ES2334184T3

ES2334184T3 - Metodo de identificacion de dominios de sitios de union que conservan la capacidad de unirse a un epitopo.

Info

Publication number: ES2334184T3
Application number: ES98963460T
Authority: ES
Inventors: Peter Kufer; Tobias Raum; Katrin Borschert; Florian Zettl; Ralf Lutterbuse
Original assignee: Micromet GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 1997-11-17
Filing date: 1998-11-16
Publication date: 2010-03-05
Anticipated expiration: 2018-11-16
Also published as: DK1032660T3; DE69841273D1; EP1032660B1; JP2009148280A; US7435549B1; JP4977156B2; JP2002508924A; AU1873199A; CA2309679C; PT1032660E; HK1031740A1; CY1110699T1; EP1032660A1; ATE447613T1; WO1999025818A1; CA2309679A1; JP4327350B2

Abstract

Un método para identificar un dominio de sitio de unión que tiene la capacidad de unirse a un epítopo predeterminado cuando se sitúa en posición C-terminal con respecto a al menos un dominio adicional en un polipéptido bi- o multivalente recombinante, que comprende las etapas de (a) ensayar un panel de dominios de sitio de unión presentados en la superficie de un sistema de presentación biológica como parte de una proteína fusión para unirse a un epítopo predeterminado, donde dicha proteína de fusión comprende (i) un dominio de bloqueo N-terminal adicional que es o procede del dominio N2 del producto del gen III del fago filamentoso y que se sitúa en posición N-terminal con respecto a dicho dominio de sitio de unión y (ii) una secuencia de aminoácidos que interviene en el anclaje de la proteína de fusión a la superficie de dicho sistema de presentación; y (b) identificar un dominio de sitio de unión que se une a dicho epítopo determinado.

Description

Método de identificación de dominios de sitios de unión que conservan la capacidad de unirse a un epítopo.

La presente invención se refiere a un método de identificación de dominios que tienen afinidad de unión por un epítopo preseleccionado. Los dominios comprenden preferiblemente dominios V_{H} y V_{L} de inmunoglobulina que conservan la capacidad de unirse a un epítopo cuando se sitúan en posición C-terminal con respecto a al menos un dominio adicional en un polipéptido bi- o multivalente recombinante. La presente invención se refiere además a un kit que comprende componentes tales como paneles de vectores recombinantes o bibliotecas bacterianas transfectadas con un panel de vectores recombinantes, que es útil en la realización del método de la invención. Además, la presente invención se refiere a polipéptidos que pueden obtenerse mediante el método descrito anteriormente y a su uso en composiciones farmacéuticas y de diagnóstico.

Los receptores multivalentes tales como construcciones de anticuerpos bifuncionales recombinantes desempeñan un papel terapéutico y científico cada vez más importante, en particular en el campo de la medicina, por ejemplo, en el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento para el cáncer y enfermedades autoinmunes o como herramientas interesantes para el análisis y la modulación de rutas de transducción de señales celulares, habiéndose hecho trabajos pioneros usando dichos receptores.

Por lo tanto, por entrecruzamiento del antígeno de activación CD3 en células T con un antígeno asociado a tumor en células tumorales, anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla pueden reunir ambas células de modo que la célula tumoral se lise eficazmente durante el contacto célula-célula (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025). Se han desarrollado o se están desarrollando estrategias comparables para otras células diana (por ejemplo, células infectadas por virus) y para el reclutamiento de otras poblaciones celulares efectoras (por ejemplo, células NK y fagocitos mononucleares). Usando proteínas de fusión bifuncionales que llevan un fragmento de anticuerpo como mecanismo de dirección, un gran número de receptores y ligandos diferentes pueden unirse específicamente a moléculas de superficie definidas en poblaciones celulares seleccionados. Es particularmente interesante que las moléculas de superficie en la misma célula puedan entrecruzarse por anticuerpos biespecíficos para modular la función celular o el estado de activación o diferenciación de dichas células. Una aplicación posible de este tipo de estrategia puede ser la inducción de anergia en linfocitos B o T autoagresivos que desempeñan un papel patógeno en muchas enfermedades autoinmunes. Con respecto a la amplia importancia científica y terapéutica, son de particular importancia métodos eficaces y reproducibles para producir polipéptidos recombinantes que comprenden sitios de unión a antígeno funcionales; dichos métodos producen, por ejemplo, construcciones de anticuerpos biespecíficos funcionalmente activos por expresión en bacterias y en células de mamífero. Dichas proteínas de cadena sencilla bifuncionales recombinantes habitualmente están constituidas por diferentes fragmentos de anticuerpo scFv, consistiendo cada uno de ellos en un dominio de unión a antígeno de cadena pesada variable (V_{H}) y uno de cadena ligera variable (V_{L}) de inmunoglobulina. Como alternativa, pueden comprender dicho fragmento de anticuerpo y una parte que no pertenece a una inmunoglobulina. Todos los dominios funcionales se localizan en una sola cadena polipeptídica y se unen por enlazadores peptídicos Glicina-Serina flexibles u otros enlazadores peptídicos apropiados. La cadena polipeptídica bifuncional puede producirse como una proteína funcional por transfección de células hospedadoras de mamífero, o menos preferentemente otras células hospedadoras, con la secuencia de ADN correspondiente que además puede codificar un marcador de proteína opcional, preferiblemente un marcador de polihistidina, lo cual facilita la purificación de la proteína recombinante, por ejemplo usando una columna de quelato de níquel. La producción de construcciones multivalentes y preferiblemente bifuncionales de acuerdo con esta estrategia de cadena sencilla tiene ventajas importantes en comparación con métodos convencionales usando heterodi- o multimerización in vitro o in vivo de dominios funcionales expresados de forma independiente, un procedimiento que puede ser muy laborioso y que frecuentemente se asocia con bajos rendimientos. La aparición de homodímeros contaminantes se excluye mediante la estrategia de cadena sencilla, dando como resultado por lo tanto preparaciones de proteína de alta pureza y rendimiento, puesto que toda la proteína recombinante producida consiste en el 100% de la construcción bifuncional deseada. Como se ha demostrado a modo de ejemplo con un anticuerpo de cadena sencilla biespecífico expresado de forma funcional en células CHO, los fragmentos de anticuerpo scFv pueden unirse en principio a su antígeno como la parte N-terminal o C-terminal de una construcción de cadena sencilla bifuncional (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(1995) 7021-7025).

Sin embargo, muchos dominios funcionales de polipéptidos multivalentes tales como fragmentos de anticuerpo pierden su actividad de unión cuando se localizan en posición C-terminal con respecto a una estructura proteica tridimensional adicional dentro de una proteína de fusión. Por ejemplo, fragmentos de scFv derivados de anticuerpos seleccionados aleatoriamente producidos por líneas celulares de hibridoma o seleccionados in vitro a partir de bibliotecas de anticuerpos combinatorias pierden frecuentemente su actividad de unión a antígeno cuando se localizan en la posición C-terminal dentro de proteínas de cadena sencilla bifuncionales recombinantes, aunque los mismos pares V_{H}/V_{L} se unen al antígeno cuando se localizan en el extremo N-terminal o como anticuerpos completos o fragmentos scFv monovalentes libres (Figura 10). Este fenómeno, a modo de ejemplo de referencia, se caracterizó exhaustivamente con moléculas de cadena sencilla bifuncionales recombinantes que consistían en el extremo N-terminal de la parte extracelular de CD80 humano (B7-1) seguido en el extremo C-terminal de diferentes fragmentos scFv derivados de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno 17-1A (Figura 1.1). De cuatro anticuerpos específicos de 17-1A diferentes, habiéndose producido tres de ellos por líneas celulares de hibridoma murino y habiéndose seleccionado uno in vitro a partir de una biblioteca de anticuerpos combinatoria humana usando el método de presentación en fagos, ninguno daba origen a un fragmento scFv que conservara su actividad de unión a antígeno cuando se fusionaba con su extremo N-terminal al extremo C-terminal del fragmento de CD80 humano y se expresaba como molécula de cadena sencilla bifuncional en células CHO (Ejemplos 1-4). Es digno de atención que dos de los fragmentos de anticuerpo murino (M79 y M74) se unen al antígeno 17-1A como parte N-terminal de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1995) 7021-7025) así como en forma de fragmentos scFv monovalentes libres, habiéndose demostrado esto último también para el anticuerpo específico de 17-1A humano VD4.5VK8 (Ejemplo 3) obtenido in vitro a partir de una biblioteca de fagos. Las cuatro especificidades se unen al antígeno 17-1A en forma de moléculas de anticuerpo completas. Por consiguiente, el problema técnico subyacente a la presente invención era proporcionar medios y métodos para identificar polipéptidos bi- o multivalentes que comprendieran sitios de unión a anticuerpo capaces de unirse eficazmente al antígeno correspondiente. La solución a dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método de identificación de un dominio de sitio de unión que tiene la capacidad de unirse a un epítopo predeterminado cuando se sitúa en posición C-terminal con respecto a al menos un dominio adicional en un polipéptido bi- o multivalente recombinante, que comprende las etapas de:

(a) ensayar un panel de dominios de sitio de unión presentados en la superficie de un sistema de presentación biológico como parte de una proteína fusión para la unión a un epítopo predeterminado, donde dicha proteína de fusión comprende

(i): un dominio de bloqueo N-terminal adicional que es o que procede del dominio N2 del producto del gen III de fago filamentoso y que se sitúa en posición N-terminal con respecto a dicho dominio de sitio de unión y

(ii): una secuencia de aminoácidos que interviene en el anclaje de la proteína de fusión a la superficie de dicho sistema de presentación; y

(b) identificar un dominio de sitio de unión que se une a dicho epítopo determinado. Preferiblemente, el dominio de sitio de unión capaz de unirse a un determinante antigénico preseleccionado comprende una secuencia de aminoácidos homóloga a la secuencia de una región variable de una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse a dicho epítopo preseleccionado.

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La expresión "dominio de sitio de unión", como se usa de acuerdo con la presente invención, denota un dominio que comprende una estructura tridimensional capaz de unirse a un epítopo.

La expresión "polipéptido bi- o multivalente", como se usa en este documento, indica un polipéptido que comprende al menos dos secuencias de aminoácidos procedentes de orígenes diferentes en las que uno de dichos orígenes especifica el dominio de sitio de unión.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "capacidad de unión a un epítopo" indica la capacidad de dicho dominio de sitio de unión para introducirse y unirse a un epítopo correspondiente, tal como anticuerpos nativos o fragmentos scFv libres. El término "panel", como se usa de acuerdo con la presente invención, se refiere a dos o más pares de los dominios citados. Preferiblemente, dicho panel procede de una biblioteca tal como una genoteca de ADNc o, más preferiblemente, una biblioteca combinatoria de, por ejemplo, cadenas V_{H}/V_{L}.

La proteína de fusión es capaz de unirse a un epítopo preseleccionado y, preferiblemente, tiene una especificidad al menos sustancialmente idéntica a la especificidad de unión de, por ejemplo, la molécula de inmunoglobulina de la que procede. Dichos dominios de sitio de unión pueden tener una afinidad de unión de al menos 10^{6} M^{-1}, preferiblemente 10^{8} M^{-1} y ventajosamente de hasta 10^{10} M^{-1} o superior.

El dominio adicional presente en la proteína de fusión puede unirse mediante un enlazador polipeptídico al dominio de sitio de unión. Además dicho dominio adicional puede ser de una especificidad o función predefinida. Por ejemplo, la bibliografía contiene una multitud de referencias para el concepto de dirección de sustancias bioactivas tales como fármacos, toxinas y enzimas a puntos específicos en el cuerpo para destruir o localizar células malignas o para inducir un fármaco o efecto enzimático localizado. Se ha propuesto conseguir este efecto por conjugación de la sustancia bioactiva con anticuerpos monoclonales (véase, por ejemplo, N.Y. Oxford University Press; y Ghose, (1978) J. Natl. Cancer Inst. 61: 657-676). Sin embargo, la construcción de proteínas multifuncionales dirigidas correspondientes está obstaculizada por el hecho de que las proteínas quiméricas pierden su afinidad y/o especificidad de unión debido a la presencia de secuencias extra y los trabajos de estimación resultaron ser insuficientes para remediar este obstáculo. El método de la presente invención puede resolver este problema y por lo tanto puede usarse para preparar e identificar dichas proteínas multifuncionales que sustancialmente conservan tanto la afinidad de unión como la función del dominio o dominios adicionales. En una realización preferida del método de la invención, el dominio del sitio de unión y dicho dominio adicional se unen por medio de un enlazador polipeptídico dispuesto entre dicho sitio de unión y dicho dominio adicional, donde dicho enlazador polipeptídico comprende múltiples aminoácidos hidrófilos unidos por enlaces peptídicos y conecta el extremo N-terminal de dicho sitio de unión y el extremo C-terminal de dicho dominio adicional.

Como bien se sabe, Fv, el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo, consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera (V_{H} y V_{L}) en asociación no covalente. Es en esta configuración en la que las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. En conjunto, las seis CDR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Las regiones flanqueantes (FR) que flanquean las CDR tienen una estructura terciaria que está esencialmente conservada en inmunoglobulinas nativas de especies tan diversas como seres humanos y ratones. Estas FR sirven para mantener las CDR en su orientación apropiada. Los dominios constantes no son necesarios para la función de unión, pero pueden ayudar a estabilizar la interacción V_{H}-V_{L}. Incluso un solo dominio variable (o la mitad de una Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tienen la capacidad de reconocer y unirse a un antígeno, aunque a una menor afinidad que un sitio de unión completo (Painter (1972) Biochem. 11: 1327-1337).

Por lo tanto, en una realización particularmente preferida del método de la invención, dicho dominio de sitio de unión es un par de dominios V_{H}-V_{L}, V_{H}-V_{H} o V_{L}-V_{L} de la misma o de diferentes inmunoglobulinas.

El orden de los dominios V_{H} y V_{L} dentro de la cadena polipeptídica no es decisivo para la presente invención, el orden de los dominios dado en este documento anteriormente puede invertirse sin ninguna pérdida de función. Sin embargo es importante que los dominios V_{H} y V_{L} se dispongan de modo que el sitio de unión a antígeno pueda plegarse apropiadamente.

De acuerdo con la presente invención, el término "identificar" se refiere, en su sentido más amplio, a la identificación de un clon que comprende el dominio del sitio de unión apropiadamente, preferiblemente dicho clon puede purificarse y puede determinarse la secuencia del dominio del sitio de unión, por ejemplo, dominios V_{H} y V_{L}.

De forma natural, el método de la invención no sólo es aplicable a la identificación de un solo par de dominios V_{H} y V_{L}, sino que también puede aplicarse a la identificación y aislamiento de una diversidad de dichos pares.

Antes de establecer el método de la invención, se consideraron una diversidad de parámetros que se esperaba que posiblemente influyeran en la actividad de unión de fragmentos de anticuerpo scFv localizados en el extremo C-terminal de polipéptidos multivalentes, en particular de moléculas de cadena sencilla bifuncionales. Por lo tanto, se produjeron construcciones con enlazadores glicina-serina de 5 y 15 aminoácidos entre el fragmento de CD80 y el fragmento scFv así como disposiciones de dominios alternativas, en concreto V_{L}-V_{H} y V_{H}-V_{L} dentro del fragmento scFv C-terminal, y se analizaron con respecto a la unión a antígeno (Ejemplos 1 y 2).

Sin embargo, la unión a antígeno de fragmentos scFv que perdieron su actividad de unión debido a su posición en el extremo C-terminal de moléculas de cadena sencilla bifuncionales no podía reconstituirse usando diferentes longitudes de enlazadores y/o cambiando la disposición de los dominios V_{L} y V_{H} en ninguno de los Ejemplos ensayados.

Sorprendentemente, se ha descubierto ahora de acuerdo con la presente invención que mediante el uso de un nuevo método de selección in vitro basado en la tecnología de presentación en fagos (Figura 11), los fragmentos de anticuerpo scFv que se unen independientemente de su posición dentro de proteínas de fusión de cadena sencilla bifuncionales podrían aislarse a partir de, a modo de Ejemplo, bibliotecas de anticuerpos combinatorias (Ejemplos 5 y 6).

La presente invención abarca por lo tanto significativamente la aplicabilidad de polipéptidos multivalentes tales como moléculas de cadena sencilla bifuncionales.

