ES2330281T3 - Mutaciones del gen de la parquina, composiciones, metodos y usos. - Google Patents
Mutaciones del gen de la parquina, composiciones, metodos y usos. Download PDFInfo
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Abstract
Ácido nucleico que codifica para la parquina humana, caracterizado porque comprende una mutación que conlleva el cambio Arg275Trp en la proteína codificada.
Description
Mutaciones del gen de la parquina,
composiciones, métodos y usos.
La presente invención se refiere al campo de la
genética y, más particularmente, a la identificación de mutaciones
del gen de la parquina. Se refiere igualmente a composiciones y
métodos para la identificación de estas mutaciones en muestras, a
formas de la parquina mutadas, truncadas o que comprenden
multiplicaciones de exones, y sus utilizaciones con fines, por
ejemplo, de diagnóstico, selección o terapéutica.
La enfermedad de Parkinson es un trastorno
neurodegenerativo frecuente cuya frecuencia está cercana al 2%
después de la edad de 65 años [de Rijk et al., 1997]. Los
síntomas fundamentales de la enfermedad son rigidez, bradiquinesia,
temblores en reposo y buena reactividad, al menos inicialmente, a la
levodopa. Los trastornos son debidos a una pérdida masiva de
neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra. Las causas de la
enfermedad siguen siendo desconocidas pero se sospecha mucho de la
susceptibilidad genética [Wood, 1997]. Se ha informado de numerosas
formas familiares con una transmisión dominante. Se han descrito
mutaciones del gen que codifica para la sinucleina alfa, localizado
en 4q21-q23, en un número pequeño de familias con un
inicio precoz y un agravamiento rápido [Polymeropoulos et
al., 1997; Krüger et al., 1998]. Un segundo locus se
sitúa en 2p13 [Gasser et al., 1998]. En Japón se ha descrito
un síndrome parkinsoniano de transmisión autosómica recesiva
(AR-JP) [Yamamura et al., 1973; Ishikawa y
Tsuji, 1996]. Se manifiesta con los síntomas fundamentales de la
enfermedad de Parkinson con algunas particularidades: i) inicio
precoz, generalmente antes de la edad de 40 años; ii) presencia de
una distonía, a menudo en los miembros inferiores; iii)
fluctuaciones a lo largo del día; y iv) evolución lenta progresiva,
pero siempre asociada a disquinesias con levodopa. El examen
neuropatológico revela una pérdida masiva de neuronas de las
sustancia negra pars compacta pero sin cuerpos de Lewy, señal
histopatológica de la enfermedad de Parkinson idiopática [Yamamura
et al., 1973; Takahashi et al., 1994]. Se ha
demostrado una relación genética entre la enfermedad en familias
japonesas y marcadores en 6q25.2-27, que define el
locus PARK2 [Matsumine et al., 1997]. Dos equipos han
descrito después familias PARK2 fuera del Japón, en particular en
Estados Unidos, en Europa y en Oriente Medio [Jones et al.,
1998; Tassin et al., 1998]. Muy recientemente, Kitada et
al. [Kitada et al., 1998] han puesto en evidencia
deleciones de los exones (3-7) o del exón 4 de un
nuevo gen, denominado parquina, en 4 familias japonesas.
La presente solicitud describe ahora la puesta
en evidencia y la caracterización, en 77 familias y 102 casos
aislados principalmente europeos con un síndrome parkinsoniano de
inicio precoz, de la presencia de nuevas alteraciones genéticas que
afectan al gen de la parquina. Además, la presente solicitud
demuestra que estas alteraciones genéticas están presentes no solo
en los síndromes parkinsonianos de inicio precoz, sino igualmente
en los síndromes parkinsonianos más tardíos o atípicos. Estas nuevas
alteraciones ofrecen por lo tanto nuevas herramientas tanto para el
diagnóstico como para el tratamiento de la enfermedad de
Parkinson.
Un objetivo más particular de la invención se
refiere a un ácido nucleico que codifica para la parquina humana,
caracterizado porque comprende una mutación que conlleva el cambio
Arg 275-Trp en la proteína codificada, (mutación
C\rightarrowT en el nucleótido 924 en el exón 7.).
El término ácido nucleico tal como se define en
la presente solicitud denomina los ácidos desoxirribonucleicos
(ADN) y ribonucleicos (ARN). Además, entre los ADN, se puede tratar
de ADN genómico (ADNg) o complementario (ADNc). Los ácidos
nucleicos de la invención pueden ser de origen natural o sintético.
Generalmente se preparan por las técnicas clásicas de biología
molecular, incluyendo la selección de bancos, la síntesis
artificial, la ligadura, la restricción, etc. Las posiciones dadas
en la presente solicitud se calculan con respecto a la secuencia de
la parquina humana representada en la figura 1 (SEQ ID No: 1). Esta
secuencia representa la secuencia del ADNc que codifica para la
parquina humana. Con respecto a la secuencia descrita por Kitada
et al., comprende una modificación en el nucleótido 768
(C->T).
La invención se refiere también a cualquier
vector que comprende un ácido nucleico tal como se ha definido
anteriormente. Puede tratarse de un vector plasmídico, de un
cósmido, un vector viral, episoma, cromosoma artificial, etc. En un
modo de realización particular, dicho vector comprende también una
región promotora que permite la expresión de dicho ácido
nucleico.
Dichos vectores pueden ser utilizados para
producir en cantidades importantes los ácidos nucleicos de la
invención, o para producir los polipéptidos correspondientes, en un
huésped celular apropiado (célula procariota, eucariota, animal o
vegetal, por ejemplo). Huéspedes celulares preferidos son
principalmente células de bacteria (por ejemplo, E. coli) o
células de levadura, o también células de mamíferos, animales o
humanas.
A este respecto, la invención se refiere también
a cualquier célula recombinante que comprende un ácido nucleico o
un vector tal como se han definido anteriormente.
La invención se refiere también a cualquier
célula de mamífero, principalmente humana, que comprende un ácido
nucleico o un vector tal como se han definido anteriormente como
sustitución del gen natural de la parquina.
Las células de la invención se pueden utilizar
principalmente para el estudio de las propiedades de la parquina y
también como modelos para la investigación de compuestos
susceptibles de compensar las alteraciones genéticas del gen de la
parquina.
La invención se refiere además a cualquier
mamífero no humano que comprende un ácido nucleico tal como se ha
definido anteriormente en sus células. Ventajosamente, estos
mamíferos se obtienen por introducción
("knock-in") de las alteraciones
identificadas anteriormente por recombinación homóloga, o también
por bloqueo ("knock-out") del gen
natural, sustituido por la versión alterada de la invención.
Dichos mamíferos (roedores, canes, conejos,
etc.) se pueden utilizar principalmente, por ejemplo, para el
estudio de las propiedades de la parquina y la identificación de
compuestos con objetivos terapéuticos.
La invención se refiere igualmente a cualquier
polipéptido codificado por un ácido nucleicos tal como se ha
descrito anteriormente.
Dichos polipéptidos, o los ácidos nucleicos
correspondientes, se pueden utilizar para identificar y/o estudiar
compuestos susceptibles de restaurar un fenotipo normal en células
que los expresan. En particular, los ácidos nucleicos descritos
anteriormente pueden ser transferidos en células huésped apropiadas,
preferentemente células eucariotas (por ejemplo, de mamífero o
levadura) para ser utilizadas en un ensayo de selección de
compuestos capaces de oponerse a su actividad, ya sean compuestos
químicos, bioquímicos o genéticos. Dichos polipéptidos se pueden
utilizar igualmente como antígenos para la preparación de
anticuerpos específicos utilizables para la detección de variantes.
Tales anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales (preparados
por ejemplo por fusión de células de bazo de animales inmunizados
con los antígenos, con células de mieloma, y a continuación
selección de los clones productores de anticuerpos
monoclonales).
A este respecto, la invención se refiere
igualmente a cualquier anticuerpo específico de un polipéptido tal
como se ha descrito anteriormente o de una región específica de
dicho polipéptido. El término "anticuerpo específico" designa
un anticuerpo que tiene una afinidad particularmente superior por el
antígeno dado, con respecto a cualquier otro antígeno.
