ES2333704T3 - Transfeccion de organulos mediada por un vector. - Google Patents

Abstract

Un método para transfectar orgánulos de células eucariotas, comprendiendo dicho método la etapa de introducir un vector viral recombinante en el citosol de una célula eucariota, uniéndose el vector viral recombinante específicamente a un receptor localizado únicamente en la superficie del orgánulo que se va a transfectar y siendo dichos orgánulos de células eucariotas mitocondrias o cloroplastos, y en el que (i) dicho método se lleva a cabo in vitro y/o (ii) dicha célula eucariota es una célula vegetal.

Description

Transfección de orgánulos mediada por un vector.

Derechos del Gobierno de los Estados Unidos

Esta invención se realizó con apoyo del Gobierno de los Estados Unidos bajo la Subvención Nº NIH NS 39005 y NIH NS39788 concedida por los Institutos Nacionales de la Salud. El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de acuerdo con 35 U.S.C.119(e) respecto a la solicitud de atente provisional Nº 60/340.338 presentada el 13 de diciembre de 2001.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y métodos de transfección de orgánulos, en particular mitocondrias y cloroplastos.

Antecedentes de la invención

Las mitocondrias son los únicos orgánulos productores de energía en todas las células eucariotas y, por lo tanto, desempeñan un papel crítico en el mantenimiento de una bioenergética celular, niveles homeostáticos y ciclos vitales celulares apropiados. De forma similar, los cloroplastos también son máquinas productoras de ATP eficaces que usan la luz como fuente de energía en lugar de azúcares o ácidos grasos. Tanto las mitocondrias como los cloroplastos contienen múltiples copias de ADN de orgánulos que se replica y se transcribe en los orgánulos. En mamíferos, el ADN mitocondrial (ADNmt) es un genoma circular sin intrones de aproximadamente 10,6 kilobases que codifica 13 proteínas de la cadena de transporte de electrones (ETC), 2 ARN ribosómicos y 22 ARNt. La mayoría de las percepciones de la genética mitocondrial han venido de levaduras, en las que la transformación biolística permite la modificación por ingeniería genética de replicones mitocondriales. Sin embargo, muchas características de la expresión de genes mitocondriales y de la biogénesis de la cadena respiratoria de mamíferos no son reproducibles en levaduras.

En mamíferos, la fusión citoplasmática y la microinyección se usan para introducir mitocondrias de donante, pero estas técnicas no proporcionan un mecanismo para la manipulación directa del ADNmt. Además, se ha descrito la captación de ADN exógeno en mitocondrias implicando a la ruta de importación de proteínas por dos laboratorios. Vestweber y Schatz ([1991] Nature (Londres) 338: 170-172) lograron la captación de un oligonucleótido tanto mono- como bicatenario de 24 pb en mitocondrias de levaduras por acoplamiento del extremo 5' del oligonucleótido con una proteína precursora que consiste en la presecuencia de la subunidad IV de la citocromo c oxidasa de levadura fusionada a una dihidrofolato reductasa de ratón modificada. Más recientemente, Seibel et al. (1995, Nucleic Acids Research 23: 10-17) describieron la importación en la matriz mitocondrial de moléculas de ADN bicatenario conjugadas con el péptido líder amino-terminal de la ornitina transcarbamilasa de rata. Sin embargo, ambos estudios se realizaron con mitocondrias aisladas, sin abordar la cuestión de cómo los conjugados de oligonucleótido-péptido atravesarán la membrana citosólica y alcanzarán la proximidad de la mitocondria.

La patente de Estados Unidos Nº 6.171.863 describe el uso de complejos de decualinio-ADN como vehículo para suministrar ADN al interior de células y, potencialmente, en las mitocondrias. Debido a que el ADN se asocia con decualinio, el complejo resultante tiene una carga positiva. El complejo cargado positivamente es atraído hacia compartimentos cargados negativamente. Por lo tanto, la patente de Estados Unidos Nº 6.171.863 describe el suministro de ADN a compartimientos cargados negativamente, y no describe el suministro específico de ADN a mitocondrias o cloroplastos. De hecho, no se ha descrito ninguna técnica para dirigirse a orgánulos específicos, por ejemplo, el cloroplasto o la mitocondria, para el suministro de ácidos nucleicos usando un mecanismo de receptor:ligando.

Por lo tanto, la incapacidad para manipular específicamente el genoma de cloroplastos y mitocondrias ha obstaculizado los esfuerzos de los investigadores por entender completamente el cloroplasto y los procesos de replicación, transcripción y traducción de ADNmt. La capacidad para manipular específicamente ADNmt e introducirlo en células vivas aumentaría enormemente la capacidad de los investigadores para investigar completamente la función de genes cloroplásticos/mitocondriales individuales y la función global de cloroplastos/mitocondrias.

Además, la capacidad para manipular el genoma mitocondrial también proporciona un nuevo método de tratamiento de enfermedades asociadas con una función mitocondrial defectuosa. Con la edad, la función de las mitocondrias disminuye, con un aumento marcado de mutaciones y grandes deleciones de ADNmt. En particular, los daños oxidativos aumentan con la edad, conduciendo con frecuencia a una mayor tasa de mutaciones de ADNmt. Aparte de las mutaciones de ADNmt conocidas, varias formas de cáncer y neurodegeneración se asocian con mutaciones en el ADNmt. Por ejemplo, las mutaciones en el ADN mitocondrial son la causa que se sospecha de un hospedador de enfermedades neurológicas degenerativas incluyendo Alzheimer, Parkinson y diabetes de comienzo en adultos. Estas mutaciones dan como resultado una disminución en la eficacia de la cadena de transporte de electrones y la acumulación de deleciones de ADNmt debido a daños por radicales libres (envejecimiento).

Además, dadas las funciones bioenergéticas de los cloroplastos, la capacidad para introducir genes exógenos o manipular de otro modo el genoma de cloroplastos podría tener un impacto tremendo sobre el aumento de la vitalidad y los rendimientos de cultivos y otras plantas. Por ejemplo, la introducción de genes en cloroplastos puede conducir a plantas con una viabilidad aumentada en entornos de otro modo hostiles y a una eficacia de fotosíntesis aumentada. Además, se piensa que la expresión de genes exógenos dentro de los cloroplastos es significativamente más eficaz en los cloroplastos respecto a la expresión de genes exógenos introducidos en el núcleo de la célula. Por lo tanto, la transfección de cloroplastos puede permitir estrategias de biosíntesis más eficaces para compuestos comerciales.

Filogenéticamente, las mitocondrias y cloroplastos se parecen a las primeras bacterias. Y así, los solicitantes reconocieron que podían utilizarse potencialmente virus bacterianos (por ejemplo, bacteriófago lambda) para introducir ADN en estos orgánulos de animales y plantas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones, métodos y sistemas para introducir secuencias de ácido nucleico en un orgánulo de una célula eucariota intacta, siendo dichos orgánulos mitocondrias o cloroplastos. Un aspecto de la presente invención proporciona construcciones de ácidos nucleicos y procedimientos para suministrar ácidos nucleicos a orgánulos específicos usando una estrategia de receptor:ligando, siendo dichos orgánulos mitocondrias o cloroplastos. Típicamente, los orgánulos a los que se dirigen expresan un receptor que se une a un ácido nucleico o vector de ácido nucleico. Por consiguiente, se describen en este documento métodos y composiciones para transfectar orgánulos de células eucariotas mediante el uso de un vector, por ejemplo, un vector viral, que comprende una proteína receptora/de acoplamiento. Los vectores virales y receptores adecuados incluyen, pero sin limitación, un vector viral bacteriano tal como el bacteriófago lambda.

Se describe un sistema que comprende una célula viable intacta que comprende uno o más orgánulos modificados y un vector recombinante, siendo dichos orgánulos mitocondrias o cloroplastos.

Los orgánulos modificados comprenden uno o más receptores localizados en la superficie del orgánulo y el vector recombinante se selecciona basándose en su capacidad para unirse específicamente al receptor localizado en el orgánulo modificado.

También se describen métodos de corrección de defectos genéticos, aumento de la expresión de ácidos nucleicos específicos, interferencia con la expresión de ácidos nucleicos específicos, restauración o aumento de la función de orgánulos, aumento de la biosíntesis de ácidos nucleicos específicos y sus proteínas correspondientes usando suministro dirigido de ácidos nucleicos a orgánulos o compartimentos celulares específicos, siendo dichos orgánulos mitocondrias o cloroplastos. Otros aspectos se refieren a minimizar o reducir la progresión de enfermedades, aliviar síntomas y ajustar el metabolismo celular. Particularmente, la invención se refiere a un suministro dirigido de ácidos nucleicos a orgánulos que contienen los componentes para la replicación, transcripción o traducción, o una combinación de los mismos tal como la mitocondria o el cloroplasto.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un esquema del método que usa vectores virales para transfectar un orgánulo de una célula eucariota. La Figura 1 muestra un solo orgánulo (por ejemplo, una mitocondria Rho) (1) de una célula eucariota, incluyendo las membranas interna (4) y externa (5), conteniendo la mitocondria un receptor viral (2) localizado en la superficie del orgánulo. Un vector viral (6) que comprende el ADN recombinante deseado (3) se introduce en el citosol de la célula usando técnicas de transfección convencionales y el vector entra en contacto con el receptor localizado en la superficie mitocondrial (2). El vector viral se une al receptor y el ADN mitocondrial se libera en el interior de la mitocondria. Después, el ADN se replica, se transcribe y sus productos génicos se traducen por la maquinaría mitocondrial.

Las Figuras 2A y 2B son gráficas de barras que representan la restauración de las actividades del complejo I y del complejo IV después de la transfección de células SH-SY5Y Rho^{0} con pMLS-LambdaR, seguida de cósmido SuperCos-1/ADNmt. La Figura 2A representa la actividad del complejo IV y la Figura 2B representa la actividad del complejo I. Las mitocondrias transfectadas presentan actividad de ETC, indicando la recuperación funcional de los productos génicos de ADNmt.

La Figura 3 es una representación esquemática del proceso para generar ratones que tengan mitocondrias transfectadas. En la primera etapa se generaron células con transfección mitocondrial a partir de células madre embrionarias (ES) Rho con el ADN de interés, seguido de microinyección de las células ES en el blastocisto. En una realización, las células ES de ratón transfectadas mitocondrialmente pueden cultivarse durante una extensión de tiempo predeterminada y después fusionarse con otra célula ES Rho (u otra línea celular con transfección mitocondrial) para formar un híbrido citoplasmático, seguido de microinyección de las células de híbrido citoplasmático resultantes en el blastocisto. El embrión resultante se implanta después en ratones sustitutos para generar ratones quiméricos que comprendan mitocondrias con transfección mitocondrial.

