ES2335018T3 - Mamifero no humano transgenico para la region constante de la cadena pesada de las inmunoglobulinas humanas de clase a y sus aplicaciones. - Google Patents
Mamifero no humano transgenico para la region constante de la cadena pesada de las inmunoglobulinas humanas de clase a y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Mamífero no humano transgénico, caracterizado por que comprende un locus IgH modificado mediante sustitución de la secuencia de conmutación Sμ por todo o parte de un transgén constituido por el gen Cα de una inmunoglobulina humana de clase A que incluye al menos el exón que codifica el dominio CH3 y el exón de membrana.
Description
Mamífero no humano transgénico para la región
constante de la cadena pesada de las inmunoglobulinas humanas de
clase A y sus aplicaciones.
La presente invención se refiere a un mamífero
no humano transgénico para la región constante de la cadena pesada
de las inmunoglobulinas humanas de clase A y a sus aplicaciones para
la producción de anticuerpos humanizados de clase IgA.
Las inmunoglobulinas A (IgA) comprenden dos
cadenas pesadas idénticas, de isotipo \alpha1 (subclase IgA1) o
\alpha2 (subclase IgA2) en el ser humano, asociadas por medio de
puentes disulfuro, a dos cadenas ligeras idénticas de isotipo kappa
(\kappa) o lambda (\lambda).
La cadena pesada \alpha, que es específica de
esta clase de inmunoglobulinas, existe en forma membranaria y en
forma secretada. La forma secretada comprende cuatro dominios de
aproximadamente 110 aminoácidos: un dominio variable VH tres
dominios constantes CH1, CH2 y CH3, así como una región bisagra (H)
entre CH2 y CH3 y un octapéptido C-terminal. La
cisteína penúltima de este octapéptido puede formar un enlace
covalente con la cadena J (o pieza de unión) que sirve para asociar
dos cadenas pesadas de IgA para formar IgA diméricas. La forma
membranaria comprende además un dominio hidrófobo que permite el
anclaje de la proteína en la membrana, así como un dominio
intracitoplasmático. La región de la cadena pesada correspondiente a
los dominios CH1, CH2, H, CH3 asociados, al octapéptido
C-terminal (forma secretada) o al dominio hidrófobo
e intracitoplasmático (forma membranaria), se denomina región
constante en oposición a la región correspondiente al dominio
variable VH, que se denomina región variable.
Las cadenas ligeras \kappa y \lambda, que
son comunes al conjunto de las clases y subclases de
inmunoglobulinas, comprenden dos dominios: un dominio variable (VL)
y un dominio constante (CL). En el ser humano, la expresión de las
cadenas \kappa y \lambda es equivalente, mientras que en ratón
la expresión del locus \lambda es muy reducida de modo que el 95%
de las cadenas ligeras son de tipo \kappa. La región de la cadena
ligera correspondiente al dominio CL se denomina región constante
en oposición a la región correspondiente al dominio variable VL,
que se denomina región variable.
Los genes de las inmunoglobulinas se organizan
en loci, un locus para las cadenas pesadas (locus IgH) y un locus
para cada una de las cadenas ligeras (locus lambda y kappa).
Los loci de las cadenas ligeras comprenden cada
uno genes V y J que codifican el dominio variable y genes C que
codifican el dominio constante; durante la diferenciación de los
linfocitos B, un gen V se reorganiza con un gen J y un gen C, y la
región V sufre además mutaciones somáticas que permiten producir
anticuerpos de gran afinidad por el antígeno.
El locus de las cadenas pesadas comprende genes
V, D y J que codifican el dominio variable y genes C (C\mu,
C\delta, C\gamma, C\varepsilon y C\alpha) que codifican los
dominios constantes de los isotipos de las diferentes clases de
inmunoglobulinas; cada gen C, excepto C\delta, viene precedido por
una secuencia de conmutación o switch (S). Los genes
C\alpha (C\alpha1 y C\alpha2 en el ser humano) contienen
intrones que separan los exones que codifican los dominios
constantes CH1, CH2 y CH3 y el exón de membrana (mb); la secuencia
que codifica la región bisagra está incluida en el exón CH2. Durante
la diferenciación de los linfocitos B, un gen V se reorganiza con
un gen D y un gen J, y la región V también sufre mutaciones
somáticas que permiten producir anticuerpos de gran afinidad por el
antígeno. Además, mientras que la respuesta primaria al antígeno
está constituida principalmente por IgM, la respuesta secundaria se
asocia al mecanismo de conmutación de clase durante el cual la
secuencia de conmutación S\mu, situada cadena arriba de C\mu
recombina con otra secuencia de conmutación conduciendo de este
modo la producción de otra clase de inmunoglobulina (IgG, IgE o
IgA).
El locus de las cadenas pesadas de
inmunoglobulinas comprende también secuencias reguladoras en 5'
(promotor pVH y activador intrónico E\mu) y en 3' (activadores de
transcripción C\alpha3'/hs3 inverso (hs3a),
\alpha3'E/hs1-2, hs3 (hs3b) y hs4). Se ha
demostrado que la deleción de los dos últimos activadores en 3'
(hs3b y hs4) reducía severamente la transcripción de la línea
germinal y la conmutación de clase hacia la mayor parte de los
isotipos de inmunoglobulinas y también podría afectar a la
expresión del gen \mu en las células B en reposo (Pinaud et
al., Immunity, 2001, 15, 187-199). Además, las
secuencias reguladoras 5' y 3' del locus de las cadenas pesadas de
ratón se utilizaron para construir un vector de expresión que
comprende una casete que permite una expresión estable y eficaz de
un transgén, particularmente un ADNc que codifica una cadena ligera
de inmunoglobulina humana en las líneas de células B de ratón que
tienen insertada esta casete de expresión en su genoma (Chauveau
et al., Gene, 1998. 222, 279-285).
El locus de las cadenas pesadas de
inmunoglobulina también puede modificarse mediante recombinación
homóloga, particularmente para producir inmunoglobulinas
monoclonales de ratón a partir de hibridomas cuyo locus IgH se ha
modificado con ayuda de un vector de sustitución universal que
comprende regiones de homologías 5' y 3' constituidas
respectivamente por el segmento JH-S\mu y un
fragmento de ADN en 3' del gen C\alpha (Ronai et al.,
Journal of Immunological Methods, 2003, 275,
191-202).
La diversidad de los anticuerpos producidos en
respuesta a la estimulación con un antígeno procede de la
combinación de varios mecanismos: la multiplicidad de los genes V,
la mutación somática de estos genes V, la recombinación somática de
los genes V y la recombinación somática de las secuencias de
conmutación.
Las IgA existen en el organismo en dos formas
diferentes: una IgA sérica y una IgA secretora
(s-IgA).
La IgA sérica representa del 15 al 20% de las
inmunoglobulinas séricas; más del 80% de la IgA sérica humana está
en forma de monómero, mientras que en la mayor parte de las demás
especies de mamíferos, ésta está esencialmente en forma de
dímero.
La IgA secretora constituye la principal
inmunoglobulina de las secreciones (oculares, salivales, mamarias,
traqueobronquiales y urogenitales), donde existe en forma de un
dímero de IgA asociado a otra proteína, el componente secretor, que
está probablemente enrolado alrededor del dímero de IgA y unido
mediante puentes disulfuro al dominio CH2 de cada monómero de IgA.
Al contrario que la cadena J, la pieza secretora no es sintetizada
por los plasmocitos sino por las células epiteliales. La IgA
dimérica secretada por los plasmocitos
sub-epiteliales se une a los receptores
poli-Ig presentes en el polo basal de las células
epiteliales. El complejo s-IgA/receptor es entonces
incluido por endocitosis y transportado a través de la célula al
tiempo que permanece fijado a la membrana de las vesículas de
transporte. Éstas se fusionan con la membrana plasmática en la
superficie luminal y liberan la IgA dimérica asociada a la pieza
secretora que proviene de la escisión del receptor. De este modo,
la pieza secretora facilita el transporte de las IgA en las
secreciones y las protege de la proteolisis.
Debido a su capacidad para atravesar el epitelio
de las mucosas y para impedir la entrada de patógenos como los
virus, bacterias, parásitos y toxinas, las IgA juegan un papel
fundamental en la inmunidad local: ocular, respiratoria, digestiva
y urogenital. El modo de acción de las IgA engloba mecanismos
activos (activación del complemento, unión al receptor Fc) y
pasivos (bloqueo de los receptores de los patógenos (virus) e
inhibición de la motilidad de las bacterias). Se ha demostrado una
correlación estrecha entre una respuesta de IgA específica y la
protección contra una infección, particularmente por virus
(rotavirus, virus de la gripe, poliovirus, citomegalovirus, virus
respiratorio sincitial, virus Epstein-Barr). Se han
aislado anticuerpos protectores de clase IgA dirigidos contra
numerosos patógenos humanos (VIH, virus de la gripe A, bacterias,
toxinas, parásitos).
Debido a esta propiedad particular, las IgA
tienen aplicaciones específicas para el diagnóstico y el tratamiento
de enfermedades infecciosas y de cáncer. Éstas podrían utilizarse
en inmunoterapia pasiva para neutralizar patógenos (seroterapia).
También podrían utilizarse en inmunoterapia activa (vacunación) como
vector para fijar como objetivo antígenos de tumores o de
microorganismos patógenos en las mucosas, para inducir una inmunidad
local específica de estos antígenos. Además, son útiles como
reactivo fiable, seguro, estable y bien definido para el
diagnóstico de enfermedades como la enfermedad celiaca, en
sustitución de las IgA humanas (IgA
anti-transglutaminasa,
anti-endomisio, anti-gliadina)
procedentes de los pacientes, que exponen a los manipuladores a
riesgos de transmisión de patógenos humanos (virus, priones).
Sin embargo, el desarrollo de estas aplicaciones
es limitado debido a que no existe ningún método eficaz de
producción de anticuerpos recombinantes humanos o humanizados, de
clase IgA.
Se entiende por anticuerpo humanizado, un
anticuerpo derivado de un mamífero no humano mediante fusión de los
dominios constantes de las cadenas pesadas y ligeras de un
anticuerpo humano con los dominios variables de las cadenas pesadas
y ligeras de un anticuerpo de un mamífero no humano.
