ES2339393T3 - Polipeptidos del factor de coagulacion humano vii. - Google Patents
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Abstract
Polipéptido del factor VII comprendiendo al menos tres sustituciones en relación con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.1, donde dichas sustituciones son (i) el reemplazo de F374 con cualquier otro aminoácido, (ii) reemplazo de S314 con cualquier otro aminoácido y (iii) reemplazo de L305 con cualquier otro aminoácido.
Description
Polipéptidos del factor de coagulación humano
VII.
La presente invención se refiere a nuevos
polipéptidos del factor VIIa de coagulación humana que tienen una
actividad coagulante así como a constructos polinucleótidos que
codifican tales polipéptidos, vectores y células huéspedes
comprendiendo y expresando el polinucleótido, composiciones
farmacéuticas, usos y métodos de tratamiento.
La coagulación sanguínea es un proceso que
consiste en una interacción compleja de varios componentes de la
sangre (o factores) que finalmente da lugar a un coágulo de fibrina.
Generalmente, los componentes de sangre, que participan en lo que se
ha referido como la "cascada" de coagulación, son proteínas
inactivas enzimáticamente (proenzimas o zimógenos) que se convierten
en enzimas proteolíticas por la acción de un activador (que en sí es
un factor de coagulación activado). Factores de coagulación que han
sufrido tal conversión son generalmente indicados como "factores
activos", y se designan por la adición de la letra "a" al
nombre del factor de coagulación (p. ej. factor VIIa).
La iniciación del proceso hemostático es mediada
por la formación de un complejo entre el factor tisular, expuesto
debido a una lesión de la pared de los vasos, y el factor VIIa. Este
complejo entonces convierte los factores IX y X en sus formas
activas. El factor Xa convierte cantidades limitadas de protrombina
en trombina en la célula de soporte del factor tisular. La trombina
activa las plaquetas y los factores V y VIII en factores Va y VIIIa,
ambos cofactores en el proceso adicional que conduce a la explosión
completa de la trombina. Este proceso incluye la generación del
factor Xa por el factor IXa (en un complejo con el factor VIIIa) y
ocurre en la superficie de las plaquetas activadas. La trombina
finalmente convierte el fibrinógeno en fibrina resultando en la
formación de un coágulo de fibrina. En los últimos años, el factor
VII y el factor tisular se han revelado ser los iniciadores
principales de la coagulación sanguínea.
El factor VII es una glicoproteína plasmática de
traza que circula en la sangre como un zimógeno monocatenario. El
zimógeno es inactivo catalíticamente. El factor VII monocatenario
puede ser convertido en el factor VIIa bicatenario por el factor Xa,
el factor XIIa, el factor IXa, el factor VIIa o la trombina in
vitro. Se considera el factor Xa el mayor activador fisiológico
del factor VII. Como otras varias proteínas plasmáticas implicadas
en la hemostasis, el factor VII depende de la vitamina K para su
actividad, que se requiere para la
gamma-carboxilación de residuos múltiples de ácido
glutámico que se agrupan cerca del amino-terminal de
la proteína. Estos ácidos glutámicos
gamma-carboxilados se requieren para la interacción
inducida por iones metálicos del factor VII con fosfolípidos. La
conversión del factor VII de zimógeno en la molécula bicatenaria
activada se produce por la ruptura de un enlace peptídico interno
Arg_{152}-Ile_{153}. En presencia del factor
tisular, fosfolípidos y de un enlace peptídico interno
Arg_{152}-Ile_{153}. En presencia del factor
tisular, de fosfolípidos y de iones de calcio, el factor VIIa
bicatenario activa rápidamente el factor X o el factor IX por
proteolisis limitada.
Frecuentemente es deseable estimular o mejorar
la cascada de coagulación en un sujeto. El factor VIIa ha sido
utilizado para controlar los trastornos de sangrado que tienen
varias causas tales como deficiencias de factor de coagulación (p.
ej. hemofilia A y B o deficiencia de factores de coagulación XI o
VII) o inhibidores de factor de coagulación. El factor VIIa ha sido
usado también para controlar la hemorragia excesiva que se produce
en sujetos con una cascada de coagulación de sangre que funciona
normalmente (sin deficiencias de factor de coagulación o inhibidores
contra cualquiera de los factores de coagulación). Este tipo de
sangrado puede, por ejemplo, ser causado por una función plaquetaria
defectuosa, trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand. El
sangrado también es un problema importante en relación con la
cirugía y otras formas de daños a tejidos.
La patente europea nº. 200,421 (ZymoGenetics) se
refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica el factor humano
VII y la expresión recombinante del factor VII en células
mamíferas.
Dickinson et al. (Proc. Nati. Acad. Sci.
EEUU (1996) 93, 14379-14384) se refiere a una
variante del factor VII donde Leu305 ha sido reemplazado por Ala
(FVII(Ala305)).
Iwanaga et al. (Tromb. Haemost.
(supplement August 1999), 466, abstract 1474) se refiere a variantes
de factor VIIa donde se suprimen los residuos
316-320 o se reemplazan los residuos
311-322 por residuos correspondientes de
tripsina.
Las solicitudes de patente internacionales WO
01/83725 y WO 02/22776 se refieren a variantes de factor VIIa con
actividad aumentada.
Existe una necesidad de variantes de factor VIIa
con una actividad coagulante, variantes de actividad alta que se
pueden administrar en dosis relativamente bajas, y variantes que no
producen los efectos secundarios indeseables como la activación
sistémica del sistema de coagulación y del sangrado,
respectivamente, asociados con terapias convencionales.
Se ha descubierto ahora que las variantes de
polipéptidos del factor VIIa de coagulación humana, donde los
aminoácidos Phe374 Leu305 y Ser314, de la SEC ID NO:1 se sustituyen
por diferentes aminoácidos, han aumentado la actividad coagulante en
comparación con el factor VIIa de coagulación humana de tipo
salvaje.
Los términos "un aminoácido diferente" como
se utilizan en este caso definen un aminoácido que es diferente a
ese aminoácido presente naturalmente en esta posición. Esto incluye
pero no se limita a éstos, aminoácidos que pueden ser codificados
por un polinucleótido. En una forma de realización el término
"actividad" diferente como se utiliza en este caso define la
capacidad de un polipéptido del factor VII para convertir su factor
X de sustrato en el factor Xa activo. La actividad de un polipéptido
del factor VII puede ser medida con el "Ensayo de proteolisis
in vitro" (véase el Ejemplo 4).
Los términos "actividad inherente" también
incluyen la capacidad para generar trombina en la superficie de
plaquetas activadas en la ausencia del factor tisular.
El residuo Phe374 se sitúa en el extremo de un
\alpha-hélix a partir del residuo 307. Este
\alpha-hélix se encuentra en forma de complejo del
factor VIIa. En el factor VIIa libre (factor VIIa no ligado al
factor tisular) el hélix está distorsionado y en consecuencia es
posiblemente inestable. Se cree que el hélix es importante para la
actividad. Las variantes según la presente invención pueden
conseguir la conformación activa, la cual normalmente tiene que ser
inducida por el factor tisular.
La actividad aumentada puede ser debida a una
estabilización del \alpha-hélix a partir del
residuo 307, una reorientación del hélix o cualquier otro cambio en
la conformación. El reemplazo del residuo Phe374 situado en el
extremo del hélix, inducirá una reorientación y/o estabilización del
hélix.
Debido a la actividad inherente más alta de la
variante del factor VIIa descrita en comparación con el factor VIIa
nativo, una dosis inferior será adecuada para obtener una
concentración adecuada funcionalmente en el sitio de acción y se
podrá así administrar una dosis inferior al sujeto que sufre
hemorragias o que necesita una mejora del sistema hemostático
normal.
El Leu305 se sitúa en el otro extremo de este
\alpha-hélix presente en forma de complejo de
factor tisular del factor VIIa, que se considera importante para la
actividad. La sustitución del Leu305 también puede inducir una
reorientación y/o estabilización del hélix.
Los aminoácidos comprendiendo Lys157, Ser314,
Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296, y Met298 se sitúan en una
área prevista para incidir en la inserción del amino terminal del
dominio de proteasa y de este modo en la formación de la
conformación activa catalíticamente del factor VIIa que depende de
un puente salino entre el grupo amino terminal de Ile153 y la cadena
lateral de Asp343. Los reemplazos pueden eliminar repulsiones
electroestáticas, añadir enlaces de hidrógeno o por otra parte
facilitar la inserción del amino terminal.
Debido a la actividad inherente más alta de las
variantes de polipéptidos del factor VIIa descritas en comparación
con el FVIIa nativo, una dosis inferior puede ser adecuada para
obtener una concentración adecuada funcionalmente en el sitio de
acción y por consiguiente será posible administrar una dosis
inferior al sujeto que sufre episodios de sangrado o que necesita
una mejora del sistema hemostático normal.
Los presentes inventores han descubierto que
para sustituir el aminoácido PHe374 en combinación con uno o más Lys
en la posición 157 y Lys en la posición 337 y Val en la posición 158
y Glu en la posición 296 y Met en la posición 298 y Asp en la
posición 334 y Ser en la posición 336 y Leu en la posición 305 y Ser
en la posición 314, el factor VIIa alcanzará espontáneamente una
conformación más activa que tiene que ser inducida normalmente por
el factor tisular. Tales variantes de polipéptidos del factor VIIa
muestran una actividad inherente que puede ser útil terapéuticamente
en situaciones donde la actividad procoagulante es independiente del
factor tisular (generación de factor Xa en la superficie de
plaqueta), como durante la administración de dosis altas, por
ejemplo, NovoSeven®.
En otra forma de realización, la sustitución
adicional de aminoácidos en el dominio proteasa facilitan aún más la
formación de la conformación activa de la molécula. Se considera, no
obstante, que los efectos más prominentes se verán cuando se
realicen las mutaciones mencionadas anteriormente en la proximidad
(secuencial o tridimensional) de estos últimos siete
aminoácidos.
La invención comprende además el reemplazo de
algunos aminoácidos en el dominio Gla N-terminal
(aminoácidos en posición correspondiente a 1-37 de
la SEC ID NO:1) de factor VIIa puede proveer la proteína con una
afinidad sustancialmente superior para los fosfolípidos de membrana,
tales como fosfolípidos de membrana de células de soporte del factor
tisular o de plaquetas, generando así variantes de polipéptidos del
factor VII que tienen un efecto procoagulante mejorado.
En consecuencia, las variantes del polipéptido
del factor VIIa mencionadas anteriormente pueden, además de la
sustitución de aminoácidos ya realizada en la posición F374 en
combinación con reemplazos en las posiciones L305; S314; K157; K337;
D334; S336; V158; E296, y M298 y sustituciones de aminoácidos
opcionales en otra parte del dominio proteasa, tener también al
menos un aminoácido reemplazado en el dominio Gla
N-terminal, obteniendo así una proteína que tiene
una actividad aumentada al igual que una afinidad aumentada para los
fosfolípidos de membrana en comparación con el factor VII nativo.
Preferiblemente los aminoácidos en posiciones 10 y 32 (en referencia
a la SEC ID NO:1) del factor VII pueden ser reemplazados por un
aminoácido diferente. Ejemplos de aminoácidos preferidos que deben
ser incorporados en las posiciones mencionadas anteriormente son: el
aminoácido Pro en posición 10 se sustituye por Gln, Arg, His, Gln,
Asn o Lys; y/o el aminoácido Lys en posición 32 se sustituye por
Glu, Gln o Asn.
Otros aminoácidos en el dominio Gla, basados en
las diferentes afinidades de fosfolípidos y secuencias de las
proteínas de plasma dependientes de la vitamina K, también pueden
ser consideradas para la sustitución.
El término "dominio GLA
N-terminal" significa la secuencia de aminoácidos
1-37 de factor VII.
La indicación de tres letras "GLA"
significa ácido 4-carboxiglutámico
(\gamma-carboxiglutamato).
El término "dominio proteasa" define la
secuencia de aminoácidos 153-406 de factor VII (la
cadena pesada del factor VIIa).
El término "polipéptido del factor VII"
como se utiliza en este caso define cualquier proteína comprendiendo
la secuencia de aminoácidos 1-406 del factor humano
VII nativo (SEC ID NO: 1) o variantes de ésta. Lo cual incluye pero
no se limita a esto, el factor VII humano, el factor VIIa humano y
variantes de éstos.
El término "factor VII" como se utiliza en
este caso se destina a incluir la molécula inactiva de monocatenaria
del factor VII zimógeno así como la molécula activada bicatenaria
del factor VII (factor VIIa). Esto incluye proteínas que tienen la
secuencia de aminoácidos 1-406 del factor humano VII
nativo o.
El término "dominio proteasa" define la
secuencia de aminoácidos 153-406 del factor VII (la
cadena pesada del factor VIIa).
El término "polipéptido del factor VII"
como se utiliza en este caso significa cualquier proteína que
comprende la secuencia de aminoácidos 1-406 del
factor humano VII nativo (SEC ID NO: 1) o variantes en esto. Esto
incluye pero no se limita al factor humano VII, al factor humano
VIIa y a las variantes en esto.
El término "factor VII" como se utiliza en
este caso se destina a incluir la molécula inactiva de una cadena
del factor VII zimógeno así como la molécula activada bicatenaria
del factor VII (factor VIIa). Esto incluye proteínas que tienen la
secuencia de aminoácidos 1-406 del factor humano VII
nativo o del factor VIIa. También incluye proteínas con una
secuencia de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, un
extremo N-terminal modificado incluyendo deleciones
de aminoácidos N-terminal o adiciones siempre que
estas proteínas retengan sustancialmente la actividad del factor
VIIa. El término "factor VIIa", o "FVIIa" como se utiliza
en este caso define un producto que consiste en la forma activada
(factor VIIa). "Factor VII" o "factor VIIa" según la
definición más arriba también incluye las variaciones alélicas
naturales que pueden existir y ocurrir de un individuo a otro.
