ES2330173A1 - Procedimiento de produccion y purificacion del factor derivado del epitelio pigmentado de la retina en un sistema de levadura. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de producción y purificación del factor derivado del epitelio pigmentado de la retina en un sistema de levadura. La presente invención se refiere a un procedimiento para producir y purificar las moléculas de PEDF y versiones mutadas y/o truncadas de dicha molécula en un sistema de expresión de levadura. También tiene como objeto la protección de las propias moléculas PEDF directamente obtenidas y el uso de las mismas en la preparación de composiciones farmacéuticas. El procedimiento comprende las etapas de obtener el ADN de PEDF al menos a partir de células del epitelio pigmentado de retina, obtener versiones mutantes y/o truncadas, clonar las construcciones en un vector de expresión de levadura, transformar y seleccionar los clones de la levadura, inocular, con los clones obtenidos, el medio de crecimiento de la levadura, inducir el factor PEDF completo o truncado en la levadura, eliminar las células del cultivo mediante centrifugación, cambiar el medio de cultivo en el que están presentes el factor PEDF completo y/o truncado, purificar y aislar.
Description
Procedimiento de producción y purificación del
factor derivado del epitelio pigmentado de la retina en un sistema
de levadura.
La presente invención está dentro del campo de
la Biología Molecular y la Biotecnología. En particular, la
invención se refiere a un procedimiento para producir y purificar
la molécula completa de PEDF (Factor Derivado del Epitelio
Pigmentado), y versiones mutadas y/o truncadas de dicha molécula en
el sistema de expresión eucariota de Pichia pastoris. La
presente invención también tiene como objeto la protección de las
propias moléculas de PEDF directamente obtenidas mediante este
procedimiento y el uso de las mismas en la preparación de
composiciones farmacéuticas.
El factor PEDF fue inicialmente purificado a
partir de medios condicionados de células epiteliales de la retina
(Tombran-Tink, J. et al. 1991). PEDF es una
proteína que inicialmente fue caracterizada como un inductor y
regulador de la diferenciación celular, y se ha propuesto que PEDF
podría regular la diferenciación neuronal en la retina embrionaria
(Jablonski, M. et al., 1995). También se ha comprobado que
PEDF ejerce actividad neurotrófica sobre todo tipo de células de
origen neuronal, y además, aumenta la supervivencia de células
granulosas del cerebelo en cultivo. También se ha descrito que esta
proteína es uno de los factores anti-angiogénicos
más potentes (Doll, J.A. et al., 2003) conocidos. Se han
descrito en la molécula PEDF dos regiones:
- 1)
- Una región amino-terminal, actividad neurotrófica.
- 2)
- Una región carboxilo-terminal, con actividad anti-angiogénica.
El aislamiento de PEDF a partir de muestras
(humor vítreo, por ejemplo, donde es abundante) es muy complicado
debido a la dificultad de disponer de cantidad suficiente de
tejido. Además, como se explicará a continuación, los procedimientos
actuales de producción de esta proteína presentan importantes
inconvenientes. Por ello, nuestro grupo de investigación consideró
interesante expresar y purificar tanto la proteína completa como la
región carboxilo de la misma, en la levadura Pichia
pastoris, con el fin de analizar su posible efecto terapéutico
en patologías tales como degeneración macular asociada a la edad,
retinopatía diabética, cáncer, enfermedades neurodegenerativas,
etc.
La expresión y purificación del factor PEDF ha
sido descrita con anterioridad en dos sistemas de producción
diferentes:
1) por una parte, se ha descrito su producción
en la bacteria Escherichia coli (Becerra SP et al.
1993, JBC):
- \bullet
- USSN 07/952,796. A DNA Clones for the Expression of Pigment Epithelium Derived Growth Factor and Related Proteins.
- \bullet
- USSN 08/257,963. A Pigment Epithelium Derived Factor: Characterizations of Its Biological Activity and Sequences Encoding and Expressing the Protein.
- \bullet
- USSN 08/279,979. A Retinal Pigmented Epithelium Derived Neurotrophic Factor.
- \bullet
- USSN 08/367,841. A Pigment Epithelium Derived Factor: Characterization, Genomic Organization and Sequence of the PEDF Gene.
