ES2338971B1 - Modelo animal para el estudio de la angiogenesis y linfoangiogenesis in vivo. - Google Patents
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Abstract
Modelo animal mal para el estudio de la
angiogénesis y linfoangiogénesis in vivo.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de la biología molecular y la biotecnología, y se refiere a un
mamífero no humano modificado genéticamente cuyas células integran
la construcción IRES-EGFP-Luciferasa
en la región 3'UTR del gen Flt4, y que es capaz de reportar la
expresión del gen Flt4 con un patrón idéntico al de la expresión del
receptor VEGFR-3. Dicho mamífero no humano es útil
en el estudio y evaluación de la progresión de las enfermedades que
cursan con linfoangiogénesis, angiogénesis y/o inflamación, así como
para el ensayo de fármacos dirigidos a modular estos procesos, y por
tanto, para el desarrollo de terapias antiangiogénicas,
antitumorales y antimetastásicas.
Description
Modelo animal para el estudio de la angiogénesis
y linfoangiogénesis in vivo.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de la biología molecular y la biotecnología, y se refiere a un
mamífero no humano modificado genéticamente cuyas células integran
la construcción IRES-EGFP-Luciferasa
en la región 3'UTR del gen Flt4, y que es capaz de reportar la
expresión del gen Flt4 con un patrón idéntico al de la expresión del
receptor VEGFR-3. Dicho mamífero no humano es útil
en el estudio y evaluación de la progresión de las enfermedades que
cursan con linfoangiogénesis, angiogénesis y/o inflamación, así como
para el ensayo de fármacos dirigidos a modular estos procesos, y por
tanto, para el desarrollo de terapias antiangiogénicas,
antitumorales y antimetastásicas.
El gen Flt4 codifica para el receptor
VEGFR-3, un receptor de membrana con actividad
tirosina-quinasa que pertenece a la familia de
receptores de factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF
A-D). Esta familia de receptores (VEGFR
1-3) tiene un patrón de expresión relativamente
específico de células endoteliales de vasos sanguíneos y linfáticos
y son reguladores muy importantes de los procesos de angiogénesis y
neovascularización, ya que participan en el control de la
proliferación, migración y diferenciación de las células
endoteliales.
El receptor VEGFR-3 comienza a
expresarse en el ratón durante el desarrollo embrionario
aproximadamente en el día 8 de gestación en los vasos sanguíneos
primordiales, pero su expresión se restringe a los vasos linfáticos
en el momento en que estos se desarrollan. De hecho, a día 12 del
desarrollo embrionario la expresión de VEGFR-3 ya se
detecta fundamentalmente en los vasos linfáticos (nuestros propios
resultados). En el animal adulto, se ha descrito que en condiciones
fisiológicas VEGFR-3 se expresa mayoritariamente en
células endoteliales de los vasos linfáticos, y se considera un buen
marcador de este tipo celular ya que al contrario que los receptores
VEGFR-1 y -2, VEGFR-3 no se
encuentra expresado en el endotelio de los vasos sanguíneos adultos,
en condiciones fisiológicas.
Aunque específico de células endoteliales
linfáticas, la expresión de VEGFR-3 en adulto es
baja en condiciones basales. En el ratón se observa una caída
dramática de los niveles de expresión entre animales jóvenes
(1-5 semanas) y animales adultos (más de 6
semanas).
En general, existe una correlación tanto a nivel
espacial como temporal entre la expresión de receptores de VEGF y
procesos de angiogénesis. Así, en adultos la expresión de estos
receptores se encuentra incrementada asociada a cicatrización
tisular, inflamación, crecimiento tumoral y formación de metástasis,
todos ellos, procesos que dependen de la formación y crecimiento de
nuevos vasos a partir de los ya existentes.
Actualmente existe un modelo desarrollado por
Xenogen Corporation basado en las señales de expresión del receptor
VEGFR-2 (Flk1/KDR) (Zhang et al., 2004.
Blood, 103, 617-626. US 6,867,348). Se trata
de un ratón genéticamente modificado en el cual dos fragmentos del
gen Flk1 del ratón conteniendo las secuencias del promotor y
enhancer respectivamente se han clonado en un plásmido que contiene
la secuencia que codifica la enzima luciferasa. Esta construcción ha
sido introducida en el genoma del ratón al azar mediante
microinyección en pronúcleos de embriones de una célula.
Además se han desarrollado otros modelos
reporter basados en las señales de expresión de otros genes cuya
expresión es específica de células endoteliales. Dos líneas
transgénicas han sido desarrolladas por diferentes laboratorios en
las que el gen de la EGFP (enhanced green fluorescent
protein) se expresa bajo el control del promotor o
promotor/enhancer de los receptores Tie1 (Iljin et al., 2002.
Faseb J, 16, 1764-1774) y Tie2 (Motoike et
al., 2000; Genesis, 28, 75-81)
respectivamente. Tie1 y Tie2 se expresan durante el desarrollo
embrionario en el ratón, en angioblastos y en células endoteliales.
En el organismo adulto la expresión endógena de estos receptores en
el endotelio se mantiene a niveles más bajos, y se induce en sitios
de neovascularización como el ovario durante la formación del cuerpo
lúteo y en procesos de cicatrización. Sin embargo, la expresión de
genes reporter bajo el control de secuencias reguladoras de estos
genes en los correspondientes modelos genéticamente modificados,
como la línea Tie1-EGFP no se induce en el endotelio
durante la neovascularización tumoral. Esta inducción sí se ha
observado, sin embargo, al reemplazar parte de la secuencia del gen
Tie1 endógena por el gen lacZ, tal y como se hizo para la generación
del knockout de Tie1 (Puri et al., 1995). La discrepancia
entre el comportamiento de la línea knockout/knockin y la línea
transgénica de Tie1 en cuanto a la activación de la expresión de
Tie1 durante la angiogénesis tumoral refleja la limitación de las
líneas transgénicas convencionales para reproducir fielmente la
regulación de la expresión de los genes endógenos. Lo mismo se
observa en una línea transgénica que expresa lacZ bajo el control
del promotor de VEGFR-3, en la que no se reproduce
por completo la expresión endógena del receptor (lljin et
al., 2001).
