ES2334335T3

ES2334335T3 - Mva que expresa genes de envoltura, gag y pol de vih modificados.

Info

Publication number: ES2334335T3
Application number: ES02721259T
Authority: ES
Inventors: Bernard Moss; Linda Wyatt; Patricia Earl; Harriet L. Robinson
Original assignee: Emory University; US Department of Health and Human Services
Current assignee: Emory University; US Department of Health and Human Services
Priority date: 2001-03-08
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2010-03-09
Anticipated expiration: 2022-03-01
Also published as: DE60234018D1; JP2004537974A; JP4554887B2; CN100446812C; US20150238593A1; AU2002252199B2; CN1638795A; JP2010115208A; CA2454959A1; CA2454959C; WO2002072754A2; WO2002072754A3; US20110104199A1; EP1372710A4; CY1109659T1; US20040146528A1; US8916172B2; PT1372710E; ATE445411T1; DK1372710T3

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un virus MVA recombinante que codifica Gag/Pol de HXB2 de MVA 48 (SEQ ID NO: 5) y la envoltura de ADA truncada (SEQ ID NO: 3).

Description

MVA que expresa genes de envoltura, gag y pol de VIH modificados.

Campo técnico de la invención

La invención proporciona un virus vaccinia Ankara modificado (MVA), una cepa del virus vaccinia de replicación deficiente, que expresa los genes env, gag y pol del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

Antecedentes de la invención

La inmunidad celular juega un papel importante en el control de las infecciones con virus de inmunodeficiencia (P. J. Goulder et al. 1999 AIDS 13:S121). Recientemente, una vacuna de ADN diseñada para aumentar la inmunidad celular por aumento de citoquina incluyó satisfactoriamente un virus de provocación de la inmunodeficiencia altamente virulento (D.H. Barouch et al. 2000 Science 290-486). Otra aproximación prometedora para aumentar la inmunidad celular es la inducción (priming) con ADN seguida de la potenciación (boosting) con poxvirus recombinantes. (H.L. Robinson et al. 2000 AIDS Rev 2:105). Este régimen de inducción/potenciación heterólogo induce frecuencias de células T de 10 a 100 veces más altas que la inducción/potenciación con ADN o las vacunas de poxvirus recombinantes en solitario. Anteriormente, los investigadores demostraron que la potenciación con un poxvirus de una respuesta inducida con ADN era superior que la potenciación con ADN o proteína para el control de un virus de inmunodeficiencia no patógeno (H.L. Robinson et al. 1999 Nat Med 5:526). Moss et al describen composiciones de vacunas que comprenden un MVA recombinante que contiene los genes gag-pol del virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS) y el gen env de VIH truncado para la inducción de una respuesta inmune protectora en monos (Moss et al: Retroviruses of human AIDS and related animal diseases, Colloque des Cent Gardes, 12 th 25 October 1999-27 October 1999, París, Francia, paginas 105-107). Existe la necesidad de controlar el virus patógeno de la inmunodeficiencia.

Compendio de la invención

Se describe aquí que la inducción con ADN seguida de una potenciación con un virus vaccinia Ankara modificado recombinante (rMVA) ha controlado un virus de provocación de la inmunodeficiencia altamente patógeno en un modelo de macaco rhesus. Tanto el componente ADN como el componente rMVA de la vacuna expresaban múltiples proteínas del virus de la inmunodeficiencia. Dos inoculaciones de ADN en las semanas 0 y 8 y un único refuerzo de rMVA en la semana 24 controlaron eficazmente una prueba de provocación intrarectal administrada siete meses después de la potenciación. Estos descubrimientos se prevén como la indicación de que una vacuna relativamente simple de ADN/MVA que libera múltiples proteínas puede ayudar a controlar la epidemia del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). También se describe que las inoculaciones de rMVA inducen respuestas inmunes buenas incluso sin el estímulo de ADN.

Descripción breve de las figuras

Figura I. Las relaciones filogenéticas del VIH-1 y VIH-2 se basan en la identidad de las secuencias del gen pol. VIS _{cpz} y VIS _{smm} son lentivirus de primates subhumanos recuperados de un chimpancé y de un mono magabeye gris, respectivamente.

Figura II. Las relaciones filogenéticas de los grupos M, N y O del VIH-1 con cuatro aislados diferentes de VIS _{cpz} se basan en la secuencias completas del gen pol. La barra indica una distancia genética de 0,1 (divergencia del 10% de los nucleótidos) y el asterisco sitúa los aislados de grupo N del VIH-1 en base a las secuencias de env.

Figura III. Propiedades biológicas y trópicas de los aislados de VIH-1.

Figura IV. Proteínas codificadas por VIH. Se indica la localización de los genes de VIH, los tamaños de los productos primarios de traducción (en algunos casos poliproteínas) y las proteínas virales maduras procesadas.

Figura V. Representación esquemática de un virión de VIH-1 maduro.

Figura VI. Representación lineal de la glicoproteína Env de VIH-1. La flecha indica el sitio de escisión gp160 para gp120 y gp41. In gp120, las áreas de entramado representan los dominios variables (V_{1} a V_{5}), las casillas en blanco indican las secuencias conservadas (C_{1} a C_{5}). En el ectodominio gp41 se indican varios dominios: el péptido de fusión N-terminal, y los dos ectodominios helicoidales (hélice-N y C). El dominio de transmembrana se representa por una casilla negra. En el dominio citoplásmico gp41, se indica el motivo de endocitosis Tyr-X-X-Leu (YXXL) (SEQ ID NO: 9) y dos motivos helicoidales predichos (hélices-1 y 2). Se indica la numeración de los aminoácidos.

Figura 1. Frecuencias temporales de las células T específicas para Gag. (A) respuestas de las células T CD8 específicas para Gag provocadas por inmunizaciones por inducción con ADN y potenciación con rMVA. El esquema presenta el promedio de los datos del tetrámero-CM9-Gag generados en animales inmunizados i.d. con dosis de ADN alta. (B) ELISPOT de IFN-\gamma específico para Gag en macacos A*01 (barras en blanco) y no-A*01 (barras con entramado) en diversos momentos antes de la prueba de provocación y dos semanas después de la prueba de provocación. Los números que están encima de las barras de datos representan el promedio aritmético \pm la DS para el resultado de ELISPOT dentro de cada grupo. Los números en la parte superior de los gráficos designan animales individuales. *,
datos no disponibles; #, ELISPOT <20 por 1x10^{6} células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Los datos temporales para células T específicas para el tetrámero Gag-CM9-Mamu-A*01 se pueden encontrar en la Figura 6.

Figura 2. Las cargas virales temporales, el recuento de CD4, y la supervivencia después de la prueba de provocación en animales vacunados y control. (A) El promedio geométrico de las cargas virales y (B) el promedio geométrico del recuento de CD4. (C) La curva de supervivencia para animales vacunados y control. La línea de puntos representa a todos los 24 animales vacunados. (D) Cargas virales. (E) Recuento de CD4 para animales individuales en los grupos vacunados y control. La clave de los números de los animales se presenta en (E). Los ensayos para las primeras 12 semanas después de la prueba de provocación tenían un nivel de detección de 1000 copias de ARN por milímetro de plasma. Los animales con cargas inferiores a 1000 se puntuaron con una carga de 500. Durante las semanas 16 y 20, el nivel de detección fue de 300 copias de ARN por milímetro. Los animales con niveles de virus inferiores a 300 se puntuaron con 300.

Figura 3. Las repuestas de las células T post provocación en grupos vacunados y control. (A) células tetrámero^{+} temporales (línea discontinua) y cargas virales (línea continua). (B) ensayos de citoquinas intracelulares para la producción de IFN-\gamma en respuesta frente a la estimulación con péptidos Gag-CM9 dos semanas después de la provocación. Este ensayo ex vivo permite la evaluación del estatus funcional del pico de las células tetrámero^{+} representadas en la Figura 1A. (C) El ensayo de proliferación a las doce semanas de la provocación. Se utilizaron para estimulación Gag-Pol-Env (barras en blanco) y Gag-Pol (barras con entramado) producidas por transfección transitoria. Los sobrenadantes de los cultivos que simulan transfección sirvieron como antígeno control. Los índices de estimulación son el crecimiento de los cultivos en presencia de antígenos virales dividido por el crecimiento de los cultivos en presencia de antígeno simulado.

Figura 4. La histomorfología del nódulo linfático a las doce semanas de la provocación. (A) El nódulo linfático típico de un macaco vacunado que muestra evidencia de una hiperplasia caracterizada por la presencia de numerosos folículos secundarios con centros germinales expandidos y zonas discretas oscuras y claras. (B) Nódulo linfático típico de un animal control infectado que muestra una depleción folicular y una atrofia linfocelular paracortical. (C) Un nódulo linfático representativo de macacos del mismo grupo de edad, no infectados que presentan centros germinales no reactivos. (D) El porcentaje del área total de nódulos linfáticos ocupada por los centros terminales se midió para dar un indicador no específico de la hiperplasia folicular. Los datos para los controles no infectados son para macacos rhesus de cuatro grupos de edad.

Figura 5. Respuestas temporales de anticuerpos. Se determinaron los microgramos totales de anticuerpos Gag (A) o Env (B) con ELISA. Los títulos de los anticuerpos neutralizantes para VIHS-89,6 (C) y VIHS-89,6P (D) se determinaron con células asesinas MT-2 y tinción con rojo neutro. (D.C. Montefiori el al 1988 J Clin Microbiol 26:231). Los títulos son recíprocos con la dilución del suero dando un 50% de neutralización de los virus indicados que crecen en PCBM de humanos. Los símbolos para los animales son los mismos que en la Figura 2.

Figura 6. Células T específicas para el tetrámero Gag-CM9-Mamu-A*01 en macacos Mamu-A*01 vacunados y control en varios momentos antes de la provocación y a las dos semanas de la provocación. El número de la esquina derecha superior de cada trama representa la frecuencia de las células T CD8 específicas para el tetrámero como un porcentaje % del total de células T CD8. Los números encima de cada columna de datos FAC designan animales individuales.

Figura A. Mapa y secuencia del plásmido vector de transferencia pLW-48.

Figura B. Secuencias del plásmido vector de transferencia pLW-48, del promotor Psy II (que controla la expresión de la envoltura ADA), envoltura ADA truncada, promotor PmH5 (que controla la expresión de pol gag de HXB2) y gag pol de HXB2 (con mutaciones seguras, integrasa \Delta).

Figura C. Vector plásmidico de transferencia pLW-48 y preparación del virus recombinante MVA MVA/IHV 48.

Figura D. Un gag pol de la estirpe B.

Figura E. Secuencia de un nuevo promotor Psyn II.

Descripción detallada de la realización preferente Virus recombinante MVA

El virus vaccinia, un miembro del género Orthopoxvirus de la familia de los Poxviridae, se utilizó como vacuna de virus vivo para inmunizar contra la enfermedad de la viruela humana. La vacunación mundial exitosa con el virus vaccinia culminó con la erradicación del virus de la viruela, el agente causante de la viruela. (The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication. History of Public Health, No 4, Ginebra: Organización Mundial de la Salud, 1980). Desde la declaración de la OMS, la vacunación universal ha sido interrumpida excepto para la población con alto riesgo de infecciones con poxvirus (p. ej. trabajadores de laboratorio).

Mas recientemente, el virus vaccinia se ha utilizado también para construir vectores virales para expresión de genes recombinantes y para el uso potencial como vacunas recombinantes de virus vivos (Mackett, M. et al. 1982 PNAS EE.UU. 79:7415-7419; Smith, G.L. et al. 1984 Biotech Genet Engin Rev 2:282-407). Esto implica secuencias de ADN (genes) que codifican antígenos extraños que son introducidos, con la ayuda de técnicas de recombinación de ADN, en el genoma del los virus vaccinia. Si el gen se integra en un lugar del ADN viral que no es esencial para el ciclo vital del virus, es posible que el nuevo virus vaccinia recombinante producido sea infeccioso, es decir capaz de infectar células extrañas y por lo tanto expresar la secuencia de ADN integrada (Solicitudes de Patentes Europeas Nº 83.286 y Nº 110.385). Los virus vaccinia recombinantes preparados de esta manera pueden ser utilizados, por un lado como vacunas de virus vivos para la profilaxis de enfermedades infecciosas, por otro lado para la preparación de proteínas heterólogas en células eucariotas.

Para las aplicaciones como vectores los riesgos para la salud se disminuirían utilizando una cepa del virus vaccinia altamente atenuada. Se desarrollaron varias de estas cepas del virus vaccinia para evitar los efectos secundarios no deseados de la vacunación contra la viruela. De este modo, se han generado los virus vaccinia Ankara modificados (MVA) mediante pases seriados de larga duración de la cepa Ankara del virus vaccinia (CVA) en fibroblastos embrionarios de pollo (para revisión véase Mayr, A. et al. 1975 Infection 3:6-14; Patente Suiza Nº 568.392). El virus MVA esta disponible públicamente en la Colección Americana de cultivos Tipo como ATCC n1 Vr-1508. El virus MVA se distingue por su gran atenuación, es decir su virulencia disminuida y su capacidad para replicar en células de primates manteniendo una buena inmunogenicidad. Se ha analizado el virus MVA para determinar alteraciones en el genoma en relación con la cepa parental CVA. Se han identificado 6 deleciones mayores del ADN genómico (deleción I, II, III, IV, V, y VI) en total 31.000 pares de bases (Meyer, H. et al. 1991 J gen Virol 72:1031-1038). El virus MVA resultante llegó a estar fuertemente restringido a células de aves como células huéspedes.

Además, MVA se caracteriza por su atenuación extrema. Cuando se probó en varios modelos animales, MVA resultó ser avirulento incluso en animales inmunodeprimidos. Aún más importante, se han demostrado las excelentes propiedades de la cepa MVA en ensayos clínicos extensos (Mayr A. et al. 1978 Zentralbl Bakteriol [B] 167:375-390; Stickl et al. 1974 Dtsch Med Wschr 99:2386-2393). Durante estos estudios en aproximadamente 120.000 seres humanos, incluyendo pacientes de alto riesgo, no se asociaron efectos secundarios con el uso de la vacuna
de MVA.

