ES2336780T3 - Agentes de formacion de imagenes dirigidos al receptor de folato. - Google Patents

Abstract

Compuesto de fórmula **(Ver fórmula)** en la que V es un folato, en la que el folato se une a un receptor de folato, y en la que el folato es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptor in vivo, o un derivado o análogo del mismo, en la que el análogo se selecciona de análogos desaza y didesaza de ácido fólico, ácido folínico, ácido pteroico, ácido pteropoliglutámico y pteridinas que se unen al receptor de folato, o de aminopterina, ametopterina (metotrexato), N10-metilfolato, 2-desamino-hidroxifolato, análogos desaza y ácido 3''5''-dicloro-4-amino-4-desoxi-N10-metilpteroilglutámico (diclorometotrexato), en la que el derivado o análogo se une al receptor de folato y es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptor in vivo; L es un conector divalente; R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH; M es un catión de un radionúclido; n es 1 ó 0; y k es 1 ó 0, con la condición de que (i) si k = 0, el compuesto no es el compuesto EC20: **(Ver fórmula)** y si dicho k = 1 y dicho compuesto es EC20, M no es 99mTc.

Description

Agentes de formación de imágenes dirigidos al receptor de folato.

Campo de la invención

La invención se refiere a compuestos y a métodos para dirigir un agente de formación de imágenes a células de un animal. Más particularmente, los agentes de formación de imágenes a base de radionúclido se dirigen a células que tienen receptores para una vitamina usando una vitamina de este tipo, o un derivado o un análogo de la misma que se une al receptor de vitamina, como el ligando dirigido para el agente de formación de imágenes.

Antecedentes y sumario de la invención

El transporte transmembrana es una función celular crítica. Puesto que los médicos han reconocido la importancia del transporte transmembrana para muchas áreas de la ciencia biológica y médica, incluyendo el tratamiento farmacológico y la transferencia génica, se han realizado esfuerzos de investigación significativos dirigidos a la comprensión y la aplicación de tales procesos. Así, por ejemplo, se ha intentado el suministro transmembrana de ácidos nucleicos a través del uso de soportes de proteínas, soportes de anticuerpos, sistemas de suministro liposómicos, electroporación, inyección directa, fusión celular, soportes virales, choque osmótico y transformación mediada por calcio-fosfato. Sin embargo, muchas de estas técnicas están limitadas tanto por los tipos de células en los que se produce el transporte transmembrana como por las condiciones requeridas para el transporte transmembrana satisfactorio de moléculas exógenas. Además, muchas de estas técnicas están limitadas por el tipo y el tamaño de la molécula exógena que puede transportarse a través de la membrana celular sin pérdida de bioactividad.

Un mecanismo para el transporte transmembrana de las moléculas exógenas que tiene amplia aplicabilidad es la endocitosis mediada por receptor. Ventajosamente, la endocitosis mediada por receptor se produce tanto in vivo como in vitro. La endocitosis mediada por receptor implica el movimiento de ligandos unidos a receptores de membrana hacia el interior de una zona limitada por la membrana a través de la invaginación de la membrana. El proceso se inicia o activa mediante la unión de un ligando específico de receptores al receptor. Se han caracterizado muchos sistemas endocitóticos mediados por receptor, incluyendo aquellos que dan como resultado la internalización de galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, transferrina, asialoglicoproteína, folato, transcobalamina (vitamina B12), \alpha-2-macroglobulinas, insulina y otros factores de crecimiento peptídicos tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF).

Se ha utilizado la endocitosis mediada por receptor para suministrar moléculas exógenas tales como proteínas y ácidos nucleicos a células. Generalmente, un ligando específico se conjuga químicamente mediante unión de hidrógeno, iónica o covalente a una molécula exógena de interés, formando una molécula conjugada que tiene un resto (la parte de ligando) que todavía se reconoce en el conjugado por un receptor diana. Usando esta técnica, se ha conjugado la proteína fototóxica psoraleno con insulina y se ha internalizado mediante la ruta endocitótica del receptor de insulina (Gasparro, Biochem. Biophys. Res. Comm. 141 (2) págs. 502-509, 15 de diciembre de 1986); se ha utilizado el receptor específico de hepatocitos para asialoglicoproteínas de galactosa-terminales para el suministro transmembrana específico de hepatocitos de asialoorosomucoide-poli-L-lisina complejada no covalentemente con un plásmido (Wu, G. Y., J. Biol. Chem., 262 (10), págs. 4429-4432, 1987); se ha utilizado el receptor celular para EGF para suministrar polinucleótidos unidos covalentemente a EGF al interior de la célula (Myers, solicitud de patente europea 86810614.7, publicada el 6 de junio de 1988); se ha usado el receptor celular ubicado en el intestino para el complejo organometálico vitamina B12-factor intrínseco para mediar en el suministro de un fármaco, una hormona, un péptido bioactivo y un inmunógeno complejado con vitamina B12 al sistema circulatorio tras la administración oral (Russell-Jones et al., solicitud de patente europea 86307849.9, publicada el 29 de abril de 1987); se ha usado el receptor de manosa-6-fosfato para suministrar lipoproteínas de baja densidad a células (Murray, G. J. y Neville, D. M., Jr., J. Biol. Chem, vol. 255 (24), págs. 1194-11948, 1980); se ha usado el receptor de la subunidad de unión a la toxina del cólera para suministrar insulina a células que carecían de receptores de insulina (Roth y Maddox, J. Cell. Phys. vol. 115, pág. 151, 1983); y se ha empleado el receptor de gonadotropina coriónica humana para suministrar una cadena \alpha de ricina acoplada
a GCH a células con el receptor de GCH apropiado (Oeltmann y Heath, J. Biol. Chem, vol. 254, pág. 1028 (1979)).

En una realización, la presente invención implica el transporte transmembrana de un agente de formación de imágenes a base de radionúclidos a través de una membrana que tiene receptores para una vitamina, o un derivado que se une al receptor de vitamina o análogo de la misma. Una membrana celular que tiene receptores de vitamina, o receptores para derivados o análogos de la vitamina, se pone en contacto con un conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes durante un tiempo suficiente para iniciar y permitir el transporte transmembrana del conjugado, y se monitoriza la biodistribución del conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes en el animal. En otra realización, el resto dirigido a la vitamina/derivado o análogo de la vitamina se une simplemente a un receptor de vitamina de la superficie celular para concentrar el radionúclido quelado sobre la superficie celular.

La invención aprovecha (1) la ubicación de los receptores de vitamina y (2) los procesos endocíticos mediados por receptor asociados. Por ejemplo, la invención aprovecha la expresión única, sobreexpresión o expresión preferencial de receptores de vitamina, transportadores u otras proteínas presentes en la superficie que se unen específicamente a vitaminas, o derivados o análogos de las mismas, en células tumorales u otros tipos celulares que sobreexpresan tales receptores. Por consiguiente, la invención puede usarse para detectar células, tales como células tumorales u otros tipos celulares, que sobreexpresan los receptores de vitamina, o los receptores para los derivados o análogos de la vitamina, aprovechando los procesos endocíticos mediados por receptor que se producen cuando se ponen en contacto tales células con el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes.

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Los receptores de vitamina, tales como el receptor de folato (RF) de alta afinidad, se expresan a niveles altos, por ejemplo, en células cancerosas. Se ha notificado que todos los cánceres epiteliales de ovario, glándula mamaria, colon, pulmón, nariz, garganta y cerebro expresan niveles elevados del RF. De hecho, se conoce que más del 90% de todos los tumores ováricos humanos expresan grandes cantidades de este receptor. Por tanto, la presente invención puede usarse para la formación de imágenes de diagnóstico de una variedad de tipos de tumores y de otros tipos celulares implicados en estados patológicos.

Se han usado quelantes de radionúclidos complejados a ligandos como sondas no invasivas para fines de formación de imágenes de diagnóstico. Por ejemplo, se han usado péptido intestinal vasoactivo, análogos de somatostatina y anticuerpos monoclonales como ligandos para localizar radionucléotidos para células, tales como células tumorales. Los anticuerpos monoclonales, y diversos fragmentos de los mismos, inicialmente recibieron la mayor atención porque se creía que la dirección específica a tumor precisa podría conseguirse usando anticuerpos monoclonales como ligandos dirigidos. Desafortunadamente, este enfoque fue problemático porque i) los anticuerpos tienen tiempos de circulación prolongados debido a su gran tamaño que es desfavorable para los fines de formación de imágenes, ii) los anticuerpos son costosos de producir, iii) los anticuerpos pueden ser inmunogénicos, y por consiguiente, deben humanizarse cuando se usan dosis múltiples, y iv) las razones de tumor con respecto a tejido no diana (T/NT) de los radionúclidos unidos a anticuerpos son subóptimas. Por tanto, el centro de atención se ha dirigido recientemente hacia el uso de ligandos específicos de tumor más pequeños que no tienen tales limitaciones.

Se han usado las vitaminas, tales como ácido fólico, para dirigir agentes de formación de imágenes a células tumorales, y son ventajosos debido a su pequeño tamaño. El primer complejo dirigido a base de ácido fólico descrito para la formación de imágenes de tumores in vivo fue un derivado de histamina que contenía ^{125}yodo. Este complejo no se consideró un candidato clínico relevante debido al componente de radionucléotido ^{125}I de larga vida. Posteriormente, se desarrolló un conjugado de deferoxamina-folato para la formación de imágenes de tumores (deferoxamina quela a ^{67}Ga, un radionucléotido que emite radiación gamma que tiene una semivida de 78 horas). Se observó aclaramiento hepatobiliar con este conjugado y, por tanto, se detuvo el desarrollo preclínico debido a problemas anticipados en la formación de imágenes de manera precisa de ubicaciones en la región abdominal. Sin embargo, se superó este obstáculo sustituyendo el quelante de deferoxamina por el ácido dietilentriamina-pentaacético (DTPA), un quelante eficaz de ^{111}In (semivida de 68 horas). Se confirmó que la vía principal de eliminación de ^{111}In-DPTA-folato era a través de los riñones.