- \bullet
- USSN 08/377,710. A DNA Clones for the Expression of Pigment Epithelium Derived Factor and Related Proteins.
- \bullet
- USSN 08/520,373. A Retinal Pigmented Epithelium Derived Neurotrophic Factor.
Sin embargo, la expresión de PEDF en E.
coli publicada por este grupo de investigación presenta graves
problemas, tales como la no secreción de la proteína PEDF
producida, y su no solubilidad (presencia en cuerpos de inclusión),
lo que conlleva la incorporación de una serie de pasos en el
procedimiento de purificación (por ejemplo, la desnaturalización de
la proteína para su purificación, y su consiguiente paso de
renaturalización) que hacen a éste mucho más tedioso, además de
obtener la proteína en un estado conformacional que puede diferir
de su estado normal. Por otra parte, el hecho de producir esta
proteína en un organismo procariota, hace que modificaciones
post-traduccionales descritas en esta proteína, y
que son esenciales para su adecuada actividad (glicosilación,
fosforilación), no sean realizadas o lo sean de manera incorrecta,
obteniéndose por tanto una variante no "fisiológica" de la
proteína. Recientemente ha sido publicado por otro grupo de
investigación un procedimiento de producción de PEDF en E.
coli (Zhang T et al. 2005, Biotechnology Letters) que
solventa los problemas de falta de solubilidad y de secreción que
presentaba el procedimiento descrito por Becerra et al. 1993.
Este nuevo método incorpora además un paso final de digestión
enzimática con el fin de eliminar la molécula de Glutation
S-transferasa (GST), fusionada con el extremo
c-terminal de PEDF para facilitar la purificación del factor PEDF. Este último paso complica aún más el procedimiento de obtención de PEDF. Aún así, la proteína obtenida en un organismo procariota no es seguro que sea madurada de forma adecuada, y esto puede afectar de forma importante a la estructura y a la actividad de la proteína obtenida.
c-terminal de PEDF para facilitar la purificación del factor PEDF. Este último paso complica aún más el procedimiento de obtención de PEDF. Aún así, la proteína obtenida en un organismo procariota no es seguro que sea madurada de forma adecuada, y esto puede afectar de forma importante a la estructura y a la actividad de la proteína obtenida.
Por otra parte, en 1996 se describió la
producción del factor PEDF en células eucariotas, concretamente, en
cultivos de células de riñón de hámster (Stratikos E et al.
1996, Protein Science). La producción de PEDF en este tipo de
células eucariotas, solventaba el importante problema de las
modificaciones post-traduccionales, aunque
incorporaba dos importantes inconvenientes al proceso de
producción:
- a)
- El cultivo de líneas celulares es mucho más caro (medios de cultivo y suplementos necesarios, como suero fetal) que el sistema de producción en organismos unicelulares como E. coli.
- b)
- El nivel de producción de PEDF en cultivos celulares es más bajo, encareciendo con ello todo el sistema de producción.
La proteína comercial PEDF es producida en la
actualidad principalmente en cultivos de células de riñón de
hámster. Debido al elevado coste, este sistema de producción, y a
los bajos niveles de proteína obtenida, la presente invención
proporciona una nueva alternativa práctica, rápida, eficaz y mucho
más económica para producir el factor PEDF. Por tanto, la presente
invención propone un método o procedimiento de obtención del factor
PEDF en un sistema de expresión diferente a los descritos en el
estado de la técnica, fundamentado en la utilización de la levadura
Pichia pastoris.
La presente invención proporciona un nuevo
procedimiento para producir el factor PEDF, un equivalente
funcional del factor PEDF que contenga sustitución(es),
adición(es), inserción(es) y/o deleción(es)
únicas o múltiples en la secuencia de la proteína tipo salvaje y/o
sustituciones de aminoácidos modificados químicamente que no
afecten la función biológica, (así como versiones hiper- e
hipo-fosforiladas que corresponden a las secuencias
SEQ.ID.N.3, SEQ.ID.N.4, SEQ.ID.N.5 Y SEQ.ID.N.6 respectivamente),
y/o versiones truncadas de PEDF en el sistema de expresión
eucariota, preferentemente en levaduras y más concretamente en
Pichia pastoris.
