ES2337255T3 - Uso de pirazolopiridinas para el tratamiento de deficit cognitivos. - Google Patents
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Abstract
Utilización de etazolato de fórmula (II) **(Ver fórmula)** o de una sal o éster del mismo, para la preparación de una composición farmacéutica dirigida a mejorar la percepción cognitiva en un paciente humano.
Description
Uso de pirazolopiridinas para el tratamiento de
déficit cognitivos.
La presente invención se refiere al campo de la
biología, la genética y la medicina. Se refiere especialmente a
nuevas composiciones y procedimientos para el tratamiento de
patologías neurodegenerativas y especialmente para mejorar,
aumentar o facilitar la cognición de sujetos aquejados de patologías
neurodegenerativas. La invención se basa más particularmente en el
uso de compuestos de la familia de las pirazolopiridinas para
mejorar las facultades cognitivas de sujetos aquejados de
enfermedades neurodegenerativas. La invención es utilizable para la
mejora de la condición de sujetos aquejados de diversas patologías
neurodegenerativas, y muy particularmente de la enfermedad de
Alzheimer o de la demencia vascular.
Se han descrito numerosas patologías
neurodegenerativas que tienen un componente o un estado ligado al
fenómeno de apoptosis o muerte celular programada. Se pueden citar
tanto las patologías neurodegenerativas del sistema nervioso
central (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica, ELA,
enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer o demencia
vascular), como las enfermedades degenerativas periféricas,
especialmente oculares. Estas patologías disponen principalmente de
tratamientos sintomáticos, especialmente de tratamientos de los
fenómenos inflamatorios asociados, pero pocos tratamientos de las
causas reales de estos trastornos, debido especialmente a la
complejidad de los mecanismos y rutas metabólicas implicados y de la
diversidad de los factores causantes.
La solicitud internacional de patente nº WO
03/016563, presentada por la solicitante, describe nuevas dianas
moleculares de neurotoxicidad así como nuevos enfoques terapéuticos
para el tratamiento de patologías neurodegenerativas. Estos
enfoques están basados en una modulación de la actividad o la
expresión de una fosfodiesterasa de tipo 4.
La solicitud internacional nº PCT/FR04/00366,
presentada por la solicitante, propone nuevos enfoques de
tratamiento de patologías degenerativas oculares basados en una
modulación de la actividad o de la expresión de una fosfodiesterasa
de tipo 4.
Las solicitudes WO 01/78709, WO 01/81348, WO
01/81345 y WO 03/045949 se refieren al uso de pirazolopiridinas en
el tratamiento de ciertos eventos asociados a patologías
neurológicas, tales como la formación de agregados peptídicos
(documento WO 01/78709), la fosforilación de la proteína TAU (WO
01/81348) o el bloqueo de la enzima GSK-3
(documentos WO 01/81345 y WO 03/045949).
La solicitud WO 02/098878 describe el uso de
trifluorometilpurinas como inhibidores de la PDE4 para el
tratamiento de problemas cognitivos.
La presente solicitud se refiere ahora a nuevas
estrategias terapéuticas de enfermedades en las que la percepción
cognitiva está alterada, como se observa especialmente en la
enfermedad de Alzheimer. Estas estrategias están basadas en la
modulación de una o varias rutas metabólicas identificadas por los
inventores, que están correlacionadas con la aparición, el
desarrollo y la progresión de excitotoxicidad y apoptosis en células
nerviosas, y son particularmente pertinentes en enfermedades
neurodegenerativas y en la función cognitiva.
La presente solicitud deriva más particularmente
de la manifestación de las propiedades ventajosas y notables del
etazolato para el tratamiento de déficit cognitivos, especialmente
aquellos inducidos por la enfermedad de Alzheimer. La presente
solicitud propone así nuevas estrategias terapéuticas destinadas a
tratar o reducir los problemas cognitivos, en particular en
pacientes aquejados de enfermedades neurodegenerativas.
La presente invención se refiere por lo tanto al
uso del etazolato o de una sal o éster del mismo para la
preparación de una composición farmacéutica dirigida a mejorar la
percepción cognitiva en un paciente humano.
La presente invención se refiere también a una
composición que comprende etazolato o una sal o éster del mismo
para uso para mejorar la percepción cognitiva en un paciente
humano.
Sin querer quedar ligado por un mecanismo de
acción, parece que la acción benéfica inesperada y ventajosa de los
compuestos según la invención sobre los trastornos cognitivos puede
explicarse por un doble impacto al nivel del receptor
GABA(A) y de la mitocondria. Efectivamente, la presente
invención describe la identificación en el cerebro de sujetos
patológicos de tres eventos moleculares originales caracterizados
por una alteración de la expresión del ARNm de PDE4, de AKAP1 y de
GABA(A)RAPL1. Estos eventos están correlacionados en
el tiempo con el fenómeno de excitotoxicidad y/o de muerte
neuronal, y demuestran la existencia de alteraciones de la
señalización de GABA con relación a problemas cognitivos. Así,
especialmente, la presente invención revela la existencia de
alteraciones del corte y empalme del ARNm que codifica la subunidad
épsilon del receptor GABA(A) entre los ARNm extraídos de la
corteza prefrontal de pacientes aquejados de enfermedad de Alzheimer
por un lado y los ARNm extraídos de la misma región del cerebro de
individuos de control que tienen la misma edad por otro lado. Este
descubrimiento es particularmente interesante, ya que esta proteína
está implicada en la presentación y la desensibilización del
receptor GABA(A) y que el envejecimiento y los procesos
ligados a la edad están asociados a un aumento de la duración
necesaria para la desensibilización de este receptor
GABA(A). Estos procesos, y especialmente los déficit
cognitivos, podrían compensarse por lo tanto por los compuestos
según la invención, que presentan una acción al nivel de la ruta
GABA y de las mitocondrias.
