: 32

*

el asterisco indica péptidos menos preferidos para MS

Son especialmente adecuados

TABLA B

ID

Proteína Péptido SEC. ID. Nº:

1

clusterina TLLSNLEEAK SEC. ID Nº:11

5

clusterina ALQEYR SEC. ID Nº:13

8

complemento c3 FYYIYNEK SEC. ID Nº:15

9

complemento c3 LVAYYTLIGASGQR SEC. ID Nº:16

12

CFH IDVHLVPDR SEC. ID Nº:18

13

CFH VGEVLK SEC. ID Nº:19

14

alfa-2-m AIGYLNTGYQR SEC. ID Nº:20

15

alfa-2-m TGTHGLLVK SEC. ID Nº:21

19

gamma-fibrinógeno LDGSVDFK SEC. ID Nº:23

20

gamma-fibrinógeno VGPEADK SEC. ID Nº:24

22

SAP VGEYSLYIGR SEC. ID Nº:25

23

SAP AYSLFSYNTQGR SEC. ID Nº:26

24

apoE LGPLVEQGR SEC. ID Nº:27

25

apoE LQAEAFQAR SEC. ID Nº:28

29

gelsolina TASDFITK SEC. ID Nº:30

30

gelsolina AVEVLPK SEC. ID Nº:31

31

gelsolina HVVPNEVVVQR SEC. ID Nº: 32

5 Los péptidos de esta tabla tienen cada uno la ventaja de un excelente comportamiento en los análisis de espectrometría de masas indicados en este documento. Los que más se prefieren son SEC. ID Nº: 30, 31 y 32, que son para la detección de gelsolina.

La solicitud se describe ahora a modo de ejemplo; los ejemplos están diseñados para ser de naturaleza ilustrativa y 10 no deben ser entendidos como limitantes de las reivindicaciones adjuntas. En los ejemplos, se hace referencia a las

23 figuras siguientes:

Breve descripción de las figuras

5 La figura 1 muestra gráficos. La figura 2 muestra una gráfica y algunos diagramas de barras. La figura 3A muestra un diagrama y algunos gráficos. En particular ésta muestra un diagrama de flujo de trabajo general para el análisis proteómico mediante etiquetado isobárico de proteínas. Los pasos que se muestran son: preparación diferencial de muestras, por ejemplo, muestras de plasma; digestión en solución con tripsina; etiquetar

10 individualmente y combinar en una sola muestra; purificación RP / SCX; LC/MS/MS; buscar datos y comparar con bases de datos; identificar y cuantificar las proteínas. La figura 3B muestra la tabla 1. La figura 4 muestra un diagrama, una gráfica y una transferencia. Análisis de inmunotransferencia tipo western de gelsolina en plasma humano de sujetos con EA y NDC. (A) (gelsolina) Box Plot muestra una disminución de la

15 gelsolina en EA (p = 0.001), pero B) (sensibilidad) el análisis ROC con gelsolina no mostró características de prueba favorables. La figura 5 muestra una tabla de transiciones MS útiles para la medición de la gelsolina en un ensayo de MRM. La figura 6 muestra un cromatograma iónico total de 192 transiciones que representan 32 biomarcadores peptídicos de EA. Las transiciones relacionadas con gelsolina se encuentran en los picos Nº 27 - 32. (A) Un SRM XIC para

20 péptidos plasmáticos 1-32 etiquetados con TMTzero - y TMTsixplex. Se evaluaron todas las transiciones ubicadas en la tabla 1. Se puede observar que los pares de péptidos etiquetados con TMTzero y TMTsixplex eluyen conjuntamente. (B (recuadro)) MRM XIC muestra los péptidos que eluyen en la parte más ocupada del gradiente de LC (32 min - 42 min). (C (gráfico debajo de marcado 'gelsolina AVEVLPK')) MRM XIC para el péptido AVEVLPK de gelsolina. Las transiciones TMTzero para cada péptido son de color azul, rojo y verde, mientras que sus

25 contrapartidas etiquetadas con TMTsixplex son de color gris (2ª parte superior), cian (parte superior) y rosado (parte inferior). La figura 7 muestra la secuencia de la gelsolina humana. Cabe señalar que ciertas isoformas pueden diferir muy ligeramente en la secuencia, por ejemplo el número de registro Unigene IPI00026314 (ISOFORMA 1 de GELSOLINA) tiene 782 residuos de aminoácidos (tiene la secuencia de la figura 7 más otros dos residuos alanina en

30 781 y 782). En caso de cualquier duda, adecuadamente, SEC. ID Nº: 1 se debe tomar como la secuencia de referencia de gelsolina (Swiss Prot P06396). La figura 8 muestra la secuencia del inhibidor C1 de la proteasa humano (SEQ ID. NO: 2) La figura 9 muestra la secuencia de la ceruloplasmina humana (SEQ ID. NO: 3) Las figuras 10 y 17 muestran datos y diagramas de barras

35 La figura 18 se muestra una visión general del experimento. Se eligieron 10 enfermedades y 10 controles para cada proteína. Se realizaron tres digestiones en cada muestra (digestiones técnicas) seguidas de tres mediciones analíticas de cada digestión. Cada proteína tenía aproximadamente tres péptidos para cuantificar, que se determinaron a partir de tres pares de transiciones por péptido. Esto resultó en aproximadamente 3240 mediciones para cada proteína individual.

40 La figura 19A muestra un cromatograma de iones extraídos (XIC) de péptidos, etiquetados con TMT ligera y pesada. La muestra con etiqueta ligera representa el péptido endógeno para el plasma y la muestra con etiqueta pesada representa el estándar interno del péptido. Las transiciones relacionadas con gelsolina se encuentran en los picos Nº 27, 29, 30 y 31. Tras el pobre desempeño y la interferencia por el ruido de fondo del plasma, los péptidos 3, 6, 11, 18 y 27 se eliminaron del análisis.

45 La figura 19B muestra un XIC de la TMT ligera y la TMT pesada para el péptido 13. Una transición fue afectada por elevado ruido de fondo del plasma (coloreado en rosado; marcado con TMT pesada) y posteriormente, esta transición y su contraparte con TMT ligera correspondiente se eliminaron del análisis. La figura 20 muestra tablas de datos (95% de IC) relativos a las figuras 10 a 17.

50 Ejemplos

Visión general

Estudios recientes indican que pueden existir diferencias en los niveles plasmáticos de las proteínas en pacientes

55 con EA y controles no dementes (NDC). En el estudio actual, utilizamos etiquetado isobárico de masas para comparar los niveles plasmáticos de proteínas en 30 probables sujetos con EA y 15 sujetos NDC en un experimento proteómico aleatorio (shotgun) de descubrimiento. Las muestras plasmáticas se emparejaron por edad, género y mediciones cognitivas (puntuaciones MMSE) y se agruparon para el análisis. La cuantificación relativa posterior y el análisis de componentes principales generaron una lista de las posibles proteínas capaces de distinguir los dos

60 grupos de EA y de NDC. Se validaron las proteínas más importantes, es decir gelsolina, inhibidor C1 de la proteasa y ceruloplasmina mediante análisis de inmunotransferencia tipo western en un conjunto más amplio de muestras de 90 sujetos con probable EA y 50 sujetos NDC en total.

En esta cohorte, los pacientes con EA presentaron niveles plasmáticos de gelsolina significativamente menores en comparación con los sujetos NDC. Además, los niveles de gelsolina se correlacionaron con la velocidad de avance de la enfermedad y fueron significativamente diferentes entre los pacientes con EA de deterioro lento y rápido. Además, se encontró que los niveles de inhibidor C1 de la proteasa estaban asociados al genotipo APOE £4 y los menores niveles de ceruloplasmina se correlacionaban con una edad de inicio más temprana. La gelsolina es,

5 debido a los niveles cambiados y su asociación con la velocidad de avance de la EA, así como debido a su interacción informada con � amiloide (A�), un marcador excelente. Por otra parte, este marcador debe ser incluido ventajosamente en grupos de biomarcadores para la EA.

Las abreviaturas siguientes tienen el significado indicado: EA enfermedad de Alzheimer; A� amiloide �; FD deterioro

10 rápido; SND pacientes con Alzheimer con deterioro lento/sin deterioro; NDC pacientes de control de la enfermedad de Alzheimer no dementes; APOE apolipoproteína E; TMT etiquetas de masas en tándem; (MRM monitoreo de reacciones múltiples); inh C1 proteína inhibidora C1 de la proteasa plasmática; SNC Sistema Nervioso Central; LCR líquido cefalorraquídeo; PBS-T solución salina amortiguada con fosfato que incluye 0.01% de Tween 20; TCEP Tris (2-carboxietil)fosfina; RT temperatura ambiente; TFA ácido trifluoracético; RP fase reversa; SCX intercambio

15 catiónico fuerte; LC/MS/MS cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem; PCA análisis de componentes principales; PLS-DA mínimos cuadrados parciales con análisis discriminante; ROC curva receptoroperador.