En efecto, los métodos de producción de
anticuerpos recombinantes humanos o humanizados actualmente
disponibles presentan los siguientes inconvenientes:
* los métodos in vitro se basan en la
expresión simultánea, a partir de uno o más vectores recombinantes,
de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, de una cadena J, y
eventualmente de una pieza secretora; las cadenas pesadas y ligeras
comprenden los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras
(VH y VL) de un anticuerpo monoclonal humano o murino de interés,
fusionados respectivamente a los dominios constantes CH1, CH2 y CH3
de una cadena pesada \alpha, y C\lambda o C\kappa de una
cadena ligera humana, o bien los dominios VH y VL se fusionan a un
dominio CH3 que incluye el octapéptido C-terminal
(Solicitudes Internacionales PCT WO 98/30577 y PCT WO 99/54484).
Por ejemplo, la Solicitud Internacional PCT WO 98/30577 describe la
producción in vitro con ayuda de uno o más baculovirus
recombinantes, de mini-IgA diméricas
(IgA-J) recombinantes humanas que comprenden los
dominios VH y VL de un anticuerpo monoclonal murino o humano, cada
uno fusionado a un dominio CH3 que incluye el octapéptido
C-terminal, asociados por medio de una cadena J; se
describe una sola mini-IgA recombinante dirigida
contra la gp120 del VIH, obtenida a partir de un anticuerpo
monoclonal humano neutralizante de clase IgG1 (anticuerpos
S1-1).
Estos métodos, que son específicos de las IgA,
están limitados a los anticuerpos murinos y a algunos raros
anticuerpos humanos para los que se han aislados hibridomas.
* los métodos in vivo se basan en la
producción de inmunoglobulinas monoclonales humanas a partir de
ratones modificados genéticamente que poseen un transgén
constituido por:
- -
- el locus IgH completo y el locus de la cadena ligera kappa y eventualmente el locus de la cadena lambda humana, en su configuración germinal, (Solicitud PCT WO 02/059154, Mendez et al., Nature Genetics, 1997, 15, 146-156; Green y Jakobovits, J. Exp. Med., 1998, 188, 483-495 y Solicitud de Patente de Estados Unidos US Nº 08/759.620; Magadan et al., Biotechniques, 2002, 33, 680-690),
- -
- un mini-locus IgH que comprende uno o más genes VH, DH y JH, el gen C\mu y un segundo gen de la región constante, preferiblemente de la región C\gamma y el locus de la cadena ligera kappa (Solicitud PCT WO 02/059154, Patente de Estados Unidos US 5.545.807), y
- -
- el locus IgH completo y el locus de la cadena lambda en su configuración germinal (Solicitud de Patente de Estados Unidos US Nº 09/734.613). Dichos ratones están eventualmente genéticamente invalidados por el locus kappa endógeno (ratón \kappa -/-) y poseen eventualmente una mutación que inactiva el locus IgH endógeno (mutación \muMT -/-).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos métodos no permiten producir grandes
cantidades de inmunoglobulinas humanas de clase IgA.
De manera sorprendente, los Inventores han
construido líneas de ratones transgénicos que producen grandes
cantidades de inmunoglobulinas humanizadas de clase IgA (del orden
del gramo por litro en el ratón). Los anticuerpos producidos por
estos animales son principalmente IgA humanizadas; estos no
contienen IgM y solamente cantidades muy reducidas de las otras
clases de inmunoglobulinas (IgG e IgE).
Por consiguiente, la invención se refiere a un
mamífero no humano transgénico, caracterizado por que
comprende un locus IgH modificado mediante sustitución de la
secuencia de conmutación S\mu por todo o parte de un transgén
constituido por el gen C\alpha de una inmunoglobulina humana de
clase A, que incluye al menos el exón que codifica el dominio CH3 y
el exón de membrana.
De acuerdo con la invención, el transgén
C\alpha o la parte de este transgén que incluye al menos el exón
que codifica el dominio CH3 y el exón de membrana, que se inserta en
lugar de la secuencia de conmutación S\mu está, por lo tanto,
situado entre el activador intrónico E\mu, en 5' y el gen C\mu
en 3' (figura 1).
En esta construcción, la supresión de la
secuencia de conmutación S\mu asociada a la inserción del transgén
C\alpha en lugar de esta secuencia, suprime la expresión del gen
endógeno responsable de la síntesis de cadenas pesadas de IgM.
Además, la de los otros genes de cadenas pesadas de inmunoglobulinas
se reduce fuertemente debido al bloqueo de la conmutación de clase
hacia los genes constantes de inmunoglobulinas situadas cadena
abajo de C\mu en el locus IgH endógeno. De este modo, los animales
transgénicos obtenidos producen grandes cantidades de IgA
quiméricas cuyo dominio constante de la cadena pesada está
humanizado y cuyos dominios variables son de origen murino.
La cadena pesada transgénica \alpha humana se
beneficia de un repertorio totalmente diversificado ya que
corresponde al repertorio normal generado por las reorganizaciones
de los segmentos VH, D y JH del locus IgH murino. Además, los
animales transgénicos son capaces de producir anticuerpos de gran
afinidad en respuesta secundaria al antígeno, debido a que sus
linfocitos B pueden reclutar el fenómeno de hipermutación
somática.
De acuerdo con una realización ventajosa de la
invención, dicho mamífero no humano transgénico es homocigótico
para dicho locus IgH modificado.
De acuerdo con otra realización ventajosa de la
invención, dicho locus IgH se modifica mediante sustitución de la
secuencia de conmutación S\mu por la totalidad del gen C\alpha,
que incluye los exones CH1, CH2, CH3 y mb, separados por los
intrones correspondientes.
De acuerdo con otra realización ventajosa de la
invención, dicho locus IgH se modifica mediante sustitución de la
secuencia de conmutación S\mu, por el segmento del gen C\alpha
que incluye el exón que codifica el dominio CH3 y el exón de
membrana.
De acuerdo con otra realización ventajosa de la
invención, dicho gen C\alpha es C\alpha1.
De acuerdo con otra realización ventajosa más de
la invención, dicho mamífero no humano transgénico comprende otro
transgén que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina
humana.
De acuerdo con una disposición ventajosa de esta
realización, dicha cadena ligera es una cadena kappa.
Preferiblemente, dicho transgén es un gen kappa
humano que comprende el activador intrónico E\mu, cadena arriba y
el palíndromo hs3a/hs1,2/hs3b, cadena abajo. Estas
secuencias, que se describen en el documento Chauveau et
al., Gene, 1998, 222, 279-285, permiten obtener
una fuerte expresión de la cadena kappa humana en las células B e
inducir la hipermutación somática del transgén kappa humano.
Preferiblemente, dicho transgén está bajo el control del promotor
de la cadena pesada humana (pVH).
De acuerdo con otra disposición ventajosa de
esta realización, dicho mamífero no humano transgénico es dicigótico
para dicho transgén.
De acuerdo con una disposición ventajosa de las
anteriores realizaciones de la invención, dichos mamíferos no
humanos transgénicos que comprenden otro transgén que codifica una
cadena ligera kappa humana poseen un locus endógeno de la cadena
ligera kappa de inmunoglobulinas inactivado (delecionado o mutado),
particularmente por recombinación homóloga. Preferiblemente, dichos
mamíferos no humanos transgénicos son homocigóticos para dicha
inactivación; preferiblemente se trata de ratones transgénicos.
Entre los mamíferos no humanos transgénicos cuyo locus endógeno de
la cadena ligera kappa de inmunoglobulina ha sido inactivado por
recombinación homóloga, puede mencionarse particularmente la línea
de ratón descrita en el documento Zou et al., EMBO J., 1993,
12, 811-820.
Dichos mamíferos no humanos transgénicos
producen IgA humanizadas de las que la casi totalidad de las cadena
ligeras son de origen humano.
De acuerdo con otra disposición ventajosa de las
anteriores realizaciones de la invención, dichos mamíferos no
humanos transgénicos para la cadena pesada \alpha1 y eventualmente
para la cadena ligera kappa humana poseen un locus endógeno de la
cadena J inactivado (delecionado o mutado), particularmente por
recombinación homóloga. Preferiblemente, dichos mamíferos no
humanos transgénicos son homocigóticos para dicha inactivación;
preferiblemente comprenden otro transgén que codifica una cadena J
humana, aún más preferiblemente se trata de ratones transgénicos.
Dichos mamíferos no humanos transgénicos son humanizados al mismo
tiempo para la producción de IgA y para una proteína que se asocia
a las IgA, la cadena J.
La invención engloba los animales transgénicos
de cualquier especie de mamífero.
De acuerdo con otra realización ventajosa de la
invención, dicho mamífero no humano transgénico es un ratón
transgénico.
La invención engloba particularmente una línea
de ratón doble-transgénico, denominada línea HAMIGA
por "Humanized Antibodies Made Up Of Monoclonal Immunoglobulin
A", que comprende:
- -
- un locus IgH modificado mediante sustitución de la secuencia de conmutación S\mu por el gen C\alpha1 de una inmunoglobulina humana de clase A, y
- -
- un gen V\kappa completo que comprende el gen V\kappa reorganizado con un gen J\kappa5, el intrón J\kappa-C\kappa y el gen C\kappa, bajo el control transcripcional del promotor de la cadena pesada humana (pVH), del activador intrónico E\mu cadena arriba, y del palíndromo hs3a/hs1,2/hs3b cadena abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales de esta línea
doble-transgénica producen IgA parcialmente
humanizadas para la cadena pesada y totalmente humanizadas en lo
que respecta a la cadena ligera.
En efecto, la expresión de la cadena kappa
transgénica en esta línea es capaz de acarrear la exclusión alélica,
es decir de impedir, en la mayor parte de las células B
transgénicas, la expresión de los genes endógenos de cadenas
ligeras de inmunoglobulinas murinas.
El repertorio de respuesta a los antígenos de
esta línea de ratón es normal dado que es esencialmente el dominio
VH de la cadena pesada el que contribuye a la formación del sitio de
anticuerpo. Ahora bien, la cadena pesada transgénica \alpha
humana se beneficia de un repertorio totalmente diversificado ya que
corresponde al repertorio normal generado por las reorganizaciones
de los segmentos VH, D y JH del locus IgH murino, como se ha
precisado anteriormente.