Resultó que la replicación de MVA en seres humanos se bloqueaba al final de la infección evitando el ensamblaje con viriones infecciosos maduros. Sin embargo MVA fue capaz de expresar genes virales y recombinantes a niveles altos incluso en células no permisivas y se propuso para servir como un vector de expresión génica eficaz y excepcionalmente seguro (Sutter, G. and Moss, B. 1992 PNAS EE.EE 89:10847-10851). Adicionalmente, se establecieron nuevas vacunas de vectores vaccinia sobre la base de MVA que tiene secuencias extrañas de ADN insertadas en el sitio de deleción III dentro del genoma de MVA. (Sutter, G. et al. 1994 Vaccine 12:1032-1040).

Los virus vaccinia MVA recombinantes se pueden preparar como se establece a continuación. Una construcción de ADN que contiene una secuencia de ADN que codifica un polipéptido extraño flanqueado por secuencias de ADN de MVA adyacentes a una deleción natural, p. ej. la deleción III, u otros sitios no esenciales, dentro del genoma de MVA, se introduce en células infectadas con MVA, para permitir una recombinación homóloga. Una vez que la construcción de ADN se ha introducido en la célula eucariota y que el DNA extraño se ha recombinado con el ADN viral, es posible aislar el virus vaccinia recombinante deseado de manera conocida, preferiblemente con la ayuda de un marcador. La construcción de ADN que se va a insertar puede ser lineal o circular. Se prefiere un plásmido o el producto de una reacción en cadena de la polimerasa. La construcción de ADN contiene secuencias que flanquean los lados izquierdo y derecho de una deleción natural, p. ej., la deleción III, dentro del genoma de MVA. La secuencia de ADN extraña se inserta entre las secuencias que flanquean la deleción natural. Para la expresión de una secuencia de ADN o de un gen, se necesita que estén presentes en el ADN secuencias reguladoras, que se requieren para la transcripción del gen. Tales secuencias reguladoras (denominadas promotores) son conocidas por el experto en la técnica, e incluyen por ejemplo las del gen de 11kDa de vaccinia descritas en EP-A-198,328, y las del gen de 7,5 kDA (EP-A-119.385). La construcción de ADN puede ser introducida en las células MVA infectadas por transfección, por ejemplo por medio de precipitación con fosfato de calcio (Graham et al. 1973 Virol 52:456-467; Wigler et al. 1979 Cell 16:777-785) mediante electroporación (Neuman et al 1982 EMBO J 1:841-845), por medio de microinyección (Graessmann et al. 1983 Meth Enzymol 101:482-492), por medio de liposomas (Straubinger et al. 1983 Meth Enzimol 101:512-527) por medio de esferoplastos (Schaffner 1980 PNAS EE.UU. 77:2163-2167) o por medio de otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.

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VIHs y su replicación

Es reconocido que el agente etiológico de síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es un retrovirus que exhibe características típicas del género lentivirus, denominado virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Las relaciones filogenéticas de los lentivirus humanos se indican en la Figura I. El VIH-2 está más estrechamente relacionado con el VIS _{smm}, un virus aislado del mono magabeye gris salvaje, que con el VIH-1. Actualmente se cree que el VIH-2 representa una transmisión zoonótica del VIS _{smm} al hombre. Una serie de aislados de lentivirus de chimpancés en cautividad, designados V1S_{cpz} son parientes genéticamente cercanos al VIH-1.

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Los primeros análisis filogenéticos de aislados de VIH se centraron en muestras de Europa/América del Norte y África: se identificaron grupos discretos de virus de estas dos zonas del mundo. Posteriormente se definieron y clasificaron los distintos subtipos genéticos o estirpes de VIH-1 en tres grupos.: M (cepas principales); O (cepas externas); y N (no perteneciente a los grupos M ni O) (Fig. II). El grupo M de VIH, que incluye mas del 95% de los aislados globales del virus, consiste en hasta ocho estirpes diferenciadas (A, B, C, D, F, G, H y J), en base a la secuencia completa de los genomas virales. Se han recuperado miembros del grupo O del VIH-1 de individuos que viven en Camerún, Gabón, y Guinea Ecuatorial; sus genomas comparten una identidad inferior al 50% en la secuencia de nucleótidos con los virus del grupo M. Las cepas de VIH-1 del grupo N descubiertas más recientemente se han identificado en camerunenses infectados, no reaccionan serologicamente en ensayos estándar con virus completos por inmunoabsor-
ción ligada a enzimas (ELISA), sin embargo son detectables fácilmente por análisis Western Blot convencionales.

La mayoría de los conocimientos actuales sobre la variación genética del VIH-1 proceden de estudios de virus del grupo M de origen geográfico diverso. Los datos recogidos durante la década pasada indican que la población de VIH-1 presente en un individuo infectado puede variar de 6% a 10% en la secuencia de nucleótidos. Los aislados de VIH-1 dentro de una misma estirpe pueden presentar distancias de nucleótidos en las secuencias codificantes de un 15% en gag y de hasta un 30% en gp120. La variación genética entre estirpes puede variar entre un 30% y un 40% dependiendo del gen analizado.

Todos los subtipos M del grupo VIH-1 se pueden encontrar en África. Los virus de la estirpe A son los más divergentes genéticamente y fueron el subtipo más común en África al principio de la epidemia. Con la rápida propagación del VIH-1 al sur de África durante mediados y finales de los años 1990, los virus de la estirpe C han llegado a ser el subtipo dominante y ahora representan el 48% de las infecciones de VIH-1 en todo el mundo. Los virus de la estirpe B, el subtipo de VIH-1 mas extensamente estudiado, sigue siendo el aislado mas frecuente en Europa y América del Norte.

Las altas tasas de recombinación genética son el sello de los retrovirus. Inicialmente se creía no era probable que se produjesen infecciones simultáneas por cepas de virus genéticamente diferentes en los individuos con riesgo de VIH-1. En 1995 sin embargo, se hizo evidente que una fracción significativa de la diversidad global del grupo M del VIH-1 incluía recombinantes virales entre estirpes. Ahora se considera que los recombinantes de VIH-1 se pueden encontrar en zonas geográficas como África, América del Sur, y el Sudeste Asiático, donde coexisten múltiples subtipos de VIH-1 y que pueden explicar más del 10% de las cepas de VIH-1 circulantes. Molecularmente, los genomas de estos virus recombinantes recuerdan a mosaicos desorganizados, con segmentos de subtipos diferentes de VIH-1 yuxtapuestos, que reflejan los episodios de cruzamiento que contribuyen a su generación. La mayoría de los recombinantes de VIH-1 han surgido en África y una mayoría contienen segmentos derivados originalmente de los virus de la estirpe A. En Tailandia, por ejemplo, la composición de la cepa circulante predominante consiste en gag de la estirpe A más un segmento del gen pol y un gen env de la estirpe. A causa de que el gen env de la estirpe E de la cepa Thai de VIH-1 está estrechamente relacionado con env de la estirpe E presente en los aislados de virus procedentes de la República Centroafricana, se cree que el suceso de recombinación original ocurrió en África, con la introducción posterior de un virus descendiente en Tailandia. Curiosamente no se ha presentado hasta la fecha ningún aislado completo del subtipo E de VIH-1 (es decir, con genes gag, pol y env del subtipo E).

El descubrimiento de que los receptores de quimioquina \alpha y \beta funcionan como correceptores para la fusión de virus y la entrada en células susceptibles CD4^{+} ha llevado a un esquema de clasificación revisado para el VIH-1 (Fig. III). Los aislados pueden agruparse ahora en base a la utilización de los receptores de quimioquina en los ensayos de fusión en los que VIH-1 gp120 y las proteínas correceptoras de CD4^{+} se expresan en células separadas. Como se indica en la Figura III, los aislados de VIH-1 que utilizan receptores CXCR4 (denominados ahora virus x4) son normalmente cepas inductoras de sincitio (SI) de las líneas celulares T, (TLC)-trópicas, mientras que los que utilizan exclusivamente el receptor CCR5 (virus R5) son predominantemente no inductores sincitios (NSI) y macrófago (M)-trópicos. La cepas dual-trópicas R5/X4, que pueden incluir la mayoría de los aislados de pacientes y que exhiben una serie continua de fenotipos trópicos, son frecuentemente SI.

Como es el caso de todos los retrovirus de replicación competente, los tres productos primarios de la traducción de VIH-1, todos codificantes de proteínas estructurales, se sintetizan inicialmente como precursores de poliproteínas, las cuales son posteriormente procesadas por proteasas virales o celulares a proteínas maduras asociadas a partículas (Fig. IV). El precursor de 55-kd de Gag, Pr55^{Gag}, se escinde en las proteínas de la matriz (MA), cápsida (CA), nucleocápsida (NC) y proteína P6. La autocatálisis de la poliproteína Gag-Pol de 160-kd, Pr160^{Gag-Pol}, da lugar a las proteínas proteasa (PR), transcriptasa inversa heterodimerica (RT), e integrasa (IN), mientras que la digestión proteolítica con una enzima/s celular/es convierte el precursor glicosilado de 160-Kd de Env, gp160, en los productos de escisión de superficie gp120 (SU) y de transmembrana (TM) gp41. Las seis proteínas codificadas por VIH-1 restantes (Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu, y Nef) son los productos primarios de la traducción de los ARNm cortados y empalmados.

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Gag

Las proteínas Gag del VIH, así como las de otros retrovirus, son necesarias y suficientes para la formación de partículas similares a virus no infecciosas. Las proteínas retrovirales Gag se sintetizan generalmente como precursores de proteínas; el precursor de Gag de VIH-1 se ha denominado Pr55^{Gag} en base a su masa molecular aparente. Como se ha señalado anteriormente, el ARNm para Pr55^{Gag} es el transcrito de 9,2-kb cortado y empalmado (Fig. IV) que requiere a Rev para su expresión en el citoplasma. Cuando el ORF de pol está presente, la proteasa viral (PR) escinde a Pr55^{Gag} durante o poco después de su gemación de la célula para generar las proteínas de Gag maduras p17 (MA), p24 (CA), p7 (NC), y p6 (véase Figura. IV). En el virión, MA se localiza inmediatamente dentro de la bicapa lipídica de la envoltura viral, CA forma la porción exterior de la estructura central en forma de cono en el centro de la partícula, y la NC está presente en la parte central en un complejo de la ribonucleoproteína con el genoma del ARN viral (Fig. V).

El precursor Pr55^{Gag} de VIH oligomeriza después de la traducción y se dirige a la membrana plasmática, donde se ensamblan partículas de tamaño y densidad suficiente como para ser visibles por ME. La formación por Pr55^{Gag} de partículas similares a los virus es un proceso de auto ensamblaje, con interacciones Gag-Gag críticas que tienen lugar entre los múltiples dominios a lo largo del precursor de Gag. El ensamblaje de partículas similares a los virus no requiere la participación del ARN genómico (aunque la presencia de ácido nucleico parece ser esencial), ni de las enzimas codificadas por pol, ni de las glicoproteínas Env, sino que la producción de viriones infecciosos requiere la encapsidación del genoma del ARN viral y la incorporación de las glicoproteínas Env y del precursor Pr160^{Gag-Pol} de la poliproteína de Gag-pol.

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Pol

Aguas abajo de gag se encuentra la región mas altamente conservada, el gen pol que codifica tres enzimas: PR, RT e IN (véase Fig. IV). RT e IN se requieren, respectivamente, para la transcripción inversa del genoma del ARN viral a una copia de ADN de doble hebra, y para la integración del ADN viral en el cromosoma de la célula hospedadora. PR juega un papel crítico posteriormente en el ciclo vital mediando en la producción de viriones infecciosos maduros. Los productos del gen pol se derivan por escisión enzimática de una proteína de fusión de 160-kd de Gag-Pol., denominada Pr160^{Gag-Pol}. Esta proteína de fusión se produce por un mecanismo de cambio de marco ribosómico durante la traducción de Pr55^{Gag} (véase Fig. IV). El mecanismo de cambio de marco para la expresión de Gag-Pol, utilizado también por muchos otros retrovirus, asegura que las proteínas derivadas de pol se expresen a niveles bajos, aproximadamente del 5% al 10% que las de gag. Al igual que Pr55^{Gag}, el extremo N-terminal de Pr160^{Gag-Pol} se miristila y se dirige a la membrana plasmática.

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Proteasa

Los estudios tempranos de radio marcado y seguimiento efectuados con retrovirus indicaron claramente que las proteínas retrovirales Gag se sintetizan inicialmente como precursores de poliproteínas que se escinden para generar productos más pequeños. Los estudios posteriores demostraron que la función de procesado se lleva a cabo por una enzima viral en lugar de por una enzima celular, y que la digestión proteolítica de los precursores de Gag y Gag-Pol es esencial para la infectividad del virus. El análisis de secuencia de las PR retrovirales indicaba que están relacionadas con proteasas "aspárticas" celulares como pepsina y renina. Al igual que estas enzimas celulares, las PR retrovirales utilizan dos restos de Asp añadidos en el sitio activo para coordinar con una molécula de agua que cataliza la hidrólisis de un péptido unido a la proteína diana. A diferencia de las proteasas aspárticas celulares, que funcionan como seudo dímeros, (utilizando dos pliegues de la misma molécula para generar el sitio activo), las PR retrovirales funcionan como verdaderos dímeros. Los datos de la cristalografía de rayos X de las PR de VIH-1 indican que los dos monómeros se mantienen juntos en parte mediante una lámina-\beta antiparalela de cuatro cadenas derivada de ambos extremos N- y C-terminales de cada monómero. El sitio de unión del substrato se localiza dentro de una surco formado entre los dos monómeros. Como sus homólogos celulares, los dímeros de PR de VIH contienen "hojas" que sobresalen del sitio de unión y que pueden estabilizar el substrato en el interior del surco; los restos de Asp del sitio activo se encuentran en el centro del dímero. Curiosamente aunque se observa alguna homología limitada en los aminoácidos que se encuentran alrededor de los restos del sitio activo, la secuencia primaria de las PR de retrovirales es altamente divergente, aunque sus estructuras son notablemente similares.