De acuerdo con la problemática planteada en
líneas anteriores, estudios recientes
(Maik-Rachline G. and Seger R., Blood., Dec. 2005)
han descrito la modificación post-traduccional de
PEDF (fosforilación), y cómo esta fosforilación afecta a las
diferentes actividades de esta proteína. Como ya se indicado
anteriormente, el empleo de células eucariotas para la expresar el
factor PEDF favorece la obtención de las diferentes formas
fosforiladas (por lo tanto funcionales) del mismo.
Un aspecto muy importante de la presente
invención es que la proteína producida en el sistema de Pichia
pastoris es totalmente soluble, es secretada al medio de
cultivo, y puede ser obtenida con un alto grado de pureza en un
único paso cromatográfico, sin necesidad de incorporar
ninguna etapa de digestión enzimática en el proceso de
purificación.
La ventaja fundamental que presenta el
procedimiento descrito en la presente invención respecto al resto
de procedimientos ya descritos es conseguir un sistema de
producción sencillo y de bajo coste, que puede ser utilizado a nivel
industrial para la producción de PEDF.
Por lo tanto, según un primer aspecto
importante, esta invención se refiere a un procedimiento para
obtener factor PEDF aislado o purificado y/o un equivalente
funcional del factor PEDF que contenga al menos una sustitución y/o
una adición y/o una inserción y/o una deleción en la secuencia de
la proteína tipo salvaje y/o contenga al menos una sustitución de
aminoácidos modificados químicamente y/o versiones truncadas de
PEDF en un sistema de expresión de una levadura que comprende las
siguientes etapas:
- a.
- Obtener el cADN de PEDF mediante RT-PCR partiendo de ARN total obtenido al menos a partir de células del epitelio pigmentado de retina;
- b.
- Obtener mediante PCR versiones mutantes y/o truncadas, empleando como ADN molde la forma completa de PEDF;
- c.
- Clonar las construcciones de la etapa a) y de la etapa b), en un vector de expresión de levaduras;
- d.
- Transformar y seleccionar los clones de la levadura con las diferentes construcciones clonadas generadas en la etapa c);
- e.
- Inocular, con los clones obtenidos en la etapa d), el medio de crecimiento de levadura;
- f.
- Inducir el factor PEDF completo y/o truncado en la levadura en medio de cultivo de levaduras con metanol corno inductor;
- g.
- Eliminar las células del cultivo mediante centrifugación;
- h.
- Cambiar el medio de cultivo en el que están presentes el factor PEDF completo y/o truncado, a un tampón de unión apropiado para la cromatografía de afinidad;
- i.
- Purificar el factor PEDF completo y/o truncado, mediante cromatografía de afinidad;
- j.
- Cambiar el tampón del factor PEDF completo y/o truncado purificado a un tampón que permita su posterior empleo en estudios de actividad.
La presente invención también se refiere al
procedimiento para obtener factor PEDF aislado o purificado y/o un
equivalente funcional del factor PEDF que contenga al menos una
sustitución y/o una adición y/o una inserción y/o una deleción en la
secuencia de la proteína tipo salvaje y/o contenga al menos una
sustitución de aminoácidos modificados químicamente y/o versiones
truncadas de PEDF según reivindicación 1 en un sistema de expresión
de una levadura, preferentemente en Pichia pastoris que
comprende las siguientes etapas:
- a.
- Obtener el cADN de PEDF mediante RT-PCR partiendo de ARN total obtenido al menos a partir de células del epitelio pigmentado de retina;
- b.
- Obtener mediante PCR versiones mutantes y/o truncadas, empleando como ADN molde la forma completa de PEDF;
- c.
- Clonar las construcciones de la etapa a) y de la etapa b), en un vector de expresión de Pichia pastoris;
- d.
- Transformar y seleccionar los clones de la levadura Pichia pastoris con las diferentes construcciones clonadas generadas en la etapa c);
- e.
- Inocular, con los clones obtenidos, el medio de crecimiento de Pichia pastoris;
- f.
- Inducir el factor PEDF completo o truncado en la levadura en medio de cultivo de Pichia pastoris con metanol como inductor;
- g.
- Eliminar las células del cultivo mediante centrifugación;
- h.
- Cambiar el medio de cultivo en el que están presentes el factor PEDF completo y/o truncado, a un tampón de unión apropiado para la cromatografía de afinidad;
- i.
