ES2331952T3

ES2331952T3 - Fraccion de quil a con baja toxicidad y su uso.

Info

Publication number: ES2331952T3
Application number: ES04749076T
Authority: ES
Inventors: Bror Morein; Karin Lovgren Bengtsson; Jill Ekstrom; Katarina Ranlund; Kefie Hu
Original assignee: Isconova AB
Current assignee: Isconova AB
Priority date: 2003-07-07
Filing date: 2004-07-07
Publication date: 2010-01-21
Anticipated expiration: 2024-07-07
Also published as: DK1648505T3; US20150320858A1; US20060239963A1; AU2004254152B2; PL1648505T3; US20240024468A1; BRPI0412444B8; US20180369368A1; ATE442164T1; JP4731475B2; US20160184427A1; US20200345840A1; BRPI0412444A; US20220241408A1; CA2529363C; EP1648505B1; US20140335049A1; ZA200600151B; EP1648505A1; DE602004023089D1

Abstract

Uso de la fracción A de Quil A integrada en una partícula iscom junto con al menos otro adyuvante con capacidad inmunomodulador en forma libre o integrado en otra partícula iscom distinta para la preparación de una composición adyuvante con efecto sinérgico que incluye el potenciamiento de las respuestas inmunes y la actividad inmunomoduladora, facilitando el uso del otro adyuvante, que cuando se usa solo puede ser tóxico en dosis que son eficaces.

Description

Fracción de Quil A con baja toxicidad y su uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de la fracción A de Quil A integrada en una partícula iscom junto con al menos otro adyuvante para la preparación de una composición adyuvante con efectos sinérgicos que incluyen el nivel de respuestas inmunes y la actividad inmunomoduladora.

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Técnica anterior

Existe una gran necesidad de sistemas de administración de adyuvantes y vacunas eficaces tanto para hombres como para animales a usar para inmunoprofilaxia o para inmunoterapia. Para las vacunas animales existen numerosos adyuvantes diferentes entre los que se incluyen vacunas adyuvadas con iscom y matriz de iscom. Sin embargo, únicamente los adyuvantes de hidróxido de aluminio y fosfato de calcio están comercialmente disponibles para vacunas humanas, y se ha registrado recientemente un adyuvante de emulsión en aceite (MF59) para una vacuna de gripe humana. De esta manera, existe una carencia de adyuvantes eficaces, particularmente para vacunas humanas. Los adyuvantes no son sólo importantes para potenciar el nivel de la respuesta inmune sino aún más para la calidad o tipo de respuesta inmune, que se debe corresponder con el tipo de infección contra la que se pretende que la vacuna proteja. Con respecto a los patógenos que se establecen por sí mismos en el interior de la célula al igual que los virus, pero también algunas bacterias y parásitos, se requiere una respuesta inmune del tipo denominado Th1 para una protección inmune óptima, y en muchos casos, una respuesta de tipo Th1 es un requisito previo para la protección inmune. Sin embargo, en la actualidad también se ha establecido, que un tipo de respuesta Th1 o Th2 puro puede producir efectos secundarios, debido a que se necesita un equilibrio entre los dos tipos de células T auxiliares para la regulación inmune. Es decir, la respuesta Th1 regula la respuesta Th2 por ejemplo mediante la producción de IFN-\gamma y la respuesta Th1 está regulada por la respuesta Th2 por ejemplo mediante la producción de la citoquina IL10. De esta manera, el equilibrio Th1-Th2 es esencial para evitar efectos secundarios. Para ser capaces de inducir el tipo correcto de respuesta inmune para la protección contra los diversos patógenos se requerirán numerosos adyuvantes. Una respuesta Th1 se refleja una por la respuesta de los anticuerpos IgG2a, y por tanto se usa como marcador de la respuesta Th1 de la célula t auxiliar. Un aspecto importante de los adyuvantes es la seguridad que incluye el hecho de que la respuesta inmune evocada debería tener una calidad que evite efectos secundarios cuando se produce una infección posterior tras la vacunación. Aparecieron efectos secundarios graves en el caso del virus respiratorio sincitial cuando una vacuna del virus respiratorio (VRS) inactivado con formalina adyuvada con hidróxido de aluminio se ensayó en niños hace aproximadamente 30 años. Los niños vacunados enfermaron y se produjo entre ellos un índice de mortalidad mayor tras la infección natural con VRS que en los niños no vacunados.

Toxicidad aguda o efectos secundarios han sido los riesgos principales en el uso veterinario y particularmente humano de las saponinas de Quillaja en las preparaciones de vacunas. Estos objetivos fueron sólo parcialmente conseguidos con éxito, las fracciones purificadas, por ejemplo, QA-21 (documento EP 0 362 279 B2) y las combinaciones de las fracciones A y C (documento WO 96/11711, patente de Iscotec se definieron químicamente, de hecho, en comparación con la "Quillaja Saponaria Molina", pero siguen produciendo cierta alguna toxicidad y efectos secundarios.

Ha resultados ahora que la fracción A de Quil A tiene baja toxicidad, y en una dosis baja potencia el nivel de respuestas inmunes y la capacidad inmunomoduladora de otros adyuvantes en dosis subóptimas, que cuando se usan por sí mismos pueden ser tóxicos o producir efectos secundarios en dosis eficaces. De esta manera, esto facilita el uso de otros adyuvantes que, cuando se usan por sí mismos, pueden ser tóxicos en dosis que son eficaces.

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Resumen de la invención

La presente invención es el uso de la fracción A de Quil A integrada en una partícula iscom junto con al menos otro adyuvante para la preparación de una composición adyuvante con efectos sinérgicos para potenciar el nivel de respuestas inmunes y actividad inmunomoduladora tal como se define en las reivindicaciones. (Esta invención se refiere especialmente al uso de la fracción A de Quil A en una composición que comprende partículas iscom en la que se integran diferentes fracciones de Quil A en diferentes partículas iscom y de matriz de iscom).

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Descripción de los dibujos

Fig 1-1

Una dosis elevada (50 \mug) de QHC en la matriz es tóxica, mientras que una dosis elevada de QWT en la matriz no es tóxica cuando se suplementa a OVA para potenciar la respuesta del anticuerpo en ratones Balb/C (véase el texto). Ambas formulaciones potencian respuestas similares de anticuerpos específicos contra OVA tal como se midió mediante ELISA tres semanas después de la segunda inmunización para la respuesta de IgG total (A) y en el subtipo IgG2a (B).

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Fig 1-2

Efectos sinérgicos de matriz-QWT y matriz-QHX cuando se suplementan a OVA para potenciar la respuesta del anticuerpo en ratones Balb/C (véase el texto). La dosis de matriz-QWT y matriz-QHC osciló como sigue en el grupo 1, sin QWT ni C; Gr. 2, 0,3 \mug QWT sin C; Gr. 3, 0,3 \mug QWT + 2 \mug C; Gr. 4, 10 \mug QWT sin C; Gr. 5, 10 \mug QWT 2 \mug C. La dosis de OVA fue de 10 \mug. Hubo 8 ratones por grupo, que se inmunizaron dos veces con 4 semanas de separación s.c con la formulación respectiva. Se midieron los títulos de anticuerpo mediante ELISA contra
OVA:

A IgG total 3 semanas después de la primera inmunización

B IgG2a 2 semanas después de la segunda inmunización

C IgG1 2 semanas después de la segunda inmunización

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Fig 2-1

Toxicidad de QWT y AC (es decir, 703) de las iscom del virus respiratorio sincitial (VRS) medida mediante el índice de supervivencia en ratones recién nacidos (1 semana de edad) tras una inyección intraperitoneal con 1 \mug de iscom (proteína). La relación proteína/saponina es 1/1.

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Fig 3-1

Respuesta de anticuerpos en ratones recién nacidos (1 semana de edad) y adultos tras una inmunización intraperitoneal y un refuerzo posterior después de 3 semanas con 1 \mug de iscom (proteína). La relación proteína/saponina es 1/1.

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Fig 4-1

Respuesta de las células T citotóxicas (CTL) tras una inmunización intraperitoneal con 1 \mug de iscom (proteína). La relación proteína/saponina es 1/1. Se recogieron las células de bazo 1 y 3 semanas después de la inmunización intraperitoneal.

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Fig 5-1

La matriz QWT es menos tóxica en células VERO (una línea celular de mono) que la matriz 703 y la matriz C tras la exposición durante 72 h en cultivo medido mediante la velocidad de crecimiento proporcional (%) en cultivos no expuestos. La matriz QWT es bien tolerada a todas las concentraciones ensayadas, es decir, hasta 1300 \mug. No se registró crecimiento en cultivos expuestos a 800 \mug de matriz 703 o 45 \mug de matriz QHC.

A.: Exposición de células VERO a la matriz QWT y a la matriz 703 tal como se indica.

B.: Exposición de células VERO a la matriz QHC tal como se indica.

