ES2333283T3

ES2333283T3 - Procedimiento y dispositivo para medir la luminiscencia.

Info

Publication number: ES2333283T3
Application number: ES99910187T
Authority: ES
Inventors: Gerd Marowsky; Dieter Neuschaefer; Michael Pawlak
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1998-02-05
Filing date: 1999-02-03
Publication date: 2010-02-18
Anticipated expiration: 2019-02-03
Also published as: EP1057008A1; WO1999040415A1; AU2924399A; DE59915078D1; ATE442579T1; US6710870B1; JP4662623B2; JP2002502967A; EP1057008B1

Abstract

Procedimiento para la excitación y determinación de una luminiscencia en una muestra de analito (3) que está en contacto con el estrato conductor de ondas (8) de un conductor de ondas óptico estratificado, y en el que se conduce al dispositivo de medición (12) y se determina la radiación luminiscente generada en el entorno próximo a la superficie del estrato conductor de ondas (8), después de penetrar en dicho estrato conductor de ondas, caracterizado porque se genera la luminiscencia mediante una excitación no evanescente en el volumen de la muestra de analito (3), generándose la excitación no evanescente mediante uno de los medios siguientes: (a) electrodos, mediante los cuales se excita una luminiscencia mediante la aplicación de un campo eléctrico, (b) una combinación de productos químicos que genera una quimiluminiscencia, y (c) radiación directa no evanescente mediante luz.

Description

Procedimiento y dispositivo para medir la luminiscencia.

La invención se refiere a un procedimiento para excitar y determinar una luminiscencia de un analito que se encuentra en contacto con la superficie del estrato conductor de ondas de una guía de ondas estratificada, en el que se genera de modo no evanescente una luminiscencia en el volumen del analito, que conduce la radiación luminiscente que ha penetrado desde la zona próxima en la superficie del estrato conductor de ondas al estrato conductor de ondas de la guía de ondas estratificada al sistema de medición óptico, preferentemente a través de por lo menos un elemento de desacoplamiento para la radiación luminiscente, y que después mide la luz luminiscente, por ejemplo por un método optoelectrónico. La invención se refiere también a un dispositivo de medida para llevar a cabo el procedimiento, y a una plataforma de sensores.

Para la identificación específica de un analito en una muestra que puede consistir en una mezcla compleja de sustancias y para ligar la molécula del analito a la superficie de la guía de ondas, inmovilizar en la zona de la profundidad de penetración del campo evanescente los elementos de identificación bioquímicos sobre la superficie de la guía de ondas, bien de forma directa o por medio de una capa de agente adherente. Para la determinación del analito se pone en contacto la muestra, bien en parada y flujo o en flujo continuo, con los elementos identificativos inmovilizados sobre la superficie de la guía de ondas.

Especialmente en el campo de la analítica bioquímica se han desarrollado muy recientemente guías de ondas planares para generar y detectar radiación de excitación evanescente. En el campo evanescente y en contacto con una muestra de analito se genera una luminiscencia, por ejemplo una fluorescencia, cuya medición permite efectuar una determinación cualitativa o cuantitativa de sustancias, incluso en una concentración muy baja. La radiación de excitación evanescente que sale al espacio de forma isótropa se determina por métodos optoelectrónicos mediante dispositivos de medida adecuados, tales como por ejemplo fotodiodos, fotomultiplicadores o cámaras CCD. Este método se da a conocer por ejemplo en el documento WO 95/33197. También existe la posibilidad de desacoplar y medir la parte de radiación de excitación evanescente vuelta a reacoplar en la guía de ondas por medio de un elemento difractor óptico. Este método se describe por ejemplo en el documento WO 95/33198. Se han conocido dispositivos (arrays) para realizar de modo simultáneo o consecutivo mediciones múltiples, donde en una plataforma de sensores están dispuestos como mínimo dos guías de ondas que se controlan de forma independiente con luz de excitación, véase por ejemplo el documento WO 96/35940.

El documento EP-A-0793090 describe una disposición de medida con un elemento de soporte transparente para la radiación de excitación y de medición, que en una primera capa límite presenta un elemento sensor óptico-luminiscente, que a través de una segunda capa límite absorbe radiación de excitación de una fuente de radiación y que a través de una tercera capa límite transmite la radiación de medición del elemento sensor a un detector de una unidad de evaluación.

Los métodos de medición conocidos plantean requisitos rigurosos a la precisión de posicionamiento de la luz de excitación en cuanto a los elementos de acoplamiento para lograr un acoplamiento de la luz suficiente y con ello suficiente sensibilidad. Por este motivo es imprescindible el empleo de componentes de ajuste, lo que complica la estructura técnica y se manifiesta especialmente en la construcción de arrays.

Además hay que limitarse al empleo de luz esencialmente coherente para ajustar el posicionamiento de acuerdo con las constantes de los elementos de acoplamiento y ajustar por ejemplo retículas difractivas.

Para las guías de ondas clásicas, altamente multimodales, tales como por ejemplo capilares multimodo, fibras de vidrio multimodo o plaquitas de vidrio multimodo se puede soslayar el problema de los rigurosos requisitos de posicionamiento para el acoplamiento de la luz de excitación mediante la aplicación del llamado "principio de concentración de lumniscencia", tal como esté descrito por ejemplo en Sensors and Actuators, tomo 38 a 39 (1997), pág. 96 a 102 y pág. 300 a 304. Ahora bien, aquí se emplean sin embargo guías de ondas ópticas, que se componen del sustrato propiamente dicho (sin un estrato de refracción superior adicional), que se encuentra en un entorno de un índice de refracción más bajo, y en los que debido a la forma geométrica resulta posible la reflexión total. Se describe que la luz luminiscente procedente de fuentes de emisión aplicadas sobre la superficie del sustrato tales como membranas de polímero que lleven incorporado un colorante indicador se concentran bajo un ángulo espacial grande, y a continuación se conducen en el sustrato de vidrio a un detector que se encuentra en la cara frontal de la guía de ondas. Típicamente se emplean tales colorantes indicadores en concentraciones elevadas, por ejemplo milimolares. Para medir concentraciones de determinación muy reducidas no son adecuados sustratos de vidrio tan gruesos empleados como guías de ondas multimodales.

Sorprendentemente se ha encontrado que también en el caso de guías de ondas estratificadas compuestas de un soporte transparente y un estrato conductor de ondas de alto poder de refracción se puede aplicar el principio del "colector de luminiscencia" y por lo tanto se evitan completamente los problemas unidos al acoplamiento de la luz de excitación, si se dirige la radiación de excitación sin empleo de elementos de acoplamiento, al menos parcialmente de modo directo sobre el volumen de la muestra de analito para generar la luminiscencia, por ejemplo en una disposición de luz incidente o de transmisión. La radiación luminiscente generada en la zona próxima a la superficie del estrato conductor de ondas se acopla sorprendentemente en el estrato conductor de ondas en una magnitud mensurable, y por ejemplo se puede determinar de modo optoelectrónico en la cara frontal de fibras ópticas o de guías de ondas planares o a través de elementos de desacoplamiento en el caso de guías de ondas planares. La luminiscencia generada en el volumen más lejano de analito prácticamente no se acopla sorprendentemente en el estrato conductor de ondas, por lo que se excluye la radiación luminiscente molesta generada en el analito, y resulta posible una medición casi exenta de fondo con alto nivel de selectividad espacial, alto rendimiento y alta sensibilidad.