- Purificar el factor PEDF completo y/o truncado, cromatografía de afinidad;
- j.
- Cambiar el tampón del factor PEDF completo y/o truncado purificado a un tampón que permita su posterior empleo en estudios de actividad.
Según otro aspecto importante en la presente
invención en la etapa c) el vector de expresión es
pPICZ\alphaA.
Según otro aspecto importante en la presente
invención en la etapa e) el medio de cultivo es el medio BMGY.
Según otro aspecto importante en la presente
invención en la etapa j) el tampón que permite el posterior empleo
en estudio de actividad es tampón PBS.
Según otro aspecto importante en la presente
invención en la etapa a) los cebadores empleados se seleccionan de
la secuencias SEQ.ID.N.7 y/o SEQ.ID.N.8 y/o cualquier cebador
equivalente cuya secuencia nucleotídica solape con las secuencias
SEQ.ID.N.7 y/o SEQ.ID.N.8.
Según otro aspecto importante en la presente
invención en la etapa b) los cebadores empleados se seleccionan del
grupo formado por la secuencias SEQ.ID.N.9, SEQ.ID.N.10,
SEQ.ID.N.11, SEQ.ID.N.12, SEQ.ID.N.13, SEQ.ID.N.14, SEQ.ID.N.15,
SEQ.ID.N.16, SEQ.ID.N.17, SEQ.ID.N.18, SEQ.ID.N.19, SEQ.ID.N.20,
SEQ.ID.N.21, SEQ.ID.N.22 y/o cualquier cebador equivalente cuya
secuencia nucleotídica solape con las secuencias SEQ.ID.N.9,
SEQ.ID.N.10, SEQ.ID.N.1 1, SEQ.ID.N.12, SEQ.ID.N.13, SEQ.ID.N.14,
SEQ.ID.N.15, SEQ.ID.N.16, SEQ.ID.N.17, SEQ.ID.N.18, SEQ.ID.N.19,
SEQ.ID.N.20, SEQ.ID.N.21, SEQ.ID.N.22.
Según otro aspecto importante en la presente
invención en la etapa b) los sitios de restricción utilizados son
EcoRI y XbaI.
Según otro aspecto importante en la presente
invención se han empleado unas cepas GS-115 y
X-33.
Según otro aspecto importante en la presente
invención en la etapa b) la inducción de PEDF en Pichia
pastoris se realiza a un intervalo de temperatura entre
25-30ºC.
Según otro aspecto importante en la presente
invención en la etapa e) se ha empleado un 2% de PMSF.
Según un segundo aspecto importante la presente
invención se refiere al producto obtenido directamente a partir del
procedimiento descrito en la presente invención en particular al
factor PEDF aislado o purificado que comprende una secuencia de
aminoácidos la cual tiene al menos un 80% de identidad con la
secuencia SEQ.ID.N.1. sobre toda su longitud, al factor PEDF
aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos la
cual tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia
SEQ.ID.N.2. sobre toda su longitud, al factor PEDF aislado o
purificado que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene
al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.3. sobre
toda su longitud, al factor PEDF aislado o purificado que comprende
una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 80% de
identidad con la secuencia SEQ.ID.N.4. sobre toda su longitud, al
factor PEDF aislado o purificado que comprende una secuencia de
aminoácidos la cual tiene al menos un 80% de identidad con la
secuencia SEQ.ID.N.5. sobre toda su longitud, al factor PEDF
aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos la
cual tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.6.
sobre toda su longitud,. Y de forma más específica al factor PEDF
aislado o purificado que consiste en una secuencia aminoacídica
escogida del grupo formado por las secuencias SEQ.ID.N.1 a
SEQ.ID.N.6, por sus secuencias complementarias y/o por sus
secuencias equivalentes funcionales.
Según tercer aspecto de la presente invención se
refiere al uso del factor PEDF en la preparación de un medicamento,
y al uso del factor PEDF de secuencias SEQ.ID.N.2, SEQ.ID.N.5 Y
SEQ.ID.N.6 en la preparación de una composición que tiene efecto
antagonista de PEDF de SEQ.ID.N.1, SEQ.ID.N.3 Y SEQ.ID.N.4 y al uso
de una composición que inhibe la diferenciación celular, al uso del
factor PEDF en la preparación de una composición química que inhibe
el efecto de las secuencias SEQ.ID.N.1, SEQ.ID.N.2 Y SEQ.ID.N.3.,
al uso del factor PEDF en la preparación de una composición que
inhibe la diferenciación celular y al uso del factor PEDF en la
preparación de una composición química que estimula la
diferenciación celular que contiene las secuencias SEQ.ID.N.1,
SEQ.ID.N.3 Y SEQ.ID.N.4.