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Transcriptasa inversa

Por definición, los retrovirus poseen la habilidad de convertir sus genomas ARN de hebra sencilla en ADN de doble hebra durante las primeras fases del proceso de infección. La enzima que cataliza esta reacción es la TR, conjuntamente con su actividad ARNsaH (endonucleasa) asociada. Las RTS retrovirales tienen tres actividades enzimáticas: (a) polimerización de ADN dirigida por ARN (para la síntesis de hebras de ADN complementarias), (b) actividad ARNasaH (para la degradación del cebador de ARNt y del ARN genómico presente en los intermediarios híbridos ADN-ARN), (c) polimerización de ADN dirigida por ADN (para la síntesis de la hebra segunda o sentido).

La holoenzima RT madura de VIH-1 es un heterodímero de subunidades de 66 y 51 kd. La subunidad de 51-kd (p51) se deriva de la subunidad de 66-kd (p66) por eliminación proteolítica del dominio ARNsaH de 15-kd del C terminal de P66 por PR (véase Fig. IV). La estructura cristalina de RT de VIH-1 revela un pliegue altamente asimétrico en el que las orientaciones de las subunidades p66 y p51 difieren substancialmente. La subunidad p66 puede visualizarse como la subunidad derecha, con el sitio activo de la polimerasa en la palma, y un surco profundo que se une al molde formado por los subdominios palma, dedos y pulgar. El dominio polimerasa se une a la ARNsaH por un subdominio de conexión. El sitio activo, localizado en la palma, contiene tres restos Asp críticos (110, 185 y 186) muy próximos, y dos iones Mg^{2+} coordinados. La mutación de estos restos Asp anula la actividad polimerizante de TR. La orientación de los tres restos Asp del sitio activo es similar a la que se observaba en otras ADN polimerasas (p. ej., el fragmento Klenow de la pol I de E. coli). La subunidad p51 parece ser rígida y no forma un surco polimerizante; los Asp 110, 185 y 186 de esta subunidad están enterrados dentro de la molécula. Aproximadamente 18 pares de bases del dúplex cebador-molde se encuentran en el surco de unión del ácido nucleico, extendiéndose desde el sitio activo de la polimerasa hasta el domino ARNsaH.

En la estructura RT-cebador-molde-dNTP, la presencia de un didesoxinucleótido en el extremo 3' del cebador permite la visualización del complejo catalítico atrapado justo antes del ataque del dNTP entrante. La comparación con la estructuras obtenidas previamente sugiere un modelo donde los dedos se cierran para atrapar al molde y al dNTP antes del ataque nucleofílico del OH-3' del cebador del dNTP entrante. Después de la adición del dNTP entrante a la cadena que crece, se ha propuesto que los dedos adoptan una configuración mas abierta, liberando así el pirofosfato y permitiendo que la RT se una al dNTP siguiente. La estructura de la ARNasaH del VIH-1 se ha determinado también por cristalografía de rayos-X; este dominio presenta un pliegue global similar al ARNasaH de E. coli.

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Integración

Una característica que distingue la replicación de los retrovirus es la inserción de una copia de ADN de genoma viral en el cromosoma de la célula hospedadora siguiendo la transcripción inversa. EL ADN viral integrado (el provirus) sirve como molde para la síntesis de ARN virales y se mantiene como parte del genoma de la célula hospedadora durante toda la vida de la célula infectada. Los retrovirales mutantes deficientes en la habilidad de integrar generalmente fallan al establecer una infección productiva.

La integración del ADN viral se cataliza por integrasa, una proteína de 32-kd generada por la escisión mediada por PR de la porción del C-terminal de la poliproteína Gag-Pol de VIH-1(véase Fig. IV).

Las proteínas retrovirales IN se componen de tres dominios estructural y funcionalmente distintos: Un dominio N-terminal que contiene un dedo de zinc, un dominio central, y un dominio C-terminal relativamente no conservado. Debido a su baja solubilidad, no ha sido posible todavía cristalizar la proteína completa de 288-amino ácidos de VIH-1. Sin embargo, la estructura de todos los tres dominios se ha resuelto independientemente por cristalografía de rayos x o por métodos de RMN. La estructura del cristal del dominio central de la IN del virus del sarcoma de las aves ha sido también determinada. El domino N-terminal (restos 1-55), cuya estructura se ha resuelto por espectroscopia de RMN, se compone de cuatro hélices con un zinc coordinado por los aminoácidos His-12, His-16, Cys-40, y Cys-43. La estructura del dominio N-terminal recuerda a las proteínas helicoidales de unión a ADN que contienen el denominado motivo de hélice-vuelta-hélice; sin embargo, en la estructura del VIH-1 este motivo contribuye a la formación del dímero. Inicialmente, la baja solubilidad obstaculizó los esfuerzos para resolver la estructura del dominio central. Sin embargo, los intentos de cristalografía tuvieron éxito cuando se observó que el cambio de Phe a Lys en el resto 185 de IN incrementaba considerablemente la solubilidad sin perturbar la actividad catalítica in vitro. Cada monómero del dominio central de IN del VIH-1 (restos 50 a 212 de IN) se compone de \beta-láminas de cinco hebras flanqueadas por hélices; esta estructura se parece sorprendentemente a otras polinucleotidiltransferasas incluyendo ARNasaH y la transposasa del bacteriófago MuA. Tres restos altamente conservados se encuentran en posiciones análogas en otra polinuclotidiltransferasas; en las IN de VIH-1 estos son el Asp-64, ASp-116 y Glu-152, el denominado motivo D,D-35-E. Las mutaciones en estas posiciones bloquean la función de IN en VIH-1 tanto in vivo como in vitro. La estrecha proximidad de estos tres aminoácidos en la estructura del cristal tanto en el virus del sarcoma de las aves como en los dominios centrales del VIH-1 apoya la hipótesis de que estos restos juegan un papel central en la catálisis de reacción de transferencia de polinucleotidos que es esencial en el proceso de integración. El domino C-terminal, cuya estructura se ha resuelto por métodos de RMN, adopta una topología de plegado barril-\beta de cinco hebras que recuerda al dominio de homología Scr 3 (SH3\cdot). Recientemente, se han resuelto las estructuras de rayos X de VIS y de fragmentos de proteínas IN del virus del sarcoma de Rous que abarcan tanto los dominios central como C-terminal.

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Env

Las glicoproteínas Env de VIH juegan un papel importante en el ciclo de la vida del virus. Contienen los determinantes que interaccionan con el correceptor y receptor CD4, y catalizan la reacción de fusión entre la bicapa lipídica de la envoltura del virus y la membrana plasmática de la célula hospedadora. Además, las glicoproteínas Env de VIH contienen los epítopos que provocan las respuestas inmunes que son importantes tanto desde las perspectivas de diagnostico como de desarrollo de vacunas.

Las glicoproteínas Env de VIH se sintetizan a partir del ARNm bicistrónico de 4,3-kb de Vpu/Env separado y empalmado (véase Fig. IV); la traducción ocurre en los ribosomas asociados con el retículo endoplásmico rugoso (RE). El precursor de la poliproteína de 160-kd (gp160) es una proteína integral de la membrana que está anclada en las membranas celulares por una señal hidrófoba de parada-transferencia en el dominio destinada a ser la glicoproteína Env madura de TM, gp41 (Fig. VI). La gp160 se glicosila cotraduccionalmente, forma enlaces disulfuro, y se somete a la oligomerización en el RE. La forma oligomérica predominante parece ser un trímero, aunque también se han observado dímeros y tetrámeros. La Gp160 se transporta al Golgi, donde, como otras proteínas precursoras de la envoltura retroviral, es cortada proteoliticamente por enzimas celulares hasta obtener la glicoproteína gp120 madura de SU y la glicoproteína gp41 de TM (véase Fig. VI). La enzima celular responsable de la escisión de los precursores Env de los retrovirales siguiendo un motivo altamente conservado Lys/Arg-X-Lys/Arg-Arg es la furina o una proteasa similar a la furina, aunque también otras enzimas pueden catalizar también el procesado de gp160. La escisión de gp160 es necesaria para la actividad de fusión inducida por Env y para la infectividad del virus. Con posterioridad a la escisión de gp160, gp120 y gp141 forman una asociación no covalente que es crítica para el transporte del complejo Env desde el Golgi a la superficie de la célula. La interacción gp120-gp41 es bastante débil y una cantidad importante de gp120 se elimina de la superficie de las células que expresan Env.

El complejo de glicoproteína Env de VIH, en particular el dominio SU (gp120), está fuertemente glicosilado; aproximadamente la mitad de la masa molecular de gp160 se compone de cadenas laterales de oligosacáridos. Durante el transporte de Env desde su lugar de síntesis en el RE a la membrana plasmática, muchas de la cadenas laterales se modifican por la adición de azucares complejos. Las numerosas cadenas laterales de oligosacáridos forman lo que podría imaginarse como una nube de azúcar que oculta gran parte de gp120 al reconocimiento inmune del hospedador. Como se indica en la Fig. VI, gp120 contiene dominios conservados (C_{1} a C_{5}) y variables (V_{1} a V_{5}) intercalados. Los restos Cys presentes en las gp120s de diferentes aislados están altamente conservadas y forman enlaces disulfuro que unen las cuatro primeras regiones variables en grandes bucles.

Una función primaria de las glicoproteínas Env virales es promover una reacción de fusión de membrana entre las bicapas lipídicas de las envolturas virales y las membranas de las células hospedadoras. Este episodio de fusión de membrana permite que el núcleo viral consiga entrar en el citoplasma de la célula hospedadora. Una serie de regiones tanto en gp120 como en gp41 han estado implicadas, directa o indirectamente, en la fusión de membrana mediada por Env. Los estudios de la proteína hemaglutinina HA_{2} de los ortomyxovirus y de la proteína F de los paramixovirus indican que el dominio altamente hidróbofo en el extremo N-terminal de esta proteína, denominado el péptido fusión, juega un papel critico en la fusión de la membrana. El análisis de las mutaciones demostró que un dominio análogo estaba localizado en el extremo N-terminal de las glicoproteínas de VIH-1, VIH2, y VIS (véase Fig. VI). Las substituciones no hidrófobas dentro de esta región de gp41 reducen o bloquean en gran medida la formación del sincitio y tienen como resultado la producción de una progenie de viriones no infecciosa. El C-terminal del péptido de fusión gp41 se compone de dos dominios helicoidales anfipáticos (véase Fig. VI) que juegan un papel central en la fusión de la membrana. Las mutaciones en la hélice N-terminal (denominada hélice N), que contiene un motivo de héptada repetitiva tipo cremallera de Leu, deterioran la infectividad y la actividad de fusión de la membrana, y los péptidos derivados de esas secuencias exhiben una actividad antiviral potente en el cultivo. La estructura del ectodominio de gp41 de VIH-1 y de VIS, los dos motivos helicoidales en particular, ha sido el centro de los análisis estructurales en los últimos años. La estructuras se determinaron por cristalografía de rayos X o espectroscopia RMN bien para las proteínas de fusión que contienen dominios helicoidales, para una mezcla de los péptidos derivada de hélices C- y N-, o en el caso de la estructura de VIS, para la secuencia intacta del ectodominio de gp41 desde el resto 27 al 149. Estos estudios obtuvieron fundamentalmente estructuras diméricas similares, en las que los dos dominios helicoidales se empaquetan de un modo antiparalelo para generar un empaquetamiento de seis hélices. Las hélices-N forman una espiral enrollada en el centro del empaquetamiento, con las hélices-C empaquetadas dentro de los surcos hidrófobos de la parte exterior.

En los pasos que conducen a la fusión de la membrana la unión de CD4 induce cambios conformacionales en Env que facilitan la unión de correceptor. Después de la formación de un complejo ternario gp120/CD4/correceptor, gp41 adopta una conformación hipotética que permite que el péptido de fusión se inserte en la bicapa lipídica diana. La formación del paquete de seis hélices de gp41 (que implica interacciones antiparalelas entre las hélices C y N de Gp41) reúne las membranas virales y celulares y se lleva a cabo la fusión de las membranas.

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Uso de virus recombinantes VMA para estimular la respuesta inmune de las células CD+8

La presente invención se refiere a la generación de una respuesta inmune de las células T CD8^{+} frente a un antígeno y también a provocar la respuesta de los anticuerpos. Más concretamente, la presente invención se refiere a regímenes de inmunización inducción/potenciación (prime/boost) en los que la respuesta inmune inducida por la administración de una composición inductora se estimula mediante la administración de una composición potenciadora. La presente invención se basa en la demostración experimental de los inventores de que el estímulo eficaz se puede conseguir utilizando vectores modificados del virus vaccinia Ankara (MVA), después de la estimulación con cualquiera de una variedad de diferentes tipos de composiciones estimuladoras incluida la del propio MVA recombinante.

Un componente importante de protección de la respuesta inmune frente a gran número de patógenos es la mediada por los linfocitos T del tipo CD8^{+}, también conocidos como linfocitos T citotóxicos (CLT). Una función importante de las células T CD8^{+} es la secreción de interferón gamma (IFN\gamma), y esto proporciona una medida de la respuesta inmune de las células T CD8^{+}. Un segundo componente de la respuesta inmune es el anticuerpo dirigido a las proteínas del patógeno.

La presente invención emplea un MVA, que tal y como muestran los experimentos que se indican a continuación, ha resultado ser un medio eficaz para proporcionar una potenciación de la respuesta inmune de las células T CD8^{+} inducida por antígeno utilizando cualquiera de una variedad de diferentes composiciones inductoras y también despertando una respuesta de los anticuerpos.

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Es digno de mención que los trabajos experimentales descritos a continuación indican que el uso de las realizaciones de la presente invención permite que los virus recombinantes MVA que expresan un antígeno VIH potencien una respuesta inmune de las células T CD8^{+} estimulada por una vacuna de ADN y despierten también provocando una respuesta de los anticuerpos. Se descubrió que el MVA induce la respuesta inmune de las células T CD8^{+} después de inmunización intradérmica, intramuscular o mucosa. El MVA recombinante también ha demostrado que induce una respuesta inmune potenciada por una o mas inoculaciones de MVA recombinante.

Los primates no humanos inmunizados con un plásmido de ADN y potenciados con MVA estaban protegidos eficazmente frente a la provocación intramucosa con virus vivo. Ventajosamente, los inventores encontraron que se puede emplear un régimen de vacunación utilizando inmunización intradérmica, intramuscular o mucosa tanto para la inducción como para la potenciación, constituyendo un régimen general de inmunización adecuado para inducir las células T CD8^{+} y también para despertar una respuesta de los anticuerpos, p. ej. en humanos.