Además, el grado y la ubicación de glicosilación u otras
modificaciones postranslacionales pueden variar dependiendo de las
células huéspedes seleccionadas y de la naturaleza del entorno
celular huésped.
Los términos "variante" o "variantes",
como se utilizan en este caso, se destinan a designar el factor VII
que tiene la secuencia de la SEC ID NO: 1, donde uno o más
aminoácidos de la proteína progenitora han sido sustituidos por otro
aminoácido y/o donde uno o más aminoácidos de la proteína
progenitora han sido delecionados y/o donde uno o más aminoácidos
han sido insertados en la proteína y/o donde uno o más aminoácidos
han sido añadidos a la proteína progenitora. Tal adición puede tener
lugar bien en el extremo N-terminal o en el extremo
C-terminal de la proteína progenitora o en ambos. La
"variante" o "variantes" según esta definición todavía
tienen una actividad FVII en su forma activada. En una forma de
realización una variante es 70% idéntica a la secuencia de la SEC ID
NO:1. En una forma de realización una variante es 80% idéntica a la
secuencia de la SEC ID NO:1. En otra forma de realización una
variante es 90% idéntica a la secuencia de la SEC ID NO:1. En otra
forma de realización una variante es 95% idéntica a la secuencia de
la SEC ID NO:1.
En un aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido del factor VII con al menos tres sustituciones en
relación con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde
dichas sustituciones son (i) el reemplazo de F374 por cualquier otro
aminoácido (ii) el reemplazo de S314 por cualquier otro aminoácido y
(iii) el reemplazo de L305 por cualquier otro aminoácido.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
constructo polinucleótido que codifica un polipéptido del factor VII
comprendiendo al menos tres sustituciones en relación con la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1 donde dichas
sustituciones son (i) el reemplazo de F374 por cualquier otro
aminoácido, (ii) el reemplazo de S314 con cualquier otro aminoácido
y (iii) el reemplazo de L305 por cualquier otro aminoácido.
El término "constructo" se destina a
indicar un segmento polinucleótido que puede basarse en una
secuencia de nucleótidos completa o parcial de origen natural que
codifica el polipéptido de interés. El constructo puede contener
opcionalmente otros segmentos de polinucleótidos. De manera similar,
los términos "aminoácidos que pueden ser codificados por
constructos polinucleótidos" definen los aminoácidos que pueden
ser codificados por los constructos polinucleótidos definidos más
arriba, es decir, aminoácidos tales como Ala, Val, Leu, Ile, Met,
Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp
y Gln.
En otro aspecto, la invención provee un vector
recombinante comprendiendo el constructo polinucleótido que codifica
un polipéptido del factor VII.
El término "vector", como se utiliza en
este caso, define cualquier entidad de ácido nucleico capaz de
producir la amplificación en una célula huésped. Así, el vector
puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que
existe en forma de entidad extracromosómica, cuya a replicación es
independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido.
Alternativamente, el vector puede ser un vector que, cuando es
introducido en una célula huésped, se integra en el genoma de la
célula huésped y se replica junto all/a los cromosoma(s) en
lo(s) que se ha integrado. La elección del vector dependerá
frecuentemente de la célula huésped en la que se debe introducir.
Los vectores incluyen, pero no se limitan a éstos, vectores
plásmidos, vectores fágicos, virus o vectores cósmidos. Los vectores
normalmente contienen un origen de la replicación y al menos un gen
seleccionable, es decir, un gen que codifica un producto que es
fácil de detectar o la presencia de lo que es esencial para el
crecimiento celular.
En otro aspecto, la invención provee una célula
huésped recombinante comprendiendo el constructo polinucleótido o el
vector. En una forma de realización la célula huésped recombinante
es una célula eucariótica. En otra forma de realización la célula
huésped recombinante es de origen mamífero. En otra forma de
realización la célula huésped recombinante se selecciona en el grupo
que consiste en células CHO, células HEK y células BHK.
Los términos "una célula huésped", como se
utilizan en este caso, definen cualquier célula, incluyendo células
híbridas, en las que el ADN heterólogo puede ser expresado. Las
células huéspedes típicas incluyen, pero no se limitan a éstas,
células de insectos, células de levadura, células mamíferas,
incluyendo células humanas, tales como células BHK, CHO, HEK, y COS.
En ia práctica de la presente invención, las células huéspedes
cultivadas son preferiblemente células mamíferas, más
preferiblemente una línea celular de mamífero establecida,
incluyendo, sin limitación, líneas celulares CHO (p. Ej., ATCC CCL
61), COS-1 (p. Ej., ATCC CRL 1650), riñon de bebé
hámster (BHK) y HEK293 (p. Ej., ATCC CRL 1573; Graham et al.,
J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Una línea celular
BHK preferida es la línea celular tk-ts13 BHK
(Waechter y Baserga, Proc.Natl.Acad.Sci.USA
79:1106-1110, 1982), de ahora en adelante referidas
como células BHK 570. La línea celular BHK 570 es disponible en
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD
20852, con el número de acceso ATCC,CRL 10314. Una línea celular
tk-ts13 BHK también es disponible a partir del
número de acceso ATCC, CRL 1632. Otras líneas celulares adecuadas
incluyen, sin limitación, Rat Hep I (hepatoma de rata; ATCC CRL
1600), Rat Hep II (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL
139), pulmón humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) y
células DUKX (Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. US
77:4216-4220, 1980). Las células 3T3, las células
Namalwa, mielomas y fusiones de mielomas con otras células también
son útiles.
En otro aspecto, la invención proporciona un
animal no-humano transgénico que contiene y expresa
el constructo polinucleótido.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para producir el polipéptido del factor VII de la invención,
el método comprendiendo el cultivo de una célula comprendiendo el
constructo polinucleótido en un medio de crecimiento apropiado en
condiciones que permiten la expresión del constructo polinucleótido
y la recuperación del polipéptido resultante del medio de
cultivo.
Como se utiliza en este caso, el término
"medio de crecimiento apropiado" define un medio que contiene
nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las
células y la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos que
codifica el polipéptido del factor VII de la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para producir el polipéptido del factor VII, el método
comprendiendo la recuperación del polipéptido de la leche producida
por el animal transgénico.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición farmacéutica comprendiendo un polipéptido del factor VII
que comprende al menos tres sustituciones en relación con la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, donde dichas
sustituciones son (i) el reemplazo de F374 por cualquier otro
aminoácido, (ii) el reemplazo de S314 por cualquier otro aminoácido
y (iii) el reemplazo de L305 por cualquier otro aminoácido.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
de un polipéptido del factor VII comprendiendo al menos tres
sustituciones en relación con la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID NO:1, donde dichas sustituciones son (i) el reemplazo de F374 por
cualquier otro aminoácido (ii) el reemplazo de S314 por cualquier
otro aminoácido y (iii) el reemplazo de L305 por cualquier otro
aminoácido para la preparación de un medicamento para el tratamiento
de trastornos de sangrado o episodios de sangrado o para la mejora
del sistema hemostático normal. En una forma de realización el uso
es para el tratamiento de la hemofilia A o B.
En el presente contexto, el término
"tratamiento" está destinado a incluir ambas la prevención de
un sangrado esperado, como en cirugía, y la regulación de un
sangrado que se está produciendo, como en un traumatismo, con el
propósito de inhibir o minimizar el sangrado. La administración
profiláctica del polipéptido del factor VIIa según la invención se
incluye así en el término "tratamiento".
Los términos "episodios de sangrado" están
destinados a incluir un sangrado descontrolado y excesivo. Los
episodios de sangrado pueden ser un problema más importante tanto
con respecto a la cirugía como a otras formas de daños a tejidos. El
sangrado descontrolado y excesivo puede producirse en sujetos que
tienen un sistema de coagulación normal y en sujetos que tienen
trastornos de coagulación o de sangrado. Como se utiliza en este
caso, los términos "trastorno de sangrado" reflejan cualquier
defecto, congénito, adquirido o inducido, de origen celular o
molecular que se manifiesta en sangrados. Unos ejemplos son las
deficiencias del factor de coagulación (p. Ej. hemofilia A y B o
deficiencia de factores de coagulación XI o VII), los inhibidores
del factor de coagulación, la función plaquetaria defectuosa, la
trombocitopenia o la enfermedad de von Willebrand.
Las hemorragias excesivas también se producen en
sujetos que tienen una cascada de coagulación de sangre de
funcionamiento normal (sin deficiencia del factor de coagulación o
inhibidores contra cualquiera de los factores de coagulación) y
pueden ser causadas por una función plaquetaria defectuosa,
trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand. En casos de este
tipo, los sangrados pueden ser comparados con los sangrados causados
por la hemofilia, ya que el sistema hemostático, como en la
hemofilia, carece de o tiene "compuestos" de coagulación
esenciales anormales (tales como plaquetas o proteína de factor de
von Willebrand) que producen hemorragias graves. En los sujetos que
experimentan un daño de tejidos extensivo relacionado con la cirugía
o un traumatismo importante, el mecanismo hemostático normal puede
ser abrumado por la demanda de hemostasis inmediata y éstos pueden
desarrollar un sangrado a pesar de un mecanismo hemostático normal.
Se trata de una terapia para prevenir una enfermedad tromboembólica.
Este tipo de terapia puede incluir heparina, otras formas de
proteoglicanos, warfarina u otras formas de antagonistas de vitamina
K así como aspirina y otros inhibidores de agregación
plaquetaria.
En una forma de realización de la invención, el
sangrado se asocia con la hemofilia. En otra forma de realización,
el sangrado se asocia con la hemofilia con inhibidores adquiridos.
En otra forma de realización, el sangrado se asocia con la
trombocitopenia. En otra forma de realización, el sangrado se asocia
con la enfermedad de von Willebrand. En otra forma de realización,
el sangrado se asocia con un daño tisular severo. En otra forma de
realización, el sangrado se asocia con un traumatismo severo. En
otra forma de realización, el sangrado se asocia con la cirugía. En
otra forma de realización, el sangrado se asocia con la cirugía
laparoscópica. En otra forma de realización, el sangrado se asocia
con la gastritis hemorrágica. En otra forma de realización, el
sangrado es el sangrado uterino profuso. En otra forma de
realización, el sangrado se produce en órganos con una posibilidad
limitada de hemostasis mecánica. En otra forma de realización, el
sangrado se produce en el cerebro, en la región de oreja interna o
en los ojos. En otra forma de realización, el sangrado se asocia con
el proceso de toma de biopsias. En otra forma de realización, el
sangrado se asocia con una terapia anticoagulante.
El término "sujeto" como se utiliza en este
caso se destina a designar cualquier animal, en particular
mamíferos, tales como seres humanos, y, puede, donde sea apropiado,
ser utilizado indistintamente con el término "pacien-
te".
El término "mejora del sistema hemostático
normal" define una mejora de la capacidad para generar
trombina.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para el tratamiento de trastornos de sangrado o episodios de
sangrado en un sujeto o para la mejora del sistema hemostático
normal, el método comprendiendo la administración de una cantidad
terapéuticamente o profilácticamente eficaz de un polipéptido del
factor VII comprendiendo al menos dos sustituciones en relación con
la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1, donde dichas
sustituciones son (i) el reemplazo de F374 por cualquier otro
aminoácido, y (ii) el reemplazo por cualquier otro aminoácido de uno
o más aminoácidos seleccionados en el grupo que consiste en L305;
S314; K157; K337; D334; S336; V158; E296, y M298; a un sujeto que
necesite los mismos.
En otro aspecto, la invención se refiere al
polipéptido del factor VII de la invención para su uso como
medicamento.
En una forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde F374 se
sustituye por cualquier otro aminoácido y L305 se sustituye por
cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde F374 se
sustituye por cualquier otro aminoácido y S314 se sustituye por
cualquier otro aminoácido.
Los términos "mejora del sistema hemostático
normal" significa una mejora de la capacidad para generar
trombina.
En otro aspecto, la invención se refiere al
polipéptido del factor VII de la invención para un uso como
medicamento.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde F374 se
sustituye por cualquier otro aminoácido y L305 se sustituye por
cualquier otro aminoácido y S314 se sustituye por cualquier otro
aminoácido y K157 se sustituye por cualquier otro aminoácido.
En una forma de realización más de la invención,
el polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde F374 se
sustituye por cualquier otro aminoácido y L305 se sustituye por
cualquier otro aminoácido y S314 se sustituye por cualquier otro
aminoácido y K337 se sustituye por cualquier otro aminoácido.
\newpage
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde F374 se
sustituye por cualquier otro aminoácido y L305 se sustituye por
cualquier otro aminoácido y S314 se sustituye por cualquier otro
aminoácido y D334 se sustituye por cualquier otro aminoácido.