Dentro del marco de la invención se entiende por guías de ondas estratificadas unas estructuras estratificadas a base de un sustrato transparente tal como por ejemplo vidrio, cuarzo o plásticos tales como policarbonato, con un índice de refracción menor que el estrato conductor de ondas de alta refracción aplicado sobre la superficie, con un índice de refracción de por ejemplo 1,8. El espesor del estrato conductor de ondas se elige preferentemente de tal modo que solamente puede conducir un único o solo unos pocos (por ejemplo hasta 3) modos discretos de luz de una determinada longitud de onda Las guías de ondas estratificadas se denominarán en lo sucesivo abreviadamente como guías de ondas.

También se ha hallado sorprendentemente que no solamente se puede medir con guías de ondas estratificadas una luminiscencia excitada por radiación óptica sino incluso luminiscencia generada por otros mecanismos, tales como por ejemplo quimio-luminiscencia, triboluminiscencia, bioluminiscencia o electroluminiscencia, y que de este modo se facilita un método nuevo para la determinación de alta sensibilidad de tal radiación luminiscente.

La irradiación directa de la muestra de analito que se encuentra en contacto con la superficie de la guía de ondas ofrece por ejemplo las siguientes ventajas:

-: Detección de alta sensibilidad mediante una excitación epifluorescente convencional de la configuración correspondiente,

-: Empleo de fuentes de radiación coherentes o no coherentes, ya que la luminiscencia no se genera por el campo evanescente de una radiación de excitación conducida por un estrato conductor de ondas sino que se mide la radiación luminiscente generada en la zona próxima a la superficie del estrato conductor de ondas de una guía de ondas,

-: Distinción entre luminiscencia de volumen y radiación luminiscente generada en la zona óptica próxima, lo que permite la medición en muestras de analito turbias tales como por ejemplo sangre, suero o mezclas de reacción,

-: Escasos requisitos relativos a la precisión de posicionamiento de la luz excitadora,

-: Reducida complejidad técnica en la utilización de plataformas de sensores con por lo menos dos zonas conductoras de ondas independientes (campos sensores) para realizar mediciones simultáneas,

-: Detección casi exenta de fondo gracias a una posición de detección totalmente separada en el espacio del lugar de la excitación,

-: Realización técnicamente sencilla de formatos de Arrays, tal como por ejemplo un formato de placas de microtitrado con adaptación a tamaños normalizados,

-: Fabricación económica de bajo coste de formas también compactas de sistemas sensores, ya que se plantean unos requisitos más reducidos a los dispositivos de ajuste óptico-mecánicos,

-: Utilización de fuentes de luz económicas, de libre elección y comerciales, ajustándose eventualmente el campo de longitudes de ondas por medio de filtros,

-: Empleo de luz de excitación con una longitud de onda de < 450 nm y posibilidad de excitación incluso con luz UV,

-: Empleo de plataformas de sensores con escotaduras abiertas en el campo de nl a \mul para alojamiento de la muestra,

-: Empleo de guías de ondas estratificadas,

-: Menor densidad de energía de la radiación de excitación, cuidando así las muestras de analito.

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La invención se refiere a un procedimiento para la excitación y determinación de una luminiscencia en una muestra de analito tal como está definido en las reivindicaciones 1 a 7, y a un dispositivo para la medición de la luminiscencia generada en una muestra de analito por medio de radiación de excitación, tal como se define en las reivindicaciones 8 a 12.

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Un primer objeto de la invención es un procedimiento para la excitación y determinación de una luminiscencia en una muestra de analito que se encuentra en contacto con el estrato conductor de ondas de una guía de ondas estratificada óptica, que está caracterizado porque se genera la luminiscencia en el volumen de la muestra de analito mediante excitación no evanescente, y se conduce al dispositivo de medición la radiación luminiscente generada en la zona próxima a la superficie del estrato conductor de ondas después de penetrar en dicho estrato conductor de ondas y allí se determina.

En la zona próxima a la superficie del estrato conductor de ondas (designado en lo sucesivo como entorno óptico próximo) significa por ejemplo una distancia máxima de aproximadamente una longitud de onda de la luz luminiscente, preferentemente de máximo media longitud de ondas y de modo especialmente preferente de máximo aproximadamente un cuarto de longitud de ondas respecto a la superficie del estrato conductor de ondas.

La luminiscencia, por ejemplo una fluorescencia, se puede excitar de diversos modos. En el campo de la colocación de la muestra pueden estar situados unos electrodos mediante los cuales y con aplicación de un campo eléctrico se excita una luminiscencia. Una quimiluminiscencia se puede producir en la muestra de analito mediante la combinación de productos químicos adecuados. La excitación de la luminiscencia tiene lugar preferentemente de forma óptica por medio de la irradiación directa (sin elementos de acoplamiento) de una radiación no evanescente en la muestra de analito mediante luz de longitudes de onda adecuadas. El campo de longitudes de onda puede ir por ejemplo desde la UV de onda corta hasta el IR próximo, preferentemente de 200 a 2000 nm, más preferentemente de 250 a 1400 nm, y de modo especialmente preferente de 250 a 1000 nm. Una excitación de la luminiscencia evanescente mediante luz UV empleando guías de ondas planares con elementos de acoplamiento sólo puede realizarse con limitaciones, ya que los períodos de retícula inferiores a 300 nm para el acoplamiento de la radiación UV solamente se pueden preparar con un gasto grande, y además la radiación UV se amortigua intensamente en la guía de ondas. El procedimiento conforme a la invención permite sorprendentemente por una parte el empleo de luz UV y por otra el aprovechamiento de la luminiscencia propia de las moléculas que se trata de determinar mediante la irradiación UV de la muestra de analito, de
modo que eventualmente no es preciso utilizar etiquetas Luminophor tales como por ejemplo etiquetas Fluorophor.

Se puede utilizar tanto una radiación coherente como no coherente y por lo tanto una fuente de luz cualquiera, por ejemplo policromática. La radiación se puede enfocar mediante lentes o espejos y/o utilizando filtros se pueden ajustar unos campos de longitud de onda más estrechos. También se puede utilizar radiación polarizada. Unas fuentes de radiación adecuadas son por ejemplo láser, láser de diodos y luz blanca procedente de diodos luminosos o bombillas fluorescentes e incandescentes tales como por ejemplo lámparas halógenas o de vapor de mercurio.

Se conoce una gran diversidad de guías de ondas estratificadas ópticas, y en parte se pueden adquirir en el comercio. Para el procedimiento conforme a la invención éstas pueden presentar diversas formas geométricas, por ejemplo fibras ópticas, cuerpos de forma cilíndrica o guías de ondas planares. El material de soporte de más bajo índice de refracción puede seleccionarse de entre cristales de plástico (por ejemplo policarbonato) o vidrios inorgánicos (vidrio, cuarzo, SiO_{2}), y el estrato conductor de ondas con un índice de refracción superior de entre los plásticos u óxidos metálicos tales como Ta_{2}P_{5}, TiO_{2}, ZnO, HfO_{2,} ZrO_{2} o Nb_{2}O_{5}. Se prefieren guías de ondas con estratos conductores de ondas muy delgados y alto índice de refracción, en los cuales se conducen sólo unos pocos modos (por ejemplo 1 a 3).