Ejemplo 1: Elección de sujetos y mezclas

20 La población del estudio principal se derivó de una población en gran medida basada en la comunidad de sujetos con enfermedad de Alzheimer y personas mayores [cohorte de Alzheimer's Research Trust (ART)] y se evaluó mediante varias medidas cognitivas incluidas la escala del mini examen del estado mental (MMSE) y la escala de evaluación de la enfermedad de Alzheimer-subescala cognitiva (ADAS-cog). Las muestras se emparejaron por edad,

25 género y puntuaciones MMSE al inicio entre grupos, y por edad, género y disminución de MMSE dentro de los grupos. Las muestras se recolectaron en tubos de vidrio recubiertos con EDTA y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis posterior.

Para el experimento de descubrimiento, se analizaron las muestras de plasma de los grupos de FD y SND al inicio

30 (año 1) y después de dos años (año 3); se obtuvo una sola muestra de plasma de cada sujeto en el grupo NDC. Se dispuso de un total de 15 muestras por grupo (75 muestras en total) y estas se agruparon en tres conjuntos de cinco muestras. Esto dio lugar a un total de 15 mezclas para el análisis posterior. La clasificación de las muestras de EA para uno de los dos grupos - deterioro rápido y deterioro lento - se realizó según la disminución en sus puntuaciones de MMSE por año, en los dos años. Las muestras de los pacientes con una disminución de 0-3 puntos por año en la

35 escala MMSE se clasificaron como pacientes con EA de deterioro lento, mientras que las muestras de los pacientes con una disminución anual de 6 o más puntos en la escala MMSE se asignaron al grupo de deterioro rápido. Las muestras mezcladas se emparejaron por edad y género (Tabla 1a). Los sujetos de las mezclas de deterioro rápido tenían una edad promedio de 78 años, una puntuación promedio de MMSE al inicio de 18-20 y una media de disminución de 11 puntos al año en la escala MMSE. Por otra parte, los sujetos de las mezclas de deterioro lento

40 tenían una edad promedio de 80-82 años, una puntuación media de MMSE al inicio de 18-21 y una disminución promedio de 2 puntos al año en la escala MMSE. En comparación, los sujetos de las mezclas de NDC tenían una edad promedio de 78 años y también se emparejaron por género.

A efectos de la validación, se utilizó un conjunto más grande de muestras, que incluyó las muestras originales. En

45 total, 90 pacientes con EA se compararon con 50 controles (Tabla 1 b). El estudio fue aprobado por los comités éticos de investigación pertinentes.

Ejemplo 2: Preparación de la muestra

50 En el ejemplo 3, se demostró la detección de proteínas por etiquetado isobárico de proteínas. Este ejemplo explica cómo se puede preparar la muestra ventajosamente para ese análisis. Por supuesto si se utiliza un análisis diferente, entonces se podría elegir una preparación de la muestra distinta.

En general, la preparación de la muestra y el etiquetado con etiquetas de masas en tándem (TMT) se realizó como

55 se describió previamente (DayOne et al., 2008) con modificaciones menores. Para aumentar el número de proteínas detectables, se redujo al máximo el contenido de las seis proteínas más abundantes en el plasma (albúmina, transferrina, IgG, IgA, antitripsina y haptoglobina) con un sistema de eliminación por afinidad múltiple (MARS, 51885332, Agilent, Palo Alto, CA). Se diluyeron 30 μl de plasma mezclado 1:4 por agregado de 90 μl de tampón A de MARS, se agitaron con vórtex y se centrifugaron durante 1 min a 15'500 x g. Se inyectaron 100 μl del sobrenadante

60 en una columna MARS de 4.6 mm x 50 mm y se procesaron según las instrucciones del fabricante. El flujo a través de las fracciones (1 ml) se recogió y transfirió a dispositivos de filtros centrífugos MWCO de 5 kDa (Vivaspin 4, VS0414, Sartorius, Goettingen, Alemania) para el intercambio del tampón y la concentración de la proteína. Después del agregado de 3 ml de bicarbonato de trietilamonio 100 mM (TEAB) de pH 8.2, los tubos se centrifugaron a 2'000 x g a 4 °C durante 30 min. Posteriormente, se añadieron 3 ml de TEAB y se centrifugó durante 30 min, se añadieron otros 3 ml de TEAB y se centrifugó durante 60 min hasta que el volumen remanente fue entre 50-100 μl. El volumen se ajustó a 150 μl y se determinó el contenido de proteína de cada mezcla de plasma con un ensayo Bradford convencional (Protein Assay, Bio-Rad, Hercules, CA).

5 Ejemplo 3: Detección de proteínas

En principio, la detección de proteínas se puede hacer por cualquier medio adecuado conocido por los lectores expertos. La técnica de etiquetado isobárico de proteínas se describe a continuación a modo de ejemplo.

10 Para asegurar cantidades iguales de proteína, se transfirieron 100 μg de proteína por cada muestra a un tubo nuevo, se agregaron 5 μl de SDS al 2% en H2O (p/p) y se llenó hasta 100 μl con TEAB 100 mM. Se agregaron 5.3 μl de clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 20 mM en H2O y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Posteriormente, se agregaron 5.5 μl de yodoacetamida 150 mM en acetonitrilo (ACN) y se incubó en la oscuridad durante 60 min a RT. Posteriormente, se agregaron 10 μL de tripsina recién preparada (tripsina

15 modificada grad SEQ, Promega, V5111, Madison, WI, Estados Unidos) a una concentración de 0.4 μg/μl en TEAB 100 mM y se incubó durante la noche a 37 °C.

Las 15 mezclas de plasma se dividieron para el análisis en tres experimentos individuales (repeticiones biológicas), mientras que uno de estos experimentos se repitió tres veces para la repetición técnica. En cada uno de los tres 20 experimentos individuales, las mezclas de plasma se etiquetaron con iones reporteros de TMT 60 mM (Proteome Sciences Plc, Londres, Reino Unido) en 40.3 μl de ACN durante 1 hora a temperatura ambiente de la manera siguiente: m/z 126.1: FD año 1, 127.1: FD año 3, 128.1: SD año 1, 129.1: SD año 3, 130.1: NDC, 131.1: plasma de referencia Dade de Behring. El plasma Dade de Behring se analizó en todos los experimentos para permitir la comparación entre experimentos. Luego de la incubación, se agregaron 8 μL de hidroxilamina al 5% en H2O (p/v) a

25 cada tubo y se mezcló durante 15 min. Las seis muestras se mezclaron en un tubo nuevo y se diluyeron 1:6 con ACN al 5% y ácido trifluoroacético (TFA) al 0.1% en H2O para la reducción del contenido de ACN.

Ejemplo 4: Preparación para el análisis MS

30 En este ejemplo las proteínas etiquetadas se detectan utilizando espectrometría de masas (MS). Para evitar los efectos negativos de los reactivos excesivos y el alto contenido de sal en el análisis de MS, las muestras se purificaron manualmente y se desalinizaron en un colector de vacío (Thames Restek UK Limited, 26077, Saunderton, Reino Unido) con columnas de fase reversa (RP) (Waters Corporation, Oasis HLB cartridge, WAT094225, Milford, MA, EE.UU.) seguidas de columnas de intercambio catiónico fuerte (SCX) preparadas a partir

35 de cartuchos vacíos (Macherey-Nagel GmbH & Co KG, 732501, Dueren, Alemania) y suspensión de sefarosa (Sigma-Aldrich, SP Sepharose Fast Flow, S1799-100ML, St. Louis, MO, EE.UU). La muestra eluida se liofilizó en un concentrador speed vac, se disolvió en 2 ml de H2O, se evacuó nuevamente hasta sequedad y se almacenó a -80 °C hasta el análisis posterior.

40 Espectrometría de masas

Para el análisis LC/MS/MS, las muestras se reconstituyeron en 100 μl de tampón de bicarbonato de amonio 50 mM durante 10 min a 37 °C. A continuación, las muestras se volvieron a diluir (1:60) en bicarbonato de amonio hasta una concentración aproximada de 0.1 μg/μl.

45 Se llevó a cabo una cromatografía de fase reversa utilizando un sistema de LC Ultimate (Dionex, Camberley, Reino Unido). Los péptidos se resolvieron en una columna C18 PepMap (75 μm de D.I.) usando un gradiente lineal de tres pasos de 0-48% de ACN / ácido fórmico al 0.05% en 120 min a una velocidad de flujo de 200 nL/min. Los péptidos se ionizaron con ionización por electronebulización usando una fuente Z-spray adaptada a un QTof-micro (Waters

50 Ltd, Elstree, Reino Unido) operando con el software Masslynx v 4.0. El instrumento se ejecutó en modo de conmutación automático, seleccionando los iones precursores basándose en su intensidad y estado de carga para secuenciar mediante fragmentación inducida por colisión. Se realizó un MS/MS usando perfiles de energía de colisión basados en las relaciones masa/carga (m/z) y optimizados para la fragmentación de péptidos etiquetados con TMT. Los datos brutos se volvieron a calibrar contra péptidos del complemento C3 internos y se procesaron en

55 listas de picos usando ProteinLynx Global Server v 2.2.5 con los parámetros de procesamiento de MS/MS siguientes: suavizado por el método de Savitzky-Golay, 2 iteraciones, 4 canales; determinación del centroide del pico máximo 80%, sin deisotopado ni sustracción del ruido de fondo.