Más recientemente, se ha adoptado ^{99m}Tc como el radionúclido preferido para la formación de imágenes, porque i) el radionúclido se obtiene fácilmente de generadores de ^{99}Mo-^{99m}Tc disponibles comercialmente, ii) el coste de producir grandes cantidades de ^{99m}Tc es insignificante en comparación con el coste de producir ^{111}In, y iii) ^{99m}Tc tiene una semivida mucho más corta (6 horas), lo que permite que se administren dosis de radionúclido mayores, produciendo imágenes con mayor resolución sin el riesgo de exposición a radiación peligrosa a órganos vitales.

Se han desarrollado varios conjugados de ^{99m}Tc a base de folato. Por ejemplo, los conjugados de folato de ^{99m}Tc-6-hidrazinonicotinamido-hidrazido (HYNIC; Guo, et al., J. Nucl. Med., 40 (9): 1563-1569 (1999)), ^{99m}Tc\sim12-amino-3,3,9,9-tetrametil-5-oxa-4,8-diaza-2,10-dodecanodiona-dioxima (OXA) (Linder, et al., Soc. Nucl. Med., Proc. 47th Annual Meeting, 2000, 41 (5): 119P), Tc-etilendicisteína (Ilgan, et al., Cancer Biother. & Radiopharm., 13 (6): 427-435 (1998)), y ^{99m}Tc-DTPA~folato (Mathias, et al., Bioconjug. Chem., 11 (2): 253-257 (2000)) han mostrado cualidades de captación en tumores in vivo prometedoras. Sin embargo, existe una necesidad de conjugados de ^{99m}Tc a base de vitamina alternativos, o conjugados a base de vitamina que empleen otros radionúclidos, que presenten razones de tumor con respecto a tejido no diana (T/NT) óptimas y se eliminen a través de los riñones. Tales conjugados a base de vitaminas deben ser adecuados para su desarrollo clínico como agentes de formación de imágenes de tumores y para el diagnóstico de otros estados patológicos.

La invención proporciona compuestos y composiciones según las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Estructura de EC20, un compuesto a modo de ejemplo usado como agente de formación de imágenes según la invención.

Figura 2. Radiocromatograma de HPLC de ^{99m}Tc-EC20. Las muestras de ^{99m}Tc-EC20 se eluyeron isocráticamente en una columna C18 (3,9 x 150 mm) Nova-Pak de Waters usando una fase móvil acuosa que contenía metanol al 20% y ácido trifluoroacético al 0,2% a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se monitorizó el análisis por HPLC con tanto el detector UV (280 nm) como un radiodetector FC-3200 de Bioscan. Pico A,Tc libre; pico B, un quelato que contiene folato de estructura desconocida; picos C y D, diastereómeros que presentan una configuración o bien syn o bien anti del enlace tecnecio-oxígeno en el anillo quelante Dap-Asp-Cys de EC20.

Figura 3. Estructuras de los isómeros de Re-EC20 y ^{99m}Tc-EC20 (posición syn o anti del enlace metal-oxo).

Figura 4. Bloqueo de la unión de ácido ^{3}H-fólico a células KB con diversos competidores que contienen folato. Se incubaron células KB durante 15 min en hielo con ácido ^{3}H-fólico 100 nM en presencia y ausencia de concentraciones crecientes de los competidores. (\medbullet) Ácido fólico; (\blacksquare) EC20; (\ding{115}) Isómero A de EC20:Re; (\ding{116}) Isómero B de EC20:Re; (a) DTPA-folato. Las barras de error representan 1 desviación estándar (n = 3).

Figura 5. Asociación dependiente del tiempo de ^{99m}Tc-EC20. Se incubaron células KB con ^{99m}Tc-EC20 10 nM durante periodos crecientes de tiempo a 37ºC. Tras múltiples lavados, se recogieron las células y se sometieron a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1 desviación estándar (n = 3).

Figura 6. Asociación dependiente de la concentración de ^{99m}Tc-EC20. Se incubaron células KB durante 2 h a 37ºC en presencia de concentraciones crecientes de ^{99m}Tc-EC20. Tras múltiples lavados, se recogieron las células y se sometieron a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1 desviación estándar (n = 3).

Figura 7. Asociación dependiente de la concentración de ^{99m}Tc-EC20 "pico B". Se incubaron células KB durante 2 h a 37ºC en presencia de concentraciones crecientes de "pico B" que se aisló de manera cromatográfica a partir de la formulación de ^{99m}Tc-EC20. Tras múltiples lavados, se recogieron las células y se sometieron a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1 desviación estándar (n = 3). (\medbullet), Pico B; (º), Pico B más ácido fólico 1 mM.

Figura 8. Aclaramiento sanguíneo de ^{99m,}Tc-EC20 en ratones Balb/c. Cada animal recibió una dosis intravenosa de 50 \mug/kg de EC20 (67 nmol/kg) en aproximadamente 0,1 ml durante una breve anestesia con dietil éter. En los tiempos designados tras la inyección, se sacrificó cada animal mediante asfixia con CO_{2}, se extrajo sangre y se sometió a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1 desviación estándar (n = 3 animales).

Figura 9. Imágenes de rayos gamma corporales totales (vista ventral). Se obtuvieron las imágenes 4 h tras la administración intravenosa de ^{99m}Tc-EC20 a un ratón Balb/c que tenía un tumor M109 positivo para receptor de folato subcutáneo. Solamente los riñones (K) y el tumor (T) presentan acumulación significativa de este radiotrazador.

Figura 10. Estructuras de EC11, EC13, EC14, EC15, EC19, EC20, EC31 y EC53.

Figura 11. Distribución en los tejidos de ^{99m}Tc-EC20 en ratones Balb/c que tenían tumores M109 positivos para RF y tumores 4T1 negativos para RF.

Figura 12. Análisis por HPLC de EC11.

Figura 13. Análisis por espectroscopía de masas de EC11.

Figura 14. Análisis por RMN de EC11.

Figura 15. Análisis por HPLC de EC13.

Figura 16. Análisis por RMN de EC14.

Figura 17. Análisis por espectroscopía de masas de EC15.

Figura 18. Análisis por HPLC de EC19.

Figura 19. Análisis por espectroscopía de masas de EC19.

Figura 20. Análisis por HPLC de EC31.

Figura 21. Análisis por HPLC de EC53.

Figura 22. Análisis por espectroscopía de masas de EC53.

Figura 23. Análisis por espectroscopía de masas de EC53.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona compuestos y composiciones según las reivindicaciones.

Por consiguiente, se usa una vitamina, o un derivado o análogo de la misma que se une al receptor, como ligando dirigido para el agente de formación de imágenes. Puede usarse el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes para dirigir radionúclidos a células y para concentrar los radionúclidos en una población de células, tal como una población de células tumorales, para su uso en la formación de imágenes de diagnóstico.

Un ejemplo de estos compuestos es un compuesto denominado EC20 representado en la figura 1. Ejemplos de otros compuestos para su uso según esta invención son compuestos denominados EC11, EC13, EC14, EC15, EC19, EC31 y EC53 (véase la figura 10). El resto de vitamina (por ejemplo, el resto de ácido fólico en EC20) proporciona una unión de alta afinidad a los RF celulares. Los compuestos contienen también un quelante a base de péptido bifuncional, que proporciona el sitio para la quelación del radionúclido, por ejemplo, ^{99m}Tc (véase la figura 1), y los compuestos pueden, opcionalmente, contener un conector a través del cual el resto de vitamina se une covalentemente al resto quelante.

Según la invención, el resto de vitamina (V) de los compuestos es un folato que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptor in vivo, o un derivado o análogo del mismo que se une al receptor de folato, según las reivindicaciones. La vitamina se une, opcionalmente, a través de un conector (L) a la parte de quelante de los compuestos. La parte de quelante comprende un resto de ácido \alpha,\beta-diaminopropiónico unido a un grupo cisteína a través de un tercer residuo de aminoácido. La parte de quelante del compuesto está adaptada para unirse a un catión radionúclido (M) (si k=1).

Según la invención, los compuestos con radionúclido unido se denominan "conjugados de vitamina-agente de formación de imágenes".

La estructura del conector, si está presente, no es crítica para la invención. Por tanto, por ejemplo, puede ser cualquier conector divalente biocompatible. Normalmente, el conector comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 átomos de carbono, más normalmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 átomos de carbono. Normalmente se emplean conectores de menor peso molecular (es decir, aquéllos que tienen un peso molecular aproximado de aproximadamente 30 a aproximadamente 300).

El folato contiene un ácido glutámico en la configuración L unido a ácido pteroico. Tal como se muestra en la figura 1, EC20 comprende un análogo de ácido fólico unido al resto de quelante porque EC20 tiene el ácido glutámico en la configuración D. EC11 y EC14 contienen dos residuos de ácido glutámico y, por tanto, estos compuestos, por ejemplo, pueden considerarse también derivados de ácido fólico (figura 10).

Entre las vitaminas que se cree que desencadenan la endocitosis mediada por receptor están niacina, ácido pantoténico, ácido fólico, riboflavina, tiamina, biotina, vitamina B12 y las vitaminas liposolubles A, D, E y K.

Según la invención pueden usarse ácido fólico, ácido folínico, ácido pteroico, ácido pteropoliglutámico y pteridinas que se unen al receptor de folato tales como tetrahidropterinas, dihidrofolatos, tetrahidrofolatos y sus análogos desaza y didesaza. Los términos análogos "desaza" y "didesaza" se refieren a los análogos de folato reconocidos en la técnica que tienen un átomo de carbono sustituido por uno o más átomos de nitrógeno en la estructura del acido fólico que se produce de manera natural. Por ejemplo, los análogos desaza incluyen los análogos 1-desaza, 3-desaza, 5-desaza, 8-desaza y 10-desaza. Los análogos didesaza incluyen, por ejemplo, los análogos 1,5-didesaza, 5,10-didesaza, 8,10-didesaza y 5,8-didesaza. Los anteriores son derivados o análogos de folato y pueden unirse a los receptores de folato. Otros derivados o análogos de folato útiles según la invención son los análogos que se unen al receptor de folato aminopterina, ametopterina (metotrexato), N^{10}-metilfolato, 2-desamino-hidroxifolato, análogos desaza tales como 1-desazametopterina o 3-desazametopterina, y ácido 3'5'-dicloro-4-amino-4-desoxi-N^{10}-metilpteroilglutámico (diclorometotrexato).