La presente invención aporta por lo tanto
elementos nuevos y esenciales para la elección del receptor
GABA(A) como diana terapéutica para el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer, y más generalmente de trastornos
cognitivos, y permite así dar cuenta de los efectos biológicos y
terapéuticos observados en el uso de los compuestos de la familia
de las pirazolopiridinas en el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer y la demencia
vascular, y más particularmente para tratar trastornos cognitivos.
Los resultados presentados en los ejemplos ilustran especialmente la
eficacia de dichos compuestos para mejorar las capacidades de
memorización de los animales en una situación de aversión.
La excitotoxicidad y la apoptosis son las dos
causas principales de muerte neuronal. Las múltiples rutas de la
apoptosis surgen de la mitocondria, y uno de los puntos cruciales
para la aparición de la apoptosis es, por ejemplo, la apertura del
poro mitocondrial de transición (MPTP). La sobreproducción de
radicales libres (ROS) debida a la disfunción de la mitocondria
desequilibra la regulación de la apoptosis e induce así un aumento
de la vulnerabilidad de las neuronas a la excitotoxicidad.
Estos dos fenómenos, la sobreproducción de
radicales libres y la excitotoxicidad, están implicados en el
mecanismo patológico que conlleva la muerte neuronal debida a la
edad y enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de
Alzheimer y la ELA. Efectivamente, se ha demostrado que los
radicales libres son al menos en parte responsables de las
deficiencias de los cerebros envejecidos. El estrés oxidativo se ha
implicado en la progresión de la enfermedad de Alzheimer, la
demencia vascular, la enfermedad de Parkinson y la ELA. El estrés
oxidativo es el resultado de una desregulación de la homeostasis
entre los prooxidantes y los antioxidantes, que conduce a la
generación de radicales libres tóxicos.
Los inventores han establecido un repertorio de
alteraciones del corte y empalme de ARN en el cerebro de animales
modelo de ELA de 60 días de edad, que se ha realizado mediante
cribado diferencial cualitativo según la técnica DATAS (descrita en
la solicitud nº WO 99/46403). Este repertorio se ha construido a
partir de ARN extraídos de muestras de cerebro y de médula espinal,
sin aislamiento previo de neuronas, con el fin de tener en cuenta
el máximo de eventos de corte y empalme alternativos ligados al
desarrollo de la patología. El repertorio así producido contiene
más de 200 secuencias distintas, que implican a los actores clave
del fenómeno de excitotoxicidad, tales como los canales potásicos y
el receptor de NMDA. La especificidad de las secuencias que
constituyen este repertorio está atestiguada por el hecho de que el
mismo análisis diferencial cualitativo de la expresión genética
realizado en animales de 90 días de edad desemboca en un repertorio
diferente, del que están ausentes especialmente los diferentes
marcadores de excitotoxicidad. El análisis de las modificaciones de
corte y empalme confirma que los eventos moleculares son diferentes
según el estado de la patología.
De manera particularmente interesante e
inesperada, la realización de DATAS sobre ARN de animales de control
y transgénicos de 60 días de edad ha permitido aislar un fragmento
de ADNc derivado del ARNm de la fosfodiesterasa 4B, de la proteína
AKAP1 ("una proteína de anclaje de cinasa") y de la proteína
GABA(A)RAPL1 ("proteína asociada al receptor
GABA(A) de tipo 1").
La proteína PDE4B, capaz de hidrolizar AMPc,
está implicada en la regulación de la concentración intracelular de
AMPc. La proteína AKAP1 ancla la subunidad reguladora de la proteína
cinasa A (activada por AMPc) a la membrana mitocondrial y regula la
actividad del poro de transición mitocondrial. Los resultados
obtenidos muestran una expresión más pronunciada de PDE4B en los
tejidos nerviosos patológicos, ligada a una modificación
estructural del ARN correspondiente, especialmente a una deleción de
una región en la parte 3' no codificante. Este resultado es
totalmente compatible con la presencia de secuencias de
desestabilización de los ARNm en la secuencia identificada por
DATAS. La deleción de estas secuencias de desestabilización del ARNm
de PDE4B por corte y empalme o por el uso de secuencias de
poliadenilación alternativas puede desembocar en una estabilización,
por lo tanto en un aumento de la expresión, de la parte codificante
de este ARN. Este evento se produce específicamente en el cerebro
de sujetos patológicos y no en los sujetos de control.
La identificación de un fragmento derivado de
AKAP1 demuestra por otra parte la implicación de esta proteína en
el desarrollo de procesos de excitotoxicidad y de muerte neuronal.