Además, los ratones de esta línea transgénica
son capaces de producir anticuerpos de gran afinidad en respuesta
secundaria al antígeno, debido a que sus linfocitos B pueden
reclutar el fenómeno de hipermutación somática, al mismo tiempo a
nivel del gen de la cadena pesada y del transgén de cadena ligera
kappa.
Los animales transgénicos de acuerdo con la
invención se obtienen mediante los procedimientos convencionales de
transgénesis animal, de acuerdo con los protocolos convencionales
tales como los descritos en el documento Transgenic Mouse: Methods
and Protocols; Methods in Molecular Biology, Clifton, N.J, Volumen.
209, octubre de 2002. Editado por: Marten H. Hojker, Jan Van
Deursen, Martern H. Hojker y Jan Van Deursen. Publicado por Holly T.
Sklar: Humana Press.
Las secuencias de los genes humanos y murinos de
inmunoglobulinas que sirven para la construcción de los animales
transgénicos de acuerdo con la invención son conocidas y están
accesibles en las bases de datos. Por ejemplo, la secuencia de los
exones CH1, CH2 y CH3 y del exón de membrana del gen C\alpha1
humano corresponden respectivamente a los números de entrada J00220
y M60326 en la base de datos Genbank/EMBL.
La construcción del gen V\kappa es tal como se
describe en el documento Chauveau et al., Gene, 1998, 222,
279-285; la secuencia del gen V\kappaI
reorganizado con el gen J\kappa5 y el gen C\kappa corresponde a
la secuencia que presenta el número de entrada X64133 en la base de
datos EMBL/Genbank, que codifica una cadena ligera humana que
presenta la secuencia correspondiente al número de entrada CAA45494
en la base de datos EMBL.
Las inserciones de fragmentos génicos en el
genoma de los mamíferos no humanos pueden realizarse de forma
aleatoria, preferiblemente se realizan de forma dirigida, por
recombinación homóloga con un vector de direccionamiento apropiado
que comprende eventualmente secuencias de recombinación de una
recombinasa específica de sitio, como los sitios LoxP de la
recombinasa Cre. Las inactivaciones o deleciones de fragmentos
génicos en el genoma de los mamíferos no humanos se realizan por
recombinación homóloga con un vector de direccionamiento apropiado
que comprende eventualmente secuencias de recombinación de una
recombinasa específica de sitio, como los sitios LoxP de la
recombinasa. Los animales doble-transgénicos se
obtienen mediante cruzamiento de animales transgénicos para la
cadena pesada alfa con animales transgénicos para la cadena ligera,
tal como se han definido anteriormente. Los animales
doble-transgénicos se cruzan eventualmente con
animales transgénicos cuyo locus endógeno de la cadena ligera kappa
de inmunoglobulinas se ha inactivado por recombinación homóloga y/o
con animales cuyo locus endógeno de la cadena J de inmunoglobulinas
se ha inactivado y que poseen además un transgén J humano, tal como
se han definido anteriormente.
La presente invención también se refiere a un
vector de direccionamiento de recombinación homóloga,
caracterizado por que comprende el gen C\alpha de una
inmunoglobulina humana de clase A o un segmento de este gen que
incluye al menos el exón que codifica el dominio CH3 y el exón de
membrana, flanqueado por fragmentos de secuencias del locus IgH de
un mamífero no humano que son adyacentes a la secuencia S\mu.
De acuerdo con una realización ventajosa de
dicho vector de direccionamiento, éste comprende una casete de
expresión de un marcador de selección apropiado, adyacente a dicho
gen C\alpha o al segmento de dicho gen tal como se ha definido
anteriormente.
De acuerdo con una disposición ventajosa de esta
realización, dicha casete de expresión está flanqueada por
secuencias de recombinación específica de sitio. Preferiblemente,
dichas secuencias son las secuencias LoxP de la recombinasa Cre.
Esta disposición permite eventualmente retirar dicha casete de
expresión.
De acuerdo con otra realización de dicho vector
de direccionamiento, dichos fragmentos de secuencias que son
adyacentes a la secuencia S\mu son de origen murino.
De acuerdo con otra realización de dicho vector
de direccionamiento, el gen C\alpha o el segmento de dicho gen
está flanqueado en 5' por un fragmento de aproximadamente 5 kb
correspondiente a la región JH/E\mu y en 3' por un fragmento de
aproximadamente 5 kb correspondiente a la región C\mu,
correspondiendo dichos fragmentos respectivamente a las posiciones
131281 a 136441 y 140101 a 145032 en la secuencia del cromosoma 12
murino (número de entrada AC073553 en la base de datos
EMBL/Genbank).
La presente invención también se refiere a
células embrionarias de un mamífero no humano, modificadas con un
vector de direccionamiento tal como se ha definido
anteriormente.
Dichas células embrionarias (células madre
totipotentes) modificadas son útiles para la obtención de los
mamíferos transgénicos tal como se han definido anteriormente;
éstas se inyectan en blastocistos de mamífero, de acuerdo con
técnicas convencionales de transgénesis animal.
La presente invención también se refiere a la
utilización de un mamífero no humano transgénico tal como se ha
definido anteriormente para la producción de anticuerpos humanizados
de clase IgA o de fragmentos de estos anticuerpos.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento de preparación de anticuerpos humanizados de clase
IgA o de fragmentos de estos anticuerpos, caracterizado por
que comprende al menos las siguientes etapas:
- -
- la inmunización de un mamífero no humano transgénico tal como se ha definido anteriormente con un antígeno de interés,
- -
- la obtención, mediante cualquier medio apropiado, de anticuerpos humanizados de clase IgA o de fragmentos de estos anticuerpos, a partir del suero, de las secreciones o de los linfocitos B de dicho mamífero no humano transgénico, previamente sacrificado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los mamíferos no humanos transgénicos de acuerdo
con la invención presentan la ventaja de permitir la producción de
anticuerpos monoclonales de clase IgA que son, de entrada,
anticuerpos quiméricos humanizados de clase IgA. El procedimiento
de producción de anticuerpos monoclonales humanizados de clase IgA
de acuerdo con la invención es, por lo tanto, más sencillo, más
rápido y más económico que los procedimientos de la técnica
anterior ya que no necesita etapas adicionales de clonación de los
genes de dichos anticuerpos y de fusión de los dominios variables
de dichos anticuerpos con los dominios constantes de
inmunoglobulinas humanas.
La invención engloba la producción de
anticuerpos policlonales o monoclonales constituidos por IgA
monoméricas, diméricas y s-IgA, así como de sus
fragmentos, particularmente los fragmentos Fab, Fab'2 y Fc.
Los anticuerpos humanizados de clase IgA tal
como se han definido anteriormente y sus fragmentos se preparan
mediante las técnicas convencionales conocidas por el especialista
en la técnica, tales como las descritas en el documento Antibodies:
A Laboratory Manual, E. Howell and D Lane, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988.
\newpage
De manera más precisa:
- -
- los anticuerpos policlonales se preparan mediante inmunización de un mamífero no humano transgénico tal como se ha definido anteriormente, con un antígeno de interés, eventualmente acoplado a KLH o a albúmina y/o asociado a un adyuvante apropiado tal como el adyuvante de Freund (completo o incompleto) o hidróxido de alúmina; después de la obtención de un valor cuantitativo de anticuerpos satisfactorio, los anticuerpos se recogen mediante extracción del suero de los animales inmunizados y enriquecidos en IgA mediante precipitación, de acuerdo con técnicas convencionales, y después las IgA específicas se purifican eventualmente mediante cromatografía de afinidad en una columna apropiada en la que está fijado el antígeno tal como se ha definido anteriormente, para obtener una preparación de IgA monoespecíficas.
- -
- los anticuerpos monoclonales se producen a partir de hibridomas obtenidos mediante fusión de linfocitos B de un mamífero no humano transgénico tal como se ha definido anteriormente con mielomas, de acuerdo con la técnica de Kôhler y Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497); los hibridomas se cultivan in vitro, particularmente en fermentadores o se producen in vivo, en forma de ascitis; como alternativa, dichos anticuerpos monoclonales se producen mediante ingeniería genética como se describe en la Patente de Estados Unidos US 4.816.567. Por ejemplo, mamíferos no humanos transgénicos tales como se han definido anteriormente se inmunizan fuerte y repetidamente con antígenos seleccionados (antígenos de bacterias, de virus, de hongos, antígenos específicos de tumores tales como el antígeno carcino-embrionario, etc.), de acuerdo con un protocolo convencional que comprende una primera inmunización mediante inyección intraperitoneal del antígeno en un volumen equivalente de adyuvante completo de Freund y después una segunda inmunización (de recuerdo) 15 días más tarde en condiciones idénticas pero esta vez con adyuvante incompleto de Freund. Los anticuerpos monoclonales se producen de acuerdo con un protocolo convencional que comprende el sacrificio de los animales dos semanas después de la primera dosis de recuerdo, la extracción del bazo, la suspensión de los linfocitos esplénicos y la fusión de estos linfocitos con la línea celular SP2/0 (esta línea murina no produce ningún anticuerpo murino, esta inmortalizada, y posee toda la maquinaria de secreción necesaria para la secreción de inmunoglobulinas).
- -
- los fragmentos de anticuerpos se producen a partir de las regiones V_{H} y V_{L} clonadas, a partir de los ARNm de hibridomas o de linfocitos esplénicos de un mamífero no humano transgénico de acuerdo con la invención, inmunizado; por ejemplo, los fragmentos Fv o Fab se expresan en la superficie de fagos filamentosos de acuerdo con la técnica de Winter y Milstein (Nature, 1991, 349, 293-299); después de varias etapas de selección, los fragmentos de anticuerpos específicos del antígeno se aíslan y se expresan en un sistema de expresión apropiado, mediante las técnicas convencionales de clonación y de expresión da ADN recombinante.
Los anticuerpos o sus fragmentos tal como se han
definido anteriormente, se purifican mediante las técnicas
convencionales conocidas por el especialista en la técnica, tales
como la cromatografía de afinidad.
La presente invención también se refiere a un
anticuerpo humanizado de clase IgA que puede obtenerse mediante el
procedimiento tal como se ha definido anteriormente,
caracterizado por que comprende una cadena pesada quimérica
cuyo(s) dominio(s) constante(s) son de origen
humano y una cadena ligera humana cuyo dominio variable es
codificado por V\kappaI-J\kappa5.
