ES2328650T3 - Metodo de seleccion directa de celulas t especificas de antigeno. - Google Patents
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Abstract
Un método de marcaje de células T específicas de antígeno con un producto secretado y liberado por las células, en el que el producto se secreta en respuesta a estimulación antigénica, comprendiendo dicho método: (a) exponer una población mixta de células que comprenden células T a al menos un antígeno en condiciones eficaces para generar una estimulación específica de antígeno de al menos una célula T y permitir la expresión de al menos un producto por la célula T estimulada, en el que el producto se secreta en respuesta a la estimulación antigénica; (b) modificar la superficie de las células para que contenga un resto de captura específico para el producto de modo que el resto de captura se acople a la superficie celular, (c) cultivar la población en condiciones en las que el producto se secreta, se libera y se une específicamente al resto de captura, marcando de este modo las células secretoras de producto; y en el que las etapas (a) y (b) pueden realizarse en cualquier orden.
Description
Método de selección directa de células T
específicas de antígeno.
La invención es en el campo del análisis de
poblaciones celulares y separación de células y las composiciones
obtenidas de este modo. Más particularmente, la invención se
refiere al análisis y la separación de células T específicas de
antígeno basados en el marcaje primario de células con sus
productos secretados mediante la captura de estos productos por un
compañero de unión específica para el producto anclado o unido a la
superficie celular.
Se han realizado numerosos intentos para
analizar poblaciones de células y para separar células basándose en
los productos que producen. Dichas estrategias para el análisis y
la separación de células son especialmente útiles en la evaluación
de las células que son capaces de secretar un producto deseado (el
"producto"), o que son relativamente buenas secretoras del
producto. Estos métodos incluyen clonación en placas de
microtitulación y análisis del sobrenadante del cultivo para
producto, clonación en agar y análisis por métodos para la
identificación del producto de las células localizadas; los métodos
de identificación incluyen, por ejemplo, ensayos de placas y
transferencia de western. La mayoría de los métodos para el análisis
y la selección de células basados en la secreción de producto
implican aislar físicamente la célula, seguido de incubación en
condiciones que permitan la secreción de producto y la exploración
de las localizaciones celulares para detectar la célula o los
clones celulares que producen el producto. Cuando las células están
en suspensión, después de que las células hayan secretado el
producto, el producto difunde desde la célula sin dejar un marcador
que permita la identificación de la célula desde la que se secretó.
Por lo tanto, las células secretoras no pueden separarse de células
no secretoras con estos tipos de sistemas.
En otros casos, las células tanto secretoras
como no secretoras pueden asociar el producto con la membrana
celular. Un ejemplo de este tipo de sistema son líneas celulares
procedentes de células B que producen anticuerpos monoclonales. Se
ha descrito que estos tipos de líneas celulares se separaron por
separación de células activadas por fluorescencia (FACS) y otros
métodos que dependen de la presencia de marcadores de superficie
celular de anticuerpos. Sin embargo, los procedimientos que analizan
y separan células por marcadores que se asocian de forma natural
con la superficie celular no pueden identificar con precisión y/o
usarse en la separación de células secretoras de células no
secretoras. Además, los sistemas de este tipo no son útiles en la
identificación de diferencias cuantitativas en células secretoras
(es decir, secretoras de bajo nivel de secretoras de alto
nivel).
Un método que se ha usado para superar los
problemas asociados con la difusión de producto desde las células
ha sido poner la célula en un medio que inhiba la velocidad de
difusión desde la célula. Un método típico ha sido inmovilizar la
célula en un medio similar a gel (agar) y después explorar las
placas de agar para la producción de producto usando un sistema que
depende de transferencia, por ejemplo, transferencias de Western.
Estos sistemas son engorrosos y caros si se van a analizar grandes
cantidades de células para determinar las propiedades de secreción,
no secreción o cantidad de secreción.
Köhler et al han descrito un sistema de
selección negativa en el que se enriquecieron mutantes de una línea
de hibridoma que secreta IgM con especificidad
anti-trinitrofenilo (anti-TNP) por
acoplamiento del hapteno (es decir, TNP) a la superficie celular e
incubación de las células en presencia de complemento. De este
modo, se lisaron las células que secretaban IgG de tipo silvestre,
mientras que las células que secretaban IgM con actividad lítica
reducida o que no se unían a TNP sobrevivieron preferentemente.
Kohler y Schulman (1980) Eur J. Immunol. 10:
467-476.
Más recientemente se ha descrito un sistema para
marcar y separar células basándose en el producto secretado.
Documento PCT/US93/10126 (WO 94/09117) (véase también Manz et
al Proc. Natl. Acad. Sci Vol. 92, 1995,
1921-1925). En este sistema, un compañero de unión
específica para un producto secretado se acopla a la superficie de
células. El producto se secreta, se libera y une a la célula por el
compañero de unión específica. Después, las células se separan
basándose en el grado en el que se marcan con el producto
unido.
Otros sistemas permiten que las células secreten
sus productos en el contexto de microgotas de gel de agarosa que
contienen reactivos que se unen a los productos de secreción y
encapsulación de las células. Se han descrito dichos métodos en
publicaciones por Nir et al. (1990) Applied and Environ.
Microbiol 56: 2870-2875; y Nir et al.
(1991) Applied and Environ. Microbiol 56:
3861-3866. Estos métodos son insatisfactorios por
una diversidad de razones. En el proceso de microencapsulación, se
produce la inmovilización estadística de varias células en las
cápsulas, dando como resultado un elevado número de cápsulas vacías
cuando se produce la encapsulación a bajas concentraciones de
células o a múltiples células por cápsula cuando la encapsulación se
produce a altas concentraciones de células. El producto secretado
se inmoviliza en la gota de agarosa por el anticuerpo de captura y
se detecta mediante un segundo anticuerpo fluorocromado. Este
proceso, aunque permite la detección y el aislamiento de células
basándose en el producto secretado, es complicado, requiere un
equipamiento especial y no es adecuado para todos los tipos de
métodos de separación.
Para analizar y separar células individuales o
grupos de células individuales mediante esta técnica, deben
manipularse grandes volúmenes para trabajar con números
relativamente pequeños de células debido a los números de cápsulas
vacías y debido al tamaño de las microcápsulas
(50-100 \mum). El gran volumen de gotas da como
resultado problemas de fondo usando análisis y separación por
citometría de flujo. Además, las cápsulas no permiten la separación
usando perlas magnéticas o selección para separación de
células.
Se han usado diversos métodos para acoplar
marcadores a superficies celulares en los que el marcador, tal como
un fluorocromo, está destinado a una detección directa. Por
ejemplo, se ha descrito que enlazadores hidrófobos insertados en la
membrana celular acoplan marcadores fluorescentes con células en el
documento PCT WO 90/02334, publicado el 8 de marzo de 1990. Los
anticuerpos dirigidos contra HLA también se han usado para unir
marcadores a superficies celulares. Dicha unión da como resultado
una menor dimensión que las gotas encapsuladas que se han descrito
anteriormente y dichas células pueden usarse convenientemente en
procedimientos de separación convencionales que incluyen
separaciones por citometría de flujo y magnéticas.
Se han usado ensayos ELISpot y métodos para
tinción intracelular de citoquinas para la enumeración y
caracterización de células T CD4^{+} y CD8^{+} específicas de
antígeno. Lalvani et al. (1997) J. Exp. Med. 186:
859-865; y Waldrop et al. (1997) J. Clin
Invest. 99: 1739-1750. Estos métodos pueden ser
bastante útiles para el mapeo de epitopos de células T o para el
control de la inmunogenicidad en ensayos de vacunas, pero no
permiten el aislamiento de células T específicas de antígeno vivas,
por ejemplo, para ensayos clínicos de inmunoterapia adoptiva
específica de cáncer o infecciones. Kern et al. (1998)
Nat. Med. 4: 975-978; El Ghazali et
al. (1993) Curr. Opin Immunol. 23:
2740-2745; y Yee et al (1997) Curr. Opin.
Immund. 9: 702-708.
Se han aprovechado recientemente complejos
multivalentes solubles de moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) cargadas con péptido para detectar y
también aislar células T específicas de antígeno. Altman et
al. (1996) Science 274: 94-96; Dunbar
et al. (1998) Curr. Biol. 8: 413-416;
Ogg et al. (1998) 279: 2103-2106; Luxembourg
et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:
281-285; Murali-Krishna et
al. (1998) Immunity 8: 177-187;
Gallimore et al. (1998) J. Exp. Med. 187:
1383-1393; y Flynn et al. (1998)
Immunity 8: 683-691. Estos reactivos son
altamente específicos, pero la estrategia se limita a combinaciones
bien definidas de péptidos antigénicos y alelos de HLA de
restricción.
El sistema inmune comprende dos tipos de células
específicas de antígeno: células B y células T. Las células T
pueden caracterizarse fenotípicamente por el modo en el que
reconocen al antígeno, por sus marcadores de superficie celular y
por sus productos secretados. A diferencia de las células B, que
reconocen antígeno soluble, las células T reconocen antígeno
solamente cuando el antígeno se presenta a las mismas en forma de
pequeños fragmentos unidos a moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) en la superficie de otra célula. Cualquier
célula que exprese moléculas de MHC asociadas con fragmentos de
antígeno en su superficie puede considerarse una célula
presentadora de antígenos (APC). Sin embargo, en la mayoría de las
situaciones, más que la mera presentación de fragmento de antígeno
unido a MHC sobre una superficie celular, es necesario activar un
linfocito T. Además de la señal suministrada por el receptor de
células T (TCR) acoplado por la molécula de MHC más antígeno, la
célula T también debe recibir señales coestimuladoras de la APC.
Típicamente, las APC son células dendríticas, macrófagos o
linfocitos B activados.
Las células T expresan moléculas de membrana
distintivas. Entre estas se incluyen el receptor de antígeno de
células T (TCR), que aparece en la superficie celular junto con
CD3; y moléculas accesorias tales como CD5, CD28 y CD45R. Las
subpoblaciones de células T pueden diferenciarse por la presencia
de moléculas de membrana adicionales. Por lo tanto, por ejemplo,
las células T que expresan CD4 reconocen antígeno asociado con
moléculas de MHC clase II y funcionan generalmente como células
auxiliares, mientras que las células T que expresan CD8 reconocen
antígeno asociado con moléculas de MHC clase I y funcionan
generalmente como células citotóxicas. La subpoblación CD4^{+} de
células T puede categorizarse adicionalmente en al menos dos
subconjuntos basándose en los tipos de citoquinas secretadas por la
célula. Por lo tanto, aunque ambos subconjuntos secretan
IL-3 y GM-CSF, las células TH1
secretan generalmente IL-2,
IFN-\gamma y TNF-\alpha,
mientras que las células TH2 secretan generalmente
IL-4, IL-5, IL-10 e
IL-13.
Los cambios minoritarios en el péptido unido a
la molécula de MHC no pueden afectar a la afinidad de la
interacción de péptido-molécula de MHC, aunque
pueden generar señales parciales que conduzcan a una respuesta
intermedia caracterizada por proliferación y secreción de solamente
una fracción de las citoquinas producidas durante un respuesta
completa de células T. Algunos péptidos modificados pueden incluso
bloquear la proliferación y secreción de citoquinas por completo e
inducir un estado de anergia o insensibilidad de células T. Por
tanto, existen tres tipos diferentes de péptidos: agonista (los que
estimulan una respuesta completa), agonista parcial (los que
estimulan una respuesta parcial) y antagonista (los que inducen
insensibilidad). Cuando una sola APC presenta una mezcla de un
agonista y un antagonista sobre su superficie, el efecto negativo
del último puede superar el efecto positivo del primero, incluso si
el antagonista está presente en cantidades mucho menores que el
agonista. Algunos virus parecen usar mutaciones en sus proteínas
para producir péptidos antagonistas capaces de suprimir la
actividad de los clones de células T que reconocen péptidos
agonistas obtenidos del virus de tipo silvestre original.
La secreción por una célula T de una citoquina
particular generalmente se asocia con una función particular. Por
ejemplo, se piensa que las diferencias en las citoquinas secretadas
por los subconjuntos TH1 y TH2 de células T CD4^{+} reflejan
diferentes funciones biológicas de estos dos subconjuntos. El
subconjunto TH1 es responsable de funciones clásicas mediadas por
células tales como hipersensibilidad de tipo retardado y activación
de células T citotóxicas, mientras que el subconjunto TH2 funciona
más eficazmente como un auxiliar para la activación de células B.
El subconjunto TH1 puede ser particularmente adecuado para
responder a infecciones víricas y patógenos intracelulares ya que
secreta IL-2 e IFN-\gamma, que
activan células T citotóxicas. El subconjunto TH2 puede ser más
adecuado para responder a bacterias extracelulares y parásitos
helmínticos y puede mediar reacciones alérgicas, ya que se sabe que
IL-4 e IL-5 inducen la producción de
IgE y la activación de eosinófilos, respectivamente. También
existen pruebas considerables que sugieren que la activación
preferente de células TH1 desempeña un papel central en la
patogenia de varias enfermedades autoinmunes. Se piensa que la
secreción de IL-10 por células TH2 suprime, de un
modo indirecto, la producción de citoquinas por células TH1 y, por
consiguiente, tiene un efecto inmunosupresor general. Un cambio en
el equilibrio TH1/TH2 puede dar como resultado una respuesta
alérgica, por ejemplo, o una respuesta aumentada de células T
citotóxicas.
Los cambios iniciados por el TCR en los primeros
pocos minutos a horas de activación conducen a la transición de la
célula de la fase G0 a G1 del ciclo celular. Varias horas después
de la estimulación de la célula T, comienza a expresar
IL-2 y receptor de IL-2 de alta
afinidad. La expresión del gen IL2 se efectúa por un
conjunto de factores de transcripción que se activan por las rutas
de señalización convergentes desencadenadas por el ligamiento de
TCR, CD28 y posiblemente otras moléculas de superficie de células
T.
