ES2330408T3 - Polimerizacion activada por pirofosforolisis (pap): aplicacion en la amplificacion de un alelo especifico y en la determinacion de secuencias de acidos nucleicos. - Google Patents
Polimerizacion activada por pirofosforolisis (pap): aplicacion en la amplificacion de un alelo especifico y en la determinacion de secuencias de acidos nucleicos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2330408T3 ES2330408T3 ES01912883T ES01912883T ES2330408T3 ES 2330408 T3 ES2330408 T3 ES 2330408T3 ES 01912883 T ES01912883 T ES 01912883T ES 01912883 T ES01912883 T ES 01912883T ES 2330408 T3 ES2330408 T3 ES 2330408T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- chain
- oligonucleotide
- terminal
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 88
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims description 84
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims description 84
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 220
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 79
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 68
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 67
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 46
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 43
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 43
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims abstract description 21
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims abstract description 19
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 230000001841 pyrophosphorolytic effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 89
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 75
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 claims description 64
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 49
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 49
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 24
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 23
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 14
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 11
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 11
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 claims description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 8
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 8
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- RAJMXAZJKUGYGW-POYBYMJQSA-N 2',3'-dideoxycytidine-5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)CC1 RAJMXAZJKUGYGW-POYBYMJQSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- PUSXDQXVJDGIBK-NKWVEPMBSA-N [(2s,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methyl dihydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 PUSXDQXVJDGIBK-NKWVEPMBSA-N 0.000 claims description 5
- WVNRRNJFRREKAR-JGVFFNPUSA-N 2',3'-dideoxythymidine-5'-monophosphate Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)CC1 WVNRRNJFRREKAR-JGVFFNPUSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 claims description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims 1
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 claims 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 29
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 5
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 4
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 108090000511 Dopamine D1 Receptors Proteins 0.000 description 3
- 108050004812 Dopamine receptor Proteins 0.000 description 3
- 101000931925 Homo sapiens D(1A) dopamine receptor Proteins 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241001200922 Gagata Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001446467 Mama Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229920001187 thermosetting polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
Abstract
Un procedimiento de polimerización activada por pirofosforolisis (PAP) para sintetizar una cadena de ácido nucleico deseada sobre una cadena molde de ácido nucleico que comprende, en serie: (a) añadir un oligonucleótido P* activable complementario a una mezcla de reacción que contiene la cadena molde, oligonucleótido P* que tiene un terminal 3'' no prolongable y que no tiene nucleótidos en o cerca de su terminal 3'' que se apareen erróneamente con los correspondientes nucleótidos sobre la cadena molde, (b) aparear el oligonucleótido activable complementario P* con la cadena molde, tal que el terminal 3'' no prolongable se hibride con la cadena molde al ser el oligonucleótido P* apareado, (c) pirofosforolizar el dúplex resultante con pirofosfato y una enzima que tenga actividad pirofosforolítica y active el oligonucleótido P* mediante la eliminación del terminal 3'' no prolongable hibridado y (d) polimerizar mediante la prolongación del oligonucleótido P* activado sobre la cadena molde en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato y una polimerasa de ácido nucleico para sintetizar la cadena de ácido nucleico deseada.
Description
Polimerización activada por pirofosforolisis
(PAP): aplicación en la amplificación de un alelo específico y en la
determinación de secuencias de ácidos nucleicos.
La presente invención se refiere a la
polimerización y amplificación de ácidos nucleicos. En concreto, se
refiere a un procedimiento nuevo y general para la amplificación de
ácidos nucleicos, en el que se combinan en serie la
pirofosforolisis y la polimerización. El procedimiento ha sido
adaptado a la amplificación de un alelo específico y puede aumentar
enormemente la especificidad para detectar un alelo sumamente raro
en presencia de alelos de tipo natural. Se hace referencia al
procedimiento como polimerización activada por pirofosforolisis
(PAP).
Las publicaciones y otros materiales usados en
la presente memoria para dilucidar los antecedentes de la invención
o proporcionar más datos relativos a su práctica se agrupan
respectivamente en las listas de referencias adjuntas.
Un procedimiento para detectar un alelo mutante
en 10^{6}-10^{9} alelos de tipo natural sería
ventajoso para muchas aplicaciones, incluyendo la detección de una
enfermedad residual mínima (células cancerosas residuales raras
durante una remisión, especialmente, las mutaciones del gen
p53 u otros genes de supresión tumoral previamente
identificados en los tumores) y la medición de la carga mutacional
(la frecuencia de las mutaciones somáticas específicas presentes en
tejidos normales, tales como la sangre o la orina). Los individuos
con una carga mutacional elevada pueden tener un mayor riesgo de
padecer cáncer ante bien una exposición ambiental o defectos
endógenos en cualquiera de los cientos de genes necesarios para
mantener la integridad del genoma. Para aquellos individuos en los
que se ha descubierto una carga mutacional elevada, es posible
obtener las claves de su etiología mediante la definición del
patrón
mutacional.
mutacional.
Se han desarrollado múltiples procedimientos
para detectar las mutaciones presentes en menos del 10% de las
células (i.e., alelos raros), incluyendo la amplificación por PCR de
alelos específicos (APAE), la PCR de bloqueo de la sujeción de ANP,
la PCR de bloqueo competitivo de un alelo específico, MAMA y
RFLP/PCR (1). Estos procedimientos: i) amplifican el alelo raro
selectivamente, ii) destruyen el alelo de tipo natural abundante o
iii) separan espacialmente el alelo raro del alelo de tipo natural.
Se ha publicado que las técnicas RFLP/PCR tienen la especificidad
más elevada de 10^{-8} (2), pero en nuestro caso, la especificidad
ha sido de 10^{-3} a 10^{-4} (3). Los procedimientos que
amplifican selectivamente el alelo raro incluyen la APAE, que
rutinariamente tiene una especificidad de menos de o igual a 1
parte entre 40 (4). Sommer et al. Biotechniques, vol. 12,
n.º 1, 1992, páginas 82-87) describen el uso de la
APAE para detectar alelos polimórficos o mutantes, y llegan a la
conclusión de que se trata de un procedimiento general para detectar
cambios de una sola base conocidos, así como pequeñas eliminaciones
o inserciones. Usan un cebador que bien no tiene apareamientos
erróneos con la secuencia diana, tiene un apareamiento erróneo en el
extremo 3' o una base del extremo 3' del cebador de un alelo
específico.
Las ADN polimerasas, que son fundamentales para
la amplificación del ADN, catalizan algunas o la totalidad de las
siguientes reacciones: i) polimerización de desoxinucleótidos
trifosfato; ii) pirofosforolisis de dúplex de ADN en presencia de
pirofosfato (PP_{i}); iii) actividad exonucleasa
3'-5' y iv) actividad exonucleasa
5'-3' (5, 6). Para las ADN polimerasas de Taq
y Tfl, se ha informado acerca de la polimerización y la
actividad exonucleasa 5'-3' (7-9).
Para las ADN polimerasas Sequenase^{TM} de T7, la pirofosforolisis
puede conducir a la degradación de segmentos con terminación en un
didesoxinucleótido específico en la reacción de secuenciación de
Sanger (10, 11). En concreto, Tabor y Richardson (10) demuestran que
la pirofosforolisis realizada por la ADN polimerasa de T7 es
responsable de la degradación de los fragmentos con terminación en
un didesoxi específico y puede ser evitada con pirofosfatasa.
Describen un sistema de secuenciación basado en el uso de una
combinación de ADN polimerasa de T7, pirofosfatasa y Mn^{2+}, que
da como resultado bandas sobre un gel de secuenciación de ADN que
tienen una intensidad uniforme.
El documento
EP-A-0 892 058 se refiere a enzimas
ADN polimerasas termoestables quiméricas que están constituidas por
una región N-terminal derivada del dominio
5'-nucleasa de una ADN polimerasa de la especie
Thermus y una región C-terminal derivada de
los dominios polimerasa y exonucleasa de 3' a 5' de la ADN
polimerasa de Tma. Estas enzimas ADN polimerasas
termoestables quiméricas mutantes tienen mejores propiedades en las
reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos.
Hay muchos procedimientos de secuenciación de
ADN y sus variantes, tales como la secuenciación de Sanger, que usa
una terminación didesoxi y la electroforesis sobre gel
desnaturalizante (27), la secuenciación de
Maxam-Gilber, que usa la escisión química y la
electroforesis sobre gel desnaturalizante (28), el pirofosfato de
detección por piro-secuenciación (PPi) liberado
durante la reacción de la ADN polimerasa (29) y la secuenciación por
hibridación (SBH), que usa oligonucleótidos
(30-35).
En la presente memoria, se describe la
polimerización activada por pirofosforolisis (PAP), un enfoque que
tiene el potencial de aumentar de manera espectacular la
especificidad de la APAE. También se describe un nuevo procedimiento
de determinación de secuencias de ADN mediante la PAP.
La invención es un procedimiento de
polimerización activada por pirofosforolisis (PAP) para sintetizar
una cadena de ácido nucleico deseada sobre una cadena molde de ácido
nucleico. El procedimiento comprende las siguientes etapas llevadas
a cabo en serie:
- (a)
- Añadir un oligonucleótido P* activable complementario a una mezcla de reacción que contiene la cadena molde. Este oligonucleótido activable tiene un 3'-desoxinucleótido no prolongable en su terminal 3'. No tiene nucleótidos en o cerca de su terminal 3' que se apareen erróneamente con los correspondientes nucleótidos de la cadena molde.
- (b)
- Aparear el oligonucleótido P* activable complementario con la cadena molde. Por lo tanto, el 3'-desoxinucleótido terminal es hibridado con la cadena molde al ser el oligonucleótido P* apareado.
- (c)
- Pirofosforolizar el oligonucleótido P* activable apareado con pirofosfato y una enzima que tenga actividad pirofosforolítica. Esto activa el oligonucleótido P* mediante la eliminación del 3'-desoxinucleótido terminal hibridado.
- (d)
- Polimerizar mediante la prolongación del oligonucleótido P* activado sobre la cadena molde en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato y una polimerasa de ácido nucleico para sintetizar la cadena de ácido nucleico deseada. El procedimiento PAP se puede aplicar a la amplificación de una cadena de ácido nucleico deseada mediante las siguientes etapas adicionales:
- (e)
- Separar la cadena de ácido nucleico deseada de la etapa (d) de la cadena molde, y
- (f)
- Repetir las etapas (b)-(e) hasta alcanzar un nivel deseado de amplificación de la cadena de ácido nucleico deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto preferido, el procedimiento PAP
según lo descrito anteriormente se aplica en la amplificación de un
alelo específico. En esta aplicación, la cadena molde de ácido
nucleico es una cadena sentido o antisentido de un alelo, y está
presente en combinación con la correspondiente cadena de ácido
nucleico (sentido o antisentido) del segundo alelo (la cadena
alélica). El oligonucleótido P* activable tiene al menos un
nucleótido en o cerca de su terminal 3' que se aparea erróneamente
con el correspondiente nucleótido de la cadena alélica. Debido al
apareamiento erróneo, en la etapa (b) del procedimiento PAP, el
3'-desoxinucleótido terminal del oligonucleótido P*
no es hibridado con la cadena alélica. En la etapa (c), la
pirofosforolisis no elimina sustancialmente el
3'-desoxinucleótido terminal no hibridado del
oligonucleótido P* apareado con la cadena alélica. En la etapa (d),
el oligonucleótido P* no es prolongado sustancialmente por
polimerización sobre la cadena alélica. Como resultado de ello, la
cadena de ácido nucleico deseada sintetizada sobre la cadena molde
es amplificada de forma preferente sobre cualquier cadena de ácido
nucleico sintetizada sobre la cadena alélica.
Se puede usar el procedimiento PAP para
amplificar bien ARN o ADN. Cuando se usa para amplificar ADN, el
oligonucleótido P* activable es un
2'-desoxioligonucleótido, el desoxinucleótido
terminal es un 2',3'-didesoxinucleótido, los cuatro
nucleósidos trifosfato son 2'-desoxinucleósidos
trifosfato y la polimerasa de ácido nucleico es una ADN polimerasa.
La ADN polimerasa usada en la etapa (d) también puede ser la enzima
que tenga la actividad pirofosforolítica usada en la etapa (c). Las
ADN polimerasas preferidas que tienen actividad pirofosforolítica
son ADN polimerasas de Tfl, Taq y diseñadas
genéticamente termoestables, tales como AmpliTaqFs y
ThermoSequenase^{TM}. Estas ADN polimerasas diseñadas
genéticamente tienen la mutación F667Y en sus sitios activos y la
eliminación de la actividad exonucleasa 5'-3'. El
uso de ADN polimerasas diseñadas genéticamente, tales como
AmpliTaqFs y ThermoSequenase^{TM}, aumenta enormemente el
rendimiento de la PAP.
La amplificación mediante el procedimiento PAP
puede ser lineal o exponencial. La amplificación lineal se obtiene
cuando el oligonucleótido P* activable es el único oligonucleótido
complementario usado. La amplificación exponencial se obtiene
cuando hay un segundo oligonucleótido presente que es complementario
a la cadena de ácido nucleico deseada. El oligonucleótido P*
activable y el segundo oligonucleótido flanquean la región que es
objeto de la amplificación. En la etapa (b, el segundo
oligonucleótido se aparea con el producto de cadena de ácido
nucleico deseada separado de la etapa (e). En la etapa (d), la
polimerización prolonga el segundo oligonucleótido sobre la cadena
de ácido nucleico deseada para sintetizar una copia de la cadena
molde de ácido nucleico. En la etapa (e), la cadena molde de ácido
nucleico sintetizada es separada de la cadena de ácido nucleico
deseada. Las etapas (b) a (e) son repetidas hasta alcanzar el nivel
deseado de amplificación exponencial.
En el procedimiento PAP, un apareamiento erróneo
entre el oligonucleótido P* activable y la cadena molde da como
resultado una falta de amplificación, si el apareamiento erróneo
tiene lugar en la subsecuencia específica de 3' de P* en el
terminal 3' de P* o en los 16 nucleótidos del terminal 3' de P*.
Esta falta de amplificación para tales apareamientos erróneos en la
subsecuencia específica de 3' de P* proporciona cuatro mil millones
de oligonucleótidos diferentes y específicos con la resolución de la
sustitución de una base.
\newpage
En un aspecto preferido, se usa el procedimiento
PAP para la amplificación exponencial de un alelo mutante raro en
una mezcla que contiene uno o más alelos de tipo natural. Se separan
las cadenas de los alelos para proporcionar ADN monocatenario, luego
se llevan a cabo las siguientes etapas en serie:
- (a)
- Aparear a las cadenas sentido o antisentido de cada alelo un 2'-desoxioligonucleótido P* activable complementario que tenga un 2',3'-desoxinucleótido no prolongable en su terminal 3'. P* no tiene 2'-desoxinucleótidos en o cerca de su terminal 3' que se apareen erróneamente con los correspondiente 2'-desoxinucleótidos sobre la cadena mutante, pero tiene al menos un 2'-desoxinucleótido en o cerca de su terminal 3' que se aparea erróneamente con el correspondiente 2'-desoxinucleótido sobre la cadena de tipo natural. Por consiguiente, el 2',3'-desoxinucleótido terminal es hibridado con la cadena mutante, pero no con la cadena de tipo natural, al ser el oligonucleótido P* apareado. Simultáneamente, un segundo 2'-desoxioligonucleótido que es complementario a las cadenas anti-paralelas de cada alelo se aparea con las cadenas anti-paralelas. El 2'-desoxioligonucleótido P* activable y el segundo 2'-desoxioligonucleótido flanquean la región del gen por ser amplificada.