La vitamina, o derivado o análogo de la misma, puede unirse selectivamente a la población de células que van a visualizarse debido a la expresión preferencial en las células seleccionadas como diana de un receptor de folato para el folato, o derivado o análogo, en el que el receptor es accesible para la unión. El sitio de unión para el folato puede incluir receptores para cualquier molécula de folato que puede unirse específicamente a un receptor en el que se expresa de manera única, sobreexpresa o expresa preferencialmente el receptor u otra proteína por la población de células que van a visualizarse. Una proteína presente en la superficie expresada de manera única, sobreexpresada o expresada preferencialmente por las células que van a visualizarse es un receptor no presente o presente en cantidades menores en otras células proporcionando un medio para la visualización sensible, rápida y selectiva de las células seleccionadas como diana para la formación de imágenes de diagnóstico usando los conjugados de vitamina-agente de formación de imágenes de la presente invención.

Los radionúclidos adecuados para la formación de imágenes de diagnóstico incluyen radioisótopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio, incluyendo los isótopos ^{111}In,Tc, ^{64}Cu, Cu, ^{67}Ga o ^{68}Ga. Estos radionúclidos son catiónicos y se complejan con el quelante a través del grupo quelante del conjugado para formar el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes.

Los conjugados de vitamina-agente de formación de imágenes según la invención se utilizan para visualizar de manera selectiva, usando técnicas de formación de imágenes gammagráficas, una población de células en un animal en el que la población de células expresa de manera única, sobreexpresa o expresa preferencialmente receptores para una vitamina, o derivado o análogo de la misma que se une al receptor de la vitamina. Pueden usarse los conjugados de vitamina-agente de formación de imágenes para visualizar poblaciones de células patógenas, siempre que las células expresen o sobreexpresen de manera única o preferencial receptores de vitamina o receptores que se unen a derivados o análogos de vitamina.

La invención es aplicable a poblaciones de células patógenas que provocan una variedad de patologías que incluyen cáncer y enfermedades mediadas por cualquier otro tipo de células patógenas que sobreexpresan receptores de vitamina, o receptores que pueden unirse a derivados o análogos de vitamina. Por tanto, la población de células patógenas puede ser tumorígena, incluyendo tumores benignos y tumores malignos, o puede ser no tumorígena. Si la población de células es una población de células cancerosas, las células cancerosas pueden surgir espontáneamente o mediante tales procesos como mutaciones presentes en la línea germinal del animal huésped o mutaciones somáticas, o el cáncer puede inducirse de manera química, viral o mediante radiación. La invención puede utilizarse para la formación de imágenes de diagnóstico de cánceres tales como carcinomas, sarcomas, linfomas, enfermedad de Hodgkin, melanomas, mesoteliomas, linfoma de Burkitt, carcinomas nasofaríngeos y mielomas. La población de células cancerosas puede incluir, pero no se limita a, cánceres oral, nasofaríngeo, de tiroides, endocrino, de piel, gástrico, esofágico, laríngeo, de garganta, pancreático, de colon, de vejiga, de huesos, ovárico, de cuello uterino, uterino, de mama, de testículos, de próstata, rectal, de riñón, de hígado, de pulmón y de cerebro. En realizaciones en las que la población de células es una población de células cancerosas, pueden visualizarse usando el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes células tumorales, incluyendo células de tumor primario o células que han experimentado metástasis o están en el proceso de disociarse del tumor primario.

Los conjugados de vitamina-agente de formación de imágenes de la presente invención pueden usarse para diagnosticar un estado patológico o monitorizar la progresión de una enfermedad. Por ejemplo, el método de formación de imágenes de diagnóstico según la invención puede usarse para monitorizar la progresión del cáncer en combinación con tratamientos profilácticos para prevenir la reaparición de un tumor tras su eliminación mediante cualquier enfoque terapéutico incluyendo la eliminación quirúrgica del tumor, radioterapia, quimioterapia o tratamiento biológico.

Las composiciones y los métodos de la presente invención pueden usarse para aplicaciones tanto de medicina clínica en humanos como veterinarias. Por tanto, el animal que alberga la población de células que se visualizan pueden ser un ser humano o, en el caso de aplicaciones veterinarias, puede ser un animal de laboratorio, agrícola, doméstico o salvaje. La presente invención puede aplicarse a animales incluyendo, pero sin limitarse a, seres humanos, animales de laboratorio tales como roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hámsters, etc.), conejos, monos, chimpancés, animales domésticos tales como perros, gatos y conejos, animales agrícolas tales como vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, y animales salvajes en cautividad tales como osos, pandas, leones, tigres, leopardos, elefantes, cebras, jirafas, gorilas, delfines y ballenas.

Las composiciones para formación de imágenes de diagnóstico comprenden una cantidad del conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes eficaz para visualizar las células seleccionadas como diana para la formación de imágenes de diagnóstico en un animal cuando se administra en una o más dosis. La composición de formación de imágenes de diagnóstico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes se administra preferiblemente al animal por vía parenteral, por ejemplo, por vía intradérmica, por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa o por vía intratecal. Alternativamente, la composición que contiene el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes puede administrarse al animal mediante otros procedimientos médicamente útiles, y puede usarse cualquier dosis eficaz y forma farmacéutica adecuada, incluyendo formas farmacéuticas para inhalación y orales.

Los ejemplos de formas farmacéuticas parenterales incluyen disoluciones acuosas del conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes, en solución salina isotónica, glucosa al 5% u otros vehículos líquidos farmacéuticamente aceptables bien conocidos tales como alcoholes, glicoles, ésteres y amidas líquidos. La forma farmacéutica parenteral según esta invención puede estar en forma de un liofilizado que puede reconstituirse que comprende la dosis del conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes.

La dosificación del conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes en la composición de formación de imágenes de diagnóstico puede variar de manera significativa dependiendo del tamaño del animal, la población de células seleccionadas como diana para la formación de imágenes de diagnóstico, el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes específico que está usándose y la vía de administración del conjugado. La cantidad eficaz que va a administrarse al animal se basa en el área de superficie corporal, peso y evaluación por el médico del estado del animal. Una dosis eficaz puede oscilar desde aproximadamente 1 ng/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg, más preferiblemente desde aproximadamente 100 ng/kg hasta aproximadamente 500 \mug/kg y lo más preferiblemente desde aproximadamente 100 ng/kg hasta aproximadamente 25 \mug/kg.

Puede usarse cualquier régimen eficaz para administrar la composición de formación de imágenes de diagnóstico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes. Por ejemplo, puede administrarse la composición de formación de imágenes de diagnóstico como dosis única, o puede administrarse en dosis múltiples, si es necesario, para conseguir la visualización de la población de células seleccionadas como diana. Pueden administrarse inyecciones adicionales de la composición de formación de imágenes de diagnóstico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes al animal a un intervalo de días o meses tras la(s) inyección/inyecciones inicial(es), y las inyecciones adicionales pueden se útiles para monitorizar el progreso del estado patológico. La composición de formación de imágenes de diagnóstico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes puede administrarse también en combinación con vitamina sin marcar. "En combinación con" significa que la vitamina sin marcar o bien puede administrarse conjuntamente con el agente de formación de imágenes o bien la vitamina sin marcar puede inyectarse previamente antes de la administración del agente de formación de imágenes para mejor la calidad de la imagen. Por ejemplo, el agente de formación de imágenes puede administrarse en combinación con de aproximadamente 0,5 ng/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o de aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o de aproximadamente 100 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg de la vitamina sin marcar.

La composición de formación de imágenes de diagnóstico se formula normalmente para administración parenteral y se administra al animal en una cantidad eficaz para permitir formar imágenes de la población de células seleccionadas como diana. Normalmente, la composición de formación de imágenes de diagnóstico que contiene la vitamina-agente de formación de imágenes dirigido se administra al animal, y tras un periodo de tiempo para permitir el suministro y la concentración del conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes en la población de células seleccionadas como diana, se somete al animal al procedimiento de formación de imágenes y la formación de imágenes se posibilita por el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes. Cuando se usa para monitorizar la progresión de la enfermedad o el diagnóstico, los procedimientos de formación de imágenes se llevan a cabo normalmente de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 horas tras la administración de la composición de formación de imágenes de diagnóstico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes.

Ejemplo 1 Materiales

Se compró ácido N^{10}-trifluoroacetilpteroico de Eprova AG, Schaffhausen, Suiza. Se compraron los reactivos para síntesis de péptidos de NovaBiochem y Bachem. Syncor suministró el ^{99m}Tc-pertecnetato de sodio. Se preparó [Re02(en)2]Cl según Rouschias (Rouschias, G., Chem. Rev., 74:531 (1974)). Se compraron placas de celulosa y placas de intercambio iónico de DEAE de J. T. Baker.

Ejemplo 2 Síntesis, purificación y caracterización analítica de EC20

Se preparó EC20 mediante un enfoque secuencial de soporte en polímero usando la estrategia de Fmoc (véase el esquema 1 a continuación; Fmoc = 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; Boc = terc-butiloxicarbonilo; Dap = ácido diaminopropiónico; DMF = dimetilformamida; DIPEA = diisopropiletilamina). Se sintetizó EC20 en una resina de Wang sensible a ácido cargada con Fmoc-L-Cys(Trt)-OH. Se aplicó hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (PyBOP) como reactivo activante para garantizar un acoplamiento eficaz usando equivalentes bajos de aminoácidos. Se eliminaron los grupos protectores de Fmoc tras cada etapa de acoplamiento en condiciones convencionales (piperidina al 20% en DMF). Después de la última etapa de ensamblaje, se escindió el péptido del soporte polimérico mediante tratamiento con ácido trifluoroacético al 92,5% que contenía un 2,5% de etanoditiol, un 2,5% de triisopropilsilano y un 2,5% de agua desionizada. Esta reacción también dio como resultado la eliminación simultánea de los grupos protectores de tritilo, Boc y t-Bu. Por último, se eliminó el resto de trifluoroacetilo en hidróxido de amonio acuoso dando EC20.