El espesor del estrato conductor de ondas puede ser por ejemplo de 50 nm a 2000 nm, preferentemente de 80 nm a 400 nm, muy preferentemente de 100 a 200 nm. La elección óptima del espesor del estrato depende de la longitud de onda de la luminiscencia que se trata de detectar. Es preferentemente de 50 nm hasta una longitud de ondas, muy preferentemente de 50 nm hasta una longitud de onda, muy preferentemente de 50 nm hasta media longitud de onda, especialmente preferente de 50 nm hasta un cuarto de longitud de onda. Al mismo tiempo se prefieren especialmente estratos conductores de ondas con un índice de refracción lo más alto posible, es decir preferentemente desde un mínimo de 1,8, más preferentemente de un mínimo de 2,0 y de modo especialmente preferente de un mínimo de 2,2. Con estos valores de los parámetros se consigue que el entorno óptico próximo situado directamente en la superficie de la guía de ondas sea especialmente fuerte, y que disminuya de modo especialmente intenso al aumentar la distancia a la superficie de la guía de ondas, lo cual da lugar a un acoplamiento de la luminiscencia en la guía de ondas con alto grado específico en el espacio, (es decir esencialmente limitado a pocos 100 nm desde la superficie).

Las guías de ondas planares están dotadas por lo menos de un elemento de desacoplamiento para la radiación luminiscente; por ejemplo prismas o preferentemente elementos difractores.

Se entiende por elementos difractores los elementos de desacoplamiento para la radiación luminosa. Con frecuencia se emplean retículas que se pueden preparar de diversos modos. Está muy extendida la preparación de retículas mediante técnicas de grabado fotolitográfico. También pueden estar tales retículas en el soporte transparente y/o en el estrato conductor de ondas, y se pueden grabar durante el conformado o posteriormente. También existe la posibilidad de producir tales retículas mediante procedimientos ablativos (radiación láser). Otros procedimientos de fabricación son grabados holográficos o incorporación de iones mediante impacto de iones. Es conocida la adaptación de los parámetros de la retícula tales como profundidad de modulación, relación entre puente y ranura y período de retícula, de acuerdo con la longitud de onda de la radiación luminiscente para obtener una eficacia de desacoplamiento optimizada. El espesor del estrato conductor de ondas puede ser de 100 a 200 nm. La profundidad de modulación puede ser de 5 a 100 nm, preferentemente de 5 a 60 nm. La relación entre profundidad de modulación y espesor del estrato conductor de ondas es preferentemente inferior a 0,5. El período de los elementos difractores (retícula de difracción) puede ser por ejemplo de 200 a 1000 nm.

Las guías de ondas planares son conocidas y se pueden adquirir en el comercio. Pueden presentar uno o varios elementos difractores opuestos entre sí para el desacoplamiento de la radiación luminiscente excitada. Para detectar la luminiscencia de una única banda de emisión, los elementos difractores están realizados preferentemente monodifractivos. Si se desean detectar luminiscencias de diferentes longitudes de onda entonces los elemento difractores están realizados preferentemente multidifractivos. Los acoplamientos de retícula multidifractivos para empleo en sistemas de medición para la detección de variaciones del denominado índice de refracción efectivo en el campo evanescente de una guía de ondas, también se conocen y están descritos por ejemplo en el documento WO 95/14225.

Las distintas líneas de los elementos difractores pueden ser rectas o curvadas, y en el caso de que exista sólo un elemento difractor también pueden estar realizadas con forma circular. Si hay dos elementos difractores, éstos pueden presentar unas constantes de retícula iguales o unas constantes de retícula diferentes, por ejemplo para dirigir la luz luminiscente emitida sobre un único detector.

En la realización del procedimiento conforme a la invención se puede irradiar una parte o el volumen total de una muestra de analito. La irradiación puede efectuarse con un ángulo inclinado pero preferentemente en ángulo recto con respecto a la superficie de la guía de ondas. Según que se empleen fibras ópticas o guías de ondas planares las disposiciones de medida pueden estar realizadas y dispuestas de diferente modo.

En el caso de utilizarse fibras de vidrio ópticas se puede realizar el procedimiento de tal modo que se coloca el analito en una célula de medición, por ejemplo en una cubeta, que puede estar realizada de forma cerrada o como célula de paso. Una o varias fibras de vidrio pueden estar unidas con un cierre realizado como cabezal de medida. Entonces la radiación luminiscente conducida a la cara frontal de una fibra de vidrio se puede medir por procedimiento optoelectrónico. La irradiación de la muestra de analito puede tener lugar a través de la cubeta, preferentemente a través de una ventana óptica. Se puede irradiar una parte o el volumen total de una muestra de analito. La irradiación puede efectuarse con un ángulo inclinado, pero preferentemente en ángulo recto con respecto a la fibra de vidrio.

Al utilizar guías de ondas planares, la disposición de la fuente de radiación, de los elementos de detección y de la carga de la muestra viene determinada principalmente por la planeidad de la guía de ondas.

En el caso de guías de ondas planares, el elemento previsto generalmente para recibir un analito, es por ejemplo un recipiente de muestra en forma de una depresión que está en contacto con la guía de ondas integrada sobre la estrato conductora de ondas. Los recipientes para la muestra pueden tener un volumen de 0,1 nl a 100 \mul y preferentemente de 10 nl a 10 \mul. Los recipientes para la muestra pueden estar abiertos hacia arriba o cerrados, donde en el caso de los citados en segundo lugar se trata de células de paso. Las guías de ondas planares con recipientes de muestra aplicados se designan en lo sucesivo como plataformas de sensores.

Los elementos de acoplamiento ópticos, realizados preferentemente como retículas de difracción, pueden estar dispuestos en el interior y en el exterior de los recipientes de las muestras. De ahí resultan diferentes requisitos respecto a las propiedades de la segunda estrato que se pone en contacto con el estrato conductor de ondas, en la que se generan los recipientes de muestra. Si los elementos de acoplamiento ópticos están situados en el interior de los recipientes de muestra entonces no hay requisitos especiales en cuanto a las propiedades ópticas y a su disposición en cuanto a la posición y alineación de las retículas de difracción como elementos ópticos de acoplamiento. Para reducir una posible diafonía óptica entre campos de sensores contiguos sobre una plataforma de sensores, en este caso el segundo estrato es preferentemente absorbente para la longitud de onda luminiscente que se trata de detectar.

Si los elementos de acoplamiento ópticos están fuera de los recipientes de las muestras y por lo tanto quedan totalmente cubiertos por el segundo estrato, lo que tiene la ventaja de asegurar unas condiciones de desacoplamiento estables, entonces el segundo estrato que está en contacto con la superficie de la guía de ondas, deberá ser transparente a la longitud de onda de la luz luminiscente por lo menos hasta la profundidad de penetración de la luz luminiscencia conducida del campo evanescente, es decir por lo menos hasta como mínimo una longitud de onda, preferentemente hasta un mínimo de 10 micrómetros. En esta disposición, el reborde de los recipientes de muestra se encuentra ventajosamente a una distancia de 1 micrómetro hasta 1 cm, preferentemente desde 5 micrómetros hasta 5 mm, del o de los elementos difractores. El segundo estrato que se encuentra en contacto con la superficie de la guía de ondas presenta en este campo una rugosidad superficial lo más reducida posible, de por ejemplo menos de 2 nm RMS, y tiene un contacto sin intersticio con la superficie de la guía de ondas, para evitar que aumenten las pérdidas por dispresión de la luz luminiscente conducida.