Los inventores han construido un modelo animal,
un ratón modificado genéticamente mediante
gene-targeting (knock-in) en
el cual una proteína trazadora o reporter se expresara bajo
el control de las señales de expresión del receptor
VEGF-3. La expresión de este reporter puede
ser monitorizada in vivo por técnicas no invasivas, lo que
implica que se podría medir y cuantificar directamente en el ratón
la angiogénesis asociada a diferentes procesos, tanto fisiológicos
como patológicos a tiempo real.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se
refiere a un mamífero no humano genéticamente modificado, de ahora
en adelante mamífero de la invención, cuyas células expresan la
construcción IRES-EGFP-Luciferasa en
la región 3'UTR del gen Flt4 con un patrón idéntico a la expresión
del receptor VEGFR-3, tanto en el espacio como en el
tiempo.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención la expresión de la construcción
IRES-EGFP-Luciferasa comprende la
introducción de una secuencia de ácidos nucléicos que comprende la
SEQ ID NO: 1 en el animal o uno de sus ancestros.
La secuencia SEQ ID NO: 1 comprende las
secuencias de IRES del virus de la encefalomiocarditis, la secuencia
de la EGFP y de la luciferasa.
Las secuencias IRES (del inglés "internal
ribosome entry site") son secuencias nucleotídicas que
permite la iniciación de la síntesis proteica en el medio de la
traducción del marco abierto de lectura de un RNA mensajero (mRNA o
ARNm). A diferencia del mecanismo más conocido de traducción
proteica en organismos eucariontes que requiere una modificación
previa en el extremo 5' del mRNA mensajero para el ensamblaje de la
maquinaria de traducción, las secuencias IRES son reconocidas por el
complejo de pre-iniciación 43S, de manera que pueden
comenzar la traducción del RNA mensajero a pesar de carecer de
modificación Cap en su extremo 5'. Estas secuencias han sido
encontradas en miembros de las familias virales picornavirus,
retrovirus y herpesvirus. Además, recientemente se han encontrado
secuencias IRES en mRNA de organismos eucariontes, especialmente en
proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular, así como
mecanismos apoptóticos. En el contexto de la presente invención se
emplea como secuencias IRES, pero sin limitarnos, la secuencia IRES
del virus de la encefalomiocarditis.
La EGFP según sus siglas en inglés (enhanced
green fluorescent protein) es una mutación de una proteína (GFP)
producida por la medusa Aequorea sp. (A. victoria, A.
aequorea, A. forskalea) que emite bioluminiscencia en la zona
verde del espectro visible. Esta mutación (S65T) incrementa la
fluorescencia, fotoestabilidad y posee unos picos de excitación y de
emisión compatibles con los filtros de isotiocianato de fluoresceína
(FITC), por lo que el gen que codifica esta proteína está aislado y
se utiliza habitualmente en biología molecular como marcador.
En esta memoria "luciferasa" se refiere a
un término genérico que agrupa un grupo de enzimas capaces de
producir bioluminiscencia en la naturaleza. La más conocida es la
firefly luciferase, de Photinus pyralis. En las
reacciones de luminiscencia la luz es producida por la oxidación de
la luciferina (un pigmento), y la reacción requiere ATP (adenosina
trifosfato). En esta memoria, por tanto "luciferasa" y
"luciferina" no se refieren a moléculas específicas, sino
términos genéricos para un substrato y su enzima asociada.
En esta memoria se define como gen "Flt4",
"FMS-like tyrosine kinase 4", "VEGFR3",
"VEGFR-3", "Chy" y/o "AI323512" una
secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la
secuencia codificante del polipéptido Flt4, y que comprendería
diversas variantes procedentes de:
- a)
- moléculas de ácido nucléico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2,
- b)
- moléculas de ácido nucléico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
- c)
- moléculas de ácido nucléico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
- d)
- moléculas de ácido nucléico que codifican un polipétptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2.
en las que el polipéptido codificado por dichos
ácidos nucléicos posee la actividad y las características
estructurales de la proteína Flt4.
\vskip1.000000\baselineskip
La modificación genética del gen Flt4 que se
realiza en la invención conduce a la expresión de un mensajero
bicistrónico, que se expresa utilizando las señales de regulación
endógenas del gen Flt4. La traducción de este mensajero da lugar
simultáneamente a la síntesis de dos proteínas: el receptor
VEGFR-3 intacto y la proteína de fusión
EGFP-luciferasa. Por tanto, después de la
modificación genética, el reporter EGFPluc se expresa recapitulando
exactamente el mismo patrón de expresión endógeno del gen Flt4, con
idéntico control tanto a nivel espacial como temporal.
El utilizar la fusión
EGFP-luciferasa como molécula reporter, permite
monitorizar la expresión de VEGFR3 mediante técnicas de imagen
óptica tanto por fluorescencia emitida por la EGFP como por
luminiscencia emitida por la luciferasa en presencia de su sutrato
específico, la luciferina.
La emisión fotónica que es emitida cuando la
luciferasa reacciona con la luciferina adecuada puede ser detectada
por un aparato sensible a la luz que se denomina luminometro, o por
microscopios ópticos modificados, o permitiendo la observación de
procesos biológicos, incluso in vivo, en el animal completo
previamente anestesiado.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "mamífero no humano" se refiere a un animal mamífero no
humano de cualquier fondo genético, preferentemente animales de
laboratorio como roedores, más preferentemente ratas y ratones, o
primates no humanos. Dicho animal no humano puede tener,
prácticamente, cualquier fondo genético conocido, es decir, puede
tratarse de un animal tipo salvaje (wild-type
ó wt) o se puede combinar con otras alteraciones genéticas en el
mismo ratón, por ejemplo, un animal transgénico, mutante o
deficiente (knock-out ó KO), con mutaciones
espontáneas o inducidas experimentalmente, así mismo en cualquier
fondo genético.