La invención se refiere además a cualquier
composición que comprenda un polipéptido o un anticuerpo o también
un vector o una célula huésped transformada por el ácido nucleico de
la invención, tales como se han descrito anteriormente. Estas
composiciones pueden estar acondicionadas en diferentes tipos de
medio (disoluciones salinas, isotónicas, etc.) en presencia de
estabilizantes o de conservantes, por ejemplo. Estas composiciones
pueden ser conservadas en frío o congeladas en cualquier dispositivo
apropiado (tubo, caja, frasco, envase, bolsa, etc.).
Una de las aplicaciones de la invención radica
en la detección de la presencia de mutaciones en el gen de la
parquina y su correlación, por ejemplo, con la susceptibilidad a la
enfermedad de Parkinson. A este respecto, la invención se refiere
igualmente a diferentes herramientas (sondas, iniciadores,
anticuerpos, etc.) usados en la realización de dichos métodos de
detección.
En particular, la invención se refiere a
cualquier sonda u oligonucleótido que hibrida específicamente con
un ácido nucleico tal como se ha definido anteriormente.
Las sondas u oligonucleótidos específicos de la
invención comprenden generalmente menos de 300 pb. Típicamente, un
oligonucleótido específico de la invención comprende de 5 a 100 pb,
ventajosamente de 5 a 50 pb. Por supuesto, la longitud del
oligonucleótido puede ser ajustada por los expertos en la técnica.
Generalmente las sondas u oligonucleótidos de la invención están
marcados, de forma que permitan su detección. Se pueden usar
diferentes tipos de marcación conocidos por los expertos en la
técnica (marcación radiactiva, fluorescente, enzimática, química,
terminal o interna, etc.). Por último, las sondas u oligonucleótidos
de la invención tienen la capacidad de hibridar específicamente con
los ácidos nucleicos tales como los que se han definido
anteriormente, es decir con las diferentes formas alteradas del gen
de la parquina. La hibridación se denomina específica cuando la
sonda o el oligonucleótido hibridan, en condiciones de severidad
elevada, con el ácido nucleico que lleva la alteración buscada y no
hibridan o hibridan poco con el mismo ácido nucleico que no lleva
dicha alteración. La hibridación se denomina por lo tanto
específica cuando el diferencial señal específica/ruido de fondo es
suficientemente grande para poder ser detectado.
Las sondas u oligonucleótidos de la invención
son por lo tanto generalmente complementarios de la región del gen
de la parquina que lleva la alteración genética descrita
anteriormente. La complementariedad es generalmente perfecta, de
forma que se asegura una mejor selectividad de hibridación. Estas
sondas u oligonucleótidos se pueden sintetizar por cualquier
técnica conocida por los expertos en la técnica, por ejemplo por
escisión a partir de los ácidos nucleicos descritos anteriormente o
por síntesis artificial o combinando estas técnicas. Estas sondas u
oligonucleótidos se pueden
utilizar para la identificación, en muestras biológicas, de la presencia de alteraciones genéticas del gen de la parquina.
utilizar para la identificación, en muestras biológicas, de la presencia de alteraciones genéticas del gen de la parquina.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere también a un par de
iniciadores para la amplificación de todo o de una parte de un
ácido nucleico tal como se ha descrito anteriormente, caracterizado
porque comprende:
- -
- un primer iniciador complementario de una región del gen de la parquina situado en 5' de una alteración genética, y
- -
- un segundo iniciador complementario de una región del gen de la parquina situado en 3' de dicha alteración genética.
\vskip1.000000\baselineskip
Los iniciadores de la invención son generalmente
complementarios de una región del gen de la parquina y comprenden
ventajosamente menos de 30 pb.
La invención se refiere además a un
procedimiento para la identificación de una alteración genética en
el gen de la parquina y en particular para la detección de deleción
(deleciones) y/o multiplicación (por ejemplo, duplicación o
triplicación) de exones en estado homocigótico y heterocigótico.
\vskip1.000000\baselineskip
Este procedimiento según la invención
comprende:
i) poner a disposición una muestra que comprende
el gen de la parquina,
ii) amplificar (semicuantitativa) una parte al
menos de dicho gen, comprendiendo dicha parte una alteración
genética tal como se ha definido anteriormente, y
iii) poner en evidencia la presencia de la
alteración genética.
\vskip1.000000\baselineskip
Ventajosamente, en el procedimiento de la
invención la muestra es una muestra de sangre, tejido, plasma o un
cultivo celular, que provienen de un sujeto, principalmente de un
mamífero, en particular de un humano. En un modo preferido de
realización, la muestra se trata previamente de forma que haga que
el gen de la parquina, o una parte de este, sea accesible para la
amplificación. Este pretratamiento puede comprender la lisis
celular, un tratamiento enzimático, una desnaturalización, etc.
Ventajosamente, la amplificación se realiza por
medio de un par de iniciadores tal como se ha descrito anteriormente
o los descritos por Kitada et al. e incluidos como
referencia.
La puesta en evidencia de una alteración
genética tal como se ha descrito anteriormente se puede realizar
por diferentes técnicas y principalmente por secuenciación,
PCR/restricción, ASO, PAGE o por PCR/multiplex semicuantitativa
como se detalla en la parte experimental. Brevemente, este método se
basa en la amplificación por PCR semicuantitativa y en fase
exponencial del ADN matriz. Según este método, la comparación de la
tasa relativa de ADN matriz es suficiente para poner en evidencia
una pérdida de la cantidad de ADN (deleción de exón (o exones)) o
por el contrario un aumento de la cantidad de ADN (multiplicación de
exón (o exones)).
La invención se refiere además a un kit para la
realización de los procedimientos de la invención que comprende una
sonda o un oligonucleótido o un par de iniciadores tal como se han
descrito anteriormente. Los kits de la invención comprenden
ventajosamente los reactivos apropiados para una reacción de
amplificación y/o de hibridación y, eventualmente, un soporte para
dichas reacciones (filtros, membranas, chips, etc.).
La presente invención está adaptada
particularmente para el diagnóstico de una susceptibilidad a la
enfermedad de Parkinson mediante la búsqueda de una alteración
genética, tal como se ha descrito anteriormente, en el gen de la
parquina.
La presente invención se refiere igualmente a la
utilización de las herramientas descritas anteriormente (ácidos
nucleicos, sondas, polipéptidos, anticuerpos, células, animales)
para la identificación de compuestos capaces de oponerse, al menos
en parte, a los efectos de una alteración del gen de la parquina,
principalmente con un objetivo terapéutico. Así, tales compuestos
se pueden poner en evidencia poniendo en contacto una composición
(o un producto) de ensayo en presencia de una célula o de un animal
tal como se ha descrito anteriormente y detectando de un efecto
fenotítico o genotípico.
El método de la invención puede permitir
principalmente la identificación de compuestos susceptibles de ser
utilizados, solos o en combinación con otros productos o
tratamientos, para el tratamiento (es decir, la disminución) de la
enfermedad de Parkinson.
Otras ventajas y aplicaciones de la presente
invención aparecerán con la lectura de los ejemplos siguientes, que
deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Secuencia del ADNc que codifica para
la parquina humana. Se indican las uniones entre los exones. El
codón iniciador (atg) y el codón de terminación (tag) se indican en
negrita. El cambio C>T en la posición 768 está en negrita y
subrayado.
Figura 2: Familias que presentan mutaciones
puntuales en el gen de la parquina. Se representa la cosegregación
completa de la mutación con la enfermedad. Los cuadrados (hombres) y
círculos (mujeres) negros representan los individuos afectados con
la edad de aparición (en años) indicado bajo el símbolo de los
pacientes. Los símbolos rayados indican pacientes muertos. El
número de hermanos y hermanas no afectados o no analizados se
indica en un rombo. Para cada mutación (cambio de aminoácido), se
indica el genotipo del miembro de la familia (+/+ homocigótico
natural, +/heterocigótico por la mutación; -/- homocigótico por la
mutación). Debajo de cada genotipo se indican los resultados de la
detección PAGE: electroforegramas con el tamaño del alelo en pb;
ASO: autorradiogramas de los alelos mutados y naturales;
PCR/restricción: productos de la PCR después de digestión con las
enzimas de restricción apropiadas. Se da la longitud de los
fragmentos en pb. Mut: mutado; nd: edad de aparición no determinada
ya que el paciente no es consciente de los síntomas.