- (b)
- Pirofosforolizar el 2'-desoxioligonucleótido P* activable que está apareado con una cadena mutante con pirofosfato y una enzima que tenga actividad pirofosforolítica. Esto activa al 2'-desoxioligonucleótido P* que está apareado con la cadena mutante mediante la eliminación del 2'-3'-desoxinucleótido terminal hibridado. Esto no activa sustancialmente el 2'-desoxioligonucleótido P* que está apareado con la cadena mutante, porque el 2',3'-desoxioligonucleótido terminal no hibridado no es eliminado sustancialmente mediante la pirofosforolisis.
- (c)
- Polimerizar mediante la prolongación del oligonucleótido P* activado sobre la cadena mutante en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato y una ADN polimerasa y, simultáneamente, prolongar el segundo 2'-desoxioligonucleótido sobre las cadenas anti-paralelas mutante y de tipo natural.
- (d)
- Separar los productos de la prolongación de la etapa (c);
- (e)
- Repetir las etapas (a) a (d) hasta alcanzar el nivel deseado de amplificación exponencial del alelo mutante.
\vskip1.000000\baselineskip
El 2'-desoxioligonucleótido P*
activable es apareado con las cadenas antisentido de los alelos y el
segundo 2'-desoxioligonucleótido es apareado con las
cadenas sentido, o viceversa.
Las etapas (a) a (c) de la PAP se pueden
realizar consecutivamente como dos o más fases de temperatura en un
termociclador, o se pueden realizar como una fase de temperatura en
un termociclador.
Se pueden usar nucleósidos trifosfato y
2'-desoxinucleósidos trifosfato o sus versiones
modificadas químicamente como sustratos para la prolongación de
múltiples nucleótidos mediante la PAP, i.e., cuando se incorpora un
nucleótido, la cadena en prolongación puede seguir siendo
prolongada. Se pueden usar 2',3'-didesoxinucleósidos
trifosfato o sus versiones modificadas químicamente que sean
terminadores de una mayor prolongación para la prolongación de un
solo nucleótido. Los 2',3'-didesoxinucleósidos
trifosfato se pueden marcar con un colorante de radiactividad o de
fluorescencia para su diferenciación del didesoxinucleótido
3'-terminal del oligonucleótido P*. También se
pueden usar mezclas de nucleósidos trifosfato o
2'-desoxinucleótidos trifosfato y
2',3'-didesoxinucleósidos trifosfato.
La PAP se puede usar en un nuevo procedimiento
de determinación de secuencias de ADN. En la PAP, se combinan en
serie la pirofosforolisis y la polimerización realizadas por ADN
polimerasa usando P*, un oligonucleótido
3'-didesoxi terminal. Este principio se basa en la
especificidad de la PAP y, a su vez, en la especificidad del
apareamiento de bases de la subsecuencia específica de 3'. Esta
propiedad de la subsecuencia específica de 3' se puede aplicar a la
exploración de variantes secuenciales desconocidas, para determinar
la secuencia de ADN de novo, para comparar dos secuencias de ADN y
para controlar el perfil de expresión génica a gran escala. Es
posible un alineamiento de P* en estos procedimientos. Es decir,
cada uno de los P* puede ser inmovilizado en un punto individual o
en un soporte sólido bidimensional, permitiendo así el procesamiento
en paralelo de todas las reacciones de la PAP.
Por lo tanto, en un aspecto, se usa el
procedimiento PAP para explorar variantes secuenciales desconocidas
en una secuencia de ácido nucleico o para volver a secuenciar una
secuencia predeterminada en un ácido nucleico llevando a cabo las
siguientes etapas en serie:
- (a)
- Mezclar en condiciones de hibridación una cadena molde del ácido nucleico con múltiples conjuntos de cuatro oligonucleótidos P* activables que sean suficientemente complementarios con la cadena molde como para hibridarse con ella. En cada conjunto, los oligonucleótidos P* difieren entre sí en que tienen un nucleótido no prolongable 3'-terminal diferente, tal que el nucleótido no prolongable 3'-terminal es hibridado con la cadena molde si la cadena molde es complementaria al nucleótido no prolongable 3'-terminal. El número de conjuntos se corresponde con el número de nucleótidos de la secuencia.
- (b)
- Tratar los dúplex resultantes con pirofosfato y una enzima que tenga actividad pirofosforolítica para activar mediante pirofosforolisis sólo aquellos oligonucleótidos P* que tengan un nucleótido no prolongable 3'-terminal que esté hibridado con la cadena molde.
- (c)
- Polimerizar mediante la prolongación de los oligonucleótidos P* activados sobre la cadena molde en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato y una polimerasa de ácido nucleico.
- (d)
- Separar las cadenas de ácido nucleico sintetizadas de la etapa (c) de la cadena molde.
- (e)
- Repetir las etapas (a) a (d) hasta alcanzar el nivel deseado de amplificación, y
- (f)
- Disponer la secuencia de ácido nucleico en orden analizando los solapamientos de los oligonucleótidos P* que produjeron amplificaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo aspecto, se usa el procedimiento
PAP para determinar de novo la secuencia de un ácido nucleico
llevando a cabo las siguientes etapas en serie:
- (a)
- Mezclar en condiciones de hibridación una cadena molde del ácido nucleico con múltiples oligonucleótidos P* activables. Todos los oligonucleótidos P* tienen el mismo número n de nucleótidos que el molde y constituyen colectivamente todas las posibles secuencias que tienen n nucleótidos. Todos los oligonucleótidos P* tienen un nucleótido no prolongable en el terminal 3'. Cualquier oligonucleótido P* que sea suficientemente complementario se hibridará con la cadena molde. El nucleótido no prolongable 3'-terminal sólo se hibridará con la cadena molde si la cadena molde es complementaria en la posición correspondiente con el terminal 3'.
- (b)
- Tratar los dúplex resultantes con pirofosfato y una enzima que tenga actividad pirofosforolítica para activar sólo aquellos oligonucleótidos P* hibridados que tengan un nucleótido no prolongable 3'-terminal que esté hibridado con la cadena molde mediante pirofosforolisis de aquellos nucleótidos no prolongables 3'-terminales hibridados.
- (c)
- Polimerizar mediante la prolongación de los oligonucleótidos P* activados sobre la cadena molde en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato y una polimerasa de ácido nucleico.
- (d)
- Separar las cadenas de ácido nucleico sintetizadas en la etapa (c) de la cadena molde.
- (e)
- Repetir las etapas (a) a (d) hasta alcanzar el nivel deseado de amplificación, y
- (f)
- Determinar la secuencia de oligonucleótidos P* que produjo amplificaciones, disponiendo entonces la secuencia de ácido nucleico en orden mediante el análisis de los solapamientos de estos oligonucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 1A y 1B son un esquema que ilustra
el uso de la PAP para detectar el alelo G en el nucleótido 229 del
gen receptor de dopamina D_{1}. El procedimiento se describe
detalladamente en el ejemplo 1 que figura más adelante.
La figura 1C es un autorradiograma de la PAP
realizada a partir de los genotipos G/G, A/A y G/A del gen receptor
de dopamina humano.
Las figuras 2A-2B son diagramas
que ilustran el aumento de especificidad de la PAP en comparación
con la APAE.
Las figuras 3A y 3B son autorradiogramas que
muestran los resultados de la electroforesis de las muestras
obtenidas en el ejemplo 1 que figura más adelante.
La figura 4 es un autorradiograma que muestra
los resultados de la electroforesis de las muestras obtenidas en el
ejemplo 1 que figura más adelante.
La figura 5 es un autorradiograma que muestra
los resultados de la electroforesis de las muestras obtenidas en el
ejemplo 1 que figura más adelante.
La figura 6A es un esquema que ilustra el
aumento del rendimiento de la PAP. La figura 6B es un
autorradiograma de la PAP realizada a partir de los genotipos G/G,
A/A y G/A del gen receptor de dopamina humano.
Las figuras 7A-7E son
autorradiogramas que muestran los resultados de la electroforesis de
las muestras obtenidas en el ejemplo 2 que figura más adelante.
La figura 8 es un autorradiograma que muestra
los resultados de la electroforesis de las muestras obtenidas en el
ejemplo 2 que figura más adelante.
La figura 9 es un autorradiograma que muestra
los resultados de la electroforesis de las muestras obtenidas en el
ejemplo 2 que figura más adelante.
La figura 10 es un autorradiograma que muestra
los resultados de la electroforesis de las muestras obtenidas en el
ejemplo 3 que figura más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención ser comprendida a partir de los
siguientes ejemplos, que ilustran la posibilidad de usar la PAP
para identificar una mutación conocida en un sitio polimórfico del
gen receptor de dopamina D_{1} humano. Se examinaron los efectos
de las secuencias de didesoxioligonucleótido, las ADN polimerasas,
las concentraciones de PP_{i}, los moldes de un alelo específico,
el pH y las concentraciones de dNTP. Los experimentos presentados
en los ejemplos fueron realizados como prueba de concepto. Los
siguientes ejemplos se ofrecen a modo ilustrativo, y no pretenden
limitar la invención de ningún modo. Se utilizaron técnicas estándar
conocidas en la técnica o las técnicas descritas específicamente en
la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó una región de 640 pb del gen
receptor de dopamina D_{1} humano por PCR con dos cebadores (T =
5' GAC CTG CAG CAA GGG AGT CAG AAG 3' (SEC ID N.º 1) y U = 5' TCA
TAC CGG AAA GGG CTG GAG ATA 3' (SEC ID N.º 2)) (Figura 1A). El
dúplex resultante TU:UT abarca los nucleótidos 33 al 672 en X55760
del GenBank, siendo el contenido de G+C del 55,3%. Hay un
polimorfismo común de A a G ubicado en el nucleótido 229, dando como
resultado tres genotipos de G/G, A/A y G/A (12). La mezcla de PCR
contiene un volumen de 50 \mul: KCl 50 mM; Tris/HCl 10 mM, pH
8,3; MgCl_{2} 1,5 mM; 200 \muM de cada uno de los cuatro dNTP
(Boehringer Mannheim); 0,1 \muM de cada cebador; DMSO al 2%; 1 U
de ADN polimerasa de Taq (Boehringer Mannheim) y 250 ng de
ADN genómico del homocigoto G/G, del homocigoto A/A o de los
heterocigotos G/A. Las condiciones de los ciclos incluyeron:
desnaturalización a 95ºC durante 15 segundos, apareamiento a 55ºC
durante 30 segundos y alargamiento a 72ºC durante un minuto, para
un total de 35 ciclos (Sistema 9600 GeneAmp PCR de Perkin Elmer). Se
purificó el producto de la PCR a partir de los cebadores y otras
moléculas pequeñas en aproximadamente 10.000 veces en tres tiempos
de retención sobre un microconcentrador Centricon® 100 (Amicon). Se
determinó la cantidad del producto de la PCR recuperado por
absorbancia UV a 260 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizó el oligonucleótido
desoxinucleotídico con un sintetizador Perseptive Biosystems modelo
8909 (Framinsham) y se purificó con cartuchos oligopure (Hamilton)
en el Laboratorio de Química de ADN/ARN de City of Hope. Se añadió
el didesoxinucleótido 3'-terminal mediante
transferasa terminal. La mezcla contenía un volumen total de 40
\mul: cacodilato de potasio 200 mM; Tris/HCl 25 mM (pH 6,6 a
25ºC); CoCl_{2} 2,5 mM; 0,25 mg/ml de ASB; 4000 pM del
oligonucleótido; 2'3'-ddNTP 2,5 mM (la proporción
molar del terminal OH-3' con respecto a ddNTP era
de 1:25) Boehringer Mannheim); 125 U de transferasa terminal
(Boehringer Mannheim). Se incubó la reacción a 37ºC durante 1 hora
y luego se detuvo añadiendo EDTA a una concentración final de 5 mM.
Tras desalinizar usando butanol, se purificó el
didesoxioligonucleótido mediante electroforesis preparativa en gel
de urea 7M/poliacrilamida al 20% en tampón de TBE (Tris/borato 90
mM; EDTA 1 mM, pH 8,3) (25). Se determinó la cantidad del P*
recuperado por absorbancia UV a 260 nm.
Como las pequeñas cantidades de oligonucleótido
sin terminar darían como resultado una inespecificidad de la
pirofosforolisis, se marcó con ^{33}P cada
didesoxioligonuclelótido en el terminal 5' con polinucleótido cinasa
de T4, y luego se sometieron a electroforesis a través de gel de
urea 7M/poliacrilamida al 20%. Sólo se hicieron visibles productos
de P*, incluso al sobre-exponer el gel (datos no
mostrados). Se estima que más del 99,99% del P* contenía un
didesoxinucleótido en el terminal 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó una región de 469 pb del molde
dúplex TU:UT mediante PAP con los oligonucleótidos P* y U, o sólo
con un P* (Tabla 1 y figura 1A). El dúplex resultante PU:UP
corresponde a los nucleótidos 204 al 672 en X55760 del GenBank,
siendo el contenido de G+C del 55,6%. A no ser que se establezca
algo distinto, la mezcla de reacción de la PAP contenía un volumen
total de 25 \mul para la ADN polimerasa de Tfl: KCl 75 mM;
Tris/HCl 20 mM (pH 7,4); MgCl_{2} 1,5 mM; 40 \muM de cada uno
de los cuatro dNTP (dATP, dTTP, dGTP y dCTP); P* 0,2 \muM; 0,05
\muM de oligonucleótido U; Na_{4}PP_{i} 300 \muM (la
solución madre 20MM fue ajustada con HCl a un pH 8,0); 1 \muCi de
[\alpha-^{32}P]-dCTP (3000
Ci/nmol, Amersham), 1 U de ADN polimerasa de Tfl (Promega) 2
ng de TU:UT. Para la ADN polimerasa de Taq, la mezcla de
reacción fue igual a excepción de KCl 50 mM; Tris/HCl 10 mM (pH
7,4); MgCl_{2} 2,0 mM y 1 U de ADN polimerasa de Taq
(Boehringer Mannheim). Las mezclas de PCR y otros controles fueron
iguales a excepción de los cebadores añadidos. Las condiciones de
los ciclos incluyeron: 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 1
minuto, subiendo hasta 72ºC durante un minuto y 72ºC durante dos
minutos, para un total de 15 ciclos.
Se sometió la reacción a electroforesis a través
de un gel de agarosa al 2% estándar. Se tiñó el gel con bromuro de
etidio para realizar una fotografía UV con una cámara CCD
(Bio-Rad Gel Doc 1000), se secó y se sometió a una
película AR X-OMAT^{TM}de Kodak para realizar una
autorradiografía.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada una de las tres endonucleasas de
restricción de AciI
(5'C\ding{116}CGC3'/3'GGC\ding{115}G5'), EaeI
(5'Py\ding{116}GGCCPu3'/
3'PuCCGG\ding{115}Py5') y Eco0109I (5'PuG GNCCPy3'/3'PyCCNG\ding{115}GPu5') tiene un sitio de restricción en el dúplex PU:UP. Se amplificaron los alelos G/G mediante PAP con D5G* y U; se usó la amplificación por PCR con D_{1} y U como control. Se purificaron 40 \mul de la reacción PAP y 2 \mul de la reacción PCR y se concentraron con un cicroconcentrador Centricon® 100, y se digirieron los productos con la endonucleasa de restricción: 2,5 U de AciI en 1 x tampón de NE 3; o 3 U de EaeI en 1 x Tampón de NE 1; o 30 U de Eco0109I en tampón de NE 4 con ASB (todas las enzimas y los tampones anteriores de New England Biolabs). Se incubaron 10 \mul de la reacción a 37ºC durante 2 horas. Se sometió la reacción de digestión a electroforesis a través de un gel de agarosa al 2% estándar según lo descrito anteriormente.