Se purificó el producto EC20 bruto mediante HPLC usando una columna (Waters) de 7 \mum, 30 x 300 mm Xterra RP18; fase móvil HCl (A) 32 mM, MeOH (B); condiciones de gradiente partiendo con el 99% de A y el 1% de B, y alcanzando el 89% de A y el 11% de B en 37 min mediante una velocidad de flujo de 20 ml/min. En estas condiciones, el monómero de EC20 eluyó normalmente a 14,38 min, mientras que el dímero de disulfuro de EC20 (contaminante minoritario) eluyó a 16,83 min. Todos los demás componentes mostrados en la figura 10 pueden prepararse usando un esquema de síntesis similar excepto para EC15 que se sintetiza tal como se muestra en el esquema 2 a continuación.

Se disolvieron dos miligramos de EC20 purificado mediante HPLC en 0,62 ml de D_{2}O, y se recogió un espectro de ^{1}H-RMN a 500 MHz. La tabla 1 (véase a continuación) enumera los desplazamientos químicos, las formas de señal y los valores J para todos los protones no intercambiables en la molécula de EC20.

También se analizó EC20 mediante espectrometría de masas por electrospray. Picos del ion positivo principal (m/z, intensidad relativa): 746,1, 100; 747,1, 44; 556,8, 32; 570,8, 16.

Esquema 1ª

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TABLA 1 Datos de ^{1}H-RMN para EC20

Se disolvió EC20 en D_{2}O y se recogió un espectro a 500 MHz. Los desplazamientos químicos (\delta) están en ppm. La señal para HOD a \delta = 4,80 ppm se usó como referencia, pD = 4,78; s = singlete; d = doblete; m = multiplete

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Esquema 2ª

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Ejemplo 3

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Preparación del vial de reactivo no radiactivo y de ^{99m}Tc-EC20

Se usaron kits de EC20 para la preparación de la sustancia farmacológica radiactiva de ^{99m}Tc-EC20. Cada kit contenía una mezcla liofilizada apirógena, estéril de 0,1 mg de EC20, 80 mg de \alpha-_{D}-glucoheptonato de sodio, 80 mg de cloruro de estaño (II) dihidratado, y suficiente hidróxido de sodio o ácido clorhídrico para ajustar el pH a 6,8 \pm 0,2 antes de la liofilización. Se selló el polvo liofilizado en un vial de 5 ml bajo una atmósfera de argón. Entonces se almacenaron los kits en congelación a -20ºC hasta su uso o caducidad (vida útil de almacenamiento actual es > 2 años). De manera importante, se requiere el componente cloruro de estaño (II) para reducir el ^{99m}Tc-pertecnetato añadido, mientras que el componente \alpha-_{D}-glucoheptonato es necesario para estabilizar el ^{99m}Tc reducido recientemente antes de su quelación final para dar el compuesto EC20.

Se preparó ^{99mm}Tc-EC20 tal como sigue (es decir, quelación de ^{99m}Tc para dar EC20). En primer lugar, se preparó un baño de agua en ebullición que contenía un elemento de protección de vial de plomo parcialmente sumergido. Se limpió con hisopo la parte superior del vial de EC20 con etanol al 70% para desinfectar la superficie y se colocó el vial en un recipiente de protección adecuado. Usando una jeringa protegida con aguja de calibre 27, se inyectó 1 ml de la inyección de ^{99m}Tc-pertecnetato de sodio estéril (de 15 a 20 mCi) en cloruro de sodio al 0,9%, en el vial protegido. Antes de retirar la jeringa del vial, se extrajo un volumen de gas del vial igual al volumen de pertecnetato añadido con el fin de normalizar la presión en el interior del vial. Se agitó suavemente el vial durante 30 segundos para garantizar la completa disolución del polvo liofilizado. Después, se colocó el vial en el elemento de protección de plomo que estaba situado en el baño de agua en ebullición. Se calentó la disolución durante \sim18 minutos y se enfrió entonces hasta temperatura ambiente durante un mínimo de 15 min. La disolución puede almacenarse a temperatura ambiente (15-25ºC) protegida de la luz, pero debe usarse en un plazo de 6 horas de su preparación.

Se determinó la estabilidad radioquímica de la sustancia farmacológica radiactiva mediante HPLC después de su almacenamiento a temperatura ambiente protegida de la luz durante hasta 24 horas. Se analizaron muestras de la disolución de ^{99m}Tc-EC20 (20 \mul) usando un sistema de HPLC que consistía en un detector UV 490 y sistema de suministro multisolvente 600E de Waters, un radiodetector EC-3200 de Bioscan, un software de radiocromatograma Laura v1.5, y una columna C18 (3,9 x 150 mm) Nova-Pak de Waters. Se eluyeron isocráticamente las muestras inyectadas usando una fase móvil acuosa que contenía metanol al 20% y ácido trifluoroacético al 0,1% a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se monitorizó el análisis por HPLC con tanto el detector UV (280 nm) como el radiodetector de rayos gamma. Notablemente, la pureza radioquímica de ^{99m}Tc-EC20 permaneció mayor que el 90% durante al menos 24 horas en todos los casos.

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Ejemplo 4 Determinación de la pureza radioquímica de ^{99m}Tc-EC20 mediante CCF

Las impurezas radioquímicas principales en la preparación de ^{99m}Tc-EC20 serán 1) ^{99m}Tc-pertecnetato, 2) ^{99m}Tc-glucoheptonato (precursor de intercambio de ligando), 3) ^{99m}Tc de unión no específica (^{99m}Tc unido a un sitio diferente del resto quelante Dap-Asp-Cys esperado de la molécula EC20) y 4)Tc hidrolizado. Dado que estaba sometiéndose a prueba ^{99m}Tc-EC20 para determinar su posible uso clínico, se desarrolló un método a base de tres CCF para determinar las cantidades de cada impureza y estimar la pureza radioquímica global de ^{99m}Tc-EC20.

En el primer sistema, se reveló una placa de celulosa con agua desionizada. ^{99m}Tc-EC20, ^{99m}Tc-glucoheptonato, ^{99m}Tc de unión no específica y ^{99m}Tc-pertecnetato se mueven al frente de disolvente (R_{f} = 1,0), mientras que ^{99m}Tc hidrolizado permanece en el origen (R_{f} = 0,0). Se cortó la placa de celulosa en dos fragmentos a R_{f} = 0,3 (1,5 cm del origen) y se sometió a recuento cada fragmento usando un calibrador de dosis. Se calculó el por ciento de ^{99m}Tc hidrolizado tal como sigue: A = % de hidrolizado;Tc = (\muCi en el fragmento inferior/\muCi en ambos fragmentos) x 100.

En el segundo sistema, se reveló una placa de celulosa con acetona y NaCl al 0,9% (7:3, v/v). ^{99m}Tc~pertecnetato se mueve con R_{f} = 0,9, mientras ^{99m}Tc-EC20, ^{99m}Tc-glucoheptonato, ^{99m}Tc de unión no específica y ^{99m}Tc hidrolizado permanecen en el origen (R_{f} = 0,0). Se cortó la placa de celulosa/acetona-solución salina en dos fragmentos a R_{f} = 0,6 (3,0 cm del origen) y se sometió a recuento cada fragmento usando un calibrador de dosis. Se calculó el por ciento de ^{99m}Tc-pertecnetato tal como sigue: B = % de ^{99m}Tc-pertecnetato = (\muCi en el fragmento superior/ \muCi en ambos fragmentos) x 100.

Por último, en el tercer sistema, se reveló una placa de intercambio iónico de DEAE con Na_{2}SO_{4} 0,3 M. ^{99m}Tc-glucoheptonato se mueve al frente de disolvente (R_{f} = 1,0), ^{99m}Tc de unión no específica se mueve con R_{f} = 0,6, y ^{99m}Tc\simEC20, ^{99m}Tc hidrolizado y ^{99m}Tc-pertecnetato permanecen cerca del origen (^{99m}Tc-EC20. R_{f} = 0,1; ^{99m}Tc hidrolizado: R_{f} = 0,0; ^{99m}Tc-pertecnetato: R_{f} = 0,3). Se cortó la placa de celulosa/Na_{2}SO_{4} en dos fragmentos a 2,5 cm del origen y se sometió a recuento cada fragmento usando un calibrador de dosis. Se calculó el por ciento de ^{99m}Tc-glucoheptonato y ^{99m}Tc de unión no específica tal como sigue: C = % de (^{99m}Tc-glucoheptonato + ^{99m}Tc de unión no específica) = (\muCi en el fragmento superior/ \muCi en ambos fragmentos) x 100. Se calculó entonces la pureza radioquímica global de ^{99m}Tc-EC20 tal como sigue: pureza radioquímica = 100 - (A+B+C).

Tal como se muestra en la figura 2, el análisis por HPLC de la formulación ^{99m}Tc-EC20 muestra cuatro componentes radioquímicos, denominados picos A hasta D. Se confirmó que el pico A era ^{99m}Tc libre y este subproducto está presente de manera reproducible a < 2%. El pico B, que era diferente del de ^{99m}Tc-glucoheptonato (no se muestran los datos), eluyó con un tiempo de retención de 2,8 min. Este componente representó aproximadamente el 3% de la mezcla y se creía que resultaba de la quelación de ^{99m}Tc en algún otro sitio de la molécula de EC20 además del resto Dap-Asp-Cys esperado. Los picos C y D (tiempos de retención de 4,8 minutos y 13,2 minutos, respectivamente), representan la mayoría de la actividad radioquímica formulada.