La orientación de las líneas de retícula en el caso de retículas de difracción utilizadas como elementos de acoplamiento es preferentemente esencialmente de la misma dirección al trazado del reborde de los recipientes de las muestras. En el caso de elementos difractores cerrados, por ejemplo de forma circular o elíptica, los recipientes de las muestras se encuentran preferentemente en su centro. En el caso de dos o más elementos difractores interrumpidos, los recipientes de las muestras se encuentran preferentemente en el centro, entre elementos difractores enfrentados entre sí.

Las plataformas de sensores pueden estar realizadas de tal modo que constan de una sola guía de ondas con elementos difractores, o pueden consistir como disposición unidimensional o bidimensional de por lo menos dos guías de ondas con elementos difractores, en cuyo caso puede haber un número cualquiera de guías de ondas con elementos difractores dispuestos de forma sucesiva y/o contigua, por ejemplo hasta 100 o más, preferentemente 2 a 50 por fila y/o línea. Estas disposiciones pueden ser por ejemplo rectangulares o redondas. Especialmente si los recipientes de muestra están abiertos hacia arriba, las dimensiones exteriores de las plataformas de sensores y la disposición de los recipientes de muestra pueden corresponder a la forma de las plataformas de microtitrado conocidas y eventualmente normalizadas, en cuyo caso el número de recipientes de muestra sobre una plataforma de sensores es preferentemente un múltiplo entero de 96, como estándar tradicional para placas de microtitrado.

A este respecto y en el caso de utilización de disposiciones unidimensionales o bidimensionales de por ejemplo dos guías de ondas con elementos difractores (Arrays) se puede renunciar a recipientes de muestra, y la muestra de analito que se trata de investigar se puede colocar directamente sobre la zona de medición (campos de sensores) del estrato conductor de ondas. Para ello se pueden aplicar métodos conocidos tales como por ejemplo la aplicación mediante micropipetas o impresoras de chorro de tinta.

La preparación de las plataformas de sensores con recipientes de muestras abiertos puede efectuarse de acuerdo con procedimientos de por sí conocidos, por ejemplo procedimientos fotolitográficos mediante estratos fotopolimerizables que se aplican sobre el estrato conductor de ondas, eventualmente por medio de una estrato intermedia de agente adherente, en cuyo caso éste ha de ser transparente por lo menos para la longitud de onda luminiscente que se trata de detectar, si es que los elementos difractores se encuentran fuera de los recipientes de muestras. Otra posibilidad consiste en la aplicación de procedimientos de vaporización en vacío a través de una máscara, mediante los cuales se pueden aplicar multitud de materiales, principalemente óxidos como SiO_{2} o Al_{2}O_{3}. Otra posibilidad consiste en la aplicación de procedimientos de ablación tales como procedimientos de grabado químico sirviéndose de una máscara y/o por radiación láser. Los procedimientos también se pueden combinar.

En el caso de plataformas de sensores con disposiciones uni- o bi-dimensionales de más de un elemento sensor equipado con elementos difractores para el desacoplamiento de la luminiscencia, formados en un estrato continuo conductor de ondas, puede ser conveniente interrumpir la conducción de ondas entre elementos difractores contiguos mediante la aplicación de estratos absorbentes, por lo menos para la longitud de onda de luminiscencia que se trata de detectar. La aplicación de los estratos absorbentes puede realizarse por ejemplo mediante untado o estampado. Además esto se puede realizar mediante la vaporización en vacío de óxidos metálicos, con aplicación de procedimientos de vaporización al vacío, con aplicación de procedimientos de recubrimiento al vacío o utilizando materiales absorbentes de la luz, tal como por ejemplo escotaduras intermedias en el estrato que contiene los recipientes de muestra y que está en contacto con la superficie de las guías de ondas, rellenas por ejemplo con carbono o materiales ennegrecidos. De este modo se evitan interferencias debidas a diafonía de la luz de excitación y/o de la luz luminiscente.

Los distintos elementos sensores también se pueden separar interrumpiendo el estrato conductor de ondas que rodea al citado elemento sensor, con el fin de evitar interferencias por diafonía. La interrupción puede realizarse mediante una simple eliminación del estrato conductor de ondas en una zona estrecha alrededor del elemento, por ejemplo por un procedimiento mecánico mediante raspado, mediante procedimientos de ataque químico o irradiación con un láser. La interrupción del estrato conductor de ondas también se puede conseguir utilizando máscaras, en el mismo momento de aplicar el estrato conductor de ondas.

También existe la posibilidad de prefabricar estratos de recubrimiento a partir de un material transparente para la radiación luminiscente y eventualmente también para la radiación de excitación, por lo menos dentro del campo de la profundidad de penetración de la luz luminiscente conducida por el campo evanescente, preferentemente hasta por lo menos 10 micras métricas, siempre y cuando los elementos difractores estén situados fuera de los recipientes de muestra, eventualmente con zonas absorbentes de la luz tales como las arriba descritas, situadas fuera de los campos de sensores y de los correspondientes elementos difractores, uniéndolos después con el estrato conductor de ondas, sirviéndose eventualmente de un agente adherente, para el cual rigen los mismos requisitos de transparencia o propiedades de absorción en función de la posición con relación a los elementos difractores.

Al realizar el procedimiento conforme a la invención con guías de ondas planares se puede irradiar la muestra de analito desde el exterior, es decir antes o entre los elementos de desacoplamiento, directamente con un ángulo inclinado o preferentemente recto con relación a la guía de ondas, (a) desde arriba a través de la muestra de analito en dirección hacia el estrato conductor de ondas y a través de la guía de ondas o (b) preferentemente desde abajo a través de la guía de ondas, desde la dirección del material de soporte. Para ello puede ser ventajoso generar un doble paso de la luz de excitación a través de la muestra mediante el empleo de espejos por el lado de la plataforma de sensores opuesta a la dirección de irradiación, en la medida en que mediante la configuración de la geometría óptica de excitación se evite aumentar la luz dispersa que incide sobre la unidad de detección. En el caso de recipientes de muestra de la plataforma de sensores cerrados hacia arriba y de irradiación de la luz de excitación desde la dirección del material de soporte, se puede por ejemplo azogar la cara superior de las escotaduras. En caso de irradiación de la luz de excitación desde arriba a través de la muestra de analito se puede azogar la cara exterior del material de soporte en la zona de los recipientes de muestras y entre los elementos difractores.