En una forma de realización más de la invención,
el polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde F374 se
sustituye por cualquier otro aminoácido y L305 se sustituye por
cualquier otro aminoácido y S314 se sustituye por cualquier otro
aminoácido y S336 se sustituye por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde F374 se
sustituye por cualquier otro aminoácido y L305 se sustituye por
cualquier otro aminoácido y S314 se sustituye por cualquier otro
aminoácido y V158 se sustituye por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde F374 se
sustituye por cualquier otro aminoácido y L305 se sustituye por
cualquier otro aminoácido y S314 se sustituye por cualquier otro
aminoácido y E296 se sustituye por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde F374 se
sustituye por cualquier otro aminoácido y L305 se sustituye por
cualquier otro aminoácido y S314 se sustituye por cualquier otro
aminoácido y M298 se sustituye por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde al menos un
aminoácido en las posiciones restantes en el dominio proteasa ha
sido reemplazado por cualquier otro aminoácido. En una forma de
realización, el polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde
un aminoácido en las posiciones restantes en el dominio proteasa ha
sido reemplazado por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde al menos 20
aminoácidos adicionales en las posiciones restantes en el dominio
proteasa han sido reemplazados por cualesquiera otros
aminoácidos.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde al menos un
aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición
seleccionada de 159-170 de la SEC ID NO:1 ha sido
reemplazado por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización más de la
invención, el polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde al
menos un aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición
seleccionada de 290-304 de la SEC ID NO: 1 ha sido
reemplazado por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde R304 ha sido
reemplazado por cualquier otro aminoácido. En una forma de
realización, R304 ha sido reemplazado por un aminoácido seleccionado
en el grupo que consiste en Tyr, Phe, Leu, y Met.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde al menos un
aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición
seleccionada de 306-312 de la SEC ID NO:1 ha sido
reemplazado por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde M306 ha sido
reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste
en Asp, y Asn.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde D309 ha sido
reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste
en Ser, y Thr.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde al menos un
aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición
seleccionada de 330-339 de la SEC ID NO:1 ha sido
reemplazado por cualquier otro aminoácido.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho D334 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Gly, y Glu.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho S336 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Thr, Cys,
Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho S336 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Gly, y Glu.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho V158 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Ala, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys,
Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho V158 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, y Glu.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho E296 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr,
Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho E296 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Arg, Lys, y Val.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho M298 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys,
Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho M298 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Lys, Arg, Gln, y Asn.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho L305 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Ala, Val, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys,
Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho L305 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Val, Tyr y Ile.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho L305 ha
sido reemplazado por Val.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho S314 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Thr, Cys,
Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho S314 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Gly, Lys, Gln y Glu.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho F374 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Ala, Val, Leu, Ile, Met, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys,
Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho F374 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Pro y Tyr.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde el aminoácido ha
sido reemplazado por un aminoácido distinto que puede ser codificado
por constructos polinucleótidos.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho
polipéptido del factor VII es el factor VII humano.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde dicho
polipéptido del factor VII es el factor VIIa humano.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde la proporción
entre la actividad de dicho polipéptido del factor VII y la
actividad del polipéptido del factor VIIa nativo mostrada en la SEC
ID NO:1 es al menos aproximadamente 1,25. En una forma de
realización, la proporción entre la actividad de dicho polipéptido
del factor VII y la actividad del polipéptido del factor VIIa nativo
mostrada en la SEC ID NO:1 es de al menos aproximadamente 2,0. En
otra forma de realización, la proporción entre la actividad de dicho
polipéptido del factor VII y la actividad del polipéptido del factor
VIIa nativo mostrada en la SEC ID NO:1 es de al menos
aproximadamente 4,0.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde la proporción
entre la actividad de dicho polipéptido del factor VII y la
actividad del polipéptido del factor VIIa nativo mostrada en la SEC
ID NO:1 es de al menos aproximadamente 1,25 cuando se evalúa en un
ensayo de actividad del factor VIIa. En una forma de realización, la
proporción entre la actividad de dicho polipéptido del factor VII y
la actividad del polipéptido del factor VIIa nativo mostrada en la
SEC ID NO:1 es de al menos aproximadamente 2,0 cuando se evalúa en
un ensayo de actividad del factor VIIa. En otra forma de
realización, la proporción entre la actividad de dicho polipéptido
del factor VII y la actividad del polipéptido del factor VIIa nativo
mostrada en la SEC ID NO:1 es de al menos aproximadamente 4,0 cuando
se evalúa en un ensayo de actividad del factor VIIa. La actividad
del factor VIIa puede ser medida por los ensayos descritos en los
ejemplos 3 o 4.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde la proporción
entre la actividad de dicho polipéptido del factor VII y la
actividad del polipéptido del factor VIIa nativo mostrada en la SEC
ID NO:1 es de al menos aproximadamente 1,25 cuando se evalúa en el
"ensayo de hidrólisis in vitro". En una forma de
realización, la proporción entre la actividad de dicho polipéptido
del factor VII y la actividad del polipéptido del factor VIIa nativo
mostrada en la SEC ID NO:1 es de al menos aproximadamente 2,0 cuando
se evalúa en el "ensayo de hidrólisis in vitro". En otra
forma de realización, la proporción entre la actividad de dicho
polipéptido del factor VII y la actividad del polipéptido del factor
VIIa nativo mostrada en la SEC ID N0.1 es de al menos
aproximadamente 4,0 cuando se evalúa en el "ensayo de hidrólisis
in vitro".
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es un polipéptido, donde la proporción
entre la actividad de dicho polipéptido del factor VII y la
actividad del polipéptido del factor VIIa nativo mostrada en la SEC
ID NO:1 es de al menos aproximadamente 1,25 cuando se evalúa en el
"ensayo de proteolisis in vitro". En una forma de
realización, la proporción entre la actividad de dicho polipéptido
del factor VII y la actividad del polipéptido del factor VIIa nativo
mostrada en la SEC ID NO:1 es de al menos aproximadamente 2,0 cuando
se evalúa en el "ensayo de proteolisis in vitro". En
otra forma de realización, la proporción entre la actividad de dicho
polipéptido del factor VII y la actividad del polipéptido del factor
VIIa nativo mostrada en la SEC ID NO:1 es de al menos
aproximadamente 4,0 cuando se evalúa en el "ensayo de proteolisis
in vitro". En otra forma de realización, la proporción
entre la actividad de dicho polipéptido del factor VII y la
actividad del polipéptido del factor VIIa nativo mostrada en la SEC
ID NO:1 es de al menos aproximadamente 8,0 cuando se evalúa en el
"ensayo de proteolisis in vitro".
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es FVII humano con al menos dos
sustituciones en relación con la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID NO:1, donde dichas sustituciones son (i) F374Y y (ii) uno o más
aminoácidos seleccionados en el grupo que consiste en K157X^{1},
K337A, D334X^{2}, S336X^{3}, V158X^{4}, E296V, M298Q, L305V,
S314E, donde X^{1} es Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, o Glu;
X^{2} es Gly o Glu; X^{3} es Gly o Glu; X^{4} es Thr o
Asp.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/K337A-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/V158D-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/E296V-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/M298Q-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/V158T-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/L305V-FVII. La
proporción entre la actividad de dicho polipéptido del factor VII y
la actividad del polipéptido del factor VIIa nativo mostrada en la
SEC ID NO:1 es de al menos aproximadamente 4,0 cuando se evalúa en
el "ensayo de proteolisis in vitro". En una forma de
realización más, la proporción entre la actividad de dicho
polipéptido del factor VII y la actividad del polipéptido del factor
VIIa nativo mostrada en la SEC ID NO:1 es al menos aproximadamente
8,0 cuando se evalúa en el "ensayo de proteolisis in
vitro".
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es FVII humano con al menos cuatro
sustituciones con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID NO:1, donde dichas sustituciones son (i) F374Y (ii) S314E, (iii)
L305V y (iv) uno o más aminoácidos seleccionados en el grupo que
consiste en K157X^{1}, K337A, D334X^{2}, S336X^{3},
V158X^{4}, E296V, M298Q, donde X^{1} es Gly, Val, Ser, Thr, Asn,
Gln, Asp, o Glu; X^{2} es Gly o Glu; X^{3} es Gly o Glu; X^{4}
es Thr o Asp.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es
F374Y/L305V/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es
F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es
F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es
F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es
F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es
F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/V158D/M298Q/K337A/
S314E-FVII.
S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es
F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es
F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es
F374Y/L305V/N158T/K337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es
F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es
F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/L305V/V158D/E296V/
M298Q/S314E-FVII.
M298Q/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/
S314E-FVII.
S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/L305V/E296V/K337A/
V158T/S314E-FVII.
V158T/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/L305V/M298Q/K337A/
V158T/S314E-FVII.
V158T/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/L305V/V158D/E296V/
K337A/S314E-FVII.
K337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/L305V/V158D/M298Q/
K337A/S314E-FVII.
K337A/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/L305V/E296V/M298Q/
K337A/V158T/S314E-FVII.
K337A/V158T/S314E-FVII.
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es F374Y/L305V/V158D/E296V/
M298Q/337A/S314E-FVII.
M298Q/337A/S314E-FVII.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es FVII humano con
- (i)
- las sustituciones de aminoácidos F374Y, L305V y S314E en relación con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, y
- (ii)
- una sustitución de aminoácidos independientemente seleccionada a partir de cualquier combinación según la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es FVII humano con
- (i)
- las sustituciones de aminoácidos, F374Y, L305V y S314V en relación con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, y
- (ii)
- dos sustituciones de aminoácidos independientemente seleccionadas a partir de cualquier combinación según la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es FVII humano con
- (i)
- las sustituciones de aminoácidos, F374Y, L305V y S314V en relación con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, y
- (ii)
- tres sustituciones de aminoácidos seleccionadas independientemente a partir de cualquier combinación según la tabla 1.
\newpage
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es FVII humano con
- (i)
- las sustituciones de aminoácidos, F374Y, L305V y S314V en relación con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, y
- (ii)
- cuatro sustituciones de aminoácidos seleccionadas independientemente a partir de cualquier combinación según la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es FVII humano con
- (i)
- las sustituciones de aminoácidos, F374Y, L305V y S314V en relación con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, y
- (ii)
- cinco sustituciones de aminoácidos seleccionadas independientemente a partir de cualquier combinación según la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización más de la invención,
el polipéptido del factor VII es FVII humano con
- (i)
- las sustituciones de aminoácidos, F374Y, L305V y S314V en relación con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, y
- (ii)
- seis sustituciones de aminoácidos seleccionadas independientemente a partir de cualquier combinación según la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VII es FVII humano con
- (i)
- las sustituciones de aminoácidos, F374Y, L305V y S314V en relación con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1, y
- (ii)
- siete sustituciones de aminoácidos seleccionadas independientemente a partir de cualquier combinación según la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
1
especificidad de sustrato. En otro
aspecto de la invención, la unión de las variantes de polipéptidos
al factor tisular no debería ser deteriorada y las variantes de
polipéptidos deberían tener al menos la actividad del factor VIIa de
tipo salvaje cuando se unen al factor
tisular.
La terminología para sustituciones de
aminoácidos usada en esta descripción es tal como se menciona a
continuación. La primera letra representa el aminoácido presente
naturalmente en una posición de la SEC ID NO:1. El número siguiente
representa la posición en la SEC ID NO: 1. La segunda letra
representa el aminoácido diferente de substitución del aminoácido
natural. Un ejemplo es L305V/K337A-FVII, la leucina
en la posición 305 de la SEC ID NO:1 se sustituye por una valina y
la lisina en la posición 337 de la SEC ID NO:1 se sustituye por una
alanina, ambas mutaciones en la misma variante del polipéptido del
factor VII.
En el contexto presente las indicaciones de tres
letras o de una letra de los aminoácidos han sido usadas en su
significado convencional como indicado en la tabla 2. A menos que se
indique explícitamente, los aminoácidos mencionados aquí son
L-aminoácidos. Además, en los extremos de izquierda
y derecha de una secuencia de aminoácidos de un péptido son,
respectivamente, los N- y C-terminales a menos que
se especifique lo contrario.
\newpage
La invención también se refiere a un método para
preparar variantes de polipéptidos del factor VII humano como se ha
mencionado anteriormente. Las variantes de polipéptidos del factor
VII descritas aquí pueden ser producidas por medio de técnicas de
ácido nucleico recombinante. En general, una secuencia clonada de
ácido nucleico del factor VII de tipo salvaje se modifica para
codificar la proteína deseada. Esta secuencia modificada se inserta
entonces en un vector de expresión, el cual sucesivamente es
transformado o transfectado en células huéspedes. Las células
eucarióticas superiores, en particular las células mamíferas
cultivadas, son preferidas como células huéspedes. Las secuencias
completas de nucleótidos y de aminoácidos para el factor VII humano
son conocidas (véase US 4,784,950, donde se describe la clonación y
la expresión del factor VII humano recombinante). La secuencia del
factor VII bovino se describe en Takeya et al., J. Biol.
Chem. 263:14868-14872 (1988)).
Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos
pueden ser realizadas por una variedad de técnicas. La modificación
de la secuencia de ácido nucleico puede ser por mutagénesis
específica de sitio. Las técnicas de mutagénesis específica de sitio
son muy conocidas en la técnica y se describen en, por ejemplo,
Zoller and Smith (DNA 3:479-488, 1984) o "Splicing
by extensión overlap", Horton et al., Gene 77, 1989,
páginas. 61-68. Por lo que, a través del uso de las
secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del factor VII, se puede
introducir alteración(es) de elección. Asimismo, los
procedimientos para preparar un constructo de ADN usando la reacción
en cadena de polimerasa con el uso de cebadores específicos son
conocidos por los expertos en la técnica (véase PCR Protocols, 1990,
Academic Press, San Diego, California, EEUU).
El constructo de ácido nucleico que codifica la
variante del polipéptido del factor VII de la invención puede ser de
forma apropiada de origen genómico o de ADNc, por ejemplo obtenido a
través de la preparación de una genoteca genómica o de ADNc y la
detección de secuencias de ADN que codifican todo o parte del
polipéptido por hibridación usando sondas de oligonucleótidos
sintéticas conformemente a técnicas estándares (véase Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).