Los factores de transcripción también inducen la
expresión del gen de CD25, que codifica la subunidad a del receptor
de IL-2 de alta afinidad. La interacción de
IL-2 con el receptor de alta afinidad inicia rutas
de señalización que provocan que la célula T pase de la fase G1 a
la S del ciclo celular y avance hasta la división celular. La rutas
de señalización controlan la expresión y la actividad de varias
proteínas clave necesarias para la división celular. Algunas de
estas también se activan directamente por señales dependientes de
TCR y CD28, mientras que otras se activan solamente por señales
proporcionadas a través del receptor de IL-2.
La célula T estimulada experimenta una secuencia
de cambios fenotípicos que comienzan con su progresión del estado
de reposo a la mitosis y, posteriormente, a la diferenciación en
células efectoras y de memoria. Entre los cambios más tempranos
(inmediatos), observables en los 15-30 minutos
siguientes a la estimulación, están la expresión de genes que
codifican factores de transcripción tales como
c-Fos, NF-AT, c-Myc
y NF-\kappaB, proteínas quinasas tales como
Jak-3 y fosfatasas de proteínas tales como
Pac-1. Los cambios tempranos posteriores, que se
producen en el intervalo de varias horas desde la estimulación,
marcan el comienzo de la expresión de genes que codifican antígenos
de activación. Estos incluyen varias citoquinas
(IL-2 y otras), subunidad \alpha del receptor de
IL-2 (CD25), receptor de insulina, receptor de
transferrina y varias moléculas de superficie adicionales tales como
CD26, CD30, CD54, CD69 y
CD70.
CD70.
Los antígenos de activación alcanzan un nivel
máximo de expresión justo antes de la primera división, 24 horas
después de la estimulación. Durante este periodo aumenta el nivel
de expresión de varias moléculas adicionales ya expresadas en
células T en reposo. En un momento posterior, algunos días después
de que haya comenzado la activación, se expresan antígenos de
activación tardía en las células T. Estos incluyen moléculas de MHC
clase II y varios miembros de la familia de integrinas \beta1. La
expresión de antígenos de activación tardía marca la diferenciación
de la célula activada en células T efectoras o de memoria.
Las células T desempeñan papeles importantes en
la autoinmunidad, inflamación, citotoxicidad, rechazo de injertos,
alergia, hipersensibilidad de tipo retardado, hipersensibilidad
mediada por IgE y modulación de la respuesta humoral. Las
patologías pueden ser el resultado de la activación de células T
autorreactivas, de la activación de células T que provoquen
reacciones alérgicas o de la activación de células T autorreactivas
después de determinadas infecciones bacterianas y parasitarias, que
pueden producir antígenos que mimeticen la proteína humana,
convirtiendo estas proteínas en "autoantígenos". Estas
enfermedades incluyen, por ejemplo, las enfermedades autoinmunes,
trastornos autoinmunes que se producen como un acontecimiento
secundario a infección con determinadas bacterias o parásitos,
alergias mediadas por células T y determinadas enfermedades cutáneas
tales como psoriasis y vasculitis. Además, el rechazo no deseado de
un antígeno extraño puede dar como resultado el rechazo de injerto
o incluso infertilidad y dicho rechazo puede deberse a la
activación de poblaciones de linfocitos T específicos. También
pueden surgir afecciones patológicas a partir de una respuesta
inadecuada de células T contra un tumor o una infección vírica. En
estos casos, sería deseable aumentar una respuesta de células T
específica de antígeno para reducir o eliminar el tumor o erradicar
una infección.
Las enfermedades autoinmunes tienen una
diversidad de causas. Por ejemplo, pueden provocarse reacciones
autoinmunes por lesión o inmunización con colágeno, por
superantígenos, por factores genéticos o errores en la regulación
inmune. Los superantígenos son activadores policlonales que pueden,
entre otras cosas, estimular clones previamente anergizados por
encuentro con un autoantígeno o clones que ignoraron los
autoantígenos potenciales debido a su baja expresión o
disponibilidad. Determinadas enfermedades autoinmunes están
causadas principalmente por autoanticuerpos, otras están mediadas
por células T. Las células T autorreactivas provocan lesión tisular
en varias enfermedades autoinmunes que incluyen artritis reumatoide
y esclerosis múltiple.
En el tratamiento de trastornos autoinmunes, se
han usado agentes inmunosupresores inespecíficos para ralentizar la
enfermedad; estas terapias causan con frecuencia una
inmunosupresión por destrucción o inhibición aleatoria de células
inmunocompetentes. Los intentos para tratar trastornos autoinmunes
por modulación de la actividad de células T autorreactivas han
incluido la inmunización con péptidos TCR, el tratamiento con
interferón-\beta (IFN-\beta) y
la vacunación con linfocitos T. Ebers (1994) Lancet 343:
275-278; Hohlfeld (1997) Brain 120:
865-916; y Hafler et al. (1992) Clin.
Immunol. Immunopathol. 62: 307-313.
El desarrollo de sensibilización alérgica,
sensibilidad por contacto e inflamación depende de la activación y
estimulación de células T que presentan funciones proalérgicas. Se
piensa que las células T específicas de alergeno desempeñan un
papel importante en la fisiopatología de alergias atópicas. La
eliminación o supresión de células T específicas de alergeno podría
ayudar a mejorar enfermedades alérgicas provocadas por dichas
células T.
En la fase inicial de una reacción alérgica, el
antígeno (alergeno) entra en el cuerpo, se capta por APC, se
presenta por las mismas en el contexto de moléculas de MHC clase II
y es reconocido por precursores de células T auxiliares. Estos se
estimulan para proliferar y diferenciarse principalmente hacia
células TH2, que ayudan a los linfocitos B a diferenciarse en
células plasmáticas productoras de anticuerpos. Como en cualquier
otra respuesta mediada por anticuerpos, las células B que reciben
ayuda específica de células TH son las que reconocen el alergeno a
través de sus receptores de superficie. Algunas de las citoquinas
producidas por las células TH2, especialmente IL-4 e
IL-13, estimulan las células B para efectuar un
cambio de isotipo de inmunoglobulina y producir anticuerpos IgE.
Los anticuerpos se unen a receptores Fc de alta afinidad sobre la
superficie de mastocitos en el tejido conectivo y la mucosa, así
como a los de la superficie de basófilos en la circulación y la
mucosa e inician las manifestaciones de reacción alérgica.
El rechazo de aloinjerto está causado
principalmente por una respuesta inmune mediada por células contra
aloantígenos (principalmente moléculas de MHC) expresadas en
células del injerto. El análisis de las subpoblaciones de
linfocitos T implicadas en el rechazo de aloinjertos ha implicado a
poblaciones tanto CD4+ como CD8+. Las células TH1 inician la
reacción inflamatoria de la hipersensibilidad de tipo retardado,
conduciendo al reclutamiento de monocitos y macrófagos hacia el
injerto. Las células asesinas naturales (NK), presumiblemente
avisadas por la ausencia en el injerto de moléculas de MHC
presentes en el receptor, también pueden atacar al injerto en las
fases tempranas de la respuesta. Los neutrófilos son principalmente
responsables de limpiar la herida o eliminar las células dañadas y
residuos celulares en la fase tardía de la reacción de
aloinjerto.
La mayoría de los tratamientos inmunosupresores
desarrollados tienen la desventaja de ser inespecíficos; es decir,
dan como resultado una inmunosupresión generalizada que sitúa al
receptor en un riesgo aumentado de infección. Los agentes
inmunosupresores empleados para evitar el rechazo de órganos
incluyen inhibidores mitóticos tales como azatioprina,
ciclofosfamida y metotrexato; corticosteroides; y fármacos tales
como ciclosporina, FK506 y rapamicina, que inhiben la transcripción
de los genes que codifican IL-2 y el receptor de
alta afinidad para IL-2.
En el tratamiento de cánceres, se ha empleado
inmunoterapia celular como una alternativa o junto con terapias
convencionales tales como quimioterapia y terapia de radiación. Por
ejemplo, las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) pueden
dirigirse contra antígenos específicamente o preferentemente
presentados por células tumorales. Después de la activación con
citoquinas de células T en presencia de antígeno tumoral
apropiadamente presentado, los linfocitos infiltrantes de tumores
(TIL) proliferan en cultivo y adquieren potentes propiedades
citolíticas antitumorales. Weidmann et al. (1994) Cancer
Immunol. Immunother. 39: 1-14.
La introducción en un paciente con cáncer de
poblaciones de linfocitos activados in vitro ha obtenido
cierto éxito. La inmunoterapia adoptiva, la infusión de células
inmunológicamente activas en un paciente con cáncer para lograr una
regresión tumoral ha sido una estrategia atractiva para la terapia
del cáncer durante varias décadas. Se han seguido dos estrategias
generales. En la primera, se recogen células de donantes que son
naturalmente reactivas contra el tumor del hospedador, basándose en
diferencias en la expresión de antígenos de histocompatibilidad, o
hechas reactivas usando una diversidad de técnicas de
"inmunización". Estas células de donante activadas se
transfunden después a un hospedador que lleva un tumor. En la
segunda estrategia general, se recogen linfocitos de un paciente
con cáncer, se activan ex vivo contra el tumor y después se
vuelven a infundir en el paciente. Triozzi (1993) Stem Cells
11: 204-211; y Sussman et al. (1994)
Annals Surg. Oncol. 1: 296.
Los métodos actuales de tratamiento del cáncer
son relativamente no selectivos. La cirugía elimina el tejido
enfermo, la radioterapia encoge tumores sólidos y la quimioterapia
destruye rápidamente células en división. El suministro sistémico
de agentes quimioterápicos, en particular, da como resultado
numerosos efectos secundarios, en algunos casos lo bastante graves
para impedir el uso de fármacos potencialmente eficaces.
Las enfermedades víricas también son candidatas
para inmunoterapia. Heslop et al. (1996) Nature Med.
2: 551-555. Las respuestas inmunológicas a
patógenos virales son a veces ineficaces para erradicar o reducir
los suficiente el virus. Además, la naturaleza altamente mutable de
ciertos virus, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana,
les permite eludir el sistema inmune.
Claramente, existe la necesidad de identificar,
analizar y enriquecer poblaciones de células T implicadas en las
patologías mencionadas anteriormente. Actualmente, existen varios
métodos para el análisis y el enriquecimiento de células T
específicas de antígenos y/o secretoras de citoquinas. El
enriquecimiento de células T específicas de antígeno puede lograrse
usando técnicas de cultivo selectivas para obtener líneas de células
T y clones de células T. Estas técnicas implican generalmente el
cultivo de células T in vitro durante un periodo de varias
semanas y el uso de métodos bastante incómodos para seleccionar
líneas o clones que presenten el fenotipo deseado, tal como
secreción de citoquinas. Otros intentos para detectar y enriquecer
para células T específicas de antígeno han empleado complejos
MHC-antígeno y MHC-péptido
multiméricos definidos. Patente de Estados Unidos Nº 5.635.363. Sin
embargo, para que dicha técnica tenga éxito, son necesarios
complejos de MHC-antígeno del alotipo de MHC
correcto y la selección se limita a especificidad de antígeno, es
decir, no se proporciona selección para secreción de citoquinas
mediante esta técnica.
La tinción de citoquinas intracelulares después
de la activación antigénica, seguida de análisis por FACS, es el
método usado para obtener información respecto a la especificidad
antigénica y a la cinética de producción de citoquinas. Waldrop
et al. (1997) J. Clin. Invest. 99:
1739-1750. Este método es útil para análisis
solamente, puesto que las células no son viables después de este
procedimiento. De forma similar, los ensayos ELISPOT de citoquinas
son útiles para análisis solamente. Miyahira et al. (1995)
J. Immunol. Met. 181: 45-54; y Lalvani et
al. (1997) J. Exp. Med. 186: 859-865. En
estos ensayos, las citoquinas secretadas se inmovilizan en una
matriz que las rodea para análisis, pero no existe ningún mecanismo
para identificar y recuperar la célula que secretó la citoquina. La
tecnología de microgotas en gel no es adecuada para procesar
grandes cantidades de células, como las que serían necesarias para
tratamiento de las indicaciones mencionadas anteriormente.
Es evidente a partir de la discusión anterior
que existe la necesidad de técnicas fiables para analizar y separar
poblaciones de células T, basándose en el producto secretado, para
varios fines terapéuticos y diagnósticos. La presente invención
aborda esta necesidad proporcionando métodos para analizar, separar
y enriquecer poblaciones de células T específicas de antígeno.
La invención proporciona un método para un
análisis y separación celular convenientes de células T específicas
de antígeno basado en uno o más productos secretados por estas
células en respuesta a la estimulación antigénica. Las células T se
proporcionan con un resto de captura específico para el producto (o
"compañero de unión específica"), que después puede usarse
directamente como marcador. La unión del producto al resto de
captura da como resultado un "producto capturado". Como
alternativa, las células se unen al producto a través del resto de
captura y pueden marcarse adicionalmente mediante restos marcadores
que se unen específicamente al producto y que están, a su vez,
marcados directamente o indirectamente con materiales de marcaje
tradicionales tales como fluoróforos, isótopos radiactivos,
cromóforos o partículas magnéticas.
Las células marcadas pueden separarse después
usando técnicas de separación de células convencionales basadas en
estos marcadores. Dichas técnicas incluyen, pero sin limitación,
citometría de flujo, FACS, separación en gradiente magnético de
alto gradiente, centrifugación.
Por lo tanto, de acuerdo con la presente
invención, se proporciona un método de marcaje de células T
específicas de antígeno con un producto secretado y liberado por
las células, en el que el producto se secreta en respuesta a
estimulación antigénica, comprendiendo dicho método:
a) exponer una población mixta de células que
comprenden células T a al menos un antígeno en condiciones eficaces
para generar una estimulación específica de antígeno de al menos
una célula T y permitir la expresión de al menos un producto por la
célula T estimulada, donde el producto se secreta en respuesta a
estimulación antigénica;
b) modificar la superficie de las células para
que contengan un resto de captura específico para el producto de
modo que el resto de captura se acopla a la superficie celular;
c) cultivar la población en condiciones en las
que el producto se secreta, se libera y se une específicamente al
resto de captura, marcando de este modo las células secretoras de
producto; y
en el que las etapas (a) y (b) pueden realizarse
en cualquier orden.