La AKAP1 interacciona con la subunidad reguladora de la proteína
cinasa A y con el receptor periférico de benzodiazepinas (PBR), que
participa en la regulación de la apertura del poro mitocondrial de
transición, apertura que caracteriza la ejecución de la apoptosis.
En consecuencia, la invención sugiere que la AKPA1 regula la
intervención del PBR en los fenómenos de muerte celular tales como
la muerte neuronal.
La identificación de un fragmento derivado de
GABA(A)RAPL1 destaca la desregulación de la
señalización dependiente del receptor GABA(A). Esta
observación es totalmente compatible con la importancia del
neurotransmisor como inhibidor de la transmisión sináptica,
especialmente por su interacción con el receptor GABA(A).
Esta inhibición permite proteger a las neuronas contra una
excitación mantenida que podría conducir a la muerte neuronal por
excitotoxicidad. Estos trabajos indican por lo tanto una alteración
de este nivel de regulación, implicados en la presentación y
desensibilización del receptor GABA(A).
Más particularmente, el descubrimiento reseñado
en la presente invención ilustra la existencia de alteraciones de
la señalización de GABA con relación a problemas cognitivos. La
presente invención revela también la existencia de alteraciones del
corte y empalme del ARNm que codifica la subunidad épsilon del
receptor GABA(A) entre los ARNm extraídos de la corteza
prefrontal de pacientes aquejados de enfermedad de Alzheimer por un
lado y de ARNm extraídos de la misma región del cerebro de
individuos de control que tienen la misma edad por otro lado. No se
había reseñado nunca ninguna anomalía de esta subunidad hasta ahora
en la patología humana.
La presente invención permite por lo tanto
proponer nuevas estrategias terapéuticas de los trastornos de la
función cognitiva basadas en una modulación de estas rutas
metabólicas, que se correlacionan con la aparición, el desarrollo y
la progresión de la excitotoxicidad y de la apoptosis en células
nerviosas, y son particularmente pertinentes en las enfermedades
neurodegenerativas.
La presente solicitud documenta las propiedades
ventajosas y notables de los compuestos de la familia de las
pirazolopiridinas, como etazolato, para el tratamiento de déficit
cognitivos, especialmente aquellos inducidos por la enfermedad de
Alzheimer y la demencia vascular.
En el contexto de la invención, el término
"tratamiento" designa el tratamiento preventivo, curativo,
paliativo, así como hacerse cargo de los pacientes (reducción del
sufrimiento, mejora del tiempo de vida, ralentización de la
progresión de la enfermedad, mejora de la supervivencia de las
neuronas, protección de las neuronas contra la excitotoxicidad o la
apoptosis, etc.), etc. El tratamiento puede realizarse además en
combinación con otros agentes o tratamientos, especialmente
dirigidos a los eventos tardíos de la patología, tales como
inhibidores de caspasas u otros compuestos activos.
La invención está particularmente adaptada al
tratamiento de déficit cognitivos en los sujetos, es decir, a la
reducción de estos efectos y/o a la mejora de la percepción
cognitiva en los pacientes. El etazolato responde a la fórmula (II)
siguiente:
Los compuestos pueden estar en forma de sal,
éster, racemato, isómero activo, etc. La capacidad de los compuestos
para proteger las células de radicales libres puede verificarse
in vitro.
La presente invención propone así, por primera
vez, una intervención terapéutica que liga una modulación de los
radicales libres y una modulación del receptor GABA(A) como
diana terapéutica para el tratamiento de déficit cognitivos
asociados a las enfermedades neurodegenerativas. Según los modos de
ejecución particulares, la invención puede utilizarse para tratar
los déficit cognitivos en fase precoz de estas enfermedades. Es
aplicable especialmente en el caso de enfermedad de Alzheimer,
demencia vascular, corea de Huntington y enfermedad de
Parkinson.
El compuesto utilizado en el marco de la
presente invención puede formularse y administrarse de formas
diferentes. La administración puede realizarse mediante cualquier
procedimiento conocido por el experto en la materia,
preferiblemente por vía oral o por inyección, sistémica o local. La
invención se realiza típicamente por vía intraocular,
intraperitoneal, intracerebral, intravenosa, intraarterial,
subcutánea o intramuscular. Se prefiere la administración por vía
oral o sistémica. Las dosis administradas pueden adaptarse por el
experto en la técnica. Típicamente, se inyectan aproximadamente de
0,01 mg a 100 mg/kg para compuestos de naturaleza química. Son
dosificaciones unitarias particulares, por ejemplo, de 0,5 a 40 mg
por dosis administrada. Se entiende que pueden realizarse
inyecciones repetidas, eventualmente en combinación con otros
agentes activos y cualquier vehículo aceptable en el plano
farmacéutico (ej.: tampones, soluciones salinas, isotónicas, en
presencia de agentes estabilizadores, etc.).
El vehículo o excipiente aceptable en el plano
farmacéutico puede elegirse entre los solutos tampones, disolventes,
ligantes, estabilizadores, emulsionantes, etc. Son solutos tampones
o diluyentes son especialmente fosfato de calcio, sulfato de
calcio, lactosa, celulosa, caolín, manitol, cloruro de sodio,
almidón, azúcar en polvo e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) (para
liberación retardada). Son ligantes, por ejemplo, almidón, gelatina
y solutos de relleno como sacarosa, glucosa, dextrosa, lactosa, etc.