La invención engloba los anticuerpos humanizados
de clase IgA cuya cadena ligera es codificada por el gen
V\kappaI-J\kappa5 que presenta la secuencia
EMBL/Genbank X64133 o una secuencia producida por hipermutación de
esta secuencia, particularmente después de la activación de los
linfocitos B en presencia del antígeno.
La presente invención también se refiere a un
fragmento de un anticuerpo humanizado de clase IgA que puede
obtenerse mediante el procedimiento tal como se ha definido
anteriormente, caracterizado por que comprende un fragmento
de dichas cadenas pesadas y ligeras tal como se han definido
anteriormente.
La invención engloba los anticuerpos
policlonales, los anticuerpos monoclonales así como sus fragmentos
(Fab, Fc, Fab'2).
Los anticuerpos humanizados de acuerdo con la
invención y sus fragmentos tal como se han definido anteriormente,
son bien tolerados por el ser humano (minimización del riesgo de
reacción alérgica mediante inmunización
inter-específica) y poseen una
semi-vida prolongada en el ser humano, dado que la
región constante de la cadena pesada y la totalidad de la cadena
ligera de estos anticuerpos son de origen humano.
La presente invención también se refiere a un
medicamento que comprende un anticuerpo humanizado de clase IgA o
un fragmento de este anticuerpo, tal como se han definido
anteriormente; dicho anticuerpo o su fragmento se utiliza
particularmente en inmunoterapia pasiva (seroterapia) para la
prevención y el tratamiento de una enfermedad infecciosa o de
cáncer.
La presente invención también se refiere a una
composición inmunógena o de vacuna, caracterizada por que
comprende al menos un anticuerpo humanizado de clase IgA o un
fragmento de este anticuerpo, tal como se han definido
anteriormente, asociado a un antígeno, preferiblemente en forma de
un complejo antígeno-anticuerpo que comprende un
anticuerpo humanizado de clase IgA o un fragmento de este
anticuerpo dirigido contra dicho antígeno; dicha
composición permite al mismo tiempo dirigir el antígeno hacia el epitelio de las mucosas y protegerlo de la proteolisis.
composición permite al mismo tiempo dirigir el antígeno hacia el epitelio de las mucosas y protegerlo de la proteolisis.
La presente invención también se refiere a una
composición farmacéutica, caracterizada por que comprende al
menos un anticuerpo humanizado de clase IgA o un fragmento de este
anticuerpo, tal como se han definido anteriormente, asociado
mediante cualquier medio apropiado a un principio activo; dicha
composición permite al mismo tiempo dirigir el principio activo
hacia el epitelio de las mucosas y protegerlo de la proteolisis.
De acuerdo con una realización ventajosa de las
composiciones de acuerdo con la invención, éstas contienen además,
al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable y eventualmente
sustancias portadoras y/o adyuvantes.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables, las
sustancias portadoras y los adyuvantes son aquellos utilizados
convencionalmente.
Los adyuvantes se seleccionan ventajosamente
entre el grupo constituido por emulsiones oleosas, saponina,
sustancias minerales, extractos bacterianos, hidróxido de alúmina y
escualeno.
Las sustancias portadoras se seleccionan
ventajosamente entre el grupo constituido por liposomas
unilamelares, liposomas multilamelares, micelas de saponina o
microesferas sólidas de naturaleza sacarídica o aurífera.
Las composiciones de acuerdo con la invención,
se administran por vía general (oral, intramuscular, subcutánea,
intraperitoneal o intravenosa) o por vía local (ocular, nasal,
vaginal, rectal); la dosis y el ritmo de administración varían en
función de la especie (humano o animal) y de la enfermedad a
tratar.
La presente invención también se refiere a un
reactivo de diagnóstico que comprende un anticuerpo humanizado de
clase IgA o un fragmento de este anticuerpo, tal como se han
definido anteriormente.
La presente invención también se refiere a la
utilización de un anticuerpo humanizado de clase IgA o un fragmento
de este anticuerpo, tal como se han definido anteriormente, para la
preparación de un medicamento para la prevención y el tratamiento
de enfermedades infecciosas y de cáncer.
La presente invención también se refiere a la
utilización de un anticuerpo humanizado de clase IgA o un fragmento
de este anticuerpo, tal como se han definido anteriormente, para la
preparación de un reactivo para el diagnóstico de enfermedades
infecciosas y de cáncer.
Además de las disposiciones anteriores, la
invención también comprende otras disposiciones que se apreciarán a
partir de la siguiente descripción, que se refiere a ejemplos de
obtención y de utilización de los mamíferos no humanos transgénicos
de acuerdo con la presente invención así como a los dibujos
adjuntos, en los que:
- la figura 1 ilustra la estructura del locus
IgH modificado obtenido por recombinación homóloga entre el locus
IgH murino y el vector de direccionamiento denominado
p-alfa1KI, que comprende: un fragmento de 5,5 kb
del gen alfa 1 humano que incluye tres exones que codifican los
dominios constantes CH1, CH2 y CH3 y el exón de membrana (mb) y una
casete neo bordeada por sitios LoxP (fragmento de 1,6 kb),
flanqueados cadena arriba por un fragmento de aproximadamente 5 kb
correspondiente a la región JH-E\mu (fragmento DQ
52/JH) y cadena abajo por otro fragmento de aproximadamente 5 kb
correspondiente al gen C\mu (fragmento C\mu).
- la figura 2 ilustra la estructura detallada
del vector de direccionamiento denominado p-alfa1KI,
que comprende: un fragmento de 5,5 kb del gen alfa 1 humano que
incluye tres exones que codifican los dominios constantes CH1, CH2
y CH3 y el exón de membrana (mb) y una casete neo bordeada por
sitios LoxP (fragmento de 1,6 kb), flanqueados cadena arriba por un
fragmento de aproximadamente 5 kb correspondiente a la región
JH-E\mu (fragmento DQ 52/JH) y cadena abajo por
otro fragmento de aproximadamente 5 kb correspondiente al gen C\mu
(fragmento C\mu).
- la figura 3 ilustra la confirmación de la
secuencia del vector de direccionamiento p-alfa1KI
mediante restricción enzimática con Xho I. \lambdaH3: marcador de
peso molecular. Pistas 3 y 4: clones que comprenden la casete neo
insertada en la orientación correcta; se detectan 5 fragmentos de
los cuales 2 migran conjuntamente (5 kb y 5,3 kb): 6,4 kb
(fragmento CH2 + CH3 de \alpha1-casete neo), 5 kb
(fragmento C\mu), 5,3 kb (fragmento JH + fragmento CH1 de
\alpha1) y 3,7 kb (fragmento plasmídico + fragmento 5' DQ52).
Pista 5: clon que comprende la casete neo insertada en orientación
inversa; se detectan 4 fragmentos: 9,5 kb (fragmento
JH-fragmento CH2 + CH3 de
\alpha1-casete neo), 5 kb (fragmento C\mu), 3,7
kb (fragmento plasmídico + fragmento 5' DQ52) y 2,4 kb (fragmento
CH1 de \alpha1 + casete neo).
- la figura 4 ilustra el perfil en transferencia
de Southern de un alelo recombinante, en comparación con un alelo
silvestre; el ADN genómico digerido con Eco RI hibrida con una sonda
situada en posición 5' del gen \delta.
- la figura 5 ilustra el análisis mediante
transferencia de Southern del ADN genómico de los clones ES
transfectados con el vector de direccionamiento
p-alfa1KI; el ADN genómico digerido con Eco RI se
hibrida con una sonda correspondiente a la región 5' del gen
\delta. La flecha indica un clon que tiene integrado el transgén
\alpha1 humano por recombinación homóloga (fragmento de 7,5 kb
correspondiente al alelo recombinante y fragmento de 12 kb
correspondiente al alelo silvestre).
- la figura 6 ilustra el análisis por citometría
de flujo de la expresión de un receptor de membrana de la clase de
las IgA humanas en la superficie de los linfocitos periféricos de
los animales homocigóticos de la línea transgénica alfa1KI. El eje
de abscisas representa el marcado con un anticuerpo
anti-\alpha1 humano marcado con fluoresceína y el
eje de ordenadas representa el marcado con un anticuerpo
anti-CD19 murino marcado con ficoeritrina. El
rectángulo en línea de puntos indica las células que expresan al
mismo tiempo CD19 (células B) y una cadena pesada \alpha1
humana.
- la figura 7 ilustra el análisis en citometría
de flujo, de la expresión de la cadena ligera kappa humana en la
superficie de los linfocitos B periféricos de los ratones de la
línea kappa ARN, en comparación con ratones no transgénicos
(control). El eje de abscisas representa el marcado con un
anticuerpo anti-kappa humano marcado con
fluoresceína y el eje de ordenadas representa el marcado con un
anticuerpo anti-kappa murino marcado con
ficoeritrina.
- la figura 8 ilustra la hipermutación somática
del transgén kappa humano en la línea de ratones transgénicos
\kappa ARN; se analizó la distribución de las mutaciones a lo
largo de la cadena ligera kappa humana de 40 clones aislados a
partir de células B activadas por PNA. Las mutaciones que generan
una sustitución de aminoácidos, las mutaciones silenciosas y las
mutaciones que generan un codón de terminación se indican
respectivamente mediante \blacksquare, \Box, y
100 . Los aminoácidos correspondientes a los puntos
de hipermutación se indican mediante su naturaleza y su posición,
así como mediante la posición de la mutación en el codón (en números
romanos, entre paréntesis).
- la figura 9 ilustra el análisis en ELISA de la
respuesta en anticuerpos IgA1 quiméricos humanos específicos, en
los ratones dobles-transgénicos de la línea HAMIGA
inmunizados con el antígeno ovoalbúmina. Los resultados se expresan
en unidades arbitrarias de IgA anti-ovoalbúmina.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen alfa 1 humano, que incluye los tres
exones que codifican los dominios constantes CH1, CH2 y CH3 y el
exón de membrana (mb), se insertó por recombinación homóloga, en
lugar de la región de conmutación S\mu de la cadena pesada murina
(S\mu), para bloquear la conmutación de clase hacia los genes
constantes de inmunoglobulinas situados cadena abajo de C\mu en
el locus endógeno (locus IgH murino, figura 1). La región fijada
como objetivo suprime la expresión del gen \mu endógeno
responsable de la síntesis de cadenas pesadas de IgM, y disminuye
fuertemente la de los demás genes de cadenas pesadas de
inmunoglobulinas. Por consiguiente, la línea transgénica obtenida
produce grandes cantidades de IgA quiméricas cuyo dominio constante
humanizado corresponde al isotipo IgA1.