Ejemplo 5 Síntesis de Re-EC20

Se disolvieron cincuenta y dos mg (0,010 mmol) de EC20 y [ReO_{2}(en)_{2}]Cl (52 mg, 0,14 mmol) en 6 ml y 1 ml de tampón fosfato purgado con argón (0,05 M, pH 5,8), respectivamente. Se combinaron las dos disoluciones y se calentaron bajo una atmósfera de argón en un baño de agua en ebullición durante 2 horas. Se congeló y se liofilizó durante la noche la mezcla de reacción. Se purificó el producto bruto mediante HPLC (columna Xterra RP18, 19 x 150 mm, NH_{4}OAc 10 mM/CH_{3}CN, velocidad de flujo 10 ml/mm; gradiente del 1% al 8%). Se recogieron las fracciones, se liofilizaron y se almacenaron a -20ºC hasta su uso.

Puesto que no estaban disponibles instalaciones para espectros de masas para el análisis de materiales radiactivos, se analizó el análogo de renio no radiactivo, Re-EC20. Tanto renio como tecnecio son metales del grupo VIIA que tienen similitud significativa en propiedades químicas y físicas. También forman complejos similares con ligandos orgánicos. Este comportamiento químico análogo se ha usado frecuentemente en la aclaración de estructuras de nuevas clases de productos radiofarmacéuticos de tecnecio basados en análogos de renio no radiactivos. De manera interesante, el análisis por HPLC de Re-EC20 mostró también dos picos principales que eluyeron a 5 y 14,2 minutos, respectivamente, similares a los picos C y D para ^{99m}Tc-EC20 (cromatograma no mostrado). El análisis de espectros de masas confirmó que estos dos componentes eran isómeros correspondientes al complejo Re-EC20 (m/z = 945). De hecho, es probable que estas especies fueran diastereómeros que presentaban una configuración o bien syn o bien anti del enlace tecnecio-oxígeno en el anillo quelante Dap-Asp-Cys, tal como se representa en la figura 3. Puesto que i) los dos picos en el cromatograma de Re-EC20 representan complejos isoméricos, y ii) existen informen de isomerismo similar en complejos de tecnecio, es probable que los componentes C y D en el radiocromatograma de ^{99m}Tc-EC20 también sean isómeros.

Ejemplo 6 Cultivo celular

Se hicieron crecer células de manera continua como una monocapa usando medio RPMI libre de folato (FFRPMI) que contenía suero de ternero fetal inactivado por calor (HIFCS) al 10% a 37ºC en una atmósfera del 5% de CO_{2}/95% humidificada con aire sin antibióticos. El HIFCS contenía su complemento normal de folatos endógenos que permitió que las células crecieran de manera sostenida en este medio más fisiológicamente apropiado. Se realizaron todos los experimentos celulares usando FFRPMI que contenía HIFCS al 10% (FFRPMI/HIFCS) como el medio de crecimiento, excepto cuando se indica.

Ejemplo 7 Ensayo de afinidad relativa

Se determinó la afinidad relativa de diversos derivados de folato según el método descrito por Westerhoff et al. (Mol. Pharm., 48:459-471 (1995)) con una ligera modificación. En resumen, se tripsinizaron ligeramente células KB positivas para RF en tripsina al 0,25%/PBS a temperatura ambiente durante 3 minutos y se diluyeron después en FFRPMI/HIFCS. Tras una centrifugación de 800 x g durante 5 minutos y un lavado con PBS, se suspendió el sedimento de células final en FFRPMI 1640 (sin suero). Se incubaron las células durante 15 min en hielo con 100 nM de ácido ^{3}H-fólico en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de artículos de prueba que contenían folato. Se centrifugaron las células a 10.000 x g durante 5 min, se suspendieron los sedimentos de células en tampón, se transfirieron a viales individuales que contenían 5 ml del cóctel de centelleo, y se sometieron entonces a recuento para determinar la radiactividad. Los tubos de control negativo contenían solamente el ácido ^{3}H-fólico en FFRPMI (sin competidor). Los tubos de control positivo contenían una concentración final de ácido fólico 1 mM, y las CPM medidas en estas muestras (que representan la unión no específica del marcado) se restaron de todas las muestras. Notablemente, se definieron las afinidades relativas como la razón molar inversa del compuesto requerido para desplazar el 50% de ácido ^{3}H-fólico unido a RF de KB, y la afinidad relativa del acido fólico por el RF se estableció en 1.

La capacidad de EC20 para competir de manera directa con el ácido fólico para unirse a los RF de superficie celular se midió usando este ensayo. De manera importante, un valor de afinidad relativa de 1,0 implica que el ligando del artículo de prueba tiene una afinidad por el RF igual al ácido fólico. Así mismo, los valores inferiores a la unidad reflejan una afinidad más débil y los valores superiores a la unidad reflejan una afinidad más fuerte.

Se incubaron células KB cultivadas con ácido ^{3}H-fólico 100 nM en presencia de concentraciones crecientes de ácido fólico no radiactivo, EC20, renio-EC20 (isómero A; pico C), renio-EC20 (isómero B; pico 0) o un producto radiofarmacéutico a base de folato, DTPA-folato. Tras una incubación durante 15 minutos a 4ºC, se enjuagaron las células libres de material sin unir y se sometieron a recuento para determinar la radiactividad asociada a célula residual. La cantidad de radiactividad unida se representó frente a la concentración del ligando sin marcar, y se estimaron los valores de CI_{50} (concentración de ligando requerida para bloquear el 50% de unión del ácido ^{3}H-fólico). Tal como se muestra en la figura 4 y tabla 2 (a continuación), se determinó que EC20 tenía una afinidad de 0,92 en relación con la del ácido fólico por los RF humanos. Ambos isómeros de renio-EC20 mostraron valores de afinidad relativa que eran muy similares a, si no mejores que, la molécula de EC20 original (1,42 y 1,37 para el isómero A e isómero B de Re-EC20, respectivamente). DTPA-folato, un agente radiofarmacéutico de folato que quela a ^{111}In, mostró una afinidad relativa de 0,87 por el receptor de folato. Por tanto, la modificación química de folato con diversos motivos quelantes de metal no alteró la afinidad intrínseca de la vitamina por el RF.

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TABLA 2 Estimaciones de la afinidad relativa

Se definieron las afinidades relativas (AR) como la razón molar inversa de compuesto requerido para desplazar el 50% del ácido ^{3}H-fólico unido a células KB positivas para RF. La afinidad relativa del ácido fólico se estableció en 1. Se evaluó cada artículo de prueba por triplicado

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Ejemplo 8 Captación celular dependiente del tiempo

Se sembraron células KB en placas Falcon de 12 pocillos y se permitió que formaran monocapas subconfluentes durante la noche. Tras un enjuague con 1 ml de FFRPMI/HIFCS recién preparado, cada pocillo recibió 1 ml de FFRPMI/HIFCS que contenía ^{99m}Tc-EC20 10 nM. Se incubaron las células durante tiempos predeterminados a 37ºC y se enjuagaron después cuatro veces con 1 ml de PBS helado, pH 7,4. Se disolvieron las monocapas de células en 0,5 ml de PBS, pH 7,4 que contenía dodecilsulfato de sodio al 1% durante 15 min a temperatura ambiente y se sometieron a recuento entonces para determinar la radiactividad usando un contador de rayos gamma de Packard. Se cuantificó la proteína en cada muestra usando un kit de ensayo de proteína DC de BioRad, y se convirtieron los valores de proteína celular en número de células usando el factor de conversión de 2,23 x 10^{-7} mg de proteína por célula. Se expresaron los valores tabulados finales en términos de moléculas de EC20 por célula.

La cinética de captación de ^{99m}Tc-EC20 en células KB positivas para RF se midió cuantitativamente usando este protocolo. Tal como se muestra en la figura 5, se alcanzó la captación en estado estacionario en el plazo de dos horas a 37ºC, en el que aproximadamente 3,2 millones de moléculas de EC20 estaban asociadas a células, mientras que la mitad de la asociación celular máxima se produjo 9 minutos tras el mezclado de 10 nM de este producto radiofarmacéutico con las células. De manera interesante, se alcanzó la mitad del punto de saturación máximo en sólo 37 segundos cuando se incubaron las células con una concentración 10 veces mayor de ^{99m}Tc-EC20 (100 nM; datos no mostrados).

Ejemplo 9 Captación celular dependiente de la concentración

Se sembraron células KB en placas Falcon de 12 pocillos y se permitió que formaran monocapas subconfluentes durante la noche. Tras un enjuague con 1 ml de FFRPMI/HIFCS fresco, cada pocillo recibió 1 ml de FFRPMI/HIFCS que contenía concentraciones crecientes de ^{99m}Tc-EC20. Se incubaron las células durante 2 horas a 37ºC y se enjuagaron después cuatro veces con 1 ml de PBS helado, pH 7,4. Se disolvieron las monocapas en 0,5 ml de PBS, pH 7,4 que contenía dodecilsulfato de sodio al 1% durante 15 min a temperatura ambiente y se sometieron a recuento entonces para determinar la radiactividad usando un contador de rayos gamma de Packard. Se determinó el contenido en proteína tal como se describió anteriormente, y se expresaron los valores tabulados finales en términos de moléculas de EC20 por célula.

Tal como se muestra en la figura 6, se encontró que la captación celular de ^{99m}Tc-EC20 dependía de la concentración extracelular. Se determinó que las células KB particulares usadas se unían a un máximo de cuatro millones de moléculas del producto radiofarmacéutico de folato por célula. El análisis de Scatchard de los datos estimó que la K_{D} de unión era 3,2 nM, un valor comparable con la K_{D} observada para la unión de la vitamina folato a estas mismas células.

Aunque no se estableció la identidad completa del componente del pico B, el análisis de absorción UV indicó que contenía un resto de folato (es decir, el espectro de absorción contenía el pico de absorción secundario distintivo de folato a 363 nm). Se recogió este material radiomarcado purificado mediante HPLC (material del pico B) y se añadió entonces a células KB cultivadas. Tal como se muestra en la figura 7, también se encontró que la captación celular del componente del pico B marcado con ^{99m}Tc era dependiente de la concentración extracelular. El análisis de Scatchard de los datos estimó que la K_{D} de unión era 1,1 nM. De manera interesante, la asociación celular del pico B se bloqueó completamente en presencia de ácido fólico en exceso, indicando que este subproducto de formulación minoritario también puede seleccionar como diana células positivas para RF para fines radiodiagnósticos.