De acuerdo con la invención, también se
proporciona una población de células marcadas y/o separadas de
acuerdo con los métodos de la invención.
Por lo tanto, la invención incluye un método
para estimular y separar células T específicas de antígeno de una
población de células de acuerdo con un producto secretado y
liberado por las células T específicas de antígeno en respuesta a
la estimulación. El método comprende estimular una mezcla de
células que contienen células T con antígeno y efectuar una
separación de células estimuladas con antígeno de acuerdo con el
grado en el que estén marcadas con el producto. Las estimulación
antigénica se consigue por exposición de las células a al menos un
antígeno en condiciones eficaces para generar estimulación
específica de antígeno de al menos una células T. El marcaje con el
producto se consigue por modificación de la superficie de las
células para que contengan al menos un resto de captura, cultivo de
las células en condiciones en las que el producto se secrete, se
libere y se una específicamente ("se capture" o "se
inmovilice") a dicho resto de captura; y marcaje del producto
capturado con un resto marcador, donde las células marcadas no se
lisan como parte del procedimiento de marcaje ni como parte del
procedimiento de separación.
También se describe una composición de sustancia
que contiene células T específicas de antígeno capaces de capturar
un producto secretado y liberado por estas células en respuesta a
la estimulación antigénica, donde la superficie de las células se
modifica para contener un resto de captura para el producto. El
producto capturado puede marcarse por separado mediante un resto
marcador.
También se describen células T específicas de
antígeno y progenie de las mismas separadas por el método descrito
anteriormente.
También se describe un método para marcar
células T específicas de antígeno con un producto secretado y
liberado por las células en respuesta a estimulación antigénica,
por modificación de la superficie de estas células para contener un
compañero de unión específica para el producto acoplado a la
superficie celular y cultivo de las células en condiciones en las
que el producto se secreta y se libera.
También se describe un método de análisis de una
población de células T específicas de antígeno para determinar la
proporción de células que secretan una cantidad de producto
respecto a otras células en la población, donde el producto se
secreta en respuesta a estimulación antigénica. El método comprende
marcar las células mediante el método descrito anteriormente,
marcar adicionalmente las células con un segundo marcador que no
marque el producto capturado y detectar la cantidad de marcador de
producto respecto al segundo marcador celular. Dichos métodos son
útiles, por ejemplo, en la evaluación del estado inmune de un
individuo.
Un aspecto adicional de la invención son
poblaciones de células T enriquecidas en células T específicas de
antígeno para el uso en métodos de tratamiento. Los métodos
comprenden administrar a un individuo que necesite tratamiento una
composición que comprende una población de célula T enriquecida en
células T específicas de antígenos. Dichas composiciones son útiles
para tratar una diversidad de afecciones patológicas, incluyendo
cáncer, alergias, inmunodeficiencias, trastornos autoinmunes y
enfermedades víricas.
También se describe un kit para el uso en la
separación de células T específicas de antígeno a partir de una
población mixta que comprende células efectoras. El kit puede
contener un medio fisiológicamente aceptable que puede ser de
grados variables de viscosidad hasta una consistencia de tipo gel,
un sistema de captura de producto que comprende restos de anclaje y
de captura; un sistema marcador para detectar el producto
capturado; e instrucciones para el uso de los reactivos, todos
envasados en recipientes apropiados. Opcionalmente, el kit
comprende además un sistema de marcaje magnético y/o uno o más
modificadores biológicos.
También se describe un kit para el uso en la
detección/separación de células T específicas de antígeno que
secreten un producto deseado en respuesta a estimulación
antigénica, comprendiendo el kit un sistema de captura de producto
que comprende restos de anclaje y de captura; un sistema marcador
para detectar el producto capturado; instrucciones para el uso de
los reactivos, todos envasados en recipientes apropiados.
Opcionalmente, el kit comprende además un sistema de marcaje
magnético y/o antígeno y/o uno o más modificadores biológicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 1-AP son
representaciones de FACS que muestran el análisis de células
sometidas al protocolo de separación descrito en el Ejemplo 1. Las
A-H muestran el análisis de células de control
cultivadas sin péptido; las IP muestran análisis de células
estimuladas con péptido. Las A, C, I y K muestran propiedades de
dispersión de la población celular de partida (A e I) y la
población celular enriquecida (C y K). Las B, D, J y L muestran
perfiles de tinción PI frente a PE de la población celular de
partida (B y J) y la población celular enriquecida (D y L). Las
representaciones E-H y M-P muestran
anti-CD8 marcado con FITC frente a tinción
anti-IFN-\gamma marcado con PE de
la población celular de partida (E y M), la primera población
negativa (F y N), la segunda población negativa (G y O) y la
población celular enriquecida (H y P).
Las Figuras 2A-N son
representaciones de FACS que muestran el análisis de células
sometidas al protocolo de separación descrito en el Ejemplo 2. Las
A-G muestran el análisis de células de control
cultivadas sin péptido; las N-R muestran el
análisis de células estimuladas con péptido. Las A-D
y H-K muestran tinción con anti-CD8
marcado con FITC frente a con
anti-IFN-\gamma marcado con PE de
la población celular de partida (A y J), las primera población
negativa (B e I), la segunda población negativa (C y J) y la
población celular enriquecida (D y K). F y M muestran tinción para
V\beta17TCR de la población celular enriquecida.
La Figura 3 es una serie de representaciones de
puntos que muestran enriquecimiento basado en secreción de
IFN-\gamma y detección de células T CD4+ y CD8+
específicas de antígeno vivas. Las representaciones de puntos
muestran tinción con CD8-Cy5 frente a anti
IFN-\gamma-PE
(A-D) o con CD4-Cy5 frente a anti
IFN-\gamma-PE
(E-L) de PBMC de donantes adultos sanos estimuladas
con (A, B) o sin (C, D) el péptido FLU 58-66
restringido por HLA-A0201, una preparación de virus
infuenza A purificado (con (E, F), sin (G, H)) y rTT.C (con (I, J),
sin (K, L)) antes (A, C, E, G, I, K) y después (B, D, F, H, J, L)
de enriquecimiento magnético de células secretoras de
IFN-\gamma. Se activaron de acuerdo con las
propiedades de dispersión de luz y exclusión de yoduro de
propidio.
La Figura 4 es una serie de representaciones de
puntos que muestran un análisis fenotípico de células T CD8+
específicas de péptido FLU 58-66. Se tiñeron
células T CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma
enriquecidas a partir de PBMC estimuladas con péptido FLU
58-66 (A, B, E, F) y, como control, a partir de
PBMC no estimuladas (C, D, G, H) con anti
IFN-\gamma-PE y se contratiñeron
con anticuerpos conjugados con FITC contra CD27, CD28, CD57 y la
cadena V\beta17 de TCR. Se usaron las propiedades de dispersión
de luz, tinción con yoduro de propidio y CD8-Cy5
para la selección de células T CD8^{+} vivas.
La Figura 5 es una gráfica que representa la
actividad citolítica de células T específicas de péptido FLU
58-66 enriquecidas y expandidas. Las células T
CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma a partir de
PBMC estimuladas con péptido FLU 58-66 se
expandieron durante 18 días en cultivo tisular en presencia de
IL-2 y después se ensayaron por ensayo de actividad
de CTL. El diagrama muestra el porcentaje de células
HLA-A2.1+ T2 estimuladas con péptido FLU
58-66 o el péptido de control negativo Melan A/MART
1 27-35.
La Figura 6 es una serie de representaciones de
puntos que representan el aislamiento y la detección de células T
CD4+ secretoras de IL-4 específicas de TT. Las
representaciones de puntos muestran la tinción con
CD4-Cy5 frente a anti
IL-4-PE de PBMC de donantes adultos
sanos estimuladas con (A, C) o sin (B, D) enriquecimiento magnético
de células secretoras de IL-4. Se seleccionaron los
linfocitos vivos de acuerdo con las propiedades de dispersión de
luz y la exclusión de yoduro de propidio.
La presente invención proporciona métodos para
detectar, analizar y separar células T de estimuladas con antígeno
en base al producto secretado, donde el producto se secreta como
resultado de la estimulación antigénica. Los métodos se basan en la
captura y relocalización en la superficie celular del producto
secretado. El producto capturado permite que la célula se detecte,
se analice y, si se desea, se separe de acuerdo con la presencia,
ausencia o cantidad del producto presente. El medio de captura
comprende un compañero de unión específico de producto ("resto de
captura") anclado a la superficie celular por un medio adecuado
para la célula a separar.
La estrategia que se presenta en este documento
combina, entre otras, las siguientes ventajas: (a) permite un
aislamiento, enumeración, fenotipado y expansión rápida de
linfocitos T específicos de antígeno vivos sin la necesidad de
activación cíclica de células T con antígeno y APC; (b) generalmente
es aplicable para el aislamiento de células T reactivas contra APC
que se han estimulado con péptidos sintéticos, proteínas nativas,
extractos celulares, patógenos no viables, transducido con vectores
retrovirales, infectado con vectores virales recombinantes,
transfectado con ARN o ADN, etc; (c) puede usarse para el
aislamiento tanto de células Th específicas de antígeno CD4+ como
de CTL específicos de antígeno CD8+, y (d) permite el aislamiento
selectivo de células T específicas de antígeno con funciones
efectoras mediadas por citoquinas particulares; por ejemplo, de
linfocitos tipo Th1, Th2 o Th3 específicos de antígeno.
La práctica de la presente invención empleará, a
menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología
molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología,
biología celular, bioquímica e inmunología, que se incluyen en la
técnica especialista. Dichas técnicas se explican en detalle en la
bibliografía, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989);
"Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal
Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in
Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental
Immunology" (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds.); "Gene
Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller y M. P.
Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology"
(F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones
periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis
et al., eds., 1994); y "Current Protocols in
Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991).
Se conocen en la técnica métodos de separación
de células y análisis de células y se describen en, por ejemplo,
The Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes 1 a 4,
(D. N. Weir, editor) y Flow Cytometry and Cell Sorting (A.
Radbruch, editor, Springer Verlag, 1992).
Como se usa en este documento, un "compañero
de unión específica" o "resto de captura" se refiere a un
miembro de una pareja de moléculas (un "pareja de unión
específica") que interacciona por medio de interacciones no
covalentes específicas que dependen de las estructuras
tridimensionales de las moléculas implicadas. Un "resto
marcador" es detectable, directa o indirectamente. Cuando el
resto de captura es un anticuerpo, puede denominarse "anticuerpo
de captura" o "anticuerpo de inmovilización". Los restos de
captura son los que se unen tanto a la célula, directa o
indirectamente, como al producto. Los restos marcadores son los que
se unen al producto y puede marcarse directamente o
indirectamente.
Como se usa en este documento, el término
"anticuerpo" pretende incluir anticuerpos policlonales y
monoclonales, anticuerpos quiméricos, haptenos y fragmentos de
anticuerpos y moléculas que sean equivalentes de anticuerpos en el
sentido de que se unan específicamente a un epítopo en el antígeno
producto. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos
policlonales y monoclonales de cualquier isotipo (IgA, IgG, IgE,
IgD, IgM) o una porción de unión a antígeno de los mismos,
incluyendo, pero sin limitación, fragmentos F(ab) y Fv tales
como scFv, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos,
anticuerpos humanizados y una biblioteca de expresión de Fab. Los
anticuerpos también pueden inmovilizarse, por ejemplo, sobre un
polímero o una partícula.
Las expresiones "anticuerpo biespecífico" y
"anticuerpos biespecíficos" también conocidos como anticuerpos
bifuncionales, se refieren a anticuerpos que reconocen dos
antígenos diferentes en virtud de poseer al menos un primer sitio
de combinación con antígeno específico para un primer antígeno o
hapteno y al menos un segundo sitio de combinación con antígeno
específico para un segundo antígeno o hapteno. Dichos anticuerpos
pueden producirse por métodos de ADN recombinante o incluir, pero
sin limitación, anticuerpos químicamente por métodos conocidos en la
técnica. Anticuerpos biespecíficos generados químicamente que se
han reducido y reformado para conservar sus características
bivalentes y anticuerpos que se han acoplado químicamente de modo
que tienen al menos dos sitios de reconocimiento de antígeno para
cada antígeno. Los anticuerpos biespecíficos incluyen todos los
anticuerpos o conjugados de anticuerpos o formas poliméricas de
anticuerpos que son capaces de reconocer dos antígenos diferentes.
El resto marcador puede ser un anticuerpo antiproducto
fluorocromado que puede incluir, pero sin limitación, anticuerpos
conjugados con perlas magnéticas, conjugados con perlas coloidales,
conjugados con FITC, Ficoeritrina, PerCP, AMCA, partículas
fluorescentes o liposomas. Como alternativa, el resto marcador puede
ser cualquier marcador adecuado incluyendo, pero sin limitación,
los descritos en este documento. Los anticuerpos biespecíficos
incluyen anticuerpos que se han reducido y reformado para conservar
sus características bivalentes y anticuerpos que se han acoplado
químicamente de modo que tienen varios sitios de reconocimiento
antigénico para cada antígeno.
Como se usa en este documento, la expresión
"población de células efectoras" se refiere a una población
celular que comprende al menos una célula T. Puede obtenerse una
población de células efectoras a partir de una población celular de
partida a partir de la que se enriquecen células T específicas de
antígeno.
Las expresiones "célula" y "células" y
"población celular", usadas de forma intercambiable se refieren
a una o más células de mamífero. Las expresiones incluyen la
progenie de una célula o población celular. Los especialistas en la
técnica reconocerán que el término "células" incluye la
progenie de una sola célula y la progenie puede no ser
necesariamente completamente idéntica (en morfología o dotación de
ADN total) a la célula parental original debido a mutación y/o
cambio natural, accidental o deliberado.