Figura 3: Representación y localización de las
mutaciones puntuales del gen de la parquina. Se representa la
secuencia codificadora del gen, con sus 12 exones (barras). Los
exones están numerados de 1 a 12. Se posicionan 8 mutaciones
puntuales causales según su efecto sobre la proteína (truncamiento
vs antisentido). Se muestran rayados el dominio similar a la
ubiquitina y el residuo en anillo ("Ring Finger"). Para
las mutaciones Thr415Asn y Trp453Stop, se indican los sitios de
fosforilación (P) y de miristoilación (M). UTR: región no
traducida.
Figura 4: Resultados de la puesta en evidencia
de las deleciones de exones heterocigóticas en una familia que
presenta el síndrome parkinsoniano de inicio precoz
(FPD-GRE-WAG-155)
según el método de PCR/multiplex semicuantitativa de la invención.
Los cuadrados (hombres) y círculos (mujeres) negros representan los
individuos afectados.
Los picos representan los exones producidos por
la PCR/multiplex semicuantitativa. Las cifras rodeadas indican la
altura de los picos. La regla graduada por debajo de los
electroforegramas indica el tamaño del par de bases de los
productos de la PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla 1: Oligonucleótidos utilizados para la
técnica ASO. Los cambios de nucleótido en la secuencia de los
oligonucleótidos se representan en negrita y subrayados. WT = tipo
natural; V = variante.
Tabla 2: Resumen de las mutaciones puestas en
evidencia. Las posiciones de los nucleótidos se dan según la
secuencia de ADN publicada en el banco de datos de ADN japonés
(DDBJ; número de entrada AB009973) y se ilustran en la figura 1.
PAGE = electroforesis sobre gel de poliacrilamida; ASO = técnica de
detección de las mutaciones que utiliza un oligonucleótido
específico de un alelo.
Tabla 3: Características clínicas de los
pacientes en función del tipo de alteración genética. Los pacientes
de la familia IT-020 que son heterocigóticos
compuestos para una mutación antisentido y una mutación por
truncamiento no figuran en la tabla a: p<0,05 para la comparación
entre los pacientes con una deleción homocigótica y pacientes con
mutaciones truncantes.
Tabla 4: Frecuencia y consecuencias de las
deleciones/multiplicaciones de exones, del = deleción, het =
heterocigótico; hom = homocigótico.
Tabla 5: Relación entre los resultados obtenidos
en la figura 4. Se da la altura de los picos para cada exón en la
parte izquierda de la tabla, sumándose los valores de los picos
dobles. La parte derecha de la tabla suministra el cálculo de las
relaciones entre los valores de los picos. Cursiva = valor
normal; subrayado = valor patológico comparado con el
control. En la segunda línea de la tabla, en cada caso, se divide la
relación del testigo por la relación del caso. Los valores
patológicos son o \leq 0,625 o \geq 1,6 (=1/0,625). Se han
detectado deleciones de exones para los sujetos FR 155 5 (exón 3),
FR 155 6 (exón 2), FR 155 8 y FR 155 9 (exones 2 + 3). Para estos
dos últimos sujetos enfermos, el valor de la relación 3/2 es normal
dado que los dos exones han sufrido una deleción de forma
heterocigótica.
\vskip1.000000\baselineskip
En una primera serie de experimentos, se han
elegido 38 familias según los criterios siguientes: síndrome
parkinsoniano reactivo a la levodopa, ii) edad de inicio de 45 años
para el menos uno de los miembros enfermos, y iii) transmisión
compatible con una herencia autosómica recesiva.
En otra serie de experimentos, se han elegido 77
familias según los criterios siguientes (como se indica en Lücking
et al., 1998; Abbas et al., 1999): i) presencia de un
síndrome parkinsoniano con una buena respuesta a la levodopa
(\geq 30% de mejora) en al menos dos miembros de una hermandad (o
uno solo si hay noción de consanguinidad); ii) ausencia de
criterios de exclusión, tales como signo de Babinski, oftalmoplegia,
demencia o disautonomía que aparece antes de dos años de evolución;
iii) inicio \leq 45 años en al menos uno de los enfermos; iv)
herencia compatible con una transmisión autosómica recesiva (varios
pacientes en una sola generación con o sin noción de
consanguinidad). Las familias eran originarias de Francia (n = 20),
Italia (n = 19), Gran Bretaña (n = 14), Países Bajos (n = 9),
Alemania (n = 9), Líbano (n = 2), Argelia (n = 1), Marruecos (n =
1), Portugal (n = 1) y Vietnam (n = 1).
Además, se han elegido 102 casos aislados, sin
consanguinidad conocida, con los mismos criterios clínicos. Eran
originarios de Francia (n = 31), Italia (n = 23), Gran Bretaña (n =
26), Alemania (n = 21) y Países Bajos (n = 1). Todos los pacientes
han sido evaluados según un protocolo estandarizado. Se ha recogido
el consentimiento informado de todos los participantes.
El ADN de los 12 exones codificadores del gen de
la parquina ha sido amplificado por PCR a partir de leucocitos de
sangre periférica, para cada caso índice, según las condiciones
descritas en Kitada et al. En resumen, la amplificación se
ha realizado en 100 ng de ADN, en presencia de 350 \muM de cada
dNTP, 350 \muM de cada iniciador y polimerasa Taq. Las
condiciones de amplificación son de 35 ciclos a 94ºC durante 30
segundos, a 55-61ºC durante 30 segundos y a
continuación a 68ºC durante 30 segundos. Para los exones 4 y 7 solo
se ha utilizado el par de iniciadores intrónicos. Se ha realizado
la secuencia de los 12 exones en las dos hebras con los iniciadores
utilizados para la amplificación por PCR, con el kit de
secuenciación "Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction" (ABI PRISM) y se han analizado después de
electroforesis sobre el secuenciador ABI 377 con el programa
informático "Sequence Analysis 3.0" (ABI PRISM).
La detección de las mutaciones de las muestras y
el análisis de una población de 45 individuos de control han sido
realizados mediante tres técnicas que pueden ser utilizadas solas o
en combinación (o combinaciones): PCR/restricción con la enzima de
restricción apropiada; técnica ASO ("Allele Specific
Oligonucleotide") y electroforesis sobre gel de poliacrilamida
("PAGE"), como se indica en la tabla 2. Más particularmente,
estas técnicas han sido realizadas como se indica a
continuación.
Técnica ASO: Esta aproximación consiste
en hibridar dos sondas de oligonucleótidos sobre una muestra
amplificada (por ejemplo por PCR), la primera específica de y que
recubre una alteración genética y la segunda específica de y que
recubre la región natural correspondiente. Por lo tanto, en
presencia de un gen mutado, solo la primera sonda permite la
hibridación con el fragmento de ADN, mientras que en presencia de un
gen no mutado solo la segunda sonda permite la hibridación con el
fragmento de ADN. En el caso de un gen heterocigótico, se obtiene
una hibridación con cada una de las sondas. Esta técnica puede
realizarse igualmente de forma concomitante con la amplificación,
usando dos pares de iniciadores, comprendiendo el primero un
iniciador específico de y que recubre la región natural
correspondiente. En un modo de realización, en presencia de un gen
mutado solo el primer par permite la amplificación de un fragmento
de ADN, mientras que en presencia de un gen no mutado solo el
segundo par de iniciadores permite la amplificación de un fragmento
de ADN. En el caso de un gen heterocigótico, se obtiene un producto
de amplificación con cada uno de los pares de iniciadores.
Para la realización de esta técnica, se han
desnaturalizado 10 \mul de producto a 95ºC durante 5 minutos, se
han depositado sobre membranas de nilón Hybond N+ (Amersham) y a
continuación se han fijado con microondas a 600W durante 2 minutos.
Los iniciadores específicos (u oligonucleótidos) utilizados para la
detección (o, si es necesario, para la amplificación) se describen
en los ejemplos (véase la tabla 1). Para el exón 3, se han
utilizado los iniciadores exónicos Ex3iFor (anterior) y Ex3iRev
(posterior). La secuencia de estos iniciadores es la siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Ex3iFor:
5'-AATTGTGACCTGGATCAGC-3'
(SEQ ID NO: 6)
\vskip1.000000\baselineskip
Ex3iRev:
5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3'
(SEQ ID NO: 7)
\vskip1.000000\baselineskip
Estos oligonucleótidos (comprendidos los
iniciadores en el caso de una amplificación simultánea), marcados
en el dCTP32 por medio de un kit Terminal Transferase (Boehringer
Mannheim), han sido hibridados en las membranas a 44ºC durante la
noche en una disolución tampón que consistía en 5 X SSC, 5 X
Denhardts y 0,1% de SDS. A continuación se han lavado las membranas
dos veces durante 30 minutos en un medio 2 X SSC a 59ºC y se han
expuesto a una película MP (Amersham) durante 3-6
horas.