Ejemplo 10 Aclaramiento sanguíneo

Se mantuvieron los animales usados para este estudio con una dieta libre de folato (Harlan n.º TD-90261) durante aproximadamente tres semanas antes de la administración de la dosis. La aclimatación a esta dieta especial es esencial porque las dietas para roedores habituales contienen grandes cantidades de ácido fólico (6 mg/kg de comida) y promueven altos niveles de folato sérico en ratones. Además, estudios anteriores han demostrado que ratones colocados en una dieta libre de folato durante 3 semanas habían mantenido un nivel de folato sérico seguro de 25 \pm 7 nM, que es ligeramente superior a la concentración de 9-14 nM medible en el suero humano.

Se preparó la disolución de ^{99m}Tc-EC20 el día de su uso y contenía inicialmente 100 \mug de EC20 por mililitro. Se diluyó adicionalmente la disolución con solución salina estéril para preparar las disoluciones madres de trabajo. Se estimó que la pureza radioquímica del producto era \sim94% mediante CCF. Cada animal recibió una dosis de 50 \mug/kg de EC20 (67 nmol/kg) en un volumen i.v. de aproximadamente 0,1 ml por medio de la vena de la cola durante una breve anestesia con dietil éter. A los tiempos designados (véase la figura 8) tras la inyección, se sacrificó cada animal mediante asfixia con CO_{2}, y se extrajo inmediatamente sangre mediante punción cardiaca.

Tal como se muestra en la figura 8, se eliminó rápidamente ^{99m}Tc-EC20 de la circulación en el ratón Balb/c. Se estimó que la semivida plasmática de este producto radiofarmacéutico era \sim4 minutos, y menos del 0,2% de la dosis de ^{99m}Tc-EC20 inyectada permaneció en la circulación después de cuatro horas (suponiendo que la sangre representa el 5,5% de la masa corporal total). Estos datos indican que los conjugados de folato se eliminan rápidamente de la circulación tras la administración intravenosa, y que pueden obtenerse datos de biodistribución tisular valiosos después de sólo unas pocas horas tras la inyección sin la preocupación de captación tisular no específica debido a la radiactividad transmitida por la sangre.

Ejemplo 11 Estudios de distribución tisular

Se evaluó la capacidad de ^{99m}Tc-EC20 para seleccionar como diana tumores in vivo usando un modelo M109 positivo para RF. Estas células tumorales son singénicas para el ratón Balb/c y forman de manera reproducible tumores sólidos subcutáneos en el plazo de dos semanas tras la inoculación. También se evaluaron en este bioensayo ^{99m}Tc-EC14, que es estructuralmente similar a ^{99m}Tc-EC20 excepto porque contiene un residuo de _{D}-Glu adicional (es decir, Pte-_{D}-Glu-_{D}-Glu-\betaDpr-Asp-Cys), ^{99m}Tc-EC28 (un control que no contiene pteroato que consiste en benzoil-_{D}-Glu-_{n}-
Glu-\betaDpr-Asp-Cys) y el producto radiofarmacéutico de ^{111}In-DTPA-folato notificado anteriormente. De manera importante, el agente de control ^{99m}Tc-EC28 no se unirá a los RF de la superficie celular porque carece de un resto de anillo de pteridina esencial.

Se compraron ratones (raza Balb/c) de cuatro a cinco semanas de edad de Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianápolis, IN) y se mantuvieron con una dieta libre de folato durante un total de tres semanas antes del experimento. Se inocularon células tumorales M109 positivas para RF, singénicas (1 x 10^{6} por animal) en el tejido subcutáneo de la axila derecha dos semanas antes del experimento. Todos los ratones eran hembras, y los pesos de los tumores fueron de 54,2 \pm 29,8 mg el día del experimento. Se preparó una disolución madre de ^{99m}Tc-EC20 que contenía 100 \mug del agente por mililitro el día de su uso, y su pureza radioquímica fue > 96%. También se prepararon los dos agentes quelantes de ^{99m}Tc adicionales, ^{99m}Tc-EC14 y ^{99m}Tc-EC28, así como ^{111}In-DTPA-folato hasta una pureza radioquímica > 90%. Se diluyeron todas la disoluciones con o bien solución salina sola o bien una solución salina que contenía 100 equivalentes de ácido fólico (para competencia) de manera que la concentración del producto radiofarmacéutico final era de 10 \mumol/ml.

Los animales recibieron una dosis i.v. de aproximadamente 40 \mumol/kg del artículo de prueba en un volumen de 100 \mul por medio de una vena lateral de la cola durante una breve anestesia con dietil éter. Cuatro horas tras la inyección, se sacrificaron los animales mediante asfixia con CO_{2} y se diseccionaron. Se retiraron los tejidos seleccionados, se pesaron y se sometieron a recuento para determinar la distribución de ^{99m}Tc. Se corrigieron por la degradación los valores de CPM y se tabularon los resultados como el % de dosis inyectada por gramo de peso húmedo de tejido.

Tal como se muestra en la tabla 3 (a continuación), los tres productos radiofarmacéuticos que contenían "folato", ^{99m}Tc-EC14, ^{99m}Tc-EC20 y ^{111}In-DTPA-folato, se acumularon de manera predominante en los riñones y el tumor positivo para RF, sin embargo, los riñones concentraron un porcentaje superior de dosis inyectada por gramo de tejido (% de DI/g) que el tumor. De manera interesante, la acumulación neta del tumor de ^{111}In-DTPA-folato y ^{99m}Tc-EC20 fue casi la misma (19 y 17% de DI/g, respectivamente), mientras que la captación del tumor de ^{99m}Tc-EC14 fue algo menos de ~10% de DI/g. No obstante, los tres agentes mostraron altas razones de tumor con respecto a sangre
(de > 30 a 1).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Biodistribución de productos radiofarmacéuticos de folato en ratones Balb/c que tienen tumores M109 subcutáneos

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Se demostró además la dirección específica a folato mediante dos métodos distintos. En primer lugar, se bloqueó de manera eficaz (> 94%) la acumulación de ^{99m}Tc-EC14, ^{99m}Tc-EC20 y ^{111}In-DTPA-folato en los riñones y el tumor positivo para RF cuando se administraron conjuntamente estos agentes con un exceso de 100 veces de ácido fólico. En segundo lugar, el agente de control ^{99m}Tc-EC28 no se acumuló de manera apreciable en los riñones y el tumor. Ambas observaciones muestran que se requiere un resto "similar a folato" (o pteroato) intacto para proporcionar la captación dirigida y la retención de estos agentes radiofarmacéuticos en los tejidos positivos para RF.

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Ejemplo 12 Gammagrafía

Se inocularon células tumorales M109 (1 x 10^{6} por animal) en el tejido subcutáneo de la axila derecha de ratones Balb/c dos semanas antes del experimento. Los animales recibieron una dosis i.v. de aproximadamente 50 \mumol/kg del artículo de prueba en un volumen de 100 \mul por medio de una vena lateral de la cola durante una breve anestesia con dietil éter. Cuatro horas tras la inyección, se sacrificaron los animales mediante asfixia con CO_{2} y se colocaron después en la parte superior de una superficie de adquisición de imágenes. Se realizó la adquisición de imágenes del organismo completo durante 1 minuto y a una tasa de recuento de 50-75.000 recuentos por minuto usando una cámara para rayos gamma radioisótopos 410 Sigma 500 de Technicare Omega. Se analizaron todos los datos usando un ordenador basado en MS-DOS de Medasys equipado con software Pinnacle de Medasys.

Se demostró la captación de ^{99m}Tc-EC20 mediante los riñones y los tumores M109 positivos para RF usando este protocolo de gammagrafía. Tal como se muestra en la figura 9, una imagen ventral de un ratón al que se le inyectó ^{99m}Tc-EC20 tal como se describió anteriormente localiza la radiación gamma en los dos riñones (K) y la masa tumoral M109 (T; región de hombro). No se observó ningún radiotrazador apreciable en otros tejidos corporales. Se ha notificado un perfil de imagen similar para el producto radiofarmacéutico ^{111}In-DTPA-folato.

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Ejemplo 13 Excreción urinaria y metabolismo

Se obtuvo el perfil de especiación por HPLC urinario de ^{99m}Tc-EC20 usando ratones Balb/c. Se les inyectó a los ratones (cada uno de \sim20 g) 1 mCi (6,7 nmol) de ^{99m}Tc-EC20 por medio de una vena lateral de la cola. Tras un periodo de tiempo de 1, 4 ó 6 horas, se sacrificaron grupos de dos ratones mediante asfixia con CO_{2} y se recogió la orina. Tras la filtración a través de un filtro Millex GV13, se evaluó la especiación radioquímica usando un sistema de HPLC equipado con una columna C18, de 3,9 x 150 mm, Nova-Pak y un detector radioquímico. Se eluyó isocráticamente el sistema con metanol al 20% que contenía TFA al 0,1% a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto.

Se determinó previamente que la vía de eliminación principal para ^{111}In-DTPA-folato era por medio de la orina. De manera similar al perfil de HPLC mostrado en la figura 2, tanto el patrón de ^{99m}Tc-EC20 como las muestras de orina presentaron cuatro picos radiactivos. Tal como se muestra en la tabla 4 (a continuación), la pureza radioquímica del patrón (suma de los picos C y D presumiblemente correspondientes a ^{99m}Tc-EC20 syn y anti) permaneció constante a ~93% durante las 6 horas de duración de este experimento. La cantidad de ^{99m}Tc libre en el patrón (pico A) era \sim2%. De manera importante, se cree que el pico B dentro de este perfil radioquímico es EC20 quelado con ^{99m}Tc en una posición menos estable, no convencional, sin embargo, no se incluyó la radiactividad medida en esta fracción en la estimación de la pureza radioquímica global para ^{99m}Tc-EC20. Estos datos indican en conjunto que la formulación permaneció estable en solución salina a largo de estas 6 horas de investigación.