\vskip1.000000\baselineskip
Las construcciones plasmídicas se realizaron a
partir del plásmido bluescript SK (pSK) (STRATAGENE) y de la cepa
bacteriana E. coli TG1 (STRATAGENE), utilizando los
protocolos convencionales de preparación, de clonación y de
análisis del ADN tales como los descritos en el documento Current
Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley
and son Inc, Library of Congress, USA).
El vector de recombinación homóloga o vector de
direccionamiento derivado de pSK, denominado
p-alfa1KI (figura 2), comprende: un fragmento de
5,5 kb del gen alfa 1 humano que incluye tres exones que codifican
los dominios constantes CH1, CH2 y CH3 y el exón de membrana (mb) y
una casete neo (fragmento de 1,6 kb), flanqueado cadena arriba por
un fragmento de aproximadamente 5 kb correspondiente a la región
JH-E\mu (fragmento DQ 52/JH) y cadena abajo por
otro fragmento de aproximadamente 5 kb correspondiente al gen C\mu
(fragmento C\mu).
De manera más precisa, los diferentes fragmentos
se insertaron en el plásmido bluescript SK, de acuerdo con las
siguientes etapas:
En una primera etapa, el fragmento C\mu
correspondiente a las posiciones 140101 a 145032 del cromosoma 12
murino (Genbank/EMBL AC073553) se amplificó por PCR con ayuda de
cebadores específicos apropiados y después se clonó en el sitio
Xho I de pSK para dar el plásmido pA.
En una segunda etapa, el fragmento DQ 52/JH
correspondiente a las posiciones 131281 a 136441 del cromosoma 12
murino (Genbank/EMBL AC073553) se amplificó por PCR con ayuda de
cebadores específicos apropiados y después se clonó en 5' del
fragmento C\mu, entre los sitios EcoR V y Cla I del
plásmido pA, para dar el plásmido pB.
En una tercera etapa, la casete neo descrita en
el documento Pinaud et al., Immunity, 2001,15,
187-199, se insertó en el sitio Sal I entre
DQ52/JH y C\mu, para dar el plásmido pC.
El fragmento Sac I-Bam HI de 5,5
kb de un plásmido recombinante que comprende la totalidad del gen
alfa 1 humano, que incluye las secuencias de los exones CH1, CH2 y
CH3 (Genbank/EMBL J00220) y del exón de membrana (Genbank/EMBL
X64133) se ligó en cada uno de sus extremos con adaptadores Cla
I.
Finalmente, en una última etapa, el fragmento de
5,5 kb flanqueado por adaptadores Cla I obtenido de este modo se
insertó entre el fragmento JH y la casete neo en el sitio Cla
I del plásmido pC para dar el vector de direccionamiento
denominado p-alfa1KI.
La secuencia de p-alfa1KI se
verificó mediante secuenciación automática y mediante análisis de
restricción con las enzimas Cla I y Xho I (figura
3).
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones de células ES procedentes de la línea
129/SJ se aislaron, se analizaron y después se inyectaron en
blastocistos de ratón C57/Black 6, utilizando los protocolos
convencionales de transgénesis y de análisis del ADN genómico,
tales como los descritos en el documento Current Protocols in
Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc,
Library of Congress, USA).
De manera más precisa, células ES se
transfectaron por electroporación del ADN de
p-alfa1KI linealizado en el sitio Not I. Los
clones seleccionados en presencia de geneticina se extrajeron y el
ADN genómico digerido con EcoR I se analizó mediante
transferencia de Southern con ayuda de una sonda radiactiva que
hibrida más allá del sitio de recombinación homóloga, en 5' del gen
constante Delta (\delta) y de su sitio EcoR I (figura 4);
esta sonda amplificada por PCR con ayuda de cebadores específicos
apropiados, corresponde a las posiciones 140101 a 145032 de la
secuencia del cromosoma 12 murino (EMBL/Genbank AC073553).
La presencia de un alelo recombinante se
visualiza mediante un fragmento de aproximadamente 7,5 kb (que
representa el fragmento \mu murino y la casete neo) mientras que
el alelo silvestre corresponde a un fragmento de 12 kb (figura 5).
En estas condiciones, de 303 clones analizados, 4 se mostraron
positivos.
La verificación del cariotipo de dos de los
cuatro clones recombinantes no mostró ninguna anomalía cromosómica
(aneuploidía).
Estos clones se inyectaron en blastocistos de
ratón C57/Black 6 utilizando los protocolos convencionales de
transgénesis tales como los descritos en el documento Transgenic
Mouse: Methods and Protocols, mencionado anteriormente. Entre
los ratones obtenidos, aquellos que presentan el grado de quimerismo
más alto se analizaron por PCR y por ELISA. Una línea de ratones
homocigóticos para el locus IgH recombinado, denominado en lo
sucesivo línea alfa 1 knock-in o alfa1KI, se
obtuvo a continuación mediante cruzamiento de los animales
heterocigóticos que presentan el grado de quimerismo más alto.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN genómico de una muestra de cola de los
animales homocigóticos obtenidos como se ha precisado anteriormente,
se analizó por PCR con ayuda de los dos pares de cebadores
siguientes:
- par específico del locus IgH murino no
mutado (alelo \mu silvestre):
- -
- cebador UpstreamSpe I Smu: 5' GAG TAC CGT TGT CTG GGT CAC 3' (SEC ID Nº 1)
- -
- cebador SacI-3'Imu: 5' GAG CTC TAT GAT TAT TGG TTA AC 3' (SEC ID Nº 2)
La reacción de amplificación se realizó con una
temperatura de hibridación de 61ºC. Esta PCR amplifica en 30 ciclos
un fragmento de 91 pares de bases que enmarcan el sitio Spe I
específico del locus IgH murino no mutado.
\vskip1.000000\baselineskip
- par específico del locus IgH recombinado
que porta el gen C\alpha1 humano (alelo alfa 1
knock-in o alfa1KI):
- -
- cebador Neo1: 5' GCA TGA TCT GGA CGA AGA GCA T 3' (SEC ID Nº 3)
- -
- cebador Neo2: 5' TCC CCT CAG AAG AAC TCG TCA A 3' (SEC ID Nº 4)
La reacción de amplificación se realizó con una
temperatura de hibridación de 55ºC. Esta PCR amplifica en 30 ciclos
un fragmento de 120 pares de bases específico del locus IgH
recombinado que porta el gen C\alpha1 humano (mutación alfa 1
knock-in o alfa1Kl).
Se estableció una línea de ratones homocigóticos
para la mutación alfa1KI, denominada en lo sucesivo línea alfa 1
knock-in o alfa1KI; los animales de esta línea son
sistemática y simultáneamente negativos en PCR con los cebadores
específicos del alelo \mu silvestre y positivos en PCR con los
cebadores específicos del alelo alfa 1
knock-in.
Las IgA séricas se dosificaron mediante
nefelometría en un autómata BNII^{TM} (BEHRING) utilizando el kit
de dosificación de las IgA (BEHRING), de acuerdo con las
recomendaciones del proveedor.
La dosificación de las IgA séricas dio
resultados totalmente correlacionados con los del genotipado
realizado por PCR:
- -
- los animales de control no mutantes tienen una tasa nula de inmunoglobulinas humanas de clase IgA
- -
- los animales heterocigóticos \alpha1-KI tienen también una tasa indetectable de IgA humanas y una tasa normal de IgM murinas.
- -
- los animales homocigóticos \alpha1-KI tienen una tasa significativa de IgA humanas, variando esta tasa entre 0,4 y 0,6 g/L en el suero. Por el contrario, las IgM murinas son indetectables en el suero de estos animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos en nefelometría se
confirmaron en ELISA siguiendo las siguientes etapas: placas de 96
pocillos (Maxisorb^{TM}, NUNC) se recubrieron de anticuerpo no
marcado anti-IgA humanas, o de anticuerpo no
marcado anti-IgM murinas, mediante incubación
durante una noche a +4ºC en presencia de Fab'2 de cabra
anti-IgA humanas o anti-IgM murinas
(Southern Biotechnologies Associates), diluidos a la 1/500^{a} en
tampón carbonato 0,1 M, pH 8,3 (100 microlitros/pocillo). Después
de 3 lavados con tampón PBS que contenía el 0,1% de Tween
(PBS-Tween al 0,1%), las placas se saturaron en
presencia de PBS que contenía el 10% de suero fetal bovino (100
microlitros/pocillo). Después de 3 lavados con tampón
PBS-Tween al 0,1%, se añadieron los sueros a
ensayar, diluidos a la 1/100^{a} y a la 1/500^{a} en tampón PBS
que contenía el 10% de suero fetal bovino (100 microlitros/pocillo)
y las placas se incubaron 3 horas a 37ºC. Después de 3 lavados con
tampón PBS-Tween al 0,1%, se añadieron un antisuero
anti-IgA humanas marcado con fosfatasa alcalina o un
suero anti-IgM murinas marcado con fosfatasa
alcalina (Biosys) diluidos a la 1/1000ª en PBS-Tween
al 0,1% (100 microlitros/pocillo) y las placas se incubaron 1 hora
a 37ºC. Después de 3 lavados con tampón PBS-Tween al
0,1%, las IgA y las IgM fijadas se revelaron mediante adición de
sustrato de la fosfatasa alcalina
(p-nitrofenilfosfato, SIGMA) a 1 mg/ml en tampón
Tris 0,2 M, pH 7,0. La reacción se bloqueó mediante adición de sosa
0,5 N (50 microlitros/pocillo) y después se midió la absorción a
una longitud de onda de 405 nm.
Los datos cuantitativos se obtienen mediante
extrapolación con una gama de un suero patrón (BEHRING) para la
dosificación de las IgA humanas, y de una IgM monoclonal murina
(SOUTHERN BIOTECHNOLOGIES ASSOCIATES) para la dosificación de las
IgM murinas.