Técnica de PCR/restricción: Esta técnica
se basa en la utilización de enzimas de restricción cuyo perfil de
digestión se encuentra modificado por el hecho de la alteración
genética. Preferentemente, esta técnica utiliza por lo tanto
enzimas de restricción cuyo sitio está modificado (destruido o
creado) por alteración genética. Por lo tanto, según el perfil de
digestión del ácido nucleico (generalmente del producto de
amplificación), es posible distinguir la presencia o no de la
alteración genética buscada. Por supuesto, esta técnica está
adaptada muy particularmente a la búsqueda de alteraciones genéticas
caracterizadas, que conllevan una modificación en un sitio de corte
enzimático. Para su realización, se digieren 15 \mul del producto
de amplificación en presencia de la o de las enzimas de restricción
apropiadas, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las
enzimas particulares usadas y el tamaño de los fragmentos de
restricción esperados se dan en la tabla 2.
Técnica de electroforesis sobre gel de
poliacrilamida ("PAGE"): Esta técnica permite detectar la
presencia de mutaciones por medida del tamaño de los productos de
amplificación. Por lo tanto, está adaptada particularmente a la
detección de alteraciones genéticas del tipo inserción o deleción.
Para su realización se ha utilizado un iniciador anterior marcado
(5'-fluorescente, Hex) para amplificar el exón 2 del
gen de la parquina. Se ha establecido la presencia de la alteración
202-203delAG, que tiene como resultado un producto
de PCR más corto (306 vs 308 pb), midiendo el tamaño del fragmento
amplificado usando un secuenciador automático ABI377 equipado de
los programas informáticos "Genescan 2.0.2" y "Genotyper
1.1.1" (ABI PRISM).
La numeración de los nucleótidos utilizados en
la presente solicitud se da en referencia a la secuencia de ADN que
figura en el Banco de Datos de ADN de Japón (DDBJ; número de
entrada: AB009973). La secuencia está representada en la figura 1.
Esta secuencia difiere de la secuencia descrita por Kitada et
al. en el nucleótido 768. La secuencia presentada en la figura
1 corresponde a la proteína natural encontrada en las poblaciones
europeas.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección de las deleciones heterocigóticas o
de las multiplicaciones de exones en el gen de la parquina no se
puede realizar por PCR no cuantitativa. Por lo tanto, una PCR
semicuantitativa que compara la tasa relativa de ADN matriz es
suficiente para saber si falta 50% del ADN matriz para uno o varios
exones o, por el contrario, en el caso de una multiplicación
heterocigótica u homocigótica, si hay, por ejemplo 50% (duplicación
heterocigótica), 100% (duplicación homocigótica o triplicación
heterocigótica) o 200% (triplicación homocigótica) de exceso de ADN
para uno o varios exones. Para realizar esta comparación, se
amplifican simultáneamente varios exones de un mismo individuo en
una reacción de PCR (PCR multiplex), sirviendo los exones
coamplificados de patrón interno de cantidad. La PCR se realiza con
iniciadores fluorescentes, de forma que la cantidad de producto de
la PCR puede ser medida por la altura de los picos en un
secuenciador automático (ABI Prism 377), como el aplicado por
ejemplo en el ensayo LOH (por sus iniciales en inglés: Loss
of Heterozygosity) de Applied Biosystems. La cantidad
de producto de la PCR (altura del pico) está relacionada
directamente con la cantidad de ADN matriz en tanto que la PCR esté
en su fase exponencial que indica una ausencia de limitación para
los sustratos disponibles. Cada PCR multiplex, para una combinación
dada de exones, produce una distribución típica de altura de picos
para un individuo testigo y por lo tanto relaciones determinadas
entre los diferentes picos.
Una deleción homocigótica de un exón vendrá
demostrada por una ausencia de pico. Si un exón ha sufrido una
deleción en estado heterocigótico el pico correspondiente tendrá la
mitad de su altura normal, lo que cambiará la relación entre los
exones que tienen la deleción y los que los que no la tienen en un
factor de 2 con respecto a un testigo (comparando el valor superior
y el valor inferior; figura 4 y tabla 4 relativa a la figura 4).
Para las duplicaciones de exones, las relaciones cambian en un
factor de 1,5 para los heterocigotos y en un factor de 2 para los
homocigotos (siempre comparando el valor superior con el valor
inferior). Por lo tanto, los factores para una triplicación
heterocigótica u homocigótica son 2 ó 3, respectivamente (siempre
comparando el valor superior con el valor inferior). Igualmente
para poder detectar una deleción o una multiplicación del conjunto
del gen de la parquina se ha amplificado un producto de la PCR de
328 pares de bases (C328) de un gen situado a distancia (gen de la
Transtiretina) y sirve de patrón externo en una de las PCR
multiplex. El hecho de que solamente se comparen las relaciones de
las alturas entre los picos hace, en una primera aproximación, que
el método sea independiente de la cantidad de ADN.
En el transcurso de experimentos preliminares,
se ha observado que los exones que se amplifican mejor podían
influir de forma negativa en la amplificación de otros exones para
los que la eficacia es menor. Por lo tanto, se han reagrupado los
exones para los que la eficacia de amplificación era comparable.
Además, como el tamaño del producto de la PCR puede influir en el
rendimiento de la amplificación (siendo normalmente las secuencias
cortas mejor amplificadas que las largas), se ha realizado el
reagrupamiento de los productos de la PCR de tamaño comparable en
la reacción multiplex. Así, se han elegido tres combinaciones de
exones:
Comb 1: Ex 4o (261 bp) + 7o (239 bp) + 8 (206
bp) + 11 (303 bp),
Comb 2: Ex 5 (227 bp) + 6 (268 bp) + 8 (206 bp)
+ 10 (165 bp) y
Comb 3: Ex 2 (308 bp) + 3i (243 bp) + 9 (278 bp)
+ 12 (255 bp) + C328 (control externo de 328 pares de bases).
\vskip1.000000\baselineskip
Los iniciadores utilizados son los descritos por
Kitada et al. (1998). Para el exón 3, se ha usado un par de
iniciadores de exones:
For:
5'-(Hex)AATTGTGACCTGGATCAGC-3' (SEQ ID NO: 8)
y
Rev:
5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3' (SEQ
ID NO: 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Los iniciadores para el C328 eran:
TTRForHex:
5'-(Hex)ACGTTCCTGATAATGGGATC-3' (SEQ ID NO:
10) y
TTR328Rev: 5'
-CCTCTCTCTACCAAGTGAGG-3' (SEQ ID NO: 11).
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener picos de alturas comparables en
cada PCR multiplex y para situarse en la fase exponencial para cada
exón, se han ajustado las condiciones de la PCR de forma permanente
(siguiendo en parte las recomendaciones de Henegariu et al.
(Henegariu et al., 1997). En particular, se han disminuido
las temperaturas de hibridación y de extensión y se ha aumentado la
duración de la extensión. Además, se han ajustado las
concentraciones de los iniciadores a partir de una concentración
patrón de 0,8\muM, según la eficacia de amplificación (las
concentraciones de iniciadores se disminuían para los exones que se
amplificaban bien y se aumentaban para los otros).
Se ha ensayado cada combinación de exones para
verificar que se le situaba en la fase exponencial y esto en dos
PCR multiplex en paralelo para las 3 combinaciones de iniciadores,
en un individuo testigo con 22, 23 y 24 ciclos. Las alturas de los
picos han sido corregidas por las variaciones de depósitos según el
marcador molecular interno (TAMRA 500 XL de Applied Biosystems).
Las alturas de los picos corregidos se compararon con el número de
ciclos y representan, en una escala logarítmica, una recta
ascendente que demuestra que se sitúa en la fase exponencial para
las condiciones siguientes:
5 minutos a 95ºC para un ciclo,
30 segundos a 95ºC, 45 segundos a 53ºC y 2,5
minutos a 68ºC durante 23 ciclos,
5 minutos a 68ºC durante un ciclo.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción se realizó con 40 ng de ADN en un
volumen de 25 \mul de disolución de PCR, con 3 mM de MgCl_{2},
0,2 mM dNTP y 1U Taq/25\mul. La concentración de cada iniciador
era:
Ex 2 (0,8 \muM), Ex 3 (0,4 \muM), Ex 4 (1,0
\muM), Ex 5 (0,6 \muM), Ex 6 (1,4 \muM), Ex 7 (0,44 \muM),
Ex 8 (en la Comb 1:
1,0 \muM y en la Comb 2: 0,8 \muM), Ex 9 (0,4 \muM), Ex 10 (1,04 \muM), Ex 11 (0,8 \muM), Ex 12 (1,2 \muM) y C328 (1,92 \muM).