Después de 1 y 4 horas tras la inyección en ratones Balc/C, no cambió el perfil de especiación radioquímica de ^{99m}Tc-EC20 en la orina del ratón. Sin embargo, la radiactividad presente en la orina 6 horas tras la inyección era demasiado baja para someterse a ensayo de manera precisa mediante HPLC. La proporción de fármaco original entre las especies radiactivas recuperadas en la orina permaneció relativamente constante a aproximadamente el 90% durante las cuatro horas durante las cuales podía cuantificarse. Este valor es muy similar a la pureza del 93% del patrón indicando que ^{99m}Tc-EC20 se excreta predominantemente en la orina en forma no modificada.

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TABLA 4 Excreción y metabolismo de ^{99m}Tc-EC20 del ratón Balb/c

Se les inyectó a los ratones 1 mCi (6,7 nmol) de ^{99m}Tc-EC20 por medio de una vena lateral de la cola. A los tiempos indicados, se sacrificaron grupos de dos ratones y se recogió la orina. Se determinó entonces la especiación radioquímica mediante HPLC. Se usa la suma del porcentaje de área de los picos C y D (isómeros syn y anti) para calcular la pureza global de ^{99m}Tc-EC20 intacto

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Ejemplo 14 Unión a proteína sérica

Se usaron suero de rata nuevo y suero humano de hombre comercial (donantes tipo AB, Sigma Chemical Co.) para evaluar la unión in vitro de ^{99m}Tc-EC20 a proteínas séricas. Un minuto después de que se mezclara ^{99m}Tc-EC20 con 1 ml de suero a temperatura ambiente, se transfirieron 0,3 ml de la disolución de suero a un dispositivo de ultrafiltración Centrifree® de Amicon limpio (30.000 NMWL) por triplicado. En el plazo de un minuto de haber cargado la centrífuga con la disolución de suero, se centrifugó el dispositivo a 1000 x g durante 20 minutos a 20ºC. Se transfirieron 50 \mul de muestras de la disolución original, y del filtrado de cada dispositivo, a un tubo limpio y se sometió a recuento en un contador de rayos gamma automático. Se ultrafiltró una disolución control de ^{99m}Tc-EC20 mezclada con 1 ml de solución salina normal de manera idéntica. Se calculó el porcentaje de ^{99m}Tc libre para cada una de las tres
muestras.

Aunque, ^{99m}Tc-EC20 presentaba sólo un nivel minoritario de unión no específica al dispositivo de ultrafiltración (\sim5%), se encontró que aproximadamente el 70% de éste se asociaba predominantemente con la fracción de proteína sérica de > 30 KDa en disoluciones de suero de rata o humano (69% y 72%, respectivamente). De manera importante, dado que ^{99m}Tc-EC20 se acumula de manera preferente y eficaz dentro de los tejidos positivos para RF (véanse la tabla 2 y la figura 8), su evidente afinidad por las proteínas séricas no parece afectar a esta capacidad de radiotrazador para dirigirse a los RF in vivo.

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Ejemplo 15 Estudios de distribución tisular

Los protocolos usados en este ejemplo son similares a aquéllos descritos en el ejemplo 11. Se evaluó además la capacidad de ^{99m}Tc-EC20 para seleccionar como diana tumores in vivo usando modelos tumorales 4T1 negativo para RF y M109 positivo para RF. Se compraron ratones Balb/c hembra de seis semanas de edad (n = 3/grupo de dosis) de Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianápolis, IN) y se mantuvieron con una dieta libre de folato (Harlan TEKLAD) durante un total de siete días antes de la inoculación de células tumorales.

Se inocularon por vía subcutánea células 4T1 negativas para RF (5 x 10^{5} P_{0} por animal) o células tumorales M109 positivas para RF (2 x 10^{6} P_{0} por animal), singénicas en 100 \mul de RPMI-1640 libre de folato que contenía suero de ratón singénico al 1%. Se preparó una disolución madre de ^{99m}Tc-EC20 que contenía 100 \mug de agente por mililitro el día de su uso tal como se describió anteriormente.

Dieciséis días después de la inoculación de las células tumorales, se les inyectaron por vía intravenosa a los animales 500 ó 1800 nmoles/kg de EC20 para los animales que tenían tumor M109 y 500 nmoles/kg de EC20 para los animales que tenían tumor 4T1 (3 ratones por grupo de dosis). Todas las inyecciones fueron en volúmenes de 100 \mul. Cuatro horas tras la inyección, se sacrificaron los animales mediante asfixia con CO_{2}, y se extrajo sangre mediante punción cardiaca y se diseccionaron los animales. Se retiraron los tejidos seleccionados (corazón, pulmones, hígado, bazo, riñón, intestinos, estómago, músculo y tumor), se pesaron y se sometieron a recuento en un contador de rayos gamma automático para determinar la distribución de ^{99m}Tc. Se calculó la captación del producto radiofarmacéutico en términos de porcentaje de dosis inyectada de peso húmedo de tejido (% de DI/g) con referencia a patrones preparados a partir de diluciones de la preparación inyectada.

Tal como se muestra en la figura 11, se demostró la selección específica del receptor de folato porque ^{99m}Tc-EC20 se acumuló predominantemente en los riñones y los tumores M109 positivos para RF, y no en los tumores 4T1 negativos para RF. La captación en los tumores 4T1 negativos para RF fue 7,6 veces menor que en los tumores M109 positivos para RF. La captación de ^{99m}Tc-EC20 en los tejidos normales, excepto en el riñón como se esperaba, fue baja. Estos resultados muestran que la selección de ^{99m}Tc-EC20 es específica para RF.

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Ejemplo 16 Estudios de distribución tisular

Los protocolos usados en este ejemplo son similares a aquéllos descritos en el ejemplo 11. Se evaluó la capacidad de ^{99m}Tc-EC11 (péptido-A_{1}), ^{99m}Tc-EC13 (péptido-A_{3}) y ^{99m}Tc-EC14 (péptido-A_{2}) para dirigirse a tumores in vivo usando el modelo tumoral KB positivo para RF. Se mantuvieron ratones desnudos macho de cuatro semanas de edad (n = 4/grupo) con una dieta libre de folato durante un total de diez días antes de la inoculación de células tumorales.

Se inocularon por vía subcutánea células tumorales KB positivas para RF (0,25 x 10^{6} por animal) en la región intracapsular. Catorce días después de la inoculación de las células tumorales, se les inyectó por vía intravenosa a los animales (n = 4/grupo) ^{99m}Tc-EC11, ^{99m}Tc-EC13 o ^{99m}Tc-EC14 a las dosis (aproximadamente 12 \mug/kg) de los conjugados mostrados en la tabla 5 a continuación. Se prepararon disoluciones madre de las disoluciones de ^{99m}Tc-EC11, ^{99m}Tc-EC13 y ^{99m}Tc-EC14 el día de su uso tal como se describió anteriormente. Se administró de manera conjunta aproximadamente un exceso de 20 veces de folato libre (aproximadamente 200 \mug/kg) a animales control (n = 4/grupo). Cuatro horas tras la inyección, se sacrificaron los animales mediante asfixia con CO_{2}, y se extrajo sangre mediante punción cardiaca y se diseccionaron los animales. Se retiraron los tejidos seleccionados, se pesaron y se sometieron a recuento en un contador de rayos gamma automático para determinar la distribución de ^{99m}Tc. Se calculó la captación del producto radiofarmacéutico en términos de porcentaje de dosis inyectada de peso húmedo de tejido (% de DI/g) con referencia a patrones preparados a partir de diluciones de la preparación inyectada.

Tal como se muestra en la tabla 5, se demostró la selección específica del receptor de folato porque se acumularon predominantemente ^{99m}Tc-EC11, ^{99m}Tc-EC13 y ^{99m}Tc-EC14 en los riñones y los tumores KB positivos para RF. Se bloqueó la acumulación mediante administración conjunta de folato libre. Estos resultados muestran que ^{99m}Tc-EC11, ^{99m}Tc-EC13 y ^{99m}Tc-EC14 pueden dirigirse a tumores in vivo de manera específica para RF.

Se obtuvieron resultados similares (véase la tabla 6 a continuación) con ^{99m}Tc-EC53 (el enantiómero D total de EC20) usando protocolos similares excepto que la dosis de ^{99m}Tc-EC53 era aproximadamente 50 \mug/kg y se usó EC53 frío o aproximadamente un exceso de 100 veces de folato libre. Tal como se muestra en la tabla 6, se demostró la selección específica del receptor de folato porque se acumuló predominantemente ^{99m}Tc-EC53 en los riñones y los tumores KB positivos para RF. Se bloqueó la acumulación mediante administración conjunta de folato libre. Estos resultados muestran que ^{99m}Tc-EC53 puede dirigirse a tumores in vivo de manera específica para RF.

TABLA 5

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TABLA 6

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Discusión

La invención proporciona un conjugado de una vitamina y un quelante de radionúclido para su desarrollo clínico como agente de formación de imágenes. Un ejemplo de un agente de formación de imágenes de este tipo es el quelante de radionúclido a base de folato recientemente diseñado, sintetizado y caracterizado radioquímicamente, ^{99m}Tc-EC20.

^{99m}Tc-EC20, un derivado peptídico de pequeño peso molecular de folato que contiene un enlace peptídico _{D}-\gamma-Glu (véase la figura 1), se sintetizó usando un procedimiento sintético en fase sólida eficaz. En su forma natural, el folato (o pteroil-glutamato) tiene un solo residuo de glutamilo presente en una configuración L. Sin embargo, un residuo de enantiómero _{D}-Glu se incorporó en la molécula de EC20. De manera importante, similar a EC20, la sustitución del residuo de _{L}-Glu en el ácido fólico por un residuo de _{D}-Glu no altera a la capacidad del ácido fólico para unirse al RF de alta afinidad.

Se encontró que EC20 quela eficazmente a ^{99m}Tc cuando está en presencia de \alpha-D-glucoheptonato y cloruro de estaño (II). Cuando se analizó mediante HPLC radioquímica, > 95% de la formulación de ^{99m}Tc-EC20 resultante consistía en una mezcla de estereoisómeros syn y anti, cada uno podía por igual unirse al RF con alta afinidad (véase la figura 3). Aproximadamente el 3% del ^{99m}Tc en la formulación estaba quelado a EC20 en algún otro sitio de la molécula de EC20 que en el resto de Dap-Asp-Cys esperado. Aunque no se aisló este componente en una cantidad suficiente para su caracterización óptima, se demostró que se unía al RF con alta afinidad (véase la figura 6). Por último, el 2% restante de la radiactividad en la formulación de ^{99m}Tc-EC20 se atribuyó a ^{99m}Tc libre.