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Fig 5-2

La matriz QWT es menos tóxica que la matriz C en células de bazo obtenidas de ratones tras la exposición durante 72 h en cultivo medida mediante la velocidad de crecimiento determinada mediante un procedimiento colorimétrico tal como se describe en el texto. La velocidad de crecimiento se compara con el crecimiento de las células de bazo en medio sólo o conjuntamente con mitógeno Con A.

A.: Exposición de células de bazo a la matriz QWT en dosis decrecientes de 10 a 1,25 \mug tal como se indica.

B.: Exposición de células de bazo a la matriz QHC en dosis decrecientes de 10 a 1,25 \mug tal como se indica.

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Figura 6

Esta figura muestra la preparación de las fracciones A, B y C mediante HPLC;

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Figura 7

Esta figura muestra el efecto sinérgico de matriz-QWT y matriz-QHC. Se inmunizaron grupos de 8 ratones hembras Balb/c s.c. en la base de la cola con 5 microgramos de ovoalbúmina (OVA) sola (Gr 1) o mezclada con matriz-A o matriz-C (Gr 3) respectivamente o una mezcla de matriz-A y matriz-C (Gr4). Los ratones se inmunizaron en las semanas 0 y 4, se tomaron muestras de suero en las semanas 3 (cebado) y 6 (refuerzo). Se ensayaron los sueros para los anticuerpos IgG o los subtipos (IgG1 e IgG2a) específicos del antígeno en ELISA La respuesta del anticuerpo a OVA (5 \mug) está muy potenciada por un combinación de Matriz-QWT y Matriz-QHC en comparación con el uso de cualquiera de las matrices en solitario. Concretamente, se potencia la respuesta de IgG2a. El potenciamiento (IgG e IgG2a) se demuestra 3 semanas después del cebado (7-1A y B) y dos semanas después del refuerzo (IgG, IgG1 e IgG2a), 7-2A, B y C).

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Figura 8

Esta figura muestra las respuestas del anticuerpo (IgG total e IgG2a) frente a OVA tras la inmunización con 5 mg de OVA sola (Gr1) o mezclada con QWT (Gr2) o mezclada con una combinación de QWT y TC (Gr3) o QWT y MFL (Gr4) respectivamente. El efecto sinérgico del adyuvante de QWT-Matriz junto con TC o MFL se demuestra para un inmunógeno semanal; OVA. Se deberían señalar tanto la magnitud de la respuesta de IgG (a) como particularmente un potenciamiento específico (inmunomodulación) del subtipo IgG2a (B).

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Figura 9-1

Esta figura muestra la respuesta del anticuerpo (IgG total) al TT (Toxoide del Tétanos) tras la inmunización con 2,5 Lf de TT sólo o con TC (1 ó 2 \mug) o una combinación de QWT y 0,2 \mug de TC (A tras la primera inmunización y B tras el refuerzo).

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Figura 9-2

Esta figura muestra la respuesta del anticuerpo (IgG2A) al TT (Toxoide del Tétanos) tras la inmunización con 2,5 Lf de TT sólo o con TC (1 ó 0,2 \mug) o una combinación de QWT y 0,2 \mug de TC (A tras la primera inmunización y B tras el refuerzo).

El efecto del adyuvante de la Toxina del Cólera (TC), medido en forma de respuesta del anticuerpo al Toxoide del Tétanos (TT), se potenció y moduló mediante la adición de Matriz-QWT. La respuesta de IgG tras la adición de Matriz-QWT a una baja dosis de TC (0,2 \mug) está en el mismo intervalo que la de 1 \mug de TC (fig. 9-1A y B) la respuesta de IgG2a (9-2A y B) está, sin embargo, muy potenciada, indicando un efecto modulador sinérgico de Matriz-QWT y TC.

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Figura 10-1

Esta figura muestra la respuesta del anticuerpo (IgG total) al TT (Toxoide del Tétanos) tras la inmunización con 2,5 Lf de TT sólo o con MFL (50 ó 10 \mug) o una combinación de QWT y 10 \mug de MFL (A tras la primera inmunización y B tras el refuerzo).

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Figura 10-2

Esta figura muestra la respuesta del anticuerpo (IgG2a) al TT (Toxoide del Tétanos tras la inmunización con 2,5 Lf de TT sólo o con MFL (50 ó 10 \mug) o una combinación de QWT y 10 \mug de MFL (A tras la primera inmunización y B tras el refuerzo).

El efecto del adyuvante del Monofosforil Lípido A (MFL), medido en forma de respuesta del anticuerpo al Toxoide del Tétanos (TT), está potenciado y modulado por la adición de Matriz-QWT. La respuesta de IgG tras la adición de Matriz-QWT a una dosis baja de MFL (10 \mug) es mayor que la de 50 y 10 \mug de MFL (fig 10-1). La respuesta de IgG2a (10-2) está muy potenciada, indicando un efecto modulador sinérgico de Matriz-QWT y MFL.

Descripción detallada de la invención

La invención es el uso de la fracción A de Quil A integrada en una partícula iscom junto con al menos otro adyuvante para la preparación de una composición adyuvante con efecto sinérgico para potenciar el nivel y la calidad de la actividad inmunomoduladora tal como se define en las reivindicaciones. Se refiere especialmente al uso de la fracción A de Quil A junto con uno o más adyuvantes diferentes en el que la fracción A tiene una baja y bien tolerada dosis que potencia sinérgicamente el efecto inmunopotenciador del adyuvante administrado simultáneamente, que por sí mismo es demasiado tóxico para uso profiláctico o clínico. Es decir, una dosis baja bien tolerada (subóptima por otra parte) del adyuvante administrado simultáneamente se vuelve eficaz y factible para el uso. De esta manera, los diferentes adyuvantes son preferiblemente aquellos que tienen una toxicidad sustancial, y cuya dosis se ha disminuido para que sean aceptados para uso profiláctico y clínico, pero también los adyuvantes que son débiles y no pueden potenciar por sí mismos niveles eficaces de respuestas inmunes o ejercer capacidad inmunomoduladora cualitativamente eficaz.

El al menos otro adyuvante se puede escoger preferiblemente entre las saponinas, que se producen naturalmente, o sus derivados, moléculas de saponinas sintéticas o semisintéticas derivadas del extracto de saponina bruta de Quillaja saponaria Molina; por ejemplo saponinas y fracciones de saponinas de Quil A, esqueleto de la pared celular, polímeros en bloque, por ejemplo, copolímeros en bloque hidrófilos, por ejemplo, CRL-1005, TDM (dimicolato de trehalosa), lipopéptidos, LPS y derivados de LPS, Lípido A de diferentes especies bacterianas y sus derivados, por ejemplo, monofosforil lípido A, muramil ditripéptido o sus derivados, variantes de CpG, variantes de CpGODN, inmunomoduladores animales humanos endógenos, por ejemplo, GM-CSF, IL-2, adyuvantes de toxinas bacterianas activas, naturales o modificados, por ejemplo toxina TC del cólera, y sus subcomponentes TCB y TCA1, toxina termolábil (TL) de E. coli, o toxina de Bordetella pertussis (BP) y los filamentos de hemaglutinina de BP.

Las fracciones de saponina de Quil A diferentes de la fracción A pueden ser las fracciones B y C descritas en el documento WO 96/11711, las fracciones B3, B4 y B4b descritas en el documento EP 0 436 620. Las fracciones QA1-22 descritas en el documento EP 0 3632 279 B2, Q-VAC (Nor-Feed, AS Dinamarca), Spikoside de Quillaja Saponaria Molina (Isconova AB, Uppsala Science, 75183 Uppsala, Suecia).

Se pueden usar las fracciones QA-1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19-20-21 y 22 del documento EP 0 3632 279 B2, especialmente, QA-7, 17-18 y 21. Éstas se obtienen tal como se describe en el documento EP 0 3632 279 B2, especialmente en la página 6 y en el Ejemplo 1 de las páginas 8 y 9.

Las fracciones A, B y C descritas en el documento WO 96/11711 se preparan a partir de la fracción lipófila obtenida mediante separación cromatográfica del extracto bruto acuoso de Quillaja Saponaria Molina y elución con acetonitrilo al 70% en agua para recuperar la fracción lipófila. A continuación se separa esta fracción lipófila mediante HPLC semipreparativa con elución usando un gradiente de entre 25% a 60% de acetonitrilo en agua ácida. La fracción denominada en el presente documento como "Fracción A" o "QH.A" es, o corresponde a, la fracción que se eluye a aproximadamente un 39% de acetonitrilo. La fracción denominada en el presente documento como "Fracción B" o "QH-B" es, o corresponde a, la fracción, que se eluye a aproximadamente un 47% de acetonitrilo. La fracción denominada en el presente documento como "Fracción C" o "QH-C" es, o corresponde a, la fracción, que se eluye a aproximadamente un 49% de acetonitrilo.