Pueden utilizarse también gomas naturales o sintéticas, como
especialmente alginato, carboximetilcelulosa, metilcelulosa,
polivinilpirrolidona, etc. Son otros excipientes, por ejemplo,
celulosa y estearato de magnesio. Pueden incorporarse a las
formulaciones agentes estabilizadores como, por ejemplo,
polisacáridos (goma arábiga, agar, ácido algínico, goma guar y
tragacanto, quitina o sus derivados y éteres de celulosa). Son
disolventes o solutos, por ejemplo, la solución de Ringer, agua,
agua destilada, tampones fosfato, soluciones salinas fosfatadas y
otros fluidos convencionales.
La invención es utilizable en mamíferos,
especialmente en el ser humano. Los resultados presentados en los
ejemplos ilustran la eficacia del etazolato para mejorar la
viabilidad de neuronas dispuestas en condiciones de
excitotoxicidad, de estrés oxidativo o de isquemia cerebral, y para
mejorar las capacidades de memorización de animales en una
situación de aversión.
Aparecerán otros aspectos y ventajas de la
presente invención con la lectura de los ejemplos siguientes.
Figura 1: Efecto neuroprotector del etazolato
sobre la toxicidad inducida por NMDA/serina sobre células granulares
del cerebelo.
Figura 2: Efecto neuroprotector del etazolato
sobre la toxicidad inducida por cainato sobre células granulares
del cerebelo.
Figura 3: Efecto neuroprotector del etazolato
sobre la toxicidad inducida por NMDA/serina sobre neuronas
corticales.
Figura 4: Efecto neuroprotector del etazoalto
sobre la toxicidad inducida por cainato sobre neuronas
corticales.
Figura 5: Efecto neuroprotector del etazolato
sobre la toxicidad inducida por NMDA/serina sobre células de la
médula espinal ventral.
Figura 6: Efecto neuroprotector del etazolato
sobre la toxicidad inducida por cainato sobre células de la médula
espinal ventral.
Figura 7: Efecto protector del etazolato en el
modelo de infarto cerebral en rata.
Se ha efectuado el análisis cualitativo
diferencial a partir de ARN poliadenilados (poli A+) extraídos de
muestras de cerebros de animales correspondientes a diferentes
estados, sin aislamiento previo de neuronas con el fin de tener en
cuenta el máximo de eventos de corte y empalme alternativos ligados
al desarrollo de la patología.
Los ARN poli A+ se preparan según técnicas
conocidas por el experto en la materia. Puede tratarse en particular
de un tratamiento mediante agentes caotrópicos tales como
tiocianato de guanidinio seguido de la extracción de ARN totales
mediante disolventes (fenol, cloroformo, por ejemplo). Dichos
procedimientos son bien conocidos por el experto en la materia
(véase Maniatis et al., Chomczynsli et al., Anal.
Biochem. 162 (1987), 156), y pueden practicarse fácilmente
utilizando kits disponibles comercialmente. A partir de estos ARN
totales, se preparan ARN poli A+ según procedimientos clásicos
conocidos por el experto en la materia y propuestos por kits
comerciales.
Estos ARN poli A+ sirven de matriz a reacciones
de transcripción inversa con la ayuda de transcriptasa inversa.
Ventajosamente, se utilizan transcriptasas inversas desprovistas de
actividad ARNasa H que permiten obtener las primeras cadenas de ADN
complementario de tamaños superiores a los obtenidos con las
transcriptasas inversas clásicas. Dichas preparaciones de
transcriptasas inversas sin actividad ARNasa H están disponibles
comercialmente.
Para cada punto de la cinética de desarrollo de
la patología (30 días, 60 días y 90 días), se preparan los ARN poli
A+ así como los ADNc monocatenarios a partir de animales
transgénicos (T) y animales de control singénicos (C).
Según la técnica DATAS, por cada punto de la
cinética se realizan hibridaciones de ARNm (C) con ADNc (T) e
hibridaciones recíprocas de ARNm (T) con ADNc (C).
Estos heterodúplex de ARNm/ADNc se purifican a
continuación según los protocolos de la técnica DATAS.
Se liberan de estos heterodúplex las secuencias
de ARN no apareadas con un ADN complementario bajo la acción de
ARNasa H, degradando esta enzima las secuencias de ARN apareadas.
Estas secuencias no apareadas representan las diferencias
cualitativas que existen entre ARN por lo demás homólogos entre sí.
Estas diferencias cualitativas pueden localizarse en cualquier
lugar de la secuencia de los ARN, tanto en 5', 3' como al interior
de la secuencia, y especialmente en la secuencia codificante. Según
su localización, estas secuencias pueden no ser solamente
modificaciones de corte y empalme, sino igualmente consecuencia de
translocaciones o deleciones.
Las secuencias de ARN que representan las
diferencias cualitativas se clonan a continuación según técnicas
conocidas por el experto en la materia y especialmente las descritas
en la patente de la técnica DATAS.