3'PuCCGG\ding{115}Py5') y Eco0109I (5'PuG GNCCPy3'/3'PyCCNG\ding{115}GPu5') tiene un sitio de restricción en el dúplex PU:UP. Se amplificaron los alelos G/G mediante PAP con D5G* y U; se usó la amplificación por PCR con D_{1} y U como control. Se purificaron 40 \mul de la reacción PAP y 2 \mul de la reacción PCR y se concentraron con un cicroconcentrador Centricon® 100, y se digirieron los productos con la endonucleasa de restricción: 2,5 U de AciI en 1 x tampón de NE 3; o 3 U de EaeI en 1 x Tampón de NE 1; o 30 U de Eco0109I en tampón de NE 4 con ASB (todas las enzimas y los tampones anteriores de New England Biolabs). Se incubaron 10 \mul de la reacción a 37ºC durante 2 horas. Se sometió la reacción de digestión a electroforesis a través de un gel de agarosa al 2% estándar según lo descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las ADN polimerasas de Tfl y Taq
demostraron contener actividad pirofosforolítica (datos no
mostrados). La ADN polimerasa de Tfl fue utilizada para
detectar el alelo G en el nucleótido 229 del gen receptor de
dopamina D_{1} (12) (Figura 1A). P* fue sintetizado bien con ddG o
con ddA en el terminal 3' (véase la tabla 1). El didesoxinucleótido
3'-terminal inhibe la prolongación directa por
polimerización, pero puede ser eliminado mediante pirofosforolisis
en presencia de pirofosfato (PP_{i}) cuando el P* se hibridada
específicamente con la cadena complementaria del alelo G. El
oligonucleótido degradado se puede prolongar por polimerización en
el sentido 5'-3' (figuras 1B y 1C).
El aumento de especificidad de la PAP en
comparación con la APAE se proporciona mediante la combinación en
serie de la pirofosforolisis y la polimerización. La amplificación
inespecífica significativa requiere la pirofosforolisis y la
incorporación incorrecta del apareamiento erróneo mediante una ADN
polimerasa, un hecho sumamente raro (Figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la PAP con dos oligonucleótidos (P* y
U), la ADN polimerasa de Tfl y el molde de ADN de los alelos
G/G y A/A. Se analizaron múltiples P* (Tabla 1). D_{5}G* (el
nucleótido de un alelo específico y el didesoxinucleótido están
co-localizados en el terminal 3') y D_{3}G* (el
nucleótido específico de un alelo está a dos bases del terminal 3')
amplificaron específicamente el alelo G en presencia de PP_{i}
(Figura 3A). Sin añadir PP_{i}, no se observó producto específico
con D_{5}G*, lo que indicó que el PP_{i} añadido era un
componente esencial para la PAP (Figura 3B, carriles 6 y 15). Se
observaron productos apenas visibles con D_{3}G* del carril 4 y
con D_{4}G* del carril 5 (Figura 3B) (véase más adelante).
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó cada uno de los parámetros
anteriores. La PAP fue más eficaz a un pH de entre 7,4 y 7,7, a una
[PP_{i}] de entre 200 \muM y 400 \muM, y a concentraciones de
[dNTP] de entre 25 \muM y 50 \muM (Tabla 2). La ADN polimerasa
de Taq puede sustituir a la de Tfl con rendimientos
similares (Tabla 2).
Para confirmar la identidad de los productos
específicos, se realizó una digestión con endonucleasas de
restricción (figura 4). Cada una de las tres endonucleasas de
restricción de AciI, EaeI y Eco0109 tiene un
sitio de restricción con el dúplex PU:UP. Se encontraron los
fragmentos de restricción esperados. Se observaron resultados
similares con D_{3}G* y U.
\global\parskip0.850000\baselineskip
Los productos específicos de la PAP con
D_{5}G* y U revelaron dos bandas específicas sobre el gel de
agarosa, i.e., PU:UP y UP; porque U fue más eficaz que D_{5}G* en
nuestras condiciones de amplificación. Para confirmar esto, se
amplificaron los alelos G/G mediante PAP usando ADN polimerasa de
Tfl con D_{5}G* y U según lo realizado anteriormente. Se
desnaturalizaron los productos y se sometieron a electroforesis a
través de un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Sólo se
observó una banda específica en forma monocatenaria, lo que indicó
que los productos especí-
ficos de la PAP contenían los segmentos de dúplex y monocatenarios. Se observó el mismo resultado con D_{3}G* y U.
ficos de la PAP contenían los segmentos de dúplex y monocatenarios. Se observó el mismo resultado con D_{3}G* y U.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la PAP para una amplificación lineal
sólo con P* de los alelos G/G y A/A en presencia de PP_{i}. Se
obtuvieron los productos específicos de la PAP con D_{3}G* y con
D_{5}G*, pero no con el otro P* (Figura 5, carriles 4 y 6). El
rendimiento de P* se vio afectado por el tamaño del oligonucleótido,
el didesoxinucleótido 3'-terminal y la posición del
nucleótido de un alelo específico.
Figuras 1A-1C: Esquema de la
PAP. Fig. 1A: Se amplifica un molde de ADN dúplex TU:UT con dos
oligonucleótidos P* y U, ADN polimerasa de Tfl, dNTP,
pirofosfato y
[\alpha-^{32}P]-dCTP. P* =
oligonucleótido activable por piro-fosforolisis. En
este ejemplo, P* es D_{5}G* y TU:UT es un segmento de 640 pb del
gen receptor de dopamina D_{1}. Fig. 1B: D_{5}G* tiene un
didesoxinucleótido G en el terminal 3', y es específico de la
cadena complementaria del alelo G, pero se aparea erróneamente con
el alelo A en el terminal 3' (Tabla 1). La eliminación del didesoxi
G por pirofosforolisis es seguida por la polimerización para cada
amplificación. Fig.1C: Autorradiograma de la PAP de los genotipos
G/G, A/A y G/A. Cuando está presente el alelo G, se generan los
productos específicos marcados radiactivamente de 469 bases (dúplex
PU:UP y cadena antisentido en exceso UP), pues la baja velocidad de
pirofosforolisis de la polimerasa de Tfl implica que el
oligonucleótido U tenga un rendimiento mucho mayor que el
oligonucleótido P*. La electroforesis durante un período más largo
de tiempo separa PU:UP de UP. Se indican otros productos de UT y
UT:TU. Cabe destacar que TU:UT deriva del apareamiento de UT
marcado radiactivamente en exceso con molde original de TU no
marcado radiactivamente. También se realizó la PAP con D_{3}G* y U
de los genotipos G/G, A/A y G/A, obteniéndose resultados
similares.
Figuras 2A-2B: Mayor
especificidad de la PAP con D_{5}G*. Se compara la
especificidad de la PAP con la de la APAE para amplificar
exponencialmente una mezcla de moldes de los alelos G y A. Fig. 2A:
La amplificación específica de la APAE deriva del alto rendimiento
de la prolongación del cebador cuando el cebador se aparea con el
alelo G. La amplificación inespecífica resulta de la prolongación
del apareamiento erróneo desde el alelo A. Cuando sucede esto, se
produce un sustrato de rendimiento para una mayor amplificación. El
espesor y la posición de la flecha representan el rendimiento de la
amplificación de cada ciclo. Fig. 2B: La amplificación específica
de la PAP del alelo G tiene lugar a un rendimiento elevado. Se
producen dos tipos de amplificaciones inespecíficas a partir del
alelo A: (i) se puede dar una amplificación inespecífica a bajo
rendimiento mediante la pirofosforolisis del apareamiento erróneo
dando como resultado un producto PU:UP del
homo-dúplex A:T, que no es un molde eficaz para una
amplificación posterior; (ii) se puede dar una amplificación
inespecífica a un rendimiento sumamente bajo tanto por la
pirofosforolisis como por la incorporación incorrecta del
apareamiento erróneo para generar el producto PU:UP del
heterodúplex G:T, pero una vez que ocurre, proporciona un molde
eficaz para una amplificación posterior. Se sugiere una tendencia de
amplificaciones inespecíficas similar para la amplificación lineal
mediante PAP sólo con D_{5}G*. Cabe destacar que el nucleótido de
un alelo específico de P*, tal como D_{3}G*, puede estar cerca,
pero no en el terminal 3'. En ese caso, la amplificación
inespecífica de la PAP necesita tanto la pirofosforolisis del
apareamiento erróneo como la prolongación del mismo. Aunque ambas
variaciones de la PAP deberían tener una especificidad más alta que
la APAE, la especificidad más elevada se predice cuando el
nucleótido didesoxi 3'-terminal también es el
nucleótido específico del alelo.
Figuras 3A-3B: Amplificación
específica con D_{5}G* y D_{3}G*. Se realizó una PAP en
presencia (Fig. 3A) o ausencia (Fig. 3B) de PP_{i} añadido con
dos oligonucleótidos para la amplificación exponencial. Los
oligonucleótidos se enumeran en la tabla 1. Los controles de la
prolongación sólo con U identifican las posiciones de TU:UT y UT.
Los controles de la prolongación con D_{1} identifican la posición
de PU. Los controles de la PCR de D_{1} y U identifican las
posiciones PU:UP y PU:UT. Sólo el 20% de la reacción de prolongación
con D_{1} y de la reacción PCR fue cargado en comparación con
otros carriles.
Figura 4: Digestión con endonucleasas de
restricción. Para demostrar la especificidad de la PAP, se
digirieron muestras del experimento mostrado en la figura 3 con las
endonucleasas de restricción AciI, EaeI y
Eco0109I. Cada enzima tiene un sitio de restricción en PU:UP.
La PAP amplificó los alelos G/G con D_{5}G* y U; y se tomó el 5%
de la reacción PCR con D_{1} y U como control. AciI produce
un fragmento de 236 pb y un fragmento de 233 pb de PU:UP y un
fragmento de 407 pb y un fragmento de 233 pb de TU:UT. EaeI
produce un fragmento de 289 pb y un fragmento de 180 pb de PU:UP y
un fragmento de 460 pb y un fragmento de 180 pb de TU:UT.
Eco0109I produce un fragmento de 348 pb y un fragmento de 121
pb de PU:UP y un fragmento de 107pb, un fragmento de 412 pb y un
fragmento de 121 pb de TU:UT. Las flechas indican los productos de
digestión esperados de PU:UP.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Figura 5: PAP lineal. Se realizó una PAP
sólo con un P* en presencia de PP_{i} añadido. Sólo el 20% de la
reacción con D_{1} fue cargado en comparación con otros carriles
(carriles 1 a 10). Sin = sin oligonucleótido añadido.
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo I proporciona pruebas de que es
posible usar la pirofosforolisis seguida por la polimerización para
aumentar la especificidad de la APAE. La significativa amplificación
inespecífica requiere el acoplamiento en serie de los dos tipos de
errores (Figura 2). La velocidad de pirofosforolisis del
apareamiento erróneo para eliminar un desoxinucleótido del
apareamiento erróneo del terminal 3', expresada como la velocidad de
eliminación de un dNMP incorrecto frente a uno correcto, ha sido
publicada como menor de 10^{-5} para la ADN polimerasa de T7 (6,
13). La velocidad de incorporación incorrecta para crear una
mutación de sustitución mediante polimerización, expresada como la
velocidad de incorporación de un dNMP incorrecto frente a uno
correcto, ha sido publicada como 10^{-5} para la ADN polimerasa
de T7 y como 10^{-4} para la ADN polimerasa I de E. coli
(6, 13, 14). Se han publicado resultados similares para la ADN
polimerasa de Taq y para los mutantes deficientes en
exonucleasa 3'-5' de la ADN polimerasa de T7 y la
ADN polimerasa I de E. coli (6, 13, 15). La especificidad
debida a (i) la amplificación inespecífica en la PAP con D_{5}G*
se estima en 10^{-5} por ciclo, si la velocidad de
pirofosforolisis del apareamiento erróneo de un ddNMP es igual que
la de dNMP. La especificidad debida a (ii) la amplificación
inespecífica se estima en 3,3 x 10^{-11}, si la pirofosforolisis
y la incorporación incorrecta del apareamiento erróneo se acoplan en
serie.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó cada P* utilizando ADN polimerasa de
Tfl o de Taq para amplificar los alelos G/G y A/A. La
amplificación específica requiere la presencia de PP_{i} y un
molde de un alelo específico. Además, el rendimiento de la
amplificación se ve afectado por el tamaño del oligonucleótido, el
didesoxinucleótido 3'-terminal y la posición del
nucleótido de un alelo específico en comparación con el terminal 3'
de P*.
No está claro por qué D_{1}G* y D_{2}G*no
generaron las señales específicas, pero puede estar relacionado con
una estabilidad umbral del dúplex entre P* y el molde. D_{6}A*,
que contiene didesoxinucleótido A en el terminal 3', no generó la
señal específica, lo que puede estar asociado con diferentes
rendimientos en la incorporación de los ddNTP por polimerización.
El fragmento de Klenow de ADN polimerasa I de E. coli, ADN
polimerasa de Taq y ADN polimerasa de \DeltaTaq
incorporan ddGTP más eficazmente que otros ddNTP (16, 17, 11). La
velocidad de incorporación de los ddNTP también varía en función de
la secuencia molde y puede ser 10 veces mayor en algunas bases en
comparación con otras (16). Otra posibilidad es que D_{6}A* tenga
un tamaño más corto con una T_{f} inferior.
En la PAP sin PP_{i} añadido, se generaron
señales falsas muy poco visibles con D_{3}G* y con D_{4}G*
(Figura 3B). Una posibilidad es que los dímeros de oligonucleótido
puedan formar y desencadenar una pirofosforolisis inespecífica de
P* en los ciclos posteriores una vez que el "endo"-PP_{i} es
liberado mediante polimerización para generar UT. D_{3}G* y
D_{4}G* con los terminales 3' degradados pueden ser hibridados y
prolongados como una señal falsa. Se observaron dímeros de
oligonucleótido con D_{3}G* y D_{4}G*. Otra posibilidad con
D_{3}G* es que la pirofosforolisis específica pueda producirse en
los ciclos posteriores, una vez liberado el "endo-" PP_{i}.
Una tercera posibilidad es que D_{3}G* y D_{4}G* fueran
contaminados con D_{3} y D_{4} mínimos que no fueran
completamente añadidos por el didesoxinucleótido G en el terminal
3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha desarrollado un número de procedimientos
para la amplificación enzimática de ácidos nucleicos in
vitro, y se pueden adaptar para detectar variantes secuenciales
conocidas. Estos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) (18,19), la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (20, 21) y
la amplificación por círculo rodante (RCA) (22, 23). La PAP es
diferente de muchos modos: i) la pirofosforolisis y la
polimerización están acopladas en serie para cada amplificación,
ii) hay al menos un didesoxioligonucleótido para la PAP. Otros
nucleótidos modificados químicamente que carecen del grupo
3'-hidroxilo en el terminal 3' pueden desempeñar la
misma función, iii) un formato es para la amplificación lineal y el
otro es para la amplificación exponencial, iv) PP_{i} es
necesario para la amplificación, v) la significativa amplificación
inespecífica requiere tanto la pirofosforolisis como la
incorporación incorrecta del apareamiento erróneo, vi) la PAP puede
detectar mutaciones puntuales conocidas y aumentar enormemente la
especificidad para detectar un alelo mutante sumamente raro del
alelo de tipo natural.
La base mecanística consiste en que dos o más
reacciones están acopladas en serie para la amplificación con un
aumento de la especificidad. El componente clave de la PAP es un
oligonucleótido activable por pirofosforolisis. El terminal 3'
bloqueado de estos experimentos es un nucleótido didesoxi, pero, en
principio, se podría sustituir por cualquier nucleótido no
prolongable susceptible a la pirofosforolisis. De hecho, cualquier
enzima que escinda un oligonucleótido 5' con respecto a un
apareamiento erróneo podría realizar la misma función que la
activación de la pirofosforolisis. Por ejemplo, un oligonucleótido
bloqueado que incluye la secuencia de reconocimiento metilada (tal
como G^{m}ATC) se aparea con su diana con la secuencia de
reconocimiento sin metilar, entonces la endonucleasa de restricción
(tal como DpnI) sólo puede escindir el sitio metilado y por
tanto activar el oligonucleótido por prolongación. Si hay un
apareamiento erróneo localizado 5' con respecto al sitio de
escisión, una amplificación inespecífica significativa requiere el
acoplamiento en serie de la escisión del apareamiento erróneo y una
incorporación incorrecta, un hecho raro. También se pueden combinar
los oligonucleótidos activables con la prolongación de un cebador
"minisecuenciador". Esto puede proporcionar un análisis más
específico para la detección de cambios de una sola base que podrían
ser particularmente adaptables a una tecnología de chips en la que
la especificidad puede ser un problema^{24}. La demostración de
que la PAP puede tener lugar en el formato lineal (Figura 5) apoya
la viabilidad de este enfoque.
Se pueden usar nucleósidos trifosfato y
2'-desoxinucleósidos trifosfato, o sus versiones
modificadas químicamente, como sustratos para la prolongación de
múltiples nucleótidos mediante la PAP, i.e., cuando se incorpora un
nucleótido, la cadena en prolongación puede seguir siendo
prolongada. Se pueden usar 2',3'-didesoxinucleósidos
trifosfato o sus versiones modificadas químicamente que sean
terminadores de una mayor prolongación para la prolongación de un
solo nucleótido. Los 2',3'-didesoxinucleósidos
trifosfato se pueden marcar con un colorante de radiactividad o de
fluorescencia para su diferenciación del didesoxinucleótido
3'-terminal del oligonucleótido P*. También se
pueden usar mezclas de nucleósidos trifosfato o
2'-desoxinucleótidos trifosfato y
2',3'-didesoxinucleósidos trifosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
En la PAP, se produce una secuencia de ácido
nucleico específica usando el ácido nucleico que contiene la
secuencia como molde. Si el ácido nucleico contiene dos cadenas, es
necesario separar las cadenas del ácido nucleico antes de poder
usarlo como molde, bien en una etapa diferente o simultáneamente. La
separación de cadenas también se puede realizar mediante cualquier
otro procedimiento adecuado, incluyendo procedimientos físicos,
químicos o enzimáticos.
Cuando se desee generar más de un producto
específico a partir del ácido nucleico o la mezcla de ácidos
nucleicos original, se utiliza el número apropiado de
oligonucleótidos diferentes. Por ejemplo, si se van a generar dos
productos específicos diferentes exponencialmente, se utilizan
cuatro oligonucleótidos. Dos de los oligonucleótidos (P*\geq1)
son específicos de una de las secuencias de ácidos nucleicos
específicas y los otros dos oligonucleótidos (P*\geq1) son
específicos de la segunda secuencia de ácidos nucleico específica.
De este modo, se puede producir exponencialmente cada una de las
dos secuencias específicas diferentes mediante el presente
procedimiento.
El ADN o el ARN puede ser mono- o bicatenario,
puede ser una especie relativamente pura o un componente de una
mezcla de ácidos nucleicos, y puede ser lineal o circular. El ácido
o los ácidos nucleicos se pueden obtener de cualquier fuente, por
ejemplo, de un plásmido, de ADN o ARN clonado, o de ADN o ARN
natural de cualquier origen, incluyendo bacterias, levadura, virus
y organismos superiores, tales como plantas o animales. El ADN o el
ARN se puede extraer de sangre, material tisular, tal como células
de las vellosidades coriónicas o amnióticas mediante una variedad
de técnicas, tales como la descrita por Maniatis et al.,
(25).
Los oligonucleótidos P* se seleccionan para que
sean "sustancialmente" complementarios a las diferentes cadenas
de cada secuencia específica por ser amplificada. Por lo tanto, la
secuencia del oligonucleótido P* no necesita reflejar la secuencia
exacta del molde. Por ejemplo, un segmento de nucleótidos no
complementarios puede estar unido al extremo 5' del oligonucleótido
P*, siendo el resto de la secuencia de oligonucleótido P*
complementaria a la cadena. Alternativamente, se pueden intercalar
dentro del oligonucleótido P* secuencias de bases no complementarias
o más largas, siempre y cuando la secuencia del oligonucleótido P*
sea lo suficientemente complementaria con la secuencia de la cadena
por ser amplificada como para hibridarse no aleatoriamente con la
misma y formar un molde para la síntesis del producto de
prolongación del otro oligonucleótido P*. Como se usa en las
reivindicaciones, se debería entender que
el término "complementario" significa "sustancialmente complementario", según lo tratado en la presente memoria.
el término "complementario" significa "sustancialmente complementario", según lo tratado en la presente memoria.
Se puede producir cualquier secuencia de ácido
nucleico específica mediante el presente procedimiento. Sólo es
necesario que un número suficiente de bases de ambos extremos de la
secuencia sea conocido con suficiente detalle tal que dos
oligonucleótidos se puedan hibridar con diferentes cadenas de la
secuencia deseada en las posiciones relativas a lo largo de la
secuencia. Cuanto mayor sea el conocimiento acerca de las bases en
ambos extremos de la secuencia, mayor puede ser la especificidad de
los oligonucleótidos por la secuencia de ácido nucleico diana, y
por tanto, mayor será el rendimiento del procedimiento. Se entenderá
que la palabra oligonucleótido, como se usa en lo sucesivo, puede
referirse a más de un oligonucleótido, particularmente, en el caso
en que exista cierta ambigüedad en la información relativa a
la(s) secuencia(s) terminal(es) del segmento
por ser amplificado. Un oligonucleótido de esta colección será 100%
homólogo al extremo de la secuencia deseada por ser amplificada.
La presente invención se puede realizar por
etapas, en cuyo caso tras cada etapa se añaden nuevos reactivos, o
simultáneamente, en cuyo caso los reactivos son añadidos en la etapa
inicial, o parcialmente por etapas y parcialmente simultáneamente,
en cuyo caso se añade reactivo recién preparado tras un número dado
de etapas. Se puede utilizar el procedimiento simultáneo cuando se
use un procedimiento enzimático para la etapa de separación de
cadenas. En el procedimiento simultáneo, la mezcla de reacción puede
contener la enzima separadora de cadenas (p. ej., helicasa), una
fuente de energía apropiada para la enzima separadora de cadenas,
tal como ATP. Se pueden añadir más materiales según sea
necesario.
La polimerasa de ácido nucleico puede ser
cualquier compuesto o sistema que funcione para realizar la
amplificación. Las enzimas adecuadas a este efecto incluyen, por
ejemplo, ADN polimerasa de Tfl, ADN polimerasa de Taq,
ADN polimerasa I de E. coli, fragmento de Klenow de ADN
polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa de T4, ADN
polimerasa de T7, otras ADN polimerasas disponibles, transcriptasa
inversa y otras versiones diseñadas genéticamente. Se predice en
base a la relación entre las reacciones inversas y directas que una
ADN polimerasa tendrá una actividad de pirofosforolisis elevada y
uniforme para el oligonucleótido activable P* si incorpora ddNTP
eficazmente (en comparación con dNTP) y uniformemente (comparando
entre los cuatro ddNTP). De todas las ADN polimerasas, la versión
diseñada genéticamente puede ser la mejor en el futuro, tal como la
ThermoSequenase (2). Generalmente, la síntesis se iniciará en el
extremo 3' de cada oligonucleótido y continuará en el sentido 5' a
lo largo de la cadena molde. Sin embargo, también se pueden usar
agentes inductores que inicien la síntesis en el extremo 5' y
continúen en el otro sentido en el procedimiento de PAP según lo
descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó una región de 640 pb del gen
receptor de la dopamina D_{1} humana por PCR con dos cebadores (T
= 5' GAC CTG CAG CAA GGG AGT CAG AAG 3' (SEC ID N.º 1) y U = 5' TCA
TAC CGG AAA GGG CTG GAG ATA 3' (SEC ID N.º 2)). El dúplex
resultante TU:UT abarca los nucleótidos 33 al 672 en X55760 del
GenBank, siendo el contenido de G+C del 55%. Hay un polimorfismo
común de A a G ubicado en el nucleótido 229, dando como resultado
tres genotipos de G/G, A/A y G/A ^{11}. El volumen de la PCR es
de 50 \mul: KCl 50 mM; Tris/HCl 10 mM, pH 8,3; MgCl_{2} 1,5 mM;
200 \muM de cada uno de los cuatro dNTP; 0,1 \muM de cada
cebador; DMSO al 2%; 1 U de ADN polimerasa de Taq
(Boehringer Mannheim) y 250 ng de ADN genómico del homocigoto G/G,
del homocigoto A/A o de los heterocigotos G/A. Las condiciones de
los ciclos incluyeron: desnaturalización a 94ºC durante 15 s.,
apareamiento a 55ºC durante 30 s. y alargamiento a 72ºC durante un
min., para un total de 35 ciclos un Sistema PCR GeneAmp modelo 9600
(Perkin Elmer Applied Biosytems). Se purificó el producto de la PCR
a partir de los cebadores y otras moléculas pequeñas en
aproximadamente 10.000 veces en tres tiempos de retención sobre un
microconcentrador Centricon® 100 (Amicon). Se determinó la cantidad
del producto de la PCR recuperado por absorbancia UV a 260 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizó el oligonucleótido desoxinucleótido
con un sintetizador Perseptive Biosystems 8909 (Framinsham) y se
purificó con cartuchos oligopure (Hamilton) en el laboratorio de
Química de ADN/ARN de City of Hope. Se añadió el didesoxinucleótido
3'-terminal mediante transferasa terminal. La mezcla
contenía un volumen total de 30 \mul: cacodilato de potasio 100
mM (pH 7,2); CoCl_{2} 2,0 Mm; DTT 0,2 mM; 2500 pM del
oligonucleótido; 2',3'-ddNTP 2 mM (la proporción
molar del terminal 3'-OH con respecto a ddNTP era de
1:24) (Boehringer Mannheim); 100 U de transferasa terminal (GIBCO
BRL). Se incubó la reacción a 37ºC durante 4 h y luego se detuvo
añadiendo EDTA a una concentración final de 5 mM. Tras desalinizar
usando una columna Centri-spin^{TM} (Princeton
Separations), se purificó P* mediante electroforesis preparativa
sobre urea 7M/gel de poliacrilamida al 20% en tampón de TBE
(Tris/borato 90 mM; EDTA 1 mM, pH 8,3) (25). Se determinó la
cantidad del P* recuperado por absorbancia UV a 260 nm.
Como pequeñas cantidades de oligonucleótido sin
terminar resultarían en inespecificidad de la pirofosforolisis, se
marcó con ^{32}P cada P* en el terminal 5' con polinucleótido
cinasa de T4, y luego se sometió a electroforesis a través de urea
7M/gel de poliacrilamida al 20%. Sólo se hicieron visibles productos
de P*, incluso al sobre-exponer el gel (datos no
mostrados). Se estima que más del 99,99% de P* contenía un
didesoxinucleótido en el terminal 3'. La pureza de P* fue apoyada
por la ausencia de producto de la PCR o de producto de la PAP a un
pH de 8,3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificaron regiones de 445 a 469 pb del
molde dúplex TU:UT mediante PAP con los oligonucleótidos P* y U, o
sólo con un P*. El dúplex resultante PU:UP corresponde a los
nucleótidos 204-228 al 672 en X55760 del GenBank,
siendo el contenido de G+C del 56%. La mezcla de reacción de la PAP
contenía un volumen total de 25 \mul: KCl 50 mM; Tris/HCl 10 mM
(pH 7,6); MgCl_{2} 1,5 mM; 100 \muM de cada uno de los cuatro
dNTP (dATP, dTTP, dGTP y dCTP); P* 0,1 \muM; 0,1 \muM de
oligonucleótido U (TCATACCGGAAAGGGCTGGAGATA (SEC ID N.º 2));
Na_{4}PP_{i} 300 \muM; DMSO al 2%; 1 \muCi de
[\alpha-^{32}P]-dCTP (3000
Ci/nmol, Amersham), 1 U de ADN polimerasa AmpliTaqFs (PE
Applied Biosystems) o 0,5 U de cada una de las ADN polimerasas de
Taq o AmpliTaqFS; y 10 ng de TU:UT. ThermoSequenase
(Amersham Pharmacia) también fue analizada en las mismas
condiciones, a excepción de las 8 U de ThermoSequenase o las 4 U de
ThermoSequenase más 0,5 U de Taq y MgCl_{2} 2,5 mM. Las
condiciones de los ciclos incluyeron: desnaturalización a 94ºC
durante 10 s., apareamiento a 60ºC durante 1 min. (a 55ºC para la
ThermoSequenase) y alargamiento a 72ºC durante 2 min., para un total
de 15 ciclos.
Se sometió el producto a electroforesis a través
de un gel de agarosa al 2% estándar. Se tiñó el gel con bromuro de
etidio para realizar una fotografía UV con una cámara CCD
(Bio-Rad Gel Doc 1000) y el programa informático
Multi-Analyst®, se secó y se sometió a una película
de AR X-OMAT^{TM}de Kodak para autorradiografía.
Se cuantificó el rendimiento de la PAP con un PhosphorImager con el
programa informático ImageQuant (Molecular Dynamics) como el número
total de píxeles de la banda de la PCR menos el fondo, indicado como
una unidad aleatoria.
\vskip1.000000\baselineskip
En el ejemplo 1, sólo se amplificó el P* con ddG
en el terminal 3' usando ADN polimerasa de Tfl o Taq
nativa. Se descubrió que las ADN polimerasas AmpliTaqFs y
ThermoSequenase alcanzan un rendimiento de la PAP mucho mayor con
mucho menos discernimiento frente a cualquier clase de
didesoxinucleótido (ddAMP, ddTMP, ddGMP o ddCMP) en el terminal 3'
de P*. Por ejemplo, P*(212)18G^{0} y
P*(212)18A^{0}, que son 18-meros del gen
receptor de dopamina D_{1}, pero que tienen ddGMP y ddAMP en el
terminal 3' (Tabla 3), amplificaron específicamente los alelos G y
A, respectivamente. Su proporción entre rendimientos fue de 1,4
(comparar el carril 9 con el 11 en la figura 6B), y así se estima
que P*(212)18G^{0} es un 4% más eficaz por ciclo que
P*(212)18A^{0}. Otro P*(228)26^{-24} = 5'
TAGGAACTTGGGGGGTGTCAGAGCCC* 3' (SEC ID N.º 12), que es un
26-mero con ddCMP en el terminal 3', fue amplificado
tan eficazmente como un cebador sin ddCMP en el terminal 3', y se
estimó que el rendimiento aumentó 1.000 veces en comparación con el
obtenido usando Tfl o Taq. Además, la PAP amplificó
segmentos directamente a partir de ADN genómico humano.