Las expresiones "linfocito T", "célula
T", "células T" y "población de células T", usadas de
forma intercambiable, se refieren a una célula o células que
presentan en su superficie una o más características antigénicas de
células T, tales como, por ejemplo, CD2 y CD3. El término incluye la
progenie de una célula T o población de célula T. Un "linfocito
T" o "célula T" es una célula que expresa CD3 en su
superficie celular y un receptor de antígeno de célula T (TCR) capaz
de reconocer un antígeno cuando se presenta en la superficie de
células autólogas o cualquier matriz presentadora de antígenos,
junto con una o más moléculas de MHC, una o más moléculas de MHC no
clásicas. La expresión "células T", como se usa en este
documento, indica cualquier célula T conocida en la técnica, por
ejemplo linfocitos que son fenotípicamente CD3^{+}, es decir que
expresan CD3 en la superficie celular, detectada típicamente usando
un anticuerpo monoclonal anti-CD3 en combinación
con una técnica de marcaje adecuada. Las células T enriquecidas
mediante los métodos de esta invención son generalmente CD3^{+}.
Las células T enriquecidas por los métodos de esta invención
también son generalmente, aunque no necesariamente, positivas para
CD4, CD8 o ambos.
La expresión "sustancialmente enriquecida",
como se usa en este documento, indica que una población celular
está al menos aproximadamente 50 veces, más preferiblemente al
menos aproximadamente 500 veces y aún más preferiblemente al menos
aproximadamente 5.000 veces o más enriquecida a partir de una
población celular mixta original que comprende la población celular
deseada.
La expresión "matriz presentadora de
antígeno", como se usa en este documento, se refiere a una
molécula o moléculas que pueden presentar antígenos de tal forma
que el antígeno pueda unirse por un receptor de antígeno de célula
T en la superficie de una célula T. La matriz presentadora de
antígeno puede estar en la superficie de una célula presentadora de
antígeno (APC), en una preparación de vesículas de APC, o puede
estar en forma de una matriz sintética en una perla o una placa. La
expresión "célula presentadora de antígeno", como se usa en
este documento, se refiere a cualquier célula que presente en su
superficie un antígeno junto con MHC o una porción del mismo, o una
o más moléculas de MHC no clásicas o una porción de las mismas.
Los términos "autógeno", "autólogo" o
"propio" como se usan en este documento, indican el origen de
una célula. Por lo tanto, una célula es autógena si la célula se
obtuvo de un individuo (el "donante") o un individuo
genéticamente idéntico y se va a volver a administrar al individuo.
Una célula autógena también puede se la progenie de una célula
autógena. El término también indica que células de diferentes tipos
celulares se obtienen del mismo donante o de donantes genéticamente
idénticos. Por lo tanto, se dice que una célula efectora y una
célula presentadora de antígeno son autógenas si proceden del mismo
donante o de un individuo genéticamente idéntico al donante, y si
son progenie de células obtenidas del mismo donante o de un
individuo genéticamente idéntico al donante.
De forma similar, el término "alogénica" o
"no propia", como se usa en este documento, indica el origen
de una célula. Por lo tanto, una célula o la progenie de la misma
es alogénica si la célula se obtuvo de un individuo no
genéticamente idéntico al receptor al que se administra. El término
se refiere a la no identidad en moléculas de MHC expresadas. El
término también indica que se obtienen células de diferentes tipos
celulares a partir de donantes genéticamente no idénticos, o si son
progenie de células obtenidas de donantes genéticamente no
idénticos. Por ejemplo, se dice que una APC es alogénica respecto a
una célula efectora si proceden de donantes genéticamente no
idénticos.
Una "enfermedad o afección relacionada con una
población de células T específicas de antígeno" es una que puede
estar relacionada con una población de células T específicas de
antígeno o con la ausencia de números adecuados de las mismas e
incluye, por ejemplo, enfermedades autoinmunes en las que las
células T específicas de antígeno son principalmente responsables
de la patogenia de la enfermedad; cánceres en los que el
crecimiento de células cancerosas no está adecuadamente controlado
por células T citotóxicas específicas de tumores; enfermedades
víricas en las que las células infectadas por virus no se lisan por
células T citotóxicas; alergias, en las que células T específicas
de alergenos median efectos no deseados; inmunodeficiencias, en las
que están presentes cantidades inadecuadas de células T en un
individuo debido a infección (tal como VIH) o de forma congénita
(tal como síndrome de DiGeorge). También es una en la que las
células T específicas de antígeno modulan o regulan la actividad de
otra célula o población celular que es principalmente responsable
de una patología; también es una en la que la presencia de una
población de células T específicas de antígeno no es la causa
primaria de la enfermedad, pero desempeña un papel clave en la
patogenia de la enfermedad; y también es una en la que una
población de células T específicas de antígeno media un rechazo no
deseado de un antígeno extraño.
Un "individuo" es un vertebrado,
preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los
mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales de granja humanos,
animales de deporte y mascotas.
Una "cantidad eficaz" es una cantidad
suficiente para lograr resultados clínicos beneficiosos o deseados.
Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más
administraciones. Para los fines de esta invención, una cantidad
eficaz de células T específicas en antígeno es una cantidad que es
suficiente para diagnosticar, paliar, mejorar, estabilizar,
revertir, ralentizar o retrasar la progresión de la patología.
Como se usa en este documento, el
"tratamiento" es una estrategia para obtener resultados
clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta invención,
los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin
limitación, alivio de síntomas, disminución del grado de enfermedad,
estado de enfermedad estabilizado (es decir que no empeora), evitar
la propagación de la enfermedad (es decir, metástasis), retraso o
ralentización de la progresión de la enfermedad, mejoría o
paliación de la patología y remisión (ya sea parcial o total), ya
sea detectable o indetectable. El "tratamiento", también puede
referirse a prolongar la supervivencia en comparación con la
supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.
"Paliar" una enfermedad significa que el
grado y/o las manifestaciones clínicas indeseables de una patología
se reducen y/o el curso de tiempo de la progresión se ralentiza o
alarga, en comparación con no administrar poblaciones de células T
enriquecidas de la presente invención.
La presente invención proporciona métodos para
obtener un población celular enriquecida en células T específicas
de antígeno que secreten un producto, donde el producto se secreta
como resultado de estimulación antigénica. Los métodos implican
generalmente obtener una población mixta de células que comprenden
células T; exponer la población de células al menos un antígeno en
condiciones eficaces para generar una estimulación específica de
antígeno de al menos una célula T; modificar la superficie de dicha
población mixta para que contenga unida a la misma un compañero de
unión específico para el producto; permitir la expresión de al
menos un producto por la células T estimuladas, donde el producto
se secreta en respuesta a la estimulación; permitir la unión del
producto a un resto de captura acoplado en la superficie de la
célula para formar un complejo de resto de captura unido a
célula-producto, marcando por lo tanto las células;
y separar las células T estimuladas de acuerdo con el grado en que
estén marcadas con dicho producto.
Por supuesto, la modificación de la superficie
celular con un compañero de unión específica puede realizarse
antes, durante o después de la estimulación antigénica.
La presente invención proporciona métodos para
obtener una población celular enriquecida en células T específicas
de antígeno que secreten un producto en respuesta a la estimulación
antigénica. Los métodos comprenden obtener una población mixta de
células (es decir, una "población de células efectoras") y
exponer la población celular a al menos un antígeno. La población
celular mixta puede obtenerse por cualquier método conocido en la
técnica y preferiblemente está enriquecida para células T. La
exposición a antígeno puede conseguirse usando matrices
presentadoras de antígeno que pueden estar en la superficie de
células presentadoras de antígeno (APC). Las matrices presentadoras
de antígeno y células efectoras pueden obtenerse a partir de una
diversidad de fuentes. La población mixta de células puede
estimularse por antígeno in vitro o in vivo o
modificarse de cualquiera de una diversidad de modos, por ejemplo,
modificarse químicamente o genéticamente.
Las poblaciones de células T que sometan a los
métodos de la presente invención se exponen al menos un antígeno en
condiciones eficaces para generar una estimulación específica de
antígeno. Se dice que una célula T que se estimula mediante el al
menos un antígeno es específica de antígeno, es decir, presenta en
su superficie celular un receptor de antígeno que reconoce
específicamente y se une a un antígeno asociado con una molécula
capaz de presentar antígeno, tal como una molécula de MHC clásica o
no clásica o una porción de la misma, o una matriz presentadora de
antígeno, por ejemplo, una matriz presentadora de antígeno
sintética o una que esté presente en la superficie de una APC.
La molécula presentadora de antígeno puede ser
una molécula de MHC que puede ser clase I o clase II o una molécula
de MHC no clásica tal como CD1; un epítopo de MHC; una proteína de
fusión que comprende un epítopo MHC; o un epítopo MHC sintético. La
naturaleza de la molécula presentadora de antígeno no es crítica
siempre que sea capaz de presentar antígenos a una célula efectora.
Se conocen en la técnica métodos para preparar epitopos de MHC.
Las matrices presentadoras de antígeno incluyen
aquellas en la superficie de una APC, así como matrices
presentadoras de antígeno sintéticas. Las APC adecuadas para el uso
en la presente invención son capaces de presentar un péptido o
proteína exógena o un antígeno endógeno a células T junto con un
molécula presentadora de antígeno, tal como una molécula de MHC.
Las APC incluyen, pero sin limitación, macrófagos, células
dendríticas, células B activadas por CD40, células B específicas de
antígeno, células tumorales, células infectadas por virus y células
modificadas genéticamente.
Pueden obtenerse APC de una diversidad de
fuentes, incluyendo, pero sin limitación células mononucleares de
sangre periférica (PBMC), sangre completa o fracciones de la misma
que contienen poblaciones mixtas, células de bazo, células de
médula ósea, linfocitos infiltrantes de tumores, células obtenidas
por leucoféresis, ganglios linfáticos, por ejemplo, ganglios
linfáticos de drenaje de un tumor. Los donantes adecuados incluyen
un donante inmunizado, un donantes no inmunizado (sin tratamiento
previo), donantes tratados o sin tratar. Un donante "tratado"
es uno que se ha expuesto a uno o más modificadores biológicos. Un
donante "sin tratar" no se ha expuesto a uno o más
modificadores biológicos. También se pueden tratarse APC in
vitro con uno o más modificadores biológicos.
Generalmente las APC están vivas pero también
pueden estar irradiadas, tratadas con mitomicina, atenuadas o
fijadas químicamente. Además, las APC no tienen que ser células
completas. En su lugar pueden usarse preparaciones de vesículas de
APC.
Las APC pueden modificarse genéticamente, es
decir, transfectarse con una construcción polinucleotídica
recombinante de modo que expresen un polipéptido o una molécula de
ARN que normalmente no expresarían o que normalmente expresarían a
niveles inferiores. Los ejemplos de polinucleótidos incluyen, pero
sin limitación, los que codifican una molécula de MHC; una molécula
coestimuladora tal como B7; o un antígeno. Por ejemplo, la expresión
de un polinucleótido que codifica una molécula de MHC bajo el
control transcripcional de un promotor fuerte tal como el promotor
de CMV puede dar como resultado un alto nivel de expresión de la
molécula de MHC en la superficie celular, aumentando por lo tanto
la densidad de presentación de antígeno. Como alternativa, una APC
puede transfectarse con una construcción polinucleotídica que
comprende un polinucleótido que codifica un antígeno bajo control
transcripcional de un promotor fuerte, tal como el promotor de CMV
de modo que el antígeno se expresa en la superficie de la célula
junto con una molécula de MHC.
La secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido está unida operativamente a secuencias de control para
transcripción y traducción. Una secuencia de control está "unida
operativamente" a una secuencia codificante si la secuencia de
control regula la transcripción o traducción. Cualquier método en
la técnica puede usarse para la transformación o inserción de un
polinucleótido exógeno en una APC, por ejemplo, lipofección,
transducción, infección o electroporación usando ADN purificado,
vectores virales o virus de ADN o ARN. El polinucleótido exógeno
puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un
plásmido o puede integrarse en el genoma de la célula
hospedadora.
Las células que normalmente no funcionan in
vivo en mamíferos como APC pueden modificarse para funcionar
como APC. Una amplia diversidad de células pueden funcionar como
APC cuando se modifican apropiadamente. Son ejemplos de dichas
células células de insecto, por ejemplo Drosophila o
Spodoptera; células de acogida, tales como la línea celular
humana T2, que lleva una mutación en su ruta de presentación de
antígeno que restringe la asociación de péptidos endógenos con
moléculas de MHC clase I de superficie celular. Zweerink et
al. (1993) J. Immunol. 150: 1763-1771.
Por ejemplo, pueden introducirse en estas células vectores de
expresión que dirigen la síntesis de uno o más polipéptidos
presentadores de antígeno, tales como moléculas de MHC y,
opcionalmente, moléculas accesorias tales como B7 para lograr la
expresión en la superficie de estas moléculas de presentación de
antígenos en células y, opcionalmente, moléculas accesorias o
porciones funcionales de las mismas. Como alternativa, pueden
usarse polipéptidos presentadores de antígeno y moléculas
accesorias que pueden insertarse por sí mismos en la membrana
celular. Por ejemplo, los polipéptidos modificados con
glicosil-fosfatidilinositol (GPI) pueden insertarse
por sí mismo en las membranas de células. Medof et al. J.
Exp. Med. 160: 1558-1578; y Huang et al.
Immunity 1: 607-613. Las moléculas accesorias
incluyen, pero sin limitación, anticuerpos coestimuladores tales
como anticuerpos específicos para CD28, CD80 o CD86; moléculas
coestimuladoras incluyendo, pero sin limitación, B7.1 y B7.2;
moléculas de adhesión tales como ICAM-1 y
LFA-3; y moléculas de supervivencia tales como
ligando Fas y CD70. Véase, por ejemplo, la Publicación PCT Nº WO
97/46256.