Preferiblemente el al menos otro adyuvante es el subfragmento C o B de Quil A.

En una forma de realización de la invención, el adyuvante de la fracción A de Quil A, denominado también en este texto como QWT y el al menos otro adyuvante se puede integrar en cada una de las diferentes partículas iscom o partículas de la matriz de iscom. De esta manera los adyuvantes se pueden integrar en cada partícula iscom diferente o partículas de la matriz de iscom diferentes y mezclarse a continuación en una composición.

La partícula iscom puede ser un complejo iscom o un complejo de la matriz de iscom preparado a partir de cualquier saponina. El adyuvante de la fracción A y el al menos otro adyuvante se pueden acoplar también en partículas iscom o partículas de la matriz de iscom diferentes o iguales, o uno o más de los adyuvantes se pueden mezclar con las partículas iscom.

Con el fin de integrarse en las partículas iscom, los adyuvantes necesitan tener alguna molécula hidrófoba. Los adyuvantes que no tienen moléculas hidrófobas pueden acoplarse a dichas moléculas. Se describen las moléculas hidrófobas y los procedimientos de acoplamiento en el documento EP 180564. Preferiblemente, los adyuvantes se integran en diferentes partículas iscom.

En otra forma de realización de la invención, el adyuvante de la fracción A de Quil A se integra en las partículas iscom, mientras que el al menos otro adyuvante no se integra en las partículas iscom y se usan en forma libre en la composición.

En otra forma de realización preferida el adyuvante de la fracciones de Quil A se integra en las partículas iscom o las partículas de la matriz de iscom, mientras que el resto de adyuvantes no se integran en las partículas iscom o las partículas de la matriz de iscom y se usan en forma libre en la composición.

En otra forma de realización especialmente preferida, la composición comprende la fracción A de Quil A integrada en las partículas iscom o las partículas de la matriz de iscom y al menos otro adyuvante, que no se integra en las partículas iscom o la partículas de la matriz de iscom.

En otra forma de realización preferida el al menos otro adyuvante es MFL o la toxina TC del cólera. El MFL o la toxina del cólera se pueden integrar en la misma partícula iscom o la partícula de la matriz de iscom o en cada diferente partícula iscom o partícula de la matriz de iscom. Preferiblemente, el MFL o las toxinas del cólera están en forma libre.

En otra forma de realización más preferida, la fracción A de Quil A se incorpora a una partícula iscom o partícula de la matriz de iscom y al menos otro adyuvante se incorpora a cada diferente partícula iscom o partícula de la matriz de iscom o el al menos otro adyuvante se incorpora a la misma partícula iscom o matriz de iscom pero en forma diferente a la partícula en la que se incorporó la fracción A de Quil A o el al menos otro un adyuvante está en forma libre.

Iscom contiene al menos un glicósido, al menos un lípido y al menos un tipo de sustancia antígena. El lípido es al menos un esterol tal como colesterol y opcionalmente también fosfatidil colina. Estos complejos pueden contener también una o más sustancias inmunomoduladoras (adyuvante-activo) y se pueden producir tal como se describe en los documentos EP 0 109 942B1, EP 0 242 380 B1 y EP 0 180 564 B1.

Una matriz de iscom comprende al menos un glicósido y al menos un lípido. El lípido es al menos un esterol tal como colesterol y opcionalmente también fosfatidil colina. Los complejos de iscom pueden contener también una o más de sustancias inmunomoduladoras (adyuvante-activo) diferentes, no necesariamente una saponina, y se pueden producir tal como se describe en el documento EP 0 436 620 B1.

En una formulación preferida, los iscom y la matriz de iscom se han formulado con la fracción A y C de Quillaja en diferentes partículas iscom, que producen efectos secundarios mínimos (véanse los ejemplos). Estos iscom se han comparado con una formulación que comprende un 70% de la fracción A y un 30% de la fracción C de Quil A denominada 703 y se produjeron de acuerdo con el documento WO 96/11711, que es un ensayo clínico en hombres de una vacuna del virus de la gripe humana. De acuerdo con el documento WO 96/11711 las fracciones A y C se integran en la misma partícula. El estudio de toxicidad se llevó a cabo en ratones recién nacidos, que son mucho más sensibles que los ratones adultos. El estudio muestra que los ratones recién nacidos toleran mejor los nuevos iscom producidos a partir de la fracción A de Quil A que la formulación 703. Además, la eficacia de las formulaciones de acuerdo con la invención se ensayó con los antígenos de un patógeno, es decir, el virus respiratorio sincitial humano VRSh y con un antígeno débil, es decir, ovoalbúmina (OVA). En el ejemplo 1 se muestra un efecto sinérgico de la fracción A de Quil A en una formulación de matriz denominada QWT. También se pueden modular antígenos potentes similares a la toxina del cólera (TC) y a la toxina del tétanos mediante formulaciones adyuvantes de acuerdo con la presente invención, potenciando el aumento del anticuerpo, pero sobre todo debido a una potente inmunomodulación tal como se describe en los ejemplos 8 y 9.

Una composición de acuerdo con la invención puede comprender el adyuvante de la fracción A de Quil A y el al menos otro adyuvante en cualquier relación ponderal peso. Preferiblemente, la fracción A de Quil A está entre 2-99,9% en peso, preferiblemente 5-90% en peso y especialmente 50-90% en peso, contado respecto de la cantidad total de adyuvantes. Para por ejemplo Al(OH)_{3}, adyuvantes de aceite y polímeros en bloque, la cantidad de la fracción A de Quil A puede ser sustancialmente inferior.

Una composición iscom preferida comprende un 50-99,9% del fragmento A de Quil A y un 0,1-50% del fragmento C y o la fracción B y/u otras fracciones o derivados de Quil A (a partir de ahora en el presente documento fracciones no A de Quil A) contado respecto al peso total de las fracciones A y fracciones no A de Quil A. Especialmente, la composición comprende un 70-99% del fragmento A de Quil A y un 0,1-30% de las fracciones no A de Quil A, preferiblemente un 75-99,9% del fragmento A de Quil A y un 0,1-25% de las fracciones no A de Quil A y especialmente un 80-99,9% del fragmento A de Quil A y un 0,1-20% de las fracciones no A de Quil A contado sobre el peso total de la fracción A y de las fracciones no A de Quil A. La composición más preferida comprende un 91-99,1% del fragmento A de Quil A y un 0,1-9% de las fracciones no A de Quil A contado sobre el peso total de las fracciones A y las fracciones no A de Quil A, especialmente un 98,0-99,9% de la fracción A y un 0,1-2,0% de las fracciones no A de Quil A contado sobre el peso total de las fracciones A y las fracciones no A de Quil A.

La composición puede comprender además un vehículo, diluyente, excipiente o aditivo farmacéuticamente aceptable. Para los objetivos de identificación de las Fracciones A, B, y C a las que se hace referencia en el presente documento, se puede hacer referencia al procedimiento de purificación del Ejemplo 1. En términos generales, en este procedimiento, las Fracciones A, B y C se preparan a partir de la fracción lipófila obtenida en separación cromatográfica del extracto bruto acuoso de Quil A y elución con acetonitrilo al 70% en agua para recuperar la fracción lipófila. A continuación se separa esta fracción lipófila mediante HPLC semipreparativa con elución usando un gradiente de entre 25% y 60% de acetonitrilo en agua ácida. La fracción denominada en el presente documento como "Fracción A" o "QH-A" es, o corresponde a la fracción, que se eluye a aproximadamente acetonitrilo al 39%. La fracción denominada en el presente documento como "Fracción B" o "QH-B" es, o corresponde a, la fracción, que se eluye a aproximadamente acetonitrilo al 47%. La fracción denominada en el presente documento como "Fracción C" o "QH-C" es, o corresponde a, la fracción, que se eluye a aproximadamente acetonitrilo al 49%.

Cuando se preparan tal como se describe en el presente documento, las Fracciones A, B y C de Quil A representan cada una grupos o familias de moléculas muy relacionadas químicamente con propiedades definibles. Las condiciones cromatográficas bajo las cuales se obtienen son tales que la reproducibilidad lote a lote en términos del perfil de elución y la actividad biológica es muy consistente.

Por la expresión "que comprende" los inventores entienden que incluye pero que no se limita a. Se describirá ahora la invención mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

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Ejemplo 1

En este experimento se enfatiza que ésta QWT en iscom y la matriz es bien tolerada y tiene una fuerte capacidad de inmunopotenciamiento e inmunomoduladora. Se usa ovoalbúmina debido a que es un antígeno débil y como tal no induce un tipo Th1 de respuesta. QWT se compara con QHC, debido a que se evalúa en ensayos clínicos humanos.