El constructo de ácido nucléico que codifica la
variante del polipéptido del factor VII puede también ser preparado
sintéticamente por métodos estándares establecidos, p. Ej. el método
de fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron
Letters 22 (1981), 1859 - 1869, o el método descrito por Matthes
et al., EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805. Según el método de
fosfoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, p. ej. en un
sintetizador automático de ADN, purificado, recocido, ligado y
clonado en vectores adecuados. Las secuencias de ADN que codifican
las variantes del polipéptido del factor humano VII también pueden
ser preparadas por reacción en cadena de polimerasa usando cebadores
específicos, por ejemplo, como se describe en US 4,683,202, Saiki
et al., Science 239 (1988), 487 - 491, o Sambrook et
al., supra.
Además, el constructo de ácido nucleico puede
ser de origen sintético y genómico mezclado, sintético y ADNc
mezclado o genómico y ADNc mezclado, preparado por ligar fragmentos
de origen sintético, genómico o de ADNc (como apropiado), los
fragmentos correspondientes a varias partes del constructo entero de
ácidos nucleicos, conformemente a técnicas estándares.
El constructo de ácido nucleico es
preferiblemente un constructo de ADN. Las secuencias de ADN para el
uso en la producción de variantes de polipéptidos del factor VII
según la presente invención codificarán típicamente un polipéptido
pre-pro en el amino-terminal del
factor VII para obtener el proceso postranslacional adecuado (p. ej.
gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico)
y secreción de la célula huésped. El polipéptido
pre-pro puede ser el del factor VII u otra proteína
de plasma dependiente de vitamina K, tal como el factor IX, factor
X, protrombina, proteína C o proteína S. Como podrán apreciar los
expertos en la técnica, unas modificaciones adicionales pueden ser
hechas en la secuencia de aminoácidos de las variantes de
polipéptidos del factor VII donde estas modificaciones no perjudican
significativamente la capacidad de la proteína para actuar como
coagulante. Por ejemplo, las variantes de polipéptidos del factor
VII pueden ser modificadas también en el sitio de corte de
activación para inhibir la conversión del factor VII zimógeno en su
forma bicatenaria activada, como se describe generalmente en US
5,288,629, incorporado aquí como referencia.
Las secuencias de ADN que codifican las
variantes de polipéptidos del factor humano VII normalmente se
insertan en un vector recombinante que puede ser cualquier vector,
que convenientemente puede ser sometido a procedimientos de ADN
recombinante, y la elección del vector frecuentemente dependerá de
la célula huésped en la que debe ser introducido. Por lo que, el
vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un
vector que existe en forma de entidad extracromosómica, cuya
replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej.
un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser un vector, el
cual, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el
genoma de la célula huésped y se replica junto al/a los
cromosoma(s) en el, lo(s) cual se ha integrado.
El vector es preferiblemente un vector de
expresión en el que la secuencia de ADN que codifica las variantes
de polipéptidos del factor VII humano está unido operativamente a
segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ADN. En
general, el vector de expresión deriva del ADN plásmido o vírico, o
puede contener elementos de ambos. Los términos "ligados
operativamente" indica que los segmentos están dispuestos de modo
que funcionen de forma concertada para conseguir sus objetivos, p.
ej. la transcripción se inicia en un promotor y continúa a través de
la secuencia de ADN codificante del polipéptido.
Los vectores de expresión para el uso en la
expresión de las variantes de polipéptidos del factor VIIa
comprenderán un promotor capaz de dirigir la transcripción de un gen
clonado o ADNc. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN,
que muestra una actividad transcripcional en la célula huésped
seleccionada y puede derivar de los genes que codifican proteínas
homologas o heterólogas a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción del ADN que codifica la variante del polipéptido del
factor humano VII en células mamíferas son el promotor SV40
(Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981),
854-864), el promotor MT-1 (gen de
metalotioneína) (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809 -
814), el promotor CMV (Boshart et al., Cell
41:521-530, 1985) o el promotor tardío mayor de
adenovirus 2 (Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol,
2:1304-1319, 1982).
Un ejemplo de promotor adecuado para el uso en
células de insectos es el promotor de polihedrina (US 4,745,051;
Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11), el promotor
P10 (J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, Págs.
765-776), el promotor de proteína básica del virus
de polihedrosis Autographa califomica (EP 397 485), el
promotor de gen 1 inmediato-precoz de baculovirus
(US 5,155,037; US 5,162,222), o el promotor
precoz-retrasado del gen baculovirus 39K (US
5,155,037; US 5,162,222).
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes de levadura incluyen promotores de genes
glicolíticos de levadura (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255
(1980), 12073 - 12080; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1
(1982), 419 - 434) o genes de alcohol deshidrogenasa (Young et
al., en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals
(Hollaender et al, eds.) Plenum Press, Nueva York, 1982), o
los promotores TPI1 (US 4,599,311) o ADH2-4c
(Russell et al., Nature 304 (1983), 652 - 654).
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes de hongos filamentosos son, por ejemplo, el
promotor ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093 -
2099) o el promotor tpiA. Ejemplos de otros promotores útiles son
aquellos derivados del gen que codifica la amilasa de A.
oryzae TAKA, la proteinasa aspártica de Rhizomucor
miehei, la \alpha-amilasa neutral de A.
niger, la \alpha-amilasa estable en ácido de
A. niger, la glucoamilasa de A. niger o de A.
awamori (gluA), la lipasa de Rhizomucor miehei, la
proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa
de A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans. Se
prefiere los promotores de TAKA-amilasa y de gluA.
Los promotores adecuados están mencionados en, p. ej. EP 238 023 y
EP 383 779.
Las secuencias de ADN que codifican las
variantes de polipéptidos del factor humano VII pueden también, si
es necesario, estar conectadas operativamente a un terminador
adecuado, tal como el terminador de la hormona de crecimiento humano
(Palmiter et al., Science 222, 1983, páginas.
809-814) o los terminadores TPI1 (Alber y Kawasaki,
J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, Págs. 419-434) o ADH3
(McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, Págs.
2093-2099). Los vectores de expresión también pueden
comprender un conjunto de sitios de unión de ARN situados hacia
abajo del promotor y hacia arriba a partir del sitio de inserción de
la misma secuencia del factor VII. Sitios de empalme de ARN
preferidos pueden ser obtenidos a partir de genes de adenovirus y/o
de inmunoglobulina. También está contenida en los vectores de
expresión una señal de poliadenilación situada hacia abajo del sitio
de la inserción. Las señales de poliadenilación particularmente
preferidas incluyen la señal de poliadenilación precoz o tardía de
SV40 (Kaufman y Sharp, ibid.), la señal de poliadenilación de
la región de adenovirus 5 Elb, el terminador de gen de hormona de
crecimiento humano (DeNoto et al. Nucí. Acids Res.
9:3719-3730, 1981) o la señal de poliadenilación
del gen de factor VII humano o del gen de factor VII bovino. Los
vectores de expresión también pueden incluir una secuencia líder
viral no codificante, tal como el líder tripartito de adenovirus 2,
situada entre el promotor y los sitios de unión de ARN; y las
secuencias potenciadoras, tal como el potenciador SV40.
Para dirigir las variantes de polipéptidos del
factor humano VII de la presente invención en la vía secretora de
las células huéspedes, una secuencia señal secretora (también
conocida como secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre)
puede ser provista en el vector recombinante. La secuencia señal
secretora se une a las secuencias de ADN que codifican las variantes
de polipéptidos del factor humano VII en el marco de lectura
adecuado. Las secuencias señal secretoras normalmente tienen una
posición 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el
péptido. La secuencia señal secretora puede ser que, normalmente
asociada con la proteína o puede proceder de un gen que codifica
otra proteína segregada.
Para segregar células de levadura, la secuencia
señal secretora puede codificar cualquier péptido señal, que asegura
la dirección eficiente de las variantes expresadas de polipéptidos
del factor humano VII en la vía secretora de la célula. El péptido
señal puede ser un péptido señal producido de forma natural, o una
parte funcional de éste, o puede ser un péptido sintético. Los
péptidos señal adecuados se revelaron ser el péptido señal
de\alpha-factor (véase US 4,870,008), el péptido
señal de amilasa salival de ratón (véase O. Hagenbuchle et
al., Nature 289, 1981, Págs. 643-646), un
péptido señal de carboxipeptidasa modificada (véase L.A. Valls et
al., Cell 48, 1987, Págs. 887-897), el péptido
señal BAR1 de levadura (véase WO 87/02670), o el péptido señal de
proteasa aspártica de levadura 3 (YAP3) (véase M.
Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, Págs.
127-137).
Para una secreción eficiente en levadura, una
secuencia de codificación de un péptido líder también puede ser
insertada hacia abajo de la secuencia señal y hacia arriba de la
secuencia de ADN de codificación de las variantes de polipéptidos
del factor humano VII. La función del péptido líder es permitir que
el péptido expresado sea dirigido desde el retículo endoplásmico
hacia el aparato de Golgi y después hacia una vesícula secretora
para la secreción dentro del medio de cultivo (es decir, exportación
de las variantes de polipéptidos del factor humano VII a través de
la pared celular o al menos a través de la membrana celular dentro
del espacio periplásmico de la célula de levadura). El péptido líder
puede ser el líder alfa-factor de levadura (cuyo uso
se describe en p. ej. US 4,546,082, US 4,870,008, EP 16 201, EP 123
294, EP 123 544 y EP 163 529). Alternativamente, el péptido líder
puede ser un péptido líder sintético, es decir, un péptido líder no
presente en la naturaleza. Los péptidos líder sintéticos pueden, por
ejemplo, ser construidos tal como se describe en WO 89/02463 o WO
92/11378.
Para un uso en hongos filamentosos, el péptido
señal puede derivar convenientemente de un gen de codificación de
una amilasa o glucoamilasa de Aspergillus sp., un gen de
codificación de una lipasa de Rhizomucor miehei o una
proteasa o lipasa de Humicola ianuginosa. El péptido señal
preferiblemente deriva de un gen que codifica una amilasa TAKA de
A. oryzae, una \alpha-amilasa neutral de
A. niger, una amilasa estable al ácido de A. Niger, o
una glucoamilasa de A. niger. Los péptidos señal adecuados se
divulgan en, p. ej. EP 238 023 y EP 215 594.
Para un uso en células de insecto, el péptido
señal puede derivar convenientemente de un gen de insectos (véase WO
90/05783), tal como el péptido señal precursor de hormona
adipocinética Manduca sexta de lepidóptero (véase US
5,023,328).
Los procedimientos usados para ligar las
secuencias de ADN codificantes de las variantes del polipéptido del
factor humano VII, el promotor y opcionalmente el terminador y/o la
secuencia señal secretora, respectivamente, y para su inserción en
vectores adecuados comprendiendo la información necesaria para la
replicación, son bien conocidos por los expertos en la técnica
(véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Los métodos de transfeccción de células
mamíferas y de expresión de secuencias de ADN introducidas en las
células se describen en p. ej. Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159
(1982), 601 - 621; Southern y Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982),
327 - 341; Loyter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 79
(1982), 422 - 426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725;
Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham y van
der Eb, Virology 52 (1973), 456; y Neumann et al., EMBO J. 1
(1982), 841 - 845.
Las secuencias de ADN clonadas se introducen en
células mamíferas cultivadas, por ejemplo, por transfección mediada
por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell
14:725-732, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell
Genetics 7:603-616, 1981; Graham y van der Eb,
Virology 52d:456-467, 1973) o la electroporación
(Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982).
Para identificar y seleccionar células que expresan el ADN exógeno,
un gen que confiere un fenotipo seleccionable (un marcador
seleccionable) generalmente se introduce en células junto con el gen
o el ADNc de interés. Los marcadores seleccionables preferidos
incluyen genes que confieren resistencia a fármacos tales como
neomicina, higromicina, y metotrexato. El marcador seleccionable
puede ser un marcador seleccionable amplificable. Un marcador
seleccionable amplificable preferido es una secuencia de
dihidrofolato reductasa (DHFR). Los marcadores seleccionables son
revisados por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth
Publishers, Stoneham, MA, incorporados aquí como referencia). El
experto en la técnica podrá elegir fácilmente marcadores
seleccionables adecuados.
Los marcadores seleccionables pueden ser
introducidos en la célula en un plásmido separado al mismo tiempo
que el gen de interés, o pueden ser introducidos en el mismo
plásmido. Si, en el mismo plásmido, el marcador seleccionable y el
gen de interés pueden estar bajo el control de diferentes promotores
o del mismo promotor, esta última disposición produciendo un mensaje
dicistrónico. Tales constructos son conocidos en la técnica (por
ejemplo, Levinson y Simonsen, US 4,713,339). También puede ser
ventajoso añadir ADN adicional, conocido como "ADN portador," a
la mezcla que se introduce en las células.
Después de que las células hayan asimilado el
ADN, éstas crecen en un medio de crecimiento apropiado, típicamente
de 1-2 días, para iniciar la expresión del gen de
interés. Como se utiliza en este caso los términos "medio de
crecimiento apropiado" indican un medio que contiene nutrientes y
otros componentes requeridos para el crecimiento de células y la
expresión de las variantes de polipéptidos del factor humano VII de
interés. Los medios generalmente incluyen una fuente de carbono, una
fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, azúcares esenciales,
vitaminas, sales, fosfolípidos, proteínas y factores de crecimiento.