Como alternativa, puede usarse una matriz
presentadora de antígeno sintética para presentar un antígeno a
células efectoras. Una matriz sintética puede incluir una molécula
presentadora de antígeno, preferiblemente una molécula de MHC Clase
I o MHC Clase II, inmovilizada en un soporte sólido, por ejemplo,
perlas o placas. Pueden estar presentes moléculas accesorias que
pueden estar coinmovilizadas o solubles, incluyendo las moléculas,
pero sin limitación, anticuerpos coestimuladores tales como
anticuerpos específicos para CD28, CD80 o CD86; moléculas
coestimuladoras incluyendo, pero sin limitación, B7.1 y B7.2;
moléculas de adhesión tales como ICAM-1 y
LFA-3; y moléculas de supervivencia tales como
ligando Fas y CD70. También pueden usarse porciones de moléculas
accesorias siempre que se mantenga su función. Los soportes sólidos
incluyen metales o plásticos, materiales porosos, microperlas,
placas de microtitulación, glóbulos rojos y liposomas. Véase, por
ejemplo, la publicación PCT Nº WO 97/46256 y WO 97/35035.
Se conocen en la técnica métodos para determinar
si una matriz presentadora de antígeno, ya esté en una superficie
celular o en un soporte sintético, es capaz de presentar antígenos
a célula efectora e incluyen, por ejemplo, captación de
^{3}H-timidina por células efectoras, producción
de citoquinas por células efectoras y ensayos de liberación
citolítica de ^{51}Cr.
Pueden aislarse células T específicas de
antígeno a partir de una población de células efectoras, es decir,
una población de células hematopoyéticas, preferiblemente
enriquecida para células T. La población de células efectoras es
una población de partida a partir de la que se aíslan células T
específicas de antígeno.
Una población de células efectoras adecuada para
usar en la presente invención puede ser autógena o alogénica,
preferiblemente autógena. Cuando las células efectoras son
alogénicas, preferiblemente se reduce el contenido de células
alorreactivas de las células antes del uso. Esto puede conseguirse
por cualquier medio conocido, incluyendo, por ejemplo, mezcla de
las células efectoras alogénicas y una población de células
receptoras e incubación de las mismas durante un tiempo adecuado,
reduciendo después las células CD69^{+} o inactivando células
alorreactivas o induciendo anergia en la población de células
alorreactivas.
La población de células efectoras puede
comprender células no separadas, es decir, una población mixta, por
ejemplo, una población de PBMC, sangre completa y similares. La
población de células efectoras puede manipularse por selección
positiva basándose en la expresión de marcadores de superficie
celular, selección negativa basándose en la expresión de marcadores
de superficie celular, estimulación con uno o más antígenos in
vitro o in vivo, tratamiento con uno o más modificadores
biológicos in vitro o in vivo, estimulación
sustractiva con uno o más antígenos o modificadores biológicos o
una combinación de cualquiera o todas estos.
Pueden obtenerse células efectoras a partir de
una diversidad de fuentes incluyendo, pero sin limitación, PBMC,
sangre completa o fracciones de la misma que contienen poblaciones
mixtas, células de bazo, células de médula ósea, linfocitos
infiltrantes de tumores, células obtenidas por leucoféresis, tejido
de biopsia, ganglios linfáticos, por ejemplo, ganglios linfáticos de
drenaje de un tumor. Los donantes adecuados incluyen un donante
inmunizado, un donante no inmunizado (sin tratamiento previo),
donantes tratados o sin tratar. Un donante "tratado" es uno
que se ha expuesto a uno o más modificadores biológicos. Un donante
"sin tratar" no se ha expuesto a uno o más
modificadores
biológicos.
biológicos.
Se conocen bien métodos de extracción y cultivo
de células efectoras. Por ejemplo, pueden obtenerse células
efectoras por leucoféresis, aféresis mecánica usando un separador
de células de flujo continuo. Por ejemplo, pueden aislarse
linfocitos y monocitos a partir de la capa leucoplaquetaria por
cualquier método conocido, incluyendo, pero sin limitación,
separación sobre gradiente de Ficoll-Hypaque^{TM}
separación sobre un gradiente de Percoll o elutriación. La
concentración de Ficoll-Hypaque^{TM} puede
ajustarse para obtener la población deseada, por ejemplo, una
población enriquecida en células T. Se conocen y pueden usarse
otros métodos basados en columnas de afinidad específica de
células. Estos incluyen, por ejemplo, separación de células
activadas por fluorescencia (FACS), adhesión de células, separación
con perlas magnéticas y similares. Los métodos basados en afinidad
pueden utilizar anticuerpos o porciones de los mismos que sean
específicos para marcadores de superficie celular y que estén
disponibles a partir de una diversidad de fuentes comerciales,
incluyendo la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD).
Los métodos basados en afinidad pueden utilizar como alternativa
ligandos o análogos de ligandos de receptores de superficie
celular.
La población de células efectoras puede
someterse a uno o más protocolos de separación basándose en la
expresión de marcadores de superficie celular. Por ejemplo, las
células pueden someterse a selección positiva en base a la
expresión de uno o más polipéptidos de superficie celular,
incluyendo pero sin limitación, marcadores de superficie celular de
"grupo de diferenciación" tales como CD2, CD3, CD4, CD8, TCR,
CD45, CD45RO, CD45RA, CD11b, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31,
CD40L; otros marcadores asociados con activación de linfocitos
tales como el producto del gen de activación de linfocitos 3
(LAG3), molécula de señalización de activación del linfocito
(SLAM), T1/ST2; receptores de quimioquinas tales como CCR3, CCR4,
CXCR3, CCR5; receptores buscadores tales como CD26L, CD44, CLA,
CD146, \alpha4\beta7, \alphaE\beta7; marcadores de
activación tales como CD25, CD69 y OX40; y lipoglicanos presentados
por CD1. La población de células efectoras puede someterse a
selección negativa por reducción de células no T y/o conjuntos de
células T particulares. Puede realizarse una selección negativa en
base a la expresión en superficie celular de una diversidad de
moléculas, incluyendo, pero sin limitación, marcadores de células B
tales como CD19 y CD20; marcador de monocitos CD14; el marcador de
células NK CD56.
La población de células efectoras puede
manipularse por exposición, in vivo o in vitro a uno
o más antígenos. Los antígenos incluyen, pero sin limitación,
péptidos, proteínas; glicoproteínas; lípidos; glicolípidos; células;
extractos celulares; extractos tisulares; microorganismos completos
tales como protozoos, bacterias y virus. Los antígenos pueden ser
sin modificar, es decir, usados en su estado nativo. Como
alternativa, un antígeno puede modificarse por cualquier medio
conocido, incluyendo, pero sin limitación, calentamiento, por
ejemplo para desnaturalizar una proteína o inactivar un patógeno;
modificación química para desnaturalizar una proteína o para
entrecruzar dos moléculas antigénicas; glicosilación, modificación
química con restos que incluyen, pero sin limitación
polietilenglicol; y digestión enzimática. Si se usa más de un
antígeno, la exposición puede ser simultánea o secuencial.
Las células efectoras pueden cultivarse en
presencia de al menos un antígeno asociado con una afección a
tratar. El antígeno puede ser un solo antígeno con múltiples
determinantes antigénicos o puede ser una mezcla de antígenos. El
antígeno puede ser un autoantígeno o un antígeno extraño,
dependiendo de la afección a tratar. Los autoantígenos incluyen
antígenos asociados con enfermedades autoinmunes y los asociados
con células cancerosas. El antígeno puede ser una proteína,
células, un tejido o un órgano diana. Si el antígeno es un
autoantígeno, el autoantígeno puede ser parte de un órgano, por
ejemplo, el cerebro o la glándula tiroidea y no tiene que estar
purificado a partir del mismo. También pueden usarse autoantígenos
purificados o mezclas de autoantígenos purificados.
El cocultivo de leucocitos de sangre periférica
(PBL) o linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) con células
tumorales autólogas se acompaña generalmente de estimulación con
citoquinas. Sport et al. (1993) Cancer Immunol.
Immunother. 37: 175-180; y Peyret et al.
(1991) Chirurgie 177: 700-709.
Una población de células efectoras puede
manipularse por exposición in vivo o in vitro a uno o
más modificadores biológicos. Los modificadores biológicos
adecuados incluyen, pero sin limitación, citoquinas tales como
IL-2, IL-4, IL-10,
TNF-\alpha, IL-12,
IFN-\gamma, modificadores inespecíficos tales como
fitohemaglutinina (PHA), ésteres de forbol tales como miristato
acetato de forbol (PMA), concanavalina-A e
ionomicina; anticuerpos específicos para marcadores de superficie
celular tales como anti-CD2,
anti-CD3, anti-receptor de
IL-2, anti-CD28; quimioquinas,
incluyendo, por ejemplo, linfotactina. Los modificadores biológicos
pueden ser factores nativos obtenidos de fuentes naturales,
factores producidos mediante tecnología de ADN recombinante,
polipéptidos químicamente sintetizados u otras moléculas, o
cualquier derivado de las mismas que tenga la actividad funcional
del factor nativo. Si se usa más de un modificador biológico, la
exposición puede ser simultánea o secuencial.
La presente invención proporciona composiciones
que comprenden células T enriquecidas en células específicas de
antígeno, enriquecidas de acuerdo con los métodos de la invención.
Por "enriquecida" se entiende que una población celular está
al menos aproximadamente 50 veces, más preferiblemente al menos
aproximadamente 500 veces y aún más preferiblemente al menos
aproximadamente 5000 veces o más enriquecida a partir de una
población celular mixta original que comprende la población celular
deseada. La proporción de la población celular enriquecida que
comprende las células específicas de antígeno deseadas puede variar
sustancialmente, de menos del 10% hasta el 100% de células
específicas de antígeno. El porcentaje que es específico de
antígeno puede determinarse fácilmente, por ejemplo, mediante un
ensayo de captación de ^{3}H-timidina en el que
la población de células T se expone a una matriz presentadora de
antígeno que presenta el antígeno o antígenos deseados.
Los métodos en este documento se basan en el
marcaje de las células con un producto secretado por las células,
donde el producto se secreta en respuesta a la estimulación
antigénica. Para conseguir el marcaje, la superficie celular de una
población celular se modifica de modo que un resto que se une
específicamente a un producto, el "compañero de unión
específica" se une a la superficie celular directamente o a
través de un medio de anclaje (o un "resto de anclaje"),
opcionalmente a través de un enlazador para formar un resto de
captura. La población celular puede contener numerosos tipos de
células y generalmente está constituida por una población mixta.
Preferiblemente, la población celular es hematopoyética más
preferiblemente, la población celular son células efectoras, más
preferiblemente la población celular son células T o un subconjunto
de las mismas. Pueden aislarse subconjuntos en virtud de marcadores
de superficie celular, por ejemplo, CD45 para linfocitos, CD8 para
células citotóxicas, etc.
Se conocen en la técnica productos secretados en
respuesta a estimulación antigénica e incluyen, pero sin
limitación, citoquinas, tales como IL-2,
IL-4, IL-10,
TNF-\alpha, TGF-\beta e
IFN-\gamma.
Los compañeros de unión específica incluyen
cualquier resto por el que exista una afinidad y una especificidad
relativamente elevadas entre producto y compañero de unión y en el
que la disociación del complejo de producto:compañero sea
relativamente lenta, de modo que el complejo de producto:compañero
se detecte durante la técnica de separación celular. Los compañeros
de unión específica incluyen, pero sin limitación, sustratos o
análogos de sustratos con los que se unirá un producto, péptidos,
polisacáridos, esteroides, biotina, digitoxina, digitonina y
derivados de los mismos. En una realización preferida, el compañero
de unión específica es un anticuerpo o fragmento de unión a
antígeno o derivado del mismo. La expresión "fragmento de unión a
antígeno" incluye cualquier péptido que se une específicamente
al producto. Típicamente, estos fragmentos incluyen fragmentos de
inmunoglobulina tales como Fab, F(ab')_{2}, Fab', scFv
(formas tanto monomérica como polimérica) y cadenas H y L aisladas.
Un fragmento de unión a antígeno conserva la especificidad de la
inmunoglobulina intacta, aunque pueden alterarse la avidez y/o la
afinidad.
En la práctica de la invención, el resto de
captura puede unirse a una membrana celular (o pared celular)
mediante una diversidad de métodos. Los métodos adecuados incluyen,
pero sin limitación, acoplamiento químico directo a grupos amino de
los componentes proteicos, acoplamiento con tioles (formados
después de la reducción de puentes disulfuro) de los componentes
proteicos, acoplamiento indirecto a través de anticuerpos
(incluyendo parejas de anticuerpos) o lectinas, anclaje en la
bicapa lipídica por medio de un anclaje hidrófobo y unión a la
superficie celular cargada negativamente por policationes.
En otras realizaciones de la invención, el resto
de captura se introduce usando dos o más etapas, por ejemplo, por
marcaje de las células con al menos un resto de anclaje que permite
el acoplamiento del resto de captura con el resto de anclaje
directamente, por ejemplo, mediante un complejo de biotina/avidina
o indirectamente, a través de un resto o restos de enlace
adecuados.
Los restos de anclaje adecuados incluyen
moléculas lipófilas tales como ácidos grasos. Como alternativa,
también pueden usarse anticuerpos u otros agentes de unión
específica a marcadores de superficie celular tales como los
antígenos o glicoproteínas de MHC.
El "resto de captura" puede acoplarse al
resto de anclaje a través de un agente de enlace y también puede
incluir un enlazador que multiplique el número de resto de captura
disponibles y, por lo tanto, el potencial para la captura de
producto, tales como polímeros ramificados incluyendo, por ejemplo,
moléculas de dextrano modificado; polietilenglicol, propilenglicol,
alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona.
Se conocen en la técnica métodos para
acoplamiento químico directo de anticuerpos a la superficie celular
e incluyen, por ejemplo, acoplamiento usando anticuerpos activados
con glutaraldehído o maleimida. Los métodos para acoplamiento
químico usando procedimientos multietapa, incluyen, pero sin
limitación, biotinilación, acoplamiento de trinitrofenol (TNP) o
digoxigenina usando, por ejemplo, ésteres de succinimida de estos
compuestos. La biotinilación puede conseguirse, por ejemplo,
mediante el uso de
D-biotinil-N-hidroxisuccinimida.