La irradiación simultánea de Arrays unidimensionales o bidimensionales de elementos sensores puede efectuarse por ejemplo utilizando un rayo de luz ensanchado en gran superficie (para irradiar simultáneamente Arrays bidimensionales) o en forma elíptica o de ranura (para la irradiación simultánea de un Array unidimensional). Esto va sin embargo unido a la generación de diferentes intensidades de irradiación sobre los diferentes elementos sensores, lo que por ejemplo en el caso de utilizarse el láser o diodos láser se debe esencialmente a su perfil de radiación en forma de campana de Gauss, y que se ha de tener en cuenta al evaluar las señales de luminiscencia generadas. Puede conseguirse una intensidad de irradiación más uniforme sobre los diferentes elementos sensores, por ejemplo mediante la multiplicación de un único rayo de luz de excitación, preferentemente de un láser o de un diodo láser, mediante una retícula de Dammann o de un Array de microlentes. Mediante unja retícula de Dammann para generar un Array unidimensional o bidimensional de rayos de excitación individuales procedentes de una única fuente de luz se puede conseguir una intensidad muy uniforme de los distintos rayos de excitación. En la medida en que se trata de iluminar simultáneamente un Array numéricamente muy grande de elementos sensores, por ejemplo de 100 o más elementos sensores, la intensidad de los rayos individuales puede llegar a ser muy reducida en el caso de empleo de fuentes de luz de excitación compactas, y por lo tanto por lo general de potencia relativamente reducida (con relación a las intensidades de excitación), lo cual puede empeorar los límites de determinación del procedimiento que se pueden conseguir. Esto se puede corregir por una parte mediante el empleo de fuentes de luz de excitación de mayor potencia, pero por lo general también de mayor tamaño. Si al mismo tiempo se desea miniaturizar la disposición de medida, entonces se prefiere utilizar como fuentes de luz de excitación Arrays de diodos láser miniaturizados. Por ejemplo son adecuados Arrays de diodos láser que emiten por el borde tal como se pueden obtener hoy día comercialmente en una gama espectral superior a unos 600 nm. Se prefieren especialmente, en particular para la utilización con Arrays de sensores de muy alta densidad, los llamados diodos láser de cavidad vertical que emitan superficialmente (Vertical-Cavity Surfage Emitting Laserdiodes, VCSEL's), tal como están descritos por ejemplo en MINAST-News 2/1997-Pág. 13 y 14. Estos Arrays de diodos láser se caracterizan por una multitud de propiedades muy favorables para el empleo conforme a la invención:

-: Rendimiento de conversión muy alto de la corriente del láser en luz láser emitida y unido con ello una generación de calor relativamente reducida, lo que permite obtener una densidad de empaquetado alta sobre una plataforma, especialmente si adicionalmente se emplean elementos disipadores de calor, para los cuales hay unos requisitos relativamente reducidos;

-: dimensiones muy reducidas de la apertura de emisión del láser en el campo micrométrico inferior, lo que junto con la disposición vertical de la cavidad láser sobre el soporte y la elevada densidad de empaquetado posible permite una miniaturazibilidad de la disposición de medida extremada;

-: muy reducida variación de las intensidades de emisión de los VCSEL fabricados sobre una única plaquita y posibilidad de activación selectiva dado el correspondiente diseño del sistema electrónico de control;

-: ángulos de apertura muy reducidos del cono de emisión al emplear unos orificios de salida muy pequeños y emisión monomodal hasta intensidades de milivatios con empleo de unas corrientes de excitación reducidas;

-: reducidos costes de fabricación por VCSEL individual gracias a la fabricación simultánea de un gran número de VCSEL sobre una única plaquita.

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La proporción de radiación luminiscente excitada en el volumen de analito en el entorno próximo de la guía de ondas se acopla al menos parcialmente en la guía de ondas, es conducida por ésta y se desacopla en los elementos de acoplamiento ópticos. La luz luminiscente desacoplada se puede dirigir entonces sobre elementos de detección optoelectrónicos, y medir.

Dado que además de depender del grueso del estrato conductor de ondas, la intensidad de los modos conducidos por el campo evanescente depende además de su polarización (transversal eléctrica TE, o transversal magnética TM), lo cual también es aplicable para los mecanismos de acoplamiento (de la penetración) de la luminiscencia generada en el entorno próximo de la guía de ondas, puede ser ventajoso para incrementar la sensibilidad, es decir para alcanzar unos límites de determinación más profundos, detectar de modo selectivo por polarización la luminiscencia desacoplada de los elementos difractores. Esto se facilita por el hecho de que el acoplamiento de la luz luminiscente de igual longitud de onda pero diferente polarización (TE o TM) tiene lugar bajo unos ángulos claramente diferentes. Especialmente en el caso del desacoplamiento de elementos luminiscentes de banda espectral ancha, es decir desacoplados bajo un cono ancho, puede ser ventajoso utilizar en el recorrido de los rayos de la luminiscencia desacoplada unos componentes ópticos adicionales, selectivos a la polarización, entre los elementos de desacoplamiento difractivos y las unidades de detección optoelectrónicas.

Otros datos relativos a la disposición de un sistema de medición y a la elección de fuentes de luz, elementos ópticos para la conducción y discriminación de la radiación de excitación y de la radiación luminiscente así como de las unidades de detección para determinar la radiación luminiscente se describen detalladamente en los documentos WO 95/33197 y WO 95/33198.

Cuando se utilicen células de medición en las que el fluido de la muestra llegue a ponerse en contacto con los elementos de acoplamiento difractores surge el problema de que pueden variar las condiciones para el acoplamiento de la luz de excitación debido a adsorción molecular o combinación con los elementos de acoplamiento. Adicionalmente y debido a la excitación de las moléculas luminiscentes o fluorescentes no combinadas, mediante la parte de luz de excitación que no se acopla en la guía de ondas sino que penetra sin difracción en la solución como orden cero, se excita en la profundidad de la muestra luminiscencia de fondo o fluorescencia de fondo, que a través de los elementos de acoplamiento ópticos se puede acoplar parcialmente en la guía de ondas y perjudicar la precisión y sensibilidad de la determinación del analito.

En Analytical Chemistry, Tomo 62, Nº 18 (1990), págs. 2012-2017 se describe una célula de paso de caucho silicona aplicada sobre una guía de ondas óptica con retícula de acoplamiento y de desacoplamiento. El elemento de acoplamiento y de desacoplamiento está situado en el campo del canal de flujo de la muestra. Con esta disposición se miden las alteraciones de la absorción de la luz y del índice de refracción, sin que se produzca una interacción selectiva con elementos específicos de identificación en la superficie de la guía de ondas. No se tienen en cuenta las alteraciones de adsorción en la superficie para el analito, una solución de colorante, durante la medición dependiente de la absorción respective fluidos de diferentes índices de refracción, al efectuar la medición dependiente del índice de refracción. En estas mediciones muy poco sensibles son previsibles para un modo conducido en la guía de ondas, incluso en caso de adsorción de un monoestrato de moléculas, frente a las intensas alteraciones del índice de refracción de las soluciones aportadas, a diferencia de las perturbaciones previsibles en el método mucho más sensible de determinación de la luminiscencia generada en el campo evanescente. En el caso del método de medición dependiente del índice de refracción basado en la variación del ángulo de acoplamiento o de desacoplamiento, el contacto de la muestra con los elementos de acoplamiento naturalmente es incluso necesario para generar la señal de medida. Debido a esta configuración con elemento de acoplamiento y de desacoplamiento situado en el interior del canal de flujo de la muestra, la célula de la muestra tiene simplemente el cometido de sellarlo para impedir la salida de fluido, sin ningún otro requisito en cuanto a propiedades ópticas del material.

Ahora se ha hallado sorprendentemente que con las plataformas de sensores se pueden superar los problemas citados, si el estrato previsto para recibir la muestra cubre totalmente los elementos de desacoplamiento, por lo menos en la zona de la radiación luminiscente conducida, y es transparente para esta radiación en el campo de la superficie de asiento.

Otro objeto de la invención es una plataforma de sensores a base de una guía de ondas estratificada óptica planar consistente en un soporte transparente y un estrato conductor de ondas, disponiendo la guía de ondas por lo menos de un elemento de desacoplamiento para desacoplar la radiación de excitación, y si sobre su estrato conductor de ondas se encuentra otro estrato que cierra de modo estanco, que por lo menos en una zona parcial de la radiación de excitación presenta una escotadura abierta hacia arriba o una escotadura cerrada hacia arriba unida por medio de un cana de afluencia y un canal de descarga para una muestra de análisis, cuya profundidad se corresponda por lo menos a la profundidad de penetración del campo evanescente de la luz luminiscente conducido por la guía de ondas, y el estrato es de un material que es transparente por lo menos en la superficie de asiento por lo menos en la profundidad de penetración del campo evanescente de la luz luminiscente conducida por la guía de ondas, para esta luz luminiscente y donde el elemento de desacoplamiento o los elementos de desacoplamiento quedan totalmente cubiertos por el material del estrato, por lo menos en la zona de desacoplamiento de la radiación luminiscente.

La profundidad de las escotaduras es por lo menos preferentemente inferior a 1 \mum, muy preferentemente por lo menos de 10 \mum.

Para la guía de ondas rigen las preferencias y exposiciones antes indicadas, incluidas las disposiciones unidimensionales y bidimensionales.

El estrato que forma una escotadura es transparente, por lo menos en la superficie de asiento, para la radiación electromagnética dentro del campo de la longitud de onda de luminiscencia. Se puede tratar de un material inorgánico tal como por ejemplo vidrio o cuarzo o polímeros orgánicos transparentes (vidrios orgánicos), tal como por ejemplo poliéster, policarbonato, poliacrilatos, polimetacrilatos o fotopotimerisatos. El estrato está formado preferentemente por un elastómero. Son especialmente adecuados los elastómeros de polisiloxanos tales como por ejemplo polidimetilsiloxanos, en los que se trata de materiales blandos y flexibles y a menudo autoadherentes. Los materiales para el estrato son conocidos y en parte pueden obtenerse en el comercio.

El estrato con por lo menos una escotadura se puede producir mediante procedimientos de conformado usuales, por ejemplo procedimientos de colada y prensado, o mediante procedimientos de esmerilado, troquelado y fresado a partir de semiproductos debidamente preformados. El estrato también puede ser de sustancias fotopolimerizables, que se pueden aplicar directamente sobre el estrato conductor de ondas mediante procedimientos litográficos. El estrato puede consistir además de materiales esencialmente inorgánicos tales como Si o SiO_{2}, en los que los recipientes para la muestra se producen mediante procedimientos de ataque químico, donde en la zona de la superficie de contacto con la luz luminiscente que se trata de conducir estos materiales son transparentes por lo menos hasta la profundidad de penetración del campo evanescente de la luz luminiscente conocida, preferentemente hasta una profundidad mínima de 1 \mum, muy preferentemente hasta una profundidad mínima de 10 \mum, por lo menos para la longitud de onda luminiscente.

En el caso de superficies muy lisas (rugosidad superficial en el campo de los nanómetros o inferior) la autoadherencia por adhesión puede dar lugar en materiales rígidos a unos cierres estancos. Los elastómeros por lo general son autoadherentes. También es deseable una rugosidad superficial lo más reducida posible para suprimir la dispersión de la luz. En estos casos el estrato se prepara preferentemente como cuerpo independiente y se aplica con contacto estanco sobre la guía de ondas, en cuya superficie puede haber eventualmente unos elementos de identificación inmovilizados sobre un estrato de agente adherente adicional delgada (es decir inferior a 100 nm).

El estrato puede consistir en un único material que sea transparente, al menos para la longitud de onda luminiscente de la muestra de analito y que sea exento de luminiscencia o también como estrato de dos estratos, cuya primera que se pone en contacto con la superficie de la guía de ondas es transparente para la longitud de onda luminiscente del analito y ha de ser exenta de luminiscencia, mientras que el estrato de cubierta contiguo entonces está realizado preferentemente de modo absorbente de la radiación. En este caso el espesor del primer estrato que está en contacto con la superficie de la guía de ondas corresponde por ejemplo a la profundidad de penetración de la luz luminiscencia conducida por el campo evanescente, es decir aproximadamente una longitud de onda. Este primer estrato tiene preferentemente un espesor de 0,8 \mum a 10 mm, preferentemente de 0,01 mm a 10 mm.

En una realización ventajosa se reducen al mínimo en el estrato de asiento los saltos del índice de refracción en el estrato conductor de ondas, a lo largo de la vía de propagación de la luz luminiscente que conduce hasta los elementos de desacoplamiento ópticos. Esto puede conseguirse realizando de forma redondeada el contorno de la escotadura en el asiento perpendicular al estrato conductor de ondas. Una transición redondeada perpendicular a la superficie de la guía de ondas en los límites de las escotaduras significa que se evita un ángulo recto. El redondeo puede ser por ejemplo parte de un trazado de forma circular, de forma de parábola o de forma de hipérbola. En el caso de materiales blandos y flexibles para el estrato, el redondeo se produce automáticamente al aplicar a presión sobre la guía de ondas. Pero el redondeo también puede estar realizado previamente mediante el procedimiento de conformado. Los saltos del índice de refracción también se pueden reducir al mínimo si la escotadura se va reduciendo eventualmente de forma continua en la dirección de la propagación de la luz luminiscente. Otra posibilidad consiste en la elección del material del estrato que forma la escotadura, con un índice de refracción próximo o igual al índice de refracción de la muestra de analito.

Si una plataforma de sensores contiene una pluralidad de elementos sensores y recipientes de muestra puede ser ventajoso que para suprimir la radiación dispersa y/o la diafonía óptica entre elementos sensores contiguos se prevea disponer a lo largo de las escotaduras materiales absorbentes de la luz, por ejemplo colorantes, pigmentos, negro de humo, óxidos metálicos o metales. Estos materiales pueden estar situados en escotaduras adicionales previstas al efecto a lo largo de los bordes de los recipientes de las muestras, fuera de la zona de los elementos de desacoplamiento ópticos pertenecientes a los elementos sensores, sobre la superficie del estrato conductor de ondas. Son convenientes las realizaciones de superficie plana que se pueden obtener de modo sencillo mediante procedimientos de extensión o vaporización en vacío. La plataforma de sensores puede estar realizada por ejemplo de modo que entre el estrato y la guía de ondas esté previsto material atenuador absorbente de la radiación de excitación evanescente dentro de la gama espectral a ambos lados de la o de cada escotadura, o que el material atenuador se aplique sobre la superficie como inmersión, o que estén previstas escotaduras de atenuación que se puedan llenar con material atenuador. Si existen estratos conductores de ondas continuos con más de un elemento difractor es también conveniente separar los elementos mediante materiales absorbentes. La plataforma de sensores también puede estar realizada de tal modo que los elementos sensores estén interrumpidos mediante la eliminación de una zona estrecha de la guía de ondas alrededor de los elementos.

La plataforma de sensores conforme a la invención puede existir en diversas formas de realización, distinguiéndose entre las formas de realización con escotadura abierta (forma de realización A) y escotadura cerrada (forma de realización B, células de paso).

Forma de realización A

Las escotaduras abiertas pueden tener realmente una forma cualquiera; las superficies de contacto con la guía de ondas pueden ser por ejemplo cuadradas, rectangulares, redondas o elipsoides. La configuración de los dispositivos conformes a la invención puede corresponderse por ejemplo con la forma de las placas de microtitrado conocidas. La disposición geométrica de las escotaduras puede ser cualquiera, pero se prefieren las disposiciones bidimensionales. Los dispositivos y preferencias expuestos y descritos para la forma de realización B pueden aplicarse debidamente también para la forma de realización A.