Ejemplo 5: Identificación de proteínas

60 Las proteínas se identificaron en cada experimento de TMT buscando los datos de la lista de picos de MS contra la base de datos humana de IPI (versión v3.32) como una sola búsqueda utilizando Mascot (v2.2; http://www.matrixscience.com/). Se emplearon las especificaciones de parámetros siguientes: tolerancia de masa del ion precursor 150 ppm, tolerancia de masa de los iones fragmento 0.6 Da, péptidos trípticos con hasta tres escisiones faltantes, modificaciones variables: carbamidometilación de cisteína, oxidación de metionina y etiquetado TMT de funciones épsilon-amino de los residuos de lisina y el extremo N-terminal del péptido. El archivo Mascot resultante contiene información sobre las proteínas identificadas y se puede utilizar para la inspección manual de los espectros. Los archivos de listas de picos también se procesaron utilizando TiTRE (v1.6), un software de desarrollo

5 interno, para extraer los datos del ion reportero. Esto se asoció posteriormente a los resultados de la búsqueda con Mascot.

Se procesaron los resultados de la búsqueda para reportar solo asignaciones con una puntuación iónica MS/MS >20 y una asignación de secuencia de calidad uno. Para las búsquedas de iones MS/MS con Mascot, una asignación de 10 calidad uno es la puntuación más alta de coincidencia de la secuencia para una consulta MS/MS. Estas asignaciones de péptidos se evaluaron en cuanto a "unicidad", es decir, si la secuencia asignada solo se produjo dentro de esa proteína la asignación fue 'única', o si la secuencia asignada también estuvo presente en otras proteínas la asignación fue 'no única'. Se validaron hits de proteínas que fueron asignados con menos de dos péptidos únicos con puntuación por encima de la puntuación de identidad de Mascot (generalmente �40), que

15 corresponde a un 5% de posibilidad de falsos positivos en la asignación de péptidos, por inspección manual de los espectros de masas de los péptidos asignados.

Las intensidades de los iones reporteros se expresaron cada una como una relación con el estándar plasmático de referencia y se convirtieron a valores log10. Los datos se normalizaron restando el valor mediano del log10 de las

20 relaciones del ion reportero (un factor de normalización global) de cada valor individual, de modo que la mediana del log10 de las relaciones del ion reportero normalizadas fuera cero.

De la experiencia previa, el umbral mínimo en el cual las intensidades del ion reportero se podían determinar confiablemente utilizando el instrumento Qtof micro fue 40 conteos. Debajo de este umbral, las relaciones de las 25 proteínas observadas no son representativas de las relaciones reales debido a la estadística pobre del ion. Por esta razón, los péptidos con intensidades de ion reportero en el plasma de referencia por debajo de 40 conteos se excluyeron de la cuantificación. Además, los péptidos que se etiquetaron de forma incompleta con TMT y los que contienen metionina se eliminaron del conjunto de datos. Se observó que las asignaciones correspondientes a etiquetado TMT incompleto o que contenían residuos de metionina cuantificaban de manera diferente de la

30 población principal de asignaciones y a menudo no eran representativas de las diferencias reales en las cantidades de proteína. En este último caso, las relaciones del ion reportero parecieron rastrear la oxidación diferencial de metionina entre las muestras.

Se reunieron los conjuntos de datos normalizados de modo que las proteínas identificadas en diferentes repeticiones 35 de los experimentos biológicos se alinearan.

Ejemplo 6: Análisis multivariable

Los conjuntos de datos alineados del ejemplo 5 se importaron al software SIMCA-P (versión 11.5). Todas las

40 variables (media del log10 de las relaciones del ion reportero para cada proteína) se escalaron a la varianza de la unidad y las variables con más de 50% de valores faltantes se excluyeron de los análisis. Inicialmente, los datos se resumieron mediante análisis de los componentes principales (PCA) para comprobar la presencia de valores atípicos fuertes o de otros problemas en el conjunto de datos que necesitarían ser abordados. A continuación, se usó mínimos cuadrados parciales con análisis discriminante (PLS-DA) para identificar proteínas que diferían entre los

45 grupos.

Análisis TMT de las muestras de plasma

Para investigar el proteoma plasmático de pacientes con EA de deterioro lento y rápido y de controles no dementes,

50 se etiquetaron 15 muestras por grupo, agrupadas en 3 conjuntos, con etiquetas isobáricas para proteínas y se analizaron por espectrometría de masas. Un total de 2365 consultas se emparejaron con secuencias peptídicas a través de los cinco experimentos. Estos péptidos se relacionaron con un total de 152 secuencias de proteínas únicas. Después de eliminar las proteínas con más de 50% de las mediciones faltantes, un total de 52 proteínas identificadas contaron con datos cuantitativos para el análisis (Tabla 2). El análisis multivariable (PLS-DA) se usó

55 después para tratar de discriminar los diferentes grupos utilizando la media relativa de los datos de concentración de proteínas. Luego del ajuste del modelo, la validación cruzada indicó que los componentes significativos no se pudieron ajustar a los conjuntos de datos que contenían las observaciones de SD año 1 o año 3 y NDC.

Un modelo de tres componentes se ajustó al conjunto de datos de FD año 1 y NDC que explica un 99.5% de

60 varianza en los datos de la clase (R2Y). La figura 1 muestra las puntuaciones y los pesos para el modelo PLS-DA junto con parámetros adicionales que resumen el modelo. Un modelo similar de tres componentes que explica un 99.5% de varianza en los datos de la clase también se ajustó al conjunto de datos de FD año 3 y NDC.

Las proteínas más importantes para la discriminación de FD y NDC están resaltadas en la tabla 1. La importancia relativa de estas proteínas se jugó basándose en los coeficientes de regresión PLS en los modelos descritos previamente.

Ejemplo 7: Análisis de inmunotransferencia tipo western

5 Como se ha señalado a lo largo de la solicitud, el etiquetado isobárico de proteínas es solo una manera en que puede llevarse a cabo la detección de los marcadores utilizados en la invención. Para la validación de los datos obtenidos mediante etiquetado isobárico de proteínas, se analizaron proteínas seleccionadas por inmunotransferencia tipo western en un conjunto más grande de muestras. Se diluyeron muestras plasmáticas de la

10 manera siguiente: 4 μl de plasma sin procesar, 96 μl de PBS que contenía cóctel inhibidor de la proteasa (Complete®, 1836145, Roche Applied Science, Penzberg, Alemania) y 100 μl de 2x tampón de muestra (Laemmli, S3401, Sigma), se calentaron a 100 °C durante 5 min, se centrifugaron a 15'500 x g y se separaron en geles de SDS poliacrilamida (NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris Midi Gel, 26W, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Después de transferir a membranas de nitrocelulosa de 0.2 μm (Schleicher & Schuell, BA-S 83, Keene, NH, USA) las

15 transferencias se bloquearon con leche descremada al 5% en PBS-Tween (PBS-T) al 0.1% se sondaron con anticuerpos para ceruloplasmina (ab8813, 1:50000, Abcam, Cambridge, Reino Unido) inhibidor C1 de la proteasa (ab36992, 1:2000, Abcam) y gelsolina (ab55070, 1:500, Abcam). Se detectaron los anticuerpos primarios con anticuerpos secundarios adecuados (dilución: 1:10000) conjugados a fluoróforos, que emiten a longitudes de onda de 700 o 800 nm, usando un equipo para obtención de imágenes por infrarrojo Odyssey (Licor, Lincoln, NE,

20 EE.UU.). El análisis densitométrico se realizó con el software Odisea v2.1.

Todas las muestras se corrieron por duplicado y, para el ajuste de las intensidades, se corrió una muestra de plasma de referencia en cada gel. Se sometieron volúmenes iguales de plasma a inmunotransferencia y densitometría cuantitativa posterior. Se construyó la relación de cada muestra con el plasma de referencia para permitir

25 comparaciones cuantitativas entre geles y se promediaron las corridas por duplicado. Al evaluar la reproducibilidad de los geles duplicados, se encontró una gran correlación positiva de 0.84 realizando una correlación de Pearson. Los resultados se analizaron para determinar la significación por la prueba t de Student utilizando el programa estadístico SPSS v15.0. Además, se realizó un análisis de curva receptor-operador (ROC) para evaluar la sensibilidad y especificidad.