Los grupos succinimida reaccionan eficazmente con grupos amino a
valores de pH por encima de 7 y, preferiblemente entre pH 8,0 y
aproximadamente pH 8,5. La biotinilación puede conseguirse, por
ejemplo, por tratamiento de las células con ditiotreitol seguido de
adición de biotina-maleimida.
El acoplamiento con las células también puede
conseguirse usando anticuerpos contra antígenos de superficie
celular ("marcadores"). Los anticuerpos dirigidos contra
antígenos de superficie requieren generalmente en el intervalo de
0,1 a 1 \mug de anticuerpo por 10^{7} células. Sin embargo, este
requerimiento variará ampliamente en respuesta a la afinidad del
anticuerpo con el producto y deberá determinarse empíricamente.
Dicha determinación está bien dentro de la habilidad de un
especialista en la técnica. Por lo tanto, la cantidad apropiada de
anticuerpo debe determinarse empíricamente y está dentro de la
habilidad de un especialista en la técnica. Esto permite el
acoplamiento con células específicas en la expresión de marcadores
específicos de tipo celular. Por ejemplo, pueden marcarse
específicamente clases de células tales como células T o
subconjuntos de las mismas. Como un resto de captura, puede usarse
un anticuerpo biespecífico que tiene un sitio de reconocimiento de
antígeno para la célula o un resto de anclaje colocado sobre el
mismo y el producto.
Un resto de captura, particularmente anticuerpos
de captura debería seleccionarse basándose en la cantidad de
producto secretado. Por ejemplo, para las células que secretan
solamente unas pocas moléculas, un anticuerpo de alta afinidad
capturará la mayoría de las moléculas secretadas. Como alternativa,
en el caso en el que la célula secrete muchas moléculas durante el
tiempo de incubación, puede preferirse un anticuerpo de menor
afinidad para evitar una saturación demasiado temprana de la matriz
de inmovilización. La determinación de afinidades adecuadas para el
nivel de proteínas secretadas se determina empíricamente y está
dentro de la habilidad de un especialista en la técnica.
Células que llevan grandes cantidades de ácido
N-acetilneuramínico en su superficie como
constituyente de sus lipopolisacáridos llevan una carga negativa a
valores de pH fisiológicos. El acoplamiento de restos de captura
puede ser mediante interacciones de carga. Por ejemplo, los restos
que llevan policationes se unen a células cargadas negativamente.
Se conocen en la técnica policationes e incluyen, por ejemplo,
polilisina y quitosana. La quitosana es un polímero que consiste en
grupos D-glucosamina unidos entre sí por enlaces
\alpha-(1-4) glucósido.
Otro método de acoplamiento de compañeros de
unión (que puede comprender uno o más restos de captura) a las
células es por acoplamiento con los polisacáridos de la superficie
celular. Se conocen en la técnicas sustancias que se unen con
polisacáridos e incluyen, por ejemplo, lectinas, incluyendo
concanavalina A, lectinas de Solanum tuberosum, Aleuria aurantia,
Datura stramonium, Galanthus nivalis, Helix pomatia, Lens
culínaris y otras lectinas conocidas suministradas por varias
compañías, incluyendo, por ejemplo, Sigma Chemical Company y
Aldrich Chemical Company.
En algunas realizaciones de la invención, el
compañero de unión a productos se acopla a la célula por anclaje
hidrófobo a la membrana celular. Se conocen en la técnica grupos
hidrófobos adecuados que interaccionarán con la bicapa lipídica de
la membrana e incluyen, pero sin limitación, ácidos grasos y
detergentes no iónicos (incluyendo, por ejemplo,
Tween-80). Una desventaja de la unión del resto de
captura a la célula mediante la inserción de un anclaje hidrófobo
es que la velocidad de integración del resto hidrófobo en la célula
es lenta. Por lo tanto, con frecuencia son necesarias altas
concentraciones del resto con el anclaje hidrófobo. Con frecuencia
esta última situación no es económica cuando el resto de captura es
una sustancia relativamente limitada o cara, por ejemplo, un
anticuerpo.
El bajo rendimiento de moléculas hidrófobas que
se embeben por sí mismas en la membrana es relevante sólo cuando
estas moléculas están disponibles en cantidades relativamente
limitadas. Este problema puede superarse mediante el uso de un
sistema de formación de enlaces que incluye un compañero de anclaje
y un compañero que contiene el resto de captura, en el que uno de
los compañeros es de mayor disponibilidad y en el que las dos
partes del sistema de formación de enlaces tiene un alto grado de
especificidad y afinidad entre sí. Por ejemplo, en una realización,
se une avidina o estreptavidina a la superficie celular mediante un
anclaje hidrófobo, mientras que el compañero con el resto de
captura de producto son anticuerpos anti-producto
biotinilados. En otra realización, la superficie celular se marca
con digoxigenina seguido de conjugados de fragmentos de anticuerpos
anti-digoxigenina y anticuerpos
anti-producto. Esta estrategia puede usarse con
otras parejas de moléculas capaces de formar un enlace, incluyendo,
por ejemplo, hapteno con anticuerpos antihapteno, NTA con restos de
polihistidina o lectinas con polisacáridos. Una realización
preferida es una permite la "amplificación" del sistema por
aumento del número de restos de captura por resto de anclaje.
En una realización ilustrativa, se une un
dextrano ramificado a ácido palmítico, proporcionando de este modo
una multiplicidad de sitios de unión disponibles. El dextrano se
acopla a su vez a biotina y se trata con un anticuerpo conjugado
con avidina específico para el producto.
Se contempla por supuesto entre las
realizaciones de la invención que pueden usarse sistemas de
formación de enlaces entre el resto de anclaje y el resto de
captura cuando el resto de anclaje se acopla de cualquier modo a la
superficie celular. Por tanto, por ejemplo, un resto enlazador de
avidina (o estreptavidina) biotina puede unir un resto de anclaje
de anticuerpo con un resto de captura. Los sistemas de anticuerpos
biespecíficos también pueden actuar como restos enlazadores.
Para analizar y, si se desea, seleccionar
células que tengan la capacidad de secretar el producto, se incuban
células modificadas como anteriormente para que contengan el resto
de captura en condiciones que permitan la producción y secreción
del producto en una cantidad suficiente para permitir la unión a y
la detección de las células que contengan el producto capturado.
Estas condiciones son conocidas para los especialistas en la técnica
e incluyen, entre otros, temperatura apropiada, pH y
concentraciones de sales, factores de crecimiento y sustratos en el
medio de incubación, así como las concentraciones apropiadas de gas
en la fase gaseosa. Cuando es deseable distinguir entre células
altas y bajas productoras, el tiempo de incubación es tal que la
secreción de producto por las células sea todavía una fase lineal.
Las condiciones apropiadas pueden determinarse empíricamente y
dicha determinación está dentro de la habilidad de un especialista
en la técnica.
Además, puede modificarse la secreción celular,
es decir, regularse positivamente, inducirse o reducirse usando
modificador biológico. Los modificadores biológicos pueden añadirse
en cualquier momento pero preferiblemente se añaden al medio de
incubación. Como alternativa, las células puede pretratarse con
estos agentes o células antes de la etapa de incubación. Los
modificadores biológicos adecuados incluyen, pero sin limitación,
moléculas y otras células. Las moléculas adecuadas incluyen, pero
sin limitación, fármacos, citoquinas, moléculas pequeñas, hormonas,
combinaciones de interleuquinas, lectinas y otros agentes
estimulantes, por ejemplo, PMA, LPS, anticuerpos biespecíficos y
otros agentes que modifican las funciones celulares o la expresión
de proteína.
Las células adecuadas incluyen, pero sin
limitación, interacciones directas célula-célula
tales como entre una célula tumoral y T e interacciones indirectas
célula-célula tales como las inducidas por la
proximidad de otras células que secretan un modificador biológico.
Las células adecuadas incluyen, pero sin limitación, células
sanguíneas, células de médula ósea periférica y diversas líneas
celulares.
Las condiciones de incubación también son tales
que el producto esencialmente no se captura o se captura en mucho
menor grado por otra célula, para distinguir células no productoras
de células productoras de producto, o altas productoras de bajas
productoras. Generalmente, el tiempo de incubación es de entre
cinco minutos y diez horas y, más habitualmente, de entre una y
cinco horas. El medio de incubación puede incluir opcionalmente una
sustancia que ralentice la difusión del producto desde la célula
productora. Se conocen en la técnica sustancias que inhiben la
difusión de producto en medios líquidos y que no son tóxicas para
las células e incluyen una diversidad de sustancias que gelifican
parcialmente o completamente, incluyendo, por ejemplo, alginato,
agarosa de bajo punto de fusión y gelatina. Variando la viscosidad
o permeabilidad del medio, puede modularse la captura local
mediante una célula productora de productos de diferente tamaño. La
exclusión por tamaño de peso molecular del medio puede ajustarse
para optimizar la reacción. La composición óptima del medio puede
determinarse empíricamente y está influida por la concentración
celular, el nivel de secreción y el peso molecular del producto y
la afinidad de los restos de captura para el producto. Dichas
determinaciones están dentro de la habilidad de un especialista en
la técnica.
Preferiblemente, los geles se solubilizan
después de la incubación para permitir el aislamiento de las
células o grupos de células a partir de los medios mediante técnicas
de separación celular. Por lo tanto, por ejemplo, los geles pueden
unirse mediante enlaces disulfuro que pueden disociarse mediante
agentes reductores de sulfhidrilo tales
\beta-mercaptoetanol o ditiotreitol, o los geles
pueden contener entrecruzantes fónicos incluyendo, por ejemplo,
iones de calcio, que se solubilizan mediante la adición de un
agente quelante tal como EDTA.
Al final de la fase de secreción las células
habitualmente se refrigeran para evitar una secreción adicional, y
la matriz de gel (si existe) se solubiliza. Por supuesto, este
orden puede invertirse. Puesto que la protección terminal puede
tener lugar después de que se añada el resto de captura debido a
entrecruzamiento, puede añadirse una etapa de incubación para
disminuir la protección terminal en este punto. Las células pueden
incubarse por ejemplo en citochalasina A o B o cualquier otra
sustancia adecuada que evite la protección terminal. Las células
que contienen el producto inmovilizado se marcan después con un
resto marcador. El marcaje puede realizarse por cualquier método
conocido por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, pueden
usarse anticuerpos anti-producto para marcar directa
o indirectamente las células que contienen el producto. Los
marcadores usados son los que son adecuados para el uso en sistemas
en los que las células se van a analizar o separar basándose en la
unión del resto marcador al
producto.
producto.
En otras realizaciones, pueden detectarse restos
de captura que no contienen producto capturado. Esto permite, por
ejemplo, el aislamiento de células que secreten grandes cantidades
por empleo de un método de separación negativa, es decir, detección
de células que no estén altamente saturadas con producto. Las
células pueden marcarse con otras sustancias de marcaje que
reconozcan, por ejemplo, marcadores de superficie celular, tipo
celular, parámetros celulares tales como contenido de ADN, estado
celular o número de restos de captura.
La enumeración de restos de captura reales puede
ser importante para compensar cantidades variables de estas
moléculas debido a, por ejemplo, diferentes potenciales de
conjugación de las células. Puede ser especialmente importante para
el aislamiento de células poco frecuentes excluir células con una
capacidad disminuida o aumentada para unirse al sistema de captura
de producto, incluyendo los restos de anclaje y de captura. Como
alternativa, las reacciones pueden desarrollarse simultáneamente en
una "reacción de una etapa".
El análisis de la población celular y la
separación de células basada en la presencia del marcador puede
conseguirse por varios procedimientos conocidos en la técnica. Las
células pueden analizarse o separarse, por ejemplo, mediante
citometría de flujo o FACS. Estas técnicas permiten el análisis y
la separación de acuerdo con uno o más parámetros de las células.
Habitualmente pueden analizarse uno o múltiples parámetros de
secreción simultáneamente en combinación con otros parámetros
medibles de la célula incluyendo, pero sin limitación, tipo
celular, marcadores de superficie celular, contenido de ADN, etc.
Los datos pueden analizarse y las células separarse usando
cualquier fórmula o combinación de los parámetros medidos. Se
conocen en la técnica métodos de separación de células y análisis de
células y se describen, por ejemplo, en The Handbook of
Experimental Immunology, Volúmenes 1 a 4 (D. N. Weir, editor);
Flow Cytometry Cell Sorting (A. Radbruch, editor, Springer
Verlag, 1992); y Cell Separation Methods and Applications
(D. Recktenwald y A. Radbruch, eds. 1997) Marcel Dekker, Inc. N. Y.
Las células también pueden analizarse usando técnicas de microscopía
que incluyen, por ejemplo, microscopía de barrido láser,
microscopia de fluorescencia; también pueden usarse técnicas tales
como estas en combinación con sistemas de análisis por imagen.
Otros métodos para separación de células incluyen, por ejemplo,
selección y separación usando técnicas de afinidad, incluyendo las
técnicas que usan soportes sólidos tales como placas, perlas y
columnas.
Algunos métodos para separación de células
utilizan separaciones magnéticas y algunos de estos métodos
utilizan perlas magnéticas. Están disponibles diferentes perlas
magnéticas a partir de varias fuentes, incluyendo por ejemplo,
Dynal (Noruega), Advanced Magnetics (Cambridge, MA, Estados
Unidos), Immuncon (Philadelphia, Estados Unidos), Immunotec
(Marseilles, Francia) y Miltenyi Biotec GmbH (Alemania).
Los métodos de marcaje magnético preferidos
incluyen partículas superparamagnéticas coloidales en un intervalo
de tamaño de 5 a 200 nm, preferiblemente en un tamaño de 10 a 100
nm. Estas partículas magnéticas permiten un marcaje magnético
cuantitativo de células, por lo tanto, la cantidad de marcador
magnético acoplado es proporcional a la cantidad de producto unido,
y los métodos de separación magnéticas son sensibles a diferentes
cantidades de secreción de producto. Se conocen en la técnica
partículas coloidales con diversas especificidades y están
disponibles, por ejemplo, a través de Miltenyi Biotec GmbH. El uso
de liposomas fluorescentes o magnéticos inmunoespecíficos también
puede usarse para el marcaje cuantitativo de producto capturado. En
estos casos, los liposomas contienen material magnético y/o
colorantes fluorescentes conjugados con anticuerpo en sus
superficies y se usa la separación magnética para permitir una
separación óptima entre células no productoras, bajas productoras y
altas
productoras.
productoras.