Para la producción de proteínas gamma-carboxiladas,
el medio comprenderá vitamina K, preferiblemente en una
concentración de aproximadamente 0,1 \mug/ml a aproximadamente 5
\mug/ml. La selección de fármacos se aplica entonces para
seleccionar el crecimiento de células que están expresando el
marcador seleccionable de forma estable. Para células que han sido
transfectadas con un marcador seleccionable amplificable, la
concentración del fármaco puede ser aumentada para seleccionar un
número de copias en aumento de las secuencias clonadas, aumentando
de este modo los niveles de expresión. Los clones de células
transfectadas de manera estable son seleccionados entonces para la
expresión de la variante de polipéptido del factor humano VII de
interés.
La célula huésped en la que se introducen las
secuencias de ADN de codificación de las variantes de polipéptidos
del factor humano VII puede ser cualquier célula, que sea capaz de
producir las variantes de polipéptidos del factor humano VII
postranslacionales modificadas e incluya levadura, hongos y células
eucarióticas superiores.
Ejemplos de líneas celulares mamíferas para un
uso en la presente invención son las líneas celulares de
COS-1 (ATCC CRL 1650), de riñon de bebé hámster
(BHK) y 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol.
36:59-72, 1977). Una línea celular BHK preferida es
la línea celular BHK tk-ts13 (Waechter y Baserga,
Proc. Nati. Acad. Sci. US 79:1106-1110, 1982,
incorporada aquí como referencia), referida a continuación como
células BHK 570. La línea celular BHK 570 ha sido depositada con la
colección American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr.,
Rockville, Md. 20852, bajo el número de acceso de ATCC CRL 10314.
Una línea celular BHK tk'' ts13 también está disponible bajo el
número de acceso de ATCC CRL 1632. Además, una serie de otras líneas
celulares puede ser usada en la presente invención, incluyendo
células de Rat Hep I (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Rat Hep II
(hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), de pulmón
humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61) y
DUKX (Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. US
77:4216-4220,
1980).
1980).
Ejemplos de células de levadura adecuadas
incluyen células de Saccharomyces spp. o
Schizosaccharomyces spp., en particular cepas de
Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces kluyveri.
Métodos para transformar células de levadura con ADN heterólogo y
para producir polipéptidos heterólogos de éstas se describen, p. ej.
en US 4,599,311, US 4,931,373, US 4,870,008, 5,037,743, y US
4,845,075, lo cual en conjunto se incorpora en la presente como
referencia. Las células transformadas son seleccionadas por un
fenotipo determinado por un marcador seleccionable, comúnmente
resistente a los fármacos o que es capaz de crecer en ausencia de un
nutriente particular, p. ej. leucina. Un vector preferido para el
uso en la levadura es el vector POT1 descrito en US 4,931,373. Las
secuencias de ADN de codificación de las variantes de polipéptidos
del factor humano VII pueden ser precedidas por una secuencia señal
y opcionalmente una secuencia líder, p. ej. como descrito
anteriormente. Otros ejemplos de células de levadura adecuadas son
cepas de Kluyveromices, tales como K. lactis,
Hansenula, p. ej. H. polymorpha, o Pichia, p.
ej. P. pastoris (véase Gleeson et al., J. Gen.
Microbiol. 132, 1986, páginas 3459-3465; US
4,882,279).
Ejemplos de otras células de hongos son células
de hongos filamentosos, p. ej. Aspergillus spp.,
Neurospora spp., Fusañum spp. o Trichoderma
spp., en particular cepas de A. oryzae, A. nidulans o
A. Niger. El uso de Aspergillus spp. para la expresión
de proteínas se describe, p. ej. en EP 272 277, EP 238 023, EP 184
438. La transformación de F. oxysporum, por ejemplo, puede
realizarse como descrito por Malardier et al., 1989, Gene 78:
147-156. La transformación de Trichoderma
spp. puede ser realizada por ejemplo como se describe en EP 244
234.
Cuando se utiliza un hongo filamentoso como
célula huésped, éste puede ser transformado con el constructo de ADN
de la invención, convenientemente por integración del constructo de
ADN en el cromosoma huésped para obtener una célula huésped
recombinante. Esta integración se considera generalmente como una
ventaja, ya que la secuencia de ADN tiene más probabilidad a ser
mantenida de manera estable en la célula. La integración de los
constructos de ADN en el cromosoma huésped puede ser realizada según
los métodos convencionales, p. ej. por recombinación homologa o
heteróloga.
La transformación de células de insecto y
asimismo producción de polipéptidos heterólogos pueden ser
realizadas tal como se describe en US 4,745,051; US 4,879,236; US
5,155,037, 5,162,222; EP 397,485) todos incorporados aquí como
referencia. La línea celular de insecto usada como el huésped
adecuadamente puede ser una línea celular de Lepidoptera, tal como
células de Spodoptera frugiperda o células de Trichoplusia ni
(véase US 5,077,214). Las condiciones de cultivo adecuadamente
pueden ser tal y como se describen en, por ejemplo, WO 89/01029 o WO
89/01028, o cualquiera de las referencias mencionadas
anteriormente.
La célula huésped transformada o transfectada
descrita anteriormente entonces se cultiva en un medio nutritivo
adecuado en condiciones que permiten la expresión de la variante de
polipéptido del factor humano VII después de la cual, todo o parte
del péptido resultante puede ser recuperado del cultivo. El medio
usado para cultivar las células puede ser cualquier medio
convencional adecuado para disponer las células huéspedes en
crecimiento, tal como unos medios mínimos o complejos comprendiendo
suplementos apropiados. Los medios adecuados son disponibles a
través de proveedores comerciales o pueden ser preparados según
fórmulas publicadas (p. ej. en catálogos de American Type Culture
Collection). La variante del polipéptido del factor humano VII
producida por las células entonces puede ser recuperada a partir del
medio de cultivo por procedimientos convencionales incluyendo la
separación de las células huéspedes del medio por centrifugación o
filtración, precipitación de los componentes proteináceos del
sobrenadante o filtrado mediante una sal, p. ej. sulfato de amonio,
purificación por una variedad de procedimientos cromatográficos, p.
ej. cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de gel
filtración, cromatografía de afinidad, o similares, dependiendo del
tipo de polipéptido en cuestión.
La tecnología de animales transgénicos puede ser
empleada para producir las variantes de polipéptidos del factor VII
de la invención. Se prefiere producir las proteínas dentro de las
glándulas mamarias de un mamífero hembra huésped. La expresión en la
glándula mamaria y la secreción posterior de la proteína de interés
en leche supera muchas dificultades presentes en el aislamiento de
proteínas de otras fuentes. La leche es recogida fácilmente, está
disponible fácilmente en grandes cantidades, y está bien
caracterizada bioquímicamente. Además, las principales proteínas de
la leche están presentes en la leche en altas concentraciones
(típicamente de aproximadamente 1 a 15 g/l).
Desde un punto de vista comercial, se prefiere
claramente el uso como huésped de una especie que tenga un gran
rendimiento de leche. Mientras que los animales más pequeños como
ratones y ratas pueden ser usados (y son los preferidos en la prueba
de la etapa de principio), se prefiere el uso de mamíferos de ganado
incluyendo, pero sin limitarse a éstos, cerdos, cabras, ovejas y
ganado vacuno. Las ovejas son particularmente preferidas debido a
factores tales como los de la historia precedente de transgénesis en
esta especie, rendimiento de la leche, coste y disponibilidad
preparada de equipamiento para la recogida de leche de oveja (véase,
por ejemplo, WO 88/00239 para una comparación de factores que
influyen en la selección de especies huéspedes). Generalmente es
deseable seleccionar una raza de animales huéspedes criados para el
uso de la leche, como las ovejas Frisia Oriental, o para introducir
ganado lechero por crianza de la línea transgénica en una fecha
tardía. En cualquier caso, se usará animales en buen estado de salud
conocido.
Para obtener la expresión en la glándula
mamaria, se utiliza un promotor de transcripción de un gen de
proteína de leche. Los genes de proteína de leche incluyen esos
genes de codificación de caseínas (véase US 5,304,489),
beta-lactoglobulina,
a-lactoalbúmina, y proteína de suero de leche ácida.
Se prefiere el promotor de beta-lactoglobulina
(BLG). En el caso del gen ovino de
beta-lactoglobulina, se usará generalmente una
región de al menos el proximal de 406 pb de secuencia flanqueadora
5' del gen, aunque se prefieren porciones mayores de secuencia
flanqueadora 5', hasta aproximadamente 5kpb, tal como un segmento de
ADN de \sim4.25 kpb que incluye el promotor flanqueante 5' y la
porción no codificante del gen de
beta-lactoglobulina (véase Whitelaw et al.,
Biochem. J. 286: 31-39 (1992)). Fragmentos similares
de ADN promotor de otras especies también son adecuados.
Otras regiones del gen de
beta-lactoglobulina también pueden ser incorporadas
en los constructos, como las regiones genómicas del gen que debe ser
expresado. Es generalmente aceptado en la técnica que los
constructos que carecen de intrones, por ejemplo, se expresen poco
en comparación con los que contienen tales secuencias de ADN (véase
Brinster et al., Proc. Nati. Acad. Sci. US 85:
836-840 (1988); Palmiter et al., Proc. Nati.
Acad. Sci. US 88: 478-482 (1991); Whitelaw et
al., Transgenic Res. 1: 3-13 (1991); WO
89/01343; y WO 91/02318, cada uno de éstos incorporado aquí como
referencia). A este respecto, generalmente se prefiere, donde sea
posible, usar secuencias genómicas comprendiendo todos o algunos de
los intrones nativos de un gen de codificación de la proteína o
polipéptido de interés, por lo que se prefiere otra inclusión de al
menos algunos intrones de, p. ej, el gen de
beta-lactoglobulina. Esta región es un segmento de
ADN que provee la eliminación de intrones y la poliadenilación de
ARN de la región no codificante 3' del gen de
beta-lactoglobulina de ovino. Cuando se sustituye
por secuencias no codificantes naturales 3' de un gen, este segmento
de beta-lactoglobulina de ovino puede al mismo
tiempo mejorar y estabilizar los niveles de expresión de la proteína
o del polipéptido de interés. En otras formas de realización, la
región alrededor de la iniciación ATG de la secuencia del factor VII
variante es sustituida por secuencias correspondientes de un gen de
proteína específica de la leche. Tal sustitución provee un entorno
de iniciación específica putativa al tejido para mejorar la
expresión. Es conveniente reemplazar el factor VII entero de
variante pre-pro y las secuencias no codificadas 5'
por las de, por ejemplo, el gen BLG, aunque las regiones más
pequeñas pueden ser reemplazadas.
Para la expresión de variantes de polipéptidos
del factor VII en animales transgénicos, un segmento de ADN de
codificación de la variante del factor VII se une operativamente a
segmentos de ADN adicionales requeridos para su expresión para
producir unidades de expresión. Estos segmentos adicionales incluyen
el promotor mencionado anteriormente, así como secuencias que
proveen la terminación de la transcripción y la poliadenilación de
ARNm. Las unidades de expresión incluyen también un segmento de ADN
de codificación de una secuencia señal secretora unida
operativamente al segmento de codificación del factor VII
modificado. La secuencia señal secretora puede ser una secuencia
señal secretora del factor VII nativo o puede ser la de otra
proteína, tal como una proteína de leche (véase, por ejemplo, von
Heijne, Nucí. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986); y
Meade et al., US 4,873,316, que se incorporan aquí como
referencia).
La construcción de unidades de expresión para su
uso en animales transgénicos se realiza convenientemente por
inserción de una secuencia variante del factor VII en un plásmido o
vector de fago comprendiendo los segmentos de ADN adicionales,
aunque la unidad de expresión puede ser construida por esencialmente
cualquier secuencia de ligaduras. Es particularmente conveniente
proveer un vector comprendiendo un segmento de ADN que codifica una
proteína de leche y reemplazar la secuencia codificante para la
proteína de leche por la secuencia de una variante del Factor VII;
creando de este modo una fusión de genes que incluye las secuencias
de control de la expresión del gen de proteína de leche. En
cualquier caso, la clonación de las unidades de expresión en
plásmidos u otros vectores facilita la amplificación de la secuencia
del factor VII variante. La amplificación se realiza
convenientemente en células huéspedes bacterianas (p. ej. E.
coli), por lo que los vectores incluirán típicamente un origen
de replicación y un marcador seleccionable funcional en células
huéspedes bacterianas. La unidad de expresión se introduce entonces
en huevos fertilizados (incluyendo embriones de fase inicial) de las
especies huéspedes elegidas. Se puede conseguir la introducción de
ADN heterólogo a través de una de varias vías, incluyendo la
microinyección (p. ej. patente EEUU nº. 4,873,191), la infección
retroviral (Jaenisch, Science 240: 1468-1474 (1988))
o la integración dirigida al sitio usando células madre embrionarias
(ES) (revisada por Bradley et al., Bio/Technology 10:
534-539 (1992)). Los huevos se implantan después en
los oviductos o úteros de mujeres seudogestantes y dispuestos para
desarrollarse a largo plazo. La descendencia que lleva el ADN
introducido en su línea de germen puede pasar el ADN a su progenie
en una forma mendeliana normal, permitiendo el desarrollo de rebaños
transgénicos. Procedimientos generales para producir animales
transgénicos se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Hogan
et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al.,
Bio/Technology 6: 179-183 (1988); Wall et
al., Biol. Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhler
et al., Bio/Technology 8: 140-143 (1990);
Ebert et al., Bio/Technology 9: 835-838
(1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:
844-847 (1991); Wall et al., J. Cell.
Biochem. 49: 113-120 (1992); US 4,873,191; US
4,873,316; WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; y GB 87/00458).
Técnicas para introducir secuencias de ADN extranjeras en mamíferos
y sus células germinales fueron desarrolladas originalmente en el
ratón (véase, p. ej., Gordon et al., Proc. Nati. Acad. Sci.