Se reagrupan estas secuencias dentro de bancos
de ADNc que constituyen bancos cualitativos diferenciales. Uno de
estos bancos contiene los exones e intrones específicos de la
situación sana; los otros bancos contienen eventos de corte y
empalme característicos de las condiciones patológicas.
Se ha verificado la expresión diferencial de
clones mediante hibridación con sondas obtenidas mediante
transcripción inversa a partir de ARN mensajeros extraídos de las
diferentes situaciones estudiadas. Los clones que hibridan de forma
diferencial se han retenido para análisis posterior. Las secuencias
identificadas por DATAS corresponden a intrones y/o a exones
expresados de forma diferencial por corte y empalme entre las
situaciones patológicas y la situación sana. Estos eventos de corte
y empalme pueden ser específicos de una etapa dada de desarrollo de
la patología o característicos del estado sano.
La comparación de estas secuencias con los
bancos de datos permite clasificar las informaciones obtenidas y
proponer una selección razonada de secuencias según su interés de
diagnóstico o terapéutico.
La realización de DATAS sobre ARN de animales de
control y transgénicos de 60 días de edad ha permitido aislar un
fragmento de ADNc derivado de ARNm de fosfodiesterasa 4B. Este
fragmento corresponde a un fragmento de exón presente
específicamente en los animales de control y por lo tanto eliminado
específicamente en los animales transgénicos para SOD1 G93A en el
estado de 60 días. Este fragmento cubre los nucleótidos 377 a 486
referidos a partir del codón de detención de la PDE4B de ratón
(secuencia accesible en GenBank nº AF208023). Esta secuencia
comprende 2912 bases, correspondiendo el fragmento eliminado a las
bases 2760 a 2869. Esta región es no codificante y se expresa
diferencialmente entre los animales de control y los animales
transgénicos debido al uso alternativo de un exón 3' no codificante
o debido al uso de dos sitios de poliadenilación alternativos.
La realización de DATAS sobre ARN de animales de
control y transgénicos de 60 días de edad ha permitido igualmente
aislar un fragmento de ADNc derivado de ARNm de AKAP1. Este
fragmento corresponde a un fragmento de exón presente
específicamente en animales de control y por lo tanto eliminado
específicamente en los animales transgénicos para SOD1 G93A en el
estado de 60 días. Este fragmento es homólogo de los nucleótidos
1794 a 2322 de la secuencia referida en GenBank con el número
NM_009648. Esta región es codificante y se expresa diferencialmente
entre los animales de control y los animales transgénicos, debido a
un corte y empalme alternativo.
La realización de DATAS sobre ARN de animales de
control y transgénicos de 60 días de edad ha permitido igualmente
aislar un fragmento de ADNc derivado de ARNm de
GABA(A)RAPL1. Este fragmento corresponde a un
fragmento de exón presente específicamente en animales de control y
por lo tanto eliminado específicamente en animales transgénicos
para SOD1 G93A en el estado de 60 días. Este fragmento es homólogo
de los nucleótidos 1055 a 1461 de la secuencia referida en GenBank
con el nº BC024706. Esta región deriva de la región 3' no
codificante y se expresa diferencialmente entre los animales de
control y los animales transgénicos. Estos elementos permiten
aclarar y definir las vías de señalización importantes, y muestran
que la señalización dependiente de GABA(A)R parece
alterada en el cerebro de pacientes aquejados de enfermedad de
Alzheimer. Efectivamente, el análisis por cribado diferencial
cualitativo según la técnica DATAS de ARNm extraídos de la corteza
prefrontal de pacientes aquejados de enfermedad de Alzheimer por
una parte y ARN extraídos de la misma región del cerebro de
individuos de control que tienen la misma edad, ha evidenciado
alteraciones del corte y empalme del ARNm que codifica la proteína
GABA(A)RAP (proteína asociada al receptor
GABA(A)). Esta alteración revela la retención de 135 bases
de una secuencia intrónica al nivel de la base 273 de la secuencia
catalogada en GenBank con el número NM_007278.1. Esta retención
modifica la fase abierta y por lo tanto la funcionalidad de la
proteína GABA(A)RAP. Al estar implicada esta proteína
en la presentación y desensibilización del receptor GABA(A),
el análisis DATAS revela una alteración a este nivel de la
regulación de las actividades sinápticas.
La señalización de GABA representa uno de los
mecanismos más potentes de regulación negativa de la actividad
sináptica. En la estimulación de este receptor GABA(A) por el
neurotransmisor GABA, este receptor que es un canal iónico permite
la entrada de iones de cloro que participan en la repolarización de
las neuronas. El receptor GABA(A) presenta una estructura
pentamérica formada por la asociación de 2 subunidades alfa, dos
subunidades beta y una subunidad accesoria, delta, épsilon o gamma
principalmente.
Los agonistas del receptor GABA(A) son
ansiolíticos pero amnesiantes.
Los antagonistas del receptor GABA(A) son
ansiogénicos, proconvulsionantes y promnesiantes.
Además, es conocido que, en el cerebro de
pacientes aquejados de enfermedad de Alzheimer, una de las
subunidades del receptor GABA(A), la subunidad beta3, está
subexpresada.
La subunidad épsilon, presente en el hipocampo y
que es una de las primeras estructuras cerebrales que se alteran en
el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, confiere propiedades
farmacológicas originales al receptor GABA(A).