Para simular funcionalmente el contexto C-terminal en polipéptidos multivalentes ejemplificados por construcciones de cadena sencilla bifuncionales, se fusionó el extremo N-terminal de fragmentos V_{H}-V_{L} de anticuerpo scFv, respectivamente el del dominio V_{H}, al extremo C-terminal de una extensión de aminoácidos que se pliegan en una estructura tridimensional. Experimentalmente, esto se consiguió empleando el dominio N2 del producto del gen III de un fago filamentoso (Krebber, FEBS Letters 377 (1995) 227-231). Por consiguiente, el dominio N2 desempeña el papel de un sustituto para cualquier dominio preferiblemente funcional localizado en el extremo N-terminal de un par de dominios V_{H} y V_{L} dentro de una proteína de cadena sencilla y bi- o multivalente. El fragmento scFv "bloqueado N-terminalmente" N2-V_{H}-V_{L}, respectivamente el extremo C-terminal de V_{L}, se fusionó a una secuencia de aminoácidos que media el anclaje de la proteína de fusión a la superficie de un fago. Experimentalmente, esto se realizó empleando el extremo N-terminal del dominio CT C-terminal del producto del gen III de un fago filamentoso (Barbas, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (1991) 7978-7982). En lo siguiente, la invención se explicará con más detalle basándose en los experimentos que se realizaron realmente: el ADN que codifica la proteína de fusión N2-V_{H}-V_{L}-CT puede clonarse en un vector fagémido (por ejemplo, pComb3H) y utilizarse para transformar una cepa de E. coli macho (por ejemplo, XL1-blue) que, después de la infección con un fago auxiliar filamentoso, produce partículas de fago que llevan la proteína de fusión N2-V_{H}-V_{L}-CT en su superficie y que contienen una copia de cadena sencilla del ADN correspondiente. Este acoplamiento de fenotipo y genotipo permite seleccionar y enriquecer -mediante varias rondas de selección en el antígeno- a partir de grandes repertorios de combinaciones de V_{H}/V_{L}, los fragmentos de anticuerpo scFv "bloqueados N-terminalmente" que no obstante conservan su actividad de unión a antígeno. Para ensayar el método de la invención, se inmunizaron ratones con antígeno 17-1A soluble recombinante; los animales con título de anticuerpos en suero anti-17-1A detectables se sacrificaron, se preparó el ARN total a partir de esplenocitos murinos y se realizó una transcripción inversa en ADNc usando sensibilización con hexámeros aleatorios. El repertorio de V_{L} y V_{H} de la presente respuesta de anticuerpos se amplificó por PCR usando cebadores oligonucleotídicos específicos de subfamilia de V_{L} y V_{H} y se clonó en el vector fagémido pComb3H que ya contiene las secuencias de ADN que codifican el dominio N2 y CT del producto de gen III de fago filamentoso. Esta biblioteca de anticuerpos combinatoria se utilizó para transformar la cepa de E. coli XL1-blue para avanzar posteriormente con la selección in vitro por selección sobre antígeno 17-1A inmovilizado de acuerdo con el método de presentación en fagos (Winter, Annu. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455; Barbas, METHODS, A companion to Methods in Enzymology 2 (1991) 119-124). Después de la tercera, cuarta y quinta vueltas de selección, se generaron fragmentos de cadena sencilla de N2-V_{H}-V_{L} solubles de clones individuales por escisión de la secuencia del gen III-CT antes de la expresión periplasmática en E. coli y se ensayaron por ELISA con respecto a la unión al antígeno 17-A1 inmovilizado. Las regiones V_{L} y V_{H} de fragmentos scFv "bloqueados con N2" que se unían al antígeno 17-A1 se secuenciaron y se subclonaron en el vector de expresión de mamífero pEF-DHFR que ya contiene la secuencia codificante del fragmento de CD80 extracelular, dando como resultado por lo tanto una construcción final que codifica una proteína de cadena sencilla bifuncional con el fragmento de CD80 localizado en la posición N-terminal (Ejemplo 7). Además, también se clonó en este contexto bifuncional un par V_{H}-V_{L} derivado de una línea celular de hibridoma murino específica de 17-1A (Ejemplo 4) y otro par V_{H}-V_{L} específico de 17-1A seleccionado de una biblioteca de anticuerpos combinatoria humana por el método de presentación en fagos convencional (Ejemplo 3). Las construcciones de cadena sencilla bifuncionales se introdujeron por transfección en células CHO deficientes en DHFR usando medio de cultivo sin nucleósidos para la selección primaria y la expresión de proteínas se aumentó posteriormente por amplificación génica usando el inhibidor de DHFR metotrexato a una concentración final de 20 nM. Las proteínas bifuncionales recombinantes se secretaron en el sobrenadante de cultivo; los sobrenadantes de cultivo de los diferentes clones se analizaron con respecto a la unión a antígeno por ELISA en antígeno 17-1A recombinante inmovilizado (Ejemplo 8) y por citometría de flujo en células CHO transfectadas con la forma transmembrana del antígeno 17-1A (Ejemplo 9). Las nueve construcciones de cadena sencilla bifuncionales diferentes obtenidas a partir el método de la invención demostraron unirse al antígeno 17-1A como se demostró en los dos ensayos de unión (ELISA y FACS) (Figuras 8.1, 8.2 y 9.1); sin embargo, las dos construcciones de cadena sencilla bifuncionales obtenidas convencionalmente no se unieron al antígeno 17-1A (Figuras 8.3, 8.4 y 9.1). Como se muestra en el Ejemplo 10, pudo confirmarse adicionalmente que la unión a antígeno específica de los fragmentos de anticuerpo scFv obtenidos por el método de la invención no depende de un dominio N-terminal adicional particular (como la parte extracelular de CD80) dentro de una proteína de cadena sencilla bifuncional. En su conjunto, estos datos demuestran que los fragmentos de anticuerpo scFv que conservan su actividad de unión a antígeno en la posición C-terminal de proteínas de cadena sencilla bifuncionales pueden obtenerse selectivamente por el método de la invención que implica un dominio sustituto N-terminal que simula el efecto de otros dominios funcionales fusionados al extremo N-terminal de fragmentos de anticuerpo scFv. Esta estrategia ejemplar puede transferirse por el especialista en la técnica a cualquier otro par de dominios V_{H} y V_{L} comprendido en un polipéptido multivalente en la posición o posiciones indicadas anteriormente.

En una realización preferida de la presente invención, dicho sistema de presentación biológica es un fago filamentoso producido por bacterias transfectadas con el mismo, un sistema de expresión en baculovirus, un sistema de presentación basado en ribosomas, un sistema de presentación en bacteriófago lambda o un sistema de expresión de superficie bacteriana basado, por ejemplo, en la proteína ompA.

Se ha descrito un ejemplo de un sistema de presentación en ribosomas, por ejemplo, por Hanes, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (1997) 4937-4942. Los ejemplos de los otros sistemas a los que se ha hecho referencia anteriormente están bien establecidos en la técnica (Mottershead, Biochem. Biophys. Res. Commun. 238 (1997) 717-722; Sternberg, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 1609-1613; Stahl, Trends Biotechnol, 15 (1997) 185-192).

En lo que se refiere a las bacterias transfectadas con el fago, se prefiere que las bacterias sean E. coli.

Haciendo referencia ahora al procedimiento experimental usado para explicar la invención y que se ha descrito de este documento anteriormente, en una realización preferida adicional de la invención, dicho método comprende antes de la etapa (a) la etapa adicional de (a'') transfectar bacterias con vectores recombinantes que codifican dichas proteínas de fusión. Preferiblemente, dichos vectores son vectores fagémidos.

En una realización preferida adicional de la invención, dicho método comprende antes de la etapa (a''), la etapa adicional de (a') clonar un panel de moléculas de ácido nucleico que codifican el dominio del sitio de unión, por ejemplo, pares de dominios V_{H} y V_{L} en un vector.

En una realización más preferida de la invención, dicho panel de moléculas de ácido nucleico procede de células inmunocompetentes de un mamífero, pez o ave. Esta realización se prefiere particularmente en la medida en que refleja el repertorio inmune del compartimento de células B del mamífero que puede amplificarse y clonarse por RT-PCR usando cebadores o conjuntos de cebadores oligonucleotídicos específicos de V_{L} y V_{H}.

En una realización preferida adicional de la invención, dicho dominio adicional comprende al menos 9 aminoácidos. Preferiblemente, dicho dominio adicional no es suficiente para mediar la infectividad de fagos cuando se presenta en la superficie de partículas de fago.

Como se ha descrito anteriormente, el dominio de bloqueo N-terminal adicional es o procede del dominio N2 del producto del gen III de fago filamentoso. Preferiblemente, N2 no es capaz de mediar la infectividad del fago.

En una realización preferida de la invención, dicha secuencia que media en dicho anclaje es o procede del dominio CT C-terminal del producto del gen III de fago filamentoso. Sin embargo, pueden usarse también otros dominios adecuados que se sabe que son capaces de mediar el anclaje a superficies, por ejemplo, de presentaciones en fago.

En una realización preferida adicional de la invención, dicho polipéptido bi- o multivalente es un polipéptido bi- o multifuncional.

En una realización más preferida de la invención, dicho al menos un dominio adicional comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en proteínas efectoras que tienen una conformación adecuada para la actividad biológica, secuencias de aminoácidos capaces de secuestrar un ión y secuencias de aminoácidos capaces unirse de manera selectiva a un soporte sólido. Preferiblemente, dicha proteína efectora es una enzima, toxina, receptor, sitio de unión, sitio de unión a anticuerpo biosintético, factor de crecimiento, factor de diferenciación celular, linfocina, citocina, hormona, un resto detectable remotamente o un antimetabolito. Además, dicha secuencia es capaz de secuestrar un ión que se selecciona preferiblemente de calmodulina, metalotioneína, un fragmento de la misma o una secuencia de aminoácidos rica en al menos uno de ácido glutámico, ácido aspártico, lisina y arginina. Además, dicha secuencia polipeptídica capaz de unirse de forma selectiva a un soporte sólido puede ser una secuencia de aminoácidos cargada positivamente o negativamente, una secuencia de aminoácidos que contiene cisteína, avidina, estreptavidina o un fragmento de proteína A de Staphylococcus.

Las proteínas efectoras y las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente pueden estar presentes en una proforma que es activa o no por sí misma y que puede eliminarse cuando, por ejemplo, se introduce en un entorno celular determinado.

En una realización más preferida de la invención, dicho receptor es una molécula de superficie coestimuladora importante para la activación de células T o comprende un sitio de unión a epítopo o un sitio de unión a hormona.

En una realización más preferida adicional de la invención, dicha molécula de superficie coestimuladora es CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD58 (LFA-3) o CD54 (ICAM-1).

En una realización más preferida adicional de la invención, dicho sitio de unión a epítopo está incluido en un par de dominios V_{H}-V_{L}, V_{H}-V_{H} y V_{L}-V_{L}.

En una realización preferida de la invención, dichos dominios V_{H} y/o V_{L} están conectados por un enlazador flexible, preferiblemente un enlazador polipeptídico dispuesto entre dichos dominios, donde dicho enlazador polipeptídico comprende múltiples aminoácidos hidrófilos unidos por enlaces peptídicos de una longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C-terminal de uno de dichos dominios y el extremo N-terminal del otro de dichos dominios cuando dicha proteína de fusión asume una conformación adecuada para la unión cuando se dispone en solución acuosa.

En una realización preferida adicional de la invención, la identificación de dicho dominio de sitio de unión comprende las etapas de

(a) eliminar dicha secuencia de aminoácidos que interviene en el anclaje de la proteína de fusión a la superficie de un fago de dicha proteína de fusión;

(b) expresar periplasmáticamente las moléculas de ácido nucleico que codifican el resto de dicha proteína de fusión en bacterias; y

(c) verificar si dicho dominio de sitio de unión se une a dicho epítopo predeterminado.

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También se describe en este documento un vector recombinante como se ha definido en las realizaciones descritas anteriormente y una célula hospedadora que alberga y es capaz de expresar dicho vector recombinante.

En una realización preferida adicional de la invención, el kit comprende

(a) el vector recombinante descrito o un panel de vectores recombinantes que codifican un panel de proteínas de fusión como se han definido en las realizaciones descritas anteriormente, donde dicho dominio adicional comprendido en dichas proteínas de fusión es un dominio de bloqueo N-terminal que es o que procede del dominio N2 del producto del gen III de fago filamentoso; y/o

(b) la célula hospedadora descrita o una biblioteca bacteriana transfectada con un panel de vectores como se ha definido en (a).

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Además, la presente invención se refiere a un dominio de sitio de unión o una proteína de fusión que puede obtenerse por el método de la invención, caracterizados anteriormente en las realizaciones. Ventajosamente, la secuencia de aminoácidos que media el anclaje de la proteína de fusión a la superficie de un fago de dicha proteína de fusión se elimina de la proteína de fusión. Por lo tanto, la proteína de fusión resultante puede comprender solamente el dominio de sitio de unión y un dominio adicional, preferiblemente una proteína efectora como se ha descrito anteriormente.

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En una realización preferida de la presente invención, el dominio de sitio de unión, por ejemplo, contenido en una proteína de fusión comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) del fragmento scFv que se muestra en una cualquiera de las Figuras 6.3 a 6.10 y 7. El especialista en la técnica sabía que cada dominio variable comprende tres regiones hipervariables, a veces denominadas regiones determinantes de complementariedad o "CDR" flanqueadas por cuatro regiones flanqueantes o "FR" relativamente conservadas. Las CDR contenidas en las regiones variables que se muestran en las Figuras 6.3 a 6.10 y 7 pueden determinarse de acuerdo con Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (U.S. Department of Health and Human Services, tercera edición, 1983, cuarta edición, 1987, quinta edición 1990).

El especialista en la técnica apreciará fácilmente que el dominio del sitio de unión o la proteína de fusión identificada de acuerdo con el método de la invención o al menos una CDR derivada de la misma puede usarse para la construcción de otros polipéptidos o anticuerpos de especificidad y función biológica deseadas. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a polipéptidos y anticuerpos que comprenden un dominio de sitio de unión o proteína de fusión de la invención. Preferiblemente, dicho polipéptido o anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada en una cualquiera de las Figuras 6.3 a 6.10 y 7. El especialista en la técnica apreciará fácilmente que usando los sitios de unión o las CDR descritas anteriormente, pueden construirse anticuerpos de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en los documentos EP-A1 0 451 216 y EP-A1 0 549 581.

En otra realización adicional, la presente invención se refiere a polinucleótidos que tras la expresión codifican los polipéptidos y anticuerpos descritos anteriormente. Dichos polinucleótidos pueden fusionarse con secuencias de control de la expresión adecuadas conocidas en la técnica para asegurar una transcripción y traducción apropiadas del polipéptido.

Además, los polinucleótidos pueden estar comprendidos en un vector que comprende además un marcador de selección.

En una realización adicional más, la presente invención se refiere a una célula que contiene el polinucleótido descrito anteriormente. Preferiblemente, dicha célula es una célula de mamífero si se prevén usos terapéuticos del polipéptido. Por supuesto, pueden servir también células de levaduras y bacterianas, en particular si el polipéptido producido se usa como medio de diagnóstico.

En una realización adicional, la presente invención se refiere por lo tanto a un proceso para la preparación de una proteína de fusión que puede obtenerse por el método de acuerdo con la invención, un polipéptido o un anticuerpo como se ha descrito anteriormente, que comprende el cultivo de una célula de la invención en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína o polipéptido de fusión y el aislamiento de la proteína de fusión, polipéptido o anticuerpo a partir del medio de cultivo de la célula.

Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene una proteína de fusión, polipéptido o anticuerpo de la invención y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En lo que se refiere a una realización adicional, la presente invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende una proteína de fusión, polipéptido o anticuerpo como se ha descrito anteriormente y opcionalmente medios adecuados para la detección.