US 77: 7380-7384 (1980); Gordon y Ruddle, Science
214: 1244-1246 (1981); Palmiter y Brinster, Cell
41: 343-345 (1985); Brinster et al., Proc.
Nati. Acad. Sci. US 82: 4438-4442 (1985); y Hogan
et al. (ibid.)). Estas técnicas fueron adaptadas
posteriormente para su uso con animales más grandes, incluyendo
especies de ganadería (véase, p. ej., WO 88/00239, WO 90/05188, y WO
92/11757; y Simons et al., Bio/Technology 6:
179-183 (1988)). Para resumir, en la vía más
eficiente usada hasta la fecha en la generación de ratones
transgénicos o ganado, se inyectan varios centenares de moléculas
lineales del ADN de interés en uno de los
pro-núcleos de un huevo fertilizado según las
técnicas establecidas. La inyección de ADN en el citoplasma de un
cigoto también puede ser empleada.
La producción en plantas transgénicas también
puede ser empleada. La expresión puede ser generalizada o dirigida a
un órgano particular, tal como un tubérculo (véase, Hiatt, Nature
344:469-479 (1990); Edelbaum et al., J.
Interferon Res. 12:449-453 (1992); Sijmons et
al., Bio/Technology 8:217-221 (1990); y EP 0 255
378).
Las variantes de polipéptidos del factor VII de
la invención se recuperan a partir del medio de cultivo celular o de
la leche. Las variantes de polipéptidos del factor VII de la
presente invención pueden ser purificadas por medio de una variedad
de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin
limitarse a éstos, la cromatografía (p. ej., de intercambio iónico,
de afinidad, hidrofóbica, de cromatoenfoque, y de exclusión de
tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque
preparativo (IEF), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de
sulfato de amonio), o extracción (véase, p. ej., Protein
Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers,
Nueva York, 1989). Preferiblemente, pueden ser purificadas por
cromatografía de afinidad en una columna de anticuerpos del
anti-factor VII. Se prefiere particularmente el uso
de anticuerpos monoclonales dependientes del calcio, como descrito
por Wakabayashi et al., J. Biol. Chem.
261:11097-11108; (1986) y Thim et al.,
Biochemistry 27: 7785-7793; (1988). La purificación
adicional puede ser conseguida por medios convencionales de
purificación química, como la cromatografía líquida de alto
rendimiento. Otros métodos de purificación, incluyendo la
precipitación con citrato de bario, se conocen en la técnica, y se
puede aplicar a la purificación de las nuevas variantes de
polipéptidos del factor VII descritas aquí (véase, por ejemplo,
Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag,
N.Y., 1982).
Con fines terapéuticos se prefiere que las
variantes de polipéptidos del factor VII de la invención sean
sustancialmente puras. Así, en una forma de realización preferida de
la invención, se purifica las variantes de polipéptidos del factor
VII de la invención en al menos aproximadamente el 90 al 95% de
homogeneidad, preferiblemente al menos aproximadamente el 98% de
homogeneidad. La pureza puede ser evaluada p. ej. por electroforesis
en gel y secuenciación de aminoácidos
amino-terminal.
La variante del Factor VII se divide en su sitio
de activación para convertirla en su forma bicatenaria. La
activación se puede realizar según los procedimientos conocidos en
la técnica, como los que describen Osterud, et al.,
Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, patente US
nº. 4,456,591; Hedner y Kisiel, J. Clin. Invest.
71:1836-1841 (1983); o Kisiel y Fujikawa, Behring
Inst. Mitt. 73:29-42 (1983). Alternativamente, como
describen Bjoem et al. (Research Disclosure, 269 septiembre
de 1986, Págs. 564-565), el factor VII puede ser
activado a través del paso por una columna de cromatografía de
intercambio iónico, tal como Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) o
similares. La variante activada del factor VII resultante entonces
puede ser formulada y administrada tal como se describe más
abajo.
La invención también provee ensayos adecuados
para seleccionar las variantes preferidas del factor VIIa según la
invención. Estos ensayos pueden ser realizados como una prueba
preliminar simple in vitro.
Así, el ejemplo 3 aquí divulga una prueba simple
(titulada "ensayo de hidrólisis in vitro") para la
actividad de las variantes del factor VIIa de la invención. En base
a esto, las variantes del factor VIIa que son de interés particular
son aquellas variantes donde la proporción entre la actividad de la
variante y la actividad del factor VII nativo mostrada en la Fig. 1
es superior a 1,0, p. ej. al menos aproximadamente 1,25,
preferiblemente al menos aproximadamente 2,0, tal como al menos
aproximadamente 3,0 o, aún más preferiblemente, al menos
aproximadamente 4,0 cuando se evalúa en el "ensayo de hidrólisis
in vitro".
La actividad de las variantes también se puede
medir utilizando un sustrato fisiológico tal como el factor X
("ensayo de proteolisis in vitro") (véase el Ejemplo 4),
adecuadamente en una concentración de 100-1000 nm,
donde se mide el factor Xa generado después de la adición de un
sustrato cromogénico adecuado (por ejemplo S-2765).
Además, se puede realizar el ensayo de actividad a temperatura
fisiológica.
La capacidad de las variantes del factor VIIa
para generar trombina también se puede medir en un ensayo que
comprende todos los factores de coagulación e inhibidores
pertinentes en concentraciones fisiológicas - sus células germinales
fueron desarrolladas originalmente en el ratón (véase, p. ej.,
Gordon et al., Proc. Nati. Acad. Sci. US 77:
7380-7384 (1980); Gordon y Ruddle, Science 214:
1244-1246 (1981); Palmiter y Brinster, Cell 41:
343-345 (1985); Brinster et al., Proc. Nati.
Acad. Sci. US 82: 4438-4442 (1985); y Hogan et
al. (ibid.)). Estas técnicas fueron posteriormente
adaptadas para un uso con animales más grandes, incluyendo las
especies de ganadería (véase, p. ej., WO 88/00239, WO 90/05188, y WO
92/11757; y Simons et al., Bio/Technology 6:
179-183 (1988)). En resumen, en la vía más eficiente
utilizada hasta la fecha para la generación de ratones transgénicos
o de ganadería, varios centenares de moléculas lineales del ADN de
interés se inyectan en uno de los pro-núcleos de un
huevo fertilizado según las técnicas establecidas. La inyección de
ADN en el citoplasma de un cigoto también puede ser empleada.
Las variantes de polipéptidos del factor VII de
la invención se recuperan en el medio de cultivo celular o de la
leche. Las variantes de polipéptidos del factor VII de la presente
invención pueden ser purificadas por una variedad de procedimientos
conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a éstos, la
cromatografía (p. ej., de intercambio iónico, de afinidad,
hidrofóbica, de cromatoenfoque, y de exclusión de tamaño), los
procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque
preparativo (IEF), la solubilidad diferencial (p. ej., precipitación
de sulfato de amonio), o la extracción (véase, p. ej., Protein
Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers,
New York, 1989). Preferiblemente, pueden ser purificadas por
cromatografía de afinidad en una columna de anticuerpos
anti-factor VII. Se prefiere particularmente el uso
de anticuerpos monoclonales dependientes del calcio, tal como
describen Wakabayashi et al., J. Biol. Chem.
261:11097-11108; (1986) y Thim et al.,
Biochemistry 27: 7785-7793; (1988). La purificación
adicional puede obtenerse por medios convencionales de purificación
química, tal como la cromatografía líquida de alto rendimiento.
Otros métodos de purificación, incluyendo la precipitación con
citrato de bario, se conocen en la técnica, y pueden ser aplicados
para la purificación de nuevas variantes de polipéptidos del factor
VII descritas aquí (véase, por ejemplo, Scopes, R., Protein
Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982).
Con fines terapéuticos se prefiere que las
variantes de polipéptidos del factor VII de la invención sean
sustancialmente puras. Así, en una forma de realización preferida de
la invención las variantes de polipéptidos del factor VII de la
invención se purifican en al menos aproximadamente el 90 al 95% de
homogeneidad, preferiblemente al menos aproximadamente el 98% de
homogeneidad. La pureza puede ser evaluada p. ej. por electroforesis
en gel y secuenciación de aminoácidos
amino-terminal.
Para el tratamiento en relación con
intervenciones deliberadas, las variantes de polipéptidos del factor
VII de la invención típicamente serán administradas en
aproximadamente 24 horas antes de realizar la intervención, y
durante un máximo de 7 días o más sucesivamente. La administración
en forma de coagulante puede realizarse a través de una variedad de
vías como se describe aquí.
La dosis de las variantes de polipéptidos del
factor VII varia de aproximadamente 0,05 mg a 500 mg/día,
preferiblemente de aproximadamente 1 mg a 200 mg/día, y más
preferiblemente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 175
mg/día para un sujeto de 70 kg como dosis de carga y mantenimiento,
dependiendo del peso del sujeto y de la gravedad de la
condición.
Las composiciones farmacéuticas están destinadas
principalmente a la administración parenteral para un tratamiento
profiláctico y/o terapéutico. Preferiblemente, las composiciones
farmacéuticas se administran por vía parenteral, es decir, por vía
intravenosa, subcutáneamente, o intramuscularmente, o pueden
administrarse por infusión continua o pulsátil. Las composiciones
para la administración parenteral comprenden la variante del factor
VII de la invención en combinación con, preferiblemente disueltos
en, un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un
portador acuoso. Una variedad de portadores acuosos puede ser
utilizada, tal como el agua, agua tamponada, 0,4% de salina, 0,3%
glicina y similares. Las variantes de polipéptidos del factor VII de
la invención también se pueden formular en preparaciones de
liposomas para la entrega o destino a los sitios de lesión. Las
preparaciones de liposomas generalmente se describen en, p. ej., US
4,837,028, US 4,501,728, y US 4,975,282. Las composiciones pueden
ser esterilizadas por técnicas de esterilización convencionales y
bien conocidas. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser
envasadas para su uso o filtradas en condiciones asépticas y
liofilizadas, la preparación liofilizada siendo combinada con una
solución acuosa estéril antes de su administración. Las
composiciones pueden contener sustancias auxiliares
farmacéuticamente aceptables como requeridas para aproximarse a
condiciones fisiológicas, como agentes reguladores de pH y
amortiguadores, agentes reguladores de tonicidad y similares, por
ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio,
cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc.
La concentración de variante del Factor VII en
estas formulaciones puede variar mucho, es decir, desde menos de
aproximadamente 0,5% en peso, normalmente en o en al menos
aproximadamente el 1% en peso hasta un máximo de 15 o 20% en peso y
se seleccionará principalmente por volúmenes de fluidos,
viscosidades, etc., según el modo particular de administración
seleccionada.
Así, una composición farmacéutica típica para
una infusión intravenosa puede ser efectuada hasta contener 250 ml
de solución estéril de Ringer y 10 mg de la variante del Factor VII.
Los métodos reales para preparar composiciones parenteralmente
administrables serán conocidos o aparentes para los expertos en la
técnica y se describen en más detalle en, por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Company, Easton,
PA
(1990).
(1990).
Las composiciones que contienen las variantes
del polipéptido del factor VII de la presente invención pueden ser
administradas para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En
las aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un
sujeto que ya está sufriendo una enfermedad, tal y como se describe
anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o
detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una
cantidad adecuada para conseguirlo se define como "cantidad
terapéuticamente eficaz". Como lo entenderáelexperto en la
técnica, cantidades efectivas para este propósito dependerán de la
gravedad de la enfermedad o de la lesión así como del peso y estado
general del sujeto. En general, no obstante, la cantidad efectiva
variará de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 500 mg de
variante del Factor VII al día para un sujeto de 70 kg, con dosis de
aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 200 mg de variante del
factor VII al día utilizadas más comúnmente.
Los polipéptidos FVIIa de la presente invención
generalmente pueden ser empleados para enfermedades serias o estados
de lesiones, es decir, situaciones de peligro para la vida o de
peligro potencial para la vida. En casos de este tipo, en vista a la
minimización de sustancias extrañas y a la falta general de
inmunogenicidad de variantes de polipéptidos del factor humano VII
en seres humanos, el médico en servicio puede estimar conveniente
administrar un exceso sustancial de estas composiciones de variantes
del factor VII.
En aplicaciones profilácticas, las composiciones
que contienen la variante del Factor VII de la invención se
administran a un sujeto susceptible de sufrir o bien expuesto a un
estado de enfermedad o de lesión para mejorar la capacidad
coagulante propia del sujeto. Tal cantidad se define como una
"dosis profilácticamente efectiva". En aplicaciones
profilácticas, las cantidades exactas otra vez dependen del estado
de salud del sujeto y del peso, pero la dosis generalmente varia de
aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 500 mg al día para un
sujeto de 70 kilogramos, más comúnmente de aproximadamente 1,0 mg a
aproximadamente 200 mg al día para un sujeto de 70 kilogramos.
Las administraciones únicas o múltiples de las
composiciones pueden realizarse con niveles de dosis y modelos
seleccionados por el médico en servicio. Para los sujetos
ambulatorios que necesitan niveles de cuidados diarios, las
variantes de polipéptidos del factor VII pueden ser administradas
por infusión continua utilizando p. ej. un sistema de bombeo
portátil.
La entrega local de la variante del factor VII
de la presente invención, tal como, por ejemplo, la aplicación
tópica puede realizarse, por ejemplo, mediante pulverización,
perfusión, catéteres de doble balón, cánula, incorporada en injertos
o cánulas vasculares, hidrogeles usados para cubrir los catéteres de
balón, u otros métodos bien establecidos. En cualquier caso, las
composiciones farmacéuticas deberían proporcionar una cantidad
suficiente de variante del Factor VII para tratar eficazmente al
sujeto.