Efectivamente, el enlace mediante las subunidades beta a los
receptores GABA(A) que contienen una subunidad épsilon de
agentes farmacológicos como pirazolopiridinas, tales como
tracazolato y etazolato, acelera la desensibilizción del receptor
GABA(A) después de la interacción con el neurotransmisor
GABA. Este efecto es particularmente interesante, puesto que el
envejecimiento está asociado a un aumento de la duración necesaria
para la desensibilización del receptor GABA(A).
Una alteración de la subunidad épsilon, como la
descrita en la presente invención, asociada al alargamiento del
periodo necesario para la desensibilización de los receptores
GABA(A) en los procesos ligados a la edad como la enfermedad
de Alzheimer, puede compensarse por lo tanto mediante el tratamiento
de pacientes con agentes farmacológicos como pirazolipiridinas,
tales como tracazolato y etazolato. Éste último compuesto presenta
igualmente la ventaja de ser un inhibidor de PDE4, de la que la
invención muestra su implicación en fenómenos de
excitotoxicidad.
La posibilidad de afectar a esta vía de
señalización puede conducir a tratamientos particularmente eficaces
de patologías neurodegenerativas, especialmente de enfermedades
degenerativas asociadas a una alteración de las funciones cognitivas
como la enfermedad de Alzheimer y la demencia vascular.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, se han cultivado neuronas
granulares del cerebelo, neuronas corticales, así como células de
médula espinal ventral de rata según las técnicas descritas a
continuación.
Se decapitan ratas Wistar de 7 días de edad y se
diseccionan sus cerebelos. Después de retirar las meninges, se
corta el tejido en pequeños trozos y se tripsiniza durante 15
minutos a 37ºC. Se disocian las células mediante trituración y se
ponen en cultivo a una densidad de 300.000 células por cm^{2} en
un medio basal Eagle suplementado con 10% de suero fetal de ternero
y glutamina 2 mM. Al día siguiente, se añade ARA-C
10 \muM, un antimitótico, para impedir la proliferación de
células gliales. Se tratan las células durante 9 días después de
poner en cultivo con el compuesto inhibidor etazolato, antes de la
adición de los tóxicos cainato 50 \muM o
N-metil-D-aspartato 100
\muM en presencia de D-serina 10 \muM. Se añade
8-bromo-AMPc justo antes de los
tóxicos. Se efectúan todos los tratamientos como mínimo por
duplicado y en al menos dos cultivos diferentes. Después de una
incubación de 6 horas, se mide la toxicidad mediante un ensayo MTT.
Se analizan estadísticamente los resultados, normalizados a la
media de no tratado, mediante el test de Wilcoxon. Se determina el
valor significativo a p inferior o igual a 0,05.
Se extraen embriones de rata Wistar de 16 días
de edad y se diseccionan las cortezas. Después de tripsinación a
37ºC durante 25 minutos, se disocian las células mediante
trituración. Se siembran las células en medio esencial mínimo,
suplementado con 10% de suero de caballo y 10 de suero fetal de
ternero y glutamina 2 mM, a una densidad de 300.00 células por
cm^{2}. Después de 4 días de cultivo, se cambia la mitad del medio
por medio esencial mínimo suplementado con 5% de suero de caballo y
glutamina 2 mM. El mismo día, se añade
5-fluoro-2-desoxiuridina
10 \muM, un antimitótico. Después de 7 y 11 días de cultivo, se
cambia la mitad del medio por medio acondicionado. El medio
acondicionado está compuesto por MEM que contiene 5% de suero de
caballo y glutamina 2 mM; este medio se pasa sobre un césped de
astrocitos corticales durante una noche antes de su uso. El día 14,
se tratan las células con el compuesto inhibidor etazolato, antes de
la adición de los tóxicos cainato 50 \muM o
N-metil-D-aspartato 20 \muM
en presencia de serina 10 \muM. Se efectúan todos los
tratamientos como mínimo por duplicado y en al menos dos cultivos
diferentes. Después de una incubación de 6 horas, se mide la
toxicidad mediante un ensayo MTT. Se analizan estadísticamente los
resultados, normalizados a la media de no tratado, mediante el test
de Wilcoxon. Se determina el valor significativo a p inferior o
igual a 0,05.
Se aíslan las células a partir de embriones de
rata Wistar de 14 días de edad. A su llegada, se sacrifican las
ratas gestantes con dióxido de carbono. Se extrae la sarta de
embriones y se pone en una placa que contiene PBS. Se disecciona la
médula espinal de cada embrión y se separa el cordón ventral de los
cordones dorsales. Se tripsinizan a continuación los cordones
ventrales a 37ºC durante 20 min. Se detiene el efecto de la tripsina
mediante la adición de un medio compuesto por medio Leibovitz 15,
20% de suero de caballo, suplemento N2 (1x), 20% de glucosa (3,2
mg/ml), 7,5% de bicarbonato (1,8 mg/ml) y
L-glutamina (2 mM). Se disocian las células por
trituración. Se retiran las masas tisulares y se cuantifican a
continuación las células disociadas mediante coloración con azul de
tripano. Se siembran las células a una densidad de 250.00
células/cm^{2} en un medio compuesto por medio neurobasal, suero
de caballo (al 2%), suplemento B27 (1x) y glutamina (2 mM). Después
de 3 días de cultivo in vitro, se añade un agente
antimitótico, ARA-C (5 \muM), a las células con el
fin de inhibir la producción de células gliales. Se ponen en
cultivo las células a 37ºC en un incubador humidificado (5% de
CO_{2}) durante 9 días. Después de 9 días de cultivo, se tratan
las células con el compuesto inhibidor etazolato antes de la
adición de
N-metil-D-aspartato (NMDA) 25
\muM en presencia de D-serina 10 \muM. Se
efectúan todos los tratamientos como mínimo por duplicado y en al
menos dos cultivos diferentes. Después de 3 horas de incubación con
NDMA/D-serina como tóxicos, se revela la toxicidad
mediante el ensayo MTT.