El término "transgénico", aplicado a
mamífero no humano, tal como se utiliza en la presente invención, se
refiere a mamíferos que contienen un transgén e incluye, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, a
animales transgénicos convencionales, u obtenidos por recombinación
homologa: KOs, KIs, modelos condicionales etc.) en cualquier fondo
genético.
Los autores de la presente invención han
introducido el alelo modificado knock-in de
Flt4, Flt4-IRES-EGFPLuc, en un ratón
inmunosuprimido (nu/nu). Este fondo genético aporta la ventaja de
que permite hacer ensayos de xenografts con líneas tumorales de
diferentes orígenes, tanto murinas como humanas y cuantificar la
angiogénesis/linfoangiogénesis en relación al tamaño de los tumores
mediante la combinación de diferentes técnicas de imagen in
vivo. Así mismo, utilizando líneas metastásicas se podría
cuantificar la angiogénesis asociada al establecimiento de
metástasis en este modelo.
La ventaja añadida de utilizar un fondo nude
(nu/nu) es que en ratones desnudos no se produce el enmascaramiento
de la señal emitida por la luciferasa como consecuencia de la
interferencia del pelo del animal, con lo cual la señal es más
intensa y permite una mejor detección y cuantificación de cambios
débiles de expresión. Por tanto, en una realización aún más
preferida de este aspecto de la invención, el mamífero no humano es
un ratón inmunodeprimido (nu/nu).
La molécula reporter (la fusión
EGFP-luciferasa) se expresa bajo el control de las
señales de expresión endógenas del gen Flt4 y por lo tanto tiene un
patrón de expresión idéntico a la del receptor tanto en el espacio
como en el tiempo. Esto no ocurre en los modelos transgénicos
convencionales.
La inserción del cassette reporter se
hace en la región 3' no traducida del gen (3'UTR, del inglés
unstranlated región o bien de untranslated trailer),
fuera de la secuencia codificante, por lo que la secuencia
codificante del gen Flt4 no se encuentra alterada. En los modelos en
los que la secuencia codificante del gen se sustituye por un
marcador, el marcador sí recapitula el patrón de expresión endógeno
del gen correspondiente pero simultáneamente en estos modelos se
inactiva una copia del gen lo cual en muchos casos puede dar lugar a
un fenotipo asociado que puede manifestarse incluso en heterocigosis
estando la segunda copia del gen intacta (haploinsuficiencia).
En esta memoria, un "cassette" o
"casete" es una región codificante de un gen procedente de un
organismo procariota o eucariota flanqueada por los elementos
reguladores necesarios para su expresión in vivo o in
vitro. Aunque los casetes de expresión pueden tener
configuraciones muy variadas, deben contener por lo menos un
promotor (promoter), una región codificante (ADNc eucariota o
gen procariota) y un terminador de la transcripción (terminator) o
un sitio de poliadenilación, según se trate de un gen derivado de un
organismo procariota o de un ADNc procedente de un organismo
eucariota. A esta configuración básica se le añade, si fuera
necesario, una secuencia con función reguladora para la expresión
natural del gen en el sistema elegido, p.ej.: un operador, un
potenciador, la secuencia de Shine y Dalgarno para la unión al ARNr
de E. coli, o las secuencias de un péptido señal (si la
proteína se exporta).
En otro aspecto de la invención, el mamífero de
la invención tiene introducida la construcción
IRES-EGFP-Luciferasa 149 nucleótidos
abajo del codón de parada TGA dentro de la región 3'UTR del gen
Flt4.
El gen reporter, al introducirse en la región
3'UTR del gen Flt4, entre el codón de parada y la secuencia de
poliadenilación, no afecta a la expresión normal de este gen, por lo
que el modelo animal puede ser utilizado tanto en heterozigosis como
en homocigosis. Esto aporta la ventaja de poder controlar la señal
basal de fluorescencia/luminiscencia según los requisitos del
ensayo, sin que esto tenga ninguna consecuencia en el fenotipo del
modelo a estudiar.
Los seres humanos y los ratones de laboratorio
(ambos mamíferos euterios) tienen más genes en común que los que se
podrían encontrar entre los humanos y animales
no-euterios. El parecido genético entre las dos
especies permite comparar los genes casi directamente, y permite a
los científicos encontrar los mismos genes en humanos para
decodificar las rutas y mecanismos de las enfermedades humanas,
porque los ratones también pueden desarrollarlas. Por tanto, en otra
realización preferida, el mamífero de la invención es un ratón
(Mus musculus).
Ventajosamente, la construcción génica
IRES-EGFP-Luciferasa está incluida
dentro de un vector, tal como, por ejemplo, un vector de expresión o
un vector de transferencia. Tal como se utiliza en la presente
invención el término "vector" se refiere a sistemas utilizados
en el proceso de transferencia de un gen exógeno o de una
construcción génica exógena al interior de una célula, permitiendo
de este modo la vehiculación estable de genes y construcciones
génicas exógenas. Dichos vectores pueden ser vectores no virales o
vectores virales.
Así, en otro aspecto de la invención se
proporciona un vector de gene-targeting, de
ahora en adelante vector de la invención, que comprende la
construcción que contiene el cDNA que codifica para la proteína de
fusión EGFP-luciferasa, precedida de una secuencia
de entrada interna de ribosomas (IRES), las secuencias genómicas del
locus Flt4 que flanquean el punto de integración de la construcción
IRES-EGFP-luciferasa en la región
3'UTR del gen Flt4, y un cassette de selección positiva que
comprende un promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK en la Fig. 1),
un gen de resistencia a la neomicina (NEO en la Fig. 1) y una señal
poliA del virus SV40, flanqueado por secuencias frt.
En una realización preferida, el vector de la
invención se encuentra acompañado además por un cassette de
selección negativa que comprende el promotor del gen de la
fosfoglicerato quinasa de ratón, la secuencia codificante del gen de
la timidina quinasa del virus herpes simple (TK en la Fig. 1), y una
señal poliA del virus SV40.