La dosificación de las IgA séricas en ELISA
muestra una diferencia significativa entre los homocigóticos y los
heterocigóticos; los sueros de homocigóticos contienen 0,4 y 0,6 g/l
de IgA1, mientras que se observan valores de absorbancia nulos o
muy reducidos para los sueros de heterocigóticos incluso a la
dilución más baja (a la 1/100ª). A la inversa, cuando las IgM
murinas se dosifican en ELISA, se observa una tasa normal de IgM
murinas (del orden de 1 g/l) en los ratones de control "no
mutantes", al igual que en los animales heterocigóticos para la
mutación \alpha1-KI. Por el contrario, la tasa de
las IgM murinas es nula en los animales homocigóticos para la
mutación \alpha1-KI.
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales homocigóticos portadores de la
mutación \alpha1-KI se fenotiparon en citometría
de flujo, por doble marcado con ayuda de anticuerpos específicos de
IgA1 humana o de IgM murinas marcados con fluoresceína, y de
anticuerpos específicos de las células B (anticuerpos
anti-CD19) marcados con ficoeritrina. De manera más
precisa:
- -
- Preparación de las células linfoides: dos órganos linfoides periféricos: el bazo y las placas de Peyer, se extrajeron por separado de los animales mutantes homocigóticos \alpha1KI, se dividieron en tampón verseno (Invitrogen), y se filtraron en un tamiz (40 micrómetros) para obtener una suspensión de células individuales libre de agregados celulares. Las células esplénicas se centrifugaron a continuación y se sometieron a una etapa suplementaria de choque osmótico para lisar los glóbulos rojos mediante resuspensión del sedimento celular en 1 ml de agua destilada. Las células de las muestras se resuspendieron inmediatamente a continuación en medio completo (RPMI + 10% de suero fetal bovino), se contaron y conservaron en hielo.
- -
- Marcado con ayuda de anticuerpos fluorescentes: 10^{5} células de cada muestra se incubaron durante 30 minutos a 4ºC con una dilución a la 1/100ª, de un anticuerpo anti-IgM de ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína (Southern Biotechnologies), o de un anticuerpo anti-IgA humanas marcado con isotiocianato de fluoresceína, o bien con la combinación de uno de los anticuerpos anteriores con un anticuerpo específico de las células B (anticuerpo anti-CD19) marcado con ficoeritrina (doble marcado). Las células se lavaron a continuación en 5 ml de PBS y después el sobrenadante se decantó y las células se resuspendieron en 100 microlitros de PBS, BSA al 0,5%, EDTA 0,1 mM.
- -
- Análisis en citofluorimetría: las células marcadas se analizaron con ayuda de un citómetro de flujo (COULTER XL^{TM}).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la citometría de flujo
concuerdan con los de la dosificación de las inmunoglobulinas
séricas. En los animales homocigóticos de la línea
alfa1-KI, no se detectó ninguna expresión de IgM
murinas, ni en el bazo, ni en las placas de Peyer.
No obstante, en ausencia de expresión de IgM, un
compartimento de células B periféricas CD 19+ es capaz de
diferenciarse en estos animales y representa del 10 al 12% de los
linfocitos esplénicos o del 40 al 60% de los linfocitos de las
placas de Peyer. Este compartimento expresa IgA membranarias cuya
cadena pesada humanizada es reconocida por un anticuerpo específico
de las IgA1 y marcado con fluoresceína (figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Una línea de animales transgénicos que expresan
en todas sus células B, una cadena ligera kappa humana codificada
por la región variable V\kappaI-J\kappa5 y la
región C\kappa (cadena kappa ARN, EMBL/Genbank X64133), se obtuvo
mediante transgénesis directa, a partir del vector de expresión
descrito en el documento Chauveau et al, Gene, 1998,
222,
279-285.
279-285.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de transgénesis es el plásmido
pALIE\mu descrito en el documento Chauveau et al, Gene,
1998, 222, 279-285; éste contiene al mismo tiempo
el promotor VH y el potenciador E\mu en 5' de la casete que
codifica la cadena kappa ARN, y en 3' de esta casete: los tres
potenciadores hs3a, hs12 y hs3b, situados en 3' del locus IgH en
3'. La secuencia codificante corresponde a la cadena
V\kappaI-J\kappa5-C\kappa
(Genbank/EMBL X64133). El plásmido pALIE\mu se linealizó con las
enzimas de restricción Not I y Pvu I que cortan en el
interior de la secuencia plasmídica, estando Not I situado
cadena arriba del promotor que precede al segmento V\kappa clonado
y estando Pvu I situado en el gen de resistencia a
ampicilina portado por el plásmido. El fragmento que incluye el
conjunto de la casete de expresión kappa flanqueada por todos los
elementos promotores y reguladores de la expresión se insertó a
continuación de forma aleatoria en blastocistos de ratón utilizando
los protocolos convencionales de transgénesis directa tales como
los descritos en el documento Transgenic Mouse: Methods and
Protocols, mencionado anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Una línea de ratón transgénico que posee el
transgén \kappa ARN se obtuvo después de la inyección del vector
de expresión; la presencia de este transgén humano se verificó en
el ADN de los ratones mediante transferencia de Southern con ayuda
de una sonda específica de la región C\kappa humana (fragmento
EcoRI-EcoRI de 2,5 kb que incluye la
totalidad del exón C\kappa humano). Los animales que portan la
inserción del transgén en los dos alelos del punto de inserción
(animales homocigóticos) tienen una cantidad doble del transgén y
pueden distinguirse mediante la transferencia de Southern de los
animales que portan una sola copia del transgén (animales
heterocigóticos). Como alternativa, la presencia del transgén se
detectó por PCR con ayuda de cebadores que permiten amplificar
específicamente la secuencia humana
V\kappaI-J\kappa5-C\kappa
(Genbank/EMBL X64133).
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales dicigóticos portadores del transgén
kappa ARN se fenotiparon en citometría de flujo, por doble marcado
con ayuda de un anticuerpo anti-\kappa murino
(marcado con ficoeritrina) en conjunción con un anticuerpo
anti-\kappa humano (marcado con isotiocianato de
fluoresceína), de acuerdo con el protocolo tal como se ha descrito
en el
ejemplo 1.
ejemplo 1.
Estos animales muestran una expresión del
transgén \kappa humano en la mayoría de las células B (figura 7).
Además, el transgén induce un fenómeno de exclusión alélica tal que
las células B que expresan el transgén \kappa humano no expresan
gen endógeno de cadenas ligeras de ratón. En citometría, estas
células son por lo tanto positivas durante el marcado con el
antisuero anti-cadenas \kappa humanas y negativas
con el antisuero anti cadenas \kappa murinas (figura 7).
\vskip1.000000\baselineskip
También se ha demostrado que esta cadena ligera
\kappa humana es capaz de asociarse con cadenas pesadas y de
diversificarse gracias al fenómeno de hipermutación somática
(desencadenado por una respuesta al antígeno). Este transgén, que
respeta la arquitectura endógena de un gen \kappa con presencia
del intrón J\kappa-C\kappa entre el
V\kappaJ\kappa y el C\kappa, se beneficia además de una
fuerte expresión asegurada por la combinación promotor
P_{VH}/potenciador E\mu + palíndromo regulador 3'IgH (hs3a,
hs1,2, hs3b). La acción acumulativa de todos estos elementos
reguladores permite reclutar la maquinaria de hipermutación
somática a nivel del transgén. De manera más precisa, las placas de
Peyer de los ratones transgénicos se extraen mediante disección del
intestino. La suspensión celular se prepara triturando las placas
de Peyer a través de una membrana de nylon. Las células se lavan
tres veces a +4ºC, en DMEM que contiene el 10% de suero fetal
bovino. Las células muertas se eliminaron después de cada lavado y
la suspensión celular se ajustó a
10^{6} células/ml.
10^{6} células/ml.
Las células se incubaron 30 minutos a +4ºC en
presencia de anticuerpo anti-B220 biotinilado.
Después de dos lavados con DMEM que contenía el 5% de suero fetal
bovino, las células se incubaron 30 minutos a +4ºC en presencia de
estreptavidina acoplada a ficoeritrina, y después se lavaron y se
resuspendieron en PBS que contenía el 5% de suero fetal bovino.
Después de la adición de una lectina específica de las células B
activadas (PNA por "penaut aglutinin" [aglutinina de
cacahuete]) conjugada con FITC, la suspensión celular se incubó 30
minutos a +4ºC. Después de dos lavados con DMEM, las células se
resuspendieron en DMEM y después las B se clasificaron a
continuación, por citometría de flujo, en dos poblaciones:
B220+PNA^{high} (B activadas) y B220+PNA^{low}(B en
reposo).
El ADN genómico se extrajo de las dos
poblaciones celulares clasificadas con ayuda del kit QIAamp
Tissue
(QIAGEN). Se realizó una amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en 2 \mul de ADN genómico utilizando cebadores correspondientes a la región señal del V\kappa1 humano (5'-AAGTCGACATGGACATGAGGGTGCC-3') (SEC ID Nº 5) y al comienzo de la región J\kappa5 humana (5'-TTCTCGAGACTTAGGTTTAATCTCCAG-3') (SEC ID Nº 6). El programa de amplificación consistía en: una etapa inicial de desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos; seguida de 35 ciclos que alternan una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, una etapa de hibridación a 52ºC durante 30 segundos, y una etapa de elongación a 72ºC durante 30 segundos; y después una etapa final de elongación a 72ºC durante 7 minutos.
(QIAGEN). Se realizó una amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en 2 \mul de ADN genómico utilizando cebadores correspondientes a la región señal del V\kappa1 humano (5'-AAGTCGACATGGACATGAGGGTGCC-3') (SEC ID Nº 5) y al comienzo de la región J\kappa5 humana (5'-TTCTCGAGACTTAGGTTTAATCTCCAG-3') (SEC ID Nº 6). El programa de amplificación consistía en: una etapa inicial de desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos; seguida de 35 ciclos que alternan una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, una etapa de hibridación a 52ºC durante 30 segundos, y una etapa de elongación a 72ºC durante 30 segundos; y después una etapa final de elongación a 72ºC durante 7 minutos.