La Figura 4 es una representación esquemática del plásmido usado para expresar una proteína de fusión de localización mitocondrial/receptor lambda en una célula eucariota. En esta realización, la señal de localización mitocondrial usada era de la subunidad VIII de la citocromo oxidasa humana (Nº de acceso NP_004065).

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La Figura 5 es una representación esquemática del plásmido usado para expresar una proteína de fusión de localización cloroplástica/receptor lambda en una célula eucariota. En esta realización, la secuencia de direccionamiento a cloroplastos se obtuvo del vector de transformación de cloroplastos pVSR326 (Nº de acceso AF527485).

Descripción detallada de la invención Definiciones

En la descripción y reivindicación de la invención, se usará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones expuestas a continuación.

Como se usa en este documento, el termino "purificado" y términos similares se refieren al aislamiento de una molécula o compuesto de forma que esté sustancialmente libre (al menos 60% libre, preferiblemente 75% libre y más preferiblemente 90% libre) de otros componentes normalmente asociados con la molécula o compuesto en un entorno nativo.

Como se usa en este documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua y emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua o de agua/aceite y diversos tipos de agentes humectantes.

Como se usa en este documento, el término "tratar" incluye aliviar los síntomas asociados con un trastorno o afección específica y/o prevenir o eliminar dichos síntomas.

La expresión "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes se configuran de modo que realicen su función habitual. Por ejemplo, las secuencias de control o promotores unidos operativamente a una secuencia codificante son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificante, y una secuencia de localización en orgánulos unida operativamente a una proteína dirigirá que la proteína unida se localice en el orgánulo específico.

Como se usa en este documento, la expresión "ADN exógeno" o "secuencia de ácido nucleico exógena" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se introdujo en una célula u orgánulo desde una fuente externa. Típicamente, la secuencia exógena introducida es una secuencia recombinante.

Como se usa en este documento, el termino "transfección" se refiere a la introducción de una secuencia de ácido nucleico en el interior de un espacio delimitado por una membrana de una célula viva, incluyendo la introducción de la secuencia de ácido nucleico en el citosol de una célula, así como en el espacio interior de una mitocondria, núcleo o cloroplasto. El ácido nucleico puede estar en forma de ADN o ARN desnudo, asociado con diversas proteínas o el ácido nucleico puede incorporarse en un vector.

Como se usa en este documento, la expresión "transfección mitocondrial" se refiere a la introducción de una secuencia de ácido nucleico en el interior de una mitocondria.

Como se usa en este documento, el término "vector" se usa en referencia a un vehículo usado para introducir una secuencia de ácido nucleico en una célula. Un vector viral es un virus que se ha modificado para permitir que se introduzcan secuencias de ADN recombinante en células hospedadoras u orgánulos celulares.

Como se usa en este documento, el término "orgánulo" se refiere a estructuras unidas a membrana celular tales como el cloroplasto, la mitocondria y el núcleo. El término "orgánulo" incluye orgánulos naturales y sintéticos.

Como se usa en este documento, la expresión "orgánulo no nuclear" se refiere a cualquier estructura unida a membrana celular presente en una célula, excepto el núcleo.

La invención

Los orgánulos celulares tienen papeles significativos en el ciclo vital de las células y sus hospedadores. Por ejemplo, las mitocondrias y cloroplastos son las "centrales eléctricas" de las células animales y vegetales. Debido a su actividad crítica en el mantenimiento de la vida celular y de la bioenergética, desempeñan papeles principales en la función celular y la muerte celular. Poseen sus propios genomas únicos -que hasta ahora no han sido susceptibles de manipulación. Las realizaciones de la presente invención proporcionan composiciones y métodos para el suministro de un polinucleótido a mitocondrias o cloroplastos.

Orgánulos

Las células eucariotas contienen estructuras unidas a membrana denominadas orgánulos. Los orgánulos pueden tener una sola o múltiples membranas y existen en células tanto vegetales como animales. Dependiendo de la función del orgánulo, los orgánulos pueden consistir en componentes específicos tales como proteínas y cofactores. Algunos orgánulos tales como mitocondrias y cloroplastos contienen su propio genoma. Los ácidos nucleicos se replican, transcriben y traducen dentro de estos orgánulos. Las proteínas se importan y los metabolitos se exportan. Por lo tanto, existe un intercambio de material a través de las membranas de los orgánulos.

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Los orgánulos ejemplares incluyen el núcleo, mitocondrias, cloroplastos, lisosomas, peroxisomas, Golgi, retículo endoplásmico y nucleolo. Pueden formarse orgánulos sintéticos a partir de lípidos y pueden contener proteínas específicas dentro de las membranas lipídicas. Además, el contenido de los orgánulos sintéticos puede manipularse para que contenga componentes para la traducción de ácidos nucleicos.

Mitocondrias

Las mitocondrias contienen la maquinaria molecular para la conversión de energía a partir de la degradación de glucosa en trifosfato de adenosina (ATP). La energía almacenada en los enlaces fosfato de alta energía del ATP está disponible entonces para suministrar energía para las funciones celulares. La mitocondria es en su mayor parte proteína, pero están presentes algunos lípidos, ADN y ARN. Estos orgánulos generalmente esféricos tienen una membrana externa que rodea una membrana interna que se pliega (crestas) en un armazón para la fosforilación oxidativa y enzimas de transporte de electrones. La mayoría de las mitocondrias tienen crestas planas en forma de baldas pero las de células secretoras de esteroides pueden tener crestas tubulares. La matriz mitocondrial contiene las encimas del ciclo del ácido cítrico, de la oxidación de ácidos grasos y ácidos nucleicos mitocondriales.

El ADN mitocondrial es bicatenario y circular. El ARN mitocondrial se encuentra en las tres variedades convencionales; ribosómico, mensajero y de transferencia, pero cada una es específica de la mitocondria. Se produce cierta síntesis de proteínas en las mitocondrias en ribosomas mitocondriales que son distintos de los ribosomas citoplasmáticos. Otras proteínas mitocondriales se producen en ribosomas citoplasmáticos con un péptido señal que las dirige a las mitocondrias. La actividad metabólica de la célula está relacionada con el número de crestas y el número de mitocondrias dentro de una célula. Las células con alta actividad metabólica, tales como el músculo cardiaco, tienen muchas mitocondrias bien desarrolladas. Se forman nuevas mitocondrias a partir de mitocondrias preexistentes cuando crecen y se dividen.

Las membranas internas de las mitocondrias contienen una familia de proteínas de secuencia y estructura relacionada que transportan diversos metabolitos a través de la membrana. Sus secuencias de aminoácidos tienen una estructura tripartita, compuesta por tres secuencias relacionadas de aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. Las repeticiones de un vehículo están relacionadas con las presentes los demás y están conservadas varias características de secuencia características por toda la familia.

Cloroplastos

El cloroplasto es un orgánulo fotosintético en eucariotas con una doble membrana circundante. El fluido en el interior de la doble membrana se denomina estroma. El cloroplasto tiene una región nucleoide para alojar su ADN desnudo circular. El estroma también es el sitio del Ciclo de Calvin. El Ciclo de Calvin es la serie de reacciones químicas catalizadas por enzimas que producen carbohidratos y otros compuestos de dióxido de carbono.

Dentro del estroma hay sacos de membrana diminutos denominados tilacoides. Los sacos se apilan en grupos. Cada grupo se denomina granum. Hay muchos grana en cada cloroplasto. Las membranas de los tilacoides son el sitio de las reacciones luminosas fotosintéticas. Los tilacoides tienen proteínas intrínsecas y extrínsecas, algunas con grupos prostéticos especiales que permiten que los electrones se desplacen de complejo proteico en complejo proteico. Estas proteínas constituyen un sistema de transporte de electrones a veces conocido como el esquema Z.

El grupo prostético para dos proteínas de membrana críticas (P680 y P700) es una clorofila, una molécula de pigmento. Estas proteínas de unión a clorofila proporcionan a los tilacoides un color verde intenso. Los muchos tilacoides en un cloroplasto proporcionan al cloroplasto un color verde. Los muchos cloroplastos en una célula del mesófilo de la hoja proporcionan a esa célula un color verde. Las muchas células del mesófilo en una hoja proporcionan a la hoja un color verde. La molécula de clorofila absorbe energía luminosa y se estimula un electrón dentro de la nube de electrones en una estructura química resonante que rodea a un ión de magnesio. Este electrón excitado se retira por las proteínas de transporte de electrones circundantes en la membrana. El desplazamiento de estos electrones y los protones que los acompañan da como resultado en última instancia la captura de energía en un enlace fosfato en ATP.

Por lo tanto, el tilacoide es la localización para la absorción de luz y la síntesis de ATP. El estroma usa el ATP para almacenar la energía capturada en enlaces de carbono-carbono de carbohidratos. Algunos cloroplastos muestran granos de almidón en desarrollo. Esto representa polímeros complejos de carbohidratos para almacenamiento a largo plazo.

Dada la importancia de mitocondrias en enfermedades humanas, proliferación celular, muerte celular y envejecimiento, las realizaciones de la presente invención incluyen la manipulación del genoma mitocondrial para suministrar los medios por los que pueden tratarse enfermedades mitocondriales conocidas (LHON, MELAS, etc.) y supuestas enfermedades mitocondriales (envejecimiento, Alzheimer, Parkinson y diabetes). Dadas las funciones bioenergéticas de los cloroplastos, la capacidad para introducir genes exógenos puede conducir a plantas con una viabilidad aumentada en entornos de otro modo hostiles y a una eficacia de fotosíntesis aumentada. Además, se piensa que la expresión de genes exógenos dentro de los cloroplastos es significativamente más eficaz en cloroplastos respecto a la expresión de genes exógenos introducidos en el núcleo de la célula. Por lo tanto, otras realizaciones se refieren a la transfección de cloroplastos para estrategias de biosíntesis más eficaces para compuestos comerciales.

Antes de la presente invención, no existían técnicas eficaces para introducir ácidos nucleicos exógenos, por ejemplo ADN, y los genes que codifican en mitocondrias o cloroplastos. Filogenéticamente, las mitocondrias y cloroplastos se parecen a las primeras bacterias. Una realización de la presente invención se refiere a un sistema que utiliza vectores virales y, más preferiblemente, virus bacterianos para transfectar orgánulos celulares incluyendo cloroplastos y mitocondrias. Esta estrategia molecular única para sustituir, aumentar o modificar de otro modo el genoma cloroplástico y mitocondrial permite, por primera vez, la exploración de cuestiones críticas en la genética de cloroplastos y mitocondrias y el desarrollo de nuevas terapias para enfermedades relacionadas con mitocondrias y
cloroplastos.

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Orgánulos Modificados

De acuerdo con la presente invención un método ejemplar para transfectar mitocondrias y cloroplastos comprende las etapas de introducir en el citosol de una célula eucariota un vector viral recombinante, uniéndose el vector específicamente a un receptor localizado únicamente en la superficie del orgánulo que se va a transfectar.

Se apreciará que el orgánulo diana puede expresar un receptor o un ligando que provoque que un vector que exprese un ligando o receptor correspondiente se asocie con el orgánulo. La asociación de receptor:ligando del orgánulo y del vector puede ser iónica, no covalente, covalente, reversible o irreversible. Las asociaciones de receptor-ligando ejemplares incluyen, pero sin limitación, proteína-proteína, proteína-carbohidrato, proteína-ácido nucleico, ácido nucleico-ácido nucleico, proteína-lípido, lípido-carbohidrato, anticuerpo-antígeno o avidina-biotina. El receptor o ligando en la superficie del orgánulo o vector puede ser una proteína, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, lípido, carbohidrato, biotina, avidina, estreptavidina, grupo químico u otro ligando que provoque una asociación específica entre el orgánulo y el vector.

La interacción específica entre el vector introducido y su orgánulo diana puede conseguirse mediante al menos dos métodos.

El vector viral recombinante puede mutarse de modo que se una a una proteína de superficie expresada endógenamente localizada en el orgánulo diana y que se exprese solamente en el orgánulo diana. En otro método, el orgánulo diana se modifica para que incorpore una proteína receptora exógena con la que se une un vector viral. Como alternativa, un vector puede modificarse para que interaccione específicamente con un orgánulo deseado.

Un bacteriófago lambda mutante puede usarse como vector viral recombinante. El fago lambda se une a su receptor bacteriano (el "receptor lambda" o proteína lamB) a través de la estructura fibrilar en el extremo de la cola. La fibra de cola está compuesta por una subunidad proteica, la proteína gpJ, que se autoensambla en bacterias en empaquetamiento o in vitro. Las mutaciones en gpJ de lambda pueden alterar la especificidad de unión del fago lambda, permitiendo de este modo la selección de lambda mutante que se una a proteínas asociadas de forma natural con orgánulos de células eucariotas y, más particularmente, a proteínas asociadas con la superficie de cloroplastos o mitocondrias (véase la patente de Estados Unidos Nº 5.736.388, cuya descripción se incorpora expresamente en este documento). Por consiguiente, en una realización, se selecciona un vector de bacteriófago lambda como vehículo de suministro, uniéndose el bacteriófago lambda específicamente a un epítopo presente en el orgánulo diana, por ejemplo, un epítopo que esté sólo presente en el orgánulo diana. El epítopo puede ser la totalidad o parte de una proteína, lípido o grupo azúcar tal como un carbohidrato o una combinación de los mismos. En esta realización, el vector lambda se introduce en el citosol de una célula, el vector se une a su receptor y el ácido nucleico presente en el vector se introduce en el orgánulo. Se apreciará por los especialistas en la técnica que el orgánulo diana puede transfectarse extracelularmente o intracelularmente. Si el orgánulo diana se transfecta extracelularmente, el orgánulo transfectado puede introducirse después en una célula usando procedimientos conocidos en la técnica tales como fusión, electroporación, microinyección, bombardeo balístico o liposomas.

Se describe una célula que tiene un orgánulo modificado, siendo el orgánulo modificado una mitocondria o un cloroplasto e incluyendo un receptor introducido exógenamente que se une específicamente a una secuencia de ácido nucleico o a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, un vector viral. Un receptor exógeno se refiere a un receptor que no se asocia de forma natural con el orgánulo ni se localiza en la superficie del orgánulo. La proteína receptora expresada en la superficie del orgánulo puede transcribirse y/o traducirse dentro del orgánulo. Además, la proteína receptora puede experimentar una modificación postraduccional dentro del orgánulo, si es necesario, para facilitar la inserción del receptor en la membrana externa del orgánulo.

La proteína receptora puede traducirse en el citosol y suministrarse al orgánulo diana, donde todo o parte del receptor se asocia con la superficie externa de la membrana. Asociarse con la superficie externa de la membrana significa que la proteína receptora puede insertarse en la membrana externa del orgánulo con el sitio de reconocimiento del vector expuesto en la superficie externa, o la proteína receptora puede asociarse iónicamente, no covalentemente o covalentemente con la superficie externa de la membrana, de modo que el sitio de reconocimiento del vector se exponga y sea capaz de unirse a un vector deseado. Puede lograrse el suministro de proteínas a orgánulos específicos usando secuencias de direccionamiento, por ejemplo, las secuencias de direccionamiento de la
Tabla 1.

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Los ácidos nucleicos, incluyendo, pero sin limitación, polinucleótidos, ácidos nucleicos antisentido, ácidos peptidonucleicos, ácidos nucleicos naturales o sintéticos, ácidos nucleicos con bases modificadas químicamente, ARN, ADN, híbridos de ARN-ADN, ácidos nucleicos enzimáticos tales como ribozimas y ADNzimas, genes nativos/endó-
genos y genes no nativos/exógenos y fragmentos o combinaciones de los mismos, pueden introducirse en orgánulos de una célula hospedadora, en particular orgánulos que pueden transcribir y/o traducir ácidos nucleicos en proteínas, tales como mitocondrias y cloroplastos.

Todo o parte del genoma mitocondrial o cloroplástico puede introducirse en un orgánulo.

Otra realización proporciona un método para transfectar orgánulos de células eucariotas, comprendiendo la primera etapa proporcionar una célula que contiene un orgánulo modificado, comprendiendo el orgánulo modificado un receptor exógeno, tal como el receptor lambda. Después, esta célula se transfecta con un vector viral recombinante de una forma que introduce el vector en el citosol de dicha célula como un vector de funcionamiento intacto. Después, el vector se une a su receptor específico localizado en el orgánulo diana y el ADN recombinante se introduce en el orgánulo.

Un vector se introduce en el citosol de una célula eucariota de una forma funcional intacta a través del uso de procedimientos convencionales conocidos por los especialistas en la técnica. Dichos procedimientos de transfección incluyen, pero sin limitación, microinyección, electroporación, permeabilización con cloruro de calcio, permeabilización con polietilenglicol, fusión de protoplastos o permeabilización con lípidos catiónicos. En una realización, se introduce un vector viral en la célula a través del uso del sistema de suministro de proteínas Bioporter (Gene Therapy Systems, Inc. San Diego, CA).

Se describe un método para introducir secuencias de ácido nucleico exógenas en una mitocondria de una célula de mamífero. Cualquier técnica de transfección mitocondrial debería asegurar que un ácido nucleico atraviese tres membranas (la membrana plasmática y las membranas mitocondriales externa e interna), aborde el alto número de copias de moléculas de ADNmt y utilice un replicón mitocondrial circular mínimo. En una realización de la presente invención, se usa un bacteriófago recombinante como vehículo de suministro para introducir secuencias de ácido nucleico en un orgánulo, por ejemplo, la mitocondria.

De acuerdo con otra realización, se usa un bacteriófago recombinante para transfección mitocondrial y, más preferiblemente, se usa bacteriófago lambda para introducir secuencias de ácido nucleico exógenas en mitocondrias de células de mamífero. Esta estrategia permite la manipulación directa de ADNmt y la introducción del genoma circular en un alto número de copias, confiando en las propiedades del bacteriófago lambda para infectar las mitocondrias de la célula. En particular, el genoma de bacteriófago lambda de 50 kilobases puede modificarse por ingeniería genética con insertos de gran tamaño (>10 kilobases) y empaquetarse para formar fago lambda activo. En una realización, las únicas secuencias de lambda contenidas en el vector son los dos sitios cos (12 pb cada uno) localizados en los extremos 5' y 3' de un fragmento lineal que se empaquetará en una partícula de lambda, dejando hasta aproximadamente 50 kb disponibles para una secuencia de ácido nucleico de interés. Las secuencias recombinantes también pueden incluir un origen de replicación (habitualmente ColEl) que permite la replicación en bacterias y un gen que codifica un marcador de selección.

Puesto que se desconoce el replicón mitocondrial mínimo, puede insertarse el genoma mitocondrial humano completo (SEC ID Nº: 8) o un fragmento parcial del mismo en lambda, con 50 copias por fago activo. Este método puede usarse para manipular o sustituir ADNmt. El genoma mitocondrial humano completo puede sustituirse por las secuencias introducidas. Por ejemplo, pueden generarse primero células Rho^{0} para eliminar el ADNmt endógeno, seguido de transfección mitocondrial, dando como resultado que se sustituya el genoma mitocondrial completo de las células. Como alternativa, pueden transfectarse mitocondrias sin proceder primero a la generación de células Rho^{0}. En este caso, el ácido nucleico introducido se incorporará (recombinará) con las secuencias de ADNmt endógenas existentes, dando como resultado la manipulación de las secuencias de ADNmt. Puede usarse cualquier método para restaurar la funcionalidad completa en mitocondrias dañadas.

Puede usarse un vector de fago lambda en el que las proteínas estructurales del bacteriófago se han modificado para permitir que el bacteriófago se una a una proteína de superficie nativa localizada en la superficie de la mitocondria. Preferiblemente, la proteína de superficie es una que es única para el orgánulo de interés, tal como VDAC para mitocondrias. El fago lambda de tipo silvestre se une a su receptor bacteriano (la proteína lamB) a través de la estructura fibrilar en el extremo de la cola. La fibra de la cola está compuesta por una subunidad proteica, la proteína gpJ, y esta proteína puede modificarse para producir un bacteriófago que sea capaz de interaccionar específicamente con proteínas transmembrana eucariotas (véase la patente de Estados Unidos Nº 5.736.388, cuya descripción se incorpora expresamente en este documento).

En una realización alternativa, se utiliza un vector lambda que conserva su afinidad natural por el receptor lambda (la proteína lamB). Puesto que las mitocondrias humanas nativas carecen del receptor de bacteriófago lambda o proteínas homólogas conocidas (BLAST, E<10^{5}), la primera etapa en esta realización es producir células que contengan mitocondrias que expresen el receptor lambda en la superficie de las mitocondrias. Para producir dichas células, se transfecta una célula con una construcción de ácido nucleico (preferiblemente ADN), que comprende una secuencia que codifica una secuencia de localización mitocondrial unida operativamente a la secuencia codificante de receptor lambda. Los especialistas en la técnica conocen secuencias de localización mitocondrial adecuadas (véase la Tabla 1) incluyen la señal de localización mitocondrial de la subunidad VIII de la citocromo oxidasa humana, la presecuencia de la subunidad IV de la citocromo c oxidasa de levadura y el péptido líder amino-terminal de la ornitina-transcarbamilasa de rata. En una realización, las secuencias introducidas se expresan de forma transitoria en la célula hospedadora. Como alternativa, las secuencias pueden insertarse en el ADN nuclear de la célula hospedadora para producir una célula transformada de forma estable que exprese el receptor viral recombinante. Tras la expresión del receptor recombinante, la señal de localización mitocondrial provoca que el receptor viral se localice en la mitocondria. La posterior transfección de esta célula hospedadora con un vector viral adecuado dirigirá el vector a la mitocondria.

De acuerdo con una realización, se proporciona una célula hospedadora eucariota que expresa el receptor lambda en la superficie de la mitocondria. Más particularmente, la célula hospedadora es una célula de mamífero que comprende una construcción de ácido nucleico recombinante, comprendiendo la construcción una señal de localización mitocondrial unida operativamente al receptor lambda. Cuando dicha célula hospedadora se transfecta con bacteriófago lambda recombinante, el vector lambda se une a su receptor expresado en la superficie mitocondrial, se introduce genoma mitocondrial de lambda en la mitocondria y se recirculariza, reproduciendo la partícula de ADNmt circular intacta.

Los ácidos nucleicos que codifican un receptor para un vector, por ejemplo, un receptor viral para un vector viral, pueden unirse operativamente a una secuencia de direccionamiento a orgánulos, por ejemplo aminoácidos usados para importar proteínas en la mitocondria. Este híbrido de proteína-ácido nucleico puede usarse para dirigir ácidos nucleicos que codifican un receptor de vector en el orgánulo. Una vez en el interior del orgánulo, el ácido nucleico que codifica el receptor de vector puede integrarse en el genoma del orgánulo. Como alternativa, el ácido nucleico puede permanecer episomal. La expresión del ácido nucleico del receptor de vector puede controlarse usando elementos de control conocidos en la técnica de modo de que la expresión se activa o desactiva por la presencia o ausencia de una sustancia inductora o represora.

En otra realización más, pueden introducirse ácidos nucleicos que codifican un receptor viral y una secuencia de direccionamiento a orgánulos, siendo el orgánulo una mitocondria o un cloroplasto, en una célula, por ejemplo una célula eucariota, y traducirse en el citosol. La proteína resultante contiene una secuencia de aminoácidos, típicamente de menos de aproximadamente 30 aminoácidos, que dirige el producto de traducción a un orgánulo específico. El orgánulo diana puede internalizar el producto de traducción y expresar el receptor de vector en la membrana externa del orgánulo. La secuencia de direccionamiento puede escindirse enzimáticamente si es necesario, de modo que el receptor de vector esté libre para unirse a su vector afín.

En una realización, la célula expresa una secuencia de ADN recombinante que comprende una señal de localización en orgánulos, siendo el orgánulo una mitocondria o un cloroplasto, unida operativamente a una secuencia que codifica un receptor viral bacteriano específico. En esta realización, los orgánulos diana se modifican por ingeniería genética para que contengan el receptor natural del vector viral seleccionado para transfectar los orgánulos celulares eucariotas. Por lo tanto, el uso de dichas células modificadas elimina la necesidad de vectores virales que se han modificado para alterar su afinidad de receptor. Por ejemplo, si el vector viral es un bacteriófago lambda, entonces los orgánulos diana se modifican para expresar el receptor de lambda en la superficie del orgánulo.

De acuerdo con esta realización, se proporciona un sistema de transfección que comprende dos componentes, el vector viral que suministra el ácido nucleico de interés, por ejemplo, ARN, ADN o una combinación de los mismos, y una construcción de ácido nucleico (o células que comprenden dicha construcción), comprendiendo la construcción una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de localización en orgánulos unida operativamente a un receptor específico para el vector viral, siendo el orgánulo una mitocondria o un cloroplasto. La construcción de ácido nucleico también incluye opcionalmente un promotor adecuado para expresar la proteína de fusión, así como cualquier otro elemento regulador necesario para expresar la proteína de fusión. Dichos elementos reguladores son bien conocidos por los especialistas en la técnica y variarán basándose en el tipo celular a transfectar. Un vector viral adecuado para usar con la presente invención es el bacteriófago lambda. Cuando se usa bacteriófago lambda como vector de transfección, el segundo componente del sistema de transfección comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor de lambda (lamB) unido operativamente a la secuencia de localización en
orgánulos.

Pueden prepararse células que comprendan mitocondrias o cloroplastos que expresen un receptor deseado, por ejemplo, un receptor viral, en su superficie, usando técnicas de biología molecular convencionales. En general, se transfecta una célula hospedadora con una construcción de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia que codifica una señal de localización en orgánulos unida operativamente a una secuencia que codifica el receptor deseado, por ejemplo, un receptor viral. La secuencia de localización en orgánulos permite que una proteína se una a la secuencia de localización (es decir, una proteína de fusión) que se suministrará en la diana de la secuencia de localización. De acuerdo con una realización de la presente invención, la secuencia de localización se usa para dirigir un receptor específico a un orgánulo de elección, una mitocondria o cloroplasto, y por lo tanto proporcionar un punto de acoplamiento para un vector introducido posteriormente que se una al receptor. El vector se introduce en el citosol de la célula y después se une al orgánulo que expresa el receptor específico para el vector. El ácido nucleico de interés dentro del vector se suministra en el orgánulo animal o vegetal diana. El vector puede introducirse por endocitosis o la secuencia de ácido nucleico de interés puede inyectarse en el orgánulo, por ejemplo, cuando el vector es un vector viral tal como bacteriófago lambda.

Los especialistas en la técnica conocen señales de localización en orgánulos y cualquiera de esas señales puede usarse para dirigir la proteína receptora o ácido nucleico para la expresión en el orgánulo diana. Se describen secuencias de localización adecuadas para usar en la presente invención en Emanuelsson et al., Predicting Subcellular Localization of Proteins Based on Their N-Terminal Amino Acid Sequence Journal of Molecular Biology 300 (4): 1005-16, 21 jul 2000, y en Cline y Henry, Import and Routing of Nucleus-encoded Chloroplast Proteins. Annual Review of Cell & Developmental Biology. 12: 1-26, 1996, cuyas descripciones se incorporan en este documento. Más particularmente, se enumera en la Tabla 1 una lista de señales de localización mitocondrial para dirigir proteínas o ácidos nucleicos unidos a la membrana externa de las mitocondrias. Se enumera en la Tabla 2 una lista de señales de localización en cloroplastos para dirigir proteínas o ácidos nucleicos unidos a la membrana de los cloroplastos. En una realización, la señal de localización en mitocondrias o cloroplastos está unida operativamente a un receptor de virus bacteriano seleccionado del grupo constituido por OmpF, OmpC, PhoB y lamB.

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TABLA 1 Señales de Localización para Direccionamiento a la Membrana Mitocondrial Externa

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TABLA 2 Señales de Localización para Direccionamiento a la Membrana Cloroplástica Externa

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La identificación de las secuencias específicas necesarias para la translocación de una proteína unida en un cloroplasto o mitocondria puede determinarse usando un programa informático predictivo conocido por los especialistas en la técnica, incluyendo las herramientas localizadas en http://www.mips.biochem.mpg.de/cgi-bin/proj/medgen/
mitofilter.

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Transfección de Plantas

Se conocen en la técnica procedimientos para transfección de plantas. Por ejemplo, tanto Agrobacterium tumefaciens como Agrobacterium rhizogenes tienen la capacidad de transferir porciones de su ADN a los genomas de plantas y pueden usarse para transfectar células vegetales. El mecanismo por el que transfieren ADN es el mismo, sin embargo las diferencias en los fenotipos resultantes se atribuyen a la presencia de un plásmido Ti en Agrobacterium tumefaciens y el plásmido Ri en Agrobacterium rhizogenes. El ADN del plásmido Ti induce que las plantas hospedadoras crezcan en masas tumorales, mientras que el ADN del plásmido Ri conduce a la proliferación abundante de raíces. Agrobacterium tumefaciens es capaz de infectar casi cualquier tejido vegetal, mientras que Agrobacterium rhizogenes sólo puede infectar raíces.

El plásmido Ti de Agrobacterium es una molécula de ADN bicatenario circular de gran tamaño (ADN-T) de aproximadamente 200 kb, que existe como una unidad de replicación autónoma. Los plásmidos se mantienen en el interior de las bacterias y sólo una región específica (región T) de aproximadamente 20 kb puede transferirse de la bacteria al hospedador. Para lograr esta transferencia el plásmido Ti contiene una serie de genes que codifican para su propia replicación, escisión del plásmido, transferencia a la célula hospedadora, incorporación en el genoma hospedador e inducción de la formación de tumores.

Agrobacterium puede detectar y migrar hacia células vegetales lesionadas a través de la detección de señales químicas que se filtran desde la planta herida. Este proceso de detección se denomina quimiotaxis. El Agrobacterium puede reconocer compuestos vegetales, tales como acetosirinogona, ácido sinapínico, alcohol coniferílico, ácido cafeico y ácido metilsiríngico que inducen la virulencia de la bacteria. Para comenzar el proceso de infección, el propio Agrobacterium debe unirse a la célula hospedadora. Esta unión se consigue por un grupo de genes localizados en el interior del cromosoma bacteriano. Las bacterias pueden anclarse en el sitio de la lesión por producción de fibrillas de celulosa. Las fibrillas se unen a la superficie celular del hospedador vegetal y facilitan el agrupamiento de otras bacterias en la superficie celular. Se piensa que este agrupamiento puede ayudar a la transferencia con éxito del ADN-T. Una vez unida al hospedador, la bacteria es libre de comenzar el procesamiento y la transferencia de la región T. Una realización de la presente invención describe la transfección de una célula vegetal con Agrobacterium habiéndose modificado el Agrobacterium para unirse a un orgánulo vegetal, por ejemplo un cloroplasto. El Agrobacterium puede modificarse adicionalmente para que codifique un ácido nucleico de interés para la expresión en el orgánulo. Tras la unión al orgánulo, el Agrobacterium puede suministrar el ácido nucleico al cloroplasto.

Para transferir la región T del plásmido Ti al orgánulo de la célula hospedadora, la región T debe procesarse de modo que se escinda del plásmido y se dirija al orgánulo. La región T se escinde del plásmido Ti y se dirige hacia la célula hospedadora u orgánulo. Una vez que está apropiadamente empaquetada, la transferencia del complejo T está mediada por varias proteínas y se piensa que es similar a la conjugación bacteriana. Una vez en el interior de la célula u orgánulo vegetal, el complejo T se capta a través de la membrana.

Células y Líneas Celulares Ejemplares

Un ácido nucleico que codifica un receptor de vector puede introducirse de forma estable en orgánulos de células de una línea celular, siendo el orgánulo una mitocondria o un cloroplasto. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un receptor de vector unido operativamente con una secuencia de direccionamiento a orgánulos, siendo el orgánulo una mitocondria o un cloroplasto, puede usarse para transfectar una línea celular eucariota de modo que la secuencia de ácido nucleico se integre de forma estable en el genoma de una célula de la línea celular. Como alternativa el ácido nucleico que codifica el receptor de vector puede ser episomal. La línea celular puede ser una línea celular transformada que puede mantenerse indefinidamente en cultivo celular, o la línea celular puede ser un cultivo celular primario. Las líneas celulares ejemplares son las disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, incluyendo líneas celulares vegetales que se incorporan en este documento como referencia. El ácido nucleico puede replicarse y transcribirse dentro del núcleo de una célula de la línea celular transfectada. Cuando se traduce en el citosol, la proteína se dirige al orgánulo específico para la secuencia de direccionamiento a orgánulos contenida en el interior de la proteína. El orgánulo diana puede internalizar la proteína y expresar el componente receptor de vector en la membrana externa del orgánulo. La secuencia de direccionamiento puede escindirse enzimáticamente si es necesario, de modo que el receptor de vector esté libre para unirse a su vector afín.

Puede transfectarse cualquier célula eucariota para producir orgánulos, siendo el orgánulo una mitocondria o un cloroplasto, que expresen un receptor específico, por ejemplo, receptores virales exógenos, incluyendo células primarias así como líneas celulares establecidas. Los tipos adecuados de células incluyen, pero sin limitación, células indiferenciadas o parcialmente diferenciadas incluyendo células madre, células totipotentes, células pluripotentes, células madre embrionarias, células de la masa interna, células madre adultas, células de médula ósea, células de sangre de cordón umbilical y células obtenidas de ectodermo, mesodermo o endodermo. Las células diferenciadas adecuadas incluyen células somáticas, células neuronales, músculo esquelético, músculo liso, células pancreáticas, células hepáticas y células cardiacas. Pueden seleccionarse células vegetales adecuadas a partir de monocotiledóneas y dicotiledóneas e incluyen maíz, soja, legumbres, pastos y cereales tales como arroz y trigo.

Si el orgánulo al que se va a dirigir es un cloroplasto, entonces la célula hospedadora puede seleccionarse de células fotosintéticas eucariotas conocidas. Si el orgánulo que se va a transfectar es la mitocondria, entonces puede usarse cualquier célula eucariota, incluyendo células de mamífero, por ejemplo, células humanas. Las células se transfectan para que expresen de forma transitoria o estable el gen de receptor viral. Puede integrarse una construcción de ADN que codifica un receptor viral en el genoma nuclear de una célula para producir una línea celular transgénica estable que comprenda orgánulos que expresen el receptor viral deseado.

Herramientas de Investigación

Los métodos pueden usarse como herramientas para investigar las consecuencias celulares de la expresión de ADNmt, los mecanismos de heteroplasmia, replicación y herencia del ADNmt, así como efectos umbrales. Pueden generarse ratones con mutaciones mitocondriales usando esta estrategia, permitiendo a los investigadores estudiar mutaciones en el ADNmt que no se encuentran en la naturaleza. Más particularmente, puede usarse la transfección mitocondrial para generar células que contengan mitocondrias que tengan genotipos idénticos o grados variables de heteroplasmia. Para preparar células homoplásmicas, se preparan primero células Rho^{0} (desprovistas de ADNmt) usando técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden generarse células Rho^{0} usando bromuro de etidio como se describe en Miller et al., J. Neurochem 67: 1897, 1996. Estas células Rho^{0} se mantienen y se propagan en medios de cultivo que contienen piruvato y después se transfectan con un genoma mitocondrial funcional. Después de la selección metabólica por retirada del piruvato del medio de cultivo, sólo sobrevivirán las células que contienen mitocondrias transfectadas con éxito, generando de este modo una población de células que tendrán todas genomas mitocondriales idénticos.

Después pueden generarse líneas celulares que tengan grados variables de heteroplasmia de una forma controlada, fusionando dos o más líneas celulares homoplásmicas para generar híbridos citoplasmáticos. Pueden generarse híbridos citoplasmáticos usando cualquiera de las técnicas conocidas para introducir orgánulos en una célula receptora, incluyendo, pero sin limitación, fusión de membranas celulares mediada por polietilenglicol (PEG), permeabilización de membrana celular, fusión célula-citoplasto, fusión de membranas mediada por virus, fusión mediada por liposomas, microinyección u otros métodos conocidos en la técnica.

Animales Transgénicos no Humanos

Las técnicas descritas en la presente invención también pueden usarse para generar animales transgénicos no humanos. En particular, cada una de microinyección de cigotos, transferencia nuclear, electrofusión de blastómeros e inyección de blastocistos de híbridos citoplasmáticos de células madre embrionarias (ES) han proporcionado estrategias viables para generar ratones hetero- y homoplásmicos que contienen ADNmt de líneas celulares transfectadas mitocondrialmente (es decir, células que contienen mitocondrias transfectadas). Una célula madre embrionaria (ES) puede someterse a transfección mitocondrial e inyectarse en el blastocisto de un embrión de mamífero como medio para generar ratones quiméricos. Pueden prepararse primero híbridos citoplasmáticos de células madre embrionarias (ES) (a partir de células transfectadas mitocondrialmente y células ES rho o partir de dos células transfectadas mitocondrialmente por separado), seguido de inyección de blastocistos en embriones como se muestra en la Figura 3. El uso de células que llevan un ADNmt con transfección mitocondrial específico de interés permite la generación de ratones transmitocondriales que son heteroplásmicos o incluso homoplásmicos para el ADN transfectado mitocondrialmente. En teoría, esta técnica ofrece la perspectiva de transferir cualquier ADNmt mutante que pueda obtenerse a partir de células transfectadas mitocondrialmente cultivadas en un modelo de organismo completo. Una vez combinada con la transfección mitocondrial, podría usarse para generar modelos de ratones de enfermedades de ADNmt humanas.

El uso de lambda para la transfección de ADNmt ("transfección mitocondrial") permitirá investigaciones en cuestiones tales como el efecto de proporciones variables de la "deleción común" de 5000 pb, que se acumula con el envejecimiento, polimorfismos que se encuentran en la diabetes y enfermedades neurodegenerativas y la dinámica de complementación de ADNmt. También existen usos terapéuticos potenciales de esta estrategia. La introducción dirigida del genoma mitocondrial normal ofrece tratamiento para tanto enfermedades basadas en ADNmt clásicas como enfermedades de envejecimiento tales como afecciones cerebrales neurodegenerativas y diabetes de comienzo en adultos, que se han asociado con una disfunción mitocondrial basada en el ADNmt.

Kits

La presente invención también se refiere a un kit o envase que suministre los elementos necesarios para realizar la transfección de orgánulos eucariotas. De acuerdo con una realización se proporciona un kit que comprende un ácido nucleico, por ejemplo una construcción de ADN, que codifica una señal de localización mitocondrial o cloroplástica unida operativamente a un receptor lambda, y componentes de empaquetamiento en lambda para preparar un vector lambda recombinante. El kit también puede incluir las secuencias de ADN de lambda (los "brazos" del vector) para insertar una secuencia de ADN de interés y el posterior uso en la generación de un vector de fago lambda recombinante. En una realización, la construcción de ADN proporcionada con el kit comprende una señal de localización mitocondrial o cloroplástica seleccionada de las enumeradas en las Tablas I y II y, más particularmente, en una realización, la construcción de ADN comprende una secuencia que codifica la señal de localización mitocondrial de la subunidad VIII de la citocromo oxidasa humana unida operativamente al receptor de bacteriófago lambda.

De acuerdo con una realización se proporciona un kit que comprende células eucariotas que contienen un orgánulo mitocondrial o cloroplástico que expresa un vector viral exógeno en la superficie del orgánulo y componentes de empaquetamiento del virus. También puede desarrollarse un kit con tal de que comprenda componentes de empaquetamiento para un vector viral, ADN viral para preparar construcciones recombinantes y células que contengan un orgánulo mitocondrial o cloroplástico que exprese un receptor en la superficie del orgánulo que sea capaz de unirse al vector viral preparado usando el kit. El kit puede contener extracto de empaquetamiento de bacteriófago lambda, ADN de lambda, y células que comprendan mitocondrias o cloroplastos que expresen el receptor lambda en su membrana externa. Más particularmente, en una realización, las células proporcionadas con los kits de la presente invención se han transformado de forma estable con una construcción de ADN que comprende una señal de localización en orgánulos unida operativamente a un receptor lambda. Los componentes individuales de los kits pueden empaquetarse en una diversidad de recipientes, por ejemplo, viales, tubos, placas de pocillos de microtitulación, frascos y similares. Otros reactivos pueden incluirse en recipientes separados y suministrarse con el kit; por ejemplo, muestras de control positivo, muestras de control de negativo, tampones, medios de cultivo celular, etc. Preferiblemente los kits incluirán también instrucciones para el uso.

Enfermedades o Síndromes Relacionados con Orgánulos

La disfunción de orgánulos puede causar enfermedad en un hospedador, por ejemplo un hospedador humano o un hospedador vegetal. En particular, los problemas con mitocondrias o cloroplastos pueden dar como resultado una enfermedad. Las enfermedades mitocondriales son el resultado de insuficiencias de las mitocondrias, compartimientos especializados presentes en todas las células del cuerpo excepto en los glóbulos rojos. Las lesiones celulares e incluso la muerte celular son el resultado de una insuficiencia mitocondrial. Si este proceso se repite por todo el cuerpo, comienzan a fallar sistemas completos y la vida de la persona en la que está sucediendo esto se ve gravemente comprometida. La enfermedad puede ser en niños, por ejemplo, individuos menores de 18 años de edad, típicamente menores de 12 años de edad, o adultos, por ejemplo individuos de 18 años de edad o más. Por lo tanto, un hospedador al que se le ha diagnosticado una enfermedad relacionada con orgánulos, en particular una enfermedad mitocondrial, puede tratarse por transfección de un orgánulo de célula hospedadora, por ejemplo, una mitocondria, para que exprese un receptor e introducción de un vector en la célula hospedadora, uniéndose el vector específicamente al receptor y comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifique una proteína o péptido mitocondrial.

Pueden manipularse, aumentarse o sustituirse porciones del genoma mitocondrial de células de mamífero, para tratar enfermedades causadas por defectos o anomalías genéticas mitocondriales.

Las enfermedades mitocondriales ejemplares incluyen, pero sin limitación: enfermedad de Alpers; síndrome de Barth; deficiencias de la \beta-oxidación; deficiencia de la carnitina-acil-carnitina; deficiencia de carnitina; deficiencia de coenzima Q10; deficiencia de Complejo I; deficiencia de Complejo II; deficiencia de Complejo III; deficiencia de Complejo IV; deficiencia de Complejo V; deficiencia de citocromo c oxidasa (COX); síndrome de oftalmoplejía externa progresiva crónica (CPEO), deficiencia de CPT I; deficiencia de CPT II; aciduria glutárica tipo II; acidosis láctica; deficiencia de acil-CoA-deshidrogenasa de cadena larga (LCAD); LCHAD; citopatía mitocondrial; reducción del ADN mitocondrial; encefalopatía mitocondrial; miopatía mitocondrial; encefalomiopatía mitocondrial con acidosis láctica y episodios similares a apoplejía (HELAS); epilepsia mioclónica con fibras rojas rasgadas (MERRF); síndrome de Leigh de herencia materna (MILS); encefalomiopatía miogastrointestinal (MNGIE); neuropatía, ataxia y retinitis pigmentosa (NARP); neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON); oftalmoplejía externa progresiva (PEO); síndrome de Pearson; síndrome de Kearns-Sayre (KSS); síndrome de Leigh; disautonomía intermitente; deficiencia de piruvato carboxilasa; deficiencia de piruvato deshidrogenasa; mutaciones y deleciones en la cadena respiratoria; deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta (SCAD); SCHAD; y deficiencia de acil-CoA-deshidrogenasa de cadena muy larga (VLCAD).

Algunas enfermedades mitocondriales son el resultado de problemas en la cadena respiratoria en las mitocondrias. La cadena respiratoria consiste en cuatro grandes complejos proteicos: I, II, III, IV (citocromo c oxidasa o COX), ATP sintasa y dos moléculas pequeñas que transportan electrones, coenzima Q10 y citocromo c. La cadena respiratoria es la etapa final en el proceso generador de energía en la mitocondria donde se genera la mayor parte del ATP. Las encefalomiopatías mitocondriales que pueden estar causadas por deficiencias en uno o más de los complejos de la cadena respiratoria específicos incluyen MELAS, MERFF, síndrome de Leigh, KSS, Pearson, PEO, NARP, MILS y MNGIE.

La cadena respiratoria mitocondrial está compuesta por proteínas que vienen tanto del ADN nuclear como del ADNmt. Aunque sólo 13 de aproximadamente 100 proteínas de la cadena respiratoria vienen del ADNmt, estas 13 proteínas contribuyen a cada parte de la cadena respiratoria excepto el complejo II y son necesarios otros 24 genes mitocondriales sólo para fabricar esas 13 proteínas. Por lo tanto, una deficiencia en un gen nuclear o en uno de los 37 genes mitocondriales puede causar la descomposición de la cadena respiratoria. Las mitocondrias pueden transfectarse con al menos una parte de un gen implicado en la función mitocondrial, en particular al menos uno o parte de los 37 genes mitocondriales para restaurar o aumentar la función de la cadena respiratoria. Cualquiera o parte de un genoma mitocondrial, por ejemplo el genoma mitocondrial humano de la SEC ID Nº: 8, puede introducirse en una mitocondria hospedadora usando los métodos descritos en este documento.

Las enfermedades de las mitocondrias parecen causar el mayor daño a células del cerebro, corazón, hígado, músculos esqueléticos, riñón y los sistemas endocrino y respiratorio. Por lo tanto, la transfección de mitocondrias en estas células y tejidos con ácidos nucleicos específicos está dentro del alcance de la presente invención, en particular la transfección de mitocondrias con ácidos nucleicos que codifiquen proteínas codificadas mitocondrialmente más que proteínas codificadas por el núcleo. Se apreciará que las mitocondrias pueden transfectarse para expresar cualquier proteína ya esté presente o no de forma natural en la mitocondria o esté codificada de forma natural por ADNmt o ADN nuclear. Dependiendo de qué células estén afectadas, los síntomas pueden incluir pérdida del control motor, debilidad y dolor muscular, trastornos gastrointestinales y dificultades para tragar, crecimiento escaso, enfermedad cardiaca, enfermedad hepática, diabetes, complicaciones respiratorias, ataques, problemas visuales/de la audición, acidosis láctica, retrasos del desarrollo y susceptibilidad a infección.

Las mutaciones del ADNmt ejemplares que pueden abordarse mediante la presente invención incluyen, pero sin limitación: ARNt^{leu} - A3243G, A3251G, A3303G, T3250C, T3271C y T3394C; ARNt^{Lys} - A8344G, G11778A, G8363A, T8356C; ND1-G3460A; ND4-A10750G, G14459A; ND6-T14484A; 12S ARNr-A1555G; MTTS2-
C12258A; ATPasa 6-T8993G, T8993C; ARNt^{Ser} (UCN)-T7511C; 11778 y 14484, mutaciones de LHON así como mutaciones o deleciones en ND2, ND3, ND5, citocromo b, citocromo oxidasa I-III y ATPasa 8.

Se describe un método para restaurar o aumentar la función de la cadena respiratoria en la célula hospedadora que incluye transfectar una mitocondria en la célula hospedadora para que exprese un receptor en la superficie externa de la mitocondria; e introducir un vector en la célula hospedadora, uniéndose el vector específicamente al receptor en la superficie externa de la mitocondria y comprendiendo un ácido nucleico que codifica una proteína o péptido de la cadena respiratoria. El ácido nucleico del vector puede inyectarse o suministrarse de otro modo en el interior de las mitocondrias cuando el vector se une al receptor, por ejemplo, cuando el receptor es bacteriófago lambda y el receptor es un receptor de bacteriófago lambda.

Se describe un método para restaurar o aumentar la actividad citocromo oxidasa en un hospedador que incluye transfectar mitocondrias en una célula, por ejemplo, una célula de músculo esquelético de un hospedador para que exprese un receptor, e introducir un vector que se una específicamente al receptor; comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifica una citocromo oxidasa o un componente funcional de la misma. Un componente funcional significa una parte o fragmento de la proteína o complejo proteico o subunidad que realiza una función biológica independientemente o en combinación con otra proteína, fragmento o subunidad.

También se describe un método para aumentar o restaurar la \beta-oxidación en un hospedador que incluye obtener células del hospedador, transfectar un orgánulo en las células del hospedador para expresar un receptor, introducir un vector que comprende un ácido nucleico que codifica proteínas implicadas en la espiral de \beta-oxidación y el transporte de carnitina, uniéndose el vector específicamente al receptor expresado en el orgánulo; e introducir las células transfectadas del hospedador de nuevo en el hospedador. Se describen métodos de restauración de la función mitocondrial perdida o disminuida como resultado de mutaciones puntuales o deleción.

Por ejemplo, KSS, PEO y Pearson son tres enfermedades que son el resultado de un tipo de mutación de ADNmt denominada deleción (faltan porciones específicas del ADN) o reducción del ADNmt (un acortamiento general del ADNmt). Por lo tanto, las células de hospedadores a los que se les ha diagnosticado KSS, PEO, Pearson o una enfermedad similar pueden tener sus mitocondrias transfectadas para que expresen un receptor en la superficie externa. Un vector que comprende un ácido nucleico que se corresponde con la deleción en el ADNmt que causa la patología puede introducirse en las células que contienen las mitocondrias transfectadas. El vector se unirá al receptor y suministrará el ácido nucleico en el interior de las mitocondrias, donde se expresa el ácido nucleico. El producto de expresión puede incorporarse después en las mitocondrias y aumentar o restaurar la función mitocondrial. Las células transfectadas pueden reintroducirse en el hospedador. Se apreciará que las células del hospedador u otras células pueden transfectarse como se describe en este documento e introducirse en un hospedador que tiene orgánulos disfuncionales en mitocondrias particulares.

Los especialistas en la técnica apreciarán que la presente invención incluye suministrar por separado o en combinación ácidos nucleicos a las mitocondrias que están codificados de forma natural por ADNmt o ADN nuclear.

Los síntomas de enfermedad mitocondrial pueden aliviarse generando células que tienen mitocondrias transfectadas y no transfectadas. Como alternativa, todas las mitocondrias en una célula pueden transfectarse o sustituirse.

Se describe un método para compensar una mutación de ADNmt en un hospedador incluyendo el método identificar un hospedador que tenga una mutación de ADNmt, obtener una célula que comprenda dicha mutación de ADNmt a partir de dicho hospedador, transfectar una mitocondria de la célula hospedadora para que exprese un receptor, introducir un vector que se una específicamente al receptor en la célula hospedadora, comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifica un producto funcional que se corresponde con la mutación del ADNmt e introducir dicha célula transfectada en el hospedador. Un ácido nucleico que codifica un producto funcional que se corresponde con la mutación del ADNmt se refiere a una secuencia que produce una proteína sin la mutación correspondiente. Por ejemplo, si una célula hospedadora tiene una mutación ND4-A10750G el ácido nucleico transfectado codificaría un producto de tipo silvestre para el gen ND4. Las células transfectadas pueden introducirse en el hospedador, por ejemplo, por vía intravenosa.

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Ejemplo 1 Localización Mitocondrial del Receptor Lambda en Células de Mamífero

Se amplificó por PCR ADNc de receptor lambda a partir de E. coli K-12. Se amplificó por PCR ADN genómico de E. coli K-12 (ATCC) usando el Clontech HotStart System con los siguientes cebadores: ATG ATG TTA CTC CTG CGC AAA C (SEC ID Nº: 1) y TTA CCA CCA GAT TTC CAT CAG GG (SEC ID Nº: 2). Se realizó una clonación TA del ADNc en pIND/Topo (Invitrogen). El plásmido resultante (pIND-LamB) se digirió con BamHI y AgeI (NEB). Se digirió pDsRed1-Mito (Clontech) con BamHI y AgeI y el fragmento de receptor lambda de 1,3 kb se insertó cadena abajo de la señal de localización mitocondrial de la subunidad VIII de la citocromo oxidasa humana. Se transformaron células DH5\alpha y se aisló el plásmido pMLS-LambdaR resultante y se usó para transfectar células Rho.

Para ensayar para localización mitocondrial del receptor lambda, se transfectaron células Rho^{0} de neuroblastoma SH-SY5Y humano desprovistas de ADNmt o actividad de ETC con el plásmido de receptor lambda de localización mitocondrial (pMLS-LambdaR). Con microscopía confocal se observó fluorescencia roja en la distribución punteada/perinuclear mitocondrial habitual. Puesto que la proteína de fusión de receptor lambda-RFP puede obstaculizar estéricamente una función de receptor lambda apropiada, el ADNc de RFP se escindió de pMLS-LambdaR para futuros experimentos.

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Ejemplo 2 Transfección de Mitocondrias y Expresión de una Construcción Génica Recombinante

El genoma mitocondrial de SH-SY5Y de control se amplificó por PCR alrededor de la región entre el supuesto sitio de terminación de la transcripción mitocondrial (MTTER) y el ARNt para leucina. Se amplificó por PCR el ADNmt con EXPAND Long Template (Roche) usando los siguientes cebadores: ACA TAC CCA TGG CCA ACC TCC TAC TCC TCA (SEC ID Nº: 3) y CCT TTT CTT CTC CTT AAC TTG GAG ACT GAC (SEC ID Nº: 4). Se usaron los siguientes parámetros de ciclado para generar el producto de 16,6 kb: 92ºC durante 2 minutos, diez ciclos de 92ºC durante 30 s, hibridación a 58ºC durante 1 min y 12 minutos de extensión a 68ºC. Esto se siguió de 25 ciclos de los diez ciclos previos con una etapa de 20 s añadida al tiempo de extensión. El producto de PCR se ligó con polienlazadores NotI y se digirió con NotI para la inserción de EGFP (la construcción ADNmt/EGFP/BamHI). Como alternativa, el producto de PCR se ligó con polienlazadores BamHI y se digirió con BamHI para la ligación en los vectores lambda sin que contuvieran la EGFP (la construcción ADNmt/BamHI). Se prepararon Supercos-1 y Lambda Fix II (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las construcciones ADNmt/BamHI o ADNmt/EGFP/BamHI se ligaron con Supercos-1 y Lambda Fix II. Las construcciones terminadas se empaquetaron en Extracto de empaquetamiento de Lambda (Stratagene).

Para establecer la prueba de concepto, se incorporó GFP como gen indicador. Puesto que las mitocondrias poseen un código de traducción único, el gen indicador GFP se mutó para impedir su traducción excepto por el aparato de traducción mitocondrial. Se realizó mutagénesis dirigida (Clontech) en la posición nucleotídica 270, cambiando una A a G. El codón posterior se cambió de AGA a AGG. Se mutó el pEGFP de Clontech usando el protocolo de Clontech en mutS-E. coli. Los cebadores usados eran: Secuencia de Cebador de Mutagénesis: CTG CCC GTG CCC TGA CCC ACC CTC GTG ACC (SEC ID Nº: 5). Secuencia de Cebador de Selección1: GAG CTC AAG CTT CGA ATC CTG CAG TCG ACG (SEC ID Nº: 6). Secuencia de Cebador de Selección 2: TTT GGA GGT CTA GGC TTT TGC AAA GAT CGA (SEC ID Nº: 7). En el código de traducción mitocondrial, el AGG continúa siendo un triptófano; mientras que en el código de traducción nuclear el AGG se lee como un codón de terminación. Esta estrategia impide completar la traducción de GFP fuera de la mitocondria, produciendo un producto génico no fluorescente acortado (70 aminoácidos de longitud).

El mito-GFP se ligó en el MTTER cadena arriba. La construcción de genoma mitocondrial-GFP se ligó después en SuperCos-1 (Stratagene) flanqueando los promotores de bacteriófago T7 y T4 y se empaquetó para producir fago lambda activo usando extractos de empaquetamiento de lambda disponibles en el mercado (Stratagene).

Usando el sistema de suministro de proteínas Bioporter (GeneTherapy Systems), el bacteriófago se introdujo en células Rho^{0} SH-SY5Y que expresaban de forma transitoria (24 horas post-transfección) el receptor de fago lambda de pMLS- LambdaR. Dentro del citosol, se dejó que el fago lambda activo que llevaba el genoma mitocondrial humano y el GFP introdujera su genoma que contenía la construcción mitocondrial. Puesto que las mitocondrias poseen un genoma circular, el fago lambda era especialmente útil debido a su capacidad para recircularizar su ADN genómico debido a sus extremos cohesivos (sitios cos).

Después de la selección por retirada de piruvato del medio de cultivo, que provocará que las células Rho^{0} normales mueran, se observó actividad indicadora de GFP en una distribución punteada/perinuclear. Las células de control transfectadas con pMLS-LambdaR y extracto de empaquetamiento no mostraban fluorescencia de GFP. Las células Rho^{0} que no poseían receptor lambda pero estaban transfectadas con el fago lambda con genoma mitocondrial activo tampoco mostraban fluorescencia de GFP, sugiriendo la necesidad de la expresión del receptor de fago lambda para un direccionamiento mitocondrial apropiado.

Para establecer la colocalización de GFP con mitocondrias, se utilizó un colorante fluorescente (MitoTracker Red) captado preferentemente por mitocondrias de una forma dependiente de potencial de membrana. Las células que expresaban pMLS-LambdaR y transfectadas con cósmido SuperCos-1/ADNmt/GFP mostraban colocalización de GFP con MitoTracker Red. Usando un anticuerpo de GFP (Molecular Probes), el análisis de transferencia de Western que comparaba un aislado mitocondrial con fracciones citoplasmáticas y nucleares puso de manifiesto que las fracciones mitocondriales contienen inmunotinción de GFP.

Puesto que las células Rho^{0} carecen de productos génicos de ADNmt, no tienen complejo I o IV de ETC funcional y no pueden consumir oxígeno o mantener los potenciales de membrana mitocondriales normales. Después de la inserción del genoma mitocondrial en células Rho^{0}, el retorno de estas actividades bioenergéticos constituiría pruebas de la expresión e incorporación funcional de productos génicos de ADNmt.

El éxito de la transfección se evaluó primero demostrando la presencia del ADNmt de longitud completa por amplificación por PCR sobre aislados de ADN de células Rho^{0} transfectadas y de control; se observó un producto de PCR de 16,5 kb a partir de células transfectadas y en ninguno de los controles. Además, las células transfectadas mostraban síntesis de ADNmt basada en la incorporación mitocondrial de tinción con bromodesoxiuridina (BrdU) que se colocalizaba con el GFP.

Puesto que la replicación del ADNmt requiere la presencia de ARNm cebador, sugiriendo una transcripción de ADNmt intacto, se buscaron los productos génicos de ETC de ADNmt mediante transferencia de Western. Se detectaron bandas positivas para la subunidad I del Complejo IV codificada por ADNmt en células transfectadas y SY5Y nativas, mientras que no se observaron señales en controles transfectantes o células Rho^{0}.

Los productos génicos codificados por ADNmt transfectados podían incorporarse con éxito en complejos de ETC funcionales como se determinó por las actividades de ensayo de Complejo I y Complejo IV. Las actividades de Complejo I y IV en las células superaban 50% de las de las SY5Y nativas (véase la Figura 2), señalando una velocidad aumentada de fosforilación oxidativa posiblemente debida a que la construcción lleva los promotores de bacteriófago T7 y T4 además de los promotores de cadena pesada y ligera del ADNmt.

Habiendo demostrado que las células transfectadas demostraban actividades de Complejo I y IV intactas, después se usó polarografía de oxígeno para demostrar una captación de oxígeno sensible a inhibidor de ETC. Las células Rho^{0} transfectadas con ADNmt consumían oxígeno a una velocidad comparable a las SH-SY5Y de control y reducen oxígeno de una forma dependiente de ETC. La captación de oxígeno por las células transfectadas con ADNmt era sensible a rotenona (un inhibidor de Complejo I), KCN (un inhibidor de Complejo IV) y se aumentaba por el CCCP desacoplante de ETC. No se observó consumo de oxígeno basal ni inducido por CCCP en las células control de transfección o Rho^{0}.

Habiendo demostrado la introducción con éxito de ADNmt de longitud completa, proteínas codificadas por ADNmt y una cadena de transporte de electrones y un consumo de oxígeno intactos, las células se investigaron para determinar pruebas de acoplamiento de la actividad de ETC al bombeo de protones, que normalmente supone la mayoría del potencial de membrana mitocondrial (DY_{M}). El colorante sensible a potencial JC-1 se usó para estimar el DY_{M} relativo en células transfectadas con ADNmt que carecían del indicador GFP pero contenían ADNmt de longitud completa. Se observó un aumento en el agregado J rojo fluorescente en comparación con células de control de transfección, Rho^{0} y SH-SY5Y nativas. Esto demostraba que la actividad de la ETC y el consumo de oxígeno en las células transfectadas con ADNmt permitían la vuelta del DY_{M} y proporcionaba pruebas de acoplamiento funcional de complejos de ETC recién expresados.