1,0 \muM y en la Comb 2: 0,8 \muM), Ex 9 (0,4 \muM), Ex 10 (1,04 \muM), Ex 11 (0,8 \muM), Ex 12 (1,2 \muM) y C328 (1,92 \muM).
Por regla general, se han realizado las PCR
multiplex al menos en dos reacciones para cada individuo. En cada
serie de pacientes, se han tratado en paralelo al menos un control
positivo (con una deleción heterocigótica de exones conocidos) y un
control negativo (individuo testigo) para obtener los valores
normales y patológicos para cada premezcla de reacción, de forma
que se eviten resultados erróneos debidos a las posibles diferencias
en la premezcla (variación de pipeteo). Se han añadido dos testigos
adicionales que no contenían ADN matriz. Se han mezclado de 1,5 a
2,5 \mul del producto de la PCR con 4 \mul de disolución tampón
de carga (que incluía 0,3 \mul del marcador de tamaño TAMRA 500
XL de Applied Biosystems). 1,5 \mul de esta mezcla se han cargado
sobre un gel de poliarilamida desnaturalizado al 4% que contenía 96
pozos sobre un secuenciador automático ABI 377. Los geles se
analizan con los programas informáticos GeneScan 3.1 y Genotyper
1.1.1 (Applied Biosystems). Se miden las alturas de los picos como
se ha indicado con el Genotyper. Para los dobles picos con un par
de bases de diferencia (producidos por el hecho de que la polimerasa
Taq añade de forma inconstante un A en cada extremo), se añaden las
dos alturas de los picos. Las relaciones de cada combinación de
picos se calculan para cada reacción usando el programa informático
Excel 5.0 (tabla 5) y se calculan los valores medios para dos
reacciones.
Para las deleciones, se interpretan los
resultados como patológicos si la diferencia entre las relaciones
era de al menos 1,6 o \leq0,625 (=1/1,6) en todas las relaciones
específicas entre el testigo y el caso (relación del
sujeto/relación del control - tabla 5 relativa a la figura 4).
Cuando las diferencias de relaciones entre las reacciones paralelas
son discordantes (por ejemplo, por una amplificación pequeña en una
de las PCR), se tienen en cuenta las relaciones obtenidas con una
amplificación satisfactoria, con la condición de que sean
normales.
Para las duplicaciones, un cambio en las
relaciones en un factor de 1,30-1,65 o >1,75 se
interpreta como una duplicación heterocigótica u homocigótica
respectivamente (comparando el valor superior con el valor
inferior).
Para una triplicación, un cambio en las
relaciones en un factor de 1,6-2,4 o >2,6 se
interpreta como una triplicación heterocigótica u homocigótica
respectivamente (comparando el valor superior con el valor
inferior).
Sin embargo, como se han ajustado las
condiciones de forma permanente durante el desarrollo del método,
algunos resultados han sido obtenidos en condiciones ligeramente
diferentes. Estos resultados se tienen en cuenta cuando son
claramente normales o patológicos y reproducibles. En las
situaciones ambiguas, se repetía el experimento en condiciones
adaptadas.
Los variantes de secuencia de la Parquina
se han ensayado en cuanto a su cosegregación en las familias (según
la disponibilidad de otras muestras) y en cuanto a la presencia en
una población de testigos sin síndrome parkinsoniano (61 a 73
individuos). A causa del carácter ciertamente patológico de la
mutación 1142-1143delGA, no se analizaba esta
mutación en los testigos. Las técnicas utilizadas son PCR y
digestión con la enzima de restricción apropiada o electroforesis
en gel de poliacrilamida (abreviado generalmente como PAGE por sus
iniciales en inglés: polyacrylamide gel
electrophoresis) (véase la tabla 2). Cuando el variante no
provocaba un cambio en el sitio de restricción por él mismo, se
creó un sitio artificialmente mediante un iniciador con un
desapareamiento. Los iniciadores se concebían de forma que se
introdujera el cambio de una base en proximidad de la posición del
variante de secuencia, de forma que se cree un sitio de restricción
que incluya este variante. Los iniciadores se indican en la tabla
siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Iniciadores modificados (no
complementarios de la secuencia natural por una base) para
PCR
Se subraya el cambio de par de bases introducido
en comparación con la secuencia natural.
La cosegregación de una deleción o de una
multiplicación de exones en las familias ha sido analizada mediante
los métodos descritos anteriormente. No se ha ensayado ninguna
población de control debido al carácter muy probablemente patógeno
de las mutaciones, que conllevan una deleción interna de la proteína
con o sin desplazamiento del marco de lectura.
Para analizar la unión en el locus PARK2, se han
ensayado cuatro marcadores de tipo microsatélite situados en la
proximidad del locus (D6S1579, D6S411, D6S1550 y D6S305) como se ha
descrito en Tassin et al. (1998).
La amplificación de los exones ha revelado la
presencia de una deleción en estado homocigótico en tres familias:
deleción del exón 3 en una familia francesa
(SAL-024) y una portuguesa
(SAL-711), y de los exones 8 y 9 en una familia
argelina (DEL-001). Estas deleciones se transmiten
con la enfermedad, ya que se detectan en cada familia en estado
homocigótico en todos los pacientes, pero no en los parientes sin
extracciones (figura 2).
El análisis de secuencia en las familias sin
deleción homocigótica ha revelado la presencia de 16 variantes de
la secuencia nucleica: 12 en los exones y 4 en los intrones (tablas
2 y 3, figura 3). Tres variantes conllevan un desplazamiento del
marco de lectura y la síntesis de una proteína truncada. Se trata de
las mutaciones 202-203delAG
(Gln34Arg(Stop37)) y 255delA (Asn52Met(Stop81)) en el
exón 2 y 321-322insGT (Trp74Cys(Stop81)) en
el exón 3, encontradas respectivamente en las familias
IT-020 y UK-086,
TOU-096 y LYO-119. Estas mutaciones,
con excepción de la 202-203delAG, están en estado
homocigótico. Una mutación sin sentido 1459G>A (Trp453Stop) en
el exón 12 está presente en estado homocigótico en la familia
IT-006. Ocho de los variantes son de tipo
antisentido. En el exón 4, 584A>T (Lys161Asp) y 601G>A
(Ser167Asn), están en estado heterocigótico en los pacientes de las
familias IT-020 y SAL-730,
respectivamente. En el exón 7, los variantes 867C>T (Arg256Cys)
y 924C>T (Arg275Trp) se encuentran en estado heterocigótico en
las familias DE-012 e IT-015,
respectivamente. En el exón 10, el variante 1239G>C (Val380Leu)
se encuentra en estado heterocigótico y homocigótico en 11 familias
(IT-014, IT-020,
IT-058, SAL-017,
GRE-029, SAL-038,
TOU-096,
SAL-431,UK-006,
UK-086 y DE-022). En el exón 11, se
detecta el variante 1281G>A (Asp394Asn) en estado heterocigótico
en la familia UK-046 y el 1345C>A (Thr415Asn) en
estado homocigótico en la familia IT-014. Por
último, el variante 768C>T (Pro223Ser) no es patógeno, ya que se
detecta en estado homocigótico en todos los individuos secuenciados
lo que sugiere que se trata de un error tipográfico en la secuencia
de la parquina [Kitada et al., 1998]. La búsqueda de estos
variantes en la población testigo revela que tres de entre ellos
representan polimorfismos (tabla 2): Ser167Asn, Val380Leu y
Asp394Asn. Los otros variantes constituyen muy probablemente
mutaciones causales puesto que conllevan la síntesis de la parquina
truncada o sustituciones no conservativas o sustituciones que se
dirigen sobre uno de los aminoácidos susceptibles de ser
fosforilados. Además, segregan con la enfermedad en las familias y
no se detectan en 90 cromosomas de los testigos.