30 Para confirmar los datos proteómicos, se analizaron proteínas seleccionadas del ejemplo 6 por inmunotransferencia tipo western para investigar la diferencia entre las muestras de los sujetos con EA y NDC encontrada en el análisis multivariable. Un alto valor absoluto de un coeficiente de PLS indica una importancia relativa alta de una cierta proteína en la separación de los grupos respectivos. Por lo tanto, seleccionamos 3 proteínas - gelsolina, inhibidor C1

35 de la proteasa (C1-inh) y ceruloplasmina - con los valores de coeficientes PLS más altos (Tabla 2) para la validación posterior en un conjunto de datos más grande. El conjunto de datos consistió en las muestras utilizadas para el estudio inicial y en muestras adicionales para contar con un total de 90 muestras de EA y 50 de NDC para comparar.

Se analizaron los resultados para determinar la significación utilizando pruebas t de Student y se pudo confirmar una

40 reducción muy significativa de los niveles de gelsolina (p = 0.001) en el plasma de pacientes con EA (Figura 2a). Los cambios en los niveles de inh C1 y ceruloplasmina parecen ser menos pronunciados y no alcanzaron significación estadística. Además se analizaron estas tres proteínas en relación con el genotipo de APOE, la puntuación MMSE como una medida de la gravedad, disminución de MMSE por año y también la edad de inicio. Se encontró que los niveles de gelsolina se correlacionaban con la disminución de MMSE por año (correlación de Pearson -0.209, p =

45 0.05). Este resultado es respaldado por el hecho de que, después de asignar los pacientes a los grupos de EA de deterioro lento y rápido aplicando criterios de clasificación idénticos a los del conjunto de datos inicial, se encontró que los niveles de gelsolina eran significativamente inferiores en el grupo de FD en comparación con SND (prueba t de Student; p = 0.019). Por lo tanto, se pudieron confirmar los resultados del análisis TMT (Figura 2b). Además, el inh C1 mostró una débil asociación con el número de alelos APOE £4 (correlación de Pearson -0.175; p = 0.043) y la

50 ceruloplasmina mostró una correlación con la edad de inicio (correlación de Spearman 0.231; p = 0.031).

Además, se realizó un análisis ROC para la gelsolina. El área bajo la curva fue altamente significativa (p = 0.001), pero la proteína no mostró características de prueba favorables: fijar la especificidad al 80% dio un valor de sensibilidad de 44%, mientras que fijar el valor de sensibilidad al 80% dio lugar a un valor de especificidad de 39%.

55 Resumen

Los inventores dan a conocer el primer análisis de plasma sin fraccionar con etiquetas isobáricas para proteínas en la enfermedad de Alzheimer.

60 Por otra parte, usando etiquetas de masas en tándem en un experimento proteómico aleatorio (shotgun) de descubrimiento, pudimos identificar varias proteínas capaces de diferenciar pacientes con enfermedad de Alzheimer de deterioro rápido y controles no dementes. Las proteínas potencialmente interesantes seleccionadas, se validaron en un conjunto de datos más grande con inmunotransferencia tipo western cuantitativa. Se demostró que los niveles plasmáticos de gelsolina disminuyeron en la EA en comparación con los controles y que los niveles también difieren entre los pacientes con EA de deterioro rápido y lento. Lo más importante es que los niveles de gelsolina se correlacionaron con el avance de la enfermedad.

5 Además, se encontró que los niveles de inhibidor C1 de la proteasa están asociados al genotipo APOE £4 y los menores niveles de ceruloplasmina se correlacionaron con una edad de inicio más temprana.

Ejemplo 8 - Descubrimiento y validación de marcadores para la enfermedad de Alzheimer mediante el etiquetado isobárico de proteínas

10 Se necesitan urgentemente biomarcadores para la enfermedad de Alzheimer (EA). Estudios recientes indican que existen diferencias en los niveles plasmáticos de las proteínas entre pacientes con EA y controles no dementes (NDC), lo que sugiere la posibilidad de un biomarcador periférico para la EA. En el estudio actual, utilizamos etiquetado isobárico de masas para comparar los niveles plasmáticos de proteínas en 30 probables sujetos con EA y

15 15 sujetos NDC en un enfoque proteómico aleatorio (shotgun). Las muestras plasmáticas se emparejaron por edad, género y mediciones cognitivas (puntuaciones MMSE) y se agruparon para el análisis. La cuantificación relativa posterior y el análisis de componentes principales generaron una lista de las posibles proteínas capaces de distinguir los dos grupos de EA y de NDC. Se validaron las proteínas más importantes, es decir gelsolina, inhibidor C1 de la proteasa y ceruloplasmina mediante análisis de inmunotransferencia tipo western en un conjunto más amplio de

20 muestras de 90 sujetos con probable EA y 50 sujetos NDC, en total. Para validar además algunos de los resultados, se utilizó monitoreo de reacciones múltiples (MRM), un método que no solo es altamente específico sino también de una gran sensibilidad, para analizar un subconjunto de muestras. En resumen, los pacientes con EA presentan niveles plasmáticos de gelsolina significativamente menores en comparación con los sujetos NDC. Además, se encontró que los niveles de inhibidor C1 de la proteasa se asociaban al genotipo APOE £4 y los menores niveles de

25 ceruloplasmina se correlacionaban con una edad de inicio más temprana. La gelsolina es, debido a sus niveles cambiados en la EA, así como debido a su interacción informada con � amiloide (Abeta), una proteína sumamente interesante con respecto a la EA y necesita evaluación adicional.

Un método general se muestra la figura 3A.

30 Etiquetado isobárico de proteínas utilizando LC/MS/MS

Se emparejaron un total de 2365 consultas con secuencias peptídicas a través de los cinco experimentos. Estos péptidos se relacionaron con un total de 152 secuencias de proteínas únicas. Incluidas solo las proteínas detectadas

35 en más del 50% de los experimentos, un total de 52 proteínas identificadas contaron con datos cuantitativos para el análisis. El análisis multivariable (PLS-DA) generó una lista de posibles proteínas (Tabla 1 - Figura 3B) capaces de discriminar los diferentes grupos de sujetos utilizando la media de los datos de las proteínas.

Tabla 1 (Figura 3B): lista de proteínas que potencialmente discriminan sujetos con EA y NDC. Altos valores

40 absolutos de los coeficientes PLS-DA indican una alta importancia de una proteína respectiva en la discriminación entre los grupos, en tanto que valores positivos/negativos indican mayores/menores niveles en el grupo de EA. T1 y T2 se refieren a las mediciones de muestras al inicio y el seguimiento de 2 años.

Inmunotransferencia tipo western

45 Para confirmar los datos proteómicos, se analizaron las proteínas seleccionadas por inmunotransferencia tipo western para investigar el cambio entre sujetos con EA y NDC extraído por análisis multivariable. Por lo tanto, seleccionamos 3 proteínas - gelsolina, inhibidor C1 de la proteasa y ceruloplasmina - con los valores de coeficientes PLS más altos (Tabla 1; en negrita) al inicio y en el seguimiento de 2 años, respectivamente, para la validación

50 posterior en un conjunto de datos más grande. El conjunto de datos consistió en las muestras utilizadas para el estudio inicial y en muestras adicionales para contar con un total de 90 muestras de EA y 50 de NDC para comparar. Los resultados se analizaron para determinar la significación mediante la prueba t de muestras independientes. Por primera vez, se pudo establecer una reducción muy significativa (p = 0.001) de los niveles de gelsolina en el plasma de pacientes con EA (Fig. 4A). Los cambios en los niveles de proteína inh C1 y ceruloplasmina parecen ser menos

55 pronunciados y no alcanzaron significación estadística. Se realizaron análisis de correlación con parámetros clínicos como puntuaciones MMSE, disminución de MMSE por año y edad de inicio y se analizaron para determinar si había una asociación con el genotipo ApoE e4. En resumen, el inhibidor C1 de la proteasa mostró una asociación significativa con los portadores de ApoE e4 (p = 0.035) y la ceruloplasmina mostró una correlación con la edad de inicio de la enfermedad (correlación de Spearman 0.231, p = 0.031), proporcionando por lo tanto una explicación

60 para los elevados valores de los coeficientes PLS-DA en el análisis multivariable.

Además, se realizó un análisis de característica operativa del receptor (ROC) para gelsolina (Fig. 4B). El área bajo la curva fue altamente significativa (p = 0.001), pero la proteína no mostró características de prueba favorables: fijar la especificidad al 80% dio un valor de sensibilidad de 44%, mientras que fijar el valor de sensibilidad al 80% dio lugar a un valor de especificidad de 39%.

Conclusiones:

5 • Los sujetos con EA presentaron niveles plasmáticos de gelsolina significativamente menores en comparación con los sujetos NDC

•

Se encontró que los niveles de inhibidor C1 de la proteasa están asociados al genotipo APOE £4.