La molécula completa de PEDF (SEQ.ID.N.1)
obtenida según el procedimiento anteriormente descrito incrementa
la diferenciación neuronal en células madre.
Se obtiene de forma adicional una molécula
truncada de PEDF (SEQ.ID.N.2), que, obtenida según el procedimiento
anteriormente descrito, es capaz de inhibir los efectos producidos
por la molécula completa de PEDF. Por lo tanto el presente
procedimiento proporciona dos productos relacionados, la molécula
truncada de PEDF y el PEDF completo, guardando por tanto la
presente invención un mismo concepto inventivo.
Los siguientes ejemplos específicos que se
proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente
invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines
ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la
invención que aquí se reivindica.
Se ha clonado el cDNA (región codificante) de
PEDF (obtenido mediante RT-PCR) en el vector de
expresión pPICZ\alphaA utilizando los sitios de restricción EcoRI
y XbaI. La ausencia de mutaciones ha sido confirmada mediante
secuenciación automática de ADN. También se ha clonado y producido
una forma truncada, correspondiente al extremo carboxilo terminal
(aminoácidos 195-400). Estas moléculas han sido
diseñadas de forma que incorporan en su extremo
C-terminal los epítopos c-myc e
His6x, para facilitar su detección y purificación.
Las construcciones generadas fueron utilizadas
para transformar diferentes cepas de P. pastoris, empleando
para ello el kit "Easy select Pichia expresión kit"
(Invitrogen).
Se analizó la producción en dos cepas distintas,
GS-115 y X-33, después de crecer un
inóculo inicial de cada clon en BMGY durante 48 horas, y de inducir
posteriormente la expresión durante 48 h en medio BMMY, utilizando
metanol como agente inductor. Concluida la inducción, las células
fueron separadas del medio de cultivo mediante centrifugación. La
confirmación de la expresión de estas proteínas fue analizada
mediante western blot de muestras del medio de cultivo, utilizando
un anticuerpo anti-myc. En total se analizaron 5
clones de la cepa GS-115 y 4 de la cepa
X-33. Se observaron diferencias importantes en el
nivel de producción de la proteína recombinante entre los
diferentes clones, como se muestra en la figura 1. Se seleccionó
para la producción el clon 2 de la cepa X-33 por ser
el que ofreció un mayor nivel de producción. En la figura 1 se
puede observar la detección mediante western blot de PEDF en el
medio de cultivo de distintos clones recombinantes de Pichia
pastoris.
En la figura 2 se muestra la expresión en Pichia
pastoris de los clones seleccionados para la expresión de la forma
completa y truncada PEDF, y detección mediante western blot.
Las proteínas recombinantes obtenidas por el
procedimiento anterior, han sido purificadas mediante cromatografía
de afinidad. La figura 3 muestra el análisis electroforético de las
distintas fracciones obtenidas en la cromatografía de la molécula
de PEDF completa. La proteína recombinante, tanto la forma completa
como la truncada, una vez purificadas, fueron cuantificadas
mediante el método Bradford, obteniéndose una concentración de
aproximadamente 30 \mugr de PEDF/ml de medio de cultivo, y 20
\mugr de C-terminal/ml de medio de cultivo.
Mediante electroforesis se estimó que la pureza de la preparación
obtenida era cercana al 100%. La figura 3 muestra exactamente el
análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (10%) en
presencia de SDS, de las fracciones obtenidas en la purificación de
PEDF completa recombinante mediante cromatografía de afinidad. El
gel fue teñido con Comassie Blue. 1: fracción no retenida; 2 y 3:
fracciones de lavado de la columna; 4 y 5: fracciones de elución.
Observe la ausencia de bandas distintas a PEDF, lo que indica la
elevada pureza de la proteína PEDF obtenida en la fracción 5.