Los variantes identificados en los intrones 2,
3, 6 y 7 (IVS2+25T>C (272+25T>C),
IVS3-20C>T (514-20C>T),
IVS6+19T>C (835+19T>C) e IVS7-35A>G
(973-35A>G)) constituyen polimorfismos (tabla 2).
No se localizan en la proximidad de los sitios de unión y se
detectan en los cromosomas de los testigos.
Se ha emprendido un estudio de los dominios
funcionales de la parquina por análisis y comparación de secuencias.
Este estudio demuestra que el cambio conservativo del aminoácido
Thr415Asn se localiza en la secuencia de consenso de una proteína
cinasa cAMP- y cGMP-dependiente (KKTT) y en el sitio
de fosforilación de una proteína cinasa C (TTK). Este estudio
demuestra además que la mutación sin sentido Trp453Stop se localiza
en un sitio N-terminal de miristoilación
(GCEWNR).
Se han detectado las deleciones homocigóticas y
las mutaciones puntuales en 12 familias que comprenden 26
pacientes. La edad media de inicio es de 36,7 años con extremos de 7
a 56 años (tabla 3). La comparación entre las familias según las
consecuencias funcionales de las mutaciones (deleción homocigótica,
mutación truncante y mutación antisentido) no revela diferencias
significativas en la edad de inicio, en la severidad o en la
frecuencia de los síntomas asociados, salvo por el temblor que es
significativamente menos frecuente en las familias con una deleción
homocigótica, en comparación con las familias con mutaciones
truncantes (tabla 3).
Se han identificado ocho nuevas mutaciones
puntuales en los exones, de las que seis son mutaciones antisentido,
una truncante y una sin sentido: 734A>T (Lys211Asn) en el exón
6, 905T>A (Cys268Stop), 939G>A (Asp280Asn) y 966T>G
(Cys289Gly) en el exón 7, 1084G>A (Gly328Glu),
1142-1143delGA y 1101C>T (Arg334Cys) en el exón
9 y 1390G>A (Gly430Asp) en el exón 12. Cinco de las mutaciones
antisentido conducen a cambios de aminoácidos no conservativos y
una a un cambio conservativo (Cys289Gly). Además, se ha puesto en
evidencia una deleción de cinco pares de bases en el intrón 8
localizada en las posiciones -21 a -17 con respecto al exón 9. Todos
estos variantes de secuencia no han sido detectados en 61 a 73
individuos testigos (no habiéndose ensayado la mutación
1142-1143delGA) y no representan por lo tanto
polimorfismos. Los resultados se presentan en la Tabla 2.
Se han detectado deleciones homocigóticas de
exones en 3 familias además de las deleciones indicadas
anteriormente por Hattori et al. (1998a) y Lücking et
al. (1998) para el exón 3 y por Hattori et al. (1998a)
para los exones 3+4. Estas deleciones conciernen a los exones 3
(FDP-ANG-GEO-141),
3+4 (IT-064) y 5+6
(SPD-LIB-HAG-076).
Las consecuencias de las deleciones de exones en el marco de lectura
y su frecuencia relativa en las muestras se indican en la tabla
4.
Se han detectado cinco nuevos tipos de
duplicaciones de exones: una duplicación del exón 3 en estado
homocigótico
(SPD-NIC-AIT-091) y
una duplicación del exón 3 en estado heterocigótico (SAL 399 213).
Además, se han detectado duplicaciones heterocigóticas del exón 6
(FPD-LIL-CHA-171),
del exón 7(DE 4001) y del exón 1 (SAL 399 213). Se han
detectado dos tipos de triplicaciones: una triplicación del exón 2
en estado homocigótico (RM 347) y en estado heterocigótico (RM
330).
Se han puesto en evidencia trece combinaciones
diferentes de deleciones heterocigóticas en 21 familias. Se han
observado las siguientes deleciones: exones 2, 2+3, 2+3+4, 3, 3+4,
3-6, 3-9, 4, 5, 6, 6+7, 7+8+9 y 8.
Las deleciones de exones 2, 2+3, 2+3+4, 3-6,
3-9, 6, 6+7, 7+8+9 y 8 son nuevas.
Para dos familias
(Sal-Hab-436 y UK 12416) no se ha
podido establecer con certeza si las mutaciones heterocigóticas de
los exones 2+3 ó 6-7, respectivamente, se situaban
en el mismo cromosoma o se trataba de casos heterocigóticos
compuestos a causa de la ausencia de ADN para otros miembros de
estas familias. Las consecuencias de las deleciones y de las
multiplicaciones de exones descritas en el marco de lectura y su
frecuencia relativa en nuestra muestra se indican en la tabla
4.
Se han puesto en evidencia cinco mutaciones en
más de una familia. Estas mutaciones son
202-203delAG (en estado heterocigótico u
homocigótico en 5 familias), 255delA (en estado homocigótico o
heterocigótico en 6 familias), Lys211Asn (en estado heterocigótico
en 2 familias) y Arg275Trp (en estado heterocigótico en 5
familias).
Entre las familias con mutaciones de la
Parquina, se han detectado deleciones homocigóticas de exones
en 8 familias, mutaciones puntuales en estado homocigótico en 10
familias, una duplicación de exón homocigótica en una familia y una
triplicación de exón en una familia. Los pacientes de 21 familias
eran heterocigóticos compuestos para dos mutaciones diferentes (3
veces para las mutaciones puntuales diferentes, 6 veces para una
mutación puntual y una deleción de exón, dos veces para una mutación
puntual y una duplicación, una vez para una triplicación y una
deleción de exón, una vez para dos duplicaciones de exón diferentes
y 6 veces para dos deleciones diferentes de exones; véase por
ejemplo la figura 4). En dos casos no era posible determinar si se
trataba de heterocigóticos para las deleciones de varios exones
adyacentes compuestas y en 13 casos solo era detectada una mutación
en estado heterocigótico (6 mutaciones puntuales y 7 mutaciones de
exones).
La presente invención se refiere a variantes del
gen de la Parquina, su utilización diagnóstica y/o
terapéutica, así como a técnicas para la detección de alteraciones
(principalmente deleciones de exones heterocigóticas y
multiplicaciones de exones) del gen de la Parquina.
La puesta en evidencia de diferentes
alteraciones genéticas (principalmente deleciones homocigóticas,
mutaciones puntuales, inserciones y multiplicaciones de exones)
causales demuestra que las anomalías del gen de la parquina
constituyen una causa frecuente de AR-JP.
Un primer estudio ha permitido poner en
evidencia la existencia de deleciones, mutaciones e inserciones en
el gen de la parquina.
El papel patógeno de las deleciones
homocigóticas parece fácil de establecer. En las 2 mutaciones
descritas, deleciones del exón 3 y de los exones
8-9, la pérdida del exón se acompaña de un
desplazamiento del marco de lectura que lleva a la aparición de un
codón de terminación prematuro. En ausencia de unión alternativa,
con ello se producirá una proteína truncada.
Ocho de los variantes exónicos constituyen
mutaciones causales. En primer lugar, estas mutaciones segregan con
la enfermedad en las familias. En segundo lugar, estos variantes no
se detectan por ASO, PAGE ni PCR/restricción en 90 cromosomas de
los testigos. En tercer lugar, las consecuencias funcionales de las
mutaciones parecen ser deletéreas. Es fácil de comprender que las 4
mutaciones puntuales truncantes (Gln34Arg(Stop37),
Asn52Met(Stop81), Trp74Cys(Stop81) y Trp453Stop),
detectadas en estado homocigótico en los pacientes de 3 de las 5
familias, van a causar una pérdida de función de la parquina, de
acuerdo con la transmisión autosómica recesiva de la enfermedad.
Tres de las cuatro mutaciones antisentido conllevan cambios no
conservativos de aminoácidos. Una de entre ellas (Lys161Asp) se
asocia a una mutación truncante en el otro alelo lo que refuerza la
hipótesis de un papel patógeno. Una mutación antisentido es
conservativa (Thr415Asn), pero afecta a un sitio potencial de
fosforilación. Tres de las mutaciones antisentido se presentan en
estado heterocigótico en pacientes cuya otra mutación no ha sido
caracterizada. Es probable que se trate de deleciones de uno o
varios exones en estado heterocigótico que no se pueden visualizar
con las técnicas usadas para este estudio.