La separación magnética puede conseguirse con
alta eficacia por combinación de una segunda fuerza con la fuerza
magnética de atracción, provocando una separación basada en las
diferentes intensidades de las dos fuerzas opuestas. Son fuerzas
opuestas típicas, por ejemplo, fuerzas inducidas por fluidos
magnéticos mezclados en el medio de separación en la cámara de
separación magnética, gravedad y fuerzas de viscosidad inducidas por
velocidad de flujo del medio respecto a la célula. Se usará
cualquier método de separación magnética, preferiblemente métodos
de separación magnética que permitan una separación cuantitativa.
También se contempla que puedan combinarse diferentes métodos de
separación, por ejemplo, la separación magnética de células puede
combinarse con FACS para aumentar la calidad de la separación o
para permitir la separación por múltiples parámetros.
Las técnicas preferidas incluyen separación
magnética de alto gradiente (HGMS), un procedimiento para retener
de forma selectiva materiales magnéticos en una cámara o columna
dispuesta en un campo magnético. En una aplicación de esta técnica
el producto se marca por unión del mismo a una partícula magnética.
La unión es generalmente a través de la asociación del producto con
un resto marcador que se conjuga con un recubrimiento sobre la
partícula magnética que proporciona un grupo funcional para la
conjugación. El producto capturado acoplado de este modo a un
"marcador" magnético se suspende en un fluido que después se
aplica a la cámara. En presencia de un gradiente magnético
suministrado a través de la cámara, la célula diana marcada
magnéticamente queda retenida en la cámara; si la cámara contiene
una matriz, se asocia con la matriz. Las células que no tienen o que
sólo tienen una baja cantidad de marcadores magnéticos pasan a
través de la cámara.
Las células retenidas pueden eluirse después por
modificación de la intensidad de, o por eliminación del campo
magnético o por introducción de un fluido magnético. La
selectividad por un producto capturado se suministra por el resto
marcador conjugado directamente o indirectamente con la partícula
magnética o mediante el uso de un anticuerpo primario y una
partícula magnética que reconozca el anticuerpo primario. La cámara
a través de la que se aplica el campo magnético se proporciona con
frecuencia con una matriz de un material de susceptibilidad
magnética adecuada para inducir un alto gradiente de campo
magnético localmente en la cámara en volúmenes próximos a la
superficie de la matriz. Esto permite la retención de partículas
bastante débilmente magnetizadas. Se conocen en la técnica
publicaciones que describen una diversidad de sistemas de HGMS e
incluyen, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.452.773,
Patente de Estados Unidos 4.230.685; Solicitud PCT WO 85/04330,
Patente de Estados Unidos Nº 4.770.183 y documento PCT/EP89/01602;
también se describen sistemas en las Patentes de Estados Unidos Nº
5.411.863; 5.543.289; 5.385.707 y 5.693.539, que son de propiedad
común y que por la presente se incorporan en este documento como
referencia.
Además, en otras realizaciones los procesos
incluyen el marcaje de las células que contienen el producto
capturado por el resto de captura si existe. Otras realizaciones
también pueden incluir analizar la población celular para detectar
células marcadas si existen y, si se desea, separar las células
marcadas si existen.
La presente invención proporciona además métodos
de diagnóstico para detectar células T específicas de antígeno.
Estos incluyen métodos para analizar una población de células
enriquecida para células T para identificar o numerar células T
específicas de antígeno, así como métodos de determinación de la
distribución de células T específicas de antígeno que secretan un
producto en respuesta a la estimulación antigénica.
Los métodos para analizar una población de
células enriquecida en células T para identificar o enumerar
células T específicas de antígeno que secretan y liberan una
cantidad de producto respecto a otras células en la población, en
los que el producto se secreta y se libera en respuesta a una
estimulación antigénica, comprenden las etapas de marcar las células
mediante los métodos de la presente invención; marcar las células
con al menos un marcador adicional que no marque el producto
capturado; y detectar la cantidad de marcador de producto respecto
al marcador adicional. Dichos métodos son útiles, por ejemplo, en
la determinación de la proporción de una población celular que sea
específica para un antígeno dado. El método puede usarse para
proporcionar información respecto al estado inmune de un individuo,
incluyendo evaluar una respuesta inmune a alergenos, un tumor o
virus, o evaluar la proporción de células en un individuo que son
autorreactivas para detectar o controlar enfermedades
autoinmunes.
La presente invención proporciona métodos de
tratamiento de una enfermedad o afección relacionada con una
población de células T específicas de antígeno, usando las células
T enriquecidas de la invención.
Los métodos de tratamiento incluyen aquellos en
los que una población de células T específicas de antígeno se
identifica, se enriquece y se introduce en un individuo; aquellos
en los que una población de células T específicas de antígeno se
identifica, se enriquece y se expande in vitro antes de la
introducción en un individuo; aquellos en los que una población de
células T específicas de antígeno se identifica y se elimina de una
población de células que se va introducir en un individuo; la
modificación genética ex vivo previa a la administración; y
la selección de células T específicas de antígeno seleccionadas de
acuerdo con la expresión de citoquinas. Los ejemplos de células T
específicas de antígeno seleccionadas de acuerdo con la expresión
de citoquinas incluyen, pero sin limitación, células T CD8^{+}
secretoras de IFN-\gamma o
TNF-\alpha (citotóxicas) para el tratamiento de
cáncer, infecciones víricas (por ejemplo CMV, EBV) y bacterianas
(por ejemplo, listeria, micobacterias); células T CD4^{+}
secretoras de IFN-\gamma para las mismas
indicaciones y también para la supresión y/o contrarregulación de
alergia o vacunación contra alergia, supresión de enfermedades
autoinmunes asociadas con TH2 o vacunación contra estas
enfermedades autoinmunes; células T CD4^{+} secretoras de
IL-10 o TGF-beta para la supresión
de enfermedades autoinmunes asociadas a TH1, pero también a TH2, o
vacunación contra enfermedades autoinmunes (inducción de
tolerancia); células T CD4^{+} secretoras de IL-4
para la supresión de enfermedades autoinmunes asociadas con TH1 o
vacunación contra estas enfermedades autoinmunes; y células T
CD4^{+} secretoras de IL-4 e IL-5
para el tratamiento de infecciones por helmintos.
Pueden usarse poblaciones de células T
enriquecidas de acuerdo con los métodos de la presente invención
para tratar una diversidad de trastornos. Entre ellos se incluye el
cáncer. Pueden obtenerse células T específicas para un antígeno
tumoral usando los métodos de la presente invención. Pueden
obtenerse células tumorales a partir de un individuo y estas pueden
cocultivarse in vitro con células T obtenidas del mismo
individuo. Después del cocultivo de las células durante un tiempo
adecuado, pueden enriquecerse células específicas de tumor de
acuerdo con los métodos de la presente invención. Después, esta
población enriquecida puede reintroducirse en el paciente. Se
conocen en las técnicas métodos para inmunoterapia antitumoral
usando células T autólogas. Véase, por ejemplo, el documento WO
97/05239.
Como alternativa, las células usadas en
tratamientos de inmunoterapia antitumoral pueden ser alogénicas. Se
han descrito en la técnica diversos modos de tratamiento del cáncer
con células T alogénicas y pueden usarse en los métodos de la
presente invención. Véase, por ejemplo, la Publicación PCT Nº WO
96/37208. Opcionalmente, pueden activarse células T alogénicas antes
de la introducción en un individuo. La activación puede efectuarse
por contacto con un modificador biológico, un anticuerpo dirigido
contra un marcador de superficie celular o un ligando o análogo del
mismo para un receptor de superficie celular.
Otro uso de poblaciones de células T
enriquecidas de la presente invención es en la inmunomodulación,
por ejemplo, en el tratamiento de trastornos autoinmunes,
trastornos inflamatorios, alergias e hipersensibilidades tales como
hipersensibilidad de tipo retardado e hipersensibilidad de contacto.
Las células T que son capaces de destruir o suprimir la actividad
de células autorreactivas pueden enriquecerse in vitro,
opcionalmente expandirse in vitro y después reintroducirse
en un paciente. En el tratamiento de respuestas alérgicas, puede
alterarse la proporción de células TH1 o TH2 o pueden enriquecerse
células reactivas contra células específicas de alergeno e
introducirse en un individuo.
También puede usarse la inducción de anergia de
células T para tratar, mejorar o prevenir el rechazo de aloinjertos
mejorando de este modo los resultados del trasplante de órganos y
aumentando el intervalo de histotipos con el que puede hacerse
histocompatible un paciente.
Las composiciones que comprenden poblaciones de
células T enriquecidas pueden usarse adicionalmente como vacunas,
para prevenir o reducir sustancialmente la probabilidad de la
aparición de una patología tal como una infección vírica, trastorno
autoinmune, respuesta alérgica, cáncer u otro trastorno o reducir
la gravedad o la duración de la enfermedad si se infecta o sufre
posteriormente la enfermedad.
Las composiciones de células pueden
administrarse por cualquier vía conocida, incluyendo, pero sin
limitación, por vía intravenosa, parenteral o local. En los métodos
de tratamiento de la presente invención, se administran células T
enriquecidas a un individuo. El número total de células, el número
de dosis y el número de células por dosis dependerá de la afección
que se trate. Generalmente, se administran de aproximadamente
10^{6} a 10^{11} células en un volumen que varía de
aproximadamente 5 ml a 1 litro. Las células pueden administrarse en
una sola dosis o en varias dosis a lo largo de intervalos de tiempo
seleccionados. De las células que se administran, preferiblemente al
menos aproximadamente el 10%, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 20%, más preferiblemente al menos aproximadamente
el 50%, son células T específicas de antígeno que secretan un
producto.
Se contempla que los reactivos usados en la
detección de células secretoras de productos deseados pueden
envasarse en forma de kits por comodidad. Los kits contendrán, por
ejemplo, opcionalmente uno o más materiales para el uso en la
preparación de un medio de cultivo celular gelatinoso, el medio que
se va a usar para la incubación celular para la producción del
producto secretado deseado; un sistema de captura de producto
compuesto por restos de anclaje y de captura; un resto marcador; e
instrucciones para el uso de los reactivos. Todos los reactivos se
envasarían en recipientes apropiados.
El kit también puede formularse para incluir lo
siguiente. En este caso, todos los reactivos se colocan
preferiblemente en un solo vial al que se añaden las células. Al
menos un anticuerpo que es biespecífico para una estructura de
superficie celular particular o un resto de anclaje y el producto.
Al menos un resto marcador y, opcionalmente, modificadores
biológicos.
Opcionalmente, el kit puede incluir un tampón
fisiológicamente aceptable. Se conocen en la técnica dichos
tampones e incluyen, pero sin limitación, PBS con y sin BSA,
solución salina isotónica, medios de cultivo celular y cualquier
medio especial requerido por el tipo celular particular. Pueden
usarse tampones que reducen el marcaje cruzado y aumentan la
concentración local de producto alrededor de las células. Los
tampones pueden incluir agentes para aumentar la viscosidad o
disminuir la permeabilidad. Se describen en este documento agentes
adecuados. La viscosidad del medio puede reducirse antes del
análisis por cualquier método conocido en la técnica incluyendo,
pero sin limitación, disolución en tampón fisiológicamente
aceptable, calor de disolución, EDTA y enzimas. En ausencia de medio
añadido, las células ya suspendidas en un medio pueden añadirse
directamente al vial. Las suspensiones de células adecuadas
incluyen, pero sin limitación líneas celulares y muestras
biológicas. Las muestras biológicas incluyen, pero sin limitación,
sangre, orina y plasma.
Pueden añadirse estructuras adicionales para
inmovilizar producto no unido para reducir la contaminación cruzada
de células, reduciendo de este modo la difusión de productos lejos
de las células productoras. Estos incluyen, pero sin limitación,
anticuerpo anti-producto inmovilizado en elementos
de gel, perlas, perlas magnéticas y polímeros.
También pueden añadirse modificares biológicos
al tampón o medio para inducir una secreción específica.
También pueden estar presentes restos marcadores
adicionales tales como anticuerpos (magnéticamente o
fluorescentemente marcados) incluyendo, pero sin limitación,
anticuerpos anti-marcador de superficie celular
para identificar tipos celulares, yoduro de propidio para marcar
células muertas y perlas magnéticas para marcar ciertos tipos
celulares.
En esta realización, todos los materiales pueden
ponerse en un solo recipiente tal como un vial y añadirse la
muestra de células. Los contenidos se incuban para permitir la
secreción de un producto y la posterior captura del producto y la
unión del resto marcador al producto. Después, las células que
tienen el producto secretado y unido pueden separarse y/o analizarse
basándose en la presencia, ausencia o cantidad del producto
capturado. La separación puede realizarse por cualquiera de los
métodos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación,
dilución simple, tisis de eritrocitos, etapa de
centrifugación-lavado, separación magnética, FACS y
separación en Ficoll. El análisis de las células puede realizarse
por una diversidad de métodos, incluyendo, pero sin limitación,
FAGS, análisis por imagen, marcaje citológico e inmunoensayo.
Los siguientes ejemplos se proporcionan
solamente con fines ilustrativos y no para limitar el alcance de la
invención. A la luz de la presente descripción, serán evidentes
numerosas realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones
para los especialistas en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se cultivaron células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) en RPMI 1640 completo (Gibco BRL, Grand Island,
NY) que contenía penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml,
glutamina 0,3 mg/ml, 2-mercaptoetanol 10 mM y suero
humano tipo AB al 10% (Sigma, St. Louis, MO) a una concentración de
células de 2 x 10^{6} células/ml. Se añadió péptido Ml-
58-66 de proteína de la matriz del virus influenza
(GILGFVFTL; Neosystem, Strasbourg, Francia) a una concentración
final de 1 \muM. Se cultivaron células de control sin
péptido.