Las proteínas purificadas según el método
descrito (tanto la forma completa como la versión truncada) son
totalmente solubles. Se evita por tanto el empleo de urea, o de
otros agentes solubilizantes, que podrían interferir en la actividad
de la proteína, o impedir su uso directo en ensayos, y que
obligaría a añadir pasos adicionales para la eliminación de estos
agentes.
Posteriormente se procedió al cambio del tampón
de elución a PBS, empleando el sistema de ultrafiltración/diálisis,
en el que la proteína purificada es totalmente soluble. Una vez en
este tampón, se realizaron los ensayos para analizar la actividad de
la proteína obtenida.
Se han llevado a cabo estudios para comprobar
que la proteína PEDF obtenida según el procedimiento anteriormente
descrito presenta actividad potenciadora de la diferenciación
neuronal, además de su papel en supervivencia como factor
neurotrófico, previamente descrito en la literatura, así como la
actividad de la molécula truncada (C-terminal) de
PEDF, como molécula inhibidora de la diferenciación neuronal.
Para ello se cultivaron células madre neurales embrionarias
derivadas de la pared del ventrículo lateral procedentes de
embriones de ratón de estadio E14.5, en presencia y ausencia del
factor PEDF, o de C-terminal, obtenidos según el
procedimiento descrito anteriormente. El protocolo de diferenciación
de estas células se llevó a cabo basándose en los protocolos de
diferenciación previamente descritos para este tipo celular que
constan de un periodo de tiempo en cultivo con medio
DMEM-F12 enriquecido con N2 suplemento, al que se
añade 10 ng/ml de bFGF durante los dos primeros días del cultivo, y
2% de FBS durante los cinco días siguientes del cultivo.
Transcurridos los dos primeros días, el medio en el que se cultivan
las células se cambio en todos los casos a DMEM-F12
conteniendo N2 supplement y con 2% de FBS durante los cinco días
siguientes. Los resultados obtenidos, recogidos en la figura 4
(recuento de células tuj-1 positivas, es decir,
neuronas, presentes en el cultivo) muestran que la proteína PEDF
obtenida con el protocolo aquí expuesto es capaz de incrementar el
número de neuronas presentes en el cultivo, indicando que la
molécula obtenida es funcional para esta actividad (***:
p<0.001). Por otra parte, estos resultados muestran que la
molécula C-terminal de PEDF es capaz de inhibir el
número de neuronas presentes en el cultivo, indicando que esta
molécula presenta esta actividad (*: p<0.05). En la figura 4 se
muestra el recuento de células neuronales o número de neuronas
diferenciadas, en la que A viene definido por el ensayo control, B
está definido por en ensayo con PEDF y C está definido por el
ensayo con la versión truncada C-terminal, en el que
se precia cómo el ensayo B aumenta el porcentaje de neuronas
diferenciadas y cómo el efecto del ensayo en el se adiciona versión
truncada C-terminal (C) disminuye el número de
neuronas diferenciadas y por tanto presenta un efecto antagónico o
inhibitorio de los efectos producidos por PEDF. También en la
figura 4, D representa la diferenciación neuronal en la muestra
control y en E se observa claramente cómo aumenta la diferenciación
neuronal, cuando se adiciona PEDF.
Mediante este sistema de producción se obtiene
de forma eficiente y rápida tanto la forma completa de PEDF
recombinante, como de su región C-terminal
(aminoácidos 191-400) en la levadura Pichia
pastoris, y gracias a la metodología posteriormente empleada
para la purificación de las proteínas recombinantes obtenidas
(cromatografía de afinidad) se obtienen aproximadamente 30 \mugr
de proteína PEDF completa por ml de medio de cultivo, y 20 \mugr
de proteína C-terminal, constituyendo una solución
práctica a la problemática actual relativa a la obtención de poca
cantidad de proteína soluble en un sistema eucariota de
producción.