Las anomalías del gen de la parquina puestas en
evidencia son variadas y no existe ningún punto caliente de
mutaciones. Es preciso tener en cuenta que las mutaciones puntuales
truncantes corresponden preferentemente a las regiones N- y
C-terminales de la parquina (que comprenden en
particular restos similares a la ubiquitina y en anillo
"RING-finger", respectivamente) mientras
que las mutaciones de tipo antisentido afectan a la región central.
Solo dos de las 11 mutaciones descritas en este primer estudio se
encuentran en varias familias. La deleción homocigótica del exón 3
se detecta en la familia francesa SAL-024 y en la
portuguesa SAL-711. La mutación con desplazamiento
del marco de lectura 202-203delAG
(Gln34Arg(Stop37)) se visualiza en estado heterocigótico en
la familia italiana IT-020 y en la inglesa
UK-086. El origen diferente de las familias está en
favor de la hipótesis de la aparición independiente de estas
mutaciones.
Las mutaciones descritas afectan a familias que
provienen de 6 países: Argelia, Alemania, Inglaterra, Francia,
Italia y Portugal. El estudio del fenotipo en las familias con una
mutación muestra que el espectro clínico asociado a las anomalías
de la parquina está más extendido que en las familias japonesas
[Kitada et al., 1998]. Estos resultados confirman las
observaciones hechas en las familias europeas y de África del Norte
estudiadas por uniones genéticas [Tassin et al., 1998]. La
edad de inicio es superior a 50 años en varios pacientes, yendo
hasta los 56 años. Algunos síntomas clínicos, tales como la distonía
o los síntomas piramidales en los miembros inferiores, no están
siempre presentes en los portadores de la mutación, incluso después
de tiempos de evolución de varios decenios. Globalmente el fenotipo
sigue siendo muy similar entre los grupos de pacientes clasificados
según las consecuencias funcionales de las mutaciones. Sin embargo,
parece que la presencia de episodios de distonía dolorosa se
encuentra exclusivamente en los pacientes portadores de deleciones
homocigóticas. La ausencia de diferencias significativas en la edad
de inicio, la severidad y la frecuencia de los síntomas asociados
entre las mutaciones puntuales truncantes y las antisentido sugieren
que los aminoácidos modificados en estas últimas tienen un papel
importante en la fisiología de la parquina.
En conclusión, este primer estudio subraya la
frecuencia de las mutaciones del gen de la parquina en los síndromes
parkinsonianos familiares de inicio precoz en Europa. Anomalías de
este gen también están en el origen de síndromes parkinsonianos más
tardíos o atípicos. Queda por determinar el papel de las mutaciones
de la parquina o sus polimorfismos en los casos aislados. Las
mutaciones detectadas son muy diversas tanto por su naturaleza como
por su localización. El estudio de su localización en la parquina
sugiere que numerosas regiones de la proteína contribuyen en su
función, aún desconocida.
Por primera vez se describe la detección de las
deleciones de exones en estado heterocigótico y de multiplicaciones
de exones (por ejemplo, duplicación, triplicaciones) en estado
homocigótico y heterocigótico en el gen de la Parquina. Este
aspecto es interesante puesto que las deleciones de exones son
relativamente frecuentes (véase a continuación). Como método de
detección, se ha elegido y puesto a punto un protocolo de PCR
multiplex semicuantitativo. Este método se había validado
anteriormente para la dosificación genética, por ejemplo para la
detección de deleciones del gen PMP22 (Poropat y Nicholson, 1998),
con la condición de que la amplificación por PCR sea en la fase
exponencial. En todos estos experimentos, la elección de los
testigos co-amplificados que sirven de patrón para
la cuantificación es crucial (Prior, 1998). En el experimento, los
exones que no han sufrido deleción sirven de testigos internos en
la amplificación por PCR multiplex en el mismo individuo. Se han
elegido las combinaciones de 4 ó 5 exones de forma que no contengan
más de 2 exones adyacentes, puesto que tales exones no pueden
servir de controles en el caso de una deleción de los dos. El exón
de un gen diferente (Transtiretina) ha sido
co-amplificado en una de las tres combinaciones para
identificar deleciones heterocigóticas del conjunto del gen
Parquina. Este control externo estaba representado
indirectamente en las otras dos combinaciones que incluyen exones
de cada lado del exón 9; habiéndose ensayado este último con la
Transtiretina.
Los resultados obtenidos por este método eran
muy reproducibles y los resultados anormales muestran diferencias
en las relaciones de un factor, lo que corresponde al esperado en
teoría. Estos resultados muestran que se trata de un método
sencillo y validado para una selección rápida. Además, pequeñas
deleciones o inserciones en el producto de la PCR, que son
relativamente frecuentes (véase a continuación), pueden detectarse
simultáneamente por este método.
Ha sido posible identificar cuatro duplicaciones
de exones y una triplicación de exones nunca descritas anteriormente
en el gen de la parquina, pero cuya frecuencia relativa es pequeña.
Además, han sido identificadas 10 combinaciones de deleciones de
exones nuevas con la demostración, por primera vez, de las
deleciones que llevan el exón 2. La frecuencia relativa de las
mutaciones puntuales y de las deleciones de exones ha sido estimada
en aproximadamente 50%. Por lo tanto, las deleciones de exones
(heterocigóticas u homocigóticas) pueden representar hasta 50% de
las mutaciones de la Parquina, subrayando el interés de la
técnica descrita aquí. De hecho, esta técnica ha permitido detectar
mutaciones en 26 de las 53 familias. Por lo tanto, en la muestra
estudiada las mutaciones puntuales y las deleciones en el gen de la
Parquina tienen la misma frecuencia, mientras que las
deleciones de exones son mayoritarias en la población japonesa
(Hattori et al., 1998). Las consecuencias funcionales de las
deleciones o de las multiplicaciones de exones descritas
(desplazamiento del marco de lectura o deleción/multiplicación en
fase) han sido deducidas de las secuencias de ADN publicadas de la
Parquina (Kitada et al., 1998) y son especulativas,
puesto que la ausencia del producto de la PCR no indica que haya
forzosamente deleción del exón en su totalidad (véase
anteriormente). Sin embargo, el papel patológico de las
modificaciones detectadas es muy probable puesto que se transmiten
con la enfermedad en las familias que han podido analizarse, se
asocian a mutaciones puntuales en heterocigotos compuestos y las
deleciones se identifican con una frecuencia similar a la de las
mutaciones puntuales. Igualmente, en los casos aislados, la
frecuencia de las deleciones heterocigóticas y de las mutaciones
puntuales es similar. En el caso del exón 3 se han usado iniciadores
exónicos que demuestran la alteración de este exón cuando no hay
producto de la PCR. Además, en una parte de los casos, había habido
deleción simultánea de varios exones yuxtapuestos, lo que es un
argumento para una gran deleción genómica.
No se han observado deleciones o
multiplicaciones heterocigóticas del conjunto del gen de la
Parquina. Se trata probablemente de un acontecimiento raro,
teniendo en cuenta el gran tamaño (aproximadamente 500 kb) de este
gen (Kitada et al., 1998).
Las deleciones de exones observadas afectan
frecuentemente a los exones 3 a 5. Esta observación se confirma en
las familias europeas. Además, se ha demostrado que el exón 2, solo
o asociado con otros, también está frecuentemente implicado en las
familias europeas (tabla 2).
La identificación de 8 nuevas mutaciones
puntuales (6 de tipo antisentido, 1 truncante y 1 de tipo sin
sentido) aumenta la diversidad de las mutaciones puntuales del gen
de la Parquina. Las mutaciones descritas son patógenas, como
ha demostrado la segregación con la enfermedad, y no se detectan en
122 a 147 cromosomas de testigos (sin incluir la mutación
1142-1143delGA). Incluso si el cambio Cys289Gly es
conservativo, este cambio de aminoácido puede tener consecuencias
deletéreas importantes si la cisteína en la posición 289 está
implicada en un puente de disulfuro, importante para la función de
la proteína.
De forma interesante, 2 pacientes de la familia
UK-040 presentan 3 mutaciones diferentes (véase la
tabla 5): una mutación antisentido Arg334Cys en el exón 9 en estado
homocigótico, una deleción homocigótica de 5 pares de bases en
posición -17 a -21 del intrón 8 y una mutación antisentido no
conservativa Asp280Asn en estado heterocigótico. Se puede sospechar
que la mutación Arg334Cys en estado homocigótico es causal, pero la
deleción de cinco pares de bases en estado homocigótico, en la
proximidad del sitio aceptor de unión del exón 9, también podría
tener consecuencias funcionales.