El producto de amplificación se purificó en gel
de agarosa al 1,2%, se eluyó (kit QIAquick Gel Extraction,
QIAGEN) y después se clonó en el vector pCRU-TOPO (INVITROGEN). Los clones recombinantes se ensayaron mediante restricción enzimática y después se purificaron (kit Flexiprep, PHARMACIA) y se secuenciaron mediante el método de Sanger. Las reacciones de secuenciación se realizaron por PCR con ayuda de los cebadores M13 inverso y M13(-20) y de didesoxinucleótidos fluorescentes y después se analizaron mediante electrofóresis capilar en secuenciador automático (ABI-PRISM 310, PERKIN-ELMER). Las secuencias obtenidas a partir de las células B activadas se alinearon a continuación con la secuencia original del transgén no mutado (Genbank/EMBL X64133). El número y la posición de las mutaciones se analizaron (figura 8). El transgén \kappa sufre esta hipermutación somática a una tasa prácticamente tan elevada (17 mutaciones por 1000 bases) como los genes de inmunoglobulinas endógenas (que mutan con una tasa de 40 mutaciones por 1000 bases). Este transgén único es por lo tanto capaz de generar un "repertorio" kappa que posee cierta diversidad.
QIAGEN) y después se clonó en el vector pCRU-TOPO (INVITROGEN). Los clones recombinantes se ensayaron mediante restricción enzimática y después se purificaron (kit Flexiprep, PHARMACIA) y se secuenciaron mediante el método de Sanger. Las reacciones de secuenciación se realizaron por PCR con ayuda de los cebadores M13 inverso y M13(-20) y de didesoxinucleótidos fluorescentes y después se analizaron mediante electrofóresis capilar en secuenciador automático (ABI-PRISM 310, PERKIN-ELMER). Las secuencias obtenidas a partir de las células B activadas se alinearon a continuación con la secuencia original del transgén no mutado (Genbank/EMBL X64133). El número y la posición de las mutaciones se analizaron (figura 8). El transgén \kappa sufre esta hipermutación somática a una tasa prácticamente tan elevada (17 mutaciones por 1000 bases) como los genes de inmunoglobulinas endógenas (que mutan con una tasa de 40 mutaciones por 1000 bases). Este transgén único es por lo tanto capaz de generar un "repertorio" kappa que posee cierta diversidad.
\vskip1.000000\baselineskip
El cruzamiento de las líneas \kappaARN y
alfa1-KI descritas en los ejemplos anteriores,
genera ratones dobles transgénicos
\kappaARN/alfa1-KI.
Para ello, los animales homocigóticos para la
mutación alfa1-KI y homocigóticos para el transgén
\kappa ARN se cruzaron entre sí. En la primera generación (F1)
después de este cruzamiento, todos los animales obtenidos son
heterocigóticos para la mutación alfa1-KI y
heterocigóticos para el transgén \kappa ARN. Estos animales de la
F1, por lo tanto, se cruzaron de nuevo: en la siguiente generación
(F2) las leyes de la genética mendeliana permiten obtener 1 animal
de cada 4 homocigótico para la mutación alfa1-KI y
un animal de cada 4 homocigótico para el transgén \kappa ARN.
Entre estos animales de la F2, un animal de cada 16 pudo
seleccionarse, por lo tanto, como portador al mismo tiempo de la
mutación alfa1-KI en estado homocigótico y como
portador del transgén \kappa ARN en estado homocigótico. Estos
animales son los fundadores de la línea HAMIGA y transmiten de forma
estable a su descendencia los genes que permiten simultáneamente la
producción de una cadena pesada alfa1 humanizada en sustitución de
la producción de IgM murinas así como la producción y la
diversificación por hipermutación de una cadena \kappa
humana.
Esta línea de ratones dobles transgénicos se
denomina línea HAMIGA por "Humanized Antibodies Made Up Of
Monoclonal Immunoglobulin A".
Se realizó el seguimiento de la transmisión del
transgén \kappa ARN durante los cruzamientos de animales
transgénicos mediante Transferencia de Southern con ayuda de una
sonda específica de la región C\kappa humana (fragmento
EcoRI-EcoRI de 2,5 kb que incluye la
totalidad de el exón C\kappa humano).
La expresión del transgén \kappa en los
animales mutantes se detectó mediante dosificación en ELISA de
cadenas kappa libres humanas eliminadas en la orina de los
animales. De manera más precisa: placas de 96 pocillos (Maxisorb,
NUNC) se incubaron durante una noche a +4ºC en presencia de un
anticuerpo no marcado anti-K humano (Kallestad)
diluido a la 1/1000ª en tampón carbonato 0,1 M pH 8,3 (100
microlitros/pocillo). Después de 3 lavados con tampón PBS que
contenía el 0,1% de Tween (PBS-Tween al 0,1%), las
placas se saturaron en presencia de PBS que contenía el 10% de
suero fetal bovino (100 microlitros/pocillo). Después de 3 lavados
con tampón PBS-Tween al 0,1%, se añadieron las
muestras de orina a ensayar, diluidas a la 1/100ª y a la 1/500ª en
tampón PBS que contenía el 10% de suero fetal bovino (100
microlitros/pocillo) y las placas se incubaron 3 horas a 37ºC.
Después de 3 lavados con tampón PBS-Tween al 0,1%,
un antisuero anti-\kappa humano marcado con
fosfatasa alcalina (SIGMA) diluido a la 1/1000ª en
PBS-Tween al 0,1% (100 microlitros/pocillo) se
añadió y las placas se incubaron 1 hora a 37ºC. Después de 3
lavados con tampón PBS-Tween al 0,1%, las cadenas
ligeras kappa humanas fijadas se revelaron mediante adición de
sustrato de la fosfatasa alcalina
(p-nitrofenilfosfato, SIGMA) a 1 mg/ml en tampón
Tris 0,2 M, pH 7,0. La reacción se bloqueó mediante adición de sosa
0,5 N (50 microlitros/pocillo) y después se midió la absorción a
una longitud de onda de
405 nm.
405 nm.
Como alternativa, la expresión del transgén
kappa humano se analizó mediante citometría de flujo como se ha
descrito en el ejemplo 2. Los resultados muestran que la presencia
del transgén \kappa ARN conlleva un fenómeno importante de
exclusión alélica, tal que entre los linfocitos periféricos más del
50% expresan la cadena ligera humana y no reorganizan los genes de
cadenas ligeras murinas para expresar una cadena ligera murina.
\vskip1.000000\baselineskip
El primer elemento simple que indica la
homocigosis \alpha1-KI es la presencia de una tasa
elevada de IgA1 humanas en el suero de los animales. Además, la
homocigosis se confirmó en PCR mediante la positividad de la "PCR
de \alpha1-KI" asociada a la negatividad de la
"PCR de alelo \mu silvestre". Finalmente, después del
sacrificio de los animales, el análisis en citometría de flujo
permitió demostrar en los linfocitos del bazo y de las placas de
Peyer que la totalidad de los linfocitos B (CD19+) expresan IgA1
humanas membranarias mientras que, paralelamente, ninguna célula B
expresa IgM murina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales doble-transgénicos
HAMIGA se caracterizaron como aquellos que responden simultáneamente
a las dos especificidades descritas anteriormente: presencia del
transgén \kappa ARN en estado homocigótico y homocigosis para la
mutación alfa1-KI. Además, estos animales se
reproducen conservando estas dos especificidades y el fenotipo de
su descendencia posee las siguientes propiedades, simultáneamente y
de forma estable:
- -
- la producción de IgA1 humanizada a una tasa consecuente (fácilmente verificable mediante ELISA o nefelometría en una simple extracción de sangre realizada en los animales vivos a nivel del seno retro-orbital)
- -
- la producción de cadena ligera \kappa humana (fácilmente verificable mediante ELISA en una simple extracción de orina realizada en los animales vivos).
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales se inmunizaron una primera vez
mediante inyección intraperitoneal de 10 microgramos de ovoalbúmina
(SIGMA) diluida en 100 microlitros de suero fisiológico y
emulsionada con 200 microlitros de adyuvante completo de Freund
(SIGMA).
Después de 4 semanas, los animales sufrieron un
recuerdo de vacuna por inyección intraperitoneal de 10 microgramos
de ovoalbúmina (SIGMA) diluida en 100 microlitros de suero
fisiológico y emulsionada con 200 microlitros de adyuvante
incompleto de Freund (SIGMA).
\newpage
La presencia de anticuerpos específicos del
antígeno de vacuna ovoalbúmina se analizó en ELISA, 4 semanas y a
continuación 7 semanas después de la segunda inyección del antígeno,
siguiendo la siguiente técnica: placas de 96 pocillos (Maxisorb®,
NUNC) se incubaron durante una noche a +4ºC en presencia de
ovoalbúmina a la concentración de 10 microgramos/ml en tampón
carbonato 0,1 M pH 8,3 (100 microlitros/pocillo). Después de 3
lavados con tampón PBS que contenía el 0,1% de Tween
(PBS-Tween al 0,1%), las placas se saturaron en
presencia de PBS que contenía el 10% de suero fetal bovino (100
microlitros/pocillo). Después de 3 lavados con tampón
PBS-Tween al 0,1%, se añadieron las muestras de
suero a ensayar, diluidas a la 1/20a y a la 1/100ª en tampón PBS que
contenía el 10% de suero fetal bovino (100 microlitros/pocillo) y
las placas se incubaron 3 horas a 37ºC. Después de 3 lavados con
tampón PBS-Tween al 0,1%, se añadió un antisuero
anti-IgA humanas marcado con fosfatasa alcalina
(BIOSYS) diluido a la 1/1000ª en PBS-Tween al 0,1%
(100 microlitros/pocillo) y las placas se incubaron 1 hora a 37ºC.
Después de 3 lavados con tampón PBS-Tween al 0,1%,
las cadenas ligeras kappa humanas fijadas se revelaron mediante
adición de sustrato de la fosfatasa alcalina
(p-nitrofenilfosfato, SIGMA) a 1 mg/ml en tampón
Tris 0,2 M, pH 7,0. La reacción se bloqueó mediante adición de sosa
0,5 N (50 microlitros/pocillo) y después se midió la absorción a
una longitud de onda de 405 nm. La tasa de anticuerpos IgA
anti-ovoalbúmina se expresó en unidades arbitrarias
establecidas para los sueros diluidos a la 1/100ª en función de la
relación Densidad óptica del suero ensayado/Densidad óptica del
suero de control.