La presente invención permite la producción recombinante de sitios de unión de cadena sencilla que tienen afinidad y especificidad por un epítopo predeterminado. Esta tecnología se ha desarrollado y se describe en este documento. En vista de esta descripción, los especialistas en la tecnología del ADN recombinante, diseño de proteínas y química de proteínas pueden producir dichos sitios que, cuando se disponen en solución, tienen altas constantes de unión (habitualmente de al menos 10^{6}, preferiblemente 10^{8} M^{-1}) y una especificidad excelente. Como es evidente a partir de lo anterior, la invención proporciona una gran familia de dominios de sitio de unión y proteínas de fusión así como polipéptidos que comprenden dichos dominios de sitio de unión y proteínas de fusión para cualquier uso en estrategias terapéuticas y de diagnóstico. Será evidente para los especialistas en la técnica que los dominios de sitio de unión y proteínas de fusión pueden acoplarse adicionalmente a otros restos, por ejemplo, para direccionamiento de fármacos y aplicaciones de formación de imágenes. Dicho acoplamiento puede realizarse químicamente después de la expresión de las proteínas o polipéptidos de fusión con un sitio de unión o el producto de acoplamiento puede modificarse genéticamente para dar el polipéptido de la invención a nivel del ADN. Los ADN se expresan después en un sistema hospedador adecuado y las proteínas expresadas se recogen y se renaturalizan si es necesario. Como se ha descrito anteriormente, el dominio de sitio de unión procede preferiblemente de la región variable de anticuerpos, preferiblemente anticuerpos monoclonales. A este respecto, la tecnología del hibridoma permite la producción de líneas celulares que secretan anticuerpos contra esencialmente cualquier sustancia deseada que produzca una respuesta inmune. El ARN que codifica las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina puede obtenerse después a partir del citoplasma del hibridoma. La porción 5' terminal del ARNm puede usarse para preparar ADNc que se usará en el método de la presente invención.

El ADN que codifica las proteínas de fusión obtenidas de acuerdo con el método de la invención puede expresarse después en células, preferiblemente células de mamífero.

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Dependiendo de la célula hospedadora, pueden ser necesarias técnicas de renaturalización para lograr una conformación apropiada. Las diversas proteínas pueden ensayarse después adicionalmente para determinar su capacidad de unión y puede seleccionarse una que tenga una afinidad apropiada para su incorporación en un polipéptido del tipo descrito anteriormente. Si es necesario, pueden realizarse mutaciones puntuales que buscan optimizar la unión en el ADN usando mutagénesis mediante casete convencional u otra metodología de modificación genética de proteínas tal como se describe más adelante.

La preparación de los polipéptidos de la invención también depende del conocimiento de la secuencia de aminoácidos (o de la secuencia de ADN o ARN correspondiente) de proteínas bioactivas tales como enzimas, toxinas, factores de crecimiento, factores de diferenciación celular, receptores, antimetabolitos, hormonas o diversas citocinas o linfocinas. Dichas secuencias se describen en la bibliografía y están disponibles mediante bancos de datos
computarizados.

Las secuencias de ADN del sitio de unión y el segundo dominio proteico se fusionan usando técnicas convencionales o se ensamblan a partir de oligonucleótidos sintetizados y después se expresan usando técnicas igualmente convencionales.

Los procesos para manipular, amplificar y recombinar el ADN que codifica secuencias de aminoácidos de interés se conocen bien en general en la técnica, y por lo tanto, no se describen con detalle en este documento. Los métodos para identificar y aislar genes que codifican anticuerpos de interés se entienden bien y se describen en la solicitud y otra bibliografía. En general, los métodos implican la selección de material genético que codifica aminoácidos que definen las proteínas de interés, incluyendo las CDR y FR de interés, de acuerdo con el código genético.

Por consiguiente, la construcción de ADN que codifica proteínas como se describe en este documento puede realizarse usando técnicas conocidas que implican el uso de diversas enzimas de restricción que realizan cortes específicos de secuencias en el ADN para producir extremos romos o extremos cohesivos, ADN ligasas, técnicas que permitan la adición enzimática de extremos cohesivos a ADN de extremos romos, construcción de ADN sintéticos por ensamblaje de oligonucleótidos de longitud corta o media, técnicas de síntesis de ADNc y sondas sintéticas para aislar inmunoglobulina u otros genes de proteínas bioactivas. También se conocen y están disponibles diversas secuencias promotoras y otras secuencias de ADN reguladoras usadas para conseguir la expresión, y diversos tipos de células hospedadoras. Las técnicas de transfección convencionales y técnicas igualmente convencionales para clonar y subclonar ADN son útiles en la práctica de esta invención y son conocidas para los especialistas en la técnica. Pueden usarse diversos tipos de vectores tales como plásmidos y virus que incluyen virus animales y bacteriófagos. Los vectores pueden aprovechar diversos genes marcadores que confieren a una célula transfectada con éxito una propiedad fenotípica detectable que puede usarse para identificar cuál de una familia de clones ha incorporado con éxito el ADN recombinante del vector.

Éstas y otras realizaciones se describen y se incluyen en la descripción y Ejemplos de la presente invención. Por ejemplo, puede recuperarse una bibliografía adicional en relación con uno cualquiera de los métodos, usos y compuestos que se emplearán de acuerdo con la presente invención a partir de bibliotecas públicas, usando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, puede utilizarse la base de datos pública "Medline" que está disponible en Internet, por ejemplo en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. El especialista en la técnica conoce bases de datos y direcciones adicionales tales como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, y también pueden obtenerse, usando, por ejemplo, http://www.lycos.com. Se proporciona una visión general de la información de patentes en biotecnología y una inspección de fuentes pertinentes de información de patentes útiles para búsqueda retrospectiva y para conocimientos actuales en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Las Figuras muestran:

Figura 1.1: diseño de diversas construcciones de CD80-scFv bifuncionales que muestran los elementos de construcción a nivel de proteína. V_{H} indica la región variable de la cadena pesada de Ig, V_{L} la de la cadena ligera de Ig. Los fragmentos Fv de cadena sencilla usados en la presente invención se proporcionan en los Ejemplos 1, 2, 3, 4 y 9.

Figura 1.2: secuencia de ADN designada CTI que se clonó en el sitio de clonación múltiple del vector Bluescript KS (número de acceso de GenBank® X52327) usando los sitios de restricción XbaI y SalI para aumentar el número de sitios de clonación posibles. Se muestran sitios de escisión de enzimas de restricción derivados de CTI.

Figura 1.3: diseño de diversas construcciones de CD80-scFv bifuncionales que muestran los elementos de construcción a nivel de ADN así como los sitios de escisión de enzimas de restricción usados.

Figura 1.4: análisis por ELISA del sobrenadante de cultivo celular obtenido a partir de células CHO transfectadas con el plásmido de expresión pEF-DHFR+CTI+CD80-M79scFv(V_{L}/V_{H}) que incluye la secuencia codificante del enlazador corto (Gly_{4}Ser_{1})_{1}. Se incubaron placas de ELISA de 96 pocillos con 50 \mul de antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml) por pocillo. Posteriormente se añadieron diluciones de sobrenadante de cultivo puro del mismo como se indica. La detección se realizó mediante un anticuerpo de IgG1 murina anti-marcador His (dianova, Hamburg) diluido a 1:200 y un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de ratón (Fc) conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) diluido a 1:5000. Como control positivo se usó el anticuerpo de cadena sencilla biespecífico anti-17-1A/anti-CD3 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). Como control negativo, los pocillos se incubaron con solución salina tamponada con fosfato. El ELISA se reveló mediante solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 1.5: análisis ELISA del sobrenadante de cultivo celular obtenido de células CHO transfectadas con el plásmido de expresión pEF-DHFR+CTI+CD80-M79scFv(V_{L}/V_{H}) que incluye la secuencia codificante del enlazador corto (Gly_{4}Ser_{1})_{1}. Se incubaron placas de ELISA de 96 pocillos con 50 \mul de antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml) por pocillo. Posteriormente, se añadieron sobrenadante de cultivo celular puro y diluciones del mismo como se indica. La detección se realizó mediante un anticuerpo de IgG1 murina anti-CD80 diluido a 1:1000 seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de ratón (Fc) conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) diluido a 1:5000. El anticuerpo de cadena sencilla biespecífico anti-17-1A/anti-CD3 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) se usó como control positivo y se detectó como se describe en la Figura 1.4. Como control negativo se incubaron los pocillos con solución salina tamponada con fosfato. El ELISA se reveló mediante una solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 1.6: análisis ELISA de la construcción CD80-M79scFv(V_{L}/V_{H}) recombinante purificada con un enlazador corto (Gly_{4}Ser_{1})_{1} obtenida por purificación a partir de sobrenadante de cultivo celular usando una columna Ni-NTA como se describe (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos durante una noche a 4ºC con eluido puro de la columna de Ni-NTA y diluciones del mismo como se indica. Posteriormente se detectó la proteína recombinante unida mediante un anticuerpo de IgG1 murina anti-CD80 diluido a 1:1000 o mediante un anticuerpo de IgG murina anti-marcador His (dianova, Hamburg) diluido a 1:2000 seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de ratón (Fc) conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) diluido respectivamente 1:5000. Como control negativo, se recubrieron pocillos durante una noche a 4ºC con BSA al 3% en solución salina tamponada con fosfato. El ELISA se reveló mediante una solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 1.7: análisis ELISA del sobrenadante de cultivo celular obtenido de células CHO transfectadas con el plásmido de expresión pEF-DHFR+CTI+CD80-M79scFv(V_{H}/V_{L}) incluyendo la secuencia codificante del enlazador corto (Gly_{4}Ser_{1})_{1}. Se incubaron placas de ELISA de 96 pocillos con antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml) por pocillo. Posteriormente, se añadió sobrenadante de cultivo celular puro y diluciones del mismo como se indica. La detección se realizó mediante un anticuerpo de IgG1 murina anti-CD80 diluido a 1:1000 seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de ratón (Fc) conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) diluido a 1:5000. El anticuerpo de cadena sencilla biespecífico anti-17-1A/anti-CD3 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) se usó como control positivo y se detectó como se describe en la Figura 1.4. Como control negativo, se incubaron pocillos con solución salina tamponada con fosfato. El ELISA se procesó mediante una solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 1.8: secuencia de ADN del oligonucleótido bicatenario designado ACCGS15BAM con salientes monocatenarios compatibles con los de enzimas de restricción BspEI y BamHI. Se muestran los aminoácidos codificados por la secuencia de nucleótidos.

Figura 1.9: análisis ELISA del sobrenadante de cultivo celular y de sus diluciones obtenidas a partir de células CHO transfectadas con el plásmido de expresión pEF-DHFR+CTI+CD80-M79scFv(V_{H}/V_{L}) incluyendo la secuencia codificante del enlazador largo (Gly_{4}Ser_{1})_{3}. Se incubaron placas de ELISA de 96 pocillos con 50 \mul de antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml) por pocillo. Posteriormente, se añadieron sobrenadante de cultivo celular puro y diluciones del mismo como se indica. La proteína unida se detectó mediante un anticuerpo murino anti-marcador His (dianova, Hamburg) diluido a 1:200 seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de ratón (Fc) conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) diluido a 1:5000. El anticuerpo de cadena sencilla biespecífico anti-17-1A/anti-CD3 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) se usó como control positivo. Como control negativo, se incubaron pocillos con solución salina tamponada con fosfato. El ELISA se reveló mediante una solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 2.1: análisis ELISA del sobrenadante de cultivo celular obtenido de células CHO transfectadas con los plásmidos de expresión pEF-DHFR+CTI+CD80-M74scFv(V_{H}/V_{L}) o pEF-DHFR+CTI+CD80-M74scFv(V_{L}/V_{H}) incluyendo la secuencia codificante del enlazador largo (Gly_{4}Ser_{1})_{3} o corto (Gly_{4}Ser_{1})_{1}, respectivamente. Se incubaron placas de ELISA de 96 pocillos con 50 \mul de antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml) por pocillo. Posteriormente, se añadieron sobrenadante de cultivo celular puro y diluciones del mismo como se indica. La detección se realizó mediante un anticuerpo de IgG1 murina anti-marcador His (dianova, Hamburg) diluido a 1:1000 y seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de ratón (Fc) conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) diluido a 1:5000. El anticuerpo de cadena sencilla biespecífico anti-17-1A/anti-CD3 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) se usó como control positivo y se detectó como se describe en la Figura 1.4. Como control negativo, se incubaron pocillos con solución salina tamponada con fosfato. El ELISA se reveló mediante una solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 2.2: análisis ELISA del sobrenadante de cultivo celular obtenido de células CHO transfectadas con los plásmidos de expresión pEF-DHFR+CTI+CD80-M74scFv(V_{H}/V_{L}) o pEF-DHFR+CTI+CD80-M74scFv(V_{L}/V_{H}) incluyendo la secuencia codificante del enlazador largo (Gly_{4}Ser_{1})_{3} o corto (Gly_{4}Ser_{1})_{1}, respectivamente. Se incubaron placas de ELISA de 96 pocillos con 50 \mul de antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml) por pocillo. Posteriormente, se añadió sobrenadante de cultivo celular puro y diluciones del mismo como se indica. La detección se realizó mediante un anticuerpo de IgG1 murina anti-CD80 diluido a 1:1000 seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de ratón (Fc) conjugado con peroxidasa (dianota, Hamburg) diluido a 1:5000. El anticuerpo de cadena sencilla biespecífico anti-17-1A/anti-CD3 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) se usó como control positivo y se detectó como se describe en la Figura 1.4. Como control negativo, se incubaron pocillos con solución salina tamponada con fosfato. El ELISA se reveló mediante una solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 3.1: secuencia de ADN y proteína de la región variable de cadena pesada D4.5 humana (V_{H} del anticuerpo anti-17-1A humano VD4.5VK8). El número indica las posiciones de nucleótidos (nt), los aminoácidos se presentan en el código de una sola letra. La CDR1 incluye nt 91 a nt 105, la CDR2 nt 148 a nt 198 y la CDR3 nt 292 a nt 351.

Figura 3.2: secuencia de ADN y proteica de la región variable de cadena ligera kappa 8 humana (V_{L} del anticuerpo anti-17-1A humano VD4.5VK8). Los números indican las posiciones de nucleótidos (nt), los aminoácidos se presentan en el código de una sola letra. La CDR1 incluye nt 70 a nt 102, la CDR2 nt 148 a nt 168 y la CDR3 nt 265 a nt 294.

Figura 3.3: análisis ELISA de fragmento scFv libre (V_{H}/V_{L}) del anticuerpo anti-17-1A humano VD4.5VK8. La secuencia que codifica el dominio N2 se escindió del plásmido pComb3H5BHis-VD4.5VK8scFv (Ejemplo 3) usando las enzimas de restricción SalI y XhoI seguido de religación del vector. El plásmido resultante se usó para la expresión periplasmática de fragmento VD4.5VK8-scFv soluble en E. coli XL1-blue de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 6. El análisis de la unión al antígeno 17-1A del fragmento VD4.5VK8-scFv soluble se realizó de la forma siguiente: se incubaron placas ELISA de 96 pocillos con antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml). Posteriormente, se añadió preparación de periplasma puro. La detección se realizó mediante un anticuerpo de IgG murina anti-marcador His diluido en 1:250 seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de ratón (Fc) conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) diluido a 1:5000. El anticuerpo de cadena sencilla biespecífico anti-17-1A/anti-CD3 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) se usó como control positivo y se detectó como se describe en la Figura 1.4. Como control negativo, se usó una preparación de periplasma irrelevante. El ELISA se reveló mediante una solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 3.4: NS3 Frame: secuencia de ADN designada L-F-NS3Frame que se clonó en el sitio de clonación múltiple del vector Bluescript-KS-CTI (Figura 1.2) usando los sitios de restricción EcoRI y SalI para aumentar el número de sitios de clonación posibles. Se muestran los sitios de clonación procedentes de L-F-NS3Frame.

Figura 4: análisis ELISA del sobrenadante de cultivo celular obtenido de células CHO transfectadas con la cadena ligera y pesada del anticuerpo anti-17-1A hecho quimérico MACH (Ejemplo 4). Se incubaron placas de ELISA de 96 pocillos con antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml). Posteriormente, se añadieron sobrenadante de cultivo celular puro y diluciones del mismo como se indica. La detección se realizó mediante un anticuerpo anti-IgG humana biotinilado seguido de estreptavidina. Como control positivo se usó sobrenadante del anticuerpo anti-17-1A murino precursor MACH y diluciones del mismo y se detectó mediante un anticuerpo anti-IgG de ratón biotinilado. Como control negativo se usó solución salina tamponada con fosfato. El ELISA se reveló mediante una solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 5.1: sitio de clonación de pComb3H con sitios de restricción importantes. Se usaron las siguientes abreviaturas: P, promotor lac; V_{L}, dominio de cadena ligera variable, CL, dominio de cadena ligera constante; V_{H}, dominio de cadena pesada variable; CH1, dominio de cadena pesada constante; L1/2 secuencias líder procariotas (L1 = ompA, L2 = peIB).