Se incubaron las células a 37ºC en una atmósfera
que contenía CO_{2} al 7,5%. Después de 5 horas y 30 minutos, las
células se recogieron por centrifugación. Las células se incubaron
a una concentración celular de 5 x 10^{7} células/ml en RPMI 1640
completo con anticuerpo monoclonal (mAb)
anti-interferón gamma humano
(IFN-\gamma) 4SB3 conjugado con mAb
anti-CD45 humano 5B1 (30 \mug/ml) a 8ºC durante 7
minutos. Después, las células se diluyeron a 2 x 10^{6}
células/ml con RPMI 1640 completo que contenía FCS al 10% y se
incubaron durante 45 minutos a 37ºC. Después las células se
sedimentaron y se incubaron con mAb anti-interferón
gamma humano (IFN-\gamma) conjugado con
ficoeritrina (PE) NIB42 (4 \mug/ml) y mAb anti-CD8
marcado con FITC en solución de PBS/BSA/EDTA con BSA al 0,05% y
EDTA 2 mM, durante 10 minutos a 4ºC. Después las células se lavaron
en PBS/BSA/EDTA y se marcaron con mAb de ratón
anti-PE 80-5 conjugado con
MicroBeads (Miltenyi Biotec) en PBS/BSA/EDTA durante 15 minutos a
8ºC. Las células se lavaron y se resuspendieron en 500 \mul de
PBS/BSA/EDTA.
Se enriquecieron las células secretoras de
IFN-\gamma con el sistema de separación magnética
de células MACS. Se pipeteó una suspensión de células marcadas
magnéticamente sobre una columna de separación MiniMACS en una
unidad de separación MiniMACS, la suspensión celular se dejó pasar a
su través y la columna se lavó con 3 x 500 \mul de tampón. El
efluente se recogió como una fracción negativa (N1). La columna se
retiró del separador y se colocó en un tubo adecuado. Se pipeteó 1
ml de tampón en la parte superior de la columna y las células
marcadas magnéticamente se retiraron por lavado abundante usando un
émbolo y se aplicaron a una segunda vuelta de separación
MiniMACS.
MiniMACS.
Las células originales (es decir, antes de la
separación por MACS), fracciones de células negativas (de la
primera así como de la segunda separación por MACS, denominadas N1
y N2, respectivamente) y la fracción de células positivas (P2) de
la segunda separación por MACS se analizaron mediante citometría de
flujo. Se usó el programa informático de búsqueda FACScan y
CELLQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Se excluyeron las
células muertas y residuos celulares de acuerdo con las propiedades
de dispersión y la tinción con yoduro de propidio (PI;
0,3 \mug/ml).
0,3 \mug/ml).
Los resultados se muestran en las Figuras 1
A-P. Aunque las representaciones de puntos
A-H muestran análisis de células de control
cultivadas sin péptido, las representaciones I-P
muestran análisis de células estimuladas con péptido. Las
representaciones de puntos muestran las propiedades de dispersión
de la población celular de partida (A e I) y las poblaciones
celulares enriquecidas (C y K); y la fluorescencia PI frente a PE de
la población celular de partida (B y J) y la población celular
enriquecida (D y L).
Las representaciones de puntos
E-H y M-P muestran tinción con
anti-CD8-FITC frente a con
anti-IFN-\gamma-PE
de células seleccionadas en la fracción de células original (E y
M), primera negativa (F y N), segunda negativa (G y O) y en la
positiva final (H y P).
Aunque en la población de células de control,
las células CD8^{+} IFN-\gamma^{+} se
enriquecieron hasta el 11% entre células vivas (Figura 1H), en la
población celular estimulada con péptido, las células CD8^{+}
IFN-\gamma^{+} se enriquecieron hasta el 40%
(Figura 1P). A partir de una población de partida de 3,5 x 10^{7}
células de control, se aislaron aproximadamente 600 células
CD8^{+} IFN-\gamma^{+} en comparación con
4100 células CD8^{+} IFN-\gamma^{+} aisladas a
partir de una población de partida de 3,5 x 10^{7} células
estimuladas con péptido.
Las células CD8- teñidas intensamente con
anti-IFN-\gamma marcado con PE
eran células B CD19^{+}, más probablemente células B específicas
para un reactivo de separación, probablemente PE. Estas células se
enriquecieron en la misma medida que las células de control en
comparación con células estimuladas con péptido.
Además, las células CD8^{-} débilmente teñidas
con anti-IFN-\gamma marcado con
PE (como las células CD8^{+} IFN-\gamma^{+})
se enriquecían en la misma medida que las células de control en
comparación con células estimuladas con péptido. Dichas células se
tiñen parcialmente para CD4 y CD56 y por lo tanto más probablemente
son células T auxiliares o células NK que secretan
IFN-\gamma.
Por lo tanto existe un nivel basal de secreción
de IFN-\gamma por células T auxiliares (CD4+),
células T citotóxicas (CD8^{+}) y células NK (CD56^{+}) sin
estimulación específica de antígeno intencionada in vitro que
refleja muy probablemente la secreción de
IFN-\gamma inducida ya in vivo en
respuestas inmunes en curso en el momento de la toma de muestra de
sangre.
Sin embargo, las células CD8^{+} secretoras de
IFN-\gamma^{+} inducidas por estimulación con
el péptido de influenza restringido por HLA clase I MI
58-66 se enriquecían significativamente por encima
de este nivel de fondo; por lo tanto, la mayoría de las células
CD8+ IFN-\gamma^{+} enriquecidas a partir de
células estimuladas con péptido son células T específicas de
péptido. La especificidad de células enriquecidas se confirmó
adicionalmente por tinción para determinar la presencia de
V\beta17 TCR, que es un segmento de receptor de célula T (TCR)
conservado en células T citotóxicas específicas de MI
58-66. Lehner et al. (1995) J. Exp.
Med. 181: 79-91; y Lalvani et al. (1997)
J. Exp. Med. 186: 859-865. Entre las células
IFN-\gamma^{+} aisladas a partir de células
estimuladas con péptido, pero no entre las células
IFN-\gamma^{+} aisladas a partir de células de
control, la mayoría expresa V\beta17^{+} TCR.
\newpage
Ejemplo
2
Se cultivaron células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) en RPMI 1640 completo (Gibco BRL, Grand Island,
NY) que contenía penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml,
glutamina 0,3 mg/ml, 2-ME 10 mM y suero humano de
tipo AB al 10% (Sigma, St. Louis, MO) a 2 x 10^{6} células/ml. Se
añadió péptido Ml 58-66 de la proteína de la matriz
del virus influenza (GILGFVFTL; Neosystem, Strasbourg, Francia) a
una concentración final de 1 \muM. Se cultivaron células de
control sin péptido.
Después de 5 horas y 30 minutos las células se
recogieron por centrifugación. Las células se incubaron a 5 x
10^{7} células/ml en RPMI 1640 completo con mAb
anti-IFN-\gamma humano 4SB3
conjugado con mAb anti-CD45 humano 5B1 (30
\mug/ml) a 8ºC durante 7 minutos. Después, las células se
diluyeron hasta 2 x 106 células/ml con RPMI 1640 completo que
contenía FCS al 10% y se incubaron durante 45 minutos a 37ºC.
Después, las células se precipitaron por centrifugación y se
incubaron como mAb anti-IFN-\gamma
humano conjugado con ficoeritrina (PE) NIB42 (4 \mug/ml) y
anti-CD8 marcado con FITC en PBS/BSA/EDTA durante
10 minutos a 4ºC. Después las células se lavaron en PBS/BSA/EDTA y
se marcaron con mAb de ratón anti-PE
80-5 conjugado con MicroBeads (Miltenyi Biotec) en
PBS/BSA/EDTA durante 15 minutos a 8ºC. Las células se lavaron y se
suspendieron en 500 \mul de PBS/BSA/EDTA.
Las células secretoras de
IFN-\gamma se enriquecieron con el sistema de
separación magnética de células MACS. Se pipeteó una suspensión de
células marcadas magnéticamente en la parte superior de una columna
de separación MiniMACS en una unidad de separación MiniMACS, la
suspensión celular se dejó pasar a su través y la columna se lavó
con 3 x 500 \mul de tampón. Se recogió el efluente como una
fracción negativa. La columna se retiró del separador y se colocó
en un tubo adecuado. Se pipeteó 1 ml de tampón en la parte superior
de la columna y se retiraron por lavado abundante las células
marcadas magnéticamente usando un émbolo y se aplicaron a una
segunda vuelta de separación por MiniMACS.
Se analizaron células originales (es decir,
antes de la separación por MACS), fracciones de células negativas
(de la primera así como de la segunda separación por MACS) y una
fracción de células positivas de la segunda separación por MACS
mediante citometria de flujo. Se usó un programa de búsqueda
FACScan y CELLQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA) para
análisis citométrico de flujo. Se excluyeron las células muertas y
los residuos celulares de acuerdo con las propiedades de dispersión
y la tinción con yoduro de propidio (PI; 0,3 \mug/ml) como se
muestra en le Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura
2.
Aunque las representaciones de puntos
2A-G muestran análisis de células de control
cultivadas sin péptido, las representaciones 2J-R
muestran análisis de células estimuladas con péptido.
Las representaciones de puntos
2A-D y 2J-M muestran tinción con
anti-CD8 marcado con FITC frente a con
anti-IFN-\gamma marcado con PE de
células seleccionadas en la fracción de células original (A, J),
primera negativa (B, K), segunda negativa (C, L) y en la positiva
final (D, M).
En las células de control se enriquecieron
células CD8^{+} IFN-\gamma^{+} hasta el 8,2%
entre las células vivas (2D), de las células estimuladas con péptido
las células CD8^{+} IFN-\gamma^{+} se
enriquecieron hasta el 41,6% (2M). De las 6,1 x 10^{7} células de
control, se aislaron aproximadamente 1360 células CD8^{+}
IFN-\gamma^{+} en comparación con 11700 células
CD8^{+} IFN-\gamma^{+} de las 6,9 x 10^{7}
células estimuladas con péptido.
Las células CD8^{+} secretoras de
IFN-\gamma^{+} inducidas por estimulación con el
péptido de influenza restringido por HLA clase I MI
58-66 estaban significativamente enriquecidas por
encima de este nivel de fondo; es decir, la mayoría de las células
CD8+ IFN-\gamma^{+} enriquecidas a partir de las
células estimuladas con péptido deben ser células T específicas de
péptido. La especificidad de las células enriquecidas se confirmó
adicionalmente por tinción contra V\beta17 TCR, que es un
segmento de receptor de célula T (TCR) conservado en células T
citotóxicas específicas de MI 58-66 (Lehner 1995
Lalvani 1997). Sólo entre las células
IFN-\gamma^{+} aisladas a partir de células
estimuladas con péptido, pero no entre las células
IFN-\gamma^{+} aisladas a partir de células de
control, la mayoría expresan V\beta17^{+} TCR (2F frente a
2O).
Los siguientes ejemplos muestran que con
estimulación específica de antígeno apropiada, los linfocitos
CD4^{+} y CD8^{+} expresan rápidamente citoquinas. La técnica
se demuestra en este documento para linfocitos T citotóxicos (CTL)
CD8^{+} específicos de péptido 58-66 de la
proteína de la matriz de influenza (FLU) restringida por
HLA-A0201, células T auxiliares tipo 1 (Th1)
específicas de fragmento de virus influenza A y toxina tetánica C
recombinante (rTT.C) y células auxiliares T tipo 2 (Th2)
específicas de toxoide tetánico (TT).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se obtuvieron capas leucoplaquetarias del
Institute for Transfusions medicine, Hospital Merheim, Cologne,
Alemania y, si es necesario, se seleccionaron en base al tipo de
HLA. Se prepararon PBMC mediante centrifugación en gradiente
densidad de Ficoll-Pacque (Pharmacia, Uppsal,
Suecia) convencional, se lavaron dos veces en PBS y se
resuspendieron a una concentración celular de 2 x 10^{6} células
por ml en medio de celular que consistía en RPMI 1640 (Life
Technologies, Paisley, Reino Unido) complementado con suero humano
AB al 10% (p/v) (Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania),
L-alanil-glutamina 1 mM (Life
Technologies), penicilina/estreptomicina 100 U/ml (Life
Technologies), 2-mercaptoetanol 0,05 mM (Life
Technologies) y piruvato sódico 1 mM (Life Technologies). Se
colocaron 12, 5 ml de la suspensión celular en placas de cultivo de
tejidos de 100 x 20 mm (Sarstedt, Newton, MA) y se añadió péptido
FLU 58-66 (Neosystems, Strasbourg, Francia) a una
concentración final de 1 \muM, se añadió preparación de virus
influenza A purificado (Biodesign, Kennebunk, ME) a una
concentración final de \mug/ml, se añadió rTT.C (Boehringer
Mannheim, Mannheim, Alemania) a una concentración final de 7
\mug/ml y se añadió TT purificado (Statens Serum Institut,
Copenhage, Dinamarca) a una concentración final de 1 \mug/ml. Las
células se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 7,5%
humidificada durante 5-10 horas.
Se produjeron conjugados Ab-Ab
dirigidos contra CD45 e IL-4 o
IFN-\gamma mediante técnicas de acoplamiento de
proteínas convencionales. Aslam et al. (1998)
Bioconjugation, Macmillan Referente Ltd., Londres. Después de
la estimulación ex vivo, las células se recogieron usando un
raspador de células desechable (Costar, Cambridge, MA) y se
marcaron durante 7 min a una concentración celular de 10^{8}
células por ml en medio enfriado en hielo con 50 \mug por ml de
los conjugados Ab-Ab. Después, las células se
diluyeron con medio hasta una concentración celular final de 2 x
10^{6} células por ml y se dejó que se secretaran durante 45 min
a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 7,5% humidificada.
Después del periodo de captura de citoquinas,
las células se recogieron de nuