ES2333223T3 - Virus de la bronquitis infecciosa que contiene un gen punta modificado. - Google Patents
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Abstract
Una vacuna para ser utilizada en la protección de las aves de corral frente a la bronquitis infecciosa, que comprende un virus de la bronquitis infecciosa (VBI) atenuado y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, que se caracteriza porque el VBI atenuado es VBI de la cepa Beaudette que contiene un gen heterólogo de la espícula del VBI, en el que el fragmento de dicho gen heterólogo de la espícula del VBI que codifica la cola citoplásmica deriva del VBI de la cepa Beaudette receptor.
Description
Virus de la bronquitis infecciosa que contiene
un gen punta modificado.
La presente invención tiene que ver con una
vacuna para ser utilizada en la protección de las aves de corral
frente a la bronquitis infecciosa (BI) que comprende un virus de la
bronquitis infecciosa (VBI) atenuado y un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable, con un método para la preparación de
tal vacuna y con la utilización de un VBI para la producción de una
vacuna para la protección de las aves de corral frente a la BI para
administración in ovo.
El VBI es un miembro del género
Coronavirus, familia Coronaviridae. Tiene un genoma de
ARN de hebra sencilla, de sentido positivo, de 28000 nucleótidos
aproximadamente asociado con una proteína de la nucleocápsida N,
rodeado por una membrana/envoltura lipídica. Otras tres proteínas
víricas están asociadas con la envoltura: la glicoproteína de la
espícula grande, S; una proteína de membrana integral más pequeña, M
y la proteína E, la más pequeña de las proteínas asociadas a la
envoltura.
La proteína S de coronavirus es una
glicoproteína de tipo I que se oligomeriza en el retículo
endoplásmico para formar trímeros que constituyen las espículas de
los viriones de coronavirus observables mediante microscopía
electrónica. La proteína S está ensamblada en las membranas del
virión, posiblemente a través de interacciones no covalentes con la
proteína M, pero no se requiere para la formación de partículas
similares al virus coronavirus. Después de la incorporación en las
partículas de coronavirus, determinada por el dominio
carboxi-terminal, la glicoproteína S es responsable
de la unión al receptor de la célula diana y de la fusión de las
membranas vírica y celular, desempeñando una función primordial en
la infección de células susceptibles. Además, la proteína de la
espícula del VBI está implicada en la inducción de una respuesta
inmune protectora cuando es inoculada a pollos (para una revisión
ver Cavanagh, en: The Coronaviridae; ed.: S.G. Siddell, Plenum
Press, 73-113, 1995).
Todas las glicoproteínas S de coronavirus
constan de cuatro dominios: de una secuencia señal que es cortada
durante la síntesis, el ectodominio que está presente en la parte
exterior de la partícula del virión, la región transmembranal
responsable del anclaje de la proteína S en la bicapa lipídica de la
partícula del virión y la cola citoplásmica que podría
interaccionar con otras proteínas del VBI, tales como la proteína de
membrana (E) y la proteína integral de membrana (M). La
glicoproteína S del VBI (1162 aminoácidos) es cortada en dos
subunidades, S1 (535 aminoácidos, 90 kDa) y S2 (627 aminoácidos, 84
kDa). La subunidad S2 C-terminal se asocia no
covalentemente con la subunidad S1 N-terminal y
contiene el dominio transmembranal y el dominio de la cola
citoplásmica C-terminal. La subunidad S1 contiene la
actividad de unión al receptor de la proteína S.
En estudios previos con otros coronavirus, el
virus de la hepatitis murina (VHM) y el virus de la gastroenteritis
transmisible (VGET), se utilizó el gen de la espícula de una cepa
vírica donante (virulenta) para sustituir al gen de la espícula de
una cepa vírica receptora para investigar los determinantes de la
patogénesis y el tropismo celular. Estos estudios mostraron que las
propiedades in vitro (tropismo celular) y las propiedades
in vivo (virulencia) de la cepa vírica donante fueron
adquiridas por la cepa vírica receptora. Se concluyó que el gen de
la espícula es un determinante del tropismo celular y de la
virulencia (Phillips y col., J. Virol. 73,
7752-7760, 1999; Sanchez y col., J. Virol. 73,
7607-7618, 1999; Das Sarma y col., J. Virol. 74,
9206-9213, 2000; Navas y col., J. Virol. 75,
2452-2457, 2001 y Kuo y col., J. Virol. 74,
1393-1406, 2000; solicitud de patente internacional
WO 01/39797). La solicitud de patente internacional WO 98/49195
describe un coronavirus (por ejemplo el VHM) en el cual una parte
del gen de la proteína de la espícula ha sido sustituida por la
parte correspondiente del gen de la proteína de la espícula de un
coronavirus no relacionado (por ejemplo el VPIF), adquiriendo de
este modo otra especificidad de sustrato celular que permite al
virus recombinante dirigirse a otros tipos celulares.
La bronquitis infecciosa es una enfermedad
respiratoria aguda, muy contagiosa, de las aves domésticas (pollos)
causada por un virus BI. Los signos clínicos de la BI incluyen
estornudos/ronroneos, crepitaciones traqueales, descarga nasal y
sibilancias. Los signos clínicos son más obvios en las crías de los
pollos que en las aves adultas. Las aves pueden parecer deprimidas
y consumir menos alimento. Las aves para carne tienen una ganancia
de peso reducida mientras que las aves ponedoras ponen menos huevos.
La infección respiratoria predispone a los pollos a infecciones
bacterianas secundarias que pueden ser fatales para las crías. El
virus puede también producir un daño permanente en el oviducto,
especialmente en las crías, dando lugar a una producción de huevos
reducida y a una calidad reducida de los mismos, y en el riñón,
dando lugar algunas veces a enfermedades renales que pueden ser
fatales.
Las vacunas de virus vivos e inactivados son
ambas utilizadas en la vacunación contra la BI. Hasta la fecha, las
vacunas más eficaces son virus vivos atenuados producidos
empíricamente después de pases repetidos ciegos a través de huevos
embrionados hasta que se consigue un grado equilibrado deseado de
atenuación e inmunogenicidad. Tales vacunas están mal definidas
genéticamente y no se conoce la base molecular de la atenuación.
Desgraciadamente, después de pases seriados la inmunogenicidad del
virus disminuye, lo cual tiene como resultado a menudo virus vacuna
seguros pero menos eficaces. El conseguir un grado
"equilibrado" de atenuación - suficiente como para no ser
patógeno pero no ser excesivo hasta el punto de que no produzca
respuestas inmunes potentes - es un procedimiento de ensayo y error
que hace que el resultado de este procedimiento de atenuación
convencional sea incierto.
Según se indicó anteriormente, una de las
propiedades biológicas del VBI es que se convierte en avirulento y
menos inmunogénico con los pases sucesivos del virus en los
embriones. La cepa Beaudette del VBI es uno de tales virus
(sobre-)atenuados por los pases en embriones que se considera no
inmunogénico (Geithausen y col., Arch. Gesamte Virusforsch 40,
285-290, 1973).
En una solicitud de patente recientemente
publicada (WO 02/092827) se describe el desarrollo de coronavirus
vivos atenuados por medio de técnicas de ADN recombinante. En la
misma se sugiere que la introducción de deleciones en genes no
esenciales del genoma del coronavirus tiene como resultado la
atenuación de estos virus.
El VBI presenta una gran variación antigénica,
reconocida inicialmente como serotipos diferentes. La clasificación
de cepas serotípicas de las cepas del VBI está basada en la
capacidad de una cepa para inducir anticuerpos neutralizantes del
virus eficaces contra otra cepa (Cook y col., Avian Pathol. 13,
733-741, 1984). La proteína más variable del VBI es
la proteína de la espícula. La misma define el serotipo y es el
inductor principal de las respuestas inmunes protectoras. Un virus
vacuna VBI de un serotipo induce respuestas inmunes que protegen a
menudo poco frente a VBI de otros serotipos, debido a las
diferencias en las proteínas S. Por consiguiente, se han
desarrollado vacunas contra la BI frente a muchos serotipos. Sin
embargo, serotipos previamente desconocidos están apareciendo
continuamente creando el requisito de nuevos virus vacuna
homólogos.
Las vacunas de VBI vivos son normalmente
administradas a pollos eclosionados. La administración puede ser
individualmente por medio de gotas oculares o intranasalmente, pero
estas vías son caras debido al trabajo necesario para su
administración, en particular en bandadas de pollos de engorde
grandes. Los métodos de aplicación en masa, incluyendo la
pulverización y el agua de bebida, son también utilizados
frecuentemente pero se han observado problemas para conseguir una
aplicación uniforme de la vacuna y la inactivación del virus
vacuna.
Se ha sugerido previamente la utilización de
vacunas como vacunas para embriones (denominadas vacunas in
ovo) (Sharma y col., Avian Diseases 29,
1155-1169, 1985).
La vacunación in ovo, en principio,
podría ser ventajosa debido a la edad temprana de resistencia a la
enfermedad específica y a la administración de una dosis uniforme
de vacuna en cada huevo utilizando máquinas semiautomáticas con
múltiples cabezas de inyección.
Normalmente, las vacunas convencionales para la
vacunación de las aves después de la eclosión no pueden ser
utilizadas para la vacunación in ovo, ya que los embriones en
etapas tardías son muy susceptibles a la infección con la mayoría
de los virus vacuna examinados. Por ejemplo, las cepas vacuna del
VBI y del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) que son
utilizadas rutinariamente como vacunas en pollos recién eclosionados
son letales para los embriones después de una inoculación in
ovo. Ejemplos de vacunas post-eclosión
comercialmente disponibles que no pueden ser utilizadas para la
vacunación in ovo debido a su efecto adverso sobre la
eclosionabilidad de los huevos embrionados son Poulvac© IB, Nobilis
IB Ma5© y Nobilis IB 4/91©.
La solicitud de patente internacional WO
01/64244 describe que la vacuna Poulvac© IB puede ser utilizada
para la administración in ovo con la condición de que sea
aplicada a una dosis muy baja
(10^{-1,0}-10^{2,0} DIE_{50}/huevo). Wakenell
y col. (J. Vet. Res. 47, 933-938, 1986) describen
que el pase de un virus vacuna contra la BI en cultivo de tejidos
convertía al virus en no patógeno para los embriones. Sin embargo,
el virus de desafío podía todavía ser aislado de los pollos
comerciales vacunados.
A la vista de lo anterior, está claro que existe
la necesidad de vacunas de VBI que sean seguras y proporcionen una
protección adecuada frente a las cepas de campo virulentas, en
particular de serotipos emergentes, y que puedan ser producidas sin
la utilización del procedimiento empírico convencional para la
preparación de vacunas de VBI.
Además, existe la necesidad de una vacuna de VBI
segura y eficaz que pueda ser administrada por vía in ovo
sin tener un impacto negativo sobre la capacidad de eclosión del
huevo embrionado vacunado.
La invención descrita en la presente satisface
una o más de estas necesidades proporcionando una vacuna de VBI que
está basada en una cepa Beaudette atenuada del VBI que es capaz de
expresar una proteína de la espícula derivada de una cepa de VBI,
por ejemplo de una cepa de campo, que es diferente de la proteína de
la espícula de la cepa Beaudette. Esta nueva cepa vacuna de VBI
atenuada está mejor equipada para combatir las infecciones por VBI
que la cepa de VBI atenuada obtenida por los métodos convencionales,
ya que expresa una proteína de la espícula que es homóloga a la de
un virus de campo (virulento).
Por tanto, la presente invención proporciona una
vacuna para ser utilizada en la protección de las aves de corral
contra la bronquitis infecciosa, que comprende un virus de
bronquitis infecciosa (VBI) atenuado y un vehículo o diluyente
farmacéutico aceptable, que se caracteriza porque el VBI atenuado es
la cepa Beaudette del VBI que contiene un gen de la espícula del
VBI heterólogo, donde el fragmento de dicho gen de la espícula del
VBI heterólogo que codifica la cola citoplásmica deriva de la cepa
Beaudette del VBI receptora.
En los Ejemplos se demuestra que la cepa
Beaudette del VBI, que se sabe que está atenuada pero que es poco
protectora, es convertida en muy protectora por la inserción de un
gen de la espícula de un virus virulento (VBI M41), mientras que el
nivel de atenuación de la cepa de VBI atenuada no se ve afectado
(Ejemplos 3 y 4). En particular, esta última propiedad del VBI
recombinante era inesperada, ya que se había demostrado para otros
coronavirus que el gen S es un determinante de la virulencia y que
la sustitución del gen S en coronavirus leves por un gen S de un
coronavirus virulento convertía al coronavirus recombinante en
virulento. La ausencia de un incremento de la virulencia del VBI
recombinante después de la sustitución de los genes S, es más
sorprendente si se tiene en cuenta que el VBI atenuado recombinante
adquiere el tropismo celular del VBI virulento in vitro
(Ejemplo 2).
La cepa Beaudette del VBI fue aislada
originalmente por Beaudette y Hudson (J. Am. Vet. Med. A., 90,
51-60, 1937) y pasada varios cientos de veces en
embriones de pollo; es comúnmente referida como cepa "adaptada a
embriones de pollo" o "adaptada al huevo". La cepa Beaudette
altamente adaptada al huevo no es patógena para la administración
post-eclosión, causa poco daño detectable al
epitelio ciliado de la tráquea y se replica predominantemente en
las células subepiteliales; pero se sabe es extremadamente patógena
para los embriones de 9-12 días de edad. Además, se
sabe que la cepa Beaudette del VBI es una cepa con poca
inmunogenicidad (Arch Gesamte Virusforsch 40,
285-290, 1973). La cepa Beaudette del VBI puede
obtenerse en la ATCC (Nº de acceso VR-22) y es
utilizada comúnmente en laboratorios de todo el mundo, aunque estos
virus pueden tener ligeras diferencias de secuencia debido a sus
historias de pases individuales. Por ejemplo, las secuencias de
nucleótidos de los genes de la espícula de diferentes aislados de
VBI Beaudette muestran una identidad del 99% o superior. Una región
del genoma de la cepa Beaudette del VBI que distingue a esta cepa
del VBI de otras cepas del VBI es una región (nucleótidos
26500-27499; numeración según Casais y col., 2001,
supra, Nº de acceso AJ311317) situada en el extremo
3'-terminal del genoma que comienza con el gen de la
nucleoproteína y termina en la región 3' no traducida (UTR). Una
cepa Beaudette del VBI para ser utilizada en la presente invención
es un VBI que presenta una identidad de secuencias de nucleótidos
del 99% o superior en esta región con la región correspondiente de
la cepa Beaudette del VBI utilizada específicamente en la presente
(BeauR, Nº de acceso AJ311317). Las secuencias de nucleótidos de la
región correspondiente en otras cepas del VBI difieren
significativamente (63-95%) de las de la cepa
Beaudette del VBI. Las identidades de las secuencias de nucleótidos
referidas en la presente son determinadas mediante el programa de
alineación ClustalX utilizando el modo de alineación múltiple,
Thompson y col., NAR 24, 4876-4882, 1997, y
analizadas mediante Genedoc, versión
2-6-002, que está accesible en
www.psc.edu/biomed/aenedoc.
En una realización particularmente preferida de
la presente invención, se proporciona una vacuna que se caracteriza
además porque el VBI atenuado es la cepa Beaudette
Beau-CK o BeauR (depositada en el CNCM del Institute
Pasteur, Paris, Francia, el 27.02.2004 bajo el nº de acceso
I-3167). BeauR es un VBI recombinante producido a
partir de un ARN infeccioso transcrito de un ADNc de longitud
completa de Beau-CK. Se han determinado los análisis
de la secuencia genómica completa de Beau-CK
(Boursnell y col., J. Gen. Virol. 68, 57-77, 1987,
Nº de acceso M951169) y de BeauR (Casais y col., 2001,
supra; Nº de acceso AJ311317).
Un VBI atenuado recombinante conteniendo un gen
heterólogo de la espícula para ser utilizado en una vacuna de
acuerdo con la invención, puede ser preparado de acuerdo con el
sistema de genética inversa descrito en Casais y col. (2001,
supra). Este sistema permite la preparación de VBI
recombinante (VBIr) mediante el ensamblaje in vitro de ADNc
de longitud completa de VBI (mutado), seguido por el clonaje directo
en el genoma de un virus vaccinia, y la recuperación del VBIr
después de la síntesis in situ de ARN de VBI infeccioso
mediante la utilización de ARN polimerasa del bacteriófago T7
expresada a partir de un virus de la viruela aviar recombinante.
"Gen heterólogo de la espícula (S)" indica
un gen S derivado de una cepa de VBI (cepa donante) que es diferente
de la cepa Beaudette del VBI atenuado específico que recibe ese gen
S (cepa receptora) y que codifica una proteína S que tiene una
secuencia de aminoácidos que es diferente comparada con la proteína
S codificada por el gen S de la cepa Beaudette del VBI. Las cepas
donante y receptora pueden ser del mismo serotipo o de diferentes
serotipos del VBI. Tal VBI recombinante está basado en el genoma de
una única cepa de VBI (receptora), siendo la única diferencia, en
esencia, el gen S que deriva de una cepa diferente del VBI
(donante).
En la presente invención, la vacuna está basada
en una cepa Beaudette del VBI que contiene un gen de la espícula
cuyo fragmento que codifica el ectodominio o una parte funcional del
mismo, en particular el polipéptido S1, deriva de un VBI donante
diferente, mientras que el fragmento que codifica la cola
citoplásmica deriva de la cepa Beaudette del VBI receptor. La
ventaja de tal gen de la espícula "quimérico" es que se evita
cualquier problema potencial entre la interacción del dominio de la
cola citoplásmica de la proteína de la espícula con las demás
proteínas del VBI, ya que ambos son nativos del VBI receptor.
En general, la secuencia señal, el ectodominio,
la región transmembranal y el dominio de la cola citoplásmica de
las proteínas de la espícula del VBI cubren los fragmentos de
aminoácidos 1-18, 19-1091,
1092-1119 y 1120-1162,
respectivamente (los números se refieren a
Beaudette-CK, Casais y col., J. Virol. 75,
12359-12369, 2001; las proteínas S de otras cepas
de VBI pueden diferir en el número de aminoácidos debido a pequeñas
deleciones e inserciones). Además, también la secuencia de
aminoácidos en el sitio de corte S1/S2 del VBI es bien conocida. En
Beaudette, los polipéptidos S1 y S2 abarcan los aminoácidos 1
(19)-535 y 536-1162,
respectivamente.
Preferiblemente, el gen de la espícula para ser
utilizado en la presente invención deriva de un VBI de campo
(virulento).
Los genes de la espícula pueden ser aislados de
cualquier cepa de VBI disponible, independientemente de su
serotipo, mediante técnicas estándar utilizadas comúnmente en el
oficio para este fin. Las secuencias de nucleótidos de los genes de
la espícula derivados de cepas de VBI del mismo serotipo están
relativamente conservadas. La máxima diferencia de secuencias de
nucleótidos entre los genes de la espícula dentro del mismo serotipo
es del 10% en la parte de S1.
Por tanto, con un gen de la espícula de un VBI
de un cierto serotipo, se indica un gen de la espícula derivado de
una cepa que tiene las características inmunológicas de ese serotipo
y que tiene una secuencia de nucleótidos que presenta un máximo de
un 10% de diferencia en la secuencia de nucleótidos (en la parte de
S1) con la de una cepa de referencia del serotipo. Ejemplos de
cepas de referencia típicas y los números de acceso en la base de
datos de secuencias de nucleótidos de sus secuencias del gen de la
espícula son M41 (serotipo Massachusetts; X04722), NL/D274/78
(serotipo D274; X15832), USA/Arkansas 99 (serotipo Ark 99; L10384),
Belgium/B1648 (serotipo B1648; X87238), USA(DE)/072/92
(serotipo DE072; U77298), US(GA)/0470/98 (serotipo Georgia
98; AF274437), UK/4/91 (serotipo 793B1; AF093794), USA/Connecticut
(serotipo Connecticut; L18990) y NL/D1466 (serotipo D1466;
M21971).
El clonaje de varios genes de la espícula de VBI
está descrito en Adzhar y col., Avian Path. 26,
625-640, 1997; Shaw y col., Avian Pathol. 25,
607-611, 1996; Binns y col., J. Gen. Virol. 67,
2825-2831, 1986 y Binns y col., J. Gen. Virol. 66,
719-726, 1985).
Una realización preferida de la presente
invención tiene que ver con una vacuna como la descrita
anteriormente que está basada en un VBI atenuado y que contiene un
gen de la espícula que codifica una proteína de la espícula de un
VBI de serotipo Massachusetts, en particular de la cepa M41 del
VBI.
En una realización preferida más, la vacuna está
basada en un VBI atenuado que contiene un gen de la espícula que
codifica una proteína de la espícula de un VBI de serotipo 793B, en
particular de la cepa 4/91 del VBI.
En principio, la cepa Beaudette del VBI que
contiene el gen de la espícula heterólogo puede tener este gen
insertado en el genoma además del gen de la espícula presente de
forma natural en el genoma. Sin embargo, en una realización
preferida de la presente invención, la vacuna contiene una cepa
Beaudette del VBI en la cual el gen de la espícula heterólogo
sustituye al gen de la espícula original en su posición natural
entre el gen de la replicasa y el gen 3 (Figura 5).
Hasta hoy, no existe ninguna vacuna de VBI
comercialmente disponible que sea segura y eficaz para la
administración in ovo. La presente invención, en particular,
demuestra que una vacuna de acuerdo con la presente invención
basada en la cepa BeaudetteR (BeauR) del VBI puede ser administrada
con seguridad por vía in ovo así como a pollos eclosionados,
y que al mismo tiempo induce una respuesta inmune protectora. En el
Ejemplo 4 se muestra que esta cepa BeauR del VBI no es letal para
embriones de dieciocho días de edad (SPF) y que la eclosionabilidad
de los huevos inoculados es muy elevada. Esta propiedad hace que la
cepa BeauR del VBI sea adecuada para recibir un gen de la espícula
heterólogo y para la administración de una vacuna de acuerdo con la
invención basada en esta cepa del VBI recombinante a un pollo por
vía in ovo.
Una vacuna de acuerdo con la presente invención
puede contener el VBI atenuado en forma viva o inactivada,
prefiriéndose la forma viva, esto es, porque no requiere
adyuvante.
La presente invención proporciona también una
solución al problema de la interferencia que tiene lugar
frecuentemente cuando se administran combinaciones de diferentes
virus vacuna vivos. La administración combinada de dos o más virus
vacuna que son iguales en esencia, pero que expresan proteínas de la
espícula de diferentes (sero)tipos de VBI, es ahora posible
sin ser interferida la replicación de un virus vacuna por el otro
virus vacuna.
Por tanto, la presente invención proporciona
también una vacuna como la definida anteriormente que contiene dos
o más cepas Beaudette del VBI que contienen genes de la espícula
heterólogos de diferentes cepas de VBI, preferiblemente de cepas de
VBI de diferentes serotipos.
Una vacuna de acuerdo con la invención puede ser
preparada mediante métodos convencionales tales como los utilizados
comúnmente para las vacunas de VBI vivos e inactivados disponibles
comercialmente.
Brevemente, un sustrato susceptible es inoculado
con el VBI atenuado y propagado hasta que el virus se haya
replicado hasta un título deseado, después de lo cual se recoge el
material que contiene el VBI. Posteriormente, el material recogido
es formulado en una preparación farmacéutica con propiedades
inmunizantes.
Puede utilizarse en la presente invención
cualquier sustrato que sea capaz de soportar la replicación del
VBI, incluyendo cultivos celulares primarios (aviares), tales como
células fibroblásticas de embrión de pollo (CEF), células renales
de pollo (CK), cultivos orgánicos de tráquea o líneas celulares de
mamífero tales como la línea celular
VERO.
VERO.
Sustratos particularmente adecuados sobre los
cuales puede ser propagado el VBI atenuado son huevos embrionados
SPF. Huevos embrionados de 9-12 días de edad pueden
ser inoculados con, por ejemplo, 0,1 ml de fluido alantoideo
conteniendo VBI que contenga al menos 10^{2,0} DIE_{50} por
huevo. Preferiblemente, huevos embrionados de 9 a 12 días de edad
son inoculados con 10^{5.0} DIE_{50} aproximadamente e incubados
posteriormente a 37ºC durante 12-72 horas. El VBI
puede ser recogido preferiblemente recolectando el fluido
alantoideo.
La vacuna de acuerdo con la invención contiene
el VBI atenuado junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable utilizado habitualmente para tales composiciones.
La vacuna que contiene el virus vivo puede ser
preparada y comercializada en forma de suspensión o en forma
liofilizada. Los vehículos incluyen estabilizantes, conservantes y
tampones. Los diluyentes incluyen agua, tampones acuosos y
polioles.
Si se desea, la vacuna viva de acuerdo con la
invención puede contener un adyuvante. Ejemplos de compuestos y
composiciones adecuadas con actividad adyuvante son los mismos que
los mencionados posteriormente para la vacuna de VBI
inactivado.
Aunque es posible la administración de la vacuna
viva de acuerdo con la presente invención por inyección, por
ejemplo intramuscular, subcutánea, la vacuna es administrada
preferiblemente mediante las técnicas baratas de aplicación en masa
utilizadas comúnmente para la vacunación contra el VBI. Para la
vacunación contra el VBI estas técnicas incluyen vacunación en el
agua de bebida, mediante aerosol y pulverización. Alternativamente,
la administración de la vacuna viva puede ser también
individualmente mediante gotas oculares, intratraqueal o
intranasal.
Según se señaló anteriormente, la presente
invención proporciona también una vacuna del VBI que puede ser
administrada de forma segura por vía in ovo y que al mismo
tiempo es capaz de inducir una respuesta inmune protectora. La
administración in ovo de la vacuna implica la administración
de la vacuna a un embrión de ave mientras está contenido en el
huevo (para una revisión de la vacunación in ovo ver: Ricks y
col., Advances in Vet. Med. 41, 495-515, 1999). La
vacuna puede ser administrada en cualquier compartimento adecuado
del huevo (por ejemplo en el fluido alantoideo, en el saco
vitelino, en el amnios, en la cámara de aire o en el embrión) según
se describe en la técnica (Sharma, Am. J. Vet. Res. 45,
1619-1623, 1984). Preferiblemente, la vacuna es
administrada debajo de la membrana de la cáscara (cámara de aire) y
en la membrana corioalantoidea.
Normalmente, la vacuna es inyectada en los
huevos embrionados durante las últimas etapas embrionarias,
generalmente durante el último cuarto del periodo de incubación,
preferiblemente 3-4 días antes de la eclosión. En
los pollos, la vacuna es administrada preferiblemente entre los
días 15-19 del periodo de incubación de 21 días, en
particular el día 17 ó 18, más preferiblemente el día 18 del periodo
de incubación.
Posteriormente, los huevos embrionados vacunados
son transferidos a un incubador para que eclosionen (Patente de
EE.UU. Nº 4.458.630, WO 98/56413 y WO 95/135121). Preferiblemente,
todo el proceso de vacunación de los embriones se lleva a cabo
utilizando sistemas de vacunación automatizados de alta velocidad,
tal como el INOVOJECT® disponible comercialmente. Tales
dispositivos están descritos también en las Patentes de EE.UU.
N^{os} 4.681.063 y 4.903.635, 4.040.388, 4.469.047 y
4.593.646.
En otro aspecto de la presente invención, se
proporciona una vacuna que contiene el VBI atenuado en forma
inactivada. Las ventajas de una vacuna inactivada son su seguridad y
los niveles elevados de anticuerpos protectores de larga duración
que pueden ser inducidos.
El objetivo de la inactivación de los virus
recogidos después de la etapa de propagación es eliminar la
reproducción de los virus. En general, esto puede ser conseguido
mediante medios químicos o físicos bien conocidos.
Una vacuna inactivada de acuerdo con la
invención puede contener, por ejemplo, uno o más de los vehículos o
diluyentes farmacéuticamente aceptables anteriormente mencionados
adecuados para este fin.
Preferiblemente, una vacuna inactivada de
acuerdo con la invención contiene uno o más compuestos con actividad
adyuvante. Compuestos o composiciones adecuadas para este fin
incluyen hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, emulsiones
aceite-en-agua o
agua-en-aceite basadas en, por
ejemplo, un aceite mineral tal como Bayol F® o Marcol 52® o en un
aceite vegetal tal como acetato de vitamina E y saponinas.
Las vacunas inactivadas son administradas
normalmente mediante inyección, por ejemplo intramuscularmente o
subcutáneamente.
La vacuna de acuerdo con la invención contiene
una dosificación eficaz del VBI atenuado como componente activo,
esto es una cantidad de VBI inmunizante que inducirá inmunidad en
las aves vacunadas frente al desafío por un virus virulento. En la
presente se define inmunidad como la inducción de un nivel de
protección en una población de aves frente a la mortalidad y los
síntomas clínicos, significativamente más elevado después de la
vacunación en comparación con un grupo no vacunado.
Típicamente, la vacuna viva para administración
post-eclosión contiene el VBI atenuado en una
concentración de 10^{2,0}-10^{8,0} dosis
infecciosas para embriones (DIE_{50}) por dosis unidad,
preferiblemente en una concentración de
10^{3,0}-10^{7,0} DIE_{50} por dosis unidad.
El volumen de la dosis por ave depende de la vía de vacunación y de
la edad del ave. Típicamente, las vacunas en colirio son
administradas en un volumen de 20-100 \mul por
dosis a cualquier edad. Las vacunas para pulverización pueden
contener la dosis en un volumen de 100-1000 \mul
para aves de días de edad y una dosis de una vacuna para el agua de
bebida es normalmente diluida en un volumen de 1 ml aproximadamente
para cada día de edad. Las vacunas inactivadas pueden contener el
equivalente antigénico de 10^{4,0}-10^{9,0}
DIE_{50} por dosis unidad.
\newpage
La vacuna viva para administración in ovo
contiene típicamente una cantidad de VBI atenuado de
10^{2,0}-10^{8,0} DIE_{50}, preferiblemente
10^{3,0}-10^{7,0} DIE_{50} en un volumen de
50-100 \mul, preferiblemente 50 \mul.
Aunque la vacuna de VBI de acuerdo con la
presente invención puede ser utilizada eficazmente en pollos, otras
aves de corral tales como pavos, palomas, codornices, faisanes,
gallinas de Guinea y perdices pueden ser también vacunadas con
éxito con la vacuna. Los pollos incluyen pollos de engorde para
carne, reproductoras y ponedoras.
La edad de las aves que reciben la vacuna viva o
inactivada de acuerdo con la invención post-eclosión
es la misma que la de las aves que reciben las vacunas de VBI vivo
o inactivado convencionales disponibles comercialmente. Por
ejemplo, los pollos de engorde para carne pueden ser vacunados
cuando tienen un día de edad o cuando tienen 1-3
semanas de edad, particularmente los pollos de engorde con niveles
elevados de MDA. Las ponedoras o reproductoras pueden ser vacunadas
inicialmente a los 1-10 días de edad y reforzadas
con una vacuna viva o inactivada a las 7-12 o a las
16-18 semanas de edad.
La invención incluye también vacunas combinadas
que contienen, además del VBI atenuado, una cepa vacuna capaz de
inducir protección frente a una cepa de VBI de otro serotipo o
frente a otro patógeno aviar.
Preferiblemente, la vacuna combinada contiene
adicionalmente una o más cepas vacuna del virus de la enfermedad de
Marek (MDV), del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), del
virus de la enfermedad infecciosa de la bursa (IBDV), del virus del
síndrome de la caída de los huevos (EDS), del virus de la
rinotraqueitis del pavo (TRTV) o de reovirus.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las técnicas de ADN recombinante utilizadas en
la presente se llevaron a cabo de acuerdo con procedimientos
estándar (Ausubel y col., en: Current Protocols in Molecular
Biology, Wiley and Sons Inc., NY, 1987; Sambrook y col., en:
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring
Harbor Laboratory, NY, 1989) o fueron utilizadas de acuerdo con las
instrucciones de los fabricantes. Los números de los nucleótidos y
de los residuos de aminoácidos se refieren todos a las posiciones
en el VBI BeauR (Casais, 2001, supra, Nº de acceso
AJ311317). Las células, los virus, los plásmidos y las cepas
bacterianas utilizados para la preparación del gen S quimérico,
para el ensamblaje del ADNc de VBI de longitud completa en virus
vaccinia, la producción de virus vaccinia recombinantes y la
producción de VBI recombinantes infecciosos fueron según está
descrito en Casais y col. (2001, supra).
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de la secuencia del gen S de
M41-CK identificó diferencias de 72 nt cuando se
comparó con la secuencia del gen S de BeauR, de las cuales 50
representaban sustituciones no sinónimas y 22 sustituciones
sinónimas, teniendo como resultado diferencias de un total de 47
aminoácidos entre las dos glicoproteínas S. La última sustitución
no sinónima tiene como resultado un codón de parada prematuro en el
gen S de M41, de tal manera que la glicoproteína S de
M41-CK es nueve aminoácidos más corta que la
proteína de Beaudette. Aparte de la pérdida de los nueve
aminoácidos no había otras diferencias de aminoácidos entre los
dominios citoplásmicos de los dos virus. En total, los productos de
la traducción primaria de los dos genes S tienen 1153 y 1162
aminoácidos para M41-CK y BeauR, respectivamente, lo
que representa una identidad del 95,2% entre las dos proteínas S.
La comparación de la secuencia de la replicasa que solapa con la
secuencia del gen S, mostró que hay solamente una mutación
sinónima, sin mutaciones entre la secuencia asociada a la
transcripción (TAS) del gen S y el codón de inicio del gen S
(Figura 1). Por tanto, la región del gen S que contiene la región
solapante del gen de la replicasa fue adquirida de
M41-CK para la generación de la secuencia del gen S
del VBIr. Sin embargo, como los extremos C terminales de los genes
S de Beaudette y M41 variaban, y estaban potencialmente implicados
en la interacción con otras proteínas de virión, conservamos los
últimos 137 nt de la secuencia del gen S de Beaudette para el VBIr.
Esto mantendría cualquier interacción del dominio
C-terminal de la proteína S con las demás proteínas
derivadas de Beaudette.
El plásmido
pACNR-NheI-NotI-IBV
(Figura 2) fue digerido con PacI y SalI y el fragmento
que contenía el vector fue purificado y conservado. El plásmido
pACNR-NheI-NotI-IBV
fue también digerido con BspHI y SalI y el fragmento
BspHI-SalI fue purificado y conservado. El plásmido
pM41Struct contenía una secuencia de ADNc derivada del VBI, que
correspondía a la secuencia desde el gen de la replicasa hasta la
cola poli(A), derivada de ARNg de M41-CK, en
pBluescript SK(+). El pM41Struct fue digerido con PacI y
BspHI y el fragmento PacI-BspHI fue purificado
y conservado (Figura 3). Se generó un gen S quimérico de
Beaudette-CK/M41-CK que constaba de
la secuencia señal, el ectodominio y regiones transmembranales que
derivaban de M41-CK y el dominio de la cola
citoplásmica de Beau-R. El fragmento
PacI-BspHI de pM41Struct derivado de
M41-CK fue utilizado para sustituir la secuencia
correspondiente de PacI-BspHI del ADNc derivado de
Beaudette-CK en pFRAG-3. Se llevó a
cabo una reacción de ligadura de tres vías entre el fragmento que
contenía el vector PacI-SalI (procedente de
pFRAG-3), el fragmento del gen S
PacI-BspHI derivado de M41-CK y el
fragmento BspHI-SalI correspondiente al resto del
genoma de Beaudette corriente abajo del gen S, teniendo como
resultado
pACNR-NheI-NotI-IBV-M41-S
(Figura 4 y resumido en la Figura 5A). El análisis de la secuencia
de pFRAG-3-M41S confirmó la
presencia de una secuencia del gen S quimérico contigua, junto con
la presencia de las dos mutaciones marcadoras, U^{19668} y
G^{27087}, presentes originalmente en pFRAG-3.
Se utilizaron fragmentos de ADNc derivado de VBI
procedentes de pFRAG-3-M41S, que
contenían la secuencia del gen S quimérico, y
pFRAG-1 y pFRAG-2 para generar un
ADNc de VBI de longitud completa utilizando ligadura in
vitro. El ADNc de longitud completa fue generado utilizando un
procedimiento de ligadura in vitro de dos etapas según está
descrito por Casais y col. (2001, supra). En la primera
etapa, el ADNc de SacI-NheI (FRAG-2)
procedente de pFRAG-2 y el ADNc de
NheI-BspHI
(FRAG-3-M41S) procedente de
pFRAG-3-M41S fueron ligados para
dar lugar a un fragmento SacI-Bsp120I de 21,5 kb que
fue purificado en gel. En la segunda etapa, el fragmento
SacI-Bsp120I de 21,5 kb fue ligado a ADNc de
BspHI-SacI (FRAG-1) procedente de
pFRAG-1 para producir un ADNc del VBI de longitud
completa de 27,9 kb (Figura 5B). Este ADNc de longitud completa,
que contenía el gen S quimérico, estaba bajo el control de un
promotor de la ARN polimerasa de T7 y terminaba en una secuencia de
terminación H\deltaR-T7 distal al poli(A).
El promotor de T7 y la secuencia de terminación
H\deltaR-T7 eran requeridos para la generación
in situ de ARN de VBI infeccioso por la ARN polimerasa de
T7. Los productos procedentes de la segunda ligadura in
vitro, que contenían el ADNc del VBI de longitud completa con
extremos de Bsp120I desfosforilados, fueron ligados
directamente a los brazos derivados de vNotI/tkNotI
en presencia de NotI. Los productos de la ligadura fueron
utilizados sin purificación adicional para recuperar los virus
vaccinia recombinantes utilizando como virus cooperador el virus de
la viruela aviar, FP9, en células CV-1. Obtuvimos 22
virus vaccinia recombinantes y el análisis de restricción del ADN
aislado de células infectadas indicó que ocho de los mismos
contenían un inserto del tamaño esperado, de los cuales se
seleccionó vNotI/IBV_{FL}-M41S para un
análisis posterior.
El análisis de la secuencia del gen S de 4/91
identificó diferencias en 562 nt cuando se comparó con la secuencia
del gen S de BeauR, de las cuales 245 representaban sustituciones no
sinónimas y 317 representaban sustituciones sinónimas, teniendo
como resultado diferencias en un total de 201 aminoácidos entre las
dos glicoproteínas S, de las cuales dos resultaban de una inserción
de seis nucleótidos en la secuencia del gen S de 4/91. Hay
diferencias de dos aminoácidos entre los dominios citoplásmicos de
los dos virus. En total, los productos de traducción primarios de
los dos genes S tienen 1162 y 1164 aminoácidos para BeauR y 4/91,
respectivamente, con una identidad del 83% entre las dos proteínas
S. La región del gen S que contenía la región solapante del gen de
la replicasa fue adquirida de 4/91 para la generación de la
secuencia del gen S del VBIr. Además, como los extremos
C-terminales de los genes S de Beaudette y 4/91 son
similares, conservamos los últimos 137 nt del gen S de Beaudette,
idénticos a la secuencia de 4/91, para el ensamblaje del gen S
quimérico. La proteína S resultante de las secuencias del gen S
quimérico consta del ectodominio de 4/91, el dominio transmembranal
de 4/91 y el dominio de la cola citoplásmica de
Beaudette-CK y es análoga a la proteína S de M41
quimérica descrita anteriormente.
La secuencia del gen S de 4/91 fue obtenida de
ARN derivado de un virus aislado de la cepa de VBI 4/91 virulenta
utilizando dos PCRs. Los productos de las dos PCRs, de 2042 pb y
2300 pb, fueron generados utilizando dos conjuntos de
oligonucleótidos (Figura 6). El producto de 2042 pb fue generado
utilizando el oligonucleótido BG42 (correspondiente a los
nucleótidos 19941-19958 del genoma de
Beau-R) y un oligonucleótido de 4/91 específico,
4/91d (el complemento inverso a los nucleótidos
21957-21976 equivalentes del genoma de
Beau-R). El producto de 2300 pb fue generado
utilizando un oligonucleótido de 4/91 específico, 4/91c
(correspondiente a los nucleótidos 21600-21619
equivalentes del genoma de Beau-R) y el
oligonucleótido BG141 (el complemento inverso de los nucleótidos
23879-23898 del genoma de Beau-R).
Ambos fragmentos fueron insertados en pGEM-T y los
plásmidos resultantes fueron utilizados como fuente de la secuencia
del gen S de 4/91 (Figura 6).
La secuencia del gen S de 4/91 quimérico fue
construida modificando pGPT-M41S (Figura 7A)
utilizando los dos productos de PCR derivados de 4/91. El producto
de 2042 pb derivado de 4/91 en pGEM-T fue escindido
como un fragmento de 1580 pb, que representaba la mitad 5' del gen
S de 4/91, utilizando PacI y AlwNI, que fue
purificado y conservado (Figura 6). El producto de 2300 pb derivado
de 4/91 en pGEM-T fue escindido como un fragmento
de 1804 pb, que representaba la mitad 3' del gen S de 4/91,
utilizando AlwNI y BspHI, que fue purificado y
conservado (Figura 6). El plásmido pGPT-M41S fue
digerido con PacI y BamHI y el fragmento de 5018 pb
que representaba la secuencia del plásmido fue purificado y
conservado (Figura 7A). Además, pGPT-M41S fue
digerido con BspHI y BamHI y un fragmento de 1080 pb
derivado de Beau-R fue purificado y conservado
(Figura 3A). Se llevó a cabo una reacción de ligadura de cuatro vías
entre el fragmento de 5018 pb PacI-BamHI que contenía
el plásmido, el fragmento de 1080 pb BspHI-BamHI
derivado de Beau-R, el fragmento de 1580 pb
PacI-AlwNI derivado de 4/91 y el fragmento de 1804 pb
AlwNI-BspHI derivado de 4/91, teniendo como resultado
pGPT-4/91S (Figura 7B). Esto tuvo como resultado la
construcción de una secuencia del gen S quimérico de
4/91-Beau-CK, que constaba de la
secuencia señal, el ectodominio y regiones transmembranales
derivados de 4/91 y el dominio de la cola citoplásmica de
Beau-R (Figura 7B). El análisis de la secuencia de
pGPT-4/91S confirmó la presencia de una secuencia
contigua del gen S quimérico.
Con el fin de modificar el ADNc de longitud
completa derivado de Beaudette CK en el virus vaccinia recombinante
vNotI/IBV_{FL}, utilizamos el método de selección dominante
transitoria (TDS) (Falkner y Moss, Journal of Virology 64,
3108-3111, 1990) para sustituir la secuencia del gen
S de Beaudette por la secuencia del gen S quimérico de
4/91-Beau-CK. El sistema TDS
consistía en un proceso de dos etapas (Figuras 8 y 9). En la primera
etapa, se utilizó el método TDS para extraer la secuencia del gen S
de Beaudette del ADNc de longitud completa en el virus vaccinia
recombinante vNotI/IBV_{FL}. El plásmido
pGPT-IBV-\DeltaS, que contenía la
secuencia de Beau-CK correspondiente a la replicasa
y al gen 3 con parte del gen M, pero que carecía de la secuencia
del gen S, fue transfectado en células infectadas con
vNotI/IBV_{FL}. Después de la recombinación homóloga entre
la secuencia derivada del VBI en
pGPT-IBV-\DeltaS y la secuencia
del VBI en vNotI/IBV_{FL}, se aisló e identificó un virus
vaccinia recombinante,
vNotI/IBV-\DeltaS_{FL}, que contenía el
ADNc del VBI que carecía de la secuencia del gen S (recombinante
"sin espícula") (Figura 8). En la segunda etapa, el método TDS
fue utilizado para insertar la secuencia del gen S quimérico de
4/91-Beau-CK en el virus vaccinia
recombinante "sin espículas"
vNotI/IBV-\DeltaS_{FL}. El plásmido
pGPT-4/91S fue transfectado en células infectadas
con vNotI/IBV-\DeltaS_{FL} y después de
la recombinación entre la secuencia derivada de VBI en
pGPT-4/91S y la secuencia del VBI en
vNotI/IBV-\DeltaS_{FL}, se aisló e
identificó un virus vaccinia recombinante,
vNotI/IBV_{FL}-4/91S, que contenía el ADNc
de longitud completa de VBI con la secuencia del gen S quimérico de
4/91-Beau-CK insertada (Figura
9).
Se recuperó VBIr infeccioso a partir de
vNotI/IBV_{FL}-M41S o
vNotI/IBV_{FL}-4/91S, utilizando células
CK previamente infectadas con rFPV/T7 (Britton y col., J. Gen.
Virol. 77, 963-967, 1996), para proporcionar ARN
polimerasa de T7, y cotrasfectadas con ADN de
vNotI/IBV_{FL}-M41S restringido por
AscI o vNotI/IBV_{FL}-4/91S y
pCi-Nuc (Hiscox y col., J. Virol. 75,
506-512, 2001). El ADN de
vNotI/IBV_{FL}-M41S o
vNotI/IBV_{FL}-4/91S fue preparado a
partir de virus vaccinia semipurificados y pCi-Nuc,
un plásmido que expresa la proteína N del VBI bajo el control de
los promotores de T7 y CMV, requerido para la recuperación con éxito
del VBIr.
Las células CK transfectadas (P_{0}) fueron
incubadas hasta que mostraron efecto citopático (ECP), se filtró el
medio para eliminar rFPV/T7 y cualquier VBI potencial se pasó en
células CK nuevas (P_{1}). Se aisló un VBIr,
BeauR-M41(S), de las células P_{1} y se
determinó el genotipo del VBIr mediante análisis de la secuencia.
El mismo confirmó la presencia de las dos mutaciones marcadoras y
que el ectodominio del gen de la proteína S quimérico derivaba de
la secuencia del gen S de M41-CK.
BeauR-M41(S), derivado de células CK
P_{5}, fue utilizado para una caracterización posterior.
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Ejemplo
2
Monocapas confluentes de células CK, Vero, CEF y
BHK-21 en placas de 60 mm fueron infectadas con 1,5
x 10^{6} UFP de VBI. Después de la adsorción durante 1 hora a
37ºC, las células fueron lavadas tres veces con solución salina
tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el virus residual e
incubadas a 37ºC en 5 ml del medio apropiado. A tiempos
seleccionados a lo largo de un periodo de 96 horas, muestras de los
medios fueron analizadas por triplicado para determinar la
presencia de virus de la progenie mediante un ensayo de placas.
Las cepas Beau-CK y
M41-CK del VBI tienen diferente tropismo celular. Se
sabe que ambos virus replican con títulos similares en células CK,
pero solamente Beau-CK produce virus infecciosos en
células Vero. Por tanto, mediante la utilización de los virus
isogénicos recombinantes BeauR y
BeauR-M41(S), que difieren únicamente en el
ectodominio de la proteína S, intentamos determinar si la
glicoproteína S del VBI era responsable de las diferencias
observadas en la capacidad de distintas cepas de VBI para infectar y
replicarse en diferentes líneas celulares.
BeauR, M41-CK y
BeauR-M41(S), mostraban perfiles de
crecimiento similares en células CK (Figura 10). Además, los tres
virus causaban todos ECP en 24 horas. El análisis de los perfiles de
crecimiento de los tres virus en células Vero, CEF y
BHK-21 (Figura 10 B-D) mostró que
solamente BeauR se replicaba hasta un grado significativo en las
diferentes células, normalmente con un título máximo hacia las 24
horas después de la infección. Estos resultados mostraban que
BeauR-M41(S) tenía el mismo tropismo que
M41-CK sobre los cuatro tipos celulares, indicando
que la sustitución del ectodominio de la glicoproteína S de
Beaudette por la secuencia correspondiente de la glicoproteína S de
M41-CK tenía como resultado un VBIr con un tropismo
celular alterado en comparación con BeauR.
Los resultados de los análisis de los productos
de RT-PCR del ARN aislado de células infectadas con
estos virus y del análisis de inmunofluorescencia indirecta de
células infectadas con VBI, corroboraban los resultados de los
experimentos de crecimiento.
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Ejemplo
3
Se utilizó la cepa de VBI M41-CK
de Massachusetts, virulenta para los pollos eclosionados, después de
11 pases en células primarias de riñón de pollo (CK) y tres pases
en embriones de 10 días de edad de pollos Rojos de Rhode Island
(RIR) libres de patógenos especificados (SPF). Los VBIrs BeauR y
BeauR-M41(S) fueron propagados en células
CK. Los virus fueron titulados en cultivos orgánicos de tráquea de
embrión de pollo. Los títulos fueron expresados en como el
log_{10} de la dosis cilioestática 50.
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Pollos RIR de ocho días de edad fueron
inoculados mediante gotas oculares y en la nariz con 0,1 ml de
solución salina tamponada con fosfato que contenía 3,0 log_{10}
de la dosis cilioestática 50 de virus o con PBS solo (grupo
inoculado de forma simulada). Las aves fueron alojadas en
grupos.
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Para determinar si alguno de los dos VBIrs era
patógeno en pollos eclosionados, se registraron tres signos
clínicos: ronroneos, descarga nasal y crepitaciones. Se registraron
los ronroneos en los grupos de aves durante un periodo de dos
minutos y se presentan como ronroneos/ave/minuto. La descarga nasal
(transparente o turbia) y las crepitaciones (moderadas y graves) se
registraron en las aves individualmente, presentándose la incidencia
más adelante como porcentaje del grupo. La actividad ciliar fue
determinada sacrificando las aves, extrayendo la tráquea, cortando
la tráquea transversalmente en anillos de 1 mm aproximadamente de
profundidad y observando los mismos mediante microscopía a bajo
aumento. Se examinaron 10 anillos de cada tráquea. La actividad
ciliar fue registrada como del 100%, 75%, 50%, 25% o 0%
aproximadamente. Los grupos contenían no menos de 20 aves los días
en los que se registraron los datos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ronroneos fueron máximos el día 6 después de
la inoculación. No había diferencia significativa entre el nivel de
ronroneo de las aves infectadas con BeauR y
BeauR-M41(S) y las aves infectadas de forma
simulada. La cepa M41-CK inducía un orden de
magnitud más ronroneos (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La descarga nasal fue máxima el día 5 p.i. Las
aves infectadas con M41-CK presentaban descarga
nasal en la mayoría de las aves, mientras que los dos virus
recombinantes lo hacían solamente en unas cuantas aves. No había
diferencia estadísticamente significativa entre el número de aves
que presentaban descarga nasal en los grupos infectados de manera
simulada y en los grupos infectados con VBIr (Tabla 2).
Las crepitaciones fueron máximas el día 4 p.i.
en el grupo infectado con M41-CK.
BeauR-M41(S) y BeauR no produjeron
crepitaciones moderadas o graves (Tabla 3).
Ninguno de los VBIrs disminuyeron la actividad
ciliar, mientras que el M41-CK virulento produjo una
cilioestasis completa (Tabla 4).
Los resultados representados en las tablas
anteriores demuestran que el VBI BeauR parental y el mutante por
intercambio BeauR-M41(S) no eran patógenos
para pollos recién eclosionados.
\vskip1.000000\baselineskip
Las aves de este experimento, que habían sido
vacunadas con BeauR, BeauR-M41(S),
M41-CK o con ningún virus a los ocho días de edad,
fueron desafiadas 21 días más tarde con 3 log_{10} dosis
cilioestática 50 de VBI M41-CK virulento. Un quinto
grupo de aves se infectó de manera simulada. Éste fue conservado
como grupo no desafiado. Cuatro días después del desafío de los
pollitos, se extrajeron las tráqueas, se raspó el epitelio y se
resuspendió en 1 ml de medio. El mismo fue titulado en cultivos
orgánicos de tráquea y el título expresado como log_{10} dosis
cilioestática 50 (DC_{50}).
El desafío con M41-CK virulento
de las aves que habían sido vacunadas con
BeauR-M41(S) tuvo como resultado un bajo
nivel de ronroneo, similar al de las aves que habían sido vacunadas
y desafiadas con M41-CK. En contraste, las aves
vacunadas con BeauR presentaban un nivel elevado de ronroneo, aunque
menos que las aves no vacunadas que habían sido desafiadas (Tabla
5).
\vskip1.000000\baselineskip
El desafío con M41-CK causó
descarga nasal en el 56% de las aves vacunadas de forma simulada y
no produjo descarga nasal en las aves que habían sido vacunadas con
BeauR-M41(S) o M41-CK (Tabla
6).
\vskip1.000000\baselineskip
El desafío con M41-CK causó
crepitaciones moderadas o graves en el 23% de las aves vacunadas de
forma simulada el día 6 p.i. y en ninguna de las aves que habían
sido vacunadas con los VBIrs (Tabla 7).
Las aves que habían sido vacunadas con
M41-CK fueron protegidas totalmente frente al
desafío con M41-CK. La actividad ciliar era del
100%, en contraste con las aves no vacunadas en las que no había
actividad ciliar. La mayoría de las aves (7/9) que habían sido
vacunadas con BeauR-M41(S) tenían una elevada
actividad ciliar (>50%) después del desafío, esto es habían
resistido al desafío. Las dos aves restantes tenían casi un 50% de
actividad (Tabla 8).
No pudo detectarse virus de desafío en los
diferentes grupos de aves vacunadas (Tabla 9).
Estos experimentos de desafío demuestran que
BeauR-M41(S) es capaz de inducir protección
frente al desafío hasta un grado similar al de
M41-CK, mientras que el VBI BeauR parental induce
sólo una escasa protección.
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Ejemplo
4
Ensayo
1
Grupos de huevos libres de patógenos específicos
(SPF) fueron incubados hasta 18 días de embrionación. Las
vacunaciones in ovo administradas están resumidas en la Tabla
10. Una dosis de Ma5, una vacuna de VBI de serotipo Massachusetts
(Intervet International BV), fue administrada al grupo 1, el grupo 2
no fue vacunado, el grupo 3 recibió el mutante del VBI por
intercambio BeauR-M41(S) y el grupo 4 el
BeauR recombinante. Los virus fueron diluidos en medio de Eagle
modificado (MEM). Un pequeño orificio fue taladrado en el huevo por
encima del espacio de aire y se utilizó una aguja de calibre 20 de
una pulgada de largo para liberar 0,1 ml del virus en el fluido
amniótico. Los huevos fueron colocados en incubadores separados y se
determinó la eclosionabilidad el día 21 de incubación.
El día 6 después de la eclosión las aves fueron
analizadas para determinar la presencia de exudado nasal (EN), un
signo clínico asociado con la infección por VBI. No se detectó EN en
las aves vacunadas in ovo con BeauR o
BeauR-M41(S). Sin embargo, se detectó EN en
una proporción de las aves vacunadas in ovo con Ma5 que
habían eclosiado (Tabla 11).
Con el fin de determinar adicionalmente el
efecto de las vacunaciones in ovo con VBI, un pequeño número
de aves fue sacrificado el día 7 de tal manera que pudiera
realizarse una determinación de la actividad ciliar traqueal. La
actividad ciliar se utiliza como medida de la atenuación del VBI
inoculado. Las tráqueas de aves/embriones inoculados son cortadas
en 10 secciones, 3 de la parte superior, 3 de la parte inferior y 4
del centro. Se realiza una determinación microscópica de la
actividad ciliar y se calcula el porcentaje medio de cilios que han
dejado de moverse para los 10 anillos. Cuanto más elevada sea la
puntuación mayor será el daño inducido por VBI.
Ma5 inoculado in ovo, aunque sólo se
determinó en 1 ave, dio lugar a puntuaciones de cilioestasis muy
elevadas en cada ave (Tabla 12). Los dos VBI Beaudette
recombinantes dieron lugar a puntuaciones bajas que son aceptables
en el terreno de la seguridad.
Con el fin de determinar la eficacia de la
vacunación in ovo con los clones infecciosos 4 semanas
después de la eclosión, se desafió una selección de aves con 2,9
log_{10} DIE_{50} del VBI M41 serotipo Massachusetts virulento
por vía ocular-nasal. Los días 5 y 7 después del
desafío, se llevaron a cabo los ensayos de cilioestasis en anillos
traqueales de aves sacrificadas. Sobre la base de la consideración
de que una puntuación de cilioestasis individual del 50% o menor
significaba que estaban protegidas, el 100% de las aves vacunadas
con Ma5 estaban protegidas, el 90% de las aves vacunadas con
BeauR-M41(S) estaban protegidas y el 30% de
las aves vacunadas con BeauR estaban protegidas. Las puntuaciones
de cilioestasis individuales y medias están mostradas en la Tabla
13.
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\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
2
En un segundo ensayo se volvió a determinar la
eclosionabilidad después de la vacunación in ovo. Según se
describió para el Ensayo 1, los huevos (40/grupo) fueron vacunados a
los 18 días de embrionación con cada uno de los clones infecciosos
o con placebo (MEM). Se realizó el ensayo de cilioestasis los días
2, 5, 8 y 12 después de la eclosión para confirmar la seguridad de
la vacunación. Se muestra que la vacunación con
BeauR-M41(S) tiene un efecto mínimo sobre la
eclosionabilidad y produce un daño traqueal mínimo.
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Figura 1. Diagrama esquemático del gen S del
VBI. El extremo 5' del gen S solapa con el extremo 3' del gen de la
replicasa. Se muestran los cuatro dominios de la proteína S, la
posición del punto de corte de S1/S2 y las posiciones de los sitios
de restricción de PacI y BspHI, la TAS del gen S, la
TAS del gen 3 y el inicio del gen 3. Los números se refieren a las
posiciones de las diferencias de aminoácidos entre las secuencias
de las proteínas de VBI Beaudette-CK y
M41-CK-S dentro de las secuencias
del gen S quimérico, resultantes de sustituciones no sinónimas tras
el intercambio de las dos secuencias de los genes S.
Figura 2. Estructura esquemática del plásmido
pACNR-NheI-NotI-IBV
utilizado como fuente de FRAG-3 para la producción
de ADNcs de longitud completa derivados de
Beaudette-CK de longitud completa. El plásmido fue
utilizado para eliminar la región del gen de
Beaudette-CK que codificaba la secuencia señal, el
ectodominio y la región transmembranal. Están indicados los sitios
de restricción.
Figura 3. Estructura esquemática del fragmento
de ADNc PacI-BspHI de 3383 pb que contiene la
secuencia señal, el ectodominio y el dominio transmembranal del gen
de la espícula de M41. Están indicados los sitios de
restricción.
Figura 4. Estructura esquemática del plásmido
pACNR-NheI-NotI-IBV-M41-S
que contiene el gen S quimérico y que es utilizado como fuente de
FRAG-3-M41S para la producción de un
ADNc de longitud completa del VBI que contenía las secuencias del
gen S quimérico. Están indicados los sitios de restricción.
Figura 5. Diagrama esquemático para la
construcción del gen S quimérico y la producción de un ADNc del VBI
de longitud completa. (A) Sustitución de las secuencias señal, de
las regiones del ectodominio y transmembranal del gen S de
Beaudette-CK por la secuencia correspondiente del
VBI M41-CK para la construcción de
FRAG-3-M41S. (B) Diagrama
esquemático del ADNc de longitud completa de
BeauR-M41(S) compuesto por
FRAG-1, FRAG-2 y
FRAG-3-M41S.
Figura 6. Diagrama esquemático para el
aislamiento de productos de PCR que representan la secuencia del gen
S de 4/91.
Figura 7. Diagrama esquemático que muestra el
ensamblaje del gen S quimérico de 4/91 en
pGPT-4/91S. (A) Se generaron dos fragmentos a
partir de pGPT-M41S para ser utilizados en el
proceso de ensamblaje. Se descartó un fragmento que representaba el
gen S quimérico de M41. (B) Ensamblaje del gen S quimérico de 4/91
en pGPT-4/91S, mediante una reacción de ligadura de
cuatro vías, utilizando los dos fragmentos aislados de
pGPT-M41S junto con los dos productos de digestión
que representan la secuencia del gen S de 4/91. Están indicados los
fragmentos relevantes y los sitios de restricción.
Figura 8. Representación esquemática de la
primera etapa de TDS para generar el ADNc del VBI "sin
espícula" en el virus vaccinia recombinante
vNotI-IBV-\DeltaS_{FL}.
Figura 9. Representación esquemática de la
segunda etapa de TDS para la inserción del gen S quimérico de
4/91-BeauR en el ADNc de longitud completa del VBI
en el virus vaccinia recombinante
v-NotI-IBVFL-4/91S.
Figura 10. Perfiles de crecimiento de los tres
VBIs en cuatro tipos celulares. Los paneles muestran el patrón de
crecimiento de BeauR (línea continua con triángulos),
M41-CK (línea discontinua con rombos) y
BeauR-M41(S) (línea de puntos con cuadrados)
en (A) células CK, (B) células Vero, (C) células CEF y (D) células
BHK-21.
<110> AKZO Nobel NV
\hskip1cmInstitute for Animal Health
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Virus de la bronquitis infecciosa
con un gen de la espícula alterado
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
2003-001-FF
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 03-075 623.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
03-03-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la bronquitis
infecciosa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3492)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(54>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_mat
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (55)..(3492)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> estructura_variable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (55)..(3279)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ectodominio
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características_varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1603)..(1617)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de corte de S1/S2
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> estructura_variable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3280)..(3363)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio transmembranal
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características_varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3353)..(3358)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de restricción de BspHI
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> estructura_variable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3364)..(3492)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de la cola citoplásmica
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1146
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la bronquitis
infecciosa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Una vacuna para ser utilizada en la
protección de las aves de corral frente a la bronquitis infecciosa,
que comprende un virus de la bronquitis infecciosa (VBI) atenuado y
un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, que se
caracteriza porque el VBI atenuado es VBI de la cepa
Beaudette que contiene un gen heterólogo de la espícula del VBI, en
el que el fragmento de dicho gen heterólogo de la espícula del VBI
que codifica la cola citoplásmica deriva del VBI de la cepa
Beaudette receptor.
2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
1, que se caracteriza porque el gen de la espícula heterólogo
codifica una proteína de la espícula de un VBI de serotipo
Massachusetts.
3. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
2, que se caracteriza porque el gen de la espícula heterólogo
codifica una proteína de la espícula del VBI de la cepa M41.
4. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
1, que se caracteriza porque el gen de la espícula heterólogo
codifica una proteína de la espícula de un VBI de serotipo 793B, en
particular de un VBI de la cepa 4/91.
5. Una vacuna de acuerdo con las
reivindicaciones 1-4, que se caracteriza
porque el gen de la espícula heterólogo sustituye al gen de la
espícula original.
6. Una vacuna de acuerdo con las
reivindicaciones 1-5, que se caracteriza
porque el VBI está en forma viva.
7. Una vacuna de acuerdo con las
reivindicaciones 1-6, que se caracteriza
porque la vacuna contiene además una o más cepas vacuna de otros
patógenos infecciosos para las aves de corral.
8. Una vacuna de acuerdo con las
reivindicaciones 1-7, que se caracteriza
porque la vacuna contiene un adyuvante.
9. Un método para la preparación de una vacuna
de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, que se
caracteriza porque el VBI atenuado es mezclado con un
vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptable.
10. Utilización del VBI de la cepa Beaudette
BeauR que contiene un gen heterólogo de la espícula del VBI para la
producción de una vacuna para la protección de las aves de corral
frente a la bronquitis infecciosa para la administración in
ovo, donde el fragmento de dicho gen heterólogo de la espícula
de VBI que codifica la cola citoplásmica deriva del VBI de la cepa
Beaudette BeauR receptor.
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