Materiales y métodos Formulación de los iscom de las matrices QHC, QWT y 703

Se preparó una mezcla de fosfatidil colina (PC) y colesterol (C) (15 mg/ml de cada) en MEGA-10 al 20% en agua. Se calentó la preparación a 60ºC y se trató con sonicación suave hasta que se solubilizó todo el lípido.

Se disolvió saponina de Quillaja a 100 mg/ml en agua. La mezcla 703 contiene 7 partes (en peso) de la Fracción A y 3 partes de la Fracción C.

La saponina de QWT contiene sólo la Fracción A.

Matriz-703. Se mezclaron 5 ml de PBS con 10 mg de la mezcla PC/C (667 microlitros), se añadieron 35 mg de 703 (350 microlitros), se mezcló la mezcla y se añadió PBS hasta un volumen total final de 10 ml. Se dializó la mezcla extensivamente usando un casette de diálisis Slide-A-Lyser (3-15 ml, Pierce).

Matriz-QWT y matriz-QHC. Se mezclaron 5 ml de PBS con 10 mg de cada PC y C (667 microlitros), se añadieron 40 mg de QWT (400 microlitros) y 30 mg de QHC (300 microlitros), respectivamente, se mezcló la mezcla y se añadió PBS hasta un volumen total final de 10 ml. Se dializó extensivamente la mezcla frente a PBS usando un casette de diálisis Slide-A-Lyser (3-15 ml, Pierce).

Diseño experimental

Se usaron en este ejemplo ratones MNRI hembra (18-20 g). El Grupo 1 estaba constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación subcutáneamente (s.c.) con 10 \mug de OVA adyuvada con 50 \mug de matriz de QWT. El Grupo 2 tenía el mismo número de ratones inmunizados mediante el mismo procedimiento pero el adyuvante eran 50 \mug de matriz de QHC. Se recogieron los sueros antes de la primera inmunización y 3 semanas después y dos semanas después del refuerzo.

Determinación de anticuerpos

Se determinaron las respuestas del anticuerpo en suero específicas de OVA mediante ELISA tanto para la respuesta de IgG total (que incluye todos los subtipos de IgG) como en los subtipos de IgG2a, tal como se describe anteriormente (Johansson, M y Lövgren-Bengtsson (1999) Iscoms with different quillaja saponin components differ in their immunomodulating activities. Vaccine 19, 2894-2900).

Resultados

Todos los ratones inmunizados con OVA adyuvada con matriz de QWT sobrevivieron y no desarrollaron ningún signo de malestar. De los 8 ratones inmunizados con OVA adyuvada con matriz de QHC, 4 ratones (50%) murieron.

No hubo diferencia significativa con respecto de anticuerpos totales (Fig 1-1A) pero existe más dispersión de los títulos de anticuerpo entre los animales del grupo 1, es decir, los ratones inmunizados con OVA adyuvada con matriz-QWT.

No hubo diferencia en el promedio de títulos en el subtipo IgG2a entre el grupo 1 y 2 (Fig 1-1B), pero existe más dispersión de los títulos de anticuerpo entre los animales del grupo 2, es decir, los ratones inmunizados con OVA adyuvada con la matriz-QHC.

En el segundo experimento de este ejemplo se exploró si la matriz de QWT puede beneficiarse de la complementación de otro adyuvante, o este facilita el uso de un adyuvante más tóxico. La respuesta de IgG2a refleja que están implicados los linfocitos de tipo Th2. La dosis de matriz-QWT y matriz-QHC osciló como sigue; en el grupo 1, sin matriz-QWT o matriz-QHC; Gr. 2, 0,3 \mu de matriz-QWT sin matriz-QHC; Gr. 3, 0,3 \mug de matriz-QWT + 2 \mug de matriz de QHC; Gr. 4, 10 \mug de matriz-QWT sin QHC; Gr. 5, 10 \mug de matriz-QWT + 2 \mug de matriz X-QHC. La dosis de OVA fue de 10 \mug. Hubo 8 ratones por grupo que se inmunizaron dos veces con 4 semanas de separación s.c. con la formulación respectiva. (Ejemplo 8 Fig 2A, B y C).

Se recogieron los sueros 3 semanas después de la primera inmunización y 2 semanas después del estímulo.

Se determinaron las respuestas del anticuerpo en suero específicas de OVA mediante ELISA para una respuesta de IgG total y en los subtipos IgG2a e IgG1 tal como se describe (Johansson, M y Lövgren-Bengtsson (1999). Iscoms with different quillaja saponin components differ in their immunomodulating activities. Vaccine 19, 2894-2900).

Resultados

Tras la primera inmunización no se registró respuesta de anticuerpos en los ratones que recibieron OVA no adyuvada u OVA adyuvada con 0,3 \mug de matriz de QWT con o sin 2 \mug de matriz de QHC (Fig 1-2A).

Tras la segunda inmunización, se detectó una respuesta baja en 3 de los 8 ratones inmunizados con OVA no adyuvada en el subtipo IgG1 (Fig 1-2B), pero no se registró respuesta en el subtipo IgG2a con las dosis de adyuvante más bajas de la matriz de QWT, es decir, 0,3 \mug con y sin 2 \mug de matriz de QHC (Fig 1-2B). Hubo un potenciamiento claro de la respuesta del anticuerpo en el subtipo IgG2a, cuando se añadió la dosis baja de 2 \mug de matriz de QHC a los 10 \mug de la matriz de QWT (Fig 1-2B).

Conclusión

QWT tiene una toxicidad baja y todavía un fuerte efecto modulador tal como se muestra, estimulando un tipo de respuesta TH1 fuerte, a diferencia de la OVA no adyuvada o muy poco adyuvada, que estimuló únicamente la respuesta del anticuerpo en el subtipo IgG1. Se muestran también las sinergias de la matriz de QWT con una dosis baja de la matriz de QHC. Este hecho es importante, porque QWT consigue optimizar el efecto del adyuvante y minimiza los efectos secundarios de otros adyuvantes.

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Ejemplo 2

El virus respiratorio sincitial (VRS) es un patógeno principal para niños pequeños (VRSh) pero también para personas mayores. Un virus muy relacionado (VRSb) es un patógeno de terneros jóvenes que produce una enfermedad grave y elevadas pérdidas económicas para los criadores de terneros. Las proteínas de la envoltura del VRSh se seleccionaron como antígenos modelo, debido a que representan antígenos procedentes de un patógeno para el cual existe carencia de vacuna y para el cual existe una gran necesidad. El ratón recién nacido representa un modelo para el animal recién nacido y muy sensible, que requiere una formulación de vacuna virtualmente libre de efectos secundarios, y un modelo en el que se pueden medir reacciones inmunológicas importantes debido a las técnicas de reactivos disponibles. Se ensayó en niños una vacuna temprana contra VRSh, pero no protege contra la enfermedad. Por el contrario, ésta agravó la enfermedad cuando se produjo una infección natural posterior. En este experimento los inventores seleccionaron 703 como un componente de quillaja en el ISCOM para comparar con la presente invención, debido a que la formulación de vacuna 703 es para ensayos en seres humanos y por tanto, una candidata para vacunas humanas. En el presente experimento se comparó la toxicidad de los iscom de QWT y los iscom de 703.

Materiales y métodos Formulación de los ISCOM-VRS de 703 y QWT

Se prepararon los ISCOM de VRS con diferentes composiciones de saponina de Quillaja (A, C y AC, es decir, ISCOPREPTM703) a partir de VRSH purificado en gradiente de sacarosa, usando esencialmente el procedimiento descrito anteriormente [17, 18]. De manera breve, se solubilizaron 2 ml (1,6 mg/ml) de VRS purificado con OG (1-O-n-Octil-b-D-glucopiranósido, C14H28O6, Boehringer, Mannheim, GmbH, FRG) a una concentración final del 2% (p/v) durante 1 h a 37ºC con agitación constante. El virus solubilizado se aplicó en un gradiente discontinuo de sacarosa de 2 ml de una capa de sacarosa al 20% que contenía OG al 0,5%, sobre una almohadilla de sacarosa al 50%. Tras la centrifugación a 210.000 g a 4ºC en un rotor Kontron TST-41 durante 1 h, se recogió el volumen de muestra junto con la capa de sacarosa al 20% que contenía las proteínas víricas y los lípidos extra, es decir, el colesterol y la fosfatidil colina, y la saponina de Quillaja, es decir, QH-A o QH-C, o se añadió ISCOPREPTM703 en las proporciones de proteína: colesterol: fosfatidilcolina: saponina de Quillaja = 1:1:1:5 calculado en peso. Tras diálisis extensiva frente a acetato de amonio 0,15 M a 4ºC durante 72 h, se purificaron los ISCOM mediante centrifugación a través de sacarosa al 10% a 210.000 g en un rotor Kontron TST-41 a 10ºC durante 18 h. Se volvió a suspender el residuo que contenía los iscom en 200 \mul de PBS. Se determinó la concentración de proteína mediante el análisis de aminoácidos (Aminosyraanalyslaboratoriet, Uppsala, Suecia). Las muestras se sometieron al microscopio electrónico de tinción negativa. No se observaron diferencias morfológicas entre los tres iscom. Todos mostraron estructuras iscom típicas, es decir, partículas esféricas de tipo jaula con un diámetro de alrededor de 40 nm. Los antígenos de VRS y las estructuras iscom se encontraron en la misma fracción de un gradiente de sacarosa tras la centrifugación.

Diseño experimental

Una camada de al menos 7 ratones recién nacidos (una semana de edad) por grupo se inyectó intraperitonealmente (i.p.) una vez con bien una formulación de iscoms de 703 o bien iscoms de QWT. Los grupos de dosis de cada componente de quillaja oscilaron entre 0,11 \mug y 1 \mug medidos en forma de contenido de proteína (Fig 2-1). La relación en peso de proteína QWT o 703 (saponina de quillaja) es 1/1. Se observaron las crías durante 15 días después de la inyección i.p. Debería señalarse que la inyección i.p. es un modo grosero de administración y los ratones son mucho más sensibles para la inyección i.p. que para los modos de administración intramuscular y subcutáneo.

Resultados

Dosis de 0, 66 y 1 \mug con mataron un 65 y un 50% respectivamente de los ratones inyectados con los iscom de 703, mientras que todos los ratones inyectados con los iscom de QWT sobrevivieron, incluyendo aquellos que recibieron 1 \mug de iscom de QWT.

Conclusión

El iscom de QWT es bien tolerado incluso mediante una ruta violenta tal como la ruta i.p. en un modelo animal muy sensible. Es mejor tolerado que como formulación en ensayos con seres humanos.

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Ejemplo 3

En este ejemplo se ensayó la respuesta del anticuerpo en suero con las proteínas G y F de la envoltura del VRSh como modelo para el antígeno de la vacuna. Se seleccionaron los antígenos del VRSh porque VRSh representa procedentes de un patógeno para el cual se carece de vacuna y de la cual existe una gran necesidad. Los ratones recién nacidos representan un modelo de los recién nacidos, que son inmunológicamente inmaduros requiriendo un sistema adyuvante con una potente capacidad inmunomoduladora (documento WO 97/30727). Además, un ratón recién nacido representa un sistema animal, que es muy sensible y requiere una formulación de vacuna virtualmente libre de efectos secundarios. Se ensayaron formulaciones de vacuna similares tal como se describe en el ejemplo 2, es decir, los iscom de QWT y de 703.

Materiales y métodos Formulación de los iscom-VRS de QWT y de 703

Véase el ejemplo 2.

Diseño experimental

Se distribuyeron ratones de una semana de edad y ratones adultos (BALB/C) en 2 grupos de recién nacidos y 2 grupos de adultos. Una camada de recién nacidos con un mínimo de 7 animales por grupo y 8 adultos se inmunizaron i.p. con 1 \mug de VRSh en la formulación de los iscom de QWT o en los iscom de 703. Un grupo de ratones recién nacidos y 1 grupo de adultos fueron inmunizados una vez, mientras que un grupo de ratones recién nacidos y un grupo de adultos se sometieron a refuerzo 3 semanas después de la primera inmunización con las mismas formulaciones de la misma manera. Todos los experimentos se repitieron una vez.

Se recogieron los sueros antes del refuerzo y en la semana 7 de vida, es decir, 3 semanas después del refuerzo. Debido al pequeño tamaño de los recién nacidos, se combinaron los sueros de un grupo.

Determinación de anticuerpos

Se determinaron las respuestas de anticuerpos en suero específicas de VRS mediante ELISA en ambos subtipos IgG1 e IgG2a tal como se describe usando 0,1 \mul de virus VRS muerto con formalina como antígeno de recubrimiento (Johansson, M y Lövgren-Bengtsson (1999) Iscoms with different quillaja saponin components differ in their immunomodulating activities. Vaccine 19, 2894-2900).

Resultados

En la Fig 3-1 se ilustran los resultados. Tras una inmunización, tanto los adultos como los recién nacidos respondieron con anticuerpos de IgG1 específicos de VRS medidos mediante ELISA. Tras una inmunización, los iscom de QWT indujeron una respuesta mayor del anticuerpo de IgG1 específico de VRS en el recién nacido que en el iscom de 703. Por otra parte, no existen diferencias claras entre las dos formulaciones iscom con respecto a su capacidad para inducir respuestas de los anticuerpos de IgG1 e IgG2 específicos de RSV en adultos o en recién nacidos. Los títulos de anticuerpo en general, fueron 10 veces mayores en los adultos que en los recién nacidos. La respuesta de IgG2a a VRS fue insignificante tras una inmunización en recién nacidos sin tener en cuenta que fueran inmunizados con los iscom de QWT o de 703. Se detectaron claramente las IgG2a específicas de VRS tras una inmunización en adultos.

Conclusión

Las respuestas del anticuerpo en suero fueron al menos tan altas tras 1 como tras 2 inmunizaciones de los recién nacidos o los adultos con la formulación iscom de QWT siguiendo los mismos calendarios de inmunización con el iscom de 703. A la vista de los resultados del ejemplo 2, que muestra que el iscom de QWT tiene una toxicidad considerablemente inferior que el iscom de 703, se prefiere el iscom de QWT para la formulación de la vacuna.

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Ejemplo 4

Los linfocitos T citotóxicos (LTC) son esenciales para la defensa inmune frente a los patógenos intracelulares. Casi todas las células infectadas con virus son dianas de los LTC matando las células infectadas. En consecuencia los LTC son un arma importante de la defensa inmune frente a las infecciones víricas. Este ejemplo muestra que los iscom de QWT que contienen los antígenos de la envoltura de VRSh inducen específicamente y ceban eficazmente la memoria de los LTC en ratones recién nacidos y adultos. Es sorprendente que los iscom de QWT indujeran la memoria de los CTL tan eficazmente en recién nacido como en adultos a la vista de su sistema inmune inmaduro.

Materiales y métodos Formulación de los iscom de VRS en QWT y de 703

Se prepararon los ISCOM de QWT y de 703 tal como se describe en el ejemplo 2.

Animales y diseño experimental

Se usó una camada de recién nacidos con al menos 7 animales para cada experimento. (8 ratones adultos BLB/C (H-2Kd)). Se llevó a cabo cada experimento dos veces. Se inyectaron ratones de una semana de edad o ratones adultos i.p. con 1 \mug de iscoms de QWT. Una semana resp. de 3 semanas después de la inmunización, se cultivaron in vitro células de bazo (células efectoras) (vueltas a estimular) durante 6 días con fibroblastos-(BCH4) infectados con VRSH (células diana). La relación de efector/diana (E/D) osciló entre 2 y 100 (Fig 4-1). Se midió la lisis de las células diana mediante la liberación de Cr51 y se expresó en forma de % de lisis específica (% de LE) de acuerdo con el procedimiento estándar. Se midió el 100% de lisis como liberación de Cr51 a partir de las células tratadas con detergente. El fondo fue la lisis producida por los fibroblastos sin infectar (BC) (véase la Fig 4-1).

Resultados

Alrededor de 1 semana después del cebado de los ratones recién nacidos y adultos con los iscom de QWT, sus esplenocitos generaron reestimulación in vitro con una fuerte respuesta de las células T citotóxicas a los fibroblastos infectados con VRSh (BCH4) ((Fig 4-1). No se observó lisis frente a las células diana sin infectar (BC en la Fig 4-1).

Conclusión

Los iscom de VSR-QWT inducen fuertes respuestas de las células T citotóxicas en ratones de 1 semana de edad y en ratones adultos. Se observó fuerte citotoxicidad específica aproximadamente 1 semana después de una inmunización. A la vista del fuerte efecto adyuvante de los iscom de QWT y de su baja toxicidad, es muy probable que esta dosificación de la vacuna y el sistema adyuvante sean valiosos para las vacunas en seres humanos y animales.

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Ejemplo 5

Se ha demostrado que las saponinas de quillaja tienen fuertes efectos adyuvantes, pero han producido efectos secundarios debido a sus propiedades líticas, que se pueden medir mediante la lisis de los glóbulos rojos de la sangre. Los efectos tóxicos de cualquier tipo evitan el crecimiento celular o la proliferación de células vivas. Está bien establecido que QHC y las saponinas de quillaja menos purificadas de tipo Quil A lisan los glóbulos rojos de la sangre (Rönnberg B, Fekadu M y Morein B, Adjuvant activity of non-toxic Quillaja saponaria Molina components for use in iscom matrix, Vaccine, 1995 13, (14): 1375-82.). Está también claro que el efecto lítico de las saponinas de quillaja produce reacciones locales cuando se inyectan. Una manera de evitar los efectos líticos de las saponinas es incluirlas en matrices de ISCOM. Además, se pueden reducir los efectos secundarios mediante la selección de la saponina de quillaja, que produce comparativamente un efecto secundario bajo. En este ejemplo, se ensayo el efecto de la matriz de QWT en células VERO, que es una línea celular de primates, y se comparó con las formulaciones de matriz de QHC y de 703. En un segundo experimento, se expusieron células de bazo de ratones a las matrices de QWT y QHC. Las células de bazo son representativas del sistema linfático, esencial para la inducción de las respuestas inmunes. Se usó el ensayo alamar-
Blue, que mide cuantitativamente la proliferación de las células basándose en la detección de la actividad metabólica.