Otro aspecto de la invención se relaciona con un
procedimiento para la obtención del mamífero de la invención, en
adelante método de la invención, que comprende:
- a)
- construir un vector de la invención según se ha descrito más arriba,
- b)
- transfectar dicha construcción en una población de células madre embrionarias, y seleccionar las células madre embrionarias que han integrado de forma estable el vector de la invención en su genoma por recombinación homologa.
- c)
- incorporar los clones de células madre embrionarias recombinadas del paso b) a embriones huésped, de manera que las células recombinadas contribuyan a todos los linajes celulares del embrión,
- d)
- permitir el desarrollo del embrión para obtener un mamífero no humano quimérico con el alelo que expresa la construcción IRES-EGFP-Luciferasa en la región 3'UTR del gen Flt4.
- e)
- cruzar el mamífero no humano quimérico del paso d) para producir mamíferos heterocigóticos para la expresión de la construcción IRES-EGFP-Luciferasa en la región 3'UTR del gen Flt4,
- f)
- cruzar los individuos heterocigóticos según el apartado e) con animales transgenicos que expresan la recombinasa Flp de forma ubicua en todas las células incluida la línea germinal (Tg-pCAG Flp) para eliminar el cassette pGK-neo flanqueado por los sitios Frt,
y opcionalmente,
- g)
- cruzar los individuos heterocigóticos según el apartado f) entre sí para producir un mamífero no humano genéticamente modificado homocigótico para la expresión de la construcción IRES-EGFP-Luciferasa en la región 3'UTR del gen Flt4.
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En una realización preferida del método de la
invención las células madre embrionarias son V6.4 de fondo genético
híbrido F1(C57BL/6 x 129).
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "transfectar" se refiere a cualquier técnica o
procedimiento que permita la integración en una serie de células de
un organismo vivo de un gen exógeno, o "transgén", y que
confiere a dichas células y al organismo que las porta una nueva
propiedad biológica. Preferiblemente el método de transfección es la
electroporación. Dicho transgén o gen exógeno se refiere a un ADN
normalmente no residente, ni presente en la célula que se pretende
transformar. En el caso particular de la presente invención el ADN
codifica para la EGFP y para una luciferasa. Por otro lado, el
proceso de transgénesis para obtener el animal modelo de la
invención puede ser aplicado tanto a animales completamente
desarrollados como a embriones del mismo siempre que permita la
integración de la construcción
IRES-EGFP-Luciferasa en la región
3'UTR del gen Flt4. Preferiblemente, el proceso de transgénesis es
aplicado a embriones.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
célula, de ahora en adelante célula de la invención, aislada del
mamífero de la invención o que ha integrado el vector de la
invención por recombinación homologa. Una realización preferida de
este aspecto de la invención se refiere a la línea celular derivada
de la o las células de la invención.
El mamífero de la invención es útil en el
seguimiento no invasivo de la angiogénesis en tumores y en otras
patologías y su aplicación al desarrollo de terapias
antiangiogénicas. Además tiene una utilidad universal para el
estudio de cualquier proceso asociado al funcionamiento y desarrollo
del endotelio, como procesos inflamatorios, patologías vasculares y
particularmente, crecimiento tumoral, extravasación de células
tumorales y establecimiento de metástasis.
La utilización del modelo como reporter de
linfoangiogénesis/angiogénesis/inflamación implica también su
utilización para el ensayo de fármacos dirigidos a modular estos
procesos y por tanto para el desarrollo de terapias
antiangiogénicas, antitumorales y antimetastásicas.
Así pues, otro aspecto de la invención se
refiere a un método de detección de agentes potencialmente útiles en
el tratamiento o prevención de procesos inflamatorios que
comprende:
- a)
- inducir un proceso inflamatorio y/o angiogénico en el mamífero de la invención,
- b)
- expresar de forma recombinante el agente, o administrar el agente al mamífero de la invención de a),
- b)
- comparar el nivel de emisión de y/o luminiscencia en el mamífero de la invención de a) con:
- i.
- el nivel de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia en el mismo mamífero de la invención antes de la administración del compuesto,
- ii.
- el nivel de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia en otro mamífero de la invención, al que no se le ha administrado el compuesto; o
- iii.
- un nivel estándar de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia para los mamíferos según i o ii;
donde un cambio favorable con el nivel del
indicador (disminución de la fluorescencia y/o luminiscencia) en
relación con el cambio de referencia usando animales normales no
afligidos por procesos inflamatorios en condiciones comparables,
indica que el compuesto es activo para tratar dicho proceso
inflamatorio.
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La inducción del proceso inflamatorio y/o
angiogénico en el mamífero de la invención se puede realizar por
diversos medios, entre los que se incluyen, pero sin limitarnos,
infligir una herida, administrar un agente angiogénico, inducir un
proceso tumoral, xenografts en un modelo nude (nu/nu).
En la presente invención, se entiende por
"agente" cualquier compuesto químico de origen natural o
sintético, con una actividad terapéutica génica o una actividad
terapéutica farmacológica. Los conceptos de terapia génica así como
el de terapia farmacológica son bien conocidos para un experto en la
materia.
En una realización preferida de este aspecto, el
mamífero de la invención es un ratón. En una realización aún más
preferida es un ratón nude (nu/nu). En una realización aún más
preferida, la introducción del cassette
IRES-EGFP-Luciferasa se realiza 149
nucleótidos abajo del codón de parada TGA dentro de la región 3'UTR
del gen Flt4. Y en otra realización aún más preferida el mamífero de
la invención es homozigótico para la introducción del cassette
IRES-EGFP-Luciferasa en la región
3'UTR del gen Flt4.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método de detección de agentes potencialmente útiles en el
tratamiento o prevención de procesos tumorales que comprende:
- a)
- inducir un proceso tumoral en el mamífero de la invención,
- b)
- expresar de forma recombinante el agente, o administrar el agente al mamífero de la invención,
- b)
- comparar el nivel de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia en el mamífero de la invención de a) con:
- i.