^{99m}Tc-EC20 demostró asociación dependiente tanto del tiempo como de la concentración con células positivas para RF. ^{99m}Tc-EC20 se aclaró rápidamente de la sangre (t_{1/2} \sim4 min), lo cual es importante para los agentes de formación de imágenes de diagnóstico, y el ^{99m}Tc-EC20 se acumuló preferentemente en grandes cantidades dentro de los tumores positivos para RF.

El rendimiento de ^{99m}Tc-EC20 se comparó directamente con aquél de un agente dirigido a RF similar, ^{111}In-DTPA-folato, usando dos métodos diferentes. En primer lugar, se encontró que ambos productos radiofarmacéuticos a base de folato competían por igual con el ácido fólico para unirse a los RF de KB (véanse la figura 3 y la tabla 1). En segundo lugar, la biodistribución de cada agente en ratones que tenían tumores era casi idéntica (véase la tabla 2). Se midieron la alta captación en el tumor y las razones de tumor con respecto a sangre para ^{99m}Tc-EC20. En su conjunto, estos resultados sugieren que al igual que ^{111}In-DTPA-folato, ^{99m}Tc-EC20 se localizará eficazmente en los tumores positivos para RF cuando se administre clínicamente a pacientes.

Se han descrito anteriormente varios conjugados de ^{999m}Tc a base de folato. Datos de biodistribución limitados están disponibles para un conjugado de folato de ^{99m}Tc-12-amino-3,3,9,9-tetrametil-5-oxa-4,8-diaza-2,10-dodecanodiona-dioxima (OXA), sin embargo, se notificaron niveles moderados (\sim7% de DI/g) de captación de trazador en un tumor KB. También, se notificaron estudios que implicaban la biodistribución de un conjugado de ^{99m}Tc-etilenodicisteína-folato en ratas que tenían tumores de mama. Las ratas en aquel estudio se alimentaron con una dieta rica en folato. Por tanto, se obtuvieron una baja captación en el tumor y bajas razones de tumor con respecto a sangre. Por último, se demostró que un derivado de folato de ^{99m}Tc-6-hidrazinonicotinamido-hidrazido (HYNIC) (HYNIC-folato) se acumulaba en grandes cantidades dentro de tumores 24JK-FBP. De manera interesante, ^{99m}Tc-EC20 se acumuló dentro de tumores M 109 a niveles casi idénticos a los de HYNIC-folato en tumores 24JK-FBP (\sim17% de DI/g)(tabla 2). Estos dos agentes mostraron también razones de tumor con respecto a sangre de aproximadamente 50:1 4 horas tras la inyección intravenosa.

En resumen, se creó un nuevo derivado peptídico de folato para quelar eficazmente a ^{99m}Tc. Este nuevo compuesto, ^{99m}Tc-EC20, se une con avidez a células tumorales positivas para RF in vitro e in vivo. Se encontró que EC20 se unía a células tumorales positivas para receptor de folato (RF) cultivadas de manera dependiente tanto del tiempo como de la concentración con muy alta afinidad (K_{D} \sim3 nM). Usando un ensayo de afinidad relativa in vitro, se encontró también que EC20 competía eficazmente con el ácido ^{3}H-fólico para su unión a células cuando se presentaba o bien solo o bien como quelato de metal formulado. Tras la inyección intravenosa en ratones Balb/c, se eliminó rápidamente ^{99m}Tc-EC20 de la circulación (t_{1/2} plasmática \sim4 min) y se excretó en la orina en forma no metabolizada. Los datos de estudios de biodistribución cuantitativa y gammagráficos realizados en ratones Balb/c que tenían tumores M109 confirmaron que ^{99m}Tc-EC20 se acumula predominantemente en tejidos de riñón y tumorales positivos para RF. Estos resultados muestran que ^{99m}Tc-EC20 es un agente de formación de imágenes de radiodiagnóstico no invasivo, eficaz, para la detección de tumores positivos para RF. También se demostró que otros agentes de formación de imágenes relacionados con EC20 eran eficaces, incluyendo EC11, EC13, EC14 y EC53.

Cada año, se diagnostica a \sim26.000 mujeres en los Estados Unidos cáncer ovárico, y menos del 50% de esas mujeres sobreviven más de cinco años. Una de los motivos para la baja tasa de supervivencia es la dificultad en diagnosticar esta forma de cáncer. Debido al miedo de romper una masa abdominal no identificada y el potencial para diseminar el cáncer por toda la cavidad abdominal, no se realiza con frecuencia la biopsia con aguja fina. En vez de esto, el diagnóstico y la determinación del estadio de masas ováricas sospechosas se hace normalmente a través de laparotomía quirúrgica, que es un procedimiento costoso e invasivo. Dado que ^{99m}Tc-EC20 se une estrechamente al RF presente en grandes cantidades en cánceres ováricos (entre otros), este producto radiofarmacéutico proporciona un método barato, no invasivo pero fiable para el diagnóstico temprano de cáncer ovárico maligno. De manera importante, Tc-EC20 puede ayudar también a guiar el proceso de decisión clínica haciendo posible un diagnóstico precoz y más definitivo de la enfermedad residual o recurrente.

Claims (15)

1. Compuesto de fórmula

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en la que V es un folato, en la que el folato se une a un receptor de folato, y en la que el folato es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptor in vivo, o un derivado o análogo del mismo, en la que el análogo se selecciona de análogos desaza y didesaza de ácido fólico, ácido folínico, ácido pteroico, ácido pteropoliglutámico y pteridinas que se unen al receptor de folato, o de aminopterina, ametopterina (metotrexato), N^{10}-metilfolato, 2-desamino-hidroxifolato, análogos desaza y ácido 3'5'-dicloro-4-amino-4-desoxi-N^{10}-metilpteroilglutámico (diclorometotrexato), en la que el derivado o análogo se une al receptor de folato y es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptor in vivo;

L es un conector divalente;

R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H_{2}NCHRCOOH;

M es un catión de un radionúclido;

n es 1 ó 0; y

k es 1 ó 0,

con la condición de que (i) si k = 0, el compuesto no es el compuesto EC20:

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y si dicho k = 1 y dicho compuesto es EC20, M no es ^{99m}Tc.

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que el radionúclido se selecciona del grupo que consiste en isótopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.

3. Compuesto según la reivindicación 2, en el que el radionúclido es un isótopo de tecnecio.

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4. Composición para formar imágenes de diagnóstico que comprende un compuesto de fórmula

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en la que V es un folato, en la que el folato se une a un receptor de folato, y en la que el folato es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptor in vivo, o un derivado o análogo del mismo, en la que el análogo se selecciona de análogos desaza y didesaza de ácido fólico, ácido folínico, ácido pteroico, ácido pteropoliglutámico y pteridinas que se unen al receptor de folato, o de aminopterina, ametopterina (metotrexato), N^{10}-metilfolato, 2-desamino-hidroxifolato, análogos desaza y ácido 3'5'-dicloro-4-amino-4-desoxi-N^{10}-metilpteroilglutámico (diclorometotrexato), en la que el derivado o análogo se une al receptor de folato y es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptor in vivo;

L es un conector divalente;

R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H_{2}NCHRCOOH;

M es un catión de un radionúclido;

n es 1 ó 0; y

un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo;

con la condición de que si el compuesto es el compuesto EC20:

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M no es ^{99m}Tc.

5. Composición según la reivindicación 4, en la que el radionúclido en el compuesto se selecciona del grupo que consiste en isótopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.

6. Composición según la reivindicación 5, en la que el radionúclido en el compuesto es un isótopo de tecnecio.

7. Composición según la reivindicación 4 adaptada para administración parenteral.

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8. Composición que comprende un compuesto de fórmula

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en la que V es el folato, o un derivado o análogo del mismo, en la que el derivado o análogo del mismo, en la que el análogo se selecciona de los análogos desaza y didesaza de ácido fólico, ácido folínico, ácido pteroico, ácido pteropoliglutámico y pteridinas que se unen al receptor de folato, o de aminopterina, ametopterina (metotrexato), N^{10}-metilfolato, 2-desamino-hidroxifolato, análogos desaza y ácido 3'5'-dicloro-4-amino-4-desoxi-N^{10}-metilpteroilglutámico (diclorometotrexato), se une al receptor de folato;

L es un conector divalente;

R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H_{2}NCHRCOOH;

M es un catión de un radionúclido;

n = 1 ó 0; y

un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo; para su uso en la formación de imágenes de una población de células en un animal en el que dichas células se caracterizan por un receptor de folato en la superficie de dichas células y la monitorización de la biodistribución de dicho compuesto en el animal, en el que el folato, derivado o análogo es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptor in vivo;

con la condición de que si el compuesto es el compuesto EC20:

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M no es ^{99m}Tc.

9. Composición según la reivindicación 8, en la que el radionúclido en el compuesto se selecciona del grupo que consiste en isótopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.

10. Composición según la reivindicación 9, en la que el radionúclido en el compuesto es un isótopo de tecnecio.

11. Composición según la reivindicación 8, en la que la composición se administra por vía parenteral al paciente.

12. Compuesto o composición según cualquier reivindicación anterior, en el que V se selecciona de ácido fólico, ácido folínico, ácido pteroico, ácido pteropoliglutámico y pteridinas que se unen al receptor.

13. Compuesto o composición según las reivindicaciones 1-11, en el que el análogo desaza es 1-desazametopterina o 3-desazametopterina.

14. Composición que comprende un liofilizado que puede reconstituirse de un compuesto de fórmula:

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en combinación con cloruro de estaño (II) y \alpha_{D}-glucoheptonato de sodio.

15. Composición según la reivindicación 14, en la que el compuesto EC20 está quelado a ^{99m}Tc.