•

Los niveles de ceruloplasmina mostraron una correlación positiva con la edad de inicio de la enfermedad.

10 El uso de gelsolina como biomarcador es merecido teniendo en cuenta sus cambios aparentes en el plasma entre los sujetos con EA y de control, y su interacción informada previamente con Ab (Chauhan et al., 1999, Ray et al., 2008).

Ejemplo 9: Monitoreo de reacciones selectivas de gelsolina como parte de un grupo más grande de biomarcadores 15 plasmáticos en la EA

Varias proteínas plasmáticas incluida la gelsolina han surgido como potenciales biomarcadores de la EA a partir de ejercicios de descubrimiento. Son necesarios ensayos para la validación de estas posibles sustancias de interés; los enfoques basados en SRM son una alternativa atractiva al ELISA debido a la sensibilidad y selectividad de la 20 técnica, la capacidad para multiplexar y la limitada disponibilidad de anticuerpos. En este documento, se miden péptidos distintivos únicos para la proteína de interés para proporcionar información cuantitativa de la proteína en la muestra. La exactitud en la cuantificación de los analitos de interés mediante SRM se puede mejorar combinando con TMT ya que esto permite la incorporación de una referencia interna en el análisis. Los resultados iniciales demostraron que TMT SRM es un método de cuantificación de péptidos preciso y reproducible. Ahora nos movemos

25 para proporcionar un análisis completo de TMT SRM permitiendo la evaluación de ocho potenciales biomarcadores en muestras plasmáticas de EA y de control.

Utilizando datos de MS/MS existentes, se seleccionaron al menos tres péptidos por proteína para la cuantificación y los péptidos representativos para gelsolina se muestran en la figura 5. Los criterios de selección incluyeron; sin 30 escisiones con tripsina faltantes, sin modificaciones variables (in vivo o experimentales) y cada uno fue proteotípico (único). Las versiones sintéticas de cada péptido se prepararon y etiquetaron con TMTzero para actuar como una referencia para la cuantificación. Los péptidos se infundieron en un QTRAP 4000 (Applied Biosystems) y se obtuvieron los datos de MS/MS. Se eligieron los iones fragmento óptimos para todos los péptidos a fin de facilitar la detección máxima de cada uno en Q3. Se calcularon las masas de los iones fragmento etiquetados con TMTsixplex 35 correspondientes y se optimizaron los parámetros del instrumento de MS para los pares de transición Q1 y Q3 individuales. Se digirió una muestra de plasmas mezclados, etiquetada con TMTsixplex y se combinó con los péptidos de referencia etiquetados con TMTzero. Se realizó un análisis LC/MS/MS utilizando un nano LC Ultimate 3000 (Dionex) y un QTRAP 4000. Los péptidos se resolvieron por cromatografía de fase reversa en un gradiente de 90 min de ACN. Usando tiempos de retención exactos para cada péptido, se aplicó programación de SRM al método

40 (ventana de detección de +/- 3 min; tiempo del ciclo 2.5 s; tiempo de mantenimiento 37.8 ms y 21 puntos de datos a FHMW).

Todos los péptidos se observaron en la muestra de plasma por TMT SRM a diferentes intensidades. Para lograr la cuantificación exacta de cada posible péptido interés, fue necesario establecer si hubo una contribución significativa

45 de señal inespecífica del plasma, cuando se agregaron péptidos que no eran de referencia. Se analizó plasma etiquetado con TMTzero en todas las transiciones TMTzero y TMTsixplex. Las señales observadas de todas las transiciones TMTzero SRM representaron un ruido de fondo no específico. Esas transiciones que tenían un ruido de fondo importante se retiraron del método posteriormente.

50 Ejemplo 10: Validación de gelsolina y grupo de marcadores más expandido

1. Introducción

Es necesario establecer biomarcadores específicos y sensibles para la enfermedad de Alzheimer (EA) para ayudar

55 en el diagnóstico y el seguimiento del avance de la enfermedad. Se encontró de los ejercicios de descubrimiento que, la clusterina (número de referencia SwissProt P10909), el complemento c3 (P01024), el componente amiloide P sérico (P02743; SAP), la alfa-2-macroglobulina (P01023; A2M), la gelsolina (P06396), el gamma-fibrinógeno (P02679) y el factor H del complemento (P08603; CFH) se expresaban diferencialmente en las muestras de EA versus las muestras de control. Además, la posesión del alelo e4 de la apolipoproteína es el único factor de riesgo

60 genético inequívoco conocido hasta la fecha para la EA de inicio tardío y la expresión de la proteína apolipoproteína E (P02649; ApoE) puede estar alterada en la EA. Estas proteínas se presentan como potenciales sustancias de interés mediante las cuales se puede seguir el avance de la enfermedad. Este ejemplo detalla la aplicación de un etiquetado de masas en tándem - monitoreo de la reacciones seleccionadas (TMT-SRM) a una cohorte de muestras clínicas (n = 20; 10 con enfermedad de Alzheimer (EA), 10 controles). Los objetivos del estudio fueron en primer lugar, validar los resultados de la inmunotransferencia tipo western (WB) para una de las proteínas, la gelsolina (que se encontró que estaba disminuida en los pacientes con EA versus los controles) utilizando una tecnología ortogonal (TMT SRM) y en segundo lugar, evaluar el comportamiento de las proteínas restantes en una cohorte de EA por

5 TMT SRM.

2. Métodos

2.1. Elección de la muestra

10 Las muestras se eligieron basándose en las mediciones de WB para la gelsolina. Para tener la mejor oportunidad de detectar una diferencia entre los enfermos y los controles por TMT-SRM, las muestras que presentaron las concentraciones de gelsolina (n = 10 por grupo) más alta y más baja se siguieron para su análisis.

15 2.2. Elección de los potenciales péptidos de interés para cuantificación por SRM

Se minaron espectros MS/MS existentes de bases de datos de plasma etiquetado con TMT, incluidos los provenientes de ejercicios de descubrimiento, para determinar los péptidos más adecuados para la validación de los posibles biomarcadores por SRM. Se seleccionaron al menos tres péptidos por cada posible proteína de interés para

20 la cuantificación (32 en total), 16 de los cuales fueron observados en ejercicios de descubrimiento. Los criterios para la selección de estos péptidos para SRM fueron; buenos iones fragmentos de masa alta, sin escisiones con tripsina faltantes, sin modificaciones variables (in vivo o experimental). Debido a la escasa detección endógena y la escasa exactitud, precisión y reproducibilidad al trazar las curvas de calibración previas, varios de los péptidos fueron eliminados del método. Esto dejó 22 péptidos para cuantificar en esta parte del estudio.

2.3. Preparación de la muestra de péptidos sintéticos

Se prepararon internamente versiones sintéticas de cada péptido para que actuaran como referencia para la cuantificación. Los resultados anteriores demostraron una variación en las cantidades recuperadas de los péptidos

30 de la misma proteína. Para minimizar dicha variación, los péptidos de la misma proteína se combinaron en una mezcla equimolar (62 nmoles/péptido; 8 mezclas en total) antes del etiquetado con TMT. Cada mezcla se procesó usando un flujo de trabajo de TMT-SRM típico que consistió en la reducción, la alquilación, la digestión con tripsina y el etiquetado químico de muestras individuales con TMT. Las mezclas se etiquetaron con TMT ligera (para actuar como un estándar interno para la generación de curvas de calibración inversa en plasma) y TMT pesada (utilizada

35 para la generación de una curva de calibración inversa en plasma y para usar como estándar interno para la cuantificación del conjunto de muestras experimental). Ambas muestras fueron sometidas a purificación por extracción en fase sólida por intercambio catiónico fuerte usando tampones volátiles.

2.4. Preparación de las muestras de plasma

40 Se extrajo un volumen igual de cada muestra de plasma (25 μl) de las existencias y se diluyeron 10 veces. De esto,

12.5 μl se agregaron a cada digestión para dar aproximadamente 100 μg de proteína por digestión. Además, se preparó una mezcla de todas las muestras (100 μg por muestra; 2 mg de proteína en total) para la preparación de curvas de calibración y para control de calidad. Luego de la solubilización con SDS y la dilución, cada muestra se

45 redujo, se alquiló y se digirió con tripsina. Las muestras se etiquetaron con TMT ligera antes de la purificación por extracción en fase sólida e intercambio catiónico fuerte usando tampones volátiles Las muestras se liofilizaron antes del análisis de MS. Todas las muestras se procesaron por triplicado (repeticiones técnicas).