Cinco mutaciones puntuales están presentes en
varias familias analizadas. Las tres más frecuentes son la 255delA
(detectada en 6 familias) y la 202-203delAG
(encontrada en 5 familias) y la Arg275Trp (detectada en 5 familias).
Se podría sospechar de un efecto fundador para la mutación 255delA
que afecta a 5 familias francesas. Sin embargo, esta hipótesis no
se podrá verificar más que mediante el análisis de los
haplotipos.
Los resultados obtenidos muestran que 34 de las
77 familias con un síndrome parkinsoniano de inicio precoz
presentan mutaciones del gen de la Parquina, lo que subraya
la importancia de este gen en las familias europeas. La detección
de las mutaciones en 18 de los 102 casos aislados y analizados es
más difícil de interpretar puesto que el efectivo es más pequeño y
el análisis de algunos casos no es completo. Sin embargo, es
impresionante constatar que la edad de inicio de los 7 casos para
los que es conocida es particularmente precoz ((13 a 22 años) y que
hay muy pocos casos de inicio muy precoz sin mutación del gen de la
Parquina (por ejemplo,
IT-NA-JMP-3). Este
resultado sugiere que la frecuencia de las mutaciones del gen de la
Parquina en casos aislados crece cuando su edad disminuye,
especialmente antes de la edad de 25 años. La observación de
mutaciones del gen de la Parquina en los casos aislados no
es sorprendente si se considera que en familias de tamaño pequeño
una enfermedad autosómica recesiva tiene todas las posibilidades de
aparecer como un caso aislado. El análisis de una muestra más
amplia será útil para determinar precisamente la frecuencia de las
mutaciones de la Parquina en los casos aislados, según la
edad de inicio.
Se han identificado mutaciones en familias de
orígenes muy variados:
Francia, Italia, Gran Bretaña, Alemania, Países
Bajos, Argelia y Portugal. Estos resultados muestran que las
mutaciones del gen de la Parquina se ponen en evidencia en
todas las poblaciones analizadas hasta el presente.
Aunque la técnica de detección de las deleciones
heterocigóticas de exones o de las multiplicaciones de exones ha
permitido identificar casos heterocigóticos compuestos, en
aproximadamente 1/4 de las familias (13 sobre 53) solo se ha
detectado una mutación. Se trata de 6 casos con una mutación puntual
en estado heterocigótico y de 7 con una deleción de exón en estado
heterocigótico. El papel patógeno de estas mutaciones es muy
probable ya que producen un cambio de aminoácido no conservativo o
un proteína truncada. Además, una de estas mutaciones de tipo
antisentido (Arg275Trp) está asociada con otra mutación puntual
heterocigótica (Gly430Asp) y con deleciones de exones
heterocigóticas (exón 3-6 ó exón 5+6), portada por
otro alelo en tres familias diferentes. La ausencia de detección de
una mutación sobre otro alelo en 13 familias sugiere que una segunda
mutación no detectada afecta a otra región del gen. Esta hipótesis
está reforzada por el hecho de que en 6 familias probablemente
relacionadas con el locus PARK2, ya que los pacientes son
haploidénticos para 4 marcadores de la región, no se ha detectado
ninguna mutación. Por lo tanto, otras regiones del gen podrían estar
afectadas, tales como las regiones promotoras, las regiones 5' y
3' no traducidas, o secuencias intrónicas.
En 5 de las 77 familias, se ha podido excluir
una unión genética al locus Parquina. Además, no se ha
identificado ninguna mutación en 21 familias para las que este
locus no ha podido ser formalmente excluido. Estos resultados
sugieren que podría existir al menos otro locus para familias con un
síndrome parkinsoniano autosómico de inicio precoz en Europa. Esta
hipótesis fue propuesta por Leroy et al. (1998), que informa
de una familia con dos ramas, de las que una presenta deleciones
del gen de la Parquina mientras que la otra no presenta ni
deleciones ni el mismo haplotipo, lo que excluye una unión en ese
locus.
Se informa de un nuevo método para la detección
de deleciones heterocigóticas de exones o de multiplicaciones de
exones. En particular, las duplicaciones/triplicaciones de exones y
deleciones del exón 2 y otras combinaciones de exones son nuevas.
En combinación con la secuenciación de exones, se han podido
identificar ocho nuevas mutaciones puntuales y una deleción
intrónica que podría afectar a un sitio de unión. Por lo tanto, 34
de las 77 familias analizadas (aproximadamente 50%) presentan
mutaciones del gen de la Parquina. Además, las mutaciones de
este gen se han detectado en 19 casos aislados. En la población
europea, la proporción de mutaciones puntuales y de deleciones de
exones parece idéntica. Además, se han puesto en evidencia dos
puntos calientes de mutaciones que corresponden a deleciones en los
exones 3 a 5 y a tres mutaciones puntuales
(202-203delAG, 255delA y Arg275Trp).
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<110> RHONE POULENC RORER
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\hskip-.1em\dddseqskipINSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE M
\hfill
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<120> MUTACIONES DEL GEN DE LA PARQUINA,
COMPOSICIONES, MÉTODOS Y UTILIZACIONES
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<130> parquina
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<140>
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<141>
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<150> FR9814254
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<151>
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<151>
1999-03-12
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<160> 23
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 2960
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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<210> 4
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<212> ADN
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<210> 12
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<213> Homo sapiens
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<210> 14
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<212> ADN
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<400> 14
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<212> ADN
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<212> ADN
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\hskip-.1em\dddseqskipgccgggaaaa ctcagggta
\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgggaaat ctcagggta
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\hskip-.1em\dddseqskiptgcaactcct gccacgtga
\hfill19
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<212> ADN
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\hfill19
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\hfill19
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<400> 22
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\hskip-.1em\dddseqskipagaaaaccac caagccctg
\hfill19
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<212> ADN
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<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaaaaccaa caagccctg
\hfill19
Claims (16)
1. Ácido nucleico que codifica para la parquina
humana, caracterizado porque comprende una mutación que
conlleva el cambio Arg275Trp en la proteína codificada.
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende la mutación C->T en el
nucleótido 924.
3. Polipéptido codificado por un ácido nucleico
según una de las reivindicaciones 1 y 2.
4. Anticuerpo específico de un polipéptido
según la reivindicación 3.
5. Composición que comprende un polipéptido
según la reivindicación 3 o un anticuerpo según la reivindicación
4.
6. Sonda nucleotídica, caracterizada
porque hibrida específicamente con un ácido nucleico según la
reivindicación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Procedimiento para la identificación de una
alteración genética que conlleva el cambio Arg 275 Trp en la
parquina humana en el gen de la parquina que comprende:
- -
- poner a disposición una muestra de ensayo que comprende el gen de la parquina,
- -
- amplificar la parte de dicho gen que comprende potencialmente dicha alteración, y
- -
- poner en evidencia la presencia de la alteración genética.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la muestra es una muestra de sangre, de
tejido, de plasma o un cultivo celular.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque la muestra se trata previamente de forma
que el gen de la parquina, o una parte de este, sea accesible para
la amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la amplificación se realiza por medio
de un par de iniciadores para la amplificación de todo o parte de un
ácido nucleico tal como se ha descrito en la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende:
- -
- un primer iniciador complementario de una región del gen de la parquina situado en 5' de dicha mutación, y
- -
- un segundo iniciador complementario de una región del gen de la parquina situado en 3' de dicha mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la puesta en evidencia se realiza por
secuenciación, PCR/restricción, ASO, PAGE, o PCR/multiplex
semicuantitativa.
12. Procedimiento de diagnóstico de una
susceptibilidad al síndrome parkinsoniano que comprende la búsqueda
de una mutación en el gen de la parquina según una de las
reivindicaciones 1 y 2.
13. Vector que comprende un ácido nucleico tal
como se ha descrito según una cualquiera de las reivindicaciones 1
y 2.
14. Célula que comprende un vector tal como se
ha descrito según la reivindicación 13.
15. Mamífero no humano que comprende, en sus
células, un ácido nucleico según una de las reivindicaciones
1 y 2.
1 y 2.
16. Utilización de una célula según la
reivindicación 14 o de un mamífero según la reivindicación 15 para
la identificación de compuestos capaces de oponerse a los efectos de
una alteración genética del gen de la parquina.
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