- el nivel de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia en el mismo mamífero de la invención antes de la administración del compuesto,
- ii.
- el nivel de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia en otro mamífero de la invención, al que no se le ha administrado el compuesto; o
- iii.
- un nivel estándar de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia para los mamíferos según i o ii;
donde un cambio favorable con el nivel del
indicador (fluorescencia y/o luminiscencia) en relación con el
cambio de referencia usando animales normales no aflijidos por el
tumor inducido en condiciones comparables, indica que el compuesto
es activo para tratar dicha enfermedad.
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En una realización preferida de este aspecto, el
mamífero de la invención es un ratón. En una realización aún más
preferida es un ratón nude (nu/nu). En una realización aún más
preferida, la introducción del cassette
IRES-EGFP-Luciferasa se realiza 149
nucleótidos abajo del codón de parada TGA dentro de la región 3'UTR
del gen Flt4. Y en otra realización aún más preferida el mamífero de
la invención es homozigótico para la introducción del cassette
IRES-EGFP-Luciferasa en la región
3'UTR del gen Flt4.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método de detección y aislamiento de células endoteliales de los
vasos linfáticos en distintos estadios del desarrollo de un mamífero
no humano, que comprende:
- a)
- disgregar los tejidos de dicho mamífero no humano,
- b)
- detectar y aislar las células que expresan EGFP mediante citometría de flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1. Generación del modelo
VEGFR3-IRESEGFPluc Kl: estrategia de gene
targeting.
A) Esquema de la estructura del gen Flt4, el
vector de gene targeting utilizado y el alelo obtenido por
recombinación homologa en células ES. Se muestra además la posición
de los sitios de restricción ScaI utilizados en el análisis por
Southern blot de los clones recombinantes así como la posición de
los fragmentos de DNA empleados como sondas en dicho análisis.
Finalmente se muestra la estructura del alelo recombinado una vez
eliminado el casete de selección positiva (PGK-neo)
mediante la actividad de la recombinasa Flp.
B) Análisis de clones recombinantes mediante
Southern Blot. Se muestra el tamaño de las bandas correspondientes a
los alelos WT (Flt4+) y recombinante
(Flt4-neo-IRESEGFPluc)
C) La escisión del casete PGKneo por la
recombinasa Flp fue analizado mediante PCR con los primers indicados
en la figura A para diferenciar
Flt4-neo-IRESEGFPluc (izquierda) y
Flt4IRESEGFPluc (derecha).
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 2. Análisis de la expresión de VEGFR3 y
EGFP en el modelo reporter.
A) Análisis de la expresión de VEGFR3 en
embriones de 13.5 días de desarrollo mediante Northern blot. Se
analizaron 15 \mug de RNA total de los genotipos indicados
utilizando una sonda de 500 bp específica para el RNA mensajero de
VEGFR3. El tamaño del RNA mensajero es el indicado tanto para el
genotipo silvestre cómo para el knockin. Los niveles de GAPDH se
muestran como control de carga.
B) Análisis de la expresión de VEGFR3 en
embriones de 13.5 días de desarrollo mediante Western Blot. Se
analizaron 100 \mug de extracto de proteína para cada uno de los
genotipos indicados en 10% de SDS-PAGE. En la figura
se muestran los inmunoblots para VEGFR3 y EGFP. Se incluye como
control de carga el inmunoblot de \alpha-Tubulin.
Se observa que los niveles de expresión de VEGFR3 permanecen
constantes en los diferentes genotipos.
C) Análisis de la expresión de
VEGFR3-EGFPluc en embriones KI/KI a diferentes
estadios de desarrollo mediante microscopía confocal. Se observa una
expresión específica de EGFP en los vasos linfáticos de los
embriones mientras que no se detecta expresión en los vasos
sanguíneos, que se reconocen por la autofluorescencia de los
eritrocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 3. Monitorización de la expresión de
VEGR3 durante el desarrollo postnatal en el modelo reporter.
La actividad de luciferasa in vivo en
hembras VEGFR3-IRESEGFPluc (n=8) a las edades de 2,
3, 4, 5, 8, 10 y 15 semanas se monitorizó en un IVIS Spectrum.
A) Imágenes representativas de la actividad de
luciferasa monitorizadas en las zonas dorsal y ventral de cada
animal.
B) Cuantificación de la actividad de luciferasa
mostrada en las imágenes en A. La actividad de luciferasa está
expresada en fotones por segundo por cm^{2} para corregir por la
diferencia de tamaño de los animales a diferentes edades. Los datos
se muestran como media + SD.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 4. Análisis de la expresión de VEGFR3 en
el modelo reporter en ensayos de cicatrización cutánea.
A) Imágenes representativas de la emisión de
luciferasa durante un ensayo de cicatrización cutánea con o sin
administración de dexametasona (DEX).
B) Cuantificación de la emisión de luciferasa
(B.1) y de la cicatrización (B.2) durante el ensayo. Los datos se
muestran como media + SD.
En los paneles A y B se muestra un máximo de
emisión de luciferasa en el día 8 del ensayo alrededor de los
extremos de la herida, que se correlaciona con una cicatrización del
30%. No se detecta expresión de luciferasa después del día 23 cuando
la herida está completamente cicatrizada. El tratamiento con
dexametasona induce una disminución significativa de la emisión de
luciferasa en los días 8-10 de cicatrización, sin
embargo la señal es la misma en los animales tratados a partir del
día 15, cuando la herida está cicatrizada aproximadamente un 40%. El
tratamiento con dexametasona causa una disminución en el
reclutamiento de macrófagos a la zona de cicatrización alterando la
cinética del proceso. Teniendo ésto en cuenta, y que los macrófagos
expresan VEGFR3, el pico de emisión que se observa alrededor del día
10 en animales no tratados puede reflejar el proceso de
reclutamiento de macrófagos a la zona de la herida. La disminución
en el reclutamiento de macrófagos puede explicar asimismo el retraso
en el proceso de cicatrización como se muestra en la Fig. B2.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 5. Expresión de VEGFR3 asociada a la
inflamación inducida mediante el ensayo de hipersensibilidad por
contacto (CHS).
Ratones
VEGFR3-IRES-EGFPluc KI/KI (n=5) se
pre-sensibilizaron mediante tratamiento tópico con
oxazolona en el abdomen. Seis días después la inflamación se indujo
en la oreja izquierda de los animales mediante administración tópica
de 1% de oxazolone. Otro grupo de animales a los que se indujo CHS
(n=7) se trató además con dexametasona, administrada
intraperitonealmente a una dosis diaria de 5 mg/Kg de peso.
A) Emisión de luciferasa medida diariamente
in vivo durante el tratamiento
B) Cuantificación de la emisión que se muestra
en A. Los datos se muestran como media + SD. (OXA) Oxazolona; (DEX)
Dexametasona.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la especificidad y efectividad de en la monitorización de
los procesos de linfoangiogénesis/angiogénesis/inflamación.
Se ha introducido en la región 3' no traducida
(UTR) del gen que codifica para el receptor VEGFR3 (flt4), cuya
expresión es específica de células endoteliales, la secuencia
codificante de la proteína de fusión EGFPluc precedida por una
secuencia IRES (Internal Ribosome Entry Site). La fusión
IRES-EGFPluc se introduce entre el codón de
terminación del gen flt4 y la secuencia de poliadenilación. Esta
estrategia permite generar un mensajero bicistrónico que da lugar a
la expresión simultánea de dos genes con la misma regulación
transcripcional y por tanto, en este caso, dirigir la expresión de
la fusión EGFPluc específicamente a las células endoteliales en las
que se transcriba el gen flt4 sin alterar la expresión endógena del
mismo.
Para la obtención del alelo knockin
Flt4-IRES-EGFPluc se diseñó en
primer lugar un vector de targeting "universal" que
permite aplicar esta misma estrategia a cualquier gen del genoma
murino. La estructura de éste vector es la que se representa en la
figura 1A y está preparado para clonar en los sitios únicos NotI y
SalI los brazos de homología del gen de interés.
NotI y SalI son sitios únicos en el vector que
reconocen estas enzimas de restricción y donde se pueden insertar
los brazos de homología de cualquier gen. PGK-neo y
PGK-hsvTK son los marcadores de selección positiva y
negativa respectivamente.
Este vector contiene un marcador que expresa un
gen de resistencia a neomicina bacteriano bajo el control del
promotor del gen que codifica la fosfoglicerato quinasa de ratón
(PGK-neo). El casete PGK-neo permite
la selección de los clones en los que el vector se ha integrado,
bien al azar o bien por recombinación homologa. Este marcador está
flanqueado por sitios frt para su posterior eliminación mediada por
la recombinasa Flp. El vector incluye un marcador para selección
negativa que se pierde si el vector se integra por recombinación
homologa pero no si se integra al azar. Este último es el casete que
expresa el gen de la timidina quinasa del virus herpes (hsvTK)
también bajo el control del promotor PGK. La pérdida de este casete
se selecciona en presencia de ganciclovir. Estos dos elementos
permiten seleccionar las células que hayan incorporado el vector
mediante recombinación homologa. La inclusión del marcador de
selección negativa proporciona un aumento de 5-10
veces en la frecuencia de clones recombinantes homólogos.
El vector además contiene sitios de restricción
únicos para las enzimas SalI y NotI que son poco frecuentes en el
genoma del ratón, y que pueden ser utilizados para clonar los brazos
de homología 5' y 3' respectivamente.
El gen reporter que se ha utilizado es una
proteína de fusión EGFP-luciferasa. La EGFP
(Enhanced Green Fluorescent Protein) es una variante de la proteina
GFP, más brillante y con mejores niveles de expresión en células de
mamífero. La fusión entre la proteína verde fluorescente y la
luciferasa tiene como ventaja que permite la monitorización de su
expresión tanto por captación de fluorescencia como de
bioluminiscencia.
Finalmente, los brazos de homología utilizados
para la construcción se han obtenido a partir de DNA genómico de
C57BL/6, y se han amplificado por PCR a partir de un BAC
(RP23-445K3) que contiene este gen. El tamaño de
cada uno de los brazos es de 3.3 Kb y 3.7 Kb el 3' y 5'
respectivamente. Los primeros utilizados para la amplificación del
brazo de homología 5' son:
\newpage
- Flt45F SEQ ID NO: 3
- Flt45R SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
y para el brazo 3' son:
- Flt43F SEQ ID NO: 5
- Flt43R SEQ ID NO: 6.
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación se hizo utilizando la TAQ
polimerasa TAQ LA de Takara mediante 2 ciclos de
pre-PCR (98ºC 10 s, 54°C 1 m, 68ºC 5 m) y 30 ciclos
de PCR (98ºC 10 s y 68ºC 5 m).
Una vez construido el vector, éste se amplificó
y después de linearizarlo mediante digestión con NotI se electroporó
en células madre embrionarias (ES) V6.4 de fondo genético híbrido F1
[C57BL/6 129SvJ], Típicamente 17 millones de células se electroporan
con 20 microgramos de DNA linearizado en 0,8 ml de PBS, a 250
voltios y 500 microFaradios, en una cubeta de 0,4 cm de ancho. La
evaluación de la frecuencia de recombinación homologa y la selección
de clones recombinantes homólogos se realizó mediante análisis por
Southern Blot. Para ello se extrajo DNA genómico de 60 clones. Para
comprobar la recombinación homologa en el brazo 5', el DNA se
digirió con ScaI y se analizó por Southern blot utilizando como
sonda un fragmento de 262 pb que híbrida en una zona externa al
brazo de homología 5'. La recombinación en el brazo 3' se analizó de
forma semejante, digiriendo el DNA genómico con ScaI y utilizando
como sonda para Southern Blot un fragmento de 324 pb. De los 60
clones analizados, 18 de fueron positivos para ambos brazos de
homología.