AmpliTaqFs tiene dos mutaciones en
comparación con la Taq nativa. Una mutación ubicada en el
dominio nucleasa 5' elimina la actividad exonucleasa
5'-3' y la segunda mutación F667Y ubicada en el
sitio activo (38). ThermoSequenase tiene la misma mutación F667Y en
el sitio activo, pero una eliminación del dominio exonucleasa
5'-3' (39, 40). No distinguen entre dNTP y ddNTP
para su incorporación. Se supone que la pirofosforolisis de los
ddNMP, que es la reacción inversa, es mucho más elevada y menos
discernida por estas enzimas. Aunque bien la ADN polimerasa
AmpliTaqFs o la ThermoSequenase usadas fueron formuladas para
que contuvieran una pirofosfatasa termoestable (instrucciones de los
fabricantes) que pudiera hidrolizar PP_{i} en la reacción para
disminuir el rendimiento de la PAP, la PAP siguió siendo amplificada
en nuestras condiciones. Las ADN polimerasas AmpliTaqFs y
ThermoSequenase funcionarán mejor en su forma pura sin la
pirofosfatasa contaminada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinaron diversos P* con diferentes
longitudes y apareamientos erróneos usando AmpliTaqFs (Tabla
3). El efecto de la longitud y del apareamiento erróneo en el
rendimiento de la PAP se expresa como el rendimiento relativo (%)
entre dos P* de diferentes longitudes desde el mismo molde (Figura
7), que varió de 0,0% a 201,5%, siendo cada uno de dos a cuatro
bases menos de longitud. La especificidad de la PAP también se ve
afectada por la longitud y el apareamiento erróneo de P* (Tabla 3).
La proporción de ruido (%) se define como el rendimiento relativo
del producto con apareamiento erróneo con respecto al producto con
apareamiento, y una proporción de ruido <10% indica una señal
específica. Cuando la base de un alelo específico de P* resultó
estar en el terminal 3', sólo se amplificó el alelo específico y la
especificidad no estaba asociada con la longitud de P* (Figura 7A).
Cuando la base de un alelo específico no resultó estar en el
terminal 3' de P*, la especificidad estaba asociada con la longitud
de P*. Cualquier apareamiento erróneo no 3'-terminal
del P* 18-mérico, que resultó ser de hasta 15 bases
a partir del terminal 3', no produjo amplificación (figuras 7B a
7E), pero incluso dos de tales apareamientos erróneos del P*
26-mérico provocaron una amplificación inespecífica
(datos no mostrados).
Los 18-meros se examinaron en
mayor profundidad usando P* "apilados", que abarcan la base de
un alelo específico en diferentes posiciones (Tabla 4). La
proporción de ruido (%) varió de 0,0% a 7,1%. La longitud de la
subsecuencia específica de 3' fue de \geq 13 bases.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron resultados similares usando P* que
se apareaban y se apareaban erróneamente con el alelo G en
diferentes posiciones (Tabla 5). La proporción de ruido con un
apareamiento erróneo fue diversa de 0,8% al 5,6%. La longitud de la
subsecuencia específica de 3' fue de \geq 16 bases. La proporción
de ruido con dos apareamientos erróneos fue del 0% (comparar el
carril 2 con los carriles 10-15 de la figura 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la PAP lineal usando sólo P*
18-méricos, y se observó una especificidad más
elevada con una proporción de ruido inferior (Tablas 4 y 5). La PAP
lineal toma una ruta mecanística diferente en la que cada producto
inespecífico es generado a partir del molde inicial que requiere una
pirofosforolisis apareada erróneamente con el P* apareado
erróneamente 3'-terminal, o tanto una
pirofosforolisis apareada erróneamente como una prolongación
apareada erróneamente con el P* apareado erróneamente no
3'-terminal.
LA APAE se realizó con cebadores
17-méricos sin la adición de un ddNMP en el terminal
3' (véanse las tablas 4 y 5). Un cebador 17-mérico
apareado erróneamente amplificó fuertemente un producto inespecífico
con una proporción de ruido del 30%, cuando el apareamiento erróneo
estaba tan cerca como a 6 bases del terminal 3', mostrando una
subsecuencia específica de 3' mucho más corta. Se han publicado
resultados en otra parte anteriormente (41).
En resumen, P* (longitud 1) tiene dos
subsecuencias: una subsecuencia específica de 3' (n = el número de
bases de la subsecuencia específica de 3' \leq 1) determina la
especificidad, i.e., dentro de esta región cualquier apareamiento
erróneo con su cadena complementaria del molde da como resultado una
falta de amplificación; y una subsecuencia potenciadora de 5' (m =
el número de bases de la subsecuencia potenciadora de 5' \geq 0)
aumenta el rendimiento de la amplificación. La especificidad de la
PAP está co-determinada por la especificidad del
apareamiento de bases de la subsecuencia específica de 3', la
especificidad de la pirofosforolisis y la especificidad de la
polimerización. De este modo, la especificidad del apareamiento de
bases de la subsecuencia específica de 3' es un requisito mínimo de
la especificidad de la PAP.
La longitud de la subsecuencia específica de 3'
de P* puede verse afectada por el contexto y el tamaño de la
secuencia del P*, el tipo de didesoxinucleótido
3'-terminal, la secuencia molde, la ADN polimerasa,
otros componentes como el hierro y las condiciones de los ciclos.
Cuando el molde contiene secuencias repetidas > 1 o series de
polímero homogéneo > 1, P* pierde la especificidad de
anclaje.
\vskip1.000000\baselineskip
La propiedad de la subsecuencia específica de 3'
de P* se puede aplicar a la exploración de variantes secuenciales
desconocidas o a la re-secuenciación de secuencias
predeterminadas de un modo paralelo. Cada nucleótido de la cadena
complementaria de la secuencia predeterminada es solicitado por
cuatro P* secuencia abajo, tales como 18-meros
(Figura 6), que tienen una secuencia idéntica, a excepción de que en
el terminal 3', bien ddAMP, ddTMP, ddGMP o ddCMP corresponde a la
secuencia de tipo natural y las tres posibles sustituciones de una
sola base. El número de los P* que exploran la cadena complementaria
de x bases es la multiplicación de 4 por x, que es adecuada bien
para la PAP exponencial o lineal. Los cuatro P* de secuencia abajo
pueden estar incluso inmovilizados en un solo punto cuando los
ddAMP, ddTMP, ddGMP y ddCMP del terminal 3' están marcados de manera
diferente para su diferenciación, tal como, con cuatro colorantes de
fluorescencia. Por lo tanto, es posible representar la señal de
amplificación mediante la disminución de la intensidad de cada
colorante al eliminar el ddNMP de P* mediante pirofosforolisis. Una
ventaja de la PAP lineal es que los cuatro ddNTP se pueden usar como
sustratos para prolongaciones de una sola base, estando marcados con
diferentes colorantes para su diferenciación.
En síntesis, si sólo se amplifican
específicamente todos los P* correspondientes a la secuencia de tipo
natural, se puede disponer la secuencia de tipo natural en orden
para analizar los solapamientos. Un P* que tenga una sustitución de
una sola base en el terminal 3' es amplificado en la posición de las
mutaciones hemi- u homo-puntuales. La mutación
también crea un "hueco" de no señal de PAP, que abarca una
región de varios nucleótidos sucesivos. Para la sustitución de una
sola base, el tamaño del hueco (bases) + 1 = la longitud de la
subsecuencia específica
de 3'.
de 3'.
Además, también es posible explorar la cadena
sentido diseñando un segundo conjunto de P* secuencia arriba. Se
puede determinar una sustitución de una sola base desconocida
mediante la combinación de los dos conjuntos de P*, incluso en
heterocigotos. Es posible detectar y localizar una eliminación y una
inserción pequeñas desconocidas. Para identificar un tipo específico
de eliminación o inserción, es posible añadir los correspondientes
P*. Para la impresión digital, que puede proporcionar información
sobre la posición de la mutación, existe un modo de apilamiento
simple en el que la región apilada de cada dos P* sucesivos < a
la subsecuencia específica de 3' del alineamiento para reducir el
número de P* en hasta n veces.
\vskip1.000000\baselineskip
El concepto de secuenciación de ADN de
novo mediante la PAP hace uso de todas las posibles
subsecuencias específicas de 3' de P* para identificar la presencia
de la subsecuencia específica de 3' en la secuencia de novo.
Un conjunto completo de las subsecuencias específicas de 3' de P* es
4^{n}. Cada subsecuencia específica de 3' tiene un subconjunto
completo de la subsecuencia potenciadora de 5' de 4^{m}. Por
ejemplo, se puede indicar un conjunto completo de
16-mero como la subsecuencia específica de 3' y de
2-mero como la subsecuencia potenciadora de 5' como
(A, T, G, C)(A, T, G, C) N_{16} = 4^{18}.
En síntesis, el procedimiento determina primero
la lista de todas las amplificaciones específicas de la PAP y luego
reconstruye la secuencia complementaria de ADN desconocida a partir
de esta lista ordenando las subsecuencias específicas de 3' con la
longitud dada mediante el uso de las reglas de apareamiento de
Watson-Crick.
El procedimiento de ensamblaje se ve
interrumpido cada vez que se encuentra una subsecuencia específica
de 3' dada de P*. Uno de los factores que influyen en la longitud de
secuenciación máxima es la longitud de la subsecuencia específica de
3'. La longitud de una secuencia aleatoria que puede ser
reconstruida claramente mediante un conjunto completo de la
subsecuencia específica de 3' con la longitud dada es
aproximadamente la raíz cuadrada del número de la secuencia
específica de 3' en el conjunto completo con \geq 50% de
posibilidad de que cualquier subsecuencia específica de 3' dada no
sea encontrada dos o más veces. Los octámeros de la subsecuencia
específica de 3', de los que hay 65.536, pueden ser útiles en el
intervalo de hasta 200 bases. Los decanucleótidos, de los que hay
más de un millón, pueden analizar una secuencia de novo de
hasta una kilobase. Los P* 18-méricos que contienen
un 16-mero como la subsecuencia específica de 3',
cuyo conjunto completo es 4^{18} de P*, pueden secuenciar un
máximo de 77.332 bases.
Cuando hay una secuencia vecina conocida se
puede diseñar un oligonucleótido opuesto para la PAP con dos
oligonucleótidos. La longitud de secuenciación máxima se limita
principalmente al oligonucleótido opuesto, pero no a la longitud de
la subsecuencia específica de 3' de P*, lo que se denomina
secuenciación de ADN de novo
condicional.
condicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la impresión digital que compara dos
secuencias de ADN para ver si son iguales o diferentes, existe un
modo simple para reducir el número de P* usando un conjunto
incompleto de las subsecuencias específicas de 3'. Ordenándolas en
un determinado orden, es posible identificar las ubicaciones
cromosómicas así como las secuencias. Teniendo en cuanta las 3 x
10^{9} pb de ADN del genoma humano, se prefiere la PAP con dos
oligonucleótidos frente a la PAP con sólo un P* para aumentar la
especificidad.
Para controlar el perfil de expresión génica, en
el que se expresan hasta 6 x 10^{4} a 10^{5} transcriptos, y no
es necesario contar con la información de la secuencia exacta, se
puede aplicar la PAP con sólo un P* y se puede diseñar un conjunto
de P* que identifique motivos únicos en los genes con una longitud
total de hasta la de un 22-mero. Entre cada
dos P*, hay al menos una diferencia secuencial en el terminal 3' o \geq 2 diferencias secuenciales en el terminal no 3'.
dos P*, hay al menos una diferencia secuencial en el terminal 3' o \geq 2 diferencias secuenciales en el terminal no 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
En la SBH mediante el uso de oligonucleótido, la
secuencia de ADN se determina mediante la hibridación y el
ensamblaje de sondas de sondas que se hibridan positivamente a
través de las partes solapantes. Hace mucho tiempo que se sabe que
la hibridación de un solo oligonucleótido sobre una muestra
inmovilizada puede ser muy específica en condiciones de hibridación
y lavado óptimas (42), por lo que es posible diferenciar híbridos
perfectos de los que contienen un solo apareamiento erróneo interno.
Los oligonucleótidos en alineamiento tienen una longitud de
11-20 nucleótidos y tienen una región específica de
7-9 bases en la mitad, siendo la señal inespecífica
generada mediante hibridación apareada erróneamente. En condiciones
de hibridación y lavado estándar, la estabilidad del dúplex entre
el apareamiento y el apareamiento erróneo también se ve afectada por
el apareamiento erróneo terminal y la secuencia flanqueadora (32,
33, 43).
La SHB se puede modificar con enzimas de varios
modos (26, 44). La prolongación con cebadores mediante una ADN
polimerasa incorpora las bases de una en una sólo si se aparean con
la cadena complementaria. La ligasa tiene necesidades similares: se
pueden unir dos oligonucleótidos enzimáticamente, siempre y cuando
ambos sean complementario al molde en la posición de unión.
Figuras 6A-6B: Aumento del
rendimiento de la PAP. Fig. 6A: La PAP es amplificada con dos
oligonucleótidos P* y U del molde de dúplex TU:UT. Cada uno de los
cuatro P* tiene un ddA, ddT, ddG y ddC en el terminal 3'. La base
3'-terminal es bien específica de la cadena
complementaria de los alelos G o A, o no se aparea. Fig. 6B:
Autorradiograma de la PAP de los genotipos G/G, A/A y G/A del gen
receptor de dopamina humano. Se generan los productos específicos
marcados radiactivamente de 461 bases (dúplex PU:UP y cadena
antisentido en exceso UP). Se indican otros productos secundarios
de UT y UT:TU. Cabe destacar que TU:UT deriva del apareamiento de
UT marcado radiactivamente en exceso con molde original de TU no
marcado radiactivamente.
Figuras 7A-7E: Efecto de la
longitud y el apareamiento erróneo de P* sobre el rendimiento de la
PAP. La PAP fue amplificada con el oligonucleótido P* y U
(véase la tabla 3). En cada una de las figuras
7A-7E, los P* tienen los terminales 3' de la
muestra, pero tienen una longitud diferente. Fig. 7A: En los
carriles 1-4, los P* se aparearon y amplificaron el
alelo G. En los carriles 5-8, los P* se aparearon
erróneamente en los terminales 3', pero amplificaron el alelo A.
Fig. 7B: En los carriles 9-12, los P* se aparearon y
amplificaron el alelo G. En los carriles 13-16, los
P* se aparearon erróneamente a 12 bases de los terminales 3', pero
amplificaron el alelo A. Fig. 7C: En los carriles
17-20, los P* se aparearon y amplificaron el alelo
A. En los carriles 21-24, los P* se aparearon
erróneamente a 2 bases de los terminales 3', pero amplificaron el
alelo G. Fig. 7D: En los carriles 25-28, los P* se
aparearon erróneamente a 9 bases del terminal 3', pero amplificaron
el alelo A. Fig. 7E: En los carriles 29-32, los P*
se aparearon erróneamente a 15 bases de los terminales 3', pero
amplificaron el alelo A. El efecto de la longitud se indica como la
proporción entre el rendimiento en un carril (L_{n}) con respecto
a la del carril anterior (L_{n-1}). No se observó
el efecto de la longitud en los carriles 5-8,
porque las señales están en o cerca del fondo.
Figura 8: Especificidad de la PAP con P*
colocados en diferentes posiciones. La PAP fue amplificada con
un oligonucleótido P* y U (véase la tabla 4). P* se apareó con y
amplificó el alelo G en los carriles 2-7, pero se
apareó erróneamente con y amplificó el alelo A en los carriles
9-15. Los carriles 1 y 9 fueron el control de la PCR
con D_{1}(212)17-mero y U. Los
carriles 8 y 16 fueron el control de la prolongación sólo con U.