La presente invención se ilustra con más detalle
por los ejemplos siguientes los cuales, no obstante, no deben ser
interpretados como un limite del alcance de la protección. Las
características divulgadas en la descripción precedente y en los
ejemplos siguientes pueden ser, tanto de forma separada como en
cualquier combinación de éstas, esenciales para realizar la
invención en sus formas diversas.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos
completa del factor de coagulación humano nativo VII (de tipo
salvaje) (SEC ID NO:1).
\vskip1.000000\baselineskip
La terminología para sustituciones de
aminoácidos usada en los ejemplos a continuación es la siguiente. La
primera letra representa el aminoácido presente naturalmente en una
posición de la SEC ID NO:1. El número siguiente representa la
posición en la SEC ID NO:1. La segunda letra representa el
aminoácido diferente que sustituye al aminoácido natural. Un ejemplo
es L305V/F374Y-FVII, la leucina en la posición 305
de la SEC ID NO:1 se sustituye por una valina y la fenilalanina en
la posición 374 de la SEC ID NO:1 se sustituye por una tirosina,
ambas mutaciones en la misma variante del Factor VII.
\vskip1.000000\baselineskip
ADN de codificación de
L305V/S314E/F374Y-FVII,
L305V/K337A/F374Y-FVII,
L305V/S314E/K337A/F374Y-FVII, y
V158D/E296V/M298Q/L305V/S314E/K337A/F374Y-FVII.
Los constructos de ADN que codifican
L305V/S314E/F374Y-FVII,
L305V/K337A/F374Y-FVII, L305V/S314E/
K337A/F374Y-FVII, y V158D/E296V/M298Q/L305V/S314E/K337A/F374Y-FVII fueron preparados por mutagénesis dirigida al sitio usando un vector de ADN superenrollado, bicatenario, con un inserto de interés y dos cebadores sintéticos comprendiendo la mutación deseada. Los cebadores siguientes se usaron (en reacciones de PCR posteriores en caso de necesidad para obtener la variante de FVII deseada):
K337A/F374Y-FVII, y V158D/E296V/M298Q/L305V/S314E/K337A/F374Y-FVII fueron preparados por mutagénesis dirigida al sitio usando un vector de ADN superenrollado, bicatenario, con un inserto de interés y dos cebadores sintéticos comprendiendo la mutación deseada. Los cebadores siguientes se usaron (en reacciones de PCR posteriores en caso de necesidad para obtener la variante de FVII deseada):
Para L305V-FVII:
| 5'-CGT GCC CCG GGT GAT GAC CCA GGA C-3' | (SEC ID NO:2) | |
| 5-GTC CTG GGT CAT CAC CCG GGG CAC G-3' | (SEC ID NO:3) |
\vskip1.000000\baselineskip
Para K337A-FVII:
| 5-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3' | (SEC ID NO:4) | |
| 5'-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3' | (SEC ID NO:5) |
\vskip1.000000\baselineskip
Para V158D-FVII:
| 5'-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3' | (SEC ID NO:6) | |
| 5'-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3' | (SEC ID NO:7) |
\vskip1.000000\baselineskip
Para E296V/M298Q-FVII:
| 5'-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3' | (SEC ID NO:8) | |
| 5'-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3' | (SEC ID NO:9) |
\vskip1.000000\baselineskip
Para S314E-FVII:
| 5'-GCC TGC AGC AGG AAC GGA AGG TGG GAG ACT CC-3' | (SEC ID N0:10) | |
| 5'-GGA GTC TCC CAC CTT CCG TTC CTG CTG CAG GC-3' | (SEC ID NO:11) |
\vskip1.000000\baselineskip
Para F374Y-FVII:
| 5'-CGC AAC CGT GGG CCA CTA TGG GGT GTA CAC C-3' | (SEC ID NO:12) | |
| 5-GGT GTA CAC CCC ATA GTG GCC CAC GGT TGC G-3' | (SEC ID NO: 13) |
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores oligonucleótidos, cada uno
complementario a cadenas opuestas del vector, se extendieron durante
ciclos de temperatura por medio de la Pfu ADN polimerasa. Con la
incorporación de los cebadores, se generó un plásmido mutado
comprendiendo cortes en bisel. Después de los ciclos de temperatura,
el producto fue tratado con Dpnl específico para el ADN metilado y
hemimetilado para digerir el molde de ADN parental y seleccionar el
ADN sintetizado que contiene la mutación.
Los procedimientos para preparar un constructo
de ADN para todas las variantes del FVII según la presente invención
mediante el uso de una reacción en cadena de polimerasa usando
cebadores específicos para conseguir la variante del FVII deseada
son conocidos por los expertos en la técnica (véase PCR Protocols,
1990, Academic Press, San Diego, California, EEUU).
Las células BHK fueron transfectadas
esencialmente tal como descrito anteriormente (Thim et al.
(1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson y Nielsen
(1996) FEBS Lett. 385, 241-243) para obtener la
expresión de la variante específica del FVII. La variante del factor
VII fue purificada de la siguiente manera:
- El medio acondicionado fue cargado sobre una columna de 25-ml de Q Sefarosa de flujo rápido (Pharmacia Biotech) después de la adición de 5 mM de EDTA, 0,1% de Tritón X-100 y 10 mM de Tris, del ajuste de pH a 8,0 y del ajuste de la conductividad a 10-11 mS/cm mediante la adición de agua.
La elución de la proteína se realizó paso a paso
a partir de 10 mM de Tris, 50 mM de NaCl, 0,1% de Tritón
X-1 00, pH 8,0 a 10 mM de Tris, 50 mM de NaCl, 25 mM
de CaCl_{2}, 0,1% de Tritón X-1 00, pH 8,0. Las
fracciones comprendiendo la variante específica del FVII se
agruparon y se aplicaron a una columna de 25 ml comprendiendo el
anticuerpo monoclonal F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dinamarca)
junto con la sefarosa activada CNBr- Sefarosa 4B activada (Pharmacia
Biotech).
La columna fue equilibrada con 50 mM de HEPES,
pH 7,5, conteniendo 10 mM de CaCl_{2}, 100 mM de NaCl y 0,02% de
Tritón X-1 00. Después del lavado con el tampón de
equilibrio y el tampón de equilibrio conteniendo 2 M de NaCl, el
material ligado fue eluido con el tampón de equilibrio conteniendo
10 mM de EDTA en vez de CaCl_{2}. Antes del uso o del
almacenamiento, el exceso de CaCl_{2} en EDTA fue añadido o la
variante del FVII específica fue transferida a un amortiguador
conteniendo Ca^{2+}. El rendimiento de cada fase fue seguido por
mediciones ELISA del factor VII y la proteína purificada fue
analizada por SDS-PAGE. Otras variantes del FVII,
variantes según el Ejemplo 1 y todas las otras variantes según la
presente invención pueden ser preparadas por el mismo método.
El factor VIIa nativo (de tipo salvaje) y la
variante del factor VIIa (a continuación ambos referidos como
"factor VIIa") se evalúan en paralelo para comparar
directamente sus actividades específicas. El ensayo se realiza en
una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El
sustrato cromogénico
D-lle-Pro-Arg-p-nitroanilida
(S-2288, Chromogenix, Suecia), concentración final
de 1 mM, se añade al factor VIIa (concentración final de 100 nm) en
50 mM de Hepes, pH 7,4, conteniendo 0,1 M de NaCl, 5 mM de
CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La absorbencia a
405 nm se mide continuamente en un lector de placas SpectraMax™ 340
(Molecular Devices, EEUU). La absorbencia desarrollada durante una
incubación de 20 minutos, después de una sustracción de la
absorbencia en un pocilio en blanco sin contenido de enzima, se usa
para calcular la proporción entre las actividades de la variante y
del factor VIIa de tipo salvaje:
Proporción =
(A_{405nm} variante de Factor VIIa) (A_{405nm} Factor VIIa de
tipo
salvaje)
\vskip1.000000\baselineskip
El factor VIIa nativo (de tipo salvaje) y la
variante del factor VIIa (a continuación ambos referidos como
"factor VIIa") se evalúan en paralelo para comparar
directamente sus actividades específicas. El ensayo se realiza en
una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El factor
VIIa (10 nm) y el factor X (0,8 microM) en 100 microL 50 mM de
Hepes, pH 7,4, conteniendo 0,1 M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1
mg/ml de albúmina de suero bovino, se incuban durante 15 min. La
división del factor X se detiene entonces por la adición de 50
microL 50 mM de Hepes, pH 7,4, conteniendo 0,1 M de NaCl, 20 mM de
EDTA y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La cantidad de Factor Xa
generada se mide por adición del sustrato cromogénico
Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida
(S-2765, Chromogenix, Suecia), concentración final
de 0,5 mM. La absorbencia a 405 nm se mide continuamente en un
lector de placas SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, EEUU). La
absorbencia desarrollada durante 10 minutos, después de la
sustracción de la absorbencia en un pocilio en blanco sin contenido
de FVIIa, se utiliza para calcular la proporción entre las
actividades proteolíticas de la variante del factor VIIa y del
factor VIIa de tipo salvaje:
Proporción =
(A_{405nm} variante de Factor VIIa) (A_{405nm} Factor VIIa de
tipo
salvaje)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet EP200421 A [0006]
- \bullet US 5037743 A [0162]
- \bullet WO 0183725 A [0009]
- \bullet US 4845075 A [0162]
- \bullet W0222776 A [0009]
- \bullet US 4882279 A [0162]
- \bullet US4784950 A [0136]
- \bullet EP 272277 A [0163]
- \bullet US4683202 A [0139]
- \bullet EP 184438 A [0163]
- \bullet US5288629 A [0141]
- \bullet EP 244234 A [0163]
- \bullet US4745051 A [0146] [0165]
- \bullet US 4879236 A [0165]
- \bullet EP 397485 A [0146] [0165]
- \bullet US 5077214 A [0165]
- \bullet US 5155037 A [0146] [0165]
- \bullet WO 8901029 A [0165]
- \bullet US 5162222 A [0146] [0165]
- \bullet WO 8901028 A [0165]
- \bullet US 4599311 A [0147] [0162]
- \bullet WO 8800239 A [0168] [0172] [0180]
- \bullet EP 238023 A [0148] [0153] [0163]
- \bullet US 5304489 A [0169]
- \bullet EP 383779 A [0148]
- \bullet WO 8901343 A [0170]
- \bullet US 4870008 A [0151] [0152] [0162]
- \bullet WO 9102318 A [0170]
- \bullet WO 8702670 A [0151]
- \bullet US 4873316 A, Meade [0171] [0172]
- \bullet US 4546082 A [0152]
- \bullet US 4873191 A [0172]
- \bullet EP 16201 A [0152]
- \bullet WO 9005188 A [0172] [0180]
- \bullet EP 123294 A [0152]
- \bullet WO 9211757 A [0172] [0180
- \bullet EP 123544 A [0152]
- \bullet GB 8700458 A [0172]
- \bullet EP 163529 A [0152]
- \bullet EP 0255378 A [0173]
- \bullet WO 8902463 [0152]
- \bullet US 4456591 A, Thomas [0176]
- \bullet WO 9211378 A [0152]
- \bullet US 4837028 A [0185]
- \bullet EP 215594 A [0153]
- \bullet US 4501728 A [0185]
- \bullet WO 9005783 A [0154]
- \bullet US 4975282 A [0185]
- \bullet US 5023328 A [0154]
- \bullet EP 6544215 A [0207]
- \bullet US 4713339 A, Levinson y Simonsen [0158]
- \bullet EP 03798087 A [0207]
- \bullet US 4931373 A [0162]
- \bullet EP 200201423 A [0207]
\bulletDickinson et al.
Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93,
14379-14384 [0007]
\bulletIwanaga et al.
Thromb. Haemost., August 1999, 466 [0008]
\bulletGraham et al. J. Gen.
Virol., 1977, vol. 36, 59-72 [0140]
[0161]
\bulletWaechter; Baserga.
Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1982, vol. 79,
1106-1110 [0040]
\bulletUrlaub; Chasin. Proc.
Nati. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77,
4216-4220 [0040] [0161]
\bulletTakeya et al. J.
Biol. Chem., 1988, vol. 263, 14868-14872
[0136]
\bulletZoller; Smith.
DNA, 1984, vol. 3, 479-488 [0137]
\bulletHorton et al. Splicing
by extensión overlap. Gene, 1989, vol. 77,
61-68 [0137]
\bullet PCR Protocols. Academic Press,
1990 [0137] [0199]
\bulletSambrook et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989 [0138]
\bulletBeaucage; Caruthers.
Tetrahedron Letters, 1981, vol. 22,
1859-1869 [0139]
\bulletMatthes et al. EMBO
Journal, 1984, vol. 3, 801-805 [0139]
\bulletSaiki et. al. Science, 1988, vol. 239, 487-491
[0139]
\bulletSubramani et al. Mol.
Cell Biol., 1981, vol. 1, 854-864
[0145]
\bulletPalmiter et al.
Science, 1983, vol. 222, 809-814
[0145]
\bulletBoshart et al.
Cell, 1985, vol. 41, 521-530
[0145]
\bulletKaufman; Sharp. Mol.
Cell. Biol. 1982, vol. 2, 1304-1319
[0145]
\bulletVasuvedan et al. FEBS
Lett., 1992, vol. 311,7-11 [0146]
\bulletJ. M. Vlak et al. J.
Gen. Virology, 1988, vol. 69, 765-776
[0146]
\bulletHitzeman et al. J.
Biol. Chem. 1980, vol. 255, 12073-12080
[0147]
\bulletAlber Kawasaki J. Mol. Appl.