<110> Universidad de
Castilla-La Mancha
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<120> PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN Y
PURIFICACIÓN DEL FACTOR DERIVADO DEL EPITELIO PIGMENTADO DE LA
RETINA (PEDF) EN UN SISTEMA DE LEVADURA
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> P340/2006
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 2006-0101
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2006-02-17
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<160> 22
\vskip1.000000\baselineskip
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<170> PatentIn version 3.3
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<210> 1
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<211> 422
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> PEDF
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 227
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> PEDF C-TERMINAL
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 422
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
PEDF-HIPERFOSFORILADO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 422
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
PEDF-HIPOFOSFORILADO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 227
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
PEDF-C-TER-HIPERFOSFORILADO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 227
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
PEDF-C-TER-HIPOFOSFORILADO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CEBADOR-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CEBADOR-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CEBADOR-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CEBADOR-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser24ala UP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser24ala DW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser24glu UP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser24glu DW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser114ala UP
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser114ala DW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser114glu UP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser114glu DW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser227ala UP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser227ala DW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser227glu UP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ser227glu DW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
Claims (20)
1. Procedimiento para obtener factor PEDF
aislado o purificado y/o un equivalente funcional del factor PEDF
que contenga al menos una sustitución y/o una adición y/o una
inserción y/o una deleción en la secuencia identificada como SEQ ID
NO: 1 y/o contenga al menos una sustitución de aminoácidos
modificados químicamente y/o versiones truncadas de PEDF en un
sistema de expresión de una levadura que comprende las siguientes
etapas:
- a)
- Obtener el cADN de PEDF mediante RT-PCR partiendo de ARN total obtenido al menos a partir de células del epitelio pigmentado de retina;
- b)
- Obtener mediante PCR versiones mutantes y/o truncadas, empleando como ADN molde la forma completa de PEDF;
- c)
- Clonar las construcciones de la etapa a) y de la etapa b), en un vector de expresión de levaduras;
- d)
- Transformar y seleccionar los clones de la levadura con las diferentes construcciones clonadas generadas en la etapa c);
- e)
- Inocular, con los clones obtenidos en la etapa d), el medio de crecimiento de levadura;
- f)
- Inducir el factor PEDF completo y/o truncado en la levadura en medio de cultivo de levaduras con metanol como inductor;
- g)
- Eliminar las células del cultivo mediante centrifugación;
- h)
- Cambiar el medio de cultivo en el que están presentes el factor PEDF completo y/o truncado, a un tampón de unión apropiado para la cromatografía de afinidad;
- i)
- Purificar el factor PEDF completo y/o truncado, mediante cromatografía de afinidad;
- j)
- Cambiar el tampón del factor PEDF completo y/o truncado purificado a un tampón que permita su posterior empleo en estudios de actividad.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según reivindicación 1 donde el
sistema de expresión es Pichia pastoris.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2 caracterizado porque en la etapa j)
el tampón que permite el posterior empleo en estudio de actividad es
tampón PBS.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque en la etapa a)
los cebadores empleados se seleccionan de la secuencias SEQ.ID.N.7
y/o SEQ.ID.N.8 y/o cualquier cebador equivalente cuya secuencia
nucleotídica solape con las secuencias SEQ.ID.N.7 y/o
SEQ.ID.N.8.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque en la etapa b)
los cebadores empleados se seleccionan del grupo formado por la
secuencias SEQ.ID.N.9, SEQ.ID.N.10, SEQ.ID.N.11, SEQ.ID.N.12,
SEQ.ID.N.13, SEQ.ID.N.14, SEQ.ID.N.15, SEQ.ID.N.16, SEQ.ID.N.17,
SEQ.ID.N.18, SEQ.ID.N.19, SEQ.ID.N.20, SEQ.ID.N.21, SEQ.ID.N.22 y/o
cualquier cebador equivalente cuya secuencia nucleotídica solape
con las secuencias SEQ.ID.N.9, SEQ.ID.N.10, SEQ.ID.N.11,
SEQ.ID.N.12, SEQ.ID.N.13, SEQ.ID.N.14, SEQ.ID.N.15, SEQ.ID.N.16,
SEQ.ID.N.17, SEQ.ID.N.18, SEQ.ID.N.19, SEQ.ID.N.20, SEQ.ID.N.21,
SEQ.ID.N.22.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque en la etapa b)
tos sitios de restricción utilizados son EcoRI y XbaI.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque se han empleado
unas cepas GS-115 y X-33.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 7 caracterizado porque en la etapa f)
la inducción de PEDF en Pichia pastoris se realiza a un
intervalo de temperatura entre 25-30ºC.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 8 caracterizado porque en la etapa e)
se ha empleado un 2% de fluoruro de sulfonil fenil metano
(PMSF).