Los resultados presentados en la figura 9
muestran la presencia de anticuerpos específicos del antígeno de
vacuna ovoalbúmina 4 semanas (tasa de los anticuerpos IgA1 humanas
anti-ovoalbúmina a 388 unidades), y a continuación
7 semanas después de la segunda inyección del antígeno (tasa de los
anticuerpos IgA anti-ovoalbúmina a 162 unidades).
En paralelo, también se ha verificado que en ausencia de
inmunización de los animales, la tasa de los anticuerpos IgA anti-
ovoalbúmina detectados seguía siendo inferior a 30 unidades.
Se espera que el repertorio de respuesta a los
antígenos de estos ratones esté por debajo de lo normal puesto que
se sabe que es esencialmente el dominio VH de la cadena pesada el
que contribuye a la formación del sitio de anticuerpos (o la cadena
pesada transgénica \alpha1 humana se beneficia de un repertorio
totalmente diversificado ya que corresponde al repertorio normal
generado por las reorganizaciones de los segmentos VH, D y JH del
locus IgH murino). Estos ratones son capaces de producir anticuerpos
de gran afinidad en respuesta secundaria, lo que resulta del hecho
de que sus linfocitos B pueden reclutar el fenómeno de hipermutación
somática al mismo tiempo a nivel del gen de cadena pesada y del
transgén de cadena ligera \kappa ARN.
Como resulta de lo anterior, la invención no se
limita en absoluto a aquellos de sus desarrollos, realizaciones y
aplicaciones que acaban de describirse de forma más explícita; por
el contrario, la invención abarca todas las variantes que pudiera
aplicar el especialista en la técnica, sin alejarse del marco ni del
alcance, de la presente invención.
<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE
\hskip1cm COGNE, Michel
\hskip1cm SIRAC, Christophe
\hskip1cm BARDEL, Micael
\hskip1cm DECOURT, Catherine
\hskip1cm LE MORVAN, Caroline
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Mamífero no humano transgénico para
la región constante de la cadena pesada de las inmunoglobulinas
humanas de clase A y sus aplicaciones
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> s644PCT115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtaccgtt gtctgggtca c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagctctatg attattggtt aac
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatgatctg gacgaagagc at
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccctcaga agaactcgtc aa
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtcgacat ggacatgagg gtgcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctcgagac ttaggtttaa tctccag
\hfill27
Claims (35)
1. Mamífero no humano transgénico,
caracterizado por que comprende un locus IgH modificado
mediante sustitución de la secuencia de conmutación S\mu por todo
o parte de un transgén constituido por el gen C\alpha de una
inmunoglobulina humana de clase A que incluye al menos el exón que
codifica el dominio CH3 y el exón de membrana.
2. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con
la Reivindicación 1, caracterizado por que es homocigótico
para dicho locus IgH modificado.
3. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con
la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, caracterizado por
que dicho locus IgH se modifica mediante sustitución de la secuencia
de conmutación S\mu, por la totalidad del gen C\alpha.
4. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con
la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, caracterizado por
que dicho locus IgH se modifica mediante sustitución de la secuencia
de conmutación S\mu, por el segmento del gen C\alpha que
incluye el exón que codifica el dominio CH3 y el exón de
membrana.
5. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con
una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, caracterizado
por que dicho gen C\alpha es C\alpha1.
6. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con
una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, caracterizado
por que comprende otro transgén que codifica una cadena ligera de
inmunoglobulina humana.
7. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con
la Reivindicación 6, caracterizado por que dicha cadena
ligera es una cadena kappa.
8. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con
la Reivindicación 7, caracterizado por que dicho transgén
comprende el activador intrónico E\mu, cadena arriba y el
palíndromo hs3\alpha/hs1,2/hs3b cadena abajo.
9. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con
la Reivindicación 8, caracterizado por que dicho transgén
está bajo el control del promotor de la cadena pesada de
inmunoglobulina humana.
10. Mamífero no humano transgénico de acuerdo
con una cualquiera de las Reivindicaciones 6 a 9,
caracterizado por que es dicigótico para dicho transgén.
11. Mamífero no humano transgénico de acuerdo
con una cualquiera de las Reivindicaciones 6 a 10,
caracterizado por que posee un locus endógeno de la cadena
kappa inactivado.
12. Mamífero no humano transgénico de acuerdo
con la Reivindicación 11, caracterizado por que es
homocigótico para dicho locus endógeno de la cadena kappa
inactivado.
13. Mamífero no humano transgénico de acuerdo
con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12,
caracterizado por que posee un gen que codifica la cadena J
inactivado.
14. Mamífero no humano transgénico de acuerdo
con la Reivindicación 13, caracterizado por que es
homocigótico para dicho gen que codifica la cadena J
inactivado.
15. Mamífero no humano transgénico de acuerdo
con la Reivindicación 13 o la Reivindicación 14,
caracterizado por que comprende otro transgén que codifica
una cadena J de inmunoglobulina humana.
16. Mamífero no humano transgénico de acuerdo
con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 15,
caracterizado por que es un ratón transgénico.
17. Ratón transgénico de acuerdo con la
Reivindicación 16, caracterizado por que comprende:
- -
- un locus IgH modificado mediante sustitución de la secuencia de conmutación S\mu por todo el gen C\alpha1 de una inmunoglobulina humana de clase A, y
- -
- un gen V\kappa completo que comprende el gen V\kappaI reorganizado con un gen J\kappa5, el intrón J\kappa-C\kappa y el gen C\kappa, bajo el control transcripcional del promotor de la cadena pesada humana (pVH) y del activador intrónico E\mu cadena arriba, y del palíndromo hs3\alpha/hs1,2/hs3b cadena abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Vector de direccionamiento de recombinación
homóloga, caracterizado por que comprende el gen C\alpha
de una inmunoglobulina humana de clase A o un segmento de este gen
que incluye al menos el exón que codifica el dominio CH3 y el exón
de membrana, flanqueado por fragmentos de secuencias del locus IgH
de un mamífero no humano que son adyacentes a la secuencia
S\mu.
19. Vector de direccionamiento de acuerdo con la
Reivindicación 18, caracterizado por que comprende una casete
de expresión de un marcador de selección apropiado, adyacente a
dicho gen C\alpha o a un segmento de dicho gen.
20. Vector de direccionamiento de acuerdo con la
Reivindicación 19, caracterizado por que dicha casete de
expresión está flanqueada por secuencias de recombinación
específicas de sitio.
21. Vector de direccionamiento de acuerdo con la
Reivindicación 19, caracterizado por que dichas secuencias
son las secuencias LoxP de la recombinasa Cre.
22. Vector de direccionamiento de acuerdo con
una cualquiera de las Reivindicaciones 18 a 21, caracterizado
por que dichos fragmentos de secuencias que son adyacentes a la
secuencia S\mu son de origen murino.
23. Vector de direccionamiento de acuerdo con la
Reivindicación 22, caracterizado por que el gen C\alpha o
el segmento de dicho gen está flanqueado, respectivamente en 5' y en
3', por fragmentos correspondientes a las posiciones 131281 a
136441 y 140101 a 145032 en la secuencia del cromosoma 12 murino
(número de entrada AC073553 en la base de datos EMBL/Genbank).
24. Célula embrionaria de mamífero no humano,
modificada con un vector de direccionamiento de acuerdo con una
cualquiera de las Reivindicaciones 18 a 23.
25. Utilización de un mamífero no humano
transgénico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1
a 16 o de un ratón transgénico de acuerdo con la Reivindicación 17,
para la producción de anticuerpos humanizados de clase IgA o de
fragmentos de estos anticuerpos.
26. Procedimiento de preparación de anticuerpos
humanizados de clase IgA o de fragmentos de estos anticuerpos,
caracterizado por que comprende al menos las siguientes
etapas:
- -
- la inmunización de un mamífero no humano transgénico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 o de un ratón transgénico de acuerdo con la Reivindicación 17, y
- -
- la obtención mediante cualquier medio apropiado, de anticuerpos humanizados de clase IgA o de fragmentos de estos anticuerpos, a partir del suero, de las secreciones o de los linfocitos B de dicho mamífero no humano transgénico previamente sacrificado.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Anticuerpo humanizado de clase IgA que puede
obtenerse mediante el procedimiento de acuerdo con la Reivindicación
26, caracterizado por que comprende una cadena pesada
quimérica cuyos dominios constantes son de origen humano y una
cadena ligera humana cuyo dominio variable está codificado por
V\kappaI-J\kappa5.
28. Fragmento de un anticuerpo humanizado de
clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27, caracterizado
por que comprende un fragmento de dichas cadenas pesadas y
ligeras.
29. Fragmento de anticuerpo humanizado de clase
IgA de acuerdo con la Reivindicación 28, caracterizado por
que se selecciona entre el grupo constituido por los fragmentos Fab,
Fab'2 y Fc.
30. Medicamento, caracterizado por que
comprende un anticuerpo humanizado de clase IgA de acuerdo con la
Reivindicación 27 o un fragmento de este anticuerpo de acuerdo con
la Reivindicación 28 o la Reivindicación 29.
31. Reactivo de diagnóstico,
caracterizado por que comprende un anticuerpo humanizado de
clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27 o un fragmento de
este anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 28 o la
Reivindicación 29.
32. Composición inmunógena o de vacuna,
caracterizada por que comprende al menos un anticuerpo
humanizado de clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27 o un
fragmento de este anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 28 o
la Reivindicación 29, asociado a un antígeno.
33. Composición farmacéutica,
caracterizada por que comprende al menos un anticuerpo
humanizado de clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27 o un
fragmento de este anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 28 o
la Reivindicación 29, asociado mediante cualquier medio apropiado a
un principio activo.
34. Utilización de un anticuerpo humanizado de
clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27 o de un fragmento de
este anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 28 o la
Reivindicación 29, para la preparación de un medicamento para la
prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas y de
cáncer.
35. Utilización de un anticuerpo humanizado de
clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27 o de un fragmento de
este anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 28 o la
Reivindicación 29, para la preparación de un reactivo para el
diagnóstico de enfermedades infecciosas y de cáncer.
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