Gen., 1982, vol. 1, 419-434 [0147]
\bulletYoung et al. Genetic
Engineering of Microorganisms for Chemicals Plenum Press
1982. [0147]
\bulletRussell et al.
Nature, 1983, vol. 304, 652-654
[0147]
\bulletMcKnight et al. The
EMBO J., 1985, vol. 4, 2093-2099
[0148]
\bulletPalmiter et al.
Science, 1983, vol. 222, 809-814
[0149]
\bulletAlber Kawasaki J. Mol. Appl.
Gen., 1982, vol. 1, 419-434 [0149]
\bulletMcKnight et al. The
EMBO J., 1985, vol. 4, 2093-2099
[0149]
\bulletDeNoto et al. Nuci.
Acids Res., 1981, vol. 9, 3719-3730
[0149]
\bulletO. Hagenbuchle et al.
Nature, 1981, vol. 289, 643-646
[0151]
\bulletL.A. Valls et al.
Cell, 1987, vol. 48, 887-897
[0151]
\bulletM. Egel-Mitani et al. Yeast, 1990, vol. 6,
127-137 [0151]
\bulletSambrook et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor
1989. [0155]
\bulletKaufman Sharp J. Mol.
Biol., 1982, vol. 159, 601-621 [0156]
\bulletSouthern Berg J. Mol. Appl.
Genet., 1982, vol. 1, 327-341 [0156]
\bulletLoyter et al. Proc.
Nati. Acad. Sci. USA, 1982, vol. 79,
422-426 [0156]
\bulletWigler et al.
Cell, 1978, vol. 14, 725 [0156]
\bulletCorsaro Pearson Somatic Cell
Genetics, 1981, vol. 7, 603 [0156]
\bulletGraham van der Eb Virology, 1973, vol. 52, 456 [0156]
\bulletNeumann et al. EMBO
J., 1982, vol. 1, 841-845 [0156]
\bulletWigler et al.
Cell, 1978, vol. 14, 725-732
[0157]
\bulletCorsaro Pearson Somatic Cell
Genetics, 1981, vol. 7, 603-616
[0157]
\bulletGraham Van der Eb Virology, 1973, vol. 52d, 456-467
[0157]
\bulletNeumann et al. EMBO
J., 1982, vol. 1, 841-845 [0157]
\bulletWaechter Baserga Proc. Nati.
Acad. Sci. USA, 1982, vol. 79, 1106-1110
[0161]
\bulletGleeson et al. J.
Gen. Microbiol., 1986, vol. 132,
3459-3465 [0162]
\bulletMalardier et al.
Gene, 1989, vol. 78, 147-156
[0163]
\bulletWhitelaw et al.
Biochem. J., 1992, vol. 286, 31-39
[0169]
\bulletBrinster et al. Proc.
Nati. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85,
836-840 [0170]
\bulletPalmiter et al. Proc.
Nati. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88,
478-482 [0170]
\bulletWhitelaw et al.
Transgenic Res., 1991, vol. 1,3-13
[0170]
\bulletHeijne Nuci. Acids Res.,
1986, vol. 14, 4683-4690 [0171]
\bulletJaenisch Science,
1988, vol. 240, 1468-1474 [0172]
\bulletBradley et al.
Bio/Technology, 1992, vol. 10, 534-539
[0172]
\bulletHogan et al.
Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual Cold Spring
Harbor Laboratory 1986. [0172]
\bulletSimons et al.
Bio/Technology, 1988, vol. 6, 179-183
[0172] [0172] [0180]
\bulletWall et al. Biol.
Reprod., 1985, vol. 32, 645-651
[0172]
\bulletBuhler et al.
Bio/Technology, 1990, vol. 8, 140-143
[0172]
\bulletEbert et al.
Bio/Technology, 1991, vol. 9, 835-838
[0172]
\bulletKrimpenfort et al.
Bio/Technology, 1991, vol. 9, 844-847
[0172]
\bulletWall et al. J. Cell.
Biochem., 1992, vol. 49, 113-120
[0172]
\bulletGordon et al. Proc.
Nati. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77,
7380-7384 [0172] [0180]
\bulletGordon Ruddle Science,
1981, vol. 214, 1244-1246 [0172] [0180]
\bulletPalmiter Brinster Cell,
1985, vol. 41, 343-345 [0172] [0180]
\bulletBrinster et al. Proc.
Nati. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82,
4438-4442 [0172] [0180]
\bulletHogan et al. PROC.
NATL. ACAD. SCI. USA, [0172] [0180]
\bulletHiatt Nature,
1990, vol. 344, 469-479 [0173]
\bulletEdelbaum et al. J.
Interferon Res., 1992, vol. 12, 449-453
[0173]
\bulletSijmons et al.
Bio/Technology, 1990, vol. 8, 217-221
[0173]
\bullet Protein Purification VCH Publishers
1989. [0174] [0181]
\bulletWakabayashi et al. J.
Biol. Chem., 1986, vol. 261, 11097-11108
[0174] [0181]
\bulletThim et al.
Biochemistry, 1988, vol. 27, 7785-7793
[0174] [0181] [0201]
\bulletScopes, R. Protein Purification
Springer-Verlag 1982. [0174] [0181]
\bulletOsterud et al.
Biochemistry, 1972, vol. 11, 2853-2857
[0176]
\bulletHedner Kisiel J. Clin.
Invest., 1983, vol. 71, 1836-1841
[0176]
\bulletKisiel Fujikawa Behring
Inst. Mitt., 1983, vol. 73, 29-42
[0176]
\bullet Remington's Pharmaceutical Sciences
Mack Publishing Company 1990. [0187]
\bulletPersson Nielsen FEBS
Lett., 1996, vol. 385, 241-243 [0201]
<110> NOVO NORDISKA/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLIPÉPTIDOS DEL FACTOR HUMANO VII
DE COAGULACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 6544.215-EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Divisional de 03798087.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-09-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PA 2002 01423
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-09-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<213> Factor humano VII de coagulación
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<210> 13
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia
artificial:Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipggtgtacacc ccatagtggc ccacggttgc g
\hfill31
Claims (51)
1. Polipéptido del factor VII comprendiendo al
menos tres sustituciones en relación con la secuencia de aminoácidos
de SEC ID NO.1, donde dichas sustituciones son (i) el reemplazo de
F374 con cualquier otro aminoácido, (ii) reemplazo de S314 con
cualquier otro aminoácido y (iii) reemplazo de L305 con cualquier
otro aminoácido.
2. Polipéptido del factor VII según la
reivindicación 1, donde K157 se reemplaza por cualquier otro
aminoácido.
3. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 2, donde D334 se reemplaza por cualquier
otro aminoácido.
4. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, donde S336 se reemplaza por cualquier
otro aminoácido.
5. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, donde V158 se reemplaza por cualquier
otro aminoácido.
6. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 5, donde E296 se reemplaza por cualquier
otro aminoácido.
7. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6, donde M298 se reemplaza por cualquier
otro aminoácido.
8. Polipéptido del factor FVII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-7, donde K337 se reemplaza
por cualquier otro aminoácido.
9. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-8, donde al menos un
aminoácido en las posiciones restantes en el dominio proteasa ha
sido reemplazado por cualquier otro aminoácido.
10. Polipéptido del factor VII según la
reivindicación 9, donde un máximo de 20 aminoácidos adicionales en
las posiciones restantes en el dominio proteasa han sido
reemplazados por cualesquiera otros aminoácidos.
11. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 9-10, donde al menos un
aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición
seleccionada de 159-170 de SEC ID NO:1 ha sido
reemplazado por cualquier otro aminoácido.
12. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 9-11, donde al menos un
aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición
seleccionada de 290-304 de SEC ID NO:1 ha sido
reemplazado por cualquier otro aminoácido.
13. Polipéptido del factor VII según la
reivindicación 12, donde R304 ha sido reemplazado por un aminoácido
seleccionado en el grupo que consiste en Tyr, Phe, Leu y Met.
14. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 9-13, donde al menos un
aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición
seleccionada entre 306 y 312 de SEC ID NO:1 ha sido reemplazado por
cualquier otro aminoácido.
15. Polipéptido del factor VII según la
reivindicación 14, donde M306 ha sido reemplazado por un aminoácido
seleccionado en el grupo que consiste en Asp y Asn.
16. Polipéptido del factor VII según la
reivindicación 14, donde D309 ha sido reemplazado por un aminoácido
seleccionado en el grupo que consiste en Ser y Thr.
17. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 9-16, donde al menos un
aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición
seleccionada entre 330y 339 de la SEC ID NO:1 ha sido reemplazado
por cualquier otro aminoácido.
18. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 9-17, donde A274 ha sido
reemplazado por cualquier otro aminoácido.
19. Polipéptido del factor VII según la
reivindicación 18, donde dicho A274 ha sido reemplazado por un
aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Met, Leu, Lys y
Arg.
20. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-2, donde dicho K157 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, y Glu.
\newpage
21. Polipéptido del factor VII según bien una u
otra de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho D334 ha sido
reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste
en Gly y Glu.
22. Polipéptido del factor VII según una u otra
de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho S336 ha sido reemplazado
por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Gly y
Glu.
23. Polipéptido del factor VII según una u otra
de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho V158 ha sido reemplazado
por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Ser, Thr,
Asn, Gin, Asp y Glu.
24. Polipéptido del factor VII según una u otra
de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho E296 ha sido reemplazado
por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Arg, Lys,
Ile, Leu y Val.
25. Polipéptido del factor VII según una u otra
de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho M298 ha sido reemplazado
por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Lys, Arg,
Gin y Asn.
26. Polipéptido del factor VII según la
reivindicación 1, donde dicho L305 ha sido reemplazado por un
aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Val, Tyr y
Ile.
27. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1-26, donde dicho S314 ha
sido reemplazado por un aminoácido seleccionado en el grupo que
consiste en Gly, Lys, Gln y Glu.
28. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 27, donde dicho F374 ha sido reemplazado
por un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Pro y
Tyr.
29. Polipéptido del factor VII según la
reivindicación 28, donde dicho F374 ha sido reemplazado por Tyr.
30. Polipéptido del factor VII según la
reivindicación 8, donde dicho K337 ha sido reemplazado por un
aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en Ala, Gly, Val,
Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, y Glu.
31. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 30, donde cada aminoácido reemplazado ha
sido reemplazado por cualquier otro aminoácido que puede ser
codificado por constructos polinucleótidos.
32. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 31, donde dicho polipéptido del factor
VII es el factor VII humano.
33. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 31, donde dicho polipéptido del factor
VII es el factor humano VIIa.
34. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 33, donde la proporción entre la
actividad de dicho polipéptido del factor VII y la actividad del
polipéptido del factor VIIa nativo mostrada en la SEC ID NO:1 es de
al menos aproximadamente 1,25.
35. Polipéptido del factor VII según la
reivindicación 34, donde dicha proporción es de al menos
aproximadamente 2,0, preferiblemente al menos aproximadamente
4,0.
36. Polipéptido del factor VII según la
reivindicación 1, que es
F374Y/L305V/S314E-FVIIa.
37. Polipéptido del factor VII según cualquiera
de las reivindicaciones 1,8 o 30, que es L305V/S314E/K337A/
F374Y-FVIIa.
F374Y-FVIIa.
38. Constructo polinucleótido que codifica un
polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones
1-37.
39. Constructo polinucleótido según la
reivindicación 38, que es un vector.
40. Célula huésped comprendiendo el constructo
polinucleótido según cualquiera las reivindicaciones 38 a 39.
41. Célula huésped según la reivindicación 40,
que es una célula eucariótica.
42. Célula huésped según la reivindicación 41,
que es de origen mamífero.
43. Célula huésped según la reivindicación 42,
donde la célula se selecciona en el grupo que consiste en células
CHO, células HEK y células BHK.
44. Animal transgénico no humano conteniendo y
expresando el constructo polinucleótido tal como se define en la
reivindicación 38.
\newpage
45. Método para la producción del polipéptido
del factor VII definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a
37, el método comprendiendo el cultivo de una célula tal como
definida en cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43 en un medio
de crecimiento apropiado en condiciones que permiten la expresión
del constructo polinucleótido y la recuperación del polipéptido
resultante a partir del medio de cultivo.
46. Composición farmacéutica comprendiendo un
polipéptido del factor VII comprendiendo al menos dos sustituciones
en relación con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1, donde
dichas sustituciones son (i) el reemplazo de F374 por cualquier otro
aminoácido, (ii) reemplazo de S314 por cualquier otro aminoácido y
(iii) reemplazo de L305 por cualquier otro aminoácido; y,
opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.
47. Composición farmacéutica comprendiendo un
polipéptido del factor VII tal como definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, y, opcionalmente, un portador
farmacéuticamente aceptable.
48. Uso de un polipéptido del factor VII
comprendiendo al menos dos sustituciones en relación con la
secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1, donde dichas sustituciones
son (i) el reemplazo de F374 por cualquier otro aminoácido, (ii)
reemplazo de S314 por cualquier otro aminoácido y (iii) reemplazo de
L305 por cualquier otro aminoácido; para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de trastornos de sangrados o
episodios de sangrados o para la mejora del sistema hemostático
normal.
49. Uso de un polipéptido del factor VII tal
como definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos de
sangrado o episodios de sangrado o para la mejora del sistema
hemostático normal.
50. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
48 a 49 para el tratamiento de la hemofilia A o B.
51. Polipéptido del factor VII tal como definido
en cualquiera de las reivindicaciones 1a 37 para un uso en forma de
medicamento.
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Family Cites Families (13)
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|---|---|---|---|---|
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