Forma de realización B

En una placa de sensores conforme a la invención para generar radiación luminiscente excitada, que presenta por lo menos un elemento de desacoplamiento para desacoplar de la guía de ondas radiación luminiscente excitada en el entorno de la guía de ondas y acoplada en la guía de ondas, es conveniente que el estrato realizado como célula de flujo cubra también el o cada elemento de desacoplamiento. A este respecto, en un perfeccionamiento está previsto que la escotadura esté situada totalmente junto a o entre cada elemento de desacoplamiento, de modo que cada elemento de desacoplamiento esté libre de material de la muestra. Esto tiene la ventaja de que al efectuar el desacoplamiento de la radiación luminiscente conducida por la guía de ondas existan unas condiciones de acoplamiento uniformes no influenciadas por el material de la muestra.

En los perfeccionamientos están previstas varias escotaduras que pueden dar lugar a una interrupción de una conducción de ondas, entre las zonas de las plataformas de sensores correspondientes a los diferentes campos de sensores. Para ello es conveniente que en esta parte de las zonas intermedias de las escotaduras complementarias a los campos de sensores, fuera de los elementos de acoplamiento ópticos pertenecientes a los campos de sensores, por ejemplo de la gama espectral del ultravioleta al infrarrojo se prevea material absorbente para impedir un sobreacoplamiento de las partes de radiación entre las escotaduras. Esto se puede conseguir por ejemplo mediante un estrato absorbente que se aplique entre la célula de flujo y la guía de ondas. En otro ejemplo de realización se han realizado para ello en la célula de flujo unas escotaduras de amortiguación que pueden llenarse con un líquido absorbente de la radiación, y que estén abiertas hacia el mismo lado de la superficie que las escotaduras.

Para el empleo en el régimen de análisis rutinario es además conveniente que el estrato que está en contacto con la guía de ondas sea de un material flexible, que cierre de forma estanca la por lo menos una escotadura al aplicarla sobre la guía de ondas. De este modo se tiene la posibilidad, en el caso de escotaduras cerradas por arriba, conducir sin fugas el material de muestra a través de la célula de flujo sin recurrir a otros medios auxiliares tales como juntas, mediante la colocación de una célula de flujo sobre la guía de ondas.

Otro objeto de la invención es un dispositivo para la medición de la luminiscencia generada por radiación de excitación en una muestra de analito, compuesto por:

a): una guía de ondas óptica estratificada con un soporte transparente y un estrato conductor de ondas;

b): una muestra de analito que se encuentra en contacto con el estrato conductor de ondas;

c): una fuente de energía eléctrica u óptica que está dispuesta de tal modo que los electrodos de la fuente de energía eléctrica estén en contacto directo con la muestra del analito, o que la radiación de excitación de la fuente de energía óptica esté dirigida con un ángulo inclinado o ángulo recto directamente sobre la muestra de analito, o de un depósito que contenga un producto químico mediante el cual se excita una quimiluminiscencia en contacto con la muestra de analito; y

d): una unidad de detección optoelectrónica para medir la radiación luminiscente producida por el efecto de un campo eléctrico o de una radiación de excitación.

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En el caso de las guía de ondas (a) se trata preferentemente de guías de ondas planares, que presentan por lo menos un elemento de desacoplamiento para desacoplar la radiación luminiscente, preferentemente elementos difractores, y las correspondientes plataformas de sensores.

En el caso de la fuente de energía (c) se trata preferentemente de una fuente de luz y eventualmente unas lentes de enfoque, unos filtros ópticos o ambos, cuya radiación de excitación se conduce con un ángulo inclinado o recto, bien desde arriba a través de la muestra de analito y de la guía de ondas o desde abajo a través de la guía de ondas y la muestra de analito, siempre fuera del o de los elementos de desacoplamiento.

Para el dispositivo conforme a la invención rigen por lo demás las preferencias y formas de realización antes expuestas. Otros detalles relativos a guías de ondas ópticas, elementos ópticos para el enfoque, filtros y conducción de la luz de excitación y la luz luminiscente así como de unidades de detección para la radiación excitada se describen en los documentos WO 95/33197 y WO 95/33198.

El procedimiento y el dispositivo conforme a la invención son adecuados de forma general para determinar luz luminiscente que se genera en el entorno óptico próximo de una guía de ondas, por ejemplo radiación luminiscente generada por procedimiento químico, eléctrico o preferentemente óptico. La excitación óptica se aplica especialmente en el análisis sensorio de afinidad donde mediante el empleo de fluoróforos adecuados y la inmovilización de uno de los socios de la afinidad se detecta el enlace de la molécula de destino con sus correspondientes elementos de identificación. Para ello los socios de la afinidad inmovilizados pueden estar dispuestos bien de forma aislada como también empotrados en estructuras funcionales mayores hasta alcanzar células completas. Como ejemplos de tales análisis se pueden citar el diagnóstico humano, animal y vegetal, la analítica bioquímica, la investigación de mezclas de reacción para el control de procesos y la analítica del medio ambiente. Las muestras de analitos son preferentemente líquidos, y pueden realizarse sin problemas mediciones incluso en soluciones turbias. Las muestras de analito pueden ser por ejemplo yema de huevo, sangre, suero, plasma, líquidos de órganos internos (por ejemplo del sistema linfático) o extractos de plantas, extractos del suelo, muestras de agua o caldos de síntesis de procedimientos bioquímicos. El procedimiento permite por ejemplo la determinación cualitativa o cuantitativa (después del calibrado) de anticuerpos y antígenos, receptores o sus ligandos, oligonucleótidos, cadenas de DNA o RNA, análogos de DNA o RNA, enzimas, sustratos de enzimas, co-factores de enzimas o inhibidores, lectinas o hidratos de carbono. El procedimiento también es adecuado para una separación de afinidad durante la búsqueda y desarrollo de sustancias activas farmacéuticas o agroquímicas, para análisis en química combinatoria, para la genotipificación o fenotipificación y el análisis de mutación de proteínas y de cadenas de DNA o RNA.

La figura 1 ilustra una plataforma de sensores (1) realizada como placa de microtitrado con cuatro campos de sensores. Se trata en este caso de escotaduras de 2 \mum para alojamiento de una muestra de analito 3, y que se encuentran centrados entre cuatro retículas de desacoplamiento 4. Los campos de sensores están separados ópticamente mediante estructuras 16 de material absorbente de la luz.

La figura 2 representa un dispositivo de medición conforme a la invención. En este caso, 1 representa una plataforma de sensores realizada como placa de microtitrado cuyos campos de sensores se encuentran entre retículas de desacoplamiento 4 para la radiación luminiscente 5, 6. Las muestras de analito 3 se iluminan perpendicularmente a través del sustrato 7 y del estrato conductor de ondas 8 mediante rayos de luz de excitación 9. La radiación luminiscente que penetra en el entorno próximo en la guía de ondas 8 y que se propaga en la guía de ondas se conduce a través de las retículas de desacoplamiento 4 en forma de rayos discretos 6 a través de un filtro de espejo dicroico 10 al sistema óptico de reproducción 11, y desde allí a un dispositivo de detección 12 (cámara CCD o multiplicador fotográfico). Los rayos de excitación 9 se conducen a través de la superficie reflectante del espejo dicroico (10) de la muestra de analito (3). Los rayos de luz de excitación 9 proceden de una fuente de luz de excitación (láser 13). Los recipientes de la muestra están realizados como escotaduras de un estrato de recubrimiento 14 consiste en estratos intermedios 15 ópticamente transparentes de material absorbente de la luz situados en el entorno próximo de las retículas de acoplamiento 4, para evitar la diafonía óptica entre escotaduras contiguas. Junto a un estrato de recubrimiento absorbente 14 pueden estar aplicados directamente sobre el estrato conductor de ondas sobre la plataforma de sensores realizada como placa de microtitrado 1 y entre las escotaduras para analito contiguas, unas estructuras 16 de material absorbente de la luz (por ejemplo cromo), con el fin de evitar la diafonía óptica de la luz luminiscente 5 que se propaga por la guía de ondas 8.