Figura 9: Especificidad de la PAP con P*
apareados erróneamente de diferentes maneras. La PAP fue
amplificada con un oligonucleótido P* y U (véase la tabla 5). En los
carriles 2-7, P* amplificó el alelo G con
apareamiento y un apareamiento erróneo. En los carriles
9-15, P* amplificó el alelo A con uno o dos
apareamientos erróneos. Los carriles 1 y 9 fueron el control de la
PCR con D_{1}(212)17-mero y U. Los
carriles 8 y 16 fueron el control de la prolongación sólo con U.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la amplificación de la PAP
directamente a partir de ADN genómico. A continuación se enumeran
los oligonucleótidos usados en este ejemplo. Los números de carril
se refieren a los carriles de la figura 10.
Los oligonucleótidos de secuencia abajo a
concentración 0,1 \muM son:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Carril 1: D _{1} (204)25D 5'
TCTGACTGACCCCTATTCCCTGCTT 3' \+ (SEC ID N.º 43)\cr \+\cr Carril 2:
P*(206)24A ^{0} 5' TGACTGACCCCTATTCCCTGCTT A * 3' \+
(específico del alelo A; SEC ID N.º 44)\cr \+\cr Carril 3:
P*(204)26G ^{0} 5' TCTGACTGACCCCTATTCCCTGCTT G * 3' \+
(específico del alelo G; SEC ID N.º 45)\cr \+\cr Carril 4:
P*(206)24G ^{-2} 5' ACTGACCCCTATTCCCTGCTT G GG* 3' \+
(específico del alelo G; SEC ID N.º 46)\cr \+\cr Carril 5:
P*(228)26A ^{-24} 5' TAGGAACTTGGGGGGTGTCAGAGCCC* 3' \+
(específico del alelo A; SEC ID N.º
47)\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
El oligonucleótido opuesto de secuencia arriba a
concentración 0,1 \muM es: D_{1}(420)24U 5'
ACGGCAGCACA
GACCAGCGTGTTC 3' (SEC ID N.º 48), que fue apareado con cada oligonucleótido de secuencia abajo. Para más información, véanse las notas al pie de la tabla 3.
GACCAGCGTGTTC 3' (SEC ID N.º 48), que fue apareado con cada oligonucleótido de secuencia abajo. Para más información, véanse las notas al pie de la tabla 3.
El resto de los componentes fueron los mismos
que en el ejemplo 2, a excepción de lo siguiente: 0,5 U de cada una
de las ADN polimerasas AmpliTaqFs y de Taq, y se
usaron 100 ng del ADN genómico alélico del heterocigoto G/A por 25
\mul de reacción mediante el uso de 30 ciclos.
El tamaño de los productos de la PAP varía de
193 pb a 218 pb. Se observaron un producto bicatenario y un producto
monocatenario sobre el gel, lo que indicó el agotamiento del
PP_{i} hidrolizado por la pirofosfatasa termoestable
contaminada.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Parsons, B.L. y Heflich, R.H.
Mutat. Res. 387, 97-121 (1997).
2. Pourzand, C. y Cerutti, P.
Mutat. Res. 288, 113-121 (1993).
3. Knoll, A., Ketting, R.P. y
Sommer, S.S. Hum. Genet. 98, 539-545
(1996).
4. Sarkar, G., Cassady, J.,
Bottema, C.D.K. y Sommer, S.S. Anal. Biochem.
186, 64-68 (1990).
5. Duetcher, M.P. y Kornberg, A.,
J. Bio. Chem. 244, 3019-3028
(1969).
6. Kornberg, A. y Baker, T.A.,
"DNA Replication", (II edición) 113-226 (W.H.
Freeman and Company, Nueva York 1992).
7. Chien, A., Edgar, D.B. y
Trela, J.M., J. Bacteriol. 127,
1550-1557 (1976).
8. Kaledin, A.S., Sliusarenko,
A.G. y Gorodetskii, S.I., Biokhimiia 46,
1576-1584 (1981).
9. Longley, M.J., Bennett, S.E. y
Mosbaugh, D.W., Nucleic Acids Res. 18,
7317-7322 (1990).
10. Tabor, S. y Richardson, D.C.
"DNA sequence analysis with a modified bacteriophage T7 DNA
polymerase". J. Bio. Chem. 265, 8322-8328
(1990).
11. Vander Horn, P.B., Davis,
M.C., Cunniff, J.J., Ruan, C., McArdle, B.F.,
Samols, S.B., Szasz, J., Hu, G., Hujer,
K.M., Domke, S.T., Brummet, S.R., Moffett,
R.B., Fuller, C.W. BioTechnigues 22,
758-762 (1997).
12. Liu, Q., Sobell, J.L. and
Sommer, S.S., Am. J. Med. Genet. (Neuropsych. Genet.)
60, 165-171 (1995).
13. Wong, I., Patel, S.S. y
Johnson, K.A. Biochemistry 30, 526-537
(1991).
14. Bebenek, K., Joyce, C.M.,
Fitzgerald, M.P. y Kunkel, T.A. J. Bio. Chem.
265, 13878-13887 (1990).
15. Eckert, K.A. y Kunkel, T.A.
Nucleic Acids Res. 18, 3739-3744
(1990).
16. Sanger, F., Nichlen S. y
Coulson, A.R. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 75,
5463-5467 (1977).
17. Tabor, S. y Richardson, C.C.
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92, 6339-6343
(1995).
18. Saiki, R.K., Scharf, S.,
Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T.,
Erlich, H.A. y Amheim, N. Science 230,
1350-1354 (1985).
19. Saiki, R.K., Gelfand, D.H.,
Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R.,
Horn, G.T., Mullis, K.B. y Erilich, H.A.
Science 239, 487-491 (1988).
20. Landegren, U., Kaiser, R.,
Sanders, J. y Hood, L. Science 241,
1077-1080 (1988).
21. Barany, F. Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 88, 189-193 (1991).
22. Lizardi, P.M., Huang, X.,
Zhu, Z., Bray-Ward, P., Thomas,
D.C. y Ward, D.C. Nature Genetics 19,
225-232 (1998).
23. Banér, J., Nilsson, M.,
Mendel-Hartvig, M. y Landegren, U.
Nucleic Acids Res. 26, 5073-5078
(1998).
24. Syvanen, A.C. Hum. Mutat. 13,
1-10 (1999).
25. Maniatis, T., Fritsch, E.F. y
Sambrook, J. "Molecular Cloning: a Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor
Laboratory, 1982.
26. Miyada, C.G. y Wallace, R.B.
"Methods in Enzymology" 154, 94-107
(1987).
27. Sanger, F., Nichlen, S. y
Coulson, A.R. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 75,
5463-5467 (1977).
28. Maxam, A.M. y Gilbert, W.
Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 74, 560-564
(1977).
29. Ronaghi, M., Uhlen, M. y
Nyren, P. Science 281, 363, 365 (1998).
30. Lysov, I., Florent'ev, V.L.,
Khorlin, A.A., Khrapko, K.R. y Shik, V.V. Dokl
Akad NaukSSSR303, 1508-1511 (1988).
31. Bains W. y Smith G.C. J.
Theor. Biol. 135, 303-307 (1988).
32. Drmanac, R., Labat, I.,
Brukner, I. y Crkvenjakov, R. Genomics 4,
114-128 (1989).
33. Khrapko, K.R., Lysov, Y.,
Khorlyn, A.A., Shick, V.V., Florentiev, V.L. y
Mirzabekov, A.D. FEBS Lett 256.
118-122 (1989).
34. Pevzner P.A. J. Biomol. Struct.
Dyn. 7, 63-73 (1989).
35. Southern, E.M., Maskos, U. y
Elder, J. K. Genomics 13, 1008-1017
(1992).
36. Liu, Q., Sobell, J.L. y
Sommer, S.S. Am J. Med. Genet.(Neuropsych.Genet.) 60,
165-171 (1995).
37. Maniatis, T. Fritsch, E.F. y
Sambrook, J. "Molecular cloning: a laboratory manual"
(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva
York, 1982).
38. Innis, M.A. y Gelfand, D.H. en
"PCR APPLICATIONS Protocols for Functional Genomics" (eds
Innis, M.A., Gelfand, D.H. y Sninsky, J.J.) 3-22
(Academic Press, 1999).
39. Tabor. S. y Richardson. C.C.
Proc Natl Acad Sci, EE.UU. 92, 6339-6343
(1995).
40. Van der Horn. P.B., Davis.
M.C., Cunniff. J.J., et al. BioTechniques 22,
758-762 (1997).
41. Sarkar, G., Cassady, J.,
Bottema, C.D.K. y Sommer, S.S. Anal. Biochem.
186,64-68 (1990).
42. Wallace, R.B., Shaffer, J.,
Murphy, R.F., Bonner, J., Hirose, T. y
Itakura, K. Nucleic Acids Res 6,
3543-3557 (1979).
43. Ginot, F. HumMutat 10,
1-10 (1997).
44. Southern, E.M. Trends Genet
12, 110-115 (1996).
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> City of Hope
\hskip1cmLiu, Qiang
\hskip1cmSommer, Steve S.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polimerización activada por
pirofosforolisis (PAP): Aplicación en la amplificación de un alelo
específico y la determinación de secuencias de ácido nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
1954-328-II
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/237.180
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
03-10-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/187.035
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
06-03-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/184.315
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-02-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacctgcagc aagggagtca gaag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcataccgga aagggctgga gata
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatctgactg acccctattc cctgcttrgg aac
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgacccct attccctgct t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgacccct attccctgct tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgacccct attccctgct tgg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgacccct attccctgct tggg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgacccct attccctgct tgggg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgactgac ccctattccc tgcttg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgactgaccc ctattccctg ctta
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcataccgga aagggctgga gata
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaggaacttg gggggtgtca gagccc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgactgac ccctattccc tgcttg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgacccct attccctgct tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgacccctat tccctgcttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccctattc cctgcttg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctattccctg cttgggaact tgaggg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccctgcttg ggaacttgag gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgcttggg aacttgaggg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcttgggaa cttgaggg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgactgaccc ctattccctg cttagg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgacccctat tccctgctta gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccctattc cctgcttagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctattccc tgcttagg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgactgaccc ctattcgctg cttagg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgacccctat tcgctgctta gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccctattc gctgcttagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctattcgc tgcttagg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgactgaccc ttattccctg cttagg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgacccttat tccctgctta gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccttattc cctgcttagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttattccc tgcttagg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactgacccc tattccctgc ttrggaactt gaggggtgtc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccctattc cctgctta
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccctgctt gggaact
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18) .. (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgcttgg gaacttga
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcttgggaa cttgaggg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccctattc cctgattg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccctattc cgtgcttg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccctatcc cctgcttg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccccgattc cctgcttg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactcctattc cctgcttg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgactgac ccctattccc tgctt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgactgaccc ctattccctg ctta
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgactgac ccctattccc tgcttg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgacccct attccctgct tggg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> didesoxinucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaggaacttg gggggtgtca gagccc
\hfill26
Claims (62)
1. Un procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis (PAP) para sintetizar una cadena de ácido
nucleico deseada sobre una cadena molde de ácido nucleico que
comprende, en serie:
- (a)
- añadir un oligonucleótido P* activable complementario a una mezcla de reacción que contiene la cadena molde, oligonucleótido P* que tiene un terminal 3' no prolongable y que no tiene nucleótidos en o cerca de su terminal 3' que se apareen erróneamente con los correspondientes nucleótidos sobre la cadena molde,
- (b)
- aparear el oligonucleótido activable complementario P* con la cadena molde, tal que el terminal 3' no prolongable se hibride con la cadena molde al ser el oligonucleótido P* apareado,
- (c)
- pirofosforolizar el dúplex resultante con pirofosfato y una enzima que tenga actividad pirofosforolítica y active el oligonucleótido P* mediante la eliminación del terminal 3' no prolongable hibridado y
- (d)
- polimerizar mediante la prolongación del oligonucleótido P* activado sobre la cadena molde en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato y una polimerasa de ácido nucleico para sintetizar la cadena de ácido nucleico deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 1 que incluye la
amplificación de la cadena de ácido nucleico deseada mediante:
- (e)
- la separación de la cadena de ácido nucleico deseada de la etapa (d) de la cadena molde y
- (f)
- la repetición de las etapas (b)-(e) hasta alcanzar un nivel deseado de amplificación de la cadena de ácido nucleico deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 2 llevado a cabo en
presencia de un segundo oligonucleótido que, en la etapa (b), se
aparea con la cadena de ácido nucleico deseada separada resultante
de la etapa (e), y en el que la etapa (d) incluye la polimerización
mediante la prolongación del segundo oligonucleótido sobre la cadena
de ácido nucleico deseada para sintetizar una copia de la cadena
molde de ácido nucleico, y la etapa (e) incluye la separación de la
cadena molde de ácido nucleico sintetizada de la cadena de ácido
nucleico deseada, tal que la amplificación es exponencial.
4. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 2 ó 3, en el que las
etapas (b) a (d) se realizan consecutivamente como dos o más fases
de temperatura en un termociclador.
5. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 2 ó 3, en el que las
etapas (b) a (d) se realizan como una fase de temperatura en un
termociclador.
6. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de las reivindicaciones 2 a 4 aplicado a la
amplificación de un alelo específico, en el que la cadena molde de
ácido nucleico está presente en combinación con una segunda cadena
de ácido nucleico alélica que difiere de la cadena molde tal que el
oligonucleótido P* activable tiene al menos un nucleótido en o cerca
de su terminal 3' que se aparea erróneamente con el correspondiente
nucleótido de la cadena alélica, tal que, en la etapa (b), el
terminal 3' no prolongable del oligonucleótido P* no se hibrida con
la cadena alélica; y, por tanto, en la etapa (c), el pirofosfato y
la enzima que tiene actividad pirofosforolítica no eliminan
sustancialmente el terminal 3' no prolongable no hibridado del
oligonucleótido P* activable y, en la etapa (d), el oligonucleótido
P* no se prolonga sustancialmente mediante la polimerización sobre
la cadena alélica, mediante lo que la cadena de ácido nucleico
deseada sintetizada sobre la cadena molde es amplificada de forma
preferente frente a cualquier cadena de ácido nucleico sintetizada
sobre la cadena alélica.
7. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 6, en el que el
apareamiento erróneo entre el oligonucleótido P* activable y la
cadena molde tiene lugar en el terminal 3' no prolongable, o en el
primer o segundo nucleótido a partir del terminal 3' no
prolongable.
8. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 6, en el que el
apareamiento erróneo entre el oligonucleótido P* activable y la
cadena molde tiene lugar en el terminal 3' no prolongable.
9. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de las reivindicaciones 6 a 8, en el que la
cadena de ácido nucleico deseada, la cadena molde y la cadena
alélica son cadenas de ADN, el oligonucleótido P* activable es un
2'-desoxioligonucleótido, el nucleótido
3'-terminal es un terminal no prolongable, los
cuatro nucleósidos trifosfato son
2'-desoxinucleósidos trifosfato y la polimerasa de
ácido nucleico es una ADN polimerasa.
10. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de las reivindicaciones 6 a 8, en el que la
cadena de ácido nucleico deseada, la cadena molde y la cadena
alélica son cadenas de ADN, el oligonucleótido P* activable y el
segundo oligonucleótidos son ambos
2'-desoxioligonucleótidos, el nucleótido
3'-terminal es un terminal no prolongable, los
cuatro nucleósidos trifosfato son
2'-desoxinucleósidos trifosfato y la polimerasa de
ácido nucleico es una ADN polimerasa.
11. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que P* tiene una subsecuencia
específica de 3' con una longitud de n > 3 nucleótidos y P* no es
sustancialmente amplificado cuando se localizan uno o más
apareamientos erróneos con su cadena molde dentro de la subsecuencia
específica de 3', mientras que P* es amplificado sustancialmente
cuando su cadena molde con la que se aparea perfectamente se
localiza dentro de la subsecuencia específica de 3'.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que el apareamiento erróneo de la subsecuencia específica de 3'
está en 16 nucleótidos del terminal 3' de P*.
13. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que la PAP se aplica con uno o dos oligonucleótidos P*.
14. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a
5 para comparar dos secuencias de ADN o para controlar el perfil de
expresión génica, en el que se aplica un conjunto de P* con
diferentes subsecuencias específicas de 3' para la PAP.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que cada P* tiene una subsecuencia específica de 3'.
16. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que el conjunto de P* es incompleto con diferentes subsecuencias
específicas de 3'.
17. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que se puntúa una lista de las amplificaciones de PAP específicas
con el conjunto de los P* y luego se determina una secuencia de ADN
complementaria a la cadena molde del ácido nucleico ordenando las
subsecuencias específicas de 3'.
18. El procedimiento de la reivindicación 17, en
el que la PAP se aplica con un P* o dos oligonucleótidos.
19. Un procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis para la amplificación exponencial de un alelo
mutante que está presente en combinación con un alelo de tipo
natural, que comprende preparar ADN monocatenario para cada alelo,
siendo uno de los ADN monocatenarios para cada alelo una cadena
molde y siendo el otro una cadena complementaria y luego, en
serie:
- (a)
- aparear con la cadena molde de cada alelo un 2'-desoxioligonucleótido P* activable complementario que tenga un terminal 3' no prolongable y que no tenga 2'-desoxinucleótidos en o cerca de su terminal 3' que se apareen erróneamente con los correspondientes 2'-desoxinucleótidos sobre la cadena molde del alelo mutante, pero que tenga al menos un 2'-desoxinucleótido en o cerca de su terminal 3' que se aparee erróneamente con el correspondiente 2'-desoxinucleótido sobre la cadena molde del alelo de tipo natural, tal que el terminal 3' no prolongable se hibride con la cadena molde mutante, pero no con la cadena molde de tipo natural cuando el oligonucleótido P* sea apareado, y simultáneamente, aparear con la cadena complementaria de cada alelo un segundo 2'-desoxioligonucleótido complementario, de manera que el 2'-desoxioligonucleótido P* activable y el segundo 2'-desoxioligonucleótido flanqueen la región del gen por ser amplificada;
- (b)
- pirofosforolizar el 2'-desoxioligonucleótido P* activable que está apareado con una cadena molde mutante con pirofosfato y una enzima que tenga actividad pirofosforolítica para activar el 2'-desoxioligonucleótido P* mediante la eliminación del terminal 3' no prolongable hibridado, y
- (c)
- polimerizar mediante la prolongación del oligonucleótido P* activado sobre la cadena molde mutante en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato y una ADN polimerasa y, simultáneamente, mediante la prolongación del segundo 2'-desoxioligonucleótido sobre las cadenas complementarias tanto mutante como de tipo natural,
- (d)
- separar los productos de la prolongación de la etapa (c); y
- (e)
- repetir las etapas (a) a (d) hasta alcanzar el nivel deseado de amplificación exponencial del alelo mutante.
\vskip1.000000\baselineskip
20. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 19, en el que el
apareamiento erróneo entre el
2'-desoxioligonucleótido P* activable y la cadena
molde de tipo natural tiene lugar en el terminal 3' no prolongable,
o en el primer o segundo 2'-desoxinucleótido a
partir del terminal 3' no prolongable.
21. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 20, en el que el
apareamiento erróneo entre el
2'-desoxioligonucleótido P* activable y la cadena
molde de tipo natural tiene lugar en el terminal 3' no
prolongable.
\newpage
22. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 19 a 21, en el que el
2'-desoxioligonucleótido P* activable es apareado
con las cadenas complementarias de los alelos y el segundo
2'-desoxioligonucleótido es apareado a las cadenas
molde.
23. Un procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis que comprende en serie:
- (a)
- añadir un oligonucleótido P* activable complementario a una mezcla de reacción que contiene una cadena de ácido nucleico molde, en la que el oligonucleótido P* tiene un terminal 3' no prolongable y no tiene nucleótidos en o cerca de su terminal 3' que se apareen erróneamente con los correspondientes nucleótidos sobre la cadena molde,
- (b)
- aparear el oligonucleótido P* activable complementario con la cadena molde, tal que el nucleótido 3'-terminal se hibride con la cadena molde al ser el oligonucleótido P* apareado,
- (c)
- pirofosforolizar el dúplex resultante con pirofosfato y una enzima que tenga actividad pirofosforolítica y active el oligonucleótido P* mediante la eliminación del nucleótido 3'-terminal hibridado y
- (d)
- prolongar el oligonucleótido P* activado sobre la cadena molde en presencia de un 3'-desoxinucleósido trifosfato no prolongable y una polimerasa de ácido nucleico.
\vskip1.000000\baselineskip
24. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 23, en el que, en la etapa
(d), el oligonucleótido P* activado es prolongado en presencia de
una mezcla de un 2',3'-didesoxinucleósido trifosfato
no prolongable y cuatro 2'-didesoxinucleósidos
trifosfato.
25. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 23, en el que, en la etapa
(d), el oligonucleótido P* activado es prolongado en presencia de
una mezcla de un 3'-desoxinucleósido trifosfato no
prolongable y cuatro nucleósidos trifosfato.
26. Un procedimiento para explorar variantes
secuenciales desconocidas en una secuencia de ácido nucleico o para
volver a secuenciar una secuencia predeterminada en un ácido
nucleico mediante la polimerización activada por pirofosforolisis
(PAP) que comprende:
- (a)
- mezclar en condiciones de hibridación una cadena molde del ácido nucleico con múltiples conjuntos de cuatro oligonucleótidos P* activables que sean suficientemente complementarios con la cadena molde como para hibridarse con ella y que, dentro de cada conjunto, difieren entre sí por tener un terminal 3' no prolongable diferente, tal que el terminal 3' no prolongable se hibride con la cadena molde si la cadena molde es complementaria al terminal 3' no prolongable, siendo el número de conjuntos correspondiente al número de nucleótidos de la secuencia;
- (b)
- tratar los dúplex resultantes con pirofosfato y una enzima que tenga actividad pirofosforolítica para activar mediante pirofosforolisis sólo aquellos oligonucleótidos P* que tengan un terminal 3' no prolongable que esté hibridado con la cadena molde,
- (c)
- polimerizar mediante la prolongación de los oligonucleótidos P* activados sobre la cadena molde en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato y una polimerasa de ácido nucleico,
- (d)
- separar las cadenas de ácido nucleico sintetizadas en la etapa (c) de la cadena molde,
- (e)
- repetir las etapas (a)-(d) hasta alcanzar el nivel deseado de amplificación y
- (f)
- poner la secuencia de ácido nucleico en orden mediante el análisis de los solapamientos de los oligonucleótidos P* que produjeron amplificaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
27. El procedimiento de la reivindicación 26, en
el que los nucleósidos trifosfato son didesoxinucleótidos trifosfato
como sustratos de la ADN polimerasa para las prolongaciones de un
solo nucleótido.
28. El procedimiento de la reivindicación 26, en
el que hay un P* cuyo nucleótido 3'-terminal se
corresponde con una base de tipo natural o con una de las tres
posibles sustituciones de una sola base.
29. El procedimiento de la reivindicación 26,
en el que hay cuatro P* que tienen una secuencia idéntica, a
excepción de que en el terminal 3', bien ddAMP, ddTMP, ddGMP o ddCMP
corresponde a una base de tipo natural y a las tres posibles
sustituciones de una sola base.
30. El procedimiento de la reivindicación 29, en
el que los cuatro P* están inmovilizados sobre un solo punto.
\newpage
31. El procedimiento de la reivindicación 29, en
el que se puntúa una lista de las amplificaciones específicas de la
PAP con los conjuntos de P* y luego se reconstruye una secuencia de
ADN complementaria a la cadena molde del ácido nucleico usando las
reglas de apareamiento de Watson-Crick.
32. El procedimiento de la reivindicación 29, en
el que la PAP se aplica con un P* o dos oligonucleótidos.
33. Un procedimiento para determinar de
novo la secuencia de un ácido nucleico mediante la
polimerización activada por pirofosforolisis (PAP) que
comprende:
- (a)
- mezclar en condiciones de hibridación una cadena molde del ácido nucleico con múltiples oligonucleótidos P* activables, todos con el mismo número n de nucleótidos y que constituyen en conjunto todas las posibles secuencias que tienen n nucleótidos, y todos con un terminal 3' no prolongable, mediante lo que cualquier oligonucleótido P* que sea suficientemente complementario se hibridará con la cadena molde, y el terminal 3' no prolongable se hibridará con la cadena molde sólo si la cadena molde es complementaria en la posición correspondiente al terminal 3';
- (b)
- tratar los dúplex resultantes con pirofosfato y una enzima que tenga actividad pirofosforolítica para activar sólo aquellos oligonucleótidos P* hibridados que tengan un terminal 3' no prolongable que esté hibridado con la cadena molde, mediante la pirofosforolisis de aquéllos terminales 3' no prolongables hibridados;
- (c)
- polimerizar mediante la prolongación de los oligonucleótidos P* activados sobre la cadena molde en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato y una polimerasa de ácido nucleico,
- (d)
- separar las cadenas de ácido nucleico sintetizadas en la etapa (c) de la cadena molde,
- (e)
- repetir las etapas (a)-(d) hasta alcanzar el nivel deseado de amplificación, y
- (f)
- determinar la secuencia de oligonucleótidos P* que produjo amplificaciones, disponiendo entonces la secuencia de ácido nucleico en orden mediante el análisis de los solapamientos de estos oligonucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
34. El procedimiento de la reivindicación 33, en
el que los nucleósidos trifosfato son didesoxinucleótidos trifosfato
como sustratos de la ADN polimerasa para las prolongaciones de un
solo nucleótido.
35. El procedimiento de la reivindicación 33, en
el que el didesoxinucleótido del terminal 3' de P* está marcado con
colorantes.
36. El procedimiento de la reivindicación 33, en
el que se aplica para la PAP un conjunto de P* con diferentes
subsecuencias específicas de 3'.
37. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que cada dos P* sucesivos están apilados con la región apilada
\leq la subsecuencia específica de 3' para reducir el número de P*
necesarios.
38. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que cada P* tiene una subsecuencia específica de 3'.
39. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que el conjunto de P* es un conjunto completo de diferentes
subsecuencias específicas de 3' o un conjunto incompleto de
diferentes subsecuencias específicas de 3'.
40. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que se puntúa una lista de las amplificaciones específicas de la
PAP con el conjunto de P* y luego se reconstruye una secuencia de
ADN complementaria a la cadena molde del ácido nucleico ordenando
las subsecuencias específicas de 3' mediante el uso de las reglas de
apareamiento de Watson-Crick.
41. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que la PAP se aplica con uno o dos P*, o con dos
oligonucleótidos.
42. Un procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis para sintetizar una cadena de ácido nucleico
deseada sobre una cadena molde de ácido nucleico que comprende, en
serie:
- (a)
- aparear a la cadena molde un oligonucleótido P* activable complementario que tenga un terminal 3' no prolongable y que tenga un apareamiento erróneo en su terminal 3' o en el primer o segundo nucleótido a partir de su terminal 3' con respecto al correspondiente nucleótido de la cadena molde,
- (b)
- pirofosforolizar el dúplex resultante con pirofosfato y una enzima que tenga actividad pirofosforolítica y active el oligonucleótido P* mediante la eliminación del nucleótido 3'-terminal hibridado y
\newpage
- (c)
- polimerizar mediante la prolongación del oligonucleótido P* activado sobre la cadena molde en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato y una polimerasa de ácido nucleico para sintetizar la cadena de ácido nucleico deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
43. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 42 que incluye la
amplificación de la cadena de ácido nucleico deseada mediante
- (d)
- la separación de la cadena de ácido nucleico deseada de la etapa (c) de la cadena molde y
- (e)
- la repetición de las etapas (a)-(d) hasta alcanzar un nivel deseado de amplificación de la cadena de ácido nucleico deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
44. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 43 llevado a cabo en
presencia de un segundo oligonucleótido que, en la etapa (a), se
aparea con la cadena de ácido nucleico deseada separada resultante
de la etapa (d), y en el que la etapa (c) incluye la polimerización
mediante la prolongación del segundo oligonucleótido sobre la cadena
de ácido nucleico deseada para sintetizar una copia de la cadena
molde de ácido nucleico, y la etapa (d) incluye la separación de la
cadena molde de ácido nucleico sintetizada de la cadena de ácido
nucleico deseada, tal que la amplificación es exponencial.
45. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de las reivindicaciones 42 a 44, en el que el
apareamiento erróneo entre el oligonucleótido P* activable y la
cadena molde tiene lugar en el 3'-desoxinucleótido
terminal.
46. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de las reivindicaciones 42 a 45, en el que las
etapas (a) a (c) se realizan consecutivamente como dos o más fases
de temperatura en un termociclador.
47. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de las reivindicaciones 42 a 45, en el que el
apareamiento erróneo entre el oligonucleótido P* activable y la
cadena molde tiene lugar en el 3'-desoxinucleótido
terminal.
48. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de las reivindicaciones 42 a 45, en el que las
etapas (a) a (c) se realizan como una fase de temperatura en un
termociclador.
49. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la polimerasa de ácido
nucleico usada es una ADN polimerasa de Tfl o Taq
termoestable, o una ADN polimerasa modificada genéticamente
seleccionada del grupo constituido por AmpliTaqFs,
ThermoSequenase o una ADN polimerasa modificada para que contenga
una mutación en su sitio activo equivalente a una mutación F667Y en
TaqFS.
50. El procedimiento de la reivindicación 49, en
el que el rendimiento de la PAP es aumentado o el rendimiento de la
PAP es menos distinguido frente a cualquier tipo de terminal 3' no
prolongable en el terminal 3' de P*.
51. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de una cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en el que la ADN polimerasa también es la enzima que
tiene actividad pirofosforolítica.
52. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de la reivindicación 51, en el que la ADN
polimerasa es una ADN polimerasa de Tfl o Taq
termoestable, o una ADN polimerasa modificada genéticamente
seleccionada del grupo constituido por AmpliTaqFs,
ThermoSequenase o una ADN polimerasa modificada para que contenga
una mutación en su sitio activo equivalente a una mutación F667Y en
TaqFS.
53. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de una cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en el que el terminal 3' no prolongable es un
3'-desoxinucleótido no prolongable.
54. El procedimiento de la reivindicación 53, en
el que el terminal 3' no prolongable ubicado en el terminal 3' no
prolongable de P* es un didesoxinucleótido o un
aciclonucleótido.
55. El procedimiento de polimerización activada
por pirofosforolisis de una cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en el que el 3'-desoxinucleósido
trifosfato no prolongable está marcado con un colorante radiactivo o
fluorescente.
56. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 54, en el que los didesoxinucleótidos
trifosfato están marcados con colorantes.