Material y métodos

Células y crecimiento celular. Se cultivaron células Vero en medio RPMI 1640 (National Veterinary Institute Uppsala Suecia) suplementado con suero de ternero fetal al 7% (obtenido como anteriormente). Tras crecimiento en matraces de 75 cm^{2} (Coming-Costar, Acton MA, EE.UU.) las células se despegaron de la superficie plástica y se diluyeron de 25 a 30.000 por ml, y se distribuyeron en porciones de 100 \mul por pocillo en placas de cultivo celular de 96 pocillos (Nunc A/S, Roskilde, Dinamarca). Los cultivos se incubaron en atmósfera de CO_{2} durante 24, 48 y 72 horas. Las matrices preparadas con QWT, o 703 o QHC se diluyeron en medio de 0 a 1300 \mug por ml. Los cultivos celulares se vaciaron del medio y se añadieron las diluciones de la matriz a los pocillos. Como control se usó medio únicamente. Se llevó a cabo el ensayo con las formulaciones que se iban a ensayar durante periodos de incubación de 24, 48 y 72 horas. El periodo de tiempo más adecuado fue de 72 horas, que es el que se presenta aquí. Los controles se consideran como 100% de crecimiento.

Registro del crecimiento celular. Se usó el ensayo AlamarBlue (Serotec Ltd, Oxford Reino Unido), que mide cuantitativamente la proliferación de células basándose en la detección de la actividad metabólica de acuerdo con la descripción del fabricante.

Resultados

Después de 72 horas de incubación de los cultivos celulares con la matriz de QWT a una concentración de 1300 \mug por ml, se registró un crecimiento celular del 80% en comparación con los cultivos control, mientras que el crecimiento celular había declinado hasta un 0% cuando se expusieron a la matriz de 703 a una concentración de 800 \mug por ml. El crecimiento celular había declinado hasta un 0% cuando se expuso a la matriz de QHC a una concentración de 40 \mug por ml. La Fig 5-1 ilustra un experimento de 3 con resultados similares.

Conclusión

La matriz de QWT es bien tolerada por las células y tiene un efecto tóxico celular muy bajo.

En un segundo experimento se expusieron células de bazo a las matrices de QWT y de QHC

Material y métodos

Células y crecimiento celular. Se cultivaron células de bazo de ratones Balb/C en medio RPMI 1640 (National Veterinary Institute, Uppsala, Suecia) suplementado con suero de ternero fetal al 7% en placas de cultivo celular de 96 pocillos (Nunc, Roskilde Dinamarca). Se llevó a cabo el ensayo en las células de bazo con las formulaciones iscom-QWT e iscom-QHC durante periodos de incubación de 24, 48 y 72 horas. El periodo más adecuado fue de 72 horas, que es el que se presenta aquí. Los controles se consideran como 100% de crecimiento.

Registro del crecimiento celular. Se usó el Ensayo alamarBlue, que mide cuantitativamente la proliferación de las células basándose en la detección de la actividad metabólica de acuerdo con la descripción del fabricante.

Resultados

Después de 72 horas de exposición de los cultivos de células de bazo a la matriz de QWT a una concentración de 10 \mug por ml, se registró un crecimiento celular del 80% en comparación con los cultivos de células de bazo no expuestos (control), mientras que el crecimiento celular había declinado cerca del 0% cuando se expusieron a la matriz de QVC
a una concentración de 2 \mug por ml (Fig 5-2A y B). La Fig 5-2 1 ilustra un experimento de 3 con resultados similares.

Preparación de saponinas del subfragmento de Quillaja Saponaria Molina

Purificación del extracto bruto de Quillaja Saponaria Molina en las fracciones A, B y C.

Una solución de extracto bruto de corteza de Quillaja en agua (0,5 g/ml) se pretrató en una columna sep-pak (Waters Associates, MA).

El pretratamiento implica el lavado de la columna sep-pak cargada con acetonitrilo al 10% en agua ácida con el fin de eliminar las sustancias hidrófilas. A continuación se eluyeron las sustancias lipófilas que incluyen QH-A, QH-B y QH-C mediante acetonitrilo al 70% en agua.

A continuación se separó la fracción lipófila procedente de la columna sep-pak mediante una columna de HPLC semipreparativa (CT-sil, C8 10 X 250 mm, Chrom Tech, Suecia).

Se eluyó la muestra a través de la columna mediante un gradiente de acetonitrilo de 25% a 60% en agua ácida. Se recogieron tres fracciones procedentes de la columna de HPLC durante la separación. Los residuos, tras la evaporación de estas tres fracciones constituyen QH-A, QH-B y QH-C.

Las fracciones designadas QH-A, QH-B y QH-C se eluyeron a aproximadamente a 39, 47 y 49% de acetonitrilo respectivamente. En la Figura 6 se muestran el perfil y las condiciones exactas de elución.

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Ejemplo 6

OVA es un antígeno débil que requiere adyuvante para la inducción de una potente respuesta inmune.

Los adyuvantes potenciales son, por tanto, ensayados a menudo conjuntamente con OVA para demostrar cuantitativamente el inmunopotenciamiento midiendo el nivel de anticuerpo o cualitativamente midiendo el efecto inmunomodulador. El efecto modulador, por ejemplo, se registra mediante la capacidad de estimular respuestas del subtipo IgG específicas del antígeno. Una respuesta dominada por el anticuerpo IgG1 es significativa de Th2 mientras que IgG2a es significativa de la respuesta del tipo Th1 de. Una respuesta en IgG1 e IgG2a implica el equilibrio de la modulación inmune entre Th1 y Th2. Este ejemplo se llevó a cabo para demostrar que la Matriz-QWT actúa sinérgicamente con la Matriz-QHC más tóxica para permitir el uso de una dosis comparativamente baja y bien tolerada de Matriz-QHC con efecto optimizado.

Materiales y métodos Matriz-QHC y QWT

Estos componentes de saponina de Quillaja (véase el Ejemplo 5) se obtuvieron y formularon en la Matriz-ISCOM tal como se describe en el Ejemplo 1. Se obtuvo la ovoalbúmina (OVA) de Sigma (San Luis, EE.UU.).

Diseño experimental

Se inmunizaron todos los ratones s.c. en la base de la cola con un volumen total de 100 \mul. Grupo 1, constituido por 8 ratones Balb/c inmunizados dos veces con 4 semanas de separación, con 5 \mug de OVA sin adición de adyuvante. Grupo 2, constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación, con 5 \mug de OVA adyuvada con 6 \mug de Matriz-QWT. Grupo 3, constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación con 5 \mug de OVA adyuvada con 6 \mug de matriz-QHC. Grupo 4, constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación con 5 \mug de OVA adyuvada con una dosis baja de Matriz-QHC (2 \mug) suplementada y suplementada con 6 \mug de Matriz-QWT.

Se recogieron los sueros antes de la primera inmunización y 3 semanas después del cebado y dos semanas después del refuerzo.

Determinación de anticuerpos

La determinación de anticuerpos en suero, incluyendo el IgG total, y los subtipos IgG1 e IgG2a, se llevó a cabo en ELISA tal como se describe en el ejemplo 1.

Resultados

Tras el cebado (fig. 7-1), hubo una respuesta de IgG sobre 1:1000 en 1 de 8 ratones inmunizados con OVA + Matriz-QWT (grupo 2), en 2 de 8 ratones del grupo inmunizado con OVA + matriz-QHC (Grupo 3). Por el contrario, los 8 ratones del grupo inmunizado con una dosis baja de matriz-QHC complementada con Matriz-QWT (Grupo 4) respondieron con una respuesta de IgG. Ninguno de los ratones inmunizados sólo con OVA respondió con un título > 1:100 tras la inmunización primaria.

Tras el cebado, 2 de los 8 ratones del grupo inmunizado con la combinación de Matriz-QWT y una dosis baja de matriz-QHC (Grupo 4) respondieron con una respuesta de IgG2a específica del antígeno > 1:100. No se registro respuesta de IgG2a tras el cebado en los otros grupos.

Tras el refuerzo (fig. 7-2), todos los ratones en los grupos 2,3 y 4 respondieron con títulos de IgG > 1:100. Sin embargo, los títulos en el Grupo 2 y el Grupo 3 variaron en 2 logs (3700-295.000 y 3.100-400.000 respectivamente), mientras que los títulos en el grupo 4 variaron comprendidos dentro de 1/10 de un log (260.000-350.000).