Figura 5.2: secuencia de ADN del sitio de clonación múltiple de pComb3H5BHis que muestra sitios de escisión de enzimas de restricción importantes así como la secuencia de aminoácidos del enlazador Glicina-Serina y la del dominio N2 del producto del gen III de fago filamentoso. La secuencia de ADN que codifica el dominio N2 comienza en el nt 19 y termina en el nt 411.

Figura 5.3: sitio de clonación de pComb3H5BHis con sitios de restricción importantes. Se usaron las siguientes abreviaturas: P, promotor lac; V_{K}, dominio de cadena ligera kappa variable; V_{H}, dominio de cadena pesada variable; ompA, secuencia líder procariota; N2 está unido a V_{H} mediante un enlazador Gly_{4}Ser_{1}; V_{H} está unido a V_{K} mediante un enlazador (Gly_{4}Ser_{1})_{3}.

Figura 6.1: esquema del plásmido pComb3H5BHis y del fago M13 totalmente expresado. En la parte superior se muestra la organización del líder (L) ompA, V_{H}, V_{K} y gen III. Una partícula de fago M13 expresado representativa (parte inferior) presenta en su superficie el fenotipo de cierto fragmento scFv que consiste en V_{H} y V_{K} unidos con su extremo C-terminal al producto del gen III y con su extremo N-terminal en el dominio N2 y contiene el genotipo correspondiente como ADN monocatenario que codifica dichos elementos proteicos como una sola cadena polipeptídica.

Figura 6.2: análisis ELISA de fragmentos de proteína scFv específicos de 17-1A generados por el método de la invención. Se añadieron preparaciones de periplasma de fragmentos proteicos scFv solubles que contienen el dominio N2 en su extremo N-terminal y que consisten en un solo dominio de cadena Vkappa de ratón y un solo dominio de cadena Vpesada, respectivamente, puras a una placa de ELISA que se había recubierto con antígeno 17-1A soluble. La detección se realizó mediante un anticuerpo de IgG murina anti-marcador His seguido de anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de ratón (Fc) conjugado con peroxidasa. El ELISA se reveló mediante una solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8. Los valores de DO (eje y) se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA. Los clones se presentan en el eje x, el número inferior indica la ronda de selección, el número superior indica el clon ensayado de esa ronda. Los clones 0-1 a 0-9 tienen una combinación de fragmentos scFv no seleccionados y por lo tanto pueden verse como controles negativos. El control positivo es un anticuerpo Fv de cadena sencilla biespecífico anti-17-1A/anti-CD3 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025).

Figura 6.3: secuencia de ADN y proteica del fragmento scFv de ratón 3-1. Los números indican las posiciones de nucleótidos (nt), los aminoácidos (aa) se presentan en el código de una sola letra. Los primeros cuatro aa del fragmento V_{H} están codificados por el plásmido pComb3H5BHis. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena pesada comienza en el nt 1 y termina en el nt 360 seguido de un enlazador (G_{4}S_{1})_{3}. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena kappa comienza en el nt 406 y termina en el nt 726.

Figura 6.4: secuencia de ADN y proteica del fragmento scFv de ratón 3-5. Los números indican las posiciones de nucleótidos (nt), los aminoácidos (aa) se presentan en el código de una sola letra. Los primeros cuatro aa del fragmento V_{H} están codificados por el plásmido pComb3H5BHis. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena pesada comienza en el nt 1 y termina en el nt 372 seguido de un enlazador (G_{4}S_{1})_{3}. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena kappa comienza en el nt 418 y termina en el nt 753.

Figura 6.5: secuencia de ADN y proteica del fragmento scFv de ratón 3-8. Los números indican las posiciones de nucleótidos (nt), los aminoácidos (aa) se presentan en el código de una sola letra. Los primeros cuatro aa del fragmento V_{H} están codificados por el plásmido pComb3H5BHis. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena pesada comienza en el nt 1 y termina en el nt 360 seguido de un enlazador (G_{4}S_{1})_{3}. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena kappa comienza en el nt 406 y termina en el nt 726.

Figura 6.6: secuencia de ADN y proteica del fragmento scFv de ratón 4-1. Los números indican las posiciones de nucleótidos (nt), los aminoácidos (aa) se presentan en el código de una sola letra. Los primeros cuatro aa del fragmento V_{H} están codificados por el plásmido pComb3H5BHis. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena pesada comienza en el nt 1 y termina en el nt 360 seguido de un enlazador (G_{4}S_{1})_{3}. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena kappa comienza en el nt 406 y termina en el nt 744.

Figura 6.7: secuencia de ADN y proteica del fragmento scFv de ratón 4-4. Los números indican las posiciones de nucleótidos (nt), los aminoácidos (aa) se presentan en el código de una sola letra. Los primeros cuatro aa del fragmento V_{H} están codificados por el plásmido pComb3H5BHis. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena pesada comienza en el nt 1 y termina en el nt 360 seguido de un enlazador (G_{4}S_{1})_{3}. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena kappa comienza en el nt 406 y termina en el nt 726.

Figura 6.8: secuencia de ADN y proteica del fragmento scFv de ratón 4-7. Los números indican las posiciones de nucleótidos (nt), los aminoácidos (aa) se presentan en el código de una sola letra. Los primeros cuatro aa del fragmento V_{H} están codificados por el plásmido pComb3H5BHis. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena pesada comienza en el nt 1 y termina en el nt 372 seguido de un enlazador (G_{4}S_{1})_{3}. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena kappa comienza en el nt 417 y termina en el nt 753.

Figura 6.9: secuencia de ADN y proteica del fragmento scFv de ratón 5-3. Los números indican las posiciones de nucleótidos (nt), los aminoácidos (aa) se presentan en el código de una sola letra. Los primeros cuatro aa del fragmento V_{H} están codificados por el plásmido pComb3H5BHis. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena pesada comienza en el nt 1 y termina en el nt 348 seguido de un enlazador (G_{4}S_{1})_{3}. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena kappa comienza en el nt 394 y termina en el nt 717.

Figura 6.10: secuencia de ADN y proteica del fragmento scFv de ratón 5-10. Los números indican las posiciones de nucleótidos (nt), los aminoácidos (aa) se presentan en el código de una sola letra. Los primeros cuatro aa del fragmento V_{H} están codificados por el plásmido pComb3H5BHis. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena pesada comienza en el nt 1 y termina en el nt 360 seguido de un enlazador (G_{4}S_{1})_{3}. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena kappa comienza en el nt 406 y termina en el nt 744.

Figura 7: secuencia de ADN y proteica del fragmento scFv de ratón 5-13. Los números indican las posiciones de nucleótidos (nt), los aminoácidos (aa) se presentan en el código de una sola letra. Los primeros cuatro aa del fragmento V_{H} están codificados por el plásmido pComb3H5BHis. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena pesada comienza en el nt 1 y termina en el nt 360 seguido de un enlazador (G_{4}S_{1})_{3}. La secuencia de ADN codificante de la región V de la cadena kappa comienza en el nt 406 y termina en el nt 744.

Figura 8.1: análisis ELISA de nueve sobrenadantes de cultivo celular (etapa de selección primaria (PS)) obtenidos a partir de células CHO transfectadas con los plásmidos de expresión pEF-DHFR + CTI + CD80 + scFv 17-1A clones 3-1 a 5-13. Se incubaron placas de ELISA de fondo en U de 96 pocillos con 50 \mul de antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml) por pocillo. Se añadieron construcciones de anticuerpos como sobrenadantes de cultivo puros y a las siguientes diluciones: 1:2, 1:4, 1:8. La detección se realizó mediante un anticuerpo monoclonal específico de CD80 diluido a 1:1000 en PBS con BSA al 1% seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de Ratón conjugado con peroxidasa (específico de Fc) (dianova, Hamburg) diluido a 1:5000. El ELISA se reveló finalmente por adición de la solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8. Para los controles negativos, las placas se incubaron con PBS en lugar de construcciones de anticuerpos bifuncionales. Los valores de DO se midieron mediante un lector de ELISA a 405 nm.

Figura 8.2: análisis ELISA de nueve sobrenadantes de cultivo celular (1. Etapa de amplificación (MTX 20 nM) (1. Amp)) obtenidos a partir de células CHO transfectadas con los plásmidos de expresión pEF-DHFR + CTI + CD80 + scFv 17-1A clones 3-1 a 5-13. Se incubaron placas de ELISA de fondo en U de 96 pocillos con 50 \mul de antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml) por pocillo. Se añadieron construcciones de anticuerpos como sobrenadantes de cultivo puros y a las siguientes diluciones: 1:2, 1:4, 1:8. La detección se realizó mediante un anticuerpo monoclonal específico de CD80 diluido a 1:1000 en PBS con BSA al 1% seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de Ratón conjugado con peroxidasa (específico de Fc) (dianova, Hamburg) diluido a 1:5000. El ELISA se reveló finalmente por adición de la solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8. Para los controles negativos, las placas se incubaron con PBS en lugar de construcciones de anticuerpo bifuncionales. Los valores de DO se midieron mediante un lector de ELISA a 405 nm.

Figura 8.3: análisis ELISA de dos sobrenadantes de cultivo celular (etapa de selección primaria (PS)) a partir de construcciones de CD80-scFv bifuncionales específicas de 17-1A que se generaron como se describe en el Ejemplo 3 y 4. Se incubaron placas de ELISA de fondo en U de 96 pocillos con 50 \mul de antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml) por pocillo. Se añadieron construcciones de anticuerpos como sobrenadantes de cultivo puros y a las siguientes diluciones: 1:2, 1:4, 1:8. La detección se realizó mediante un anticuerpo monoclonal específico de CD80 diluido 1:1000 en PBS con BSA al 1% seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de Ratón conjugado con peroxidasa (específico de Fc) (dianova, Hamburg) diluido a 1:5000. El ELISA se reveló finalmente por adición del sustrato ABTS como se ha descrito en el Ejemplo 8. Para los controles negativos, las placas se incubaron con PBS en lugar de construcciones de anticuerpos bifuncionales. Como control positivo se usó un sobrenadante generado en el Ejemplo 7. Los valores de DO se midieron a 405 nm usando un lector de ELISA.

Figura 8.4: análisis ELISA de dos sobrenadantes de cultivo celular (1. Etapa de amplificación (MTX 20 nM) (1. Amp)) a partir de construcciones de CD80-scFv bifuncionales específicas de 17-1A, que se generaron como se describe en el Ejemplo 3 y 4. Se incubaron placas de ELISA de fondo en U de 96 pocillos con 50 \mul de antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml) por pocillo. Se añadieron construcciones de anticuerpos como sobrenadantes de cultivo puras y a las siguientes diluciones: 1:2, 1:4, 1:8. La detección se realizó mediante un anticuerpo monoclonal específico de CD80 diluido a 1:1000 en PBS con BSA al 1% seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de Ratón conjugado con peroxidasa (específico de Fc) (dianova, Hamburg) diluido a 1:5000. El ELISA se reveló finalmente por adición de la solución de sustrato ABTS como se ha descrito en el Ejemplo 8. Para los controles negativos, las placas se incubaron con PBS en lugar de construcciones de anticuerpo bifuncionales. Como control positivo se usó un sobrenadante generado en el Ejemplo 7. Los valores de DO se midieron a 405 nm usando un lector de
ELISA.

Figura 9.1: estudios de unión de construcciones de CD80-scFv bifuncionales específicas de 17-1A en células CHO transfectadas con 17-1A (líneas continuas) y no transfectadas (líneas discontinuas) detectada por citometría de flujo. Se incubaron 5x10^{5} células en 50 \mul de sobrenadante de cultivo celular no diluido que contenía la construcción bifuncional correspondiente. Se detectaron construcciones de CD80-scFv bifuncionales unidas mediante un anticuerpo anti-CD80 monoclonal (Immunotech. Nº Cat.: 1449) diluido a 1:20 en 50 \mul de PBS. Las condiciones de incubación fueron las mismas que se han descrito en la Figura 8.5. El anticuerpo CD80 unido se detectó finalmente mediante un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG + IgM de Ratón (H+L) conjugado con fluoresceína diluido a 1:100 en PBS. La incubación se realizó de nuevo durante 30 minutos en hielo. Para la fijación de células marcadas con fluoresceína se usó paraformaldehído al 1% en PBS. Como primer control negativo se usaron células CHO sin transfectar. El segundo control negativo contenía células transfectadas con 17-1A que se incubaron con PBS en lugar de construcciones de CD80-scFv bifuncionales. Las células se analizaron mediante citometría de flujo en un explorador FACS (Becton Dickinson).

Figura 9.2: Control por FACS de las células CHO después de la transfección con 17-1A. La expresión de 17-1A transmembrana se aumentó por amplificación génica por etapas inducida por la adición posterior de concentraciones crecientes del inhibidor de DHFR MTX a una concentración final de 500 nM, con las etapas de concentración entre 20 nM y 100 nM. En estas células se ensayó la expresión en la membrana de 17-1A por citometría de flujo a una concentración de 10 \mug/ml del anticuerpo específico de 17-1A M79 (Gottlinger, Int. J. Cancer 38 (1986), 47-53) seguido de anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG + IgM (H+L) de Ratón marcado con FITC diluido a 1:100 en PBS. Como control negativo se usaron células CHO no transfectadas, mientras que como control positivo se usó la línea celular de cáncer gástrico humana positiva para 17-1A Kato, obtenida en la ATCC.

Figura 10: Principio de construcción de proteínas de cadena sencilla bifuncionales.

Figura 11: comparación estructural entre fago de tipo silvestre, presentación en fagos convencional y presentación en fagos de acuerdo con el método de la invención.

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Figura 12: análisis ELISA de sobrenadantes de cultivo celular de diferentes construcciones de scFv con anti-17-1A-CD54, anti-17-1A-CD58 y anti-17-1A-CD86 con especificidades anti-17-1A variables (4-7, 5-3, 5-10) obtenidas por el método de la invención. Se incubó sobrenadante de cultivo celular de células CHO transfectadas sometidas a una etapa de amplificación génica (MTX 20 nM, véase el Ejemplo 10) en varias diluciones en placas de ELISA de fondo en U de 96 pocillos con antígeno 17-1A inmovilizado (condiciones de recubrimiento: véase el Ejemplo 8). Se realizó la detección específica de las diferentes construcciones unidas a antígeno 17-1A inmovilizado usando un anticuerpo anti-CD54-(Immunotech Hamburg, Nº Cat. 0544), un anti-CD58-(Immunotech, Hamburg Nº Cat. 0861), o un anticuerpo anti-CD86-(R&D Systems, Nº Cat. MB141) (diluido a 1:1000) seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de Ratón conjugado con peroxidasa (específico de Fc) diluido a 1:5000, respectivamente. El ELISA se reveló finalmente por adición de una solución de sustrato ABTS como se ha descrito en el Ejemplo 8. Para los controles negativos, las placas se incubaron con PBS en lugar de con construcciones de anticuerpos bifuncionales. Los valores de DO se midieron a 405 nm usando un lector de ELISA.

Tabla 1: conjuntos de cebadores para la amplificación de los fragmentos de ADN de V_{H} y VK (5' a 3').

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención:

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Ejemplo 1 Construcciones de CD80-M79scFv 1.1. Construcción de CD80-M79 scFv (V_{L}/V_{H}) con enlazador (Gly_{4}Ser_{1})_{1}

Se construyó una proteína que consiste en el fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) del anticuerpo anti-17-1A murino M79 y la parte extracelular de la proteína coestimuladora humana CD80 (B7-1) conectados mediante un enlazador (Gly_{4}Ser_{1})_{1} (Figura 1.1.). El anticuerpo M79 se obtuvo como se describe por Gottlinger (1986) Int. J. Cancer: 38, 47-53. El fragmento scFv de M79 se clonó como se describe por Mack. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025. El plásmido completo se clonó en varias etapas. Primero, se insertó un polienlazador denominado CTI en el vector Bluescript KS (número de acceso del GenBank® X52327) usando los sitios de escisión de enzimas de restricción XbaI y SalI (Boheringer Mannheim). La introducción del polienlazador CTI proporcionaba sitios de escisión adicionales así como la secuencia que codifica el enlazador (Gly_{4}Ser_{1})_{1}, un marcador de histidina de seis aminoácidos y un codón de terminación como se muestran en la Figura 1.2. El vector Bluescript KS + CTI se preparó por escisión con las enzimas de restricción EcoRV y XmaI (Boheringer Mannheim y New England Biolabs) para ligarlo (ADN Ligasa de T4 Boheringer Mannheim) con el fragmento scFv de M79 escindido por EcoRV y BspEI (New England Biolabs). El vector Bluescript KS+CTI-M79 scFv resultante se escindió de nuevo con EcoRI (Boheringer Mannheim) y BspEI para insertar el fragmento de ADN de CD80 que se había preparado previamente usando las mismas enzimas. Antes de la subclonación, el fragmento de CD80 se obtuvo por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleotídicos específicos complementarios a los extremos 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la parte extracelular de CD80 (Freeman G. J. et al. J. Immunol. 143, (1989) 2714-2722). Estos cebadores también introducían un sitio de escisión EcoRI y BspEI (Cebador 5'CD80: 5'GCA GAA TTC ACC ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG 3'; Cebador 3'CD80: 5'TGG TCC GGA GTT ATC AGG AAA ATG CTC TTG CTT G 3'). El molde de ADNc usado para esta PCR se preparó por transcripción inversa del ARN total preparado a partir de la línea celular de linfoma de Burkitt Raji de acuerdo con procedimientos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2^{a} Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (1989)).

La proteína coestimuladora CD80 pertenece a la superfamilia de Ig. Es una proteína muy glicosilada de 262 aminoácidos. Se publicó una descripción más detallada por Freeman G. J et al. J. Immunol. 143, (1989) 2714-2722.

En la última etapa, se aisló el fragmento de ADN de CD80-M79scFv (V_{L}/V_{H}) completo (Figura 1.3.1) por escisión del vector Bluescript KS+CTI-CD80-M79scFv (V_{L}/V_{H}) con EcoRI y SalI (Boheringer Mannheim) y posteriormente se introdujo en el vector de expresión eucariota pEF-DHFR descrito en Mack et al. Proc. Natl. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025 que contenía el gen de la dihidrofolatorreductasa como marcador de selección. El plásmido final se linealizó con la enzima de restricción NdeI (Boheringer Mannheim) y se utilizó para transfectar células CHO por medio de electroporación. Las condiciones de electroporación fueron 260V/960\muFD usando un BioRad Gene Pulser^{TM}. Se realizó una expresión estable en células CHO deficientes en DHFR como se describe por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Las células se cultivaron para selección en medio \alpha-MEM sin nucleósidos complementado con FCS dializado al 10% y L-glutamina 2 mM. Para la producción de la construcción de CD80-M79 scFv (V_{L}/V_{H}) bifuncional, las células se cultivaron en frascos rotatorios (Falcon) durante 7 días en 300 ml de medio cultivo. La proteína se purificó a través de su marcador His unido al extremo C-terminal (véase la Figura 1.1.) usando una columna Ni-NTA (Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025). Para analizar las propiedades de unión se realizaron diferentes ensayos ELISA:

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1.1.1. ELISA con sobrenadante de cultivo celular usando detección anti-marcador His

Se analizó la unión al antígeno 17-1A usando antígeno 17-1A soluble obtenido como se describe (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025) por expresión estable en células CHO del ADN que codifica los primeros 264 aminoácidos del antígeno 17-1A también conocido como GA 733-2 (Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990) 3542-3546) seguido de un codón de terminación. El antígeno se inmovilizó en placas de ELISA de fondo en U de 96 pocillos (nunc maxisorb) a una concentración de 50 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato PBS. Se realizó el recubrimiento a 4ºC durante 12 horas con 50 \mul seguido de lavado una vez con (PBS) con Tween al 0,05%. El ELISA se bloqueó después durante 1 hora con PBS/albúmina de suero bovino (BSA) al 3% y se lavó de nuevo una vez. Ahora se añadió el sobrenadante de cultivo celular sin diluir y a varias diluciones y se incubó durante 2 horas. Como sistema de detección se aplicaron secuencialmente un anticuerpo de IgG1 murina anti-marcador His (dianova, Hamburg) diluido a 1:200 y un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón (Fc) conjugado con peroxidada (dianova, Hamburg). El ELISA se reveló por adición de solución de sustrato ABTS (2'2 Azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico), SIGMA A-1888, Steinheim) como se describe en el Ejemplo 8. El resultado se midió mediante un Lector de ELISA a DO 405 nm; los resultados se muestran en la Figura 1.4. Obviamente no pudo medirse ninguna actividad de unión. Como controles negativos, las placas se incubaron con PBS en lugar de construcciones de anticuerpo. Como control positivo se utilizó el anticuerpo de cadena sencilla biespecífico anti-17-1A/anti-CD3 descrito anteriormente (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025).

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1.1.2. ELISA con sobrenadante de cultivo celular usando detección anti-CD80

La inmovilización del antígeno 17-1A, el bloqueo y la incubación de los sobrenadantes de cultivo celular se realizó como se ha descrito anteriormente. Se realizó la detección con un anticuerpo de IgG1 murina anti-CD80 diluido a 1:1000 (dianova, Hamburg) seguido de un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón (Fc) conjugado con peroxidada diluido a 1:5000 (dianova, Hamburg). El ELISA se reveló con solución de sustrato ABTS y se midieron los valores de DO como se ha descrito anteriormente, sin embargo, de nuevo no pudo detectarse ninguna actividad de unión de 17-1A. Como control positivo, se usó el anticuerpo de cadena sencilla biespecífico anti-17-1A/anti-CD3 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) y se detectó con el anticuerpo anti-marcador His descrito. Los resultados se muestran en la Figura 1.5.

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1.1.3. Análisis ELISA de construcción de CD 80-M79scFv recombinante purificada

Como todos los ELISA con sobrenadantes de cultivo celular que detectan unión de antígeno específico eran negativos, se obtuvo CD80-M79scFv soluble por purificación de proteína a partir de sobrenadante en un cultivo de frasco rotatorio (300 ml) para excluir la posibilidad de que no se secretase proteína recombinante al sobrenadante. La purificación se realizó usando una columna de Níquel-NTA como se describe (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). Los pocillos del ELISA se recubrieron con la proteína eluida de la columna de Níquel-NTA. La detección de la construcción CD80-M79scFv bifuncional se realizó de forma independiente de su actividad de unión a antígeno 17-1A usando un anticuerpo anti-marcador His (véase el Ejemplo 1.1.1.) así como un anticuerpo anti-CD80 (véase el Ejemplo 1.1.2.) en experimentos separados seguido de un anticuerpo anti-IgG de ratón (Fc), respectivamente. El revelado del ELISA así como la medición de los valores de DO se realizaron como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 1.6., confirmando la presencia de la construcción de CD80-M79scFv en el sobrenadante de cultivo celular.

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1.2. Construcción de CD80-M79 scFv (V_{H}/V_{L}) con enlazador (Gly_{4}Ser_{1})_{1}

Para cambiar la disposición de las regiones variables de Ig dentro del fragmento M79scFv de V_{L}/V_{H} a V_{H}/V_{L} se realizó una PCR de fusión de dos etapas usando cebadores oligonucleotídicos 5'V_{H}B5RRV:AGG TGT ACA CTC CGA TAT C(A,C)A (A,G)CT GCA G (G,C)A GTC (A;T)GG, 3'V_{H}GS15, 5'V_{L}GS15 3'V_{L}BSPE1 (para secuencias de los tres últimos oligonucleótidos véase el Ejemplo 2.1) de acuerdo con el procedimiento descrito por Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025 (véase también el Ejemplo 2.1.). El fragmento de PCR que codifica el fragmento V_{H}/V_{L}-scFv se escindió con las enzimas de restricción EcoRV/BspEI y se insertó en el vector Bluescript KS + CTI ya preparado por escisión con EcoRV/XmaI (véase el Ejemplo 1.1.). A continuación se escindió el fragmento M79scFv (V_{H}/V_{L}) invertido con las enzimas de restricción BspEI/SalI y se introdujo en el plásmido pEF-DHFR+CTI + CD80-M79scFv (V_{L}/V_{H}) usando BspEI/SalI reemplazando por lo tanto el fragmento M79scFv-V_{L}/V_{H} (véase la Figura 1.3.2.). Los procedimientos de transfección y cultivo celular se realizaron como se ha descrito anteriormente. El análisis de unión a antígeno se realizó usando el ELISA de 17-1A descrito (Ejemplo 1.1.2.). Sin embargo, no pudo detectarse ninguna actividad de unión de la construcción CD80-M79scFv dispuesta alternativamente. Los resultados se muestran en la Figura 1.7.

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1.3. Construcción de CD80-M79 scFv (V_{H}/V_{L}) con un enlazador largo (Gly_{4}Ser_{1})_{3}

Primero se obtuvo el fragmento de M79scFv (V_{H}/V_{L}) mediante una PCR de fusión de dos etapas como se describe en el Ejemplo 1.2. El fragmento de PCR que codificaba el fragmento V_{L}/V_{H}-scFv se escindió con las enzimas de restricción EcoRV/BspEI y se subclonó en el vector Bluescript KS + CTI escindido con EcoRV/XmaI (véase el Ejemplo 1.1.). En una etapa adicional se introdujo un enlazador de Glicina-Serina más largo (Gly_{4}Ser_{1})_{3} que consistía en 15 aminoácidos. Por lo tanto, tenía que insertarse otro enlazador oligonucleotídico (ACCGS15BAM), que se diseñó para codificar el enlazador (Gly_{4}Ser_{1})_{3} y para proporcionar salientes compatibles con BspEI y BamHI en el Bluescript KS + CTI + M79 scFv (V_{H}/V_{L}) (Ejemplo 1.2). La secuencia de nucleótidos del enlazador se muestra en la Figura 1.8.

El plásmido Bluescript KS + CTI + M79 scFv (V_{H}/V_{L}) que incluía la secuencia codificante del enlazador
(Gly_{4}Ser_{3})_{3} se escindió con BspEI y SalI y el fragmento de ADN resultante (Gly_{4}Ser_{1})_{3}+M79scFv (V_{H}/V_{L}) se insertó en el vector pEF-DHFR escindido con BspEI/SalI que contiene el fragmento codificante de CD80 (Ejemplo 1.1.) sustituyendo de este modo el fragmento M79scFv (V_{L}/V_{H}) junto con el enlazador corto (Gly_{4}Ser_{1})_{1} (véase la Figura 1.3.3). Para un procedimiento de transfección y cultivo celular véase el Ejemplo 1.1. Se analizó la unión específica de antígeno por ELISA de 17-1A como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 1.1.1) y se realizó la detección de la proteína recombinante funcional en el sobrenadante de cultivo celular con un anticuerpo anti-marcador His seguido de un anticuerpo anti-IgG de ratón (Fc) (compárese con el Ejemplo 1.1.1). El anticuerpo de cadena sencilla biespecífico anti-17-1A/anti-CD3 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) sirvió como control positivo. El revelado del ELISA y la medición de los valores de DO se realizaron como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 1.1.1). Sin embargo no fue detectable unión a antígeno. Los resultados se muestran en la Figura 1.9.

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Ejemplo 2 Construcción de CD80-M79 scFv con enlazador corto (Gly_{4}Ser_{1})_{1} o largo (Gly_{4}Ser_{1})_{3} así como disposición de dominio (V_{H}/V_{L}) o (V_{L}/V_{H})

Se construyó una proteína que consistía en el fragmento de Fv de cadena sencilla (scFv) del anticuerpo anti-17-1A M74 y la proteína coestimuladora CD80 conectada mediante un enlazador (Gly_{4}Ser_{1}) (Figura 1.1). El anticuerpo M74 se obtuvo como se describe por Gottlinger (1986) Int. J. Cancer: 38, 47-53. La V_{L} y V_{H} de M74 se clonaron a partir del ARN total de la línea celular de hibridoma correspondiente como se describe por Orlandi (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837 y se secuenciaron. Los plásmidos que contenían V_{L} y V_{H} del anticuerpo M74 se usaron respectivamente como moldes para PCR de fusión de dos etapas dando como resultado fragmentos de scFv de M74 con la disposición de dominio V_{L}/V_{H} o la disposición alternativa V_{H}/V_{L}. En lo que se refiere a la disposición V_{L}/V_{H}, los cebadores para V_{L} de M74 eran 5'V_{L}B5RRV (5'AGG TGT ACA CTC CGA TAT CCA GCT GAC CCA GTC TCC A3') y 3'V_{L}GS15 (5'GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC TTT GAT CTC GAG CTT GGT CCC3'), para V_{H} de M74 5'M74V_{H}GS15 (5'GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT CAG GT(GC) (AC)A(AG) CTG CAG (GC)AG TC(AT) GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATT TCC TGC 3') y 3'V_{H}BspEI (5'AAT CCG GAG GAG ACG GTG ACC GTG GTC CCT TGG CCC CAG3'). En lo que se refiere a la disposición V_{H}/V_{L}, los cebadores para V_{H} M74 eran 5'M74V_{H}EcoRV (5'TCC GAT ATC (AC)A(AG) CTG CAG (GC)AG TC(AT) GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATT TCC TGC 3') y 3'V_{H}GS15 (5'GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G 3'), para V_{L} de M74 5-V_{L}GS15 (5'GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA3') y 3'V_{L}BspEI (5'AAT CCG GAT TTG ATC TCG AGC TTG GTC CC3'). En la primera etapa de PCR se obtuvieron los fragmentos de V_{H} y V_{L} correspondientes usando el siguiente programa de PCR: desnaturalización a 94ºC durante 5 min., hibridación a 37ºC durante 2 min., elongación a 72ºC durante 1 min. para el primer ciclo; desnaturalización a 94ºC durante 1 min., hibridación a 37ºC durante 2 min., elongación a 72ºC durante 1 min. durante seis ciclos; desnaturalización a 94ºC durante 1 min., hibridación a 55ºC durante 1 min., elongación a 72ºC durante 45 s y 18 ciclos; extensión terminal a 72ºC durante 2 min.).

Los fragmentos de PCR purificados de V_{H} y V_{L} se usaron después para la segunda etapa de la PCR de fusión usando los siguientes cebadores para V_{L}N_{H} de scFv de M74: 5'V_{L}B5RRV y 3'V_{H} BspEI, así como 5'M74V_{H}EcoRV y 3V_{L}BspEI para V_{H}/V_{L} de scFv de M74. Se usó el siguiente programa de PCR: desnaturalización a 94ºC durante 5 min. una vez; desnaturalización a 94ºC durante 1 min., hibridación a 55ºC durante 1 min., elongación a 72ºC durante 1:30 min. y 8 ciclos; extensión terminal a 72ºC durante 2 min.). La siguiente etapa era clonar las dos secuencias de scFv de M74 en el plásmido Bluescript KS+CTI (véase Ejemplo 1) por escisión de los fragmentos con EcoRV/BspEI y el vector con EcoRV/XmaI. Para obtener construcciones con diferente longitud de enlazador se usó la siguiente estrategia:

Para generar la construcción de CD80-M74scFv con la disposición V_{H}/V_{L} y V_{L}/V_{H} respectivamente y un enlazador corto (Gly_{4}Ser_{1})_{1}, se escindieron el fragmento scFv de M74 (V_{H}/V_{L}) así como el fragmento scFv de M74 (V_{L}/V_{H}) a partir de BluescriptKS+CTI respectivamente y cada uno se insertó en el vector pEF-DHFR+CTI+ CD80-M79scFv (V_{L}/V_{H}) (véase el Ejemplo 1.1.) usando las enzimas de restricción BspEI y SalI (véase la Figura 1.3.4 y 1.3.5). Para la transfección en células CHO y las condiciones de cultivo celular, véase el Ejemplo 1.1.

Para generar la construcción CD80-M74 scFv con la disposición V_{H}/V_{L} y V_{L}/V_{H} respectivamente, conteniendo cada uno un enlazador largo (Gly_{4}Ser_{1})_{3}, los fragmentos scFv de M74 se escindieron del vector BluescriptKS+CTI como se ha descrito anteriormente y se introdujeron en el plásmido Bluescript KS+CTI+M79scFv(V_{H}/V_{L}) que incluía el enlazador largo (véase el Ejemplo 1.3) por escisión del vector y los fragmentos con EcoRV y SalI respectivamente, sustituyendo de este modo la especificidad de M79 con (V_{H}/V_{L}) de M74 o (V_{L}/V_{H}) de M74. La última etapa antes de la transfección era introducir M74 (V_{H}/V_{L}) o M74 (V_{L}/V_{H}) en el vector pEFDHFR+CTI+CD80-M79scFv(V_{H}/V_{L}) respectivamente usando las enzimas de restricción BspEI y SalI (véanse las Figuras 1.3.6 y 1.3.7) dando como resultado por lo tanto plásmidos con todos los requisitos para la expresión en células CHO de construcciones CD80-M74 scFv con la disposición de dominio V_{H}/V_{L} o V_{L}/V_{H} y un enlazador largo (Gly_{4}Ser_{1})_{3}, respectivamente. En relación con la transfección en células CHO y las condiciones de cultivo celular véase el Ejemplo 1.1. Las cuatro construcciones diferentes (CD80-(Gly_{4}Ser_{1})_{1}-M74 (V_{H}/V_{L}), CD80-(Gly_{4}Sen)_{1}-M74 (V_{H}/V_{L}), CD80-(Gly_{4}Sen)_{3}-M74 (V_{H}/V_{L}), CD80-(Gly_{4}Ser_{1})_{3}-M74 (V_{H}/V_{L})) se ensayaron para determinar la unión al antígeno 17-1A usando sobrenadantes de cultivo celular y además se purificaron a partir del sobrenadante de cultivo usando columnas de Níquel-NTA como se ha descrito en el Ejemplo 1.1.1. y 1.1.3, respectivamente. El ELISA se realizó como se ha descrito y la detección se realizó usando un anticuerpo anti-marcador His o un anticuerpo anti-CD80 seguido de anticuerpo anti-IgG de ratón (Fc) conjugado con peroxidasa (véase el Ejemplo 1.1.1.), respectivamente. A pesar del hecho de que la proteína recombinante pudo purificarse a partir de los cuatro sobrenadantes (no se muestran los datos), no pudo detectarse unión al antígeno 17-1A como se muestra en la Figura 2.1 y 2.2.

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Ejemplo 3 Construcción CD80-VD4.5VK8 scFv(V_{H}/V_{L}) con enlazador corto (Gly_{4}Ser_{1})_{1}

En un Ejemplo adicional se seleccionó un anticuerpo anti-17-1A humano (VD4.5VK8) in vitro mediante el método de presentación en fagos a partir de una biblioteca de anticuerpos combinatoria para analizar su actividad de unión a antígeno al extremo C-terminal de una construcción de cadena sencilla bifuncional como en los Ejemplos 1, 2 y 4 y como se ilustra en la Figura 1.1. La cadena V_{H} y V_{L} de VD4-5VK8 estaban disponibles en forma de fragmentos de ADN clonados con secuencia de nucleótidos conocida (Figura 3.1 y 3.2) y sirvieron como moléculas de molde para PCR usando los siguientes cebadores: para V_{H}: 5'V_{H}1357 5'-AGG TGC AGC TGC TCG AGT CTGG-3, y 3'huV_{H}BstElI 5'-CTG AGG AGA CGG TGA CC'-3; para V_{L}: 5'VK3 GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG(AT)TG AC(AG) CAG TCT CC-3', y 3'huVkBsiWI/SpeI 5'-GAA GAC ACT AGT TGC AGC CAC CGT ACG TTT (AG) AT-3'). Las cadenas V_{H} y V_{L} respectivamente se introdujeron en un vector recién construido designado pComb3H5BHis y descrito en el Ejemplo 5. La V_{H} de VD4.5VK8 se subclonó con XhoI y BstElI, y la V_{L} de VD4.5VK8 con SacI y SpeI dando como resultado el plásmido: pCOMB3H5BHis+VD4.5VK8 V_{H}+V_{L}. Mediante el uso del vector pComb3H5BHis, ya no era necesaria una PCR de fusión para obtener un fragmento de anticuerpo scFv con la disposición de dominio V_{H}/V_{L}.

Para analizar actividad de unión a 17-1A del fragmento scFv de VD4.5Vk8 se escindió el fragmento N2 (véase el Ejemplo 5) mediante las enzimas de restricción XhoI y SalI. Los extremos del vector compatibles se religaron; el producto de ligación se utilizó para transformar E. coli XI 1 Blue y se indujo la expresión de proteína periplasmática por adición de IPTG. Se realizó la preparación de periplasma y la muestra resultante se usó directamente para el análisis basado en ELISA de la actividad de unión al antígeno 17-1A como se describe en el Ejemplo 5. Los pocillos se recubrieron con 17-1A soluble y se detectaron los fragmentos scFv unidos con un anticuerpo murino anti-marcador His diluido a 1:200 seguido de un anticuerpo anti-IgG de ratón (Fc) (véase el Ejemplo 1.1.1) diluido a 1:5000. El revelado del ELISA y la medición de los valores de DO se realizaron como se describe en el Ejemplo 1.1.1. Como control positivo se usó anticuerpo anti-17-1A clon 3-5 obtenido mediante el método de la invención (véase el Ejemplo 6). Los resultados se muestran en la Figura 3.3 y ponen de manifiesto una unión significativa del fragmento scFv de VD4.5.VK8 monovalente libre al antígeno 17-1A inmovilizado. La siguiente etapa en la generación de la construcción CD80-VD4.5VK8-scFv bifuncional fue escindir el plásmido designado Bluescript KS + CTI+L+F-NS3 Frame delecionado del sitio NotI derivado de Bluescript y que contenía un polienlazador extendido (véase la secuencia en la Figura 3.4) mediante las enzimas EcoRI y NotI para subclonar el fragmento EcoRI/NotI de VD4.5VK8 del vector pCOMB3H5BHis+VD4.5VK8 V_{H}+V_{L} descrito anteriormente. Como última etapa en la generación de la construcción CD80-VD4.5VK8-scFv bifuncional, se escindió el fragmento scFv de VD4.5VK8 del vector Bluescript KS+CTI+L+F+NS3 Frame usando las enzimas de restricción BspEI y SalI y se subclonó en el plásmido pEF-DHFR+CTI+CD80-M79scFv(V_{H}/V_{L}) (véanse los Ejemplos 1.1 y 1.2) escindido con las mismas enzimas, sustituyendo por lo tanto el fragmento scFv de M79 por el del anticuerpo humano VD4.5VK8 (véase la Figura 1.3.8). Los procedimientos de transfección en células CHO y cultivo celular se realizaron como se describe en el Ejemplo 1.1.1. La actividad de unión a antígeno 17-1A se analizó por ELISA (Figuras 8.3 y 8.4) y citometría de flujo (Figura 9.1 y 9.2) como se describe con detalle en los Ejemplos 8 y 9; sin embargo, no pudo detectarse unión al antígeno 17-1A por ningún método.

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Ejemplo 4 Construcción de anticuerpo de CD80-MACHscFv

Se analizó otro anticuerpo anti-17-1A murino (MACH) obtenido por el método descrito por Gottlinger (1986) Int. J. Cancer: 38, 47-53 con respecto a la actividad de unión a antígeno de su fragmento scFv en el extremo C-terminal de una construcción de cadena sencilla bifuncional. Las regiones variables de inmunoglobulina correspondientes V_{L} y V_{H} se clonaron por RT-PCR de acuerdo con Orlandi, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86, 3833-3837 a partir del ARN total preparado a partir de la línea celular de hibridoma y posteriormente se expresaron en células de mamífero como anticuerpo quimérico del Isotipo IgG1_{kappa} humano de acuerdo con Orlandi (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.: 86, 3833-3837. El anticuerpo recombinante demostró que se unía al antígeno 17-1A asemejándose a su anticuerpo parental murino como se determinó por ELISA de 17-1A usando los sobrenadantes de cultivo de la línea celular transfectada y de hibridoma, respectivamente. La detección del anticuerpo unido se realizó con un anticuerpo de inmunoglobulina anti-humano o anti-murino respectivamente. El revelado del ELISA y la medición de los valores de DO se realizaron como se describe en el Ejemplo 8. Los resultados se muestran en la Figura 4.

Los dominios Vk y Vh se clonaron en pComb3H5BHis (de acuerdo con los Ejemplos 3 y 5). El anticuerpo anti-fragmento scFv de 17-1A murino se introdujo en el plásmido pEF-DHFR+CTI+CD80-VD4.5VK8 (véase el Ejemplo 3) usando las enzimas de restricción BspEI y NotI, sustituyendo de este modo el fragmento scFv de VD4.5VK8 específico de 17-1A (Figura 1.3.9). El plásmido de expresión obtenido se utilizó después para transfectar células CHO como se describe en el Ejemplo 1.1. La actividad de unión a 17-1A se analizó mediante ELISA (Figuras 8.3 y 8.4) y citometría de flujo (Figura 9.1 y 9.2) como se describe con detalle en los Ejemplos 8 y 9; sin embargo, no se pudo detectar unión al antígeno 17-1A por ningún método.

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Ejemplo 5 Construcción del vector fagémido pComb3H5BHis

Como punto de partida para un vector de presentación en fagos aplicable para la selección in vitro de fragmentos de anticuerpo de acuerdo con el método de la presente invención se usó el vector pComb3H, un derivado de pComb3 (Barbas, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (1991) 7978-7982) (véanse los sitios de clonación en la Figura 5.1) proporcionando:

-: el gen bla que permite selección por resistencia a carbenicilina para transformación positiva e infección con partículas de fago recombinantes.

-: una secuencia líder procariota para excreción de proteína de fragmentos de anticuerpo funcionales en el periplasma bacteriano.

-: un promotor lac inducible para alta productividad de proteína.

-: el dominio de cubierta CT del producto del gen III del fago M13 necesario para anclar fragmentos de anticuerpo en la superficie de un fago filamentoso (presentación en fagos).

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Para la detección y aislamiento de proteínas expresadas en el periplasma de E. coli, especialmente fragmentos scFv pequeños, es muy preferible un marcador His. Por lo tanto, la primera etapa fue subclonar una secuencia de ADN que codificaba seis restos de Histidina cadena abajo de la secuencia del gen III. El vector pComb3H se escindió con NheI y se insertó un oligonucleótido bicatenario con extremos adecuados por ligación. El oligómero bicatenario que codificaba los seis restos His se generó por hibridación de los dos cebadores 5' fosforilados His6s y His6as (a 94ºC, 10 min; 65ºC, 30 min; 52ºC 30 min y 30ºC 10 min).

100

Los extremos del cebador se diseñaron de un modo que después de la fusión con el vector, se destruyó el sitio de restricción NHeI 3' mientras que el sitio de escisión NHeI 5' permaneció intacto. El inserto se secuenció para confirmar una clonación con éxito y el nuevo vector se denominó pComb3HHis.

Con el fin de generar fragmentos scFv unidos al producto del gen III con el extremo C-terminal del dominio variable de cadena ligera (VK), tenían que subclonarse sitios de clonación múltiple (mcs) totalmente nuevos.

La primera parte del mcs original de pComb3HHis se escindió por digestión con SacI-XhoI. El fragmento del vector resultante se ligó con un fragmento de ADN bicatenario (bc) generado por hibridación de dos cebadores fosforilados en posición 5' (5BFors; 5BForas) dando origen a salientes compatibles con SacI 5' y XhoI 3' y destruyendo el sitio de escisión SacI 5' original. La hibridación de los dos cebadores se realizó a 94ºC, 10 min; 65ºC, 30 min; 52ºC, 30 min y 30ºC, 10 min.

101

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El inserto se secuenció para confirmar la clonación con éxito y el nuevo vector se denominó pComb3HForHis. Después se escindió el relleno de clonación de cadena pesada original con XhoI y SpeI y el fragmento de vector resultante se ligó con otro fragmento de ADN bc generando de nuevo por hibridación de dos cebadores fosforilados en posición 5' (5BBacks; 5BBackas) en las mismas condiciones usadas para la hibridación de 5BFors y 5BForas.

102

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El inserto completo se secuenció de nuevo para confirmar la clonación con éxito y el nuevo vector se denominó pComb3HmcsHis (Figura 5.2).

Este vector proporciona todos los sitios de clonación necesarios para la clonación de fragmentos de anticuerpo scFv, una secuencia líder procariota para el transporte de las proteínas recombinantes hacia el periplasma de E. coli, un enlace de fragmentos scFv con el dominio CT del producto de gen III de fago filamentoso y después de la eliminación de la secuencia codificante de CT un enlace con un marcador de histidina. La última etapa, y la más importante, fue introducir una proteína que reducía la actividad de unión a antígeno de fragmentos de anticuerpos sensibles a la posición y que era neutra frente a fragmentos scFv insensibles de modo que su extremo C-terminal se fusione con el extremo N-terminal de fragmentos de anticuerpo scFv clonados posteriormente. El dominio N2 del gen III de M13 que corresponde a los aminoácidos 87 a 217 del producto del gen III del bacteriófago fd (Beck, Nucl. Acid. Res. 5 (1978), 4495-4503) se seleccionó como una proteína adecuada para fusionarse con el extremo N-terminal de fragmentos scFv; a diferencia del producto del gen III completo, el dominio N2 no media infectividad por fagos. El fragmento N2 de aproximadamente 400 pb se amplificó por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) a partir de E. coli XL1blue infectada con fago VCSM13 (disponible de Stratagene) (94ºC, 4 min; (94ºC, 0,5 min, 52ºC, 1 min; 72ºC, 0,5 min) x 40 ciclos; 72ºC, 10 min; 30ºC, 1 s) usando los cebadores 5' N2 SalI y 3' N2 BspEI.

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Este fragmento se subclonó después en el vector pComb3HmcsHis usando los sitios de restricción SalI y BspEI. La subclonación correcta se confirmó por secuenciación de ADN. El vector resultante se designó pComb3H5BHis.

La secuencia de su sitio de clonación múltiple se muestra en la Figura 5.2. La Figura 5.3 muestra un mapa de plásmido de pComb3H5BHis con un fragmento de anticuerpo scFv clonado. A menos que se indique otra cosa, los procedimientos usados siguieron los descritos en Sambrook, Molecular Cloning, 'A Laboratory Manual', 2^{a} Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1989).

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Ejemplo 6 Construcción de la biblioteca de anticuerpos combinatoria y presentación en fagos

Para inmunización se mezclaron 25 \mug de antígeno 17-1A soluble en 100 \mul de PBS con 100 \mul de Adyuvante incompleto de Freund (IFA) y se inyectaron por vía subcutánea en un ratón. Después de dos y cinco semanas, se repitió la inyección con la misma cantidad de antígeno mezclado con el mismo volumen (100 \mul) de IFA, respectivamente.

Cuatro semanas después de la primera inyección, se analizó la inmunización con éxito mediante el ELISA de 17-1A (véase el Ejemplo 8) usando suero de ratón diluido a 1:5, 1:50 y 1:500 seguido de un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa. Se obtuvo una señal fuerte en todas las concentraciones en comparación con controles negativos y de reactividad cruzada. Tres días después de la tercera inyección, se recogieron los esplenocitos murinos para la preparación de ARN total de acuerdo con Chomczynski, Analytical biochemistry 162 (1987) 156-159.

Se construyó una biblioteca de fragmentos de ADN de región variable de cadena ligera (kappa) de inmunoglobulina (Ig) murina (VK) y región variable de cadena pesada de Ig (V_{H}) por RT-PCR en ARN de bazo murino usando cebadores específicos de VK y V_{H}. Se sintetizó ADNc de acuerdo con protocolos convencionales (Sambrook, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, segunda edición). Los conjuntos de cebadores (Tabla 1) se seleccionaron para dar origen a un sitio de reconocimiento XhoI 5' y BstEII 3' para los fragmentos de cadena pesada V y a un sitio de reconocimiento SacI 5' y SpeI 3' para VK.

Para la amplificación por PCR de los fragmentos de ADN de V_{H} se combinaron ocho cebadores específicos de familia de V_{H} 5' diferentes, cada uno con un cebador V_{H} 3'; para la amplificación por PCR de los fragmentos de cadena VK se combinaron siete cebadores específicos de familia de VK 5' diferentes, cada uno con un cebador VK 3'. Los conjuntos de cebadores para la amplificación de los fragmentos de ADN de V_{H} y VK (5' a 3') se muestran en la Tabla 1.

Se uso el siguiente programa de PCR para amplificación: desnaturalización a 94ºC durante 20 s; hibridación de cebador a 52ºC durante 50 s y extensión de cebador a 72ºC durante 60 s y 40 ciclos, seguido de una extensión final de 10 min a 72ºC.