Finalmente dos de los clones recombinantes
(ESIM4.31 y ESIM4.52) se incorporaron a embriones en desarrollo
mediante la técnica de agregación. Para ello, se extrajeron mórulas
de ratones de la cepa CD1, a día 2,5 de gestación. Estos embriones,
una vez eliminada la zona pelúcida mediante digestión con solución
de Tyrode, se agregaron con cúmulos de unas 6-8
células por embrión. Los embriones agregados (aproximadamente 70) se
incubaron toda la noche en medio KSOM a 37ºC, 5% CO2 y al día
siguiente se transfirieron al oviducto de hembras pseudogestantes de
la cepa CD1 a día 0,5 de pseudogestación. El parto tuvo lugar a los
19 días después de la transferencia de los embriones. Entre las
crías nacidas las quimeras se distinguieron por la presencia de
pigmentación en la piel y en el pelo, que indica la contribución de
las células ES, ya que el embrión huésped proviene de una cepa
albina. Se obtuvieron 10 quimeras (ESIM4.31, 5 machos
(1)100%, 1(70%), 2(50%), 1(30%) y para
el clon ESIM4.52, 5 machos 100%).
Las mejores quimeras machos, se cruzaron con
hembras CD1 para analizar la contribución de las células ES a la
línea germinal (aparición de crías pigmentadas). 7 quimeras (de 7
testadas) transmitieron la pigmentación a su descendencia. De 71
crías analizadas por PCR, 20 contenían el alelo recombinante. Estos
animales, heterocigotos para el alelo
Flt4-IRES-EGFPluciferasa, se
cruzaron entre sí para generar animales homocigotos. La frecuencia
de animales homocigotos nacidos de estos cruces fue del 25%,
indicando que la mutación en homocigosis no resulta en letalidad
embrionaria o perinatal.
Para los ensayos de Northern, se extrajo RNA
total a partir de embriones a día de desarrollo E13,5 de los
genotipos indicados, mediante extracción con Trizol. Se analizaron
15 microgramos de RNA total de cada genotipo. Como sonda se utilizó
un fragmento de 500 pb correspodiente a la zona 3'UTR del gen flt4
externo al sitio de integración del reporter
IRES-EGFPluciferasa. La sonda para GAPDH corresponde
a un fragmento de 400 pb de la secuencia codificante del gen de la
GAPDH de rata.
Para analizar los niveles de proteína por
Western blot, 100 microgramos de extracto de proteína total obtenido
a partir de embriones a día E13,5 de cada genotipo, se resolvieron
en un gel SDS-PAGE al 10%. Las proteínas se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se hibridaron con
anticuerpos anti-VEGFR3 (AFL4 de Becton Dickinson) y
anti-EGFP (AB3080 Chemicon International) a las
diluciones 1:60 y 1:400 respectivamente.
Embriones en diferentes días de gestación se
extrajeron de útero en PBS y se observaron en un microscopio
confocal Leica TCS-SP5(AOBS) equipado con el
software de adquisición LAS AF. Para excitar la EGFP se utilizó un
láser de argón de 488 nm.
La actividad de luciferasa en extractos de
diferentes órganos y tejidos se midió utilizando un kit comercial de
Promega (E-1501) siguiendo las recomendaciones del
fabricante.
Animales a diferentes edades y de diferentes
genotipos son anestesiados por inhalación de isofluorano. A
continuación se les administra D-luciferina (Xenogen
XR-1001) a una concentración de 15 mg/ml en PBS
mediante una única inyección intraperitoneal. La dosis de luciferina
es de 150 mg/Kg de peso. Los animales inyectados se observan en un
IVIS Spectrum (Xenogen Corp.) adquiriendo imágenes durante 30
segundos de forma continuada hasta que se alcanza el máximo de
emisión (aproximadamente a los 20 minutos de la administración de la
luciferina).
En este ensayo se emplean hembras de
11-14 semanas de edad y heterocigotas para el alelo
VEGFR3-EGFPluciferasa Kl. Los animales son
anestesiados por inhalación de isofluorano. Se les afeita la zona
dorsal y se realiza una herida circular en la piel, aproximadamente
a una altura media de la zona dorsal, con un punzón de biopsia de 8
mm de diámetro, escindiendo la piel y el panículo carnoso. A
diferentes días se mide la emisión de luciferasa en un IVIS Spectrum
como se describe anteriormente. En este caso el ROI (región of
interest), donde se mide la señal, corresponde al área inicial
de la herida para cada ratón en cada punto. En paralelo se mide el
diámetro de la herida, en orientación vertical (V) y horizontal (H)
con un calibre. Para calcular el área en cada punto se multiplican
las medias V x H. La cicatrización se representa en cada punto como
el tamaño porcentual de la herida respecto al tamaño de la herida
a
día 0.
día 0.
Para estudiar la contribución de la inflamación
al proceso de cicatrización, en el mismo ensayo algunos animales
fueron tratados con dexametasona (Sigma D1756) a una concentración
de 1 mg/ml en Etanol y a una dosis de 5 mg/Kg de peso administrada
mediante inyección intraperioteneal diaria. Los animales control
fueron tratados de la misma forma sólo con vehículo.
Hembras homocigotas para el alelo
VEGFR3-EGFPluciferasa Kl de aproximadamente 11
semanas de edad fueron pre-sensibilizadas por
administración tópica de 50 microlitros de oxazolona al 2% en
acetona/aceite. 4:1 v/v en el abdomen afeitado previamente. Seis
días después (día 0) se indujo la inflamación por administración
tópica de 10 microlitros de oxazolona al 1% en el mismo vehículo en
la oreja izquierda del animal. La oreja derecha fue tratada sólo con
vehículo como control interno. En paralelo, otro grupo de animales
de la misma edad y genotipo fueron tratados con dexametasona como se
describe anteriormente. La emisión de luciferasa se midió
diariamente a día 0 y durante los seis días siguientes al comienzo
del tratamiento utilizando el IVIS Spectrum como se describe en los
apartados anteriores. En este caso el ROI es sólo la oreja tratada o
la oreja control de cada animal.