El siguiente ejemplo describe la invención con mayor detalle.

Ejemplo

La eficacia del procedimiento de excitación en el volumen de una muestra de analito 3 se comprueba mediante un ensayo de hibridización de DNA. La guía de ondas se compone de vidrio Coming C7059 como material de soporte 7 y Ta_{2}O_{5} como estrato conductor de ondas 8 (espesor del estrato 150 nm) y contiene dos retículas de desacoplamiento 5 con una profundidad de modulación de aprox. 10 nm y un período de retícula de 320 nm. La escotadura para la muestra de analito se encuentra en el centro de las retículas, a una distancia de 5 mm. Para la inmovilización de los elementos de identificación de oligonucleótidos, la superficie conductora de ondas está silanizada mediante 3-Glycidoxipropil-trimetoxisilano en fase líquida (ortho-Xylol). El siguiente oligonucleótido está inmovilizado covalente como elemento de identificación sobre el estrato de silano funcionalizado con un espesor de recubrimiento típico del 10%: Amino-(grupo puente C6)-5'-CACAATTCCACACAAC-3'.

El enlace covalente del oligonucleótido tiene lugar a través del grupo libre amino del oligonucleótido y del grupo epoxídico del estrato de silano. Se inmoviliza con una concentración de oligonucleótido de 0,1 mM de oligonucleótido en 100 mM de solución tampón de bicarbonato, con un pH de 8,7.

Como determinación de un ensayo de enlace específico sirve la hibridización de un oligonucleótido complementario al elemento de identificación, alimentado durante 3 minutos en flujo continuo vía una solución tampón. El oligonucleótido de determinación también va marcado en el extremo 5' mediante el colorante fluorescente Cy5. La secuencia del oligonucleótido de determinación viene dada en la forma siguiente: By5-5'-GTTGTGTGGAATTGTG-3'.

El oligonucleótido complementario se aplica en cantidades crecientes desde 0,5 a 500 pM, donde antes de cada aplicación se regenera la superficie del sensor con NaOH (10 mM).

La superficie de excitación en la muestra de analito para la luz láser con una longitud de onda de 633 nm es de 0,5 mm^{2}, y la intensidad de la luz de excitación es de 2,4 mW. El recipiente para la muestra se ilumina desde el lado del sustrato con un ángulo de unos 45º respecto a la normal al sustrato. El dispositivo de iluminación forma también un ángulo de unos 45º respecto a la dirección de la luz desacoplada fluorescente 6 en una retícula de acoplamiento 5 (con un desacoplamiento casi perpendicular), y mantiene así en un nivel muy reducido (y con el correspondiente bajo nivel de ruido) la señal de fondo de la emisión gracias a las direcciones de excitación y de emisión opuestas así como a los lugares de excitación y emisión físicamente separados entre sí.

Para la determinación de la señal de respuesta óptica se indica la relación entre la señal neta (señal máxima del sensor menos señal de fondo en el tampón) respecto al ruido de fondo, en función de la concentración. El resultado de la medición está representado en la siguiente Tabla:

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TABLA

1

Las desviaciones estándar de los valores señal: ruido de tres series de medida, realizadas sucesivamente e independientes de la concentración son \leq 4%.

Claims

1. Procedimiento para la excitación y determinación de una luminiscencia en una muestra de analito (3) que está en contacto con el estrato conductor de ondas (8) de un conductor de ondas óptico estratificado, y en el que se conduce al dispositivo de medición (12) y se determina la radiación luminiscente generada en el entorno próximo a la superficie del estrato conductor de ondas (8), después de penetrar en dicho estrato conductor de ondas, caracterizado porque se genera la luminiscencia mediante una excitación no evanescente en el volumen de la muestra de analito (3), generándose la excitación no evanescente mediante uno de los medios siguientes: (a) electrodos, mediante los cuales se excita una luminiscencia mediante la aplicación de un campo eléctrico, (b) una combinación de productos químicos que genera una quimiluminiscencia, y (c) radiación directa no evanescente mediante luz.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la radiación luminiscente se genera mediante excitación eléctrica, química o radiación óptica.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como guía de ondas estratificada (3) se emplea una guía de ondas planar con elementos de desacoplamiento (4) para la luz luminiscente.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por emplearse una plataforma de sensores (1) que presenta una disposición unidimensional o bidimensional de por lo menos dos guías de ondas con elementos de desacoplamiento difractores (4).

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la plataforma de sensores está recubierta de un segundo estrato que en la zona de la luz luminiscente conducida contiene escotaduras para el alojamiento de una muestra de analito (3).

6. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la guía de ondas planar presenta uno o varios elementos para el desacoplamiento de la radiación luminiscente, y porque la muestra de analito (3) está dispuesta antes de uno o entre varios elementos de desacoplamiento (4).

7. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la radiación de excitación de la excitación de radiación óptica se dirige desde el lado opuesto del estrato conductor de ondas a través de una guía de ondas planar sobre una muestra de analito (3).

8. Dispositivo para la medición de luminiscencia generada por excitación en una muestra de analito (3), generándose la luminiscencia mediante la excitación no evanescente en el volumen de la muestra de analito (3), compuesto por

a): una guía de ondas óptica estratificada con un soporte transparente (7) y un estrato conductor de ondas (8) que puede ponerse en contacto con la muestra de analito;

b): una fuente de energía eléctrica u óptica que está dispuesta de tal modo que los electrodos de la fuente de energía se encuentran en contacto directo con la muestra de analito (3), o porque la radiación de excitación (9) de la fuente de energía óptica está dirigida directamente sobre la muestra de analito con un ángulo inclinado o recto, o un depósito que contiene un producto químico mediante el cual se excita una quimiluminiscencia en contacto con la muestra de analito; y

c): una unidad de detección optoelectrónica (12) para medir la radiación luminiscente (5, 6) generada por el efecto de un campo eléctrico o de una radiación de excitación o químicamente.

9. Dispositivo según la reivindicación 8, caracterizado porque las guías de ondas son guías de ondas planares que presentan por lo menos un elemento de desacoplamiento (4) para desacoplar la radiación luminiscente.

10. Dispositivo conforme a la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque la luminiscencia se genera mediante excitación no evanescente en el volumen de la muestra de analito (3), generándose la excitación no evanescente mediante electrodos con los cuales se genera una luminiscencia por la aplicación de un campo eléctrico.

11. Dispositivo según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque la luminiscencia se genera mediante una excitación no evanescente en el volumen de la muestra de analito (3), generándose la excitación no evanescente mediante una combinación de productos químicos que genera una quimiluminiscencia.

12. Dispositivo según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque la luminiscencia se genera mediante excitación no evanescente en el volumen de la muestra de analito (3), generándose la excitación no evanescente mediante una irradiación directa no evanescente mediante luz.