Se normalizan los resultados a la media de
controles no tratados y se analizan estadísticamente con un test de
Wilcoxon con p inferior a 0,05.
Se mide la toxicidad utilizando el ensayo MTT.
Después de la incubación con los compuestos, se añade MTT a una
concentración final de 0,5 mg/ml por pocillo. Se incuban a
continuación las placas durante 30 minutos a 37ºC en la oscuridad.
Se aspira el medio y se vuelven a poner en suspensión los cristales
en 500 \mul de DMSO (dimetilsulfóxido). Se lee la absorbancia a
550 nm y se calcula el porcentaje de viabilidad.
Se presentan los resultados obtenidos en las
figuras 1-5. Estos resultados ilustran el efecto
protector de los compuestos de la invención sobre la supervivencia
neuronal. En el cotratamiento de neuronas con un inhibidor de la
invención, se observa un efecto protector dependiente de la dosis en
los modos de inducción de la excitotoxicidad (NDMA/serina y/o
cainato).
Las figuras 1 y 2 presentan los resultados
obtenidos con la ayuda de etazolato sobre células granulares del
cerebelo. Los resultados presentados muestran que el etazolato
permite alcanzar en estas células un efecto protector del 40% en el
caso de tratamiento con NMDA/Ser y del 50% en el caso de toxicidad
inducida por cainato.
Las figuras 3 y 4 presentan los resultados
obtenidos con la ayuda de etazolato sobre neuronas corticales. Los
resultados presentados muestran que el etazolato permite alcanzar en
estas células un efecto protector del 47% en el caso de tratamiento
con NMDA/ser y del 40% en el caso de toxicidad inducida por
cainato.
La figura 5 presenta los resultados obtenidos
con etazolato sobre células de médula espinal ventral. Estos
resultados muestran que el etazolato permite alcanzar en estas
células un efecto protector del 36% en el caso de tratamiento con
NMDA/Ser.
La presente invención documenta por lo tanto no
solamente la implicación de la PDE4B y los receptores GABA(A)
en los mecanismos de excitotoxicidad, sino igualmente la capacidad
de los inhibidores de conservar la viabilidad neuronal en estrés
ligado a excitotoxicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, se han puesto en cultivo
células de la línea SH-SY5Y según técnicas conocidas
por el experto en la materia. Estas células, derivadas de un
neuroblasto humano, poseen propiedades que caracterizan a un
precursor neuronal en un estado precoz de desarrollo. El tóxico
empleado es la 6-hidroxidopamina
(6-OHDA) que induce un estrés oxidativo. La
toxicidad se mide mediante un ensayo MTT.
La figura 6 presenta los resultados obtenidos
con el etazolato sobre células SH-SY5Y. Estos
resultados muestran que el etazolato permite alcanzar en estas
células un efecto protector del 40% en el caso de tratamiento con
6-OHDA.
El etazolato es por lo tanto un protector
potencial in vitro de la muerte celular inducida por ROS. Por
lo tanto, el potencial neuroprotector del etazolato se refuerza por
los resultados obtenidos en el ejemplo 2 y 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evalúa el efector protector in vivo
del etazolato en un modelo de infarto cerebral en rata. En el curso
de este estudio, se provoca un infarto cerebral por oclusión
intracavitaria de la carótida interna y de las arterias medias del
cerebro. Se trata un grupo de 8 ratas con etazolato (10 mg/kg, oral)
antes y varias veces después de la oclusión. Se trata un grupo de 8
ratas con el compuesto de referencia L-NAME (1
mg/kg, i.p.) antes y varias veces después de la oclusión. Se trata
un grupo de 8 ratas sólo con el vehículo. Se evalúan los efectos
mediante observaciones clínicas, ensayos funcionales neurológicos y
mediante la determinación del tamaño del infarto al final del
estudio.
Los resultados obtenidos muestran que el
etazolato induce una reducción del 28% de media del tamaño del
infarto con relación al control (véase el ejemplo de la figura 7).
Por otro lado, se observa una mejora de la hipoactividad en el
grupo tratado con etazolato con relación al grupo de control (31%
para el grupo de etazolato frente a 42% para el grupo de control).