Los resultados de IgG1 tras el cebado se reflejaron por la respuesta de la IgG (total). De esta manera, estos resultados no se representan gráficamente mediante una figura. La respuesta de IgG2a específica del antígeno fue despreciable en el Grupo 2 dado OVA + Matriz-QWT. Los Grupos 1 y 3 mostraron respuestas variables del subtipo IgG2a mientras que en el Grupo 4, dados OVA + Matriz-QWT y 2 \mug de matriz-QHC todos respondieron con títulos de IgG2a altos, todos comprendidos dentro de un log.

Conclusión

La Matriz-QWT en una dosis baja es bien tolerada y sin efectos secundarios mensurables en la dosis usada en este ejemplo, pero es también tolerada en dosis mayores muchas veces tal como se muestra en el ejemplo 1. En este ejemplo se usó la Matriz-QHC en una dosis baja y bien tolerada pero subóptima para uso adyuvante por sí misma. Está claramente documentado en este experimento que la Matriz-QWT y la Matriz-QHC actúan sinérgicamente en una formulación adyuvante bien tolerada. Debería enfatizarse que ambas dosis de la Matriz-QWT y la Matriz-QHC, tal como se usan en la formulación combinada en este ejemplo, son demasiado bajas para ser efectivas por sí mismas, lo que implica sinergia.

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Ejemplo 7

En este experimento se ensayó el efecto sinérgico de la Matriz-QWT sobre compuestos derivados de un potente adyuvante activo bacteriano: monofosforil lípido A(MFL) y la Toxina del cólera (TC). Se evaluó con respecto al potenciamiento de la inmunogenicidad del antígeno débil, OVA. Se usaron ratones NMRI genéticamente heterogéneos, que a diferencia de los ratones Balb/C responden fácilmente con el tipo TH 1 así como con TH2 de inmunidad reflejada por lo niveles de anticuerpos IgG2a (Th1) e IgG1 (Th2).

Materiales y métodos Iscoms-QWT de OVA

Estos ISCOMS se prepararon esencialmente tal como se describe para la Matriz-QWT en el ejemplo 1, con la excepción que se añadió a la preparación OVA palmitificada (pOVA) a una concentración de 1 mg por mg de colesterol. Se ha descrito la preparación de iscoms-pOVA por Johansson y Lövgren-Bengtsson en Vaccine 17 (1999), p 2894. TC se obtuvo comercialmente de Ke-Lab, Gotemburgo, Suecia. MFL (L6895) y OVA fue de Sigma (San Luis, EE.UU).

Diseño experimental

Todos los ratones se inmunizaron s.c. en la base de la cola con un volumen total de 100 \mul. El Grupo 1 estaba constituido por 8 ratones NMRI inmunizados dos veces, con 4 semanas de separación con 5 \mug de OVA sin adición de adyuvante. El Grupo 2 estaba constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación con 5 \mug de OVA incorporada en iscoms-QWT que contenían 6 \mug de QWT y sin adyuvante adicional. El Grupo 3 estaba constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación con 5 \mug de OVA (como en el grupo 1) adyuvada con una dosis alta de TC (1 \mug). El Grupo 4 estaba constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación con 5 \mug de OVA (como en el grupo 1) adyuvada con una dosis alta de MFL (50 \mug). El Grupo 5 estaba constituido por 8 ratones inmunizados con 5 \mug de OVA en ISCOMs-QWT (como en el grupo 2) suplementada con una dosis baja (0,2 \mug) de TC. El Grupo 6 estaba constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación con 5 \mug de OVA en iscoms-QWT (como en el grupo 2) adyuvada con una dosis baja (10 \mug) de MFL.

Se recogieron los sueros 3 semanas después del cebado y dos semanas después de la inyección de refuerzo.

Determinación de anticuerpos

Se llevó a cabo la determinación de anticuerpos en suero, incluyendo IgG total, y los subtipos IgG1 e IgG2a en ELISA tal como se describe en el ejemplo 1.

Resultados

En la Figura 8 se representan gráficamente los resultados.

Tras la primera inmunización, los niveles de IgG totales fueron comparables a los de los grupos 2 a 6 y la respuesta del anticuerpo IgG2a a OVA fue baja para los ratones en todos los grupos (no se muestra)

Tras el refuerzo (Fig 8A) los ratones inmunizados sólo con OVA reaccionaron con bajos niveles de IgG en suero. OVA en ISCOM-QWT suplementados con una dosis baja de TC (0,2 \mug) indujo niveles de IgG mayores de 7 veces que los de OVA adyuvada con una dosis alta (1 \mug) de TC. OVA en ISCOM-QWT suplementada con una dosis baja de MFL (10 \mug) indujo niveles de IgG mayores de 2 veces que la OVA adyuvada con una dosis alta (50 \mug) de MFL.

IgG1 se reflejó esencialmente por las respuestas de los anticuerpos IgG totales, y no se muestran.

Se registraron mayores diferencias cuando se midió las respuestas de los anticuerpos comprendidas dentro del subtipo IgG2a (Fig 8 B). Se potenció la dosis baja de de MFL aproximadamente 10 veces en los niveles del anticuerpo IgG2a en suero con OVA en una formulación de ISCOM-QWT en comparación con la OVA adyuvada con la dosis alta de MFL. Es más notable incluso el potenciamiento de 100 veces de la respuesta de IgG2a por el ISCOM-QWT-OVA con una dosis baja de TC en comparación con la OVA formulada con una dosis alta de TC.

Conclusión

OVA en ISCOM-QWT formulada con una dosis baja de TC o MFL fueron considerablemente más inmunogénicos que las formulaciones a altas dosis de MFL o TC correspondientes excluyendo QWT. El potenciamiento de ISCOM-QWT de la inmunogenicidad de OVA fue más notable en el subtipo IgG2a que muestra fuertes efectos inmunomoduladores del componente QWT en las formulaciones respectivas. Aunque la modulación Th1 fue más notable que la de Th2, la modulación engranada por ISCOM-QWT fue equilibrada. El efecto estimulante de Th1 fue más prominente sobre TC, lo que se explica por el hecho de que TC es más estimulante que la Th2 de MFL.

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Ejemplo 8

Las vacunas están a menudo compuestas por antígenos en formas particuladas como es a menudo el caso de las vacunas contra bacterias o virus. Las toxinas, por otra parte, son antígenos solubles detoxificados mediante conversión a toxoides, por ejemplo, mediante tratamiento con formalina. En el ejemplo 1 (Figs. 1-2A, B y C) y en los ejemplos 6 y 7 se muestra que la inmunogenicidad del antígeno OVA soluble débil está fuertemente potenciada por el efecto sinérgico de la Matriz-QWT, cuando se usa la Matriz-QWT para complementar una dosis baja y bien tolerada de Matriz-QHC, TC o MFL.

En este ejemplo, un antígeno de vacuna comercial soluble pero inmunogénico, el Toxoide del Tétanos (TT) está suplementado con la Toxina del Cólera (TC) siendo un fuerte adyuvante que estimula una respuesta de tipo Th2, pero también tóxico en dosis comparativamente bajas. Incluido en este ejemplo está también un grupo de ratones inmunizados con TT y adyuvados con TC complementado con la Matriz-QWT. La Matriz-QWT se añade para demostrar que se puede conseguir la modulación de la respuesta de TC con una dosis baja de TC y que se puede obtener una formulación TC/QWT bien tolerada, que es bien tolerada debido a un efecto sinérgico.

Materiales y métodos Matriz-QWT

Se formuló la Matriz-QWT tal como se describe en el Ejemplo 1.

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TT y TC

TT se obtuvo comercialmente del The State SERUM Institute, Copenhague, Dinamarca.

TC se obtuvo comercialmente de KeLab, Gotemburgo, Suecia.

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Diseño experimental

Todos los ratones se inmunizaron s.c. en la base de la cola con 100 \mul de vacuna. El Grupo 1 estaba constituido por 6 ratones NMRI genéticamente heterogéneos inmunizados do veces con 4 semanas de separación con 2,5 Lf de TT sin adición de adyuvante. El Grupo 2 estaba constituido por 8 ratones inmunizados 2 veces con 4 semanas de separación con 2,5 Lf de TT adyuvado con una dosis alta de TC (1 \mug). El Grupo 3 estaba constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación con 2,5 Lf de TT adyuvado con una dosis baja de TC (0,2 \mug). El Grupo 4 estaba constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación con 2,5 Lf de TT adyuvado con una dosis baja de TC (0,2 \mug) suplementado con 10 \mug de Matriz-QWT.

Se recogieron los sueros 3 semanas después del cebado y 2 semanas después del refuerzo.