<110> Fundación Centro Nacional de
investigaciones Oncológicas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Modelo animal para el estudio de la
angiogénesis y linfoangiogénesis in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1599.6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2915
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción (fusión)
IRES-EGFPluc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador Flt45F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador Flt45R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador Flt43F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador Flt43R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
Claims (13)
1. Mamífero no humano genéticamente modificado
cuyas células expresan la construcción
IRES-EGFP-Luciferasa en la región
3'UTR del gen Flt4 con el mismo patrón de la expresión del receptor
VEGFR-3, tanto en el espacio como en el tiempo.
2. Mamífero no humano genéticamente modificado
de acuerdo con la reivindicación anterior, donde la expresión de la
construcción IRES-EGFP-Luciferasa se
consigue mediante la introducción de la SEQ ID NO: 1 en el animal o
uno de sus ancestros.
3. Mamífero no humano genéticamente modificado
según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde
el mamífero está inmunodeprimido.
4. Mamífero no humano genéticamente modificado
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde
la introducción del cassette
IRES-EGFP-Luciferasa se realiza 149
nucleótidos abajo del codón de parada TGA dentro de la región 3'UTR
del gen Flt4.
5. Mamífero no humano genéticamente modificado
según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es
homocigótico para la introducción del cassette
IRES-EGFP-Luciferasa en la región
3'UTR del gen Flt4.
6. Mamífero no humano genéticamente modificado
según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde
el mamífero es un ratón.
7. Vector de
gene-targeting que comprende la construcción
genética con el cDNA que codifica para la proteína de fusión
EGFP-luciferasa, precedida de una secuencia de
entrada interna de ribosomas (IRES), las secuencias genómicas del
locus Flt4 que flanquean el punto de integración de la construcción
IRES-EGFP-luciferasa en la región
3'UTR del gen Flt4, y un cassette de selección positiva.
8. Vector de
gene-targeting según la reivindicación
anterior donde el cassette de selección positiva comprende el
promotor del gen de la fosfoglicerato quinasa de ratón, un gen de
resistencia a la neomicina y una señal poliA del virus SV40,
flanqueado por secuencias frt.
9. Vector según cualquiera de las
reivindicaciones 7-8, acompañado además por un
cassette de selección negativa que comprende, el promotor del
gen de la fosfoglicerato quinasa de ratón, la secuencia codificante
del gen de la timidina quinasa del virus herpes simple, y una señal
poliA del virus SV40.
10. Método de modificación genética para
construir un mamífero no humano genéticamente modificado según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que
comprende:
- a.
- construir un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7-9.
- b.
- transfectar dicha construcción en una población de células madre embrionarias no humanas, y seleccionar las células madre embrionarias que han integrado de forma estable el vector de (a) en su genoma por recombinación homologa.
- c.
- incorporar los clones de células madre embrionarias recombinadas del paso (b) a embriones huésped no humanos de manera que las células recombinadas contribuyan a todos los linajes celulares del embrión.
- d.
- permitir el desarrollo de éstos embriones para obtener un mamífero no humano quimérico con el alelo que expresa la construcción IRES-EGFP-Luciferasa en la región 3'UTR del gen Flt4.
- e.
- cruzar el mamífero no humano quimérico del paso (d) para producir mamíferos no humanos heterocigóticos para la modificación introducida, y opcionalmente,
- f.
- cruzar los individuos heterocigóticos según (e) entre sí para producir un mamífero no humano genéticamente modificado homocigótico para la expresión de la construcción IRES-EGFP-Luciferasa en la región 3'UTR del gen Flt4.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Método según la reivindicación 10, donde
las células madre embrionarias son V6.4 de fondo genético híbrido
F1(C57BL/6 x 129).
12. Célula aislada de un mamífero según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o que ha
integrado por recombinación homologa un vector según cualquiera de
las reivindicaciones 7-9.
13. Línea celular derivada de una célula aislada
según la reivindicación 12.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200802569A ES2338971B1 (es) | 2008-09-08 | 2008-09-08 | Modelo animal para el estudio de la angiogenesis y linfoangiogenesis in vivo. |
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| ES200802569A ES2338971B1 (es) | 2008-09-08 | 2008-09-08 | Modelo animal para el estudio de la angiogenesis y linfoangiogenesis in vivo. |
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|---|---|
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| ES200802569A Withdrawn - After Issue ES2338971B1 (es) | 2008-09-08 | 2008-09-08 | Modelo animal para el estudio de la angiogenesis y linfoangiogenesis in vivo. |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| EP1692935A1 (en) * | 2005-02-22 | 2006-08-23 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Transgenic animal as a model for human pulmonary disease |
| WO2006122141A2 (en) * | 2005-05-10 | 2006-11-16 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods and products for determining f4/80 gene expression in microglial cells |
-
2008
- 2008-09-08 ES ES200802569A patent/ES2338971B1/es not_active Withdrawn - After Issue
-
2009
- 2009-09-08 WO PCT/ES2009/070372 patent/WO2010026277A1/es not_active Ceased
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1692935A1 (en) * | 2005-02-22 | 2006-08-23 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Transgenic animal as a model for human pulmonary disease |
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| KARPANEN, T., et al. Lymphangiogenic growth factor responsiveness is modulated by postnatal lymphatic vessel maturation. The American journal of pathology. Agosto 2006. Vol. 169, n$^{o}$ 2, páginas 708-718. ISSN 0002-9440. Ver todo el documento, especialmente resumen; páginas 709,710 y discusión. * |
| VEIKKOLA, T., et al. Signalling via vascular endothelial growth factor receptor-3 is sufficient for lymphangiogenesis in transgenic mice. The EMBO journal. 15.03.2001. Vol. 20, n$^{o}$ 6, páginas 1223-1231. ISSN 0261-4189. Ver todo el documento, especialmente resumen; páginas 1224,1225,1230 (párrafo 3). * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2338971A1 (es) | 2010-05-13 |
| WO2010026277A1 (es) | 2010-03-11 |
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