Además, la evaluación neurológica de los animales demuestra una
mejora en el grupo tratado con relación al grupo de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utiliza este ensayo para evaluar las
capacidades de memorizar y gestionar la información espacial en rata
en una situación de aversión. La tarea para el animal consiste en
localizar con la ayuda de índices distales una plataforma "de
refugio" invisible mediante inmersión en una cubeta llena de agua
opacificada. El dispositivo permite evaluar la memoria de
referencia del animal (la plataforma se encuentra en el mismo lugar
en cada día del ensayo). Este ensayo permite apreciar los
desempeños mnésiccs dependientes de funciones del hipocampo de los
animales ensayados. Especialmente, este ensayo permite discriminar
los desempeños de ratas adultas (10 meses) y los de ratas
envejecidas (30 meses). El hipocampo es una estructura cerebral
cuyas funciones se alteran precozmente en la enfermedad de
Alzheimer. El ensayo de la piscina de Morris es por lo tanto
particularmente reconocido por el experto en la materia para
permitir apreciar las propiedades farmacológicas de compuestos
dirigidos a tratar la enfermedad de Alzheimer así como otras
patologías asociadas a un déficit cognitivo. Se han utilizado para
este estudio ratas envejecidas tratadas con etazolato (3 mg/kg y 10
mg/kg) administrado por vía oral, así como ratas tratadas con
vehículo. Se han comparado los desempeños de estos animales en el
ensayo de la piscina de Morris con los de un grupo de control de
ratas adultas.
El tratamiento con 3 mg/kg de etazolato mejora
ligeramente los desempeños de las ratas envejecidas. El tratamiento
con 10 mg/kg de etazolato acerca de forma importante los desempeños
de los animales envejecidos a los de los animales adultos.
Este resultado indica que el etazolato mejora
las propiedades mnésicas y cognitivas dependientes del hipocampo,
permitiendo reducir los déficit de desempeño ligados a la edad. Este
resultado cualifica al etazolato para el tratamiento de problemas
cognitivos ligados a la edad como la enfermedad de Alzheimer,
especialmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe las condiciones de uso en
el hombre de etazolato para el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas. Este ejemplo ilustra el potencial terapéutico de
la invención y sus condiciones de uso en el hombre.
En este estudio, se han administrado dosis
únicas crecientes de etazolato (0,5, 1, 2, 5, 10 y 20 mg) por vía
oral en forma de cápsulas dosificadas a 0,5 y 5 mg a grupos
diferentes y secuenciales de 8 sujetos jóvenes y sanos, voluntarios
de sexo masculino. Este estudio se ha realizado en un solo centro,
por doble ciego, y 2 de los 8 sujetos han recibido un placebo. Los
parámetros evaluados han sido la tolerancia clínica (aparición de
efectos adversos, de señales clínicas, cambio de la presión arterial
o la frecuencia cardiaca), electrocardiográficos (registro del ECG)
y biológicos (hematología y bioquímica sanguínea, examen urinario)
durante las 24 h siguientes a la administración del producto. Se ha
realizado una dosificación plasmática del producto en cada sujeto
en diferentes momentos antes y después de la administración del
producto
(0,25-0,50-1,00-1,50-2,00-3,00-4,00-5,00-6,00-8,00-10,00-12,00
y 24,00 horas). Se ha realizado igualmente una dosificación
urinaria del producto a partir de orinas recogidas antes y después
de la administración del producto (4, 4-8,
8-12 y 12-24 horas).
Al término de esta fase de administración de
dosis crecientes, un grupo suplementario de 6 sujetos recibe una
dosis de etazolato en dos tomas: en ayunas y en el curso de una
comida rica en grasa. El objetivo de esta segunda parte es comparar
la evolución de las tasas sanguíneas de producto entre las dos
condiciones de administración. Los parámetros evaluados son la
tolerancia clínica (aparición de efectos adversos, de señales
clínicas, cambio de la presión arterial o la frecuencia cardiaca),
electrocardiográficos (registro del ECG) y biológicos (hematología
y bioquímica sanguínea, examen urinario) durante las 24 h después de
la administración del producto. Se ha realizado una dosificación
plasmática del producto en cada sujeto en diferentes momentos antes
y después de la administración del producto
(0,25-0,50-1,00-1,50-2,00-3,00-4,00-5,00-6,00-8,00-10,00-12,00
y 24,00 horas).
Se ha realizado igualmente una dosificación
urinaria del producto a partir de orinas recogidas antes y después
de la administración del producto (4, 4-8,
8-12 y 12-24 horas). Se desarrolla
igualmente una cápsula gastrorresistente para este producto de
forma que se pueda utilizar en estudios clínicos en el hombre. Los
resultados obtenidos en el transcurso de la primera fase de estudio
de dosis crecientes han mostrado que el etazolato es bien tolerado
y no conlleva efectos secundarios. Además, las dosificaciones
plasmáticas han confirmado en el hombre la buena absorción del
producto a dosis altas.
Claims (4)
1. Utilización de etazolato de fórmula (II)
o de una sal o éster del mismo,
para la preparación de una composición farmacéutica dirigida a
mejorar la percepción cognitiva en un paciente
humano.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el
paciente está aquejado de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de
Parkinson o corea de Huntington.
3. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la
composición se administra por vía oral o sistémica.
4. Composición que comprende etazolato de
fórmula (II)
o una sal o éster del mismo, para
uso para mejorar la percepción cognitiva en un paciente
humano.
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