La presente invención emplea en varios aspectos y realizaciones un vector de MVA que codifica un antígeno de VIH como se define en las reivindicaciones anexas para la potenciación de la respuesta inmune de las células CD8^{+} frente a un antígeno inductor por la administración previa de un ácido nucleico que codifica el antígeno y también despertando una respuesta de anticuerpos.

Un aspecto general de la presente invención proporciona el uso de un vector de MVA como se define en las reivindicaciones anexas para potenciar una respuesta inmune celular frente a un antígeno de VIH y también para despertar una respuesta de anticuerpos.

Un aspecto de la presente invención proporciona el uso de un vector de MVA que incluye un ácido nucleico que codifica el antígeno que se define en las reivindicaciones anexas unido operativamente a secuencias reguladoras para la producción del antígeno en el individuo por expresión del ácido nucleico, con lo que una respuesta inmune de la célula T CD8^{+} frente al antígeno previamente inducida en el individuo, se potencia para la preparación de una vacuna para potenciar una respuesta inmune de las células T CD8^{+} frente a un antígeno VIH en un individuo y también despertar una respuesta de los anticuerpos.

Se puede inducir una respuesta inmune a un antígeno de VIH por inmunización con un ADN plasmídico o por infección con un agente infeccioso.

Un aspecto adicional de la invención establece el uso de una composición inductora que comprende el ácido nucleico que codifica el antígeno y una composición potenciadora que comprende un vector de MVA que incluye un ácido nucleico que codifica el antígeno unido operativamente a secuencias reguladoras para la producción del antígeno en un individuo por expresión del ácido nucleico, para la preparación de una vacuna para inducir una respuesta inmune de la célula T CD8^{+} frente a un antígeno VIH en un individuo y también despertar una respuesta de anticuerpos donde la composición inductora se va a administrar antes que la composición potenciadora.

Un aspecto adicional establece el uso de un vector de MVA, como se ha descrito, en la fabricación de un medicamento para administrar a un mamífero para potenciar la respuesta inmune de las células T CD8^{+} frente un antígeno de VIH, y también despertar una respuesta de anticuerpos. Tal medicamento se administra generalmente después de una administración previa de una composición inductora que comprende un ácido nucleico que codifica el antígeno.

La composición inductora puede comprender cualquier vector viral, del tipo del vector del virus vaccinia, tal como una cepa deficiente para la replicación como el virus vaccinia Ankara modificado (MAV) o NYVAC (Tartaglia et al. 1992 Virology 118:217-232), un vector de la viruela aviar del tipo de la viruela de aves de corral o del canario., p. ej. la cepa conocida como ALVAC (Paoletti et al. 1994 Dev Biol Stand 82: 65-69), o un vector de un adenovirus o un vector de virus de la estomatitis vesicular o un vector de alfavirus.

La composición inductora puede comprender el ADN que codifica el antígeno, tal como ADN en la forma de un plásmido circular que no es capaz de replicarse en células de mamíferos. El marcador de selección no será la resistencia a un antibiótico de uso clínico, así por ejemplo la resistencia a la Kanamicina es preferible a la resistencia a la Ampicilina. La expresión del antígeno debe ser dirigida por un promotor que sea activo en células de mamíferos, por ejemplo el promotor precoz inmediato de citomegalovirus (CMV IE).

En realizaciones particulares de diversos aspectos de la presente invención, la administración de una composición inductora va seguida de potenciación con una composición potenciadora, o de una primera y una segunda composiciones potenciadoras, siendo la primera y la segunda composiciones potenciadoras iguales o diferentes una de la otra. Se pueden utilizar aún composiciones potenciadoras adicionales sin apartarse de la presente invención. En una realización, un régimen de inmunización triple emplea ADN, después adenovirus como una primera composición potenciadora, a continuación MVA como segunda composición potenciadora, y a continuación opcionalmente una (tercera) composición potenciadora adicional o composiciones potenciadoras posteriores de uno u otro o ambos vectores iguales o diferentes. Otra opción es ADN, después MVA, después adenovirus, seguido de posteriores administraciones opcionales de uno u otro o de ambos vectores iguales o diferentes.

El antígeno que va a ser codificado en las respectivas composiciones inductora y potenciadora (aunque pueden utilizarse muchas composiciones potenciadoras) no necesita ser idéntico, pero debe compartir al menos un epítopo de la célula T CD8^{+}. El antígeno puede corresponder a un antígeno completo, o a un fragmento del mismo. Pueden utilizarse epítopos peptídicos o cadenas artificiales de los epítopos, cortando más eficazmente la secuencia innecesaria de la proteína en el antígeno y la secuencia codificante en el vector o en los vectores. Se pueden incluir uno o más epítopos adicionales, por ejemplo epítopos que son reconocidos por las células T colaboradoras (helper), especialmente epítopos reconocidos en individuos con tipos de HLA diferentes.

Un antígeno de VIH codificado por un virus MVA recombinante como se define en las reivindicaciones posteriores incluye polipéptidos que tienen actividad inmunogénica despertada por una secuencia de aminoácidos de Env, Gag, Pol, Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu, o Nef de VIH similar a al menos un epítopo de la célula T CD8^{+}. Esta secuencia de aminoácidos corresponde de forma substancial al menos a un fragmento de 10-900 aminoácidos y/o a una secuencia consenso de un Env o Pol de VIH conocido; o al menos a un fragmento de 10-450 aminoácidos y/o a una secuencia consenso de un Gag de VIH conocido; o al menos a un fragmento de 10-100 aminoácidos y/o a una secuencia consenso de un Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu o Nef de VIH conocido.

Aunque se presenta una secuencia completa del precursor Env para su uso en la presente invención, Env se suprime opcionalmente de las subsecuencias. Por ejemplo, los productos de escisión de las regiones de superficie gp120 y de transmembrana gp41 se pueden suprimir.

Aunque se presenta una secuencia completa del precursor de Gag para su uso en la presente invención, Gag se suprime opcionalmente de las subsecuencias. Por ejemplo, se pueden suprimir las regiones de la proteína matriz (p17), las regiones de la proteína de la cápsida (p24), las regiones de la proteína de la nucleocápsida (p7) y las regiones de p6 (péptido C-terminal de la poliproteína Gag).

Aunque se presenta una secuencia completa del precursor Pol para su uso en la presente invención, Pol se suprime opcionalmente de las subsecuencias. Por ejemplo, se pueden suprimir las regiones de la proteína proteasa (p10), las regiones de la proteína transcriptasa inversa (p66/p51), y las regiones de la proteína integrasa (p32).

Estas Env, Gag, o Pol de VIH pueden tener una identidad total de hasta 50% con las secuencias de aminoácidos de las proteínas Env, Gag, o Pol conocidas, del orden de 50-99% de identidad, o cualquier intervalo o valor incluido en el mismo, mientras que provoquen una respuesta inmune frente al menos una cepa de VIH.

El porcentaje de identidad se puede determinar, por ejemplo, comparando la información de la secuencia utilizando el programa de ordenador GAP, versión 6.0, puesto a disposición por el Grupo de Genética Computerizada de la Universidad de Wisconsin (UWGCG). El programa GAP utiliza el método del alineamiento de Needleman y Wunsch (J. Mol Biol 1970 48:443), revisado por Smith y Waterman (Adv Appl Math 1981 2:482). En resumen, el programa GAP define la identidad como el número de símbolos alineados (p. ej. nucleótidos o aminoácidos) idénticos, divididos por el numero total de símbolos en la más corta de dos secuencias. Los parámetros preferidos por defecto para el programa GAP incluyen: (1) Una matriz unitaria de comparación (que contiene un valor 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz ponderada de comparación de Gribskov y Burgues (Nucl Acids Res 1986 14:6745), descrita por Schwartz and Dayhoff (eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, Nacional Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. 1979, pp. 353-358); (2) una penalización de 3,0 para cada diferencia y una penalización de 0,10 para cada símbolo en cada diferencia; y (3) ninguna penalización para las diferencias en los extremos.

En una realización preferida, una Env de la presente invención es una forma variante de por lo menos una proteína de la envoltura de VIH. Preferiblemente, la Env está compuesta por gp120 y los dominios de transmembrana y el ectodominio de gp141 pero carece de parte o de todos los dominios citoplásmicos de gp41.

Las subsecuencias de VIH conocidas ya están disponibles en las bases de datos de secuencias de VIH comerciales e institucionales, como GENBANK, o como publicaciones de compilaciones, como Myers, Vol. I y II, Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, N. Mex. (1993), o http://hiv-web.lanl.gov/.

Las substituciones o inserciones de una Env, Gag o Pol de VIH para obtener una Env, Gag o Pol adicional, codificada por un ácido nucleico para su uso en los virus MVA recombinantes de la presente invención, pueden incluir substituciones o inserciones de por lo menos un resto de aminoácido (p. ej. 1-25 aminoácidos). Como alternativa, se puede eliminar al menos un aminoácido (p. ej. 1-25 aminoácidos) de la secuencia de Env, Gag o Pol de VIH. Preferiblemente, estas substituciones, inserciones o deleciones se identifican en base a sus características de seguridad, niveles de expresión, inmunogenicidad y compatibilidad con tasas altas de replicación de MVA.

Las variaciones en la secuencia de aminoácidos en una Env, Gag o Pol de VIH de la presente invención pueden prepararse p. ej. por mutaciones en el ADN. Estas Env, Gag o Pol de VIH incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones o substituciones de nucleótidos que codifican restos de aminoácidos diferentes en la secuencia de aminoácidos. Obviamente, la mutaciones que se efectuarán en los ácidos nucleicos que codifican Env, Gag o Pol de VIH no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y preferiblemente no crearán dominios complementarios que pudiesen producir estructuras secundarias de ARNm.

El ácido nucleico que codifica las Env, Gag o Pol de VIH de la presente invención puede también prepararse por amplificación o mutagénesis dirigida de nucleótidos en el ADN o ARN que codifica una Env, Gag o Pol y por lo tanto sintetizar o transcribir inversamente el ADN codificante para producir el ADN o el ARN que codifica una Env, Gag o Pol de VIH, sobre la base de las enseñanzas y orientaciones presentadas aquí.

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Los virus MVA recombinantes que expresan las Env, Gag o Pol de VIH de la presente invención, incluyen un grupo limitado de secuencias codificantes de Env, Gag o Pol de VIH como substituciones de nucleótidos que pueden obtenerse rutinariamente por el experto en la técnica, sin experimentación indebida, sobre la base de las enseñanzas y orientaciones presentadas aquí. Para una descripción detallada de la química y estructura de las proteínas, véase Schulz, G.E. et al., 1978 Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, Nueva York, N.Y., y Creighton, T.E., 1993 Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA. Para una presentación sobre substituciones en secuencias de nucleótidos, p. ej. preferencias de codones, véase Ausubel et al. eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publidhing Assoc., Nueva York, N.Y. 1994 en \NAK\NAK A.1.1-A.1.24, y Sambrook, J et al. 1989 Molecular Cloning:A Laboratoty Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. en apéndices C y D.

Por lo tanto, un experto en la técnica, con las enseñanzas y orientaciones presentadas aquí, sabrá como substituir otros restos de aminoácidos en otras posiciones de un ADN o ARN de env, gag o pol de VIH para obtener Env, Gag o Pol de VIH alternativas, incluyendo variantes con substituciones, delecciones o inserciones.

En el vector MVA, las secuencias reguladoras de la expresión del antígeno codificado incluirán promotores de poxvirus naturales, modificados o artificiales. Por "promotor" se entiende una secuencia de nucleótidos a partir de la cual se puede iniciar la transcripción del ADN unido operativamente aguas abajo (es decir, en la dirección 3' de la hebra sentido de un ADN de doble hebra). "Unido operativamente" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, situado adecuadamente y orientado para que se inicie la transcripción desde el promotor. Un ADN unido operativamente a un promotor está "bajo la regulación de la iniciación de la transcripción" del promotor. Se pueden incluir, si es adecuado, otras secuencias reguladoras que incluyan fragmentos de terminación, secuencias de poliadenilación, marcadores genéticos y otras secuencias, de acuerdo con los conocimientos y práctica de un experto en la técnica habitual: véase, por ejemplo, Moss, B. (2001). Poxviridae: the viruses and their replication. En Fields Virology, D.M. Knipe, y P.M. Howley, eds. (Philadelphia, Lippincott Williams & Williams), pp. 2849-2883. Muchas de las técnicas conocidas y de los protocolos de manipulación del ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en las células y expresión génica, y del análisis de proteínas, están descritas detalladamente en Current Protocols in Molecular Biology, 1998 Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons.

Los promotores que se usan en los aspectos y realizaciones de la presente invención deben ser compatibles con los sistemas de expresión de los poxvirus e incluir secuencias naturales, modificadas o artificiales.

Cada una o ambas composiciones inductora y potenciadora pueden incluir un coadyuvante, p. ej un factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) o el ácido nucleico que lo codifica.

La administración de una composición potenciadora se produce generalmente entre 1 y 6 meses aproximadamente después de la administración de la composición inductora, preferiblemente entre 1 y 3 meses aproximadamente.

Preferiblemente, la administración de la composición inductora, de la composición potenciadora, o de ambas composiciones inductora y potenciadora, es inmunización intradérmica, intramuscular o mucosa.

La administración de vacunas de MVA se puede llevar a cabo utilizando una aguja para inyectar una suspensión del virus. Una alternativa es el uso de dispositivos de inyección sin aguja para administrar la suspensión del virus (usando, p. ej. el inyector sin aguja Biojector^{tm}) o un polvo liofilizado resuspendido que contenga la vacuna, proporcionados para fabricar dosis preparadas individualmente que no necesitan almacenaje en frío. Esto seria una gran ventaja para una vacuna que se necesite en las áreas rurales de África.

El MVA es un virus con un excelente historial de seguridad en las inmunizaciones de seres humanos. La generación de virus recombinantes puede producirse fácilmente, y éstos pueden ser fabricados de forma reproducible en grandes cantidades. La administración intradérmica, intramuscular o mucosa del virus MVA recombinante es por lo tanto altamente adecuada en la vacunación profiláctica o terapéutica de seres humanos contra el SIDA que se puede controlar por una respuesta de las células T CD8^{+}.