2.5. Análisis SRM del conjunto de muestras

50 Se realizó un análisis SRM en un espectrómetro de masas QTRAP 4000 (Applied Biosystems) acoplado a un sistema de LC Ultimate 3000 (Dionex). El espectrómetro de masas se equipó con una fuente de ionización por electronebulización para velocidades de flujo de microlitros operado en modo positivo y la resolución de Q1 y Q3 se fijó en la unidad (0.7 FWHM). Los péptidos se resolvieron por cromatografía de fase reversa usando una columna

55 Hypersil gold (1 mm de d.i. x 50 mm; 1,9 μm, Thermo Fisher Scientific), en un gradiente de 14 min de 5-30% ACN/ácido fórmico al 0.2% a una velocidad de flujo de 100 μL/min. El lavado y el equilibrado de la columna aumentaron el tiempo total de la corrida a 20 min.

Los péptidos marcados se infundieron directamente en el MS QTRAP y en primera instancia se seleccionaron para

60 la fragmentación por MS/MS. Se eligieron los iones fragmento (tres) MS/MS óptimos para cada péptido a fin de facilitar la detección y la especificidad máximas de cada transición en Q3. Todos los péptidos se midieron después por SRM mediante infusión directa utilizando las transiciones Q3 seleccionadas. Después la sensibilidad de detección de cada SRM se optimizó mediante la regulación de la energía de colisión, el potencial de desclusterización y el potencial de salida de la celda de colisión. Los péptidos se analizaron por LC-SRM para definir los tiempos de retención exactos. El método de SRM final aplicado al análisis de las muestras tuvo una ventana de programación de SRM de 45 s, un tiempo de ciclo de 1 s, >20 ms de tiempo de detención/transición con 5 a 10 puntos de datos en FWHM.

5 Las muestras se resuspendieron en 333.33 μL de ACN al 3%/ácido fórmico al 0.2%. Para cada análisis individual, se pasaron alícuotas de 100 μl a un pocillo de una placa de microtitulación y se liofilizaron. Todas las muestras se procesaron por triplicado (repeticiones técnicas). Inmediatamente antes del análisis, las muestras se resuspendieron en 25 μl de péptidos etiquetados con TMT pesada (5 fmoles/μl; 100 fm en columna). Esta concentración de muestra aseguró una buena detección del analito diana sin acarreo a las corridas subsiguientes. Se inyectó una muestra (23

10 μl) en la columna usando un bucle de inyección completo (Figura 1). Se produjo una curva de calibración de 12 puntos resuspendiendo la muestra de plasmas mezclados con 25 μl de péptidos etiquetados con TMT ligera y TMT pesada (los péptidos con TMT ligera constantes a 5 fmoles/μl:100 fm en columna y los péptidos con TMT pesada variaron de 1-6000 fm en columna).

15 Se analizaron las muestras experimentales en tres conjuntos consecutivos de 60 muestras para proporcionar tres repeticiones analíticas. En cada conjunto de 60 el orden de la corrida se barajó para excluir el tiempo de la corrida y el sesgo del orden de la corrida, y para asegurar que una muestra particular no era precedida ni seguida por la misma muestra dos veces. Se corrió una curva de calibración inmediatamente antes de correr un conjunto de 60 muestras con dos curvas extra corridas después de que se completó todo el conjunto de muestras (cinco en total).

20 Antes del análisis del conjunto de muestras se hicieron controles del sistema para asegurar que el MS y el LC estuvieran funcionando con la sensibilidad, la exactitud de masa, la calibración y la estabilidad iónica óptimas. Durante el análisis del conjunto de muestras se adquirió una muestra de referencia múltiples veces para asegurar que se mantenía el desempeño del LC-SRM.

25 2.6. Procesamiento de datos de SRM

Los SRM se visualizaron a través del asistente para la cuantificación de Analyst's (Applied Biosystems). Se verificaron visualmente todas las coincidencias de los picos y las áreas de los picos se exportaron a Excel de Microsoft. Se excluyeron las transiciones cuando había una mala definición del pico de la señal de fondo. El área del

30 pico para cada transición con etiqueta ligera (muestra de plasma experimental o muestra de mezcla de plasmas para el control de calidad) se midió con respecto al área del pico de la correspondiente transición con etiqueta pesada (péptido sintético; muestra de referencia). Estas relaciones (L/H) para cada par de transiciones se siguieron para el análisis cuantitativo.

35 2.7. Análisis estadístico.

El diseño experimental fue jerárquico (anidado) con transiciones anidadas dentro de péptidos anidados dentro de digestiones y se realizaron tres mediciones repetidas para cada digestión. Elegimos una aproximación al análisis que daría una estimación realista del intervalo de confianza del 95%, teniendo en cuenta la varianza atribuible a

40 todos los factores en la jerarquía. Se utilizó un análisis de varianza de 3 vías para separar y estimar las diferentes fuentes de variación y después éstas se recombinaron para dar una estimación de la varianza de la media. La varianza de la media se utilizó para estimar el error estándar y éste, junto con un valor de la distribución t se utilizó para estimar el intervalo de confianza del 95% alrededor de la gran media.

45 Las mediciones de la gelsolina se correlacionaron con los resultados de la WB calculando el coeficiente de Spearman para cada péptido de gelsolina (relación L/H) en cada muestra, como se comparó con la correspondiente medición WB de la muestra.

3. Resultados

50 La tabla muestra los niveles de gelsolina según se determinaron por WB para muestras de la enfermedad (EA) y de control (CTL). Se eligieron específicamente niveles de gelsolina altos y bajos para tener la mejor oportunidad de detectar una diferencia por TMT-SRM. Se puede ver de los valores medios de cada grupo que hay una reducción en 4 veces en los niveles de gelsolina en la EA en comparación con los controles.

Nº de muestra de EA con niveles de gelsolina bajos por WB

Niveles Nº de muestra de CTL con niveles de gelsolina altos por WB Niveles

68

0.33 352 1.55

156

0.37 436 1.55

284

0.27 446 1.80

371

0.40 449 1.67

Nº de muestra de EA con niveles de gelsolina bajos por WB

Niveles Nº de muestra de CTL con niveles gelsolina altos por WB de Niveles

768

0.36 520 2.16

891

0.48 880 1.63

1212

0.34 886 1.53

1219

0.52 960 1.78

1239

0.43 1035 2.99

1312

0.52 1172 1.76

Media

0.40 Media 1.84

3.1 Eliminación de las transiciones y los péptidos que pueden dar lugar a inexactitudes en la cuantificación

Se eliminaron las transiciones de los análisis de datos cuando tenían una mala detección del pico o poseían un ruido

5 de fondo de plasma alto (Figura 2). Además, se eliminaron cuatro péptidos del análisis porque la detección endógena fue mala en la mayoría de las muestras (péptidos 3, 6, 11 y 27) o se observó una varianza elevada para todas las mediciones a través de todas las muestras (péptido 18). Por consiguiente, quedaron 17 péptidos para la cuantificación, con al menos 2 péptidos por proteína.

10 3.2 TMT SRM de gelsolina y comparación con los resultados de WB

Originalmente se incluyeron cuatro péptidos de gelsolina en el método (péptidos 27, 29, 30 y 31). El péptido 27 tuvo una mala detección del pico y por lo tanto se eliminó del análisis de datos. Los tres péptidos restantes se comportaron de manera similar, mostrando una reducción en los niveles de gelsolina de 30% en las muestras de

15 EA en comparación con las de control (véase fig. 17). Esto concuerda con los resultados de WB y los ejercicios de descubrimiento. Después del cálculo de Spearman para comparar las plataformas de TMT SRM y WB, se observó una correlación muy alta (0.65-0.73; Tabla 2) para cada péptido de gelsolina en cada muestra, en comparación con la medición de la muestra por WB correspondiente:

20 Tabla 2. Correlación de las mediciones de TMT SRM para los péptidos de gelsolina 29, 30 y 31 con las mediciones de WB. Se observó una alta correlación para todos los péptidos

Correlaciones

Gelsolina_WB Péptido_29 Péptido_30 Péptido_31

rho de Spearman

Gelsolina_B Coeficiente de correlación 1.000 0.651 0.664 0.731

Sig. (bilateral) 0.002 0.001 0.000

N 20 20 20 20

Péptido 29 Coeficiente de correlación 0.651 1.000 0.923 0.902

Sig. (bilateral) 0.002 0.002 0.000 0.000

N 20 20 20 20

Péptido 30 Coeficiente de correlación 0.664 0.923 1.000 0.808

Sig. (bilateral) 0.001 0.000 0.000

N 20 20 20 20

Péptido 31 Coeficiente de correlación 0.731 0.902 0.808 1.000

Sig. (bilateral) 0.000 0.000 0.000

N 20 20 20 20

**. La correlación es significativa al nivel 0.01 (bilateral).

3.3 TMT SRM de los péptidos restantes 3.3.1 Clusterina

5 De un total de cuatro péptidos, se eliminaron dos péptidos de clusterina (péptidos 3 y 6) de los análisis de datos debido a la mala detección de los picos. Los dos péptidos remanentes cubren ambos la cadena alfa (péptido 1) y la cadena beta (péptido 5) de la clusterina. Ninguno de los dos péptidos mostró un cambio significativo entre las muestras de EA y de los controles (véase fig. 10), lo que concuerda con los estudios de validación previos.