Determinación de anticuerpos

Se llevó a cabo ésta en ELISA tal como se describe en el ejemplo 1 excepto en que el antígeno fue TT recubierto con placas ELISA (Nunc) a una concentración de 1 \mug/ml.

Resultados

Se registró una clara respuesta del anticuerpo primario medido como IgG específico del antígeno, en los cuatro grupos, lo que muestra que TT es comparativamente un fuerte inmunógeno. TT adyuvado con una dosis baja de TC (0,2 \mug) suplementada con Matriz-QWT indujo una respuesta de IgG primaria mayor de 3 veces en comparación con las otras formulaciones (9-1A).

Tras el refuerzo, la respuesta de IgG total aumentó en todos los grupos en los que TT se suplementó con adyuvante (9-1B) mientras que la segunda inmunización no aumentó significativamente el nivel del anticuerpo en ratones inmunizados sólo con TT.

Tras una inmunización, la respuesta de IgG2a, que indica un tipo Th 1 de respuesta inmune, tú únicamente inducida en ratones (grupo 4) inmunizados con TT adyuvado con una dosis baja de TC (0,2 \mug) suplementado con la Matriz-QWT (9-2A).

Tras el refuerzo, el grupo de la Matriz-QWT de ratones respondió con los títulos de IgG2a más altos (9-2B). Los ratones del grupos 3 inmunizados con TT adyuvado con una dosis baja de TC (0,2 \mug) respondieron con títulos despreciables o muy bajos del anticuerpo IgG2 específico de TT.

Conclusión

TT es un inmunógeno soluble comparativamente fuerte que promueve el tipo de respuesta Th2. TC es una fuerte toxina con efecto adyuvante fuerte que promueve también un tipo de respuesta Th2. En este experimento se muestra que la Matriz-QWT promueve fuertemente (modula) al huésped para que responda también con el anticuerpo IgG2a específico del antígeno cuando se añade al antígeno de TT suplementado con una dosis baja de TC. Es interesante señalar que el fuerte efecto adyuvante de Th2 que estimula el de TC está modulado por la Matriz-QWT hacia Th1. De esta manera, la Matriz-QWT tiene un fuerte efecto inmunomodulador combinado con TC como adyuvante.

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Ejemplo 9

En este ejemplo, un Toxoide del Tétanos (TT) del antígeno de la vacuna comercial soluble se suplementa con monofosforil lípido A (MFL) siendo un adyuvante fuerte que estimula un tipo de respuesta Th1. Se complementó una dosis baja de MFL con la Matriz-QWT para demostrar el efecto modulador y sinérgico de la Matriz-QWT sobre el antígeno TT en presencia de MFL.

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Materiales y Métodos Matriz-QWT

Se formuló la Matriz-QWT tal como se describe en el Ejemplo 1.

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TT y MFL

Se obtuvo comercialmente TT de The State SERUM Institute, Copenhague, Dinamarca. MFL (L6895) fue de Sigma (San Luis, EE.UU.).

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Toxoide del Tétanos

Se obtuvo comercialmente TT de The State SERUM Institute, Copenhague, Dinamarca.

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Diseño experimental

Se inmunizaron todos los ratones s.c. en la base de la cola con 100 \mul de vacuna. El Grupo 1 estaba constituido por 6 ratones NMRI genéticamente heterogéneos inmunizados dos veces con 4 semanas de separación con 2,5 Lf de TT sin adición de adyuvante. El Grupo 2 estaba constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación con 2,5 Lf de TT adyuvado con una dosis alta de MFL (50 \mug). El Grupo 3 estaba constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación con 2,5 Lf de TT adyuvados con una dosis baja de MFL (10 \mug). El Grupo 4 estaba constituido por 8 ratones inmunizados dos veces con 4 semanas de separación con 2,5 Lf de TT adyuvado con una dosis baja de MFL (10 \mug) suplementado con 10 \mug de Matriz-QWT.

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Determinación de anticuerpos

Se llevó a cabo esto tal como se describe en el ejemplo 8.

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Resultados

Se registro una clara respuesta del anticuerpo primario, medido como IgG específico del antígeno, en los cuatro grupos, lo que muestra que TT es un inmunógeno comparativamente fuerte (10-1A). TT adyuvado con una dosis baja de MFL (10 \mug) suplementado con Matriz-QWT indujo una respuesta de IgG primario aproximadamente 2 veces mayor que la formulación TT adyuvada con 10 \mug de MFL.

Tras el refuerzo, la respuesta del anticuerpo IgG total aumentó sustancialmente en todos los grupos en los que se suplementó TT con el adyuvante (10-2B), mientras que la segunda inmunización no aumentó significativamente el nivel de anticuerpo en ratones inmunizados sólo con TT. Los ratones inmunizados con TT adyuvado con MFL (10 \mug) suplementados con Matriz-QWT respondieron con más de una respuesta de IgG 100 veces específica (10-1B) que fue aproximadamente 8 veces mayor que la respuesta inducida por TT suplementado con una dosis baja de MFL (10 \mug) pero sin la Matriz-QWT.

La respuesta de IgG1 mostró el mismo perfil que la respuesta de IgG total tras la inmunización primaria y la segunda.

Los ratones inmunizado con TT adyuvado con una dosis baja de MFL (10 \mug) suplementado con Matriz-QWT respondieron con títulos de IgG2a 10 veces mayores que los ratones inmunizados con TT suplementado con una dosis baja d MFL (10-2A). Los ratones en otros grupos no desarrollan respuesta d IgG2a primaria significativa.

Tras el refuerzo, los ratones inmunizados con TT adyuvado con una dosis baja de MFL (10 \mug) suplementado con Matriz-QWT respondieron con los títulos de IgG2a más altos siendo más de 100 veces mayores que los de los ratones en otros grupos (10-2B).

Conclusión

La Matriz-QWT con antígeno y/o MFL potencia poderosamente la respuesta del anticuerpo IgG2a, pero también IgG1, lo que indica un fuerte efecto inmunomodulador equilibrado sobre el antígeno TT en presencia de MFL. La fuerte inmunogenicidad de TT está enfatizada por el hecho de que MFL por sí mismo no o únicamente potencia marginalmente las respuestas de IgG total o IgG2a o IgG1. Esto indica que un fuerte adyuvante, de tipo MFL, puede tener un efecto inmunomodulador limitado en presencia de un fuerte inmunógeno de tipo TT. Por el contrario, QWT es simbiótico en el efecto con MFL demostrado por el hecho de que esta combinación tiene un fuerte efecto inmunomodulador.

Claims

1. Uso de la fracción A de Quil A integrada en una partícula iscom junto con al menos otro adyuvante con capacidad inmunomodulador en forma libre o integrado en otra partícula iscom distinta para la preparación de una composición adyuvante con efecto sinérgico que incluye el potenciamiento de las respuestas inmunes y la actividad inmunomoduladora, facilitando el uso del otro adyuvante, que cuando se usa solo puede ser tóxico en dosis que son eficaces.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el al menos otro adyuvante se escoge entre saponinas, que se producen naturalmente, moléculas de saponina sintética o semisintética derivadas del extracto bruto de saponina de
Quillaja saponaria Molina escogido entre las fracciones de C, el B B3, B4 y B4b y QA-1, QA-2, QA-3, QA-4,
QA-5, QA-6, QA-7, QA-8, QA-9, QA-10, QA-11, QA-12, QA-13, QA-14, QA-15, QA-16, QA-17, QA-18, QA-19, QA-20 QA-22, el esqueleto de la pared celular, polímeros en bloque, por ejemplo, copolímeros en bloque hidrófilos, por ejemplo, CRL-1005, TDM (Dimicolato de trehalosa), lipopéptidos, LPS y derivados de LPS, el Lípido A de diferentes especies bacterianas y sus derivados, por ejemplo, monofosforil lípido A, variantes de CpG, variantes de Cp-GODN, inmunomoduladores animales humanos endógenos, por ejemplo, GM-CSF, IL-2, adyuvante de toxinas bacterianas activas, por ejemplo, la toxina del cólera TC, y sus subcomponente TCB y TCA1, toxina termolábil (TL) de E. coli, o toxina de Bordetella pertussis (BP) y el filamento de hemaglutinina de BP.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la fracción de saponina de Quil A se escoge a partir de la fracción C o B de Quil A.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que al menos otro adyuvante se integra en una partícula iscom.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el al menos otro adyuvante se integra en partículas iscom distintas.

6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la fracción A de Quil A se integra en una partícula iscom y al menos otro adyuvante está libre y no integrado en ninguna partícula iscom.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que al menos otro adyuvante que está libre y no integrado en ninguna partícula iscom es monofosforil lípido A y/o la toxina del cólera TC.

8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la partícula iscom es un complejo iscom.

9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la partícula iscom es un complejo de matriz de iscom.

10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la composición comprende además un vehículo, diluyente, excipiente o aditivo farmacéuticamente aceptable.