El individuo puede contraer el SIDA de tal manera que la distribución del antígeno y la generación de una respuesta inmune de las células T CD8^{+} frente al antígeno sea beneficiosa o tenga un efecto terapéutico beneficioso.

Más probablemente, la administración tendrá el fin profiláctico de generar una respuesta inmune contra el VIH o el SIDA antes de la infección o del desarrollo de los síntomas.

Los componentes que se administran según la presente invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable, un vehículo, un tampón, un estabilizante u otros materiales bien conocidos por el experto en la técnica. Tales materiales no deben ser tóxicos y no deberían interferir en la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo o de otro material puede depender de la vía de administración, p. ej. vía intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular o intraperitoneal.

Como se ha señalado, la administración es preferiblemente intradérmica, intramuscular o mucosa.

Puede incluirse una disolución salina fisiológica, dextrosa u otras disoluciones de sacáridos, o glicoles como etilenglicol, propilenglicol, o polietilenglicol.

Para la inyección intravenosa, cutánea, subcutánea, intramuscular o mucosa, o para la inyección en el lugar del dolor, el ingrediente activo estará en forma de una disolución acuosa aceptable por vía parenteral que este libre de pirógenos y tenga el pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica pueden preparar disoluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos como Inyección de Cloruro Sódico, Inyección de Ringer, Inyección de Ringer Lactato. Se pueden incluir conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros coadyuvantes si fuese necesario.

Se puede utilizar una formulación de liberación lenta.

Después de la producción de las partículas de MVA y la formulación opcional de tales partículas en composiciones, las partículas se pueden administrar a un individuo, en particular a seres humanos u otro primate. Se puede administrar a otro mamífero, p. ej. a roedores como el ratón, rata o hámster, cobaya, conejo, oveja, cabra, cerdo, caballo, vaca, burro, perro o gato.

La administración se realiza preferiblemente en una "cantidad efectiva para la profilaxis" o en una "cantidad terapéuticamente efectiva" (según el caso, aunque la profilaxis puede considerarse terapia), siendo ésta la suficiente para obtener beneficio en el individuo. La cantidad real o efectiva administrada, la velocidad y la duración del tratamiento, dependerá de la naturaleza y gravedad de lo que se está tratando. La prescripción del tratamiento, p. ej. las decisiones sobre la dosificación etc., son responsabilidad del médico general o de otros médicos, o en un contexto veterinario del veterinario, y normalmente se tiene en cuenta la enfermedad que se va a tratar, el estado del paciente individual, el lugar de distribución, el método de administración y otros factores conocidos por los profesionales. Se pueden encontrar ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, 1980, Osol, A. (ed.).

En un régimen preferido, el ADN se administra en una dosis de 250 \mug a 2,5 mg/inyección, seguida de MVA en una dosis comprendida de 10^{6} a 10^{9} partículas de virus infeccioso/inyección.

Una composición se puede administrar a solas o en combinación con otros tratamientos, bien simultáneamente o secuencialmente dependiendo de la enfermedad que va ser tratada.

La administración a un mamífero no humano no es necesariamente para uso terapéutico, sino que puede ser para uso en un contexto experimental, por ejemplo en la investigación de mecanismos de respuestas inmunes a un antígeno de interés, p. ej. protección contra VIH o SIDA.

Otros aspectos y realizaciones de la presente invención se consideran obvios para un experto en la materia a la vista de la descripción anterior y de los siguientes ejemplos experimentales, incluidos para ilustrar y no para limitar y referidos a las figuras adjuntas.

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Ejemplo 1 Control de una provocación mucosa y prevención del SIDA por una vacuna de ADN/MVA que libera múltiples proteínas

Se ensayó la capacidad de un proceso de inducción con ADN y potenciación con poxvirus para proteger contra una provocación mucosa altamente patógena. Se utilizó la quimera 89,6 de los virus de la inmunodeficiencia humana y de simios (VIHS-89,6) para la construcción de inmunógenos, y su derivado altamente patógeno, VIHS-89,6P, para la provocación (G.B. Karlsson et al. 1997 J Virol 71: 4218). VIHS-89,6 y VIHS-89,6P no generan anticuerpos neutralizantes cruzados (D.C... Montefiori et al. 1998 J. Vir 72: 3427) y nos permiten dirigir la capacidad del las células T y de los anticuerpos no neutralizantes incrementados por la vacuna para controlar un virus de provocación de la inmunodeficiencia. Se utilizó vaccinia Ankara modificado (MVA) para la construcción de un poxvirus recombinante. MVA ha resultado altamente efectivo en la potenciación de células T CD8 inducidas por ADN y goza de la característica de seguridad de no replicarse eficazmente ni en células humanas o ni de monos (H.L. Robinson et al 2000 AIDS Reviews 2:105).

Para asegurar una respuesta inmune amplia ambos componentes ADN y MVA recombinante (rMVA) de la vacuna expresaron múltiples proteínas del virus de la inmunodeficiencia. El ADN inductor (ADN/89,6) expresó Gag, Pol, Vif, Vpx y Vpr del virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS) y Env, Tat y Rev del virus I de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) a partir de un solo transcrito (R.J. Gorelick et al. 1999 Virology 253:259; M.M. Sauter et al 1996 J Cell Biol 132:795).

Las secuencias de VIHS-89,6 clonadas molecularmente se clonaron en el vector pGA2 utilizando los sitios ClAI y RsrII. Esta clonación eliminó las repeticiones terminales largas (LTRS) y nef. Las secuencias VIHS-89,6 también sufrieron mutaciones en el interior en una región de 12 pares de bases que codifica los primeros cuatro aminoácidos del segundo dedo de zinc de la nucleocápsida. Esta mutación produce virus VIHS no infecciosos (R.J. Gorelick et al. 1999 Virology 253:259). Una mutación de gp41 convierte la tirosina de la posición 710 en cisteína para conseguir una expresión mejor de Env en la membrana plasmática de las células que expresan el ADN. (M.M. Sauter et al 1996 J Cell Biol 132:795). pGA2 utiliza el promotor temprano inmediato de CMV sin el intrón A y la secuencia de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina para expresar los insertos de la vacuna. El ADN de la vacuna fue producido por Althea (San Diego, CA). En transfecciones transitorias de las células 293T, el ADN/89,6 produjo aproximadamente 300 ng de Gag y 85 ng de Env por 1x10^{6} células.

El potenciador rMVA (MVA/89,6) expresó Gag, Pol de VIS y Env de VIH-1 bajo el control de los promotores tempranos y tardíos del virus vaccinia.

El virus recombinante doble de MVA expresó tanto Env de VIH 89,6 como Gag-Pol 239 de VIS, que fueron insertadas en la deleción II y la deleción III de MVA respectivamente. La proteína Env de 89,6 fue truncada en los 115 aminoácidos del COOH terminal de gp41. El promotor H5 modificado controló la expresión de ambos genes extraños.

La vacunación se llevo a cabo mediante inducción con ADN en las semanas 0 y 8 y potenciación con rMVA a las 24 semanas (Fig. 1A).

Las inmunizaciones con ADN intradérmicas e intramusculares se administraron en una disolución salina tamponada con fosfato (PBS) con un inyector sin aguja (Bioject, Portland, OR) para administrar cinco inyecciones intradérmicas de 100-ul en cada cara externa del muslo para la dosis de 2,5 mg de ADN o una inyección intradérmica de 100 \mul en la cara externa del muslo derecho para la dosis de 250 \mug de plásmido. Las administraciones intramusculares de ADN se realizaron con una inyección de 0,5 ml de ADN en PBS en cada cara externa del muslo para la dosis de 2,5 mg y una inyección de 100 \mul en la cara externa del muslo derecho la dosis de 250 \mug. Se administraron 1x10^{8} pfu de MVA/89,6 con una aguja tanto intradérmica como intramuscularmente. Se administró una dosis de 100 \mul a cada cara externa del muslo para la dosis intradérmica y una dosis de 500 \mul a cada cara externa del muslo para la dosis intramuscular. Los animales control recibieron 2,5 mg del vector de pGA2 sin inserto de vacuna con un dispositivo Bioject para administrar cinco dosis de 100 \mul intradérmicas a cada cara externa del muslo. El control de la inmunización del potenciador MVA consistió en 2x10^{8} pfu de MVA sin inserto distribuidas intradérmica e intramuscularmente como se describió para MVA/89,6.

Cada uno de los cuatro grupos de seis macacos rhesus fue inducido bien con 2,5 mg (dosis alta) o 250 \mug (dosis baja) de ADN por ruta intradérmica (i.d.) o intramuscular (i.m.) usando un dispositivo de inyección sin aguja a alta presión (Bioject, Portland, OR) (T.M. Allen et al. 2000 J Immunol 164:4968).

Los macacos rhesus adultos jóvenes de la colonia de cría de Yerkes fueron cuidados según las directrices establecidas por el "Animal Welfare Act y la NIH Guide for the Care and Use of Laboratoy Animals" con los protocolos aprobados por el Comité Institutional para el cuidado y utilización de animales de la "Universidad de Emory (Emory University Institucional Animal Care and Use Committee". Los macacos se clasificaron según el alelo Mamu-A*01 por análisis de la reacción de cadena de la polimerasa (PCR) (M.A. Egan et al. 2000 J Virol 74:7485; I. Ourmanov et al. 2000 J Virol 74:2740. Dos o más animales que contenían al menos un alelo Mamu-A*01 fueron asignados a cada grupo. Los números de los animales son los que siguen: 1, RBr-5*; 2, Rlm-5*; 3, RQf-5*; 4, RZe-5*; 5, ROm-5; 6, RDm-5; 7, RAj-5*; 8, RJi-5*; 9, RAl-5*; 10, RDe-5*; 11, RAi-5; 12, RPr-5; 13, RKw-4*; 14, RWz-5*; 15, RGo-5; 16, RLp-4; 17, RWd-6; 18, RAt-5; 19, RPb-5*; 20, Rli-5*; 21, Rlq-5; 22, RSp-4; 23, RSn-5; 24, RGd-6; 25, RMb-5*; 26, RGy-5*; 27, RUs-4; y 28, RPm-5. Los animales con el alelo A*01 se indican con asteriscos.

No se utilizó la administración de genes con pistolas porque habían inducido respuestas inmunes no protectoras en un ensayo en 1996-98 (H. L. Robinson et al. 1999 Nat Med 5:526). El potenciador de inmunización MVA/89,6 (2x10^{8} unidades formadoras de placas, pfu) se inyectó con una aguja tanto intradérmica como intramuscularmente. Un grupo de control incluyó dos animales que simulaban inmunización y dos animales sin tratamiento previo. El virus de provocación se administró siete meses después de la potenciación con rMVA para comprobar la generación de inmunidad de larga duración. Puesto que la mayoría de las infecciones de VIH-1 se trasmiten a través de superficies mucosas, se administró una provocación intrarectal.

La inducción con ADN seguida de la potenciación con rMVA generó frecuencias altas de células T específicas para el virus que alcanzaban un pico máximo a la semana siguiente de la potenciación con rMVA (Fig. 1.). Las frecuencias de las células T que reconocen el epítopo de Gag-CM9 se evaluaron por medio de los tetrámeros de Mamu-A*01, y las frecuencias de las células T que reconocen los epítopos a lo largo de Gag se evaluaron con grupos de péptidos que solapan y con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISPOT) (C.C. Power et al. 1999 J Immunol Methods 227:99).

Para el análisis de tetrámeros, aproximadamente 1x10^{6} células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron marcadas en la superficie con anticuerpos de CD3 conjugados con isocianato de fluoresceína (FITC) (FN-18; Biosource Internacional, Camarillo, CA), con CD8 conjugadas con la proteína clorofila peridinina (PerCP) (SKI; Becton Dickinson, San Jose, CA), y con el tetrámero Gag-CM9 (CTPYDINQM)-Mamu-A*01 (SEQ ID NO: 6) conjugado con aloficocianina (APC), en un volumen de 100 \mul a entre 8 y 10ºC durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS que contiene un 2% de suero fetal bovino (FBS), se fijaron con paraformaldehido al 1% en PBS, y se analizaron a las 24 horas con un FACScaliber (Becton Dickinson, San Jose, CA). Las células fueron inicialmente acotadas en poblaciones de linfocitos con dispersión hacia delante y dispersión lateral y posteriormente en células CD3. Las células CD3 se analizaron después para CD8 y para células de unión al tetrámero. Se adquirieron aproximadamente 150.000 linfocitos para cada muestra. Los datos se analizaron utilizando el software FloJo (Tree Star, San Carlos, CA).

Para el ELISPOT del interferón-\gamma (IFN-\gamma), se recubrieron las placas de filtración MULTISCREEN de 96 pocillos (Millipore Inc. Bedford, MA) durante la noche con un anticuerpo frente a IFN-\gamma humano (Clon B27, Pharmingen, Sandiego, CA) a una concentración de 2 \mug/ml en un tampón de bicarbonato de sodio (pH 9,6) a entre 8º y 10ºC. Las placas se lavaron dos veces con un medio RPMI y después se bloquearon durante 1 hora con un medio completo (RPMI que contiene 10% de FBS) a 37ºC. Las placas se lavaron otras cinco veces con un medio RPMI sin enriquecer, y las células se sembraron en 100 \mul de un medio completo duplicado en cantidades que variaban de 2x10^{4} a 5x10^{5} células por pocillo. Los grupos de péptidos se añadieron a cada pocillo a una concentración final de 2\mug/ml de cada péptido en un volumen de 100 \mul de medio completo. Las células se hicieron crecer a 37ºC durante 36 horas con un 5% de CO_{2}. Las placas se lavaron seis veces con un tampón (PBS con 0,05% de Tween-20) y se incubaron después con 1\mug de anticuerpo biotilinado frente a IFN-\gamma por mililitro (clon 7-86-1; Diapharma Group, West Chester, OH) diluido en un tampón que contiene 2% de FBS. Las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC y se lavaron seis veces con el tampón de lavado. Se añadió avidina/peroxidasa de rábano picante (Vector Laboratorie, Burlingame, CA) a cada pocillo y se incubó entre 30 y 60 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron seis veces con tampón y las manchas se revelaron utilizando como substrato DAB estable (Research Genetics, Huntsville. AL). Se hizo un recuento de las manchas con un microscopio de disección estéreo. Se incluyó un péptido de ovoalbúmina (SIINFEKL) (SEQ ID NO: 7) como control en cada análisis. Las manchas de fondo para el péptido de ovoalbúmina fueron generalmente <5 por 5X10^{5} PBMC. Cuando este fondo se normalizó para 1x10^{6} PBMC fueron <10. Solo se consideraron significativos los recuentos de ELISPOT dobles que el fondo (\pm20). Las frecuencias resultado del ensayo de ELISPOT son aproximadas porque soluciones diferentes de células tienen eficiencias diferentes de formación de manchas en ausencia de células alimentadoras (feeder). (C.A. Power et al. 1999 J Immunol Methods 227:99). Se utilizó la misma dilución de células para todos los animales en el mismo momento, pero se utilizaron diferentes diluciones para detectar el recuerdo y las respuestas agudas.

El análisis de los tetrámeros Gag-CM9 se restringió a los macacos que expresaban el tipo de incompatibilidad Mamu-A*01 mientras que las respuestas de ELISPOT no dependían de un tipo de histocompatibilidad específico. Como se esperaba, las inmunizaciones con ADN alcanzaron niveles bajos de células de recuerdo que se expandieron a frecuencias altas en la primera semana de la potenciación con rMVA (Fig. 1 y 6). En los macacos Mamu-A*01, las células CD8 específicas para el epítopo de Gag-CM9 se expandieron a frecuencias de hasta 19% del total de las células CD8T (Fig. 6.). Este pico de células específicas experimentó una contracción de 10 a 100 veces en el grupo de recuerdo con ADN/MVA. (Fig. 1A y 6). El resultado del ensayo de ELISPOT para los tres grupos de péptidos Gag también experimentó una expansión importante (frecuencias de hasta 4000 manchas por 1x10^{6} PBMC) antes de contraerse de 5 a 20 veces en el respuesta de recuerdo con ADN/MVA (Fig. 1B). Las frecuencias de ELISPOT fueron las mismas en macacos con y sin el tipo de incompatibilidad A01* (P>0,2).

Se utilizó la regresión lineal simple para estimar las correlaciones entre las respuestas obtenidas de ELISPOT post-potenciación y post-provocación, entre las respuestas de recuerdo y post-provocación del ensayo de ELISPOT, entre las cargas virales transformadas logarítmicamente y las frecuencias de ELISPOT. Las comparaciones entre grupos vacunados y control y macacos A*01 y no A*01 se llevaron a cabo por medio de ensayos t de dos muestras con cargas virales transformadas logarítmicamente y respuestas del ensayo de ELISPOT. Se utilizaron dos análisis de varianza para examinar los efectos de la dosis y de la ruta de administración en el pico de los resultados del ensayo de ELISPOT de ADN/MVA, en los resultados del ensayo de ELISPOT de recuerdo con ADN/MVA y en los datos de los anticuerpos frente a Gag transformados logarítmicamente.

Tanto en los picos como en las fases de recuerdo de respuesta a la vacuna, el orden de preferencia para los resultados de ensayo de ELISPOT en los grupos vacunados fue 2,5 mg i.d. >2,5 mg i.m. >250 \mug i.d. >250 \mug i.m. (Fig. 1B). Los ensayos de ELISPOT de INF-\gamma incluían tanto células CD4 como CD8. Las células CD8 específicas para Gag-CM9 tenían una buena actividad lítica después de la estimulación con el péptido.

El virus de provocación altamente patógeno VIHS-89,6 se administró por vía intrarectal siete meses después de la potenciación con rMVA cuando las células T producidas por la vacuna estaban en recuerdo (Fig. 1).

La reserva del virus de provocación (5,7 x 10^{9} copias de ARN viral por milímetro) se produjo mediante un paso intravenoso seguido de otro intrarectal en macacus rhesus de la reserva de VIHS-89,6P original (G.B. Karlsson et al. 1997 J Virol 71:4218). Las células linfoides se recolectaron del animal infectado por vía intrarectal en el pico de viremia, empobrecido en CD8 y estimulado con mitógeno para la producción de la reserva. Antes de la provocación intrarectal, los animales en ayunas fueron anestesiados (ketamina, 10 mg/kg) y apoyados en sus estómagos con la región pélvica ligeramente elevada. Se les insertó una sonda de alimentación (8Fr (2,7 m.m.) x 16 pulgadas (41 cm); Sherwood Medical, St. Louis, MO) en el recto un recorrido de 15 a 20 cm. Después de la inserción de la sonda de alimentación, se colocó en la sonda una jeringa que contiene 20 dosis intrarectales infecciosas en 2 ml de RPMI-1640 más FBS al 10% y se inyectó el inóculo lentamente en el recto. Después de la distribución del inóculo, la sonda se enjuagó con 3,0 ml de RPMI sin PBS y después se retiró lentamente. Los animales permanecieron en el sitio, con las regiones pélvicas ligeramente elevadas, durante un período de diez minutos después de la provocación.

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La prueba de provocación infectó a todos los animales vacunados y controles (Fig.2.). Sin embargo, a las dos semanas de la provocación los títulos de ARN viral del plasma fueron diez veces inferiores en los grupos vacunados (promedios geométricos de 1x10^{7} a 5x10^{7}) que en los animales control (promedio geométrico de 4x10^{8}) (Fig. 2A) (S. Staprans et al. en : Viral Genome Methods K. Adolph, ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1996 pp. 167-184; R. Hofmann-Lehmann et al 2000 AIDS Res Hum Retroviruses 16:1247).

Para la determinación del número de copias de VIHS, se extrajo el ARN viral directamente de 150 \mul de plasma ACD anticoagulado con el kit de ARN viral QIAamp (Qiagen), eluido en 60 \mul de tampón AVE, y congelado a -80ºC hasta que se realizó la cuantificación del ARN de VIHS. Se efectuó la transcripción inversa de cinco microlitros de plasma de ARN purificado en un volumen final de 20 \mul que contenían KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 4 mM, 1mM de cada desoxinucleotido trifosfato (dNTP), hexámeros al azar 2,5 \muM, 20 unidades de RT MultiScribe, y 8 unidades de inhibidor de ribonucleasa. Las reacciones se incubaron a 25ºC durante 10 min, seguida de incubación a 42ºC durante 20 minutos, e inactivación de la transcriptasa inversa a 99ºC durante 5 min. La mezcla de reacción se ajustó a un volumen final de 50 \mul que contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 4 mM, desoxinucleotidos trifosfato (dNTP) 0,4 mM de cada, cebador sentido 0,2 \muM, cebador antisentido 0,2 \muM, sonda 0,1 \muM, y 5 unidades de ADN polimerasa AmpliTaq Gold (todos los reactivos de PerkinElmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias del cebador con una región conservada del gen gag de VIS son las mismas que las descritas anteriormente (S. Staprans et al. en: Viral Genome Methods K. Adolph, ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1996 pp. 167-184). Se utilizó el Sistema de Detección de Secuencias 7700 de PerkinElmer Applied Biosystems con el perfil de PCR siguiente: 95ºC durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 93ºC durante 30 s y 59,5ºC durante 1 min. El producto acumulado de PCR se monitorizó con el detector de secuencias 7700 y una sonda para la secuencia interna conservada del gen gag: 6FAM-CTGTCTGCGTCATTTGGTGC-Tamra (SEQ ID NO: 8), donde FAM y TamRa se refieren al agente fluorescente (reporter) y al colorante inhibidor de fluorescencia (quencher). El número de copias de ARN se determinó por comparación con una curva estándar externa que consistía en el ARN de VISmac239 derivado del virión cuantificado por el método bADN VIS (Bayer Diagnostics, Emeryville, CA). Todos los especímenes se extrajeron y amplificaron por duplicado, con información del promedio de los resultados. Con una entrada de 0,15 ml de plasma, el ensayo tiene una sensibilidad de 10^{3} copias de ARN por milímetro de plasma y un intervalo dinámico lineal de 10^{3} a 10^{8} copias de ARN (R^{2} = 0,995). El coeficiente de variación entre ensayos fue < 20% para muestras que contienen <10^{4} copias de ARN VIHS por milímetro, y < 25% para muestras que contiene de 10^{3} a 10^{4} copias de ARN VIHS por milímetro. Para cuantificar más precisamente el bajo número de copias de ARN VIHS en los animales vacunados en las semanas 16 y 20, hacemos las siguientes modificaciones para aumentar la sensibilidad del ensayo de ADN de VIHS: (i) Los viriones de \leq 1 ml de plasma se concentraron por centrifugación a 23.000 g y 10ºC durante 150 minutos antes de la extracción del ARN viral, y ii) se utilizó un método PCR con transcriptasa inversa de una sola etapa (R. Hofmann-Lehmann et al. 2000 AIDS Res Hum Retoviruses 16:1247). Estos cambios proporcionaron un límite de cuantificación fiable de 300 copias de ARN de VIHS por mililitro, y dieron valores para ARN de VIHS que están altamente correlacionados con los obtenidos por el primer método usado (r = 0,91, P< 0,0001).

A las 8 semanas de la provocación, tanto los grupos inducidos con dosis de ADN alta como el grupo inducido con dosis intradérmica de ADN baja redujeron sus cargas el promedio geométrico de sus cargas a aproximadamente 1000 copias de ARN viral por milímetro. En ese momento, el grupo inducido con dosis intramuscular de ADN baja tenía un promedio geométrico de 6x10^{3} copias de ADN viral y los controles no vacunados tenían un promedio geométrico de 2x10^{6}. A las 20 semanas de la provocación, incluso el grupo de dosis intramuscular baja redujo el promedio geométrico de las copias de ARN viral a 1000. Entre los animales vacunados, sólo un animal, el animal número 22 de grupo de dosis intramuscular baja, tenia cargas virales intermitentes superiores a 1x10^{4} por milímetro (Fig. 2D).

A las 5 semanas de la provocación, todos los controles no vacunados habían sufrido una reducción profunda de células CD4 (Fig. 2B) Todos los animales vacunados mantuvieron sus niveles de CD4, con la excepción del animal 22 del grupo de dosis intramuscular baja (véase mas arriba), que sufrió una disminución suave de CD4 (Fig. 2E). A las 23 semanas de la provocación, tres de los cuatro animales control sucumbieron al SIDA (Fig. 2C). Estos animales tuvieron distintos grados de enterocolitis con diarrea, criptosporidiosis, coliciscitis, infección entérica por campilobacter, esplenomegalia, linfoadenopatia, y neumonía de células gigantes asociada al VIH. Por el contrario, todos los 24 animales vacunados mantenían su salud.

La contención de la provocación viral se asoció con una irrupción de células T antivirales (Fig. 1 y 3A). Una semana después de la provocación, la frecuencia de las células tetrámero^{+} en la sangre periférica había disminuido, reflejando en potencia el reclutamiento de las células T específicas para el sitio de infección (Fig. 3A). Sin embargo, a las dos semanas de la provocación, las células tetrámero^{+} en la sangre periférica se habían incrementado a frecuencias tanto o más altas que las de después de la potenciación con rMVA (Fig. 1 y 3A). La mayoría de las células tetrámero^{+} produjeron IFN-\gamma en respuesta a una estimulación con péptidos de 6 horas (Fig. 3B) (S.L. Waldrop et al 1997 J Clin Invest 99:1739) y no tenían el "asombroso" fenotipo IFN-\gamma negativo observado a veces en las infecciones virales (F. Lechner et al. 2000 J Exp Med 191:1499).

Para los ensayos de citoquina intracelular, se estimularon aproximadamente 1x10^{6} PBMC durante 1 hora a 37ºC en tubos de polipropileno con 100 \mug del péptido Gag-CM9 (CTPYDINQM)(SEQ ID NO:6) por mililitro en un volumen de 100 \mul de RPMI que contenía 0,1% de albumina de suero bovino (BSA) y 1 \mug de anticuerpo frente a CD28 humano y 1 \mug de anticuerpo frente a CD49d (Pharmingen, San Diego, CA) por mililitro. Después, se añadieron 900 \mul de RPMI que contenían un 10% de FBS y monensin (10 \mug/ml), y las células se hicieron crecer durante 5 horas adicionales a 37ºC con un ángulo de 5ºcon 5% de CO_{2.} Las superficies de las células se marcaron con anticuerpos de CD8 conjugados con PerPC (clon SK1, Becton Dickinson) a entre 8 y 10ºC durante 30 minutos, se lavaron dos veces con PBS frío que contenía 2% de FBS, y se fijaron y permeabilizaron con una disolución de Cytofix/Cytoperm (Pharmigen). Después las células se incubaron con anticuerpos de CD3 (clon FN-18 y ficoeritrina, respectivamente, en una disolución de lavado Perm (Pharmigen) durante 30 minutos a 4ºC. Las células se lavaron dos veces con la disolución de lavado Perm, una vez con PBS sencillo, y fueron resuspendidas en formaldehído al 1% en PBS. Se adquirieron aproximadamente 150.000 linfocitos de FACScaliber y se analizaron con el software FloJo.

El incremento post provocación de las células T se contrajo concomitantemente con la disminución de la carga viral. A las doce semanas de la provocación, las células T específicas para virus estaban presentes en aproximadamente una décima parte de su valor máximo (Figs, 1A y 3A). En contraste con la respuesta secundaria vigorosa en los animales vacunados, los animales no infectados tuvieron una respuesta primaria modesta (Fig. 1B y 3A). Las células tetrámero^{+} alcanzaron un máximo por debajo del 1% de las células CD8 totales (Fig. 3A), y los ELISPOT producidos por el IFN-\gamma estaban presentes con una frecuencia promedio de aproximadamente 300 en contraposición a las frecuencias más altas de entre 1000 y 6000 en los grupos vacunados (Fig. 1B) (P< 0,05).

Las células tetrámero^{+} del grupo control, así como las del grupo de vacunados, produjeron IFN-\gamma después de estimulación con péptido (Fig. 3B). A las 12 semanas de la provocación, tres de los cuatro controles tenían niveles no detectables de ELISPOT producidos por el IFN-\gamma. Esta pérdida rápida de células T antivirales en presencia de cargas virales altas puede reflejar la falta de ayuda de CD4.

Las respuestas proliferativas de las células T demostraron que las células CD4 específicas para virus habrían sobrevivido a la provocación y eran capaces de soportar la respuesta inmune antiviral (Fig. 3C).

Se estimularon por triplicado aproximadamente 0,2 millones de PBMC durante cinco días con el antígeno indicado en 200 \mul de RPMI a 37ºC en 5% de CO2. Los sobrenadantes de las células 293T transfectadas con ADN que expresan bien Gag o Pol de VIHS-89,6 o Gag, Pol y Env de VIHS-89,6 se utilizaron directamente como antígenos (concentración final de \approx 0,5 \mug de Gag por mililitro). Los sobrenadantes de las células transfectadas con ADN simulado (solo el vector) sirvieron como controles negativos. Al sexto día, las células fueron pulsadas con 1 \muCi de timidina tritiada por pocillo durante 16 a 20 horas. Las células se recogieron con un recolector de células/TOMTEC, Recolector 96, Modelo 1010, Hamden, CCT) y se hizo un recuento con un contador de centelleo Wallac MICROBETA 1450 (Gaithersburg. MD). Los índices de estimulación son los recuentos de timidina tritiada incorporada en PBMC estimuladas con antígenos de 89,6 divididos por los recuentos de timidina tritiada incorporada por las mismas PBMC estimuladas con antígenos simulados.

Doce semanas después de la provocación, el promedio de los índices de estimulación para las proteínas Gag-Pol-Env o Gag-Pol variaba de 35 a 14 en los grupos vacunados pero no eran detectables en el grupo control. De acuerdo con los ensayos de proliferación, los ensayos de citoquinas intracelulares demostraban la presencia de células CD4 específicas para el virus en los animales vacunados pero no en los animales control. El orden general de clasificación para los grupos vacunados según la magnitud de la respuesta proliferativa fue 2,5 mg i.d > 2,5 mg i.m. > 250 \mug i.d. > 250 \mug i.m.

A las doce semanas de la provocación, los nódulos linfáticos de los animales vacunados estaban intactos morfológicamente y respondían a la infección, mientras que los de los controles infectados habían sido destruidos funcionalmente (Fig. 4). Los nódulos de los animales vacunados contenían gran número de folículos secundarios reactivos con centros germinales expandidos y zonas oscuras y claras diferenciadas. (Fig. 4A). Por el contrario, los nódulos linfáticos de los animales control no vacunados mostraban depleción paracortical y folicular (Fig. 4B), mientras que los animales no vacunados y sometidos a provocación mostraban números normales de centros germinales mínimamente reactivos. (Fig. 4C). Los centros germinales ocupaban <0,05 % del área total de los nódulos linfáticos en los controles infectados, 2% del área de los nódulos linfáticos de los controles no infectados, y hasta el 18% del área de los nódulos linfáticos en los grupos vacunados (Fig. 4D). La reactividad inmune más enérgica de los animales estimulados con dosis de ADN baja frente a los de dosis alta vino sugerida por los centros germinales más extensos de los grupos de dosis baja (Fig. 4D). A las doce semanas de la provocación, la hibridación in situ del ARN viral reveló células extrañas que expresaban virus en los nódulos linfáticos de 3 de los 24 macacos vacunados, mientras que las células que expresaban virus se detectaron fácilmente en los nódulos linfáticos de cada uno de los animales control infectados. En los controles, que habían sufrido una profunda disminución de las células T CD4, la citomorfología de las células de los nódulos linfáticos infectados era coherente con el fenotipo del macrófago.

La estrategia de inducción/potenciación despertó niveles bajos de anticuerpo frente a Gag y niveles no detectables de anticuerpo frente a Env (Fig. 5). Después de la provocación, los anticuerpos frente a Env y Gag, produjeron respuestas anamnésticas alcanzando el anticuerpo total frente a Gag niveles próximos a 1 mg/ml y el anticuerpo total frente a Env niveles de hasta 100 \mugr/ml.

Los ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA) para el anticuerpo total frente a Gag utilizaron gag p27 de VIS producido bacterianamente para recubrir los pocillos (2 \mug por mililitro en tampón bicarbonato). La prueba de anticuerpos ELISA, frente a los anticuerpos de Env, utilizó Env de 89,6 producido en células 293T transfectadas transitoriamente y capturado con Env contra anticuerpos de oveja (número de catálogo 6205; International Enzymes, Fairbrook CA). La curvas estándar de los ensayos ELISA para Gag y Env se produjeron con suero de un macaco infectado con 89,6 de VIHS con cantidades conocidas de inmunoglobulinas G (IgG) específicas para Gag o Env. Se detectó anticuerpo unido con anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa para IgG de macaco (nº en catálogo # YNGMOIGGFCP; Accurate Chemical, Westbury, NY) y substrato TBM (nº en catálogo # T3405; Sigma, St. Louis, MO). Se hizo un ensayo con sueros a diluciones al triple en pocillos duplicados. Las diluciones de los sueros de ensayo se llevaron a cabo con un tampón de suero de leche (4% de suero y 0,1% de tween 20 en 1x PBS). El tampón bloqueante consistía en un tampón de suero de leche más 0,5% de leche seca desnatada. Las reacciones se pararon con H2SO4 2M y se leyó la densidad óptica a 450 nm. Se ajustaron las curvas estándar y las concentraciones de las muestras fueron interpoladas como \mug de anticuerpo por ml de suero utilizando el software SOFTmax 2,3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Dos semanas después de la provocación, los anticuerpos neutralizantes para el inmunógeno 89,6, pero no así los virus de provocación VIHS-89,6P, estaban presentes en los grupos inducidos con dosis de ADN alta (promedio geométrico de los títulos de 352 para los grupos i.d. y de 303 para los grupos de i.m.) (Fig. 5C) (D.C. Montefiori et al. 1988 J Clin Microbiolg 26:231). A las cinco semanas de la provocación, se había generado el anticuerpo neutralizante para 89,6P (promedio geométrico de los títulos de 200 para los grupos i.d. y de 126 para los grupos i.m.) (Fig 5D) y el anticuerpo neutralizante de 89,6 había empezado a disminuir. En las semanas 16 a 30 después de la provocación, los anticuerpos frente a Gag y Env habían disminuido en la mayoría de los animales.

Estos resultados demuestran que una vacuna de ADN/MAV que produce múltiples proteínas puede despertar una respuesta inmune de recuerdo capaz de controlar una provocación mucosa con un virus de la inmunodeficiencia altamente virulento. Estos niveles de control viral fueron más favorables que habían sido los conseguidos utilizando sólo ADN (M.V. Egan et al. 2000 J. Virol 74:7485) o vacunas rMVA (1. Ourmanov et al. 2000 J virol 74:2740) y fueron aquí comparables a los obtenidos por inmunizaciones con ADN coadyuvado con interleuquina-2 (D.H. Barouch et al 2000 Science 290:486). Todos estos estudios previos habían utilizado más de tres inoculaciones de vacunas, ninguno había utilizado provocaciones mucosas, y la mayoría se habían provocado con respuestas máximas del efector y no permitían un periodo prolongado de post vacunación para valorar una eficacia a "largo plazo".

Las dosis de ADN tuvieron resultados estadísticos significativos tanto en respuestas celulares como humorales (P<0,05). La administración intradérmica del ADN fue hasta 10 veces más efectiva que las inoculaciones i.m. para la generación anticuerpos frente a Gag (P= 0,02). Ni la vía ni la dosis de ADN parecían tener un efecto significativo en la protección. A las 20 semanas de la provocación, los animales inducidos con dosis de ADN altas tenían un promedio geométrico de los niveles de ARN viral ligeramente inferior (7x10^{2} y 5x10^{2}) al de los animales inducidos con dosis de ADN bajas.

La vacuna de ADN/MVA controló la infección, reduciendo rápidamente las cargas virales a aproximadamente 1000 copias de ARN viral por mililitro de sangre o menos. La contención, más que la prevención de la infección, da la oportunidad de establecer una infección crónica (H.L. Robinson et al. 1999 Nat Med 5:526). Mediante una reducción rápida de las cargas virales, una vacuna de ADN/MVA que libera proteínas múltiples extenderá las expectativas de no progresión a largo plazo y limitará la transmisión del VIH. (J. W. Mellors et al. 1996 Science 272:1167; T.C. Quinn et al. 2000 N Eng J Med 342:921).

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Ejemplo 2 MVA que expresa los genes Env, Gag y Pol de VIH modificado

La descripción describe la construcción de un virus recombinante vaccinia Ankara modificado (MVA), del virus recombinante MVA/VIH de la estirpe B que expresa env de ADA de la cepa de VIH y de pol gag de HXB2 (ADA env MVA/VIH + gag pol de HXB2). Para la amplificación, se utilizará la denominación de laboratorio de MVA/VIH, que hace referencia al plásmido del que procede la construcción.

Los genes gag-pol de VIH derivaron de la estirpe infecciosa B del virus HXB2. El gen gag-pol, se truncó de manera que la mayoría de las secuencias codificantes de la integrasa se eliminaron y los aminoácidos 185, 266, y 478 se mutaron para inactivar la transcriptasa inversa, inhibiendo la actividad de transferencia de las hebras, e inhibiendo la actividad ARNasaH, respectivamente. El gen de la envoltura trópica de la estirpe B CCR5 se derivó del aislado primario de ADA; las secuencias TTTTTNT mutaron sin perder su capacidad de codificar para evitar la transcripción prematura de la terminación y la cola citoplásmica se truncó para mejorar la expresión de superficie, la inmunogenicidad, y la estabilidad del vector MVA. Los genes de VIH se insertaron en un vector plasmídico de transferencia de manera que el gen gag-pol era regulado por el promotor temprano/tardío H5 del virus vaccinia modificado y el gen env era regulado por el promotor temprano/tardío PsyII diseñado recientemente para proporcionar niveles altos de expresión similares. Se incluyó un gen marcador (reporter) de autodeleción GUS que permite la detección y aislamiento del virus recombinante. Los genes de VIH estaban flanqueados por secuencias de MVA que permiten la recombinación homóloga en el sitio de deleción 3 de manera que el MVA recombinante permaneciera positivo para TK para la estabilidad y la expresión alta en las células restantes. El MVA recombinante se aisló y mostró la expresión de cantidades abundantes de gag-pol-env y el procesado de gag. La producción de partículas similares al VIH se manifestó por centrifugación y por microscopia electrónica. La presencia de env en las partículas similares a VIH se manifestó mediante microscopia inmunoelectrónica.

TABLA DE SECUENCIAS

1

Vector plasmídico de transferencia

El vector plasmídico de transferencia pLW-48 (Fig. C) utilizado para fabricar el virus recombinante MVA por recombinación homóloga, se construyó de la siguiente forma:

1. A partir del plásmido pGem-4Z (Promega) obtenido comercialmente, las zonas que flanquean cada lado de la deleción III, denominadas flank1 y flank2, que contienen respectivamente los pares de bases 926 y 520, se amplificaron por PCR a partir de las manchas de MVA del virus vaccinia. Entre estos flancos, se añadió un promotor, el mH5, que había sido modificado a partir de las secuencias publicadas originalmente cambiando dos bases que habían demostrado según el trabajo previamente publicado que incrementaban la expresión del gen clonado.

2. Un gag pol de la estirpe B (Figure D) se truncó de manera que se eliminó la integrasa y se clonó en el plásmido de modo que fuese controlado por el promotor mH5. Este gen contenía la secuencia completa de gag de HXB2. El gen pol tiene mutaciones de seguridad para la transcriptasa inversa en el aminoácido 185 dentro del sitio activo de TR, en el aminoácido 266 que inhibe la actividad de transferencia de las hebras, y en el aminoácido 478 que inhibe la actividad de la ARNasaH. Además, se eliminó el gen de la integrasa pasado el sitio de EcoRI.

3. Después del flanco 1 se añadió una repetición directa de 280 pares de bases, que corresponden a las últimos 280 pares de bases del flanco 1 de MVA.

4. Se añadieron el promotor p11 y el gen marcador GUS entre dos repeticiones directas del flanco 1 de modo que este marcador de selección se pudiese utilizar inicialmente para obtener el virus recombinante, siendo eliminado no obstante del virus recombinante final (Scheiflinger, F. et al 1998 Arch Virol 143:467-474; Carroll, M.V. and B. Moss 1995 BioTechniques 19:352-355).

5. Se designó un nuevo promotor, Psyn II, para permitir el incremento de la expresión del env de ADA. La secuencia de este nuevo promotor temprano/tardío se indica en la Figura E.

6. Se obtuvo una versión truncada de la envoltura de ADA con una mutación silenciosa 5TNT obtenida por PCR e insertada en el plásmido bajo el control del promotor Psyn II. La envoltura se truncó en la cola citoplásmica del gen gp41, eliminando 115 aminoácidos de la cola de citoplásmica. Este truncamiento produjo un incremento de la cantidad de proteína de la envoltura en la superficie de las células infectadas e incrementó la inmunogenicidad de la envoltura proteica en los ratones, y la estabilidad de los virus recombinantes en el cultivo de tejidos.

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Construcción del MVA recombinante

1. El virus MVA, que puede obtenerse de ATCC con el número VR-1568, se purifico tres veces en las placas mediante diluciones terminales en fibroblastos de embriones de pollo (CEF), preparados a partir de huevos fertilizados de gallina SPAFAS SPF Premium de 9 días, distribuidos por B y E Eggs, Stevens, PA.

2. Las células secundarias de CEF se infectaron a una MOI de MVA de 0,05 y se transfectaron con 2 \mug de pLW-48, el plásmido descrito anteriormente. Después de dos días de incubación a 37ºC, el virus se recogió, congeló y descongeló tres veces, y se separó en placas CEF.

3. A los 4 días, los focos de infección que se tiñeron de azul después de añadir un substrato de X-glu, que indicaba que había tenido lugar la recombinación entre el plásmido y el virus infectante, se recogieron y se inocularon en placas CEF. Se recogieron de nuevo los focos teñidos de azul.

4. Estos focos que contenían GUS (que ahora queríamos eliminar) se separaron por triplicado y se analizaron para la tinción de GUS, y para la expresión de la envoltura de ADA. Se escogieron los focos individuales de la tercera placa de replicación de aquellas muestras que tenían aproximadamente el mismo número de poblaciones mixtas de focos teñidos y no teñidos con GUS además de la mayoría de los focos de envoltura teñidos.