En resumen, se utilizó bacteriófago lambda que contenía el genoma mitocondrial humano completo para restaurar la actividad de la cadena de transporte de electrones (ETC) en células completamente desprovistas de ADNmt (células Rho^{0}). Se observó la reaparición de ADNmt, proteínas de ETC codificadas por ADNmt, función de ETC, potencial de membrana mitocondrial y un consumo de oxígeno sensible a inhibidor de ETC.

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Ejemplo 3 Rescate de una Deficiencia Mitocondrial

La estrategia de transfección de ADNmt basada en bacteriófago lambda también puede usarse para rescatar líneas celulares que llevan ADNmt de pacientes con enfermedades mitocondriales o ADNmt mutados in vitro. Por ejemplo, la Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber (LHON) es un trastorno causado por mutaciones en el ADNmt. La mutación en el gen de la subunidad 4 de la NADH deshidrogenasa es una transición de G \rightarrow A en el nucleótido 11778. Esto elimina un sitio de restricción para SfaN1. Por lo tanto, la presencia de esta deficiencia mitocondrial puede detectarse digiriendo el ADN de las células con la enzima de restricción SfaN1 y observando los fragmentos resultantes por electroforesis en gel. Se generaron líneas celulares de híbridos citoplasmáticos de LHON a partir de un paciente con Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber (LHON) y estas células contenían sólo el ADNmt mutante. Usando la estrategia de transfección de la presente invención, se introdujo ADNmt SH-SY5Y de tipo silvestre en los híbridos citoplasmáticos de LHON. Estos transfectantes de ADNmt de LHON demostraron suministro de ADNmt de tipo silvestre.

La detección de las secuencias de NADH deshidrogenasa mutante y de tipo silvestre se realizó usando amplificación por PCR y análisis con endonucleasas de restricción. En particular, se amplificó por PCR una amplicón de 450 nucleótidos que incluía esta región de los híbridos citoplasmáticos de LHON, híbridos citoplasmáticos de LHON con transfección mitocondrial con el genoma de tipo silvestre y de células SY5Y normales. El amplicón se digirió con SfaN1 (la digestión en dos fragmentos indica un genoma de tipo silvestre mientras que la no digestión indica el genotipo LHON). No se observó digestión en los híbridos citoplasmáticos de LHON mientras que se observó digestión en los híbridos citoplasmáticos de LHON con transfección mitocondrial con el genoma de tipo silvestre y en las células SY5Y. Además, la PCR cuantitativa después de la transfección mostraba un aumento de ADNmt de tipo silvestre sobre el ADNmt mutante.

Por lo tanto, las células mutantes mitocondriales homoplásmicas se rescataron con éxito con ADNmt de tipo silvestre. Estos resultados concuerdan con estudios previos que muestran que las células Rho^{0} contienen niveles normales de polimerasa de ADNmt y pueden acoplarse en la transcripción de ADNmt si se proporciona molde de ADNmt. Esta estrategia molecular única permite una incorporación eficaz de ADNmt en mitocondrias de células y no depende de procesos mecánicos. Dicha técnica permite por primera vez sustituir o aumentar el genoma mitocondrial y, por lo tanto, explorar cuestiones críticas en la genética mitocondrial, así como desarrollar nuevas terapias para enfermedades mitocondriales.

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<110> University of Virginia Patent Foundation

\hskip1cm Khan, Shaharyar M

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<120> Transfección de orgánulos mediada por un vector

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<130> 00731-02

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<150> 60/340,338

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<151> 2001-12-13

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<160> 8

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> cebador de la PCR de receptor lambda

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<221> unión_cebador

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<222> (1)..(22)

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<223>

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<400> 1

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atgatgttac tcctgcgcaa ac

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22

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<210> 2

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<223> cebador de la PCR de receptor lambda

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<221> unión_cebador

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<222> (1)..(23)

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<223>

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<400> 2

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ttaccaccag atttccatca ggg

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23

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<210> 3

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<223> cebador de la PCR mitocondrial

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<221> unión_cebador

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<222> (1)..(30)

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<223>

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<400> 3

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acatacccat ggccaacctc ctactcctca

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30

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<210> 4

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<223> cebador de la PCR mitocondrial

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<221> unión_cebador

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<222> (1)..(30)

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<223>

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<400> 4

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ccttttcttc tccttaactt ggagactgac

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30

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<210> 5

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador de la PCR de la mutagénesis del informador GFP

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<221> unión_cebador

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<222> (1)..(30)

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<223> cebador de la PCR de la mutagénesis del informador GFP

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<400> 5

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ctgcccgtgc cctgacccac cctcgtgacc

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30

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<210> 6

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<223> cebador de la PCR del informador GFP

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<220>

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<221> unión_cebador

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<222> (1)..(30)

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<223>

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<400> 6

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gagctcaagc ttcgaatcct gcagtcgacg

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30

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<210> 7

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador de la PCR de la mutagénesis del informador GFP

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<220>

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<221> unión_cebador

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<222> (1)..(30)

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<223>

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<400> 7

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tttggaggtc taggcttttg caaagatcga

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30

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<210> 8

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<211> 16569

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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\hskip1cm5

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Claims (26)

1. Un método para transfectar orgánulos de células eucariotas, comprendiendo dicho método la etapa de introducir un vector viral recombinante en el citosol de una célula eucariota, uniéndose el vector viral recombinante específicamente a un receptor localizado únicamente en la superficie del orgánulo que se va a transfectar y siendo dichos orgánulos de células eucariotas mitocondrias o cloroplastos, y en el que (i) dicho método se lleva a cabo in vitro y/o (ii) dicha célula eucariota es una célula vegetal.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho método comprende las etapas de proporcionar una célula que comprende un orgánulo modificado, comprendiendo dicho orgánulo modificado un receptor viral; e introducir un vector viral recombinante en el citosol de dicha célula que contiene un orgánulo modificado para producir un orgánulo transfectado.

3. Un sistema para transfectar mitocondrias o cloroplastos de células eucariotas, comprendiendo dicho sistema:

una construcción de ácido nucleico, comprendiendo dicha construcción una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de localización en orgánulos unido operativamente a un receptor viral; y

un vector viral recombinante.

4. El método o sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho vector viral es un vector de bacteriófago y dicho receptor es un receptor de bacteriófago.

5. El método o sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el vector viral recombinante es bacteriófago lambda y el receptor es un receptor de lambda.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 ó 5, en el que el vector viral recombinante se introduce en el citosol celular por electroporación, microinyección, precipitación con calcio, fusión o por tratamiento químico.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el tratamiento químico comprende poner en contacto la célula con lípidos catiónicos.

8. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de localización mitocondrial o cloroplástica unida operativamente a una secuencia que codifica un receptor viral.

9. El ácido nucleico de la reivindicación 8, en el que el receptor viral se selecciona del grupo constituido por OmpF, OmpC, PhoE y lamB.

10. Una célula eucariota que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 8 ó 9.

11. Una célula eucariota que comprende una mitocondria o cloroplasto modificado, comprendiendo dicha mitocondria o cloroplasto modificado un receptor de bacteriófago lambda localizado en su membrana externa.

12. Un método para preparar una célula que tenga una mitocondria o cloroplasto modificado, comprendiendo dicho método la etapa de transfectar dicha célula con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una señal de localización mitocondrial o cloroplástica unida operativamente a un receptor de bacteriófago lambda, en el que (i) dicho método se realiza in vitro y/o (ii) dicha célula es una célula vegetal.

13. El método o sistema de la reivindicación 12, o la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 8 ó 9, en el que la señal de localización en orgánulos es una señal de localización mitocondrial que es la subunidad VIII de la citocromo oxidasa humana.

14. Un polipéptido que comprende una señal de localización mitocondrial unida operativamente a un receptor de bacteriófago lambda.

15. Una composición que comprende un péptido señal de localización mitocondrial unido operativamente a un ácido nucleico que codifica un receptor de bacteriófago lambda.

16. Un kit para transfectar mitocondrias o cloroplastos de células eucariotas, comprendiendo dicho kit:

(i) una construcción de ácido nucleico, comprendiendo dicha construcción comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de localización mitocondrial o cloroplástica unida operativamente a un receptor viral; o

(ii) una célula eucariota que comprende una mitocondria o cloroplasto que tiene un receptor viral en la superficie de dicha mitocondria o cloroplasto; y

(iii) componentes de empaquetamiento de virus para preparar un vector viral recombinante.

17. El kit de la reivindicación 16, en el que el receptor viral y el vector viral son como se han definido en la reivindicación 4 o reivindicación 5.

18. El kit de la reivindicación 16, en el que la señal de localización es la subunidad VIII de la citocromo oxidasa humana.

19. Un orgánulo, estando dicho orgánulo transfectado para que exprese un receptor específico para un vector recombinante y siendo dicho orgánulo una mitocondria o un cloroplasto.

20. El orgánulo de la reivindicación 19, en el que el receptor se selecciona del grupo que consiste en OmpF, OmpC, Phoe y lamB.

21. El orgánulo de la reivindicación 19, en el que el receptor se expresa en la membrana externa del orgánulo.

22. El orgánulo de la reivindicación 19, en el que el vector recombinante comprende bacteriófago lambda.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, para modificar el metabolismo de una célula eucariota, comprendiendo el método

modificar la mitocondria de una célula eucariota que comprende una mitocondria que tiene al menos un componente de la cadena respiratoria defectuoso; para que presente un receptor de vector en la membrana externa de la mitocondria; e

introducir un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un componente de la cadena respiratoria funcional en el citosol de la célula eucariota, compensando el componente de la cadena respiratoria funcional al menos un componente de la cadena respiratoria defectuoso, y

en el que el vector recombinante se une al receptor de vector y suministra el ácido nucleico a la mitocondria.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, para restaurar o aumentar la actividad citocromo oxidasa en una célula, comprendiendo el método

transfectar una mitocondria de una célula hospedadora para que exprese un receptor, e

introducir un vector que se una específicamente al receptor en la célula hospedadora, comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifica una subunidad de citocromo oxidasa.

25. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, para compensar una mutación de ADNmt, comprendiendo el método las etapas de transfectar una mitocondria de una célula hospedadora que comprende una mutación de ADNmt obtenida de un hospedador que tiene dicha mutación de ADNmt para que exprese un receptor y

introducir un vector que se una específicamente al receptor en la célula hospedadora, comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifica un producto funcional que se corresponde con la mutación de ADNmt.

26. Un animal transgénico no humano que contiene mitocondrias transfectadas preparadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.