10. Factor PEDF aislado o purificado obtenido
por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado
porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al
menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.1. sobre toda su
longitud.
\newpage
11. Factor PEDF aislado o purificado obtenido
por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado
porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al
menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.2. sobre toda su
longitud.
12. Factor PEDF aislado o purificado obtenido
por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado
porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al
menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.3. sobre toda su
longitud.
13. Factor PEDF aislado o purificado obtenido
por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado
porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al
menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.4. sobre toda su
longitud.
14. Factor PEDF aislado o purificado obtenido
por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado
porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al
menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.5. sobre toda su
longitud.
15. Factor PEDF aislado o purificado obtenido
por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado
porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al
menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.6. sobre toda su
longitud.
16. Factor PEDF aislado o purificado obtenido
por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado
porque consiste en una secuencia aminoacídica escogida del grupo
formado por las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.6, y/o por sus
secuencias equivalentes funcionales.
17. Uso del factor PEDF según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 16 en la preparación de un medicamento.
18. Uso del factor PEDF según reivindicación 11,
14 y 15 en la preparación de una composición química que inhibe el
efecto de las secuencias SEQ.ID.N.1, SEQ.ID.N.2 y SEQ.ID.N.3.
19. Uso del factor PEDF según reivindicación 18
en la preparación de una composición que inhibe la diferenciación
celular.
20. Uso del factor PEDF según reivindicación 10,
12 y 13 en la preparación de una composición química que estimula
la diferenciación celular.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200600385A ES2330173B1 (es) | 2006-02-17 | 2006-02-17 | Procedimiento de produccion y purificacion del factor derivado del epitelio pigmentado de la retina en un sistema de levadura. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200600385A ES2330173B1 (es) | 2006-02-17 | 2006-02-17 | Procedimiento de produccion y purificacion del factor derivado del epitelio pigmentado de la retina en un sistema de levadura. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2330173A1 true ES2330173A1 (es) | 2009-12-04 |
| ES2330173B1 ES2330173B1 (es) | 2010-10-13 |
Family
ID=41328835
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200600385A Active ES2330173B1 (es) | 2006-02-17 | 2006-02-17 | Procedimiento de produccion y purificacion del factor derivado del epitelio pigmentado de la retina en un sistema de levadura. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2330173B1 (es) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006054278A2 (en) * | 2004-11-16 | 2006-05-26 | Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science | Variants of pigment epithelium derived factor and uses thereof |
-
2006
- 2006-02-17 ES ES200600385A patent/ES2330173B1/es active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006054278A2 (en) * | 2004-11-16 | 2006-05-26 | Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science | Variants of pigment epithelium derived factor and uses thereof |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| INVITROGEN, Life Technologies. "{}Easy Select TM Pichia Expression Kit"{}. A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZ? in Pichia pastoris. Catalog no. K1740-01; 01.11.2005; [en línea]; [recuperado el 20.10.2008]. Recuperado de Internet <URL: http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/ adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&entryPoint=adirect& productID=K174001&CID=Search-K1740-01&messageType=catProduc Detail&showAddButton=true >. Todo el documento, especialment páginas 14-19. * |
| INVITROGEN, Life Technologies. "Easy Select TM Pichia Expression Kit". A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZ? in Pichia pastoris. Catalog no. K1740-01; 01.11.2005; [en línea]; [recuperado el 20.10.2008]. Recuperado de Internet <URL: http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/ adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&entryPoint=adirect& productID=K174001&CID=Search-K1740-01&messageType=catProduct Detail&showAddButton=true >. Todo el documento, especialmente páginas 14-19. * |
| STEELE, F.R. "{}Pigment epithelium-derived factor: neurotrophic activity and identification as a member of the serine protease inhibitor gene family"{}. PROC. NATL. ACAD. SCI. USA. Febrero 1992. Vol. 90, páginas 1526-1530; todo el documento. * |
| STEELE, F.R. "Pigment epithelium-derived factor: neurotrophic activity and identification as a member of the serine protease inhibitor gene family". PROC. NATL. ACAD. SCI. USA. Febrero 1992. Vol. 90, páginas 1526-1530; todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2330173B1 (es) | 2010-10-13 |
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| Date | Code | Title | Description |
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