Se ligaron 450 ng de los fragmentos de cadena ligera kappa (digeridos con SacI-SpeI) con 1400 ng del fagémido pComb3H5BHis (digerido con SacI-SpeI; fragmento grande). La biblioteca de anticuerpos combinatoria resultante después se usó para transformar 300 \mul de células Eschenchia coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de hueco de 0,2 cm, 25 \muFD, 200 Ohm, Biorad gene-pulser) dando como resultado un tamaño de biblioteca de 6 x 10^{8} clones independientes. Después de una hora de expresión del fenotipo, se seleccionaron transformantes positivos para resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BHis en 100 ml de cultivo en supercaldo (SB) líquido durante una noche. Después, las células se recogieron por centrifugación y se realizó la preparación de plásmido usando un kit de preparación de plásmido disponible en el mercado (Qiagen). Se ligaron 2800 ng de este ADN plasmídico que contenía la biblioteca VK (digerido con XhoI-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos de cadena pesada V (digeridos con XhoI-BstEII) y de nuevo se utilizaron para transformar dos alícuotas de 300 \mul de células E. coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de hueco de 0,2 cm, 25 \muFD, 200 Ohm) dando como resultado un tamaño de biblioteca de scFv de V_{H}-V_{K} (fragmento variable de cadena sencilla) total de 4 x 10^{8} clones independientes. Después de una hora de expresión fenotípica, se seleccionó la transformación positiva por resistencia a carbenicilina. Después de esta adaptación, se infectaron estos clones con una dosis infecciosa de 1 x 10^{12} partículas del fago auxiliar VCSM13 dando como resultado la producción y secreción de fagos filamentosos, conteniendo cada uno de ellos ADN de pComb3H5BHis monocatenario que codifica un fragmento scFv murino y que presenta la proteína scFv correspondiente fusionada con el dominio N2 en la superficie del fago como una fusión traduccional con proteína de la cubierta III del fago (presentación en fago, véase la Figura 6.2).

Esta biblioteca de fago que lleva el repertorio de scFv clonado se recogió a partir del sobrenadante de cultivo por precipitación con PEG8000/NaCl y centrifugación, se redisolvió en TBS/BSA al 1% y se incubó con 17-1A soluble recombinante inmovilizado en placas de ELISA de 96 pocillos. Se preparó 17-1A como se describe (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025. Se eliminaron las partículas de fago que expresaban fragmentos scFv fusionados con N2 que no se unían específicamente al antígeno diana mediante hasta diez etapas de lavado con TBS/Tween. Se eluyeron entidades de unión usando HCl-Glicina pH 2,2 y después neutralización con Tris 2 M pH 12, y el eluido se usó para infección de un nuevo cultivo de E. coli XL1 Blue sin infectar. Las células transducidas con éxito con una copia de fagémido pComb que codificaba un fragmento scFv murino se seleccionaron de nuevo para resistencia a carbenicilina y posteriormente se infectaron con fago auxiliar VCMS13 para comenzar la segunda ronda de presentación de anticuerpo y selección in vitro. Después de cinco rondas de producción de fago y la posterior selección para fagos que presentan scFv de unión a antígeno, se aisló ADN plasmídico a partir de cultivos de E. coli que se corresponden con 3, 4 y 5 rondas de selección así como con el repertorio no seleccionado antes de la primera ronda de selección. Para la producción de fragmentos de anticuerpos scFv solubles que llevan el domino N2 en su extremo N-terminal, se escindió el fragmento de ADN que codifica el dominio CT del producto del gen III de los plásmidos (SpeI/NheI), destruyendo de este modo la fusión traduccional que ancla el fragmento scFv a la superficie del fago. Después de la religación, esta combinación de ADN plasmídico se usó para transformar 100 \mul de células E. coli XL1 Blue competentes para choque térmico y estas células se sembraron en LB-Agar con Carbenicilina. Se cultivaron colonias individuales en 10 ml de cultivos de LB-Carbenicilina/MgCl_{2} 20 mM y se indujo la expresión de scFv después de seis horas por adición de Isopropil-\beta-D-tiogalactósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM. Este procedimiento de selección in vitro, así como la expresión periplásmica de fragmentos de anticuerpo solubles, se realizó de acuerdo con Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10134-10137. Estas células se recogieron después de 20 horas por centrifugación y por medio de cuatro rondas de congelación a -70ºC y descongelación a 37ºC la membrana externa de la bacteria se destruyó por choque térmico de modo que las proteínas periplasmáticas solubles, incluyendo las proteínas de fusión N2-scFv, se liberaron en la solución. Después de la eliminación de células intactas y residuos celulares por centrifugación, el sobrenadante se ensayó por ELISA con respecto a la presencia de proteínas de fusión de N2-scFv que se unen a 17-1A. La detección de fragmentos de N2-scFv unidos a antígeno 17-1A soluble inmovilizado se realizó usando un anticuerpo anti-marcador His (PBS a 1 \mug/ml) detectado con anticuerpo policlonal anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (PBS a 1 \mug/ml). La señal se reveló por adición de solución de sustrato ABTS como se describe en el Ejemplo 8, y se detectó a una longitud de onda de 405 nm. Al contrario que los clones antes de la selección de antígeno, muchos clones obtenidos después de 3, 4 y 5 vueltas de selección mostraron actividad de unión a 17-1A como se muestra en la Figura 6.2.

Se determinó la secuencia de ADN de las regiones V_{H} y V_{K} de algunos clones positivos (3-1; 3-5; 3-8; 4-1; 4-4; 4-7; 5-3; 5-10 y 5-13), pero ninguno de los clones resultó tener combinaciones de secuencia de ADN de V_{H} y VK idénticas (Figuras 6.3-6.10 y 7). A menos que se indique otra cosa, los procedimientos usados siguieron lo descrito en Sambrook, Molecular Cloning, "A Laboratory Manual", 2ª Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1989).

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Ejemplo 7 Clonación de construcciones de cadena sencilla de CD80-anti-17-1A bifuncionales usando los fragmentos de anticuerpo scFv generados por el método de la presente invención

Las siguientes nueve construcciones de scFv específicas de 17-1A obtenidas por el procedimiento descrito en el Ejemplo 6

1

se subclonaron en el vector pEF-DHFR para la expresión estable en células CHO. En esta etapa, el domino N2 se sustituyó por los dos dominios extracelulares de CD80 humano (= B7-1). Con este fin, el vector pEF-DHFR + CTI + CD80 + scFv VD4.5VK8 descrito en el Ejemplo 3 se escindió de la misma forma que los fragmentos derivados de pComb3H5BHis clones 3-1 a 5-13 usando las enzimas de restricción BspEI y NotI de acuerdo con procedimientos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1989)).

Tanto el vector como los fragmentos se aislaron en un gel de agarosa al 1%, y las bandas específicas se eluyeron usando un kit de elución en gel comercial (Qiagen). Después de la ligación, el ADN se usó para transformar la cepa de E. coli XL-1blue mediante el método de choque térmico convencional (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1989)).

\newpage

Los clones positivos se detectaron mediante exploración de colonias basada en PCR con los siguientes cebadores:

104

Se cultivó un clon de cada construcción en un cultivo de LB de 200 ml en presencia de ampicilina a 50 \mug/ml. Se purificó el ADN plasmídico con el kit Mega Prep disponible en el mercado (Qiagen) y se linealizó mediante la enzima de restricción NdeI. Por último, estos ADN plasmídicos linealizados se usaron para transfectar células CHO deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) por electroporación a 260 V y 960 \muFD como se describe (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995), 7021-7025).

Se realizó una selección primaria en medio de cultivo alfa-MEM sin nucleósidos complementado con FCS dializado al 10% como se describe (Kaufmann, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566). La expresión de estas construcciones se aumentó por amplificación génica inducida por la adición del inhibidor de DHFR metotrexato (MTX) a una concentración final de 20 nM como se describe (Kaufmann, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566).

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Ejemplo 8 Análisis ELISA de construcciones de CD80-anti-17-1A-scFv bifuncionales producidas por el método de la presente invención

Los sobrenadantes de cultivo de estas líneas celulares transfectadas derivadas de la selección primaria y la primera etapa de amplificación se ensayaron mediante ELISA. Por lo tanto, se aplicó 17-1A soluble recombinante (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995), 7021-7025) como un recubrimiento en placas de ELISA de fondo en U de 96 pocillos (Nunc maxisorb) (50 \mug/ml, 50 \mul/pocillo) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El recubrimiento se realizó durante una noche a 4ºC, el bloqueo se realizó con albúmina de suero bovino (BSA) al 3% en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Se añadieron construcciones de anticuerpo como sobrenadantes de cultivo de la selección primaria (PS) (Figura 8.1 y 8.2) y la primera etapa de amplificación (1. Amp.) (Figura 8.3 y 8.4), respectivamente, y se incubó durante una hora a temperatura ambiente a diferentes diluciones realizadas en PBS que contenía BSA al 1%.

Las construcciones de anticuerpo bifuncional unido se detectaron mediante un anticuerpo monoclonal específico de CD80 (Immunotech., Nº Cat. 1449) diluido a 1:1000 en PBS con BSA al 1%. Después de lavar tres veces con PBS con Tween20 al 0,05%, se añadió un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG de Ratón (específico de Fc) conjugado con peroxidasa y se incubó a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar cuatro veces con PBS con Tween20 al 0,05%, el ELISA se reveló finalmente por adición de la siguiente solución de sustrato: 22 mg de ABTS (Ácido 2,2-Azino-bis (3-Etilbenzotiazolin-6 Sulfónico) sal de diamonio) disueltos en 10 ml de tampón citrato 0,1 M pH 5,1 que contenía 2,3 mg de perborato sódico tetrahidrato. Para los controles negativos, las placas se incubaron con PBS en lugar de construcciones de anticuerpo bifuncional. El precipitado coloreado se midió a 405 nm usando un lector de ELISA.

Como se muestra en las Figuras 8.1 y 8.2, todos los clones demostraron unirse al antígeno 17-1A con intensidades de unión variables.

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Ejemplo 9 Análisis de citometría de flujo de construcciones CD80-anti-17-1A-scFv bifuncionales producidas por el método de la presente invención

Los sobrenadantes de cultivo de la primera etapa de amplificación génica que contenían cada uno una de las nueve construcciones C80-scFv bifuncionales específicas de 17-1A (Ejemplo 7) se ensayaron en células CHO transfectadas con 17-1A por citometría de flujo. Estas líneas celulares transfectadas se generaron por subclonación de un fragmento de ADN que codificaba la secuencia de aminoácidos completa del antígeno 17-1A también conocido como GA733-2 (Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990), 3542-3546), en el vector de expresión eucariota pEF-DHFR de acuerdo con procedimientos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1989)); la linealización del plásmido resultante con la enzima de restricción NdeI y la posterior transfección estable en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe en el Ejemplo 7. La expresión de 17-1A transmembrana se aumentó por amplificación génica por etapas inducida por la adición posterior de concentraciones crecientes del inhibidor de DHFR Metotrexato (MTX) a una concentración final de 500 nM, estando las etapas de concentración comprendidas entre 20 nM y 100 nM (Kaufmann, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566). Estas células se ensayaron con respecto a la expresión en la membrana de 17-1A por citometría de flujo usando el anticuerpo monoclonal específico de 17-1A M79 (Gottlinger, Int. J. Cancer 38 (1986), 47-53) a una concentración de 10 \mug/ml seguido de un anticuerpo policlonal de Cabra Anti IgG + IgM de Ratón(H+i_) diluido a 1:100 en PBS. Como control negativo se usaron células CHO no transfectadas mientras que la línea celular de cáncer gástrico humano positiva para 17-1A Kato, obtenida de ATCC sirvió como control positivo. Los resultados se muestran en la Figura 9.2.

La unión de las construcciones de CD80-scFv bifuncionales producidas por el método de la presente invención en células positivas para 17-1A se analizó de la forma siguiente:

Con este fin se desprendieron células CHO transfectadas con 17-1A y no transfectadas adherentes usando PBS que contenía Tripsina al 0,05%, respectivamente. Se incubaron 5x10 células durante 30 minutos en hielo en 50 \mul de sobrenadante de cultivo que contenía la construcción bifuncional correspondiente no diluida (Figura 9.1). Se detectaron construcciones CD80-scFv bifuncionales unidas mediante un anticuerpo anti-CD80 monoclonal (Immunotech Nº Cat. 1449) diluido a 1:20 en 50 \mul de PBS. Las condiciones de incubación fueron las mismas que anteriormente. Finalmente se detectó un anticuerpo CD80 unido mediante un anticuerpo policlonal de Cabra Anti-IgG + IgM de Ratón (H+L) conjugado con fluoresceína diluido a 1:100 en PBS. La incubación se realizó de nuevo durante 30 minutos en hielo. Para la fijación de las células marcadas con fluoresceína se usó paraformaldehído al 1% en PBS.

Como primer control negativo se usaron células CHO sin transfectar. El segundo control negativo contenía células transfectadas con 17-1A que se incubaron con PBS en lugar de construcciones CD80-sc-Fv bifuncionales. Como control positivo se usó tinción con el anticuerpo monoclonal M79 (Gottlinger, Int. J. Cancer 38 (1986), 47-53).

Las células se analizaron mediante citometría flujo en una exploración FACS (Becton Dickinson). La tinción de FACS y la medición de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se ha descrito en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-Interscience, 1992).

Como se muestra en la Figura 9.1, las nueve construcciones CD80-scFv bifuncionales se unían al antígeno 17-1A en la superficie celular confirmando de este modo los resultados del ELISA del Ejemplo 8.

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Ejemplo 10 Construcción y análisis de unión de construcciones bifuncionales de cadena sencilla de CD54-, CD58- y CD86-anti-17-1A que contenían fragmentos de anticuerpos scFv generados por el método de la invención

Para confirmar que la unión específica a antígeno 17-1A de fragmentos de anticuerpos scFv obtenidos por el método de la invención no depende de un dominio N-terminal particular adicional dentro de una construcción de cadena sencilla bifuncional, la parte extracelular de CD80 que forma la región N-terminal de las proteínas de cadena sencilla recombinantes descritas en los Ejemplos 7-9 se sustituyó por la de CD54, CD58 y CD86, respectivamente. A continuación se describe la construcción de las diferentes construcciones de cadena sencilla bifuncionales.

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Construcciones de cadena sencilla de CD54

El antígeno CD54 conocido como ICAM-1 (molécula de adhesión intercelular 1) pertenece a la superfamilia de Ig. Es una proteína muy glicosilada que se expresa en muchas células linfoides, por ejemplo, células dendríticas. Se publicó una descripción más detallada por Simmons D. et al. Nature 331 (1987) 624-626. El molde de ADNc se obtuvo por transcripción inversa del ARN total preparado a partir de células HL-60 estimuladas con TPA. Para amplificar la región extracelular de CD54 se usaron cebadores específicos para los extremos 5' y 3'. Estos cebadores también introducían los sitios de escisión de restricción EcoR1 y BspE1 (5' ICAM: CTC GAA TTC ACT ATG GCT CCC AGC AGC CCC CG y 3'ICAM: GAT TCC GGA CTC ATA CCG GGG GGA GAG CAC).

El fragmento de PCR de CD54 se clonó en el vector Bluescript KS+CTI+M79scFv (VL/VH) (véase el Ejemplo 1) usando los sitios de escisión de restricción EcoR1 y BspE1, dando como resultado por lo tanto el vector Bluescript KS+CTI+CD54+M79scFv(VL/VH). El fragmento CD54-M79scFv (VL/VH) se aisló por escisión del vector Bluescript KS+CTI+CD54+M79scFv (VL/VH) con EcoRI y SalI y posteriormente se introdujo en el vector de expresión eucariota pEFDHFR (véase el Ejemplo 1). El plásmido resultante pEFDHFR CD54-M79scFv (VL/VH) se escindió después con las enzimas de restricción NdeI y BspEI para subclonar el fragmento de ADN correspondiente (aproximadamente 2 kb) que contenía la secuencia de CD54 truncada en los vectores pEFDHFR + CTI + CD80 +scFv anti 17-1A 4-7, pEFDHFR + CTI + CD80 +scFv anti 17-1A 5-3 y pEHDFR + CTI + CD80 +scFv anti 17-1A 5-10 (véase el Ejemplo 7), respectivamente, sustituyendo de este modo CD80 por CD54. Los plásmidos finales se linealizaron con la enzima de restricción NdeI y se utilizaron para transfectar células CHO por electroporación (véase el Ejemplo 1). Las células CHO transfectadas (pEF-DHFR-CTI-CD54-anti 17-1A 4-7, pEF-DHFR-CTI-CD54-anti 17-1A 5-3 y pEF-DHFR-CTI-CD54-anti 17-1A 5-10) se cultivaron para selección en medio \alpha-MEN sin nucleósidos complementado con FCS dializado al 10% y L-glutamina 2 mM. La expresión de estas construcciones se aumentó posteriormente por amplificación génica inducida por la adición del inhibidor de DHFR metotrexato (MTX) a una concentración final de 20 nM como se describe (Kaufman, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566).

La unión de las construcciones de cadena sencilla de CD54 al antígeno 17-1A se analizó usando antígeno 17-1A recombinante obtenido por expresión estable en células CHO como se describe (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995)7021-7025); el ELISA correspondiente se realizó como se describe en el Ejemplo 8 usando sobrenadantes de cultivo celular, excepto porque la detección específica se realizó con un anticuerpo anti-CD54 humano diluido a 1:1000 (Immunotech Hamburg, Nº Cat. 0544). El precipitado coloreado se midió a 405 nm usando un lector de ELISA. Los resultados presentados en la Figura 12 demuestran claramente que podía detectarse la unión de cada una de las construcciones anti 17-1A CD54 construidas al antígeno 17-1A.

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Construcciones de cadena sencilla de CD58

CD58 también conocido como LFA-3 (Antígeno Asociado a la Función de los Linfocitos) es una proteína que pertenece a la superfamilia de Ig y es el contra-receptor de CD2. Una descripción más detallada se publicó por Wallner B. P. et al. J. Exp. Med 166 (1987) 923-932). El molde de ADNc se obtuvo por transcripción inversa del ARN total preparado a partir de células U937. Para amplificar la región extracelular de CD58 y para introducir los sitios de escisión por enzimas de restricción Xba1 y BspE1, se usaron los cebadores 5' y 3' específicos (5'LFA-3 AA TCT AGA ACC ATG GTT GCT GGG AGC GAC G y 3'LFA-3 AAG TCC GGA TCT GTG TCT TGA ATG ACC GCT GC). El procedimiento de clonación y expresión adicional era el mismo que el descrito anteriormente para las construcciones de CD54 excepto porque se usó XbaI en lugar de EcoRI debido a un sitio de EcoRI interno dentro del fragmento de ADN de CD58 y una cepa de E. coli deficiente en dam-metilasa se usó para prevenir el bloqueo del sitio BspEI en el extremo 3' del fragmento de CD58 debido a un sitio dam solapante. Las células CHO transfectadas resultantes en última instancia (pEF-DHFR-CTI-CD58-anti 17-1A 4-7, pEF-DHFR-CTI-CD58-anti 17-1A 5-3 y pEF-DHFR-CTI-CD58-anti 17-1A 5-10) se cultivaron para selección en medio \alpha-MEN sin nucleósido complementado con FCS dializado al 10% y L-glutamina 2 mM. La expresión de estas construcciones se aumentó posteriormente por amplificación génica inducida por la adición del inhibidor de DHFR metotrexato (MTX) a una concentración final de 20 nM como se describe (Kaufman, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566). La unión de las construcciones de CD58 de cadena sencilla al antígeno 17-1A se analizó como se ha descrito anteriormente excepto porque se realizó la detección específica con anticuerpo anti-CD58 humano diluido a 1:1000 (Immunotech, Hamburg Nº Cat. 0861). Los resultados que se muestran en la Figura 12 demuestran claramente que podía detectarse la unión de cada una de las construcciones anti-17-1A-CD58 scFv construidas contra el antígeno 17-1A.

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Construcciones de cadena sencilla de CD86

La proteína coestimuladora CD86 también conocida como B7-2 pertenece a la superfamilia de Ig. Es una proteína muy glicosilada de 306 aminoácidos. Se publicó una descripción más detallada por Freeman G. J. et al. Science 262 (1993) 909-911. El molde de ADNc se obtuvo por transcripción inversa del ARN total preparado a partir de la línea celular de Linfoma de Burkitt Raji. Para amplificar la región extracelular de CD86 se usaron cebadores 5' y 3' específicos (5'B7-2: 5'AAG TCT AGA AAA TGG ATC CCC AGT GCA CTA TG 3', 3'B7-2: 5'AAT TCC GGA TGG GGG AGG CTG AGG GTC CTC AAG C '3). Estos cebadores también introducen sitios de escisión Xba1 y BspE1 que se usaron para clonar el fragmento de PCR de CD86 en el vector Bluescript KS-CTI-M79scFv (VL/VH) (véase el Ejemplo 1). El procedimiento de clonación y expresión adicional fue el mismo que el descrito anteriormente para la construcción de CD54 excepto porque se usó XbaI en lugar de EcoRI debido a un sitio de EcoRI interno dentro del fragmento de ADN de CD86. Las células CHO transfectadas resultantes en última instancia (pEF-DHFR-CTI-CD86-anti 17-1A 4-7, pEF-DHFR-CTI-CD86-anti 17-1A 5-3 y pEF-DHFR-CTI-CD86-anti 17-1A 5-10) se cultivaron para selección en medio \alpha-MEN sin nucleósidos complementado con FCS dializado al 10% y L-glutamina 2 mM. La expresión de estas construcciones se aumentó posteriormente por amplificación génica inducida por la adición del inhibidor de DHFR metotrexato (MTX) a una concentración final de 20 nM como se describe (Kaufman, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566).

La unión de las construcciones de cadena sencilla de CD86 al antígeno 17-1A se analizó como se ha descrito anteriormente excepto porque se realizó una detección específica con un anticuerpo anti-CD86 humano diluido a 1:1000 (R&D Systems, Nº Cat. MB141). Los resultados que se muestran en la Figura 12 demuestran claramente que podía detectarse la unión de cada una de las construcciones anti-17-1A-CD68 scFv construidas al antígeno 17-1A.

TABLA 1 Conjuntos de cebadores para la amplificación de los fragmentos de ADN de VH y VK (5' a 3') de la cadena pesada V murina

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Referencias citadas en la descripción

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

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Documentos de patente citados en la descripción

\bullet EP 0451216 A1 [0037]: \bullet EP 97120096 A [0108]

\bullet EP 0549581 A1 [0037]

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Literatura no patente citada en la descripción

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\bulletMack. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995, 7021-7025 [0004]

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<110> Kufer Dr, Peter

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<120> Un nuevo método de identificación de dominios de sitio de unión que conservan la capacidad de unirse a un epítopo

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<130> B 3077 PCT

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<150> EP 97 12 0096.9

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<151> 17-11-1997

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<160> 75

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido sintético

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<400> 1

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gcagaattca ccatgggcca cacacggagg cag

\hfill

33

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<210> 2

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido sintético

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<400> 2

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tggtccggag ttatcaggaa aatgctcttg cttg

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34

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<210> 3

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido sintético

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<400> 3

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aggtgtacac tccgatatcm arctgcagsa gtcwgg

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36

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<210> 4

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido sintético

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aggtgtacac tccgatatcc agctgaccca gtctcca

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<210> 5

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido sintético

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ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc tttgatctcg agcttggtcc c

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<210> 6

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<211> 96

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<400> 6

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3

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<210> 7

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatccggagg agacggtgac cgtggtccct tggccccag

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gacattcagc tgacccagtc tcca

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatccggatt tgatctcgag cttggtccc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggtgcagct gctcgagtct gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgaggagac ggtgacc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagccgcacg agcccgagct cgtgwtgacr cagtctcc

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagacacta gttgcagcca ccgtacgttt rat

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagccatca ccatcaccat caca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagtgtgat ggtgatggtg atgg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagctggtc gacaaatccg gaggtggtgg atccgaggtg cagctgc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgagcagct gcacctcgga tccaccacct ccggatttgt cgaccagctg cagct

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgtcgaca ctaaacctcc tgagtacgg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctccggaa gcattgacag gaggttgagg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagaattca ccatgggcca cacacggagg cag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtgcacta gtcgtacgtt tgatctcaag cttggtccc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgaattca ctacggctcc cagcagcccc cg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gattccggac tcataccggg gggagagcac

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatctagaac catggttgct gggagcgacg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagtccggat ctgtgtcttg aatgaccgct gc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagtctagaa aatggatccc cagtgcacta tg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattccggat gggggaggct gagggtcctc aagc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

saggtgcagc tcgaggagtc aggacct

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtccagc tcgagcagtc tggacct

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggtccaac tcgagcagcc tggggct

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggttcagc tcgagcagtc tggggca

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gargtgaagc tcgaggagtc tggagga

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtgaagc ttctcgagtc tggaggt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagtgaagc tcgaggagtc tggggga

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggttcagc tcgagcagtc tggagct

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagttccga gctcgttgtg actcaggaat ct

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagttccga gctcgtgttg acgcagccgc cc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagttccga gctcgtgctc acccagtctc ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagttccga gctccagatg acccagtctc ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagatgtga gctcgtgatg acccagactc ca

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagatgtga gctcgtcatg acccagtctc ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagttccga gctcgtgatg acacagtctc ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtgcacta gtcgtacgtt tgatctcaag cttggtccc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaggtgg tggttccggg ggtggaggtt caggcggtgg tg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatccaccac cgcctgaacc tccacccccg gaaccaccac ct

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido codificado por el oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 381

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 525

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Fago-M13 y secuencia artificial del MCS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de ADN del dominio N2 y el MCS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia proteica de la proteína III y dominio N2 de M13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 726

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

19

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 753

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

22

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 726

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 744

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 726

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 753

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 717

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 744

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

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<400> 74

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46

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<210> 75

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<211> 248

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<212> PRT

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<213> Mus sp.

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<400> 75

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47

48

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<210> 76

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<211> 744

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<212> ADN

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<213> Mus sp.

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<400> 76

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49

50

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<210> 77

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<211> 248

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<212> PRT

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<213> Mus sp.

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<400> 77

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Claims

1. Un método para identificar un dominio de sitio de unión que tiene la capacidad de unirse a un epítopo predeterminado cuando se sitúa en posición C-terminal con respecto a al menos un dominio adicional en un polipéptido bi- o multivalente recombinante, que comprende las etapas de

(a) ensayar un panel de dominios de sitio de unión presentados en la superficie de un sistema de presentación biológica como parte de una proteína fusión para unirse a un epítopo predeterminado, donde dicha proteína de fusión comprende

(i): un dominio de bloqueo N-terminal adicional que es o procede del dominio N2 del producto del gen III del fago filamentoso y que se sitúa en posición N-terminal con respecto a dicho dominio de sitio de unión y

(b) identificar un dominio de sitio de unión que se une a dicho epítopo determinado.

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2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho dominio de sitio de unión y dicho dominio adicional se unen mediante un enlazador polipeptídico dispuesto entre dicho sitio de unión y dicho dominio adicional, donde dicho enlazador polipeptídico comprende múltiples aminoácidos hidrófilos unidos por enlaces peptídicos y conecta el extremo N-terminal de dicho dominio de sitio de unión y el extremo C-terminal de dicho dominio adicional.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde dicho dominio de sitio de unión es un par de dominios V_{H}-V_{L},
V_{H}-V_{H} o V_{L}-V_{L}.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho sistema de presentación es un fago filamentoso producido por bacterias transfectadas con el mismo, un sistema de expresión de baculovirus, un sistema de expresión basado en ribosomas, un sistema de presentación en bacteriófago lambda o un sistema de expresión de superficie bacteriana.

5. El método de la reivindicación 4 que comprende, antes de la etapa (a), la etapa adicional de

(a''): transfectar bacterias con vectores recombinantes que codifican dichas proteínas de fusión.

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6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende, antes de la etapa (a''), la etapa adicional de

(a'): clonar un panel de moléculas de ácido nucleico que codifican dichos dominios de sitios de unión en un vector.

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7. El método de la reivindicación 6, en el que dicho panel de moléculas de ácido nucleico procede de células inmunocompetentes de un mamífero, pez o ave.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho dominio adicional comprende al menos 9 aminoácidos.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha secuencia que interviene en dicho anclaje es o procede del dominio CT C-terminal del producto del gen III de fago filamentoso.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho polipéptido bi- o multivalente es un polipéptido bi- o multifuncional.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho al menos un dominio adicional comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en proteínas efectoras que tienen una conformación adecuada para actividad biológica, secuencias de aminoácidos capaces de secuestrar un ión y secuencias de aminoácidos capaces de unirse de manera selectiva a un soporte sólido.

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicha proteína efectora es una enzima, toxina, receptor, sitio de unión, sitio de unión de anticuerpo biosintético, factor de crecimiento, factor de diferenciación celular, linfocina, citocina, hormona, un resto detectable remotamente o un antimetabolito.

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13. El método de la reivindicación 11, en el que dicha secuencia capaz de secuestrar un ión es calmodulina, metalotioneína, un fragmento de la misma o una secuencia de aminoácidos rica en al menos uno de ácido glutámico, ácido aspártico, lisina y arginina.

14. El método de la reivindicación 11, en el que dicha secuencia polipeptídica capaz de unirse de manera selectiva a un soporte sólido es un secuencia de aminoácidos cargada positivamente o negativamente, una secuencia de aminoácidos que contiene cisteína, estreptavidina o un fragmento de proteína A de Staphylococcus.

15. El método de la reivindicación 12, en el que dicho receptor es una molécula de superficie co-estimuladora importante para la activación de células T o comprende un sitio de unión a epítopo o un sitio de unión a hormona.

16. El método de la reivindicación 15, en el que dicha molécula de superficie co-estimuladora es CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD58 (LFA-3) o CD54 (ICAM-1).

17. El método de la reivindicación 16, en el que dicho sitio de unión a epítopo está incluido en un par de dominios V_{H}-V_{L}, V_{H}-V_{H} o V_{L}-V_{L}.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 17, en el que dicho par de dominios están conectados por un enlazador flexible, preferiblemente por un enlazador polipeptídico dispuesto entre dichos dominios, donde dicho enlazador polipeptídico comprende múltiples aminoácidos hidrófilos unidos por enlaces peptídicos de una longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C-terminal de uno de dichos dominios y el extremo N-terminal del otro de dichos dominios cuando dicha proteína de fusión asume una conformación adecuada para la unión cuando se dispone en solución acuosa.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la identificación de dicho dominio del sitio de unión comprende las etapas de

(b'): eliminar dicha secuencia de aminoácidos que media el anclaje de la proteína de fusión a la superficie de un fago de dicha proteína de fusión;

(b''): expresar periplasmáticamente las moléculas de ácido nucleico que codifican el resto de dicha proteína de fusión en bacterias; y

(b'''): verificar si dicho dominio de sitio de unión se une a dicho epítopo predeterminado.

20. Kit que comprende

(a): un panel de vectores recombinantes que codifica un panel de proteínas de fusión como se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde dicho dominio adicional comprendido en dichas proteínas de fusión es un dominio de bloqueo N-terminal que es o procede del dominio N2 del producto del gen III del fago filamentoso; y/o

(b): una biblioteca bacteriana transfectada con un panel de vectores como se define en (a).

21. Un dominio de sitio de unión o una proteína de fusión que puede obtenerse por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde dicho dominio de sitio de unión comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) del fragmento scFv que se muestra en una cualquiera de las Figuras 6.3 a 6.10 y 7.

22. Un polipéptido o un anticuerpo que comprende al menos un dominio de sitio de unión o proteína de fusión de la reivindicación 21.

23. El polipéptido o anticuerpo de la reivindicación 22 que tiene la secuencia de aminoácidos que se representa en una cualquiera de las Figuras 6.3 a 6.10 y 7.

24. Polinucleótidos que al ser expresados codifican el polipéptido o anticuerpo de la reivindicación 22 ó 23.

25. Una célula transfectada con un polinucleótido de la reivindicación 24.

26. Un proceso para la preparación de un polipéptido o anticuerpo de la reivindicación 22 ó 23 que comprende cultivar una célula de la reivindicación 25 en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido y aislar el polipéptido a partir del medio de cultivo celular.

27. Una composición farmacéutica que contiene un polipéptido o anticuerpo de la reivindicación 22 ó 23 y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

28. Una composición de diagnóstico que comprende el polipéptido o anticuerpo de la reivindicación 22 ó 23 y opcionalmente medios adecuados para la detección.