10 3.3.2 Complemento c3

Los dos péptidos del complemento c3 (péptidos 8 y 9) mostraron un aumento similar en los sujetos con EA en comparación con los de control (véase fig. 11). Este aumento concuerda con los ejercicios de descubrimiento previos.

3.3.3 Factor H del complemento

Uno de los péptidos CFH (péptido 11) tuvo una mala detección del pico y se eliminó del análisis de datos. Los dos péptidos restantes(péptidos 12 y 13) mostraron un aumento similar en los sujetos con EA en comparación con los de

20 control (véase fig. 14). Este aumento concuerda con los ejercicios de descubrimiento previos.

3.3.4 Alfa-2 macroglobulina

Los dos péptidos A2M (14 y 15) se comportaron de forma similar, no mostraron ningún cambio significativo entre los

25 sujetos con EA y los de control. Los ejercicios de descubrimiento previos mostraron un aumento en A2M en los sujetos con EA en comparación con los controles (véase fig. 15).

3.3.5 Gamma-fibrinógeno

30 Se observó una varianza elevada para un péptido (péptido 18) para todas las mediciones en todas las muestras y por lo tanto se eliminó del análisis de datos. Los péptidos 19 y 20 de gamma-fibrinógeno, mostraron ambos un aumento en los sujetos con EA en comparación con los controles (véase fig. 12), lo que concuerda con los resultados del descubrimiento.

35 3.3.6 Componente amiloide P sérico

Los dos péptidos de SAP (péptidos 22 y 23) mostraron un aumento similar en los sujetos con EA en comparación con los de control (véase fig. 13). Este aumento concuerda con los resultados del descubrimiento.

40 3.3.7 Apolipoproteína E

Los dos péptidos de ApoE (24 y 25) se comportaron de forma similar, no mostraron ningún cambio significativo entre los sujetos con EA y los de control (véase fig. 16). Esto está reflejado en la bibliografía, donde hay muchos grupos que no muestran cambio en los niveles de proteína ApoE en los sujetos con EA en comparación con los controles.

4. Conclusiones

Los resultados demuestran el desempeño de TMT SRM como una herramienta para la cuantificación relativa de potenciales biomarcadores de la EA. La eliminación de esos péptidos que tienen una mala detección de los picos 50 resultó en una mejor estadística. Los péptidos de la misma proteína mostraron diferencias similares en las muestras de EA y de control, con baja varianza a través de todas las muestras (IC de 95%). La comparación de las muestras de EA y de control para la mayoría de los péptidos estuvo de acuerdo con los ejercicios de descubrimiento. Se encontró que los resultados de TMT SRM para la gelsolina se correlacionaban muy bien con los resultados de WB. Después de esto, las curvas de calibración se incorporarán a los análisis para calcular las cantidades endógenas de

55 cada péptido en cada muestra. Además, el conjunto de datos se normalizará a una muestra de referencia para tener en cuenta las diferencias observadas en las relaciones L/H de los péptidos de la misma proteína. Los resultados demuestran el buen desempeño de TMT SRM para la cuantificación relativa de un conjunto de muestras pequeño. Se pueden cuantificar cohortes más grandes de la misma manera.

60 REFERENCIAS

Abdi F, Quinn JF, Jankovic J, McIntosh M, Leverenz JB, Peskind E, Nixon R, Nutt J, Chung K, Zabetian C, Samii A, Lin M, Hattan S, Pan C, Wang Y, Jin J, Zhu D, Li GJ, Liu Y, Waichunas D, Montine TJ, Zhang J (Detection of biomarkers with a multiplex quantitative proteomic platform in cerebrospinal fluid of patients with neurodegenerative

disorders. J Alzheimers Dis 9:293-348.2006). Aggarwal K, Choe LH, Lee KH (Shotgun proteomics using the iTRAQ isobaric tags. Briefings in functional genomics & proteomics 5:112-120.2006). Akuffo EL, Davis JB, Fox SM, Gloger IS, Hosford D, Kinsey EE, Jones NA, Nock CM, Roses EA, Saunders AM,

5 Skehel JM, Smith MA, Cutler P (The discovery and early validation of novel plasma biomarkers in mild-to-moderate Alzheimer's disease patients responding to treatment with rosiglitazone. Biomarkers 13:618-636.2008). Anderson NL, Anderson NG (The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics 1:845-867.2002). Baranowska-Bik A, Bik W, Wolinska-Witort E, Martynska L, Chmielowska M, Barcikowska M, Baranowska B (Plasma

10 beta amyloid and cytokine profile in women with Alzheimer's disease. Neuro endocrinology letters 29:75-79.2008). Blennow K, de Leon MJ, Zetterberg H (Alzheimer's disease. Lancet 368:387-403.2006). Carugati A, Pappalardo E, Zingale LC, Cicardi M (C1-inhibitor deficiency and angioedema. Molecular immunology 38:161-173.2001). Chauhan VP, Ray I, Chauhan A, Wisniewski HM (Binding of gelsolin, a secretory protein, to amyloid beta-protein.

15 Biochemical and biophysical research communications 258:241-246.1999). Choe L, D'Ascenzo M, Relkin NR, Pappin D, Ross P, Williamson B, Guertin S, Pribil P, Lee KH (8-plex quantitation of changes in cerebrospinal fluid protein expression in subjects undergoing intravenous immunoglobulin treatment for Alzheimer's disease. Proteomics 7:3651-3660.2007). Connor JR, Tucker P, Johnson M, Snyder B (Ceruloplasmin levels in the human superior temporal gyrus in aging and

20 Alzheimer's disease. Neuroscience letters 159:88-90.1993). Dayon L, Hainard A, Licker V, Turck N, Kuhn K, Hochstrasser DF, Burkhard PR, Sanchez JC (Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Analytical chemistry 80:29212931.2008). Dayon L, Turck N, Kienle S, Schulz-Knappe P, Hochstrasser D F, Scherl A, Sanchez J-C (Isobaric Tagging-Based

25 Selection and Quantitation of Cerebrospinal Fluid Tryptic Peptides with Reporter Calibration Curves. Analytical Chemistry DOI: 10.1021 /ac901854k, January 8, 2010). Gaggelli E, Kozlowski H, Valensin D, Valensin G (Copper homeostasis and neurodegenerative disorders (Alzheimer's, prion, and Parkinson's diseases and amyotrophic lateral sclerosis). Chemical reviews 106:19952044.2006).

30 Garbis SD, Tyritzis SI, Roumeliotis T, Zerefos P, Giannopoulou EG, Vlahou A, Kossida S, Diaz J, Vourekas S, Tamvakopoulos C, Pavlakis K, Sanoudou D, Constantinides CA (Search for Potential Markers for Prostate Cancer Diagnosis, Prognosis and Treatment in Clinical Tissue Specimens Using Amine-Specific Isobaric Tagging (iTRAQ) with Two-Dimensional Liquid Chromatography and Tandem Mass Spectrometry. Journal of proteome research.2008).

35 Gilman S, Koller M, Black RS, Jenkins L, Griffith SG, Fox NC, Eisner L, Kirby L, Rovira MB, Forette F, Orgogozo JM (Clinical effects of Abeta immunization (AN1792) in patients with EA in an interrupted trial. Neurology 64:15531562.2005). Giometto B, Argentiero V, Sanson F, Ongaro G, Tavolato B (Acute-phase proteins in Alzheimer's disease. European neurology 28:30-33.1988).

40 Glenner GG, Wong CW, Quaranta V, Eanes ED (The amyloid deposits in Alzheimer's disease: their nature and pathogenesis. Appl Pathol 2:357-369.1984). Hergenroeder G, Redell JB, Moore AN, Dubinsky WP, Funk RT, Crommett J, Clifton GL, Levine R, Valadka A, Dash PK (Identification of serum biomarkers in brain-injured adults: potential for predicting elevated intracranial pressure. J Neurotrauma 25:79-93.2008).

45 Hirko AC, Meyer EM, King MA, Hughes JA (Peripheral transgene expression of plasma gelsolin reduces amyloid in transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Mol Ther 15:1623-1629.2007). Hye A, Lynham S, Thambisetty M, Causevic M, Campbell J, Byers HL, Hooper C, Rijsdijk F, Tabrizi SJ, Banner S, Shaw CE, Foy C, Poppe M, Archer N, Hamilton G, Powell J, Brown RG, Sham P, Ward M, Lovestone S (Proteomebased plasma biomarkers for Alzheimer's disease. Brain 129:3042-3050.2006).