5. Estos focos se separaron otra vez por triplicado, y se analizaron de la misma manera. Después de tres pases, se derivó un virus que expresaba la proteína de la envoltura pero del que se había eliminado el gen GUS a causa de la repetición doble. Mediante inmunomarcaje, este virus expresó también la proteína de gag pol.

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Caracterización del virus MVA recombinante, MVA/VIH 48

1. Se analizaron alícuotas de lisados celulares de MVA/VIH 48 por radioinmunoprecipitación e inmunomarcaje con anticuerpos monoclonales para la expresión de las proteínas de la envoltura y de gag. En estas dos pruebas, se detectaron cada una de las dos proteínas.

2. El virus recombinante demostró producir las partículas gag en el sobrenadante de las células infectadas mediante el granulado de las partículas marcadas con ^{35}S en un colchón de 20% de sacarosa.

3. Las partículas de gag se visualizaron también en el exterior y en gemación de células así como en el interior de las vacuolas celulares con el microscopio electrónico en secciones finas. Estas partículas gag tenían proteína de la envoltura en su superficie.

A no ser que se indique lo contrario, todas las secuencias de nucleótidos resueltas por secuenciación de una molécula de ADN aquí mencionadas se resolvieron utilizando un secuenciador automático de ADN, y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de ADN resueltas aquí mencionadas se predijeron por la traducción de las secuencias de ADN resueltas como se indica anteriormente. Por lo tanto, como es conocido en la técnica para cualquier secuencia de ADN resuelta por este método automático, cada secuencia de nucleótidos resuelta aquí mencionada puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos resueltas de manera automática tienen normalmente una identidad aproximada de hasta un 90%, mas normalmente una identidad comprendida entre un 95% y un 99,9% con la secuencia de nucleótidos real de las moléculas de ADN secuenciadas. La secuencia real se puede resolver más concretamente por otros métodos que incluyen métodos de secuenciación manual bien conocidos en la técnica. Como también es sabido en la técnica, una inserción o una deleción en una determinada secuencia de nucleótidos comparada con la secuencia real causará un cambio de marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos tal que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada realmente por la molécula de ADN secuenciada, que empieza en el punto de tal inserción o deleción.

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Compendio

En resumen, la solicitante ha preparado un virus MVA recombinante, MVA/VIH 48, que tiene una expresión alta de la envoltura truncada de ADA y de gag pol de HXB2. El virus MVA recombinante se prepara utilizando un marcador GUS expresado transitoriamente que se elimina en el virus final. La expresión alta de la envoltura de ADA es posible gracias a un nuevo promotor híbrido temprano/tardío, Psyn II. Además, la envoltura se ha truncado porque se ha demostrado que el truncamiento de la envoltura incrementa la cantidad de proteína de la superficie de las células infectadas, y por lo tanto incrementa la inmunogenicidad; la estabilidad del recombinante también se incrementa. El recombinante de MVA forma partículas gag que se han descubierto por la granulación de las partículas a través de sacarosa y por el análisis con PAGE. Las partículas gag con la proteína de la envoltura en la superficie se han visualizado también en el microscopio electrónico.

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Ejemplo 3 Promotores modificados o artificiales adicionales diseñados para la expresión génica en MVA u otros Poxvirus

Se diseñaron promotores modificados o artificiales adicionales para expresión génica en MVA u otros poxvirus. Se modificaron los promotores para permitir la expresión temprana o tardía después de la infección y para reducir la posibilidad de recombinación homóloga entre secuencias idénticas cuando se utilizaban promotores múltiples en el mismo vector de MVA. Los promotores se sitúan aguas arriba en la secuencia codificante de la proteína.

100

1000

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Ejemplo 4

Tablas A-F

Tabla A: Inmunización MVA/48 de cobayas

Los grupos de cobayas fueron inmunizados en los días 0 y 30 con 1x10^{8} unidades infecciosas de MAV/48 bien por vía intramuscular (IM) o intradérmica (ID). Se inmunizó como control otro grupo IM con la misma dosis de MVA no recombinante. Se analizó el suero extraído tanto antes como después de cada inmunización para su actividad neutralizante frente a VIH-1-MN. Los títulos son las diluciones de suero reciprocas a las que el 50% de las células de MT-2 estaban protegidas de la muerte inducida por virus (killing). Se observó actividad neutralizante significativa en todos los animales después de la segunda inmunización con MVA/48 (día 49).

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Tabla B: Frecuencias de células T específicas para gag de VIH/1 después de inmunización de ratones con MVA/48

Los grupos de ratones BalbC fueron inmunizados en los días 0 y 21 con 1x10^{7} unidades infecciosas de MAV/48 por una de las tres vías: intraperitoneal (IP), intradérmica (ID), o intramuscular (IM). Un grupo control fue inmunizado con un MVA no recombinante. A las 5 semanas de la última inmunización, se prepararon los esplenocitos y se estimularon in vitro con un péptido inmunodominante p24 de VIH-1 durante 7 días. Posteriormente las células se mezclaron bien con las células p815 pulsadas con péptido o bien con péptido soluble. Las células que produjeron interferón gamma se cuantificaron en un ensayo de ELISPOT. Se asignó un valor >500 a los pocillos que contienen demasiadas manchas que contar. Se habían presentado respuestas enérgicas de las células T en los ratones inmunizados IP con otros virus. En este experimento, la inmunización IP de ratones con MVA/48 provocó unas repuestas muy enérgicas de las células T específicas para el gag de VIH-1.

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Tabla C: Inducción con ADN y potenciación con MVA/48-ELISPOT totales por animal

Se estimularon diez macacos rhesus (semanas 0 y 8) con una vacuna de ADN que expresaba los antígenos de VIH-1 que incluyen la envoltura de ADA y gag pol de HXB2. En la semana 24 los animales se llevó a cabo la potenciación intramuscular con 1x10^{8} unidades infecciosas de MVA/48. Se analizaron las células mononucleares de sangre periférica (PMBC) para la producción de interferón gamma en un ensayo de ELISPOT como se indica a continuación: las PBMC se incubaron durante 30-36 horas en presencia de grupos de péptidos solapantes que correspondían a antígenos individuales de VIH-1 en las vacunas. El número total de células productoras de interferón gamma de cada animal se indica en la tabla. Las respuestas de las células T a la vacunación con ADN fueron limitadas (semanas 2-20). Sin embargo, la potenciación con MVA/48 dio como resultado respuestas muy enérgicas de las células T específicas para VIH-1 en todos los animales (semana 25).

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Tablas D: La respuesta de los anticuerpos después de la inmunización de macacos con KB9 de MVA/VIHS

Los grupos de macacos rhesus fueron inmunizados con 2x20^{8} unidades infecciosas de KB9-MVA/VIHS en las semanas 0 y 4 por una de las diversas vías: Amigdalas, intradérmica (ID), o intramuscular (IM). Otro grupo fue inmunizado con MVA no recombinante utilizando las mismas vías. Las muestras de suero procedentes de las dos semanas desde la segunda inmunización se analizaron para la unión de la proteína de la envoltura de KB9 por ELISA y para la neutralización de VIHS-89,6P y VIHS-89,6. En el ensayo ELISA, la proteína soluble de la envoltura de KB9 se capturó en placas de 96 pocillos utilizando un anticuerpo para el C-terminal de gp120. Se analizaron las diluciones seriadas de los sueros y se utilizaron para determinar los títulos de los puntos finales. Se determinó la neutralización de VIHS-89,6P y de VIHS-89,6 en un ensayo con células MT-2. Los títulos son las diluciones de suero reciprocas a las cuales el 50% de las células estaban protegidas de la muerte inducida por virus. En los ensayos de neutralización in vitro, VIHS-89,6P y VIHS-89,6 eran heterólogos, p. ej. el suero de los animales infectados con uno de los virus no neutralizaba el otro virus. Por lo tanto, las dos inmunizaciones con MVA/VIHS-KB9 provocaron anticuerpos que se unían bien en ELISA en todos los animales y anticuerpos neutralizantes frente a los virus homólogos (VIHS-89,6P) en algunos animales. Además, se observaron anticuerpos neutralizantes heterólogos en un subgrupo de animales.

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Tabla E: Las frecuencias de las células T CD3/CD8 específicas para gag de CM-9 después de la inmunización de macacos con MVA/VIHS-KB9

Los grupos de macacos rhesus MamuA*01 positivos fueron inmunizados con 2x10^{8} unidades infecciosas de KB9 MVA/VIHS en las semanas 0 y 4 por una de las diversas vías: amigdalas, intradérmica (ID), o intramuscular (IM). Otro grupo fue inmunizado con MVA no recombinante. Las frecuencias de las células T CD3+/CD8+ que se unen al complejo tetramérico que contiene el péptido gag de CM9 especifico para VIS se determinaron por citometría de flujo en varios momentos después de la inmunización. Los intervalos de tiempo fueron los siguientes: 1a ,1b y 1d fueron en las semanas una, dos y cuatro después de la primera inmunización respectivamente; 2a, 2b, 2c y 2d fueron en las semanas una, dos tres y doce después de la segunda inmunización, respectivamente. Los valores por encima del fondo se indican en negrita. Se observaron respuestas enérgicas específicas para gag de VIS después de una sola inmunización con KB9-MAV/IHVS en todos los animales inmunizados. Se observó potenciación en la mayoría de los animales después de la segunda inmunización. Además, todavía se encontró una unión con el tetrámero considerable doce semanas después de la segunda inmunización.

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Tabla F: Las frecuencias de las células T específicas después de la inmunización con KB9 de MVA/VIHS

Los grupos de macacos se inmunizaron con KB9 de MAV/VIHS como se describió anteriormente. KB9 de MAV/VIHS expresan 5 genes del virus quimérico, VIHS-89,6P: envoltura, gag, polimerasa, tat y nef. En consecuencia se analizaron las frecuencias de las células T específicas para cada uno de los 5 antígenos utilizando grupos de péptidos que corresponden a cada proteína individual. Las PBMC frescas fueron estimuladas con grupos de péptidos durante 30-36 horas in vitro. Las células que producían interferón gamma se enumeraron en un ensayo ELISPOT. El número total de células específicas para cada antígeno se representa como "manchas # totales". Además, se representa el número de animales que responden y el promedio # de manchas por grupo. Las PMBC se analizaron una semana después de la primera inmunización (1a) y una semana después de la segunda inmunización (2 a). Otro grupo de 7 animales se inmunizó con un MVA no recombinante. En estos animales, no se detectaron manchas detectables por encima del nivel de fondo. En consecuencia, una inmunización sencilla con KB9 de MVA/VIHS provocó una respuesta enérgica de las células T específicas para VIHS en todos los animales. Las respuesta frente a la envoltura y frente a gag fueron las más fuertes; la mayoría de los animales presentaron respuesta frente a gag, todos los animales tuvieron respuesta frente a la envoltura. Las respuestas ELISPOT también se observaron después de la segunda inmunización con KB9 de MVA/VIHS, aunque a niveles más bajos. Ambas veces, el orden de preferencia de las respuestas fue: amígdala > ID > IM. Obtuvimos una respuesta inmune buena frente a nef y alguna respuesta inmune frente a tat.

TABLA A

2

TABLA B

3

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TABLA C

4

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TABLA D

5

TABLA D (continuación)

6

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TABLA E

7

8

Aunque la presente invención se ha descrito en detalle con el propósito de la claridad y comprensión de la misma, un experto en la técnica entenderá que puedan realizarse diversos cambios en las formas y detalles sin apartarse del verdadero alcance de la invención.

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<110> EL GOBIERNO DE LOS ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA, REPRESENTADO POR EL SECRETARIO DEPARTAMENTO DE SALUD Y SERVICIOS HUMANOS

\hskip1cm

Moss, Bernard

\hskip1cm

Wyatt, Linda

\hskip1cm

Earl, Patricia

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<120> MVA QUE EXPRESA LOS GENES MODIFICADOS GAG Y POL DE LA ENVOLTURA EN VIH

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<130> NIH211.001PCT

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<150> US 60/274,434

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<151> 2001-03-08

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<160> 13

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<170> FastSEQ para la versión 4.0 de Windows

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<210> 1

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<211> 12225

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Plásmido pLW-48

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<400> 1

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9

10

11

12

\newpage

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<210> 2

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<211> 74

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Promotor Psyn II

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<400> 2

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\hskip1cm

13

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<210> 3

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<211> 2214

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Gen env de VIH

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<400> 3

14

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<210> 4

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<211> 70

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Promotor PmH5

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<400> 4

\hskip1cm

15

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<210> 5

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<211> 3479

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Genes de VIH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de inmunodeficiencia simia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pollo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtctgcgt catttggtgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la inmunodeficiencia humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Promotor m7,5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Promotor Psyn III

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Promotor Psyn IV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Promotor Pysn V

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

24

Claims

1. Una composición farmacéutica que comprende un virus MVA recombinante que codifica Gag/Pol de HXB2 de MVA 48 (SEQ ID NO: 5) y la envoltura de ADA truncada (SEQ ID NO: 3).

2. Uso de una composición de la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para potenciar una respuesta inmune de la célula T CD8+ frente a un antígeno de Env, Gag, o Pol de VIH en un primate, por lo que se potencia en un primate una respuesta inmune de la célula T CD8+ frente al antígeno previamente inducido.

3. Uso de una composición de la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmune de la célula T CD8+ frente a un antígeno de Env, Gag, o Pol de VIH en un primate, por lo que se induce una respuesta inmune de la célula T CD8+ frente al antígeno en un primate.

4. Uso de una composición inductora que comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno Env, Gag o Pol de VIH y una composición potenciadora que comprende una composición de la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmune de la célula T CD8+ frente a un antígeno de Env, Gag o Pol de VIH en un primate, por lo que se induce una respuesta inmune de la célula T CD8+ frente al antígeno.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde el primate es un ser humano.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde el virus recombinante MVA se administra mediante inyección sin aguja.

7. El uso de la reivindicación 4, donde la composición inductora comprende un plásmido de ADN que codifica dicho antígeno.

8. Un método para preparar una composición de la reivindicación 1 que comprende:

-: preparar un vector plasmídico de transferencia que codifica Gag/Pol de HXB2 de MVA 48 (SEQ ID NO: 5) y la envoltura ADA truncada de MVA 48 (SEQ ID NO: 3); y

-: recombinar dicho vector plasmídico de transferencia con un virus MVA para producir una composición de la reivindicación 1.