57. Un procedimiento que comprende acoplar en
serie dos reacciones, en el que la segunda reacción comprende la
amplificación de un ácido nucleico por prolongación de un
oligonucleótido activado sobre un molde de ácido nucleico en
presencia de cuatro nucleósidos trifosfato y una polimerasa de ácido
nucleico, en el que la primera reacción comprende la activación de
un oligonucleótido bloqueado del extremo 3' añadido mediante la
eliminación de un bloque del extremo 3' que, de no eliminarse,
evitaría que el oligonucleótido fuera prolongado sobre el molde para
producir el oligonucleótido activado, en el que (i) el bloque del
extremo 3' es un 3'-desoxinucleótido no prolongable
situado en el terminal 3' del oligonucleótido y el bloque del
extremo 3' es eliminado por pirofosforolisis o (ii) el
oligonucleótido contiene una secuencia de reconocimiento metilada y
se hibrida con una cadena diana no metilada y el bloque 3' es
eliminado mediante escisión con una endonucleasa de restricción
dependiente de la metilación.
58. El procedimiento de la reivindicación 57, en
el que la secuencia de reconocimiento metilada es G^{m}ATC.
59. El procedimiento de la reivindicación 58, en
el que la endonucleasa de restricción es DpnI.
60. Un procedimiento para detectar un ácido
nucleico que comprende: (a) añadir un oligonucleótido P* a una
mezcla que contenga el ácido nucleico, en la que el oligonucleótido
P* tiene un extremo 3' no prolongable, siendo el terminal no
prolongable 3' del oligonucleótido P* eliminable mediante
pirofosforolisis; (b) aparear el oligonucleótido P* con el ácido
nucleico; (c) eliminar el terminal no prolongable 3' del
oligonucleótido P* mediante pirofosforolisis para producir un
oligonucleótido desbloqueado; y (d) detectar la eliminación del
terminal no prolongable 3' del oligonucleótido P*.
61. El procedimiento de la reivindicación 60, en
el que el terminal no prolongable 3' del oligonucleótido P* está
marcado y la detección de la eliminación del terminal no prolongable
3' del oligonucleótido P* se realiza mediante la detección de la
reducción en el marcaje del oligonucleótido P*.
62. El procedimiento de la reivindicación 60, en
el que la detección de la eliminación del terminal no prolongable 3'
del oligonucleótido P* se realiza (i) prolongando el oligonucleótido
desbloqueado usando uno o más nucleótidos y una enzima que catalice
la incorporación de un nucleótido en un híbrido de ácido nucleico; e
(ii) detectando la presencia del ácido nucleico mediante la
detección del oligonucleótido prolongado.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18431500P | 2000-02-23 | 2000-02-23 | |
| US184315P | 2000-02-23 | ||
| US18703500P | 2000-03-06 | 2000-03-06 | |
| US187035P | 2000-03-06 | ||
| US23718000P | 2000-10-03 | 2000-10-03 | |
| US237180P | 2009-08-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2330408T3 true ES2330408T3 (es) | 2009-12-10 |
Family
ID=27391815
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01912883T Expired - Lifetime ES2330408T3 (es) | 2000-02-23 | 2001-02-22 | Polimerizacion activada por pirofosforolisis (pap): aplicacion en la amplificacion de un alelo especifico y en la determinacion de secuencias de acidos nucleicos. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6534269B2 (es) |
| EP (2) | EP1259646B1 (es) |
| JP (1) | JP4989004B2 (es) |
| AT (1) | ATE441726T1 (es) |
| AU (2) | AU4162101A (es) |
| CA (1) | CA2395391C (es) |
| DE (1) | DE60139762D1 (es) |
| ES (1) | ES2330408T3 (es) |
| WO (1) | WO2001062975A2 (es) |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7033763B2 (en) * | 2000-02-23 | 2006-04-25 | City Of Hope | Pyrophosphorolysis activated polymerization (PAP) |
| AUPR050700A0 (en) * | 2000-10-03 | 2000-10-26 | Id+Plus Ltd | Detection method |
| AU2001291513B2 (en) * | 2000-10-03 | 2007-06-07 | Id+Plus Ltd | Nucleotide detection method |
| WO2002044425A2 (en) * | 2000-12-01 | 2002-06-06 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
| CA2442169A1 (en) * | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Applera Corporation | Nucleic acid analysis using non-templated nucleotide addition |
| GB0110501D0 (en) | 2001-04-30 | 2001-06-20 | Secr Defence Brit | Amplification process |
| US7141370B2 (en) * | 2001-07-03 | 2006-11-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Bioluminescence regenerative cycle (BRC) for nucleic acid quantification |
| US7668697B2 (en) * | 2006-02-06 | 2010-02-23 | Andrei Volkov | Method for analyzing dynamic detectable events at the single molecule level |
| EP2292787B1 (en) * | 2002-05-10 | 2017-03-22 | City of Hope | Pyrophosphorolysis activated polymerization (PAP) |
| EP1753873A4 (en) | 2004-03-05 | 2008-11-05 | Ohio Med College | METHOD AND COMPOSITIONS FOR THE ASSESSMENT OF NUCLEIC ACIDS AND ALLELES |
| WO2005106036A2 (en) | 2004-04-12 | 2005-11-10 | Medical College Of Ohio | Methods and compositions for assaying analytes |
| US7745125B2 (en) * | 2004-06-28 | 2010-06-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | 2′-terminator related pyrophosphorolysis activated polymerization |
| US20060060977A1 (en) * | 2004-09-22 | 2006-03-23 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Semiconductor device |
| US7378260B2 (en) * | 2005-04-01 | 2008-05-27 | Applera Corporation | Products and methods for reducing dye artifacts |
| JP5596554B2 (ja) * | 2007-11-28 | 2014-09-24 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 向上したピロリン酸分解活性化重合（ｐａｐ）能力を有する変異ｄｎａポリメラーゼ |
| EP2644707B1 (en) | 2008-04-30 | 2015-06-03 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| US8911948B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| CN101381766B (zh) * | 2008-06-11 | 2012-04-18 | 厦门大学 | 一种基因稀有突变的定量检测方法 |
| US20100112565A1 (en) * | 2008-11-03 | 2010-05-06 | Life Technologies Corporation | Methods, kits, and reaction mixtures for high resolution melt genotyping |
| US8481685B2 (en) * | 2008-11-03 | 2013-07-09 | Kapa Biosystems | Modified DNA polymerases |
| US8932813B2 (en) | 2010-12-13 | 2015-01-13 | Life Technologies Corporation | Polymerization of nucleic acids using activation by polyphosphorolysis (APP) reactions |
| WO2012135053A2 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers |
| US10270033B2 (en) | 2015-10-26 | 2019-04-23 | Oti Lumionics Inc. | Method for patterning a coating on a surface and device including a patterned coating |
| CN105316421B (zh) * | 2015-12-01 | 2019-09-03 | 湖南宏雅基因技术有限公司 | 用于检测与肺癌相关的shox2基因启动子区甲基化程度的试剂盒 |
| CN105331727B (zh) * | 2015-12-01 | 2019-09-03 | 湖南宏雅基因技术有限公司 | 一种人外周血循环肿瘤DNA中septin 9基因甲基化的检测试剂盒 |
| WO2018100559A1 (en) | 2016-12-02 | 2018-06-07 | Oti Lumionics Inc. | Device including a conductive coating disposed over emissive regions and method therefor |
| JP2020518107A (ja) | 2017-04-26 | 2020-06-18 | オーティーアイ ルミオニクス インコーポレーテッドＯｔｉ Ｌｕｍｉｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ． | 表面上のコーティングをパターン化する方法およびパターン化されたコーティングを含むデバイス |
| KR102685809B1 (ko) | 2017-05-17 | 2024-07-18 | 오티아이 루미오닉스 인크. | 패턴화 코팅 위에 전도성 코팅을 선택적으로 증착시키는 방법 및 전도성 코팅을 포함하는 디바이스 |
| US11655497B2 (en) | 2017-09-26 | 2023-05-23 | Ningbo Shining Biotechnology Co., Ltd | Method of amplifying a target nucleic acid |
| US11751415B2 (en) | 2018-02-02 | 2023-09-05 | Oti Lumionics Inc. | Materials for forming a nucleation-inhibiting coating and devices incorporating same |
| WO2019180137A1 (en) | 2018-03-21 | 2019-09-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dna polymerases for efficient and effective incorporation of methylated-dntps |
| KR20250150689A (ko) | 2018-05-07 | 2025-10-20 | 오티아이 루미오닉스 인크. | 보조 전극을 제공하는 방법 및 보조 전극을 포함하는 장치 |
| US11268140B2 (en) * | 2018-06-12 | 2022-03-08 | Shaofeng Ding | Delayed pyrophosphorolysis activated polymerization |
| CN112889162A (zh) | 2018-11-23 | 2021-06-01 | Oti照明公司 | 包括光透射区域的光电装置 |
| WO2020178804A1 (en) | 2019-03-07 | 2020-09-10 | Oti Lumionics Inc. | Materials for forming a nucleation-inhibiting coating and devices incorporating same |
| KR20250110358A (ko) | 2019-04-18 | 2025-07-18 | 오티아이 루미오닉스 인크. | 핵 생성 억제 코팅 형성용 물질 및 이를 포함하는 디바이스 |
| US12069938B2 (en) | 2019-05-08 | 2024-08-20 | Oti Lumionics Inc. | Materials for forming a nucleation-inhibiting coating and devices incorporating same |
| KR20240134240A (ko) | 2019-06-26 | 2024-09-06 | 오티아이 루미오닉스 인크. | 광 회절 특성을 갖는 광 투과 영역을 포함하는 광전자 디바이스 |
| US11832473B2 (en) | 2019-06-26 | 2023-11-28 | Oti Lumionics Inc. | Optoelectronic device including light transmissive regions, with light diffraction characteristics |
| US12302691B2 (en) | 2019-08-09 | 2025-05-13 | Oti Lumionics Inc. | Opto-electronic device including an auxiliary electrode and a partition |
| US11737298B2 (en) | 2019-12-24 | 2023-08-22 | Oti Lumionics Inc. | Light emitting device including capping layers on respective emissive regions |
| CN111108860B (zh) * | 2020-01-19 | 2024-05-14 | 黑龙江丰沃非凡农业科技发展有限公司 | 一种仿形播种机 |
| CA3240373A1 (en) | 2020-12-07 | 2022-06-16 | Michael HELANDER | Patterning a conductive deposited layer using a nucleation inhibiting coating and an underlying metallic coating |
| CN117904281B (zh) * | 2024-01-29 | 2024-11-22 | 上海科亦生物科技有限公司 | 检测ugt1a1基因多态性的引物组及试剂盒与方法 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2020958C (en) * | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
| US5302509A (en) | 1989-08-14 | 1994-04-12 | Beckman Instruments, Inc. | Method for sequencing polynucleotides |
| ES2089038T3 (es) * | 1990-01-26 | 1996-10-01 | Abbott Lab | Procedimiento mejorado para amplificar acidos nucleicos blanco aplicable para la reaccion en cadena de polimerasa y ligasa. |
| US5210015A (en) * | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US6228628B1 (en) * | 1997-07-09 | 2001-05-08 | Roche Molecular Systems | Mutant chimeric DNA polymerase |
| US6270973B1 (en) * | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Multiplex method for nucleic acid detection |
| US6235480B1 (en) * | 1998-03-13 | 2001-05-22 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
| US6277578B1 (en) * | 1998-03-13 | 2001-08-21 | Promega Corporation | Deploymerization method for nucleic acid detection of an amplified nucleic acid target |
| US6335162B1 (en) * | 1998-03-13 | 2002-01-01 | Promega Corporation | Nucleic acid detection |
| US6159693A (en) * | 1998-03-13 | 2000-12-12 | Promega Corporation | Nucleic acid detection |
| US6312902B1 (en) * | 1998-03-13 | 2001-11-06 | Promega Corporation | Nucleic acid detection |
| US6391551B1 (en) * | 1998-03-13 | 2002-05-21 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
| US6270974B1 (en) * | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Exogenous nucleic acid detection |
| US7090975B2 (en) | 1998-03-13 | 2006-08-15 | Promega Corporation | Pyrophosphorolysis and incorporation of nucleotide method for nucleic acid detection |
| US6268146B1 (en) * | 1998-03-13 | 2001-07-31 | Promega Corporation | Analytical methods and materials for nucleic acid detection |
| US6200757B1 (en) * | 1999-01-19 | 2001-03-13 | Dade Behring Inc. | Method for controlling the extension of an oligonucleotide |
| US6509157B1 (en) * | 1999-11-05 | 2003-01-21 | Roche Molecular Systems, Inc | 3 blocked nucleic acid amplification primers |
| WO2001075139A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-11 | Biolink Partners, Inc. | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization |
-
2001
- 2001-02-22 CA CA2395391A patent/CA2395391C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-22 WO PCT/US2001/005527 patent/WO2001062975A2/en not_active Ceased
- 2001-02-22 EP EP01912883A patent/EP1259646B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-22 ES ES01912883T patent/ES2330408T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-22 US US09/789,556 patent/US6534269B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-22 DE DE60139762T patent/DE60139762D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-22 AU AU4162101A patent/AU4162101A/xx active Pending
- 2001-02-22 JP JP2001561783A patent/JP4989004B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-22 EP EP09166826.9A patent/EP2112233B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-22 AT AT01912883T patent/ATE441726T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-02-22 AU AU2001241621A patent/AU2001241621B2/en not_active Ceased
-
2002
- 2002-10-15 US US10/269,879 patent/US7105298B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2001062975A3 (en) | 2002-08-29 |
| CA2395391A1 (en) | 2001-08-30 |
| EP2112233A1 (en) | 2009-10-28 |
| CA2395391C (en) | 2011-08-02 |
| EP1259646A2 (en) | 2002-11-27 |
| US20030092051A1 (en) | 2003-05-15 |
| DE60139762D1 (de) | 2009-10-15 |
| EP2112233B1 (en) | 2013-10-23 |
| US20020127554A1 (en) | 2002-09-12 |
| EP1259646B1 (en) | 2009-09-02 |
| JP4989004B2 (ja) | 2012-08-01 |
| WO2001062975A9 (en) | 2002-10-24 |
| AU4162101A (en) | 2001-09-03 |
| WO2001062975A2 (en) | 2001-08-30 |
| US6534269B2 (en) | 2003-03-18 |
| US7105298B2 (en) | 2006-09-12 |
| ATE441726T1 (de) | 2009-09-15 |
| AU2001241621B2 (en) | 2005-08-25 |
| JP2003526344A (ja) | 2003-09-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2330408T3 (es) | Polimerizacion activada por pirofosforolisis (pap): aplicacion en la amplificacion de un alelo especifico y en la determinacion de secuencias de acidos nucleicos. | |
| AU2001241621A1 (en) | Pyrophosphorolysis activated polymerization (PAP): application to allele-specific amplification and nucleic acid sequence determination | |
| US7033763B2 (en) | Pyrophosphorolysis activated polymerization (PAP) | |
| JP5133969B2 (ja) | 加ピロリン酸分解活性化重合（ｐａｐ） | |
| EP1147217B1 (en) | A method of dna sequencing | |
| Liu et al. | Pyrophosphorolysis-activated polymerization (PAP): application to allele-specific amplification | |
| Liu et al. | PAP: detection of ultra rare mutations depends on P* oligonucleotides:“sleeping beauties” awakened by the kiss of pyrophosphorolysis | |
| Kamiya et al. | Induction of mutation of a synthetic c-Ha-ras gene containing hypoxanthine | |
| CA2911712C (en) | Pyrophosphorolysis activated polymerization (pap) | |
| Kabilov et al. | Detection of Three-Nucleotide Deletion ΔF508 in Human Gene CFTR by UV Immobilization on Nylon of a Complex Formed by the PCR-Amplified DNA Fragment with a Highly Specific Probe |