50 Jacobs JM, Adkins JN, Qian WJ, Liu T, Shen Y, Camp DG, 2nd, Smith RD (Utilizing human blood plasma for proteomic biomarker discovery. Journal of proteome research 4:1073-1085.2005). Janus C, Pearson J, McLaurin J, Mathews PM, Jiang Y, Schmidt SD, Chishti MA, Horne P, Heslin D, French J, Mount HT, Nixon RA, Mercken M, Bergeron C, Fraser PE, St George-Hyslop P, Westaway D (A beta peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature 408:979-982.2000).

55 Ji L, Chauhan A, Chauhan V (Cytoplasmic gelsolin in pheochromocytoma-12 cells forms a complex with amyloid beta-protein. Neuroreport 19:463-466.2008). Kessler H, Pajonk FG, Meisser P, Schneider-Axmann T, Hoffmann KH, Supprian T, Herrmann W, Obeid R, Multhaup G, Falkai P, Bayer TA (Cerebrospinal fluid diagnostic markers correlate with lower plasma copper and ceruloplasmin in patients with Alzheimer's disease. J Neural Transm 113:1763-1769.2006).

60 Kiuru S, Salonen O, Haltia M (Gelsolin-related spinal and cerebral amyloid angiopathy. Annals of neurology 45:305311.1999). Lee VM, Trojanowski JQ (The disordered neuronal cytoskeleton in Alzheimer's disease. Current opinion in neurobiology 2:653-656.1992). Levy E, Haltia M, Fernandez-Madrid I, Koivunen O, Ghiso J, Prelli F, Frangione B (Mutation in gelsolin gene in

Finnish hereditary amyloidosis. The Journal of experimental medicine 172:1865-1867.1990). Loeffler DA, DeMaggio AJ, Juneau PL, Brickman CM, Mashour GA, Finkelman JH, Pomara N, LeWitt PA (Ceruloplasmin is increased in cerebrospinal fluid in Alzheimer's disease but not Parkinson's disease. Alzheimer disease and associated disorders 8:190-197.1994).

5 Loeffler DA, LeWitt PA, Juneau PL, Sima AA, Nguyen HU, DeMaggio AJ, Brickman CM, Brewer GJ, Dick RD, Troyer MD, Kanaley L (Increased regional brain concentrations of ceruloplasmin in neurodegenerative disorders. Brain research 738:265-274.1996). Loeffler DA, Sima AA, LeWitt PA (Ceruloplasmin immunoreactivity in neurodegenerative disorders. Free radical research 35:111-118.2001).

10 Lu H, Yang Y, Allister EM, Wijesekara N, Wheeler MB (The identification of potential factors associated with the development of type 2 diabetes: A quantitative proteomic approach. Mol Cell Proteomics.2008). Matsuoka Y, Saito M, LaFrancois J, Saito M, Gaynor K, Olm V, Wang L, Casey E, Lu Y, Shiratori C, Lemere C, Duff K (Novel therapeutic approach for the treatment of Alzheimer's disease by peripheral administration of agents with an affinity to beta-amyloid. J Neurosci 23:29-33.2003).

15 Matta A, DeSouza LV, Shukla NK, Gupta SD, Ralhan R, Siu KW (Prognostic significance of head-and-neck cancer biomarkers previously discovered and identified using iTRAQ-labeling and multidimensional liquid chromatographytandem mass spectrometry. Journal of proteome research 7:2078-2087.2008). Maury CP, Kere J, Tolvanen R, de la Chapelle A (Finnish hereditary amyloidosis is caused by a single nucleotide substitution in the gelsolin gene. FEBS letters 276:75-77.1990).

20 Maurya P, Meleady P, Dowling P, Clynes M (Proteomic approaches for serum biomarker discovery in cancer. Anticancer research 27:1247-1255.2007). McGeer PL, McGeer EG (The possible role of complement activation in Alzheimer disease. Trends in molecular medicine 8:519-523.2002). Qiao H, Koya RC, Nakagawa K, Tanaka H, Fujita H, Takimoto M, Kuzumaki N (Inhibition of Alzheimer's amyloid-beta

25 peptide-induced reduction of mitochondrial membrane potential and neurotoxicity by gelsolin. Neurobiology of aging 26:849-855.2005). Ralhan R, Desouza LV, Matta A, Chandra Tripathi S, Ghanny S, Datta Gupta S, Bahadur S, Siu KW (Discovery and verification of head-and-neck cancer biomarkers by differential protein expression analysis using iTRAQ labeling, multidimensional liquid chromatography, and tandem mass spectrometry. Mol Cell Proteomics 7:1162-1173.2008).

30 Ray I, Chauhan A, Wegiel J, Chauhan VP (Gelsolin inhibits the fibrillization of amyloid beta-protein, and also defibrillizes its preformed fibrils. Brain research 853:344-351.2000). Ray S, Britschgi M, Herbert C, Takeda-Uchimura Y, Boxer A, Blennow K, Friedman LF, Galasko DR, Jutel M, Karydas A, Kaye JA, Leszek J, Miller BL, Minthon L, Quinn JF, Rabinovici GD, Robinson WH, Sabbagh MN, So YT, Sparks DL, Tabaton M, Tinklenberg J, Yesavage JA, Tibshirani R, Wyss-Coray T (Classification and prediction of

35 clinical Alzheimer's diagnosis based on plasma signaling proteins. Nature medicine 13:1359-1362.2007). Strohmeyer R, Ramirez M, Cole GJ, Mueller K, Rogers J (Association of factor H of the alternative pathway of complement with agrin and complement receptor 3 in the Alzheimer's disease brain. Journal of neuroimmunology 131:135-146.2002). Sun HQ, Yamamoto M, Mejillano M, Yin HL (Gelsolin, a multifunctional actin regulatory protein. The Journal of

40 biological chemistry 274:33179-33182.1999). Thompson A, Schafer J, Kuhn K, Kienle S, Schwarz J, Schmidt G, Neumann T, Johnstone R, Mohammed AK, Hamon C (Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical chemistry 75:1895-1904.2003). Veerhuis R, Janssen I, Hoozemans JJ, De Groot CJ, Hack CE, Eikelenboom P (Complement C1-inhibitor expression

45 in Alzheimer's disease. Acta neuropathologica 96:287-296.1998). Yasojima K, McGeer EG, McGeer PL (Complement regulators C1 inhibitor and CD59 do not significantly inhibit complement activation in Alzheimer disease. Brain research 833:297-301.1999).

LISTADO DE SECUENCIAS 50

<110> Electrophoretics Limited King's College London Lovestone, Simon H Guntert, Andreas C Campbell, James O'Brien, Darragh P W Byers, Helen L

<120> Métodos

<130> P2864PC01 55 <160> 32

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 782

<212> PRT 60 <213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 500

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 1065

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 1663

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 223

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7 5 <211> 1474

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7 10

<210> 8

<211> 453

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 1231

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 317

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 11

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 12

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HVVPNEVWQR

<400> 13

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 14

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 15

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 16

<210> 17

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 17

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 18

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 19

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 20

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 21

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 22

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 23

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 24

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 25

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 26

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 27

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

15 <400> 28

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 25 <223> péptido

<400> 29

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 30

<210> 31

<211> 7 45 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 31

55 <210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido

<400> 32

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, que comprende proporcionar una muestra de un derivado de la sangre, donde dicho derivado de la sangre es suero o plasma, obtenido de dicho sujeto; determinar la cantidad de gelsolina presente en dicha muestra; comparar la cantidad de gelsolina presente en dicha muestra con una cantidad de referencia de gelsolina presente en una muestra de un sujeto sano, donde la detección de un nivel de gelsolina en la muestra de dicho sujeto que sea menor que el nivel de gelsolina en la muestra de referencia, indica una mayor probabilidad de enfermedad de Alzheimer en dicho sujeto.

2. 2.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 1 donde dicha muestra consiste en plasma sanguíneo.

3. 3.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 2 donde a dicho plasma sanguíneo se le puede reducir al mínimo el contenido de una o más de las proteínas siguientes: albúmina; transferrina; IgG; IgA; antitripsina o haptoglobina.

4. 4.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 3, donde a dicho plasma sanguíneo se le puede reducir al mínimo el contenido de cada una de: albúmina; transferrina; IgG; IgA; antitripsina o haptoglobina.

5. 5.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la proteína se detecta por inmunotransferencia tipo western.

6. 6.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la proteína se detecta mediante arreglo de microesferas en suspensión.

7. 7.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la proteína se detecta mediante arreglo planar.

8. 8.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la proteína se detecta por etiquetado isobárico de proteínas o por etiquetado isotópico de proteínas.

9. 9.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la reivindicación 8 donde la proteína se detecta por un análisis que utiliza un espectrómetro de masas.

10. 10.

    Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, u 8 o 9 donde la proteína gelsolina se detecta por referencia a uno o más de los péptidos siguientes de la tabla B: SEC. ID Nº: 30, SEC. ID Nº: 31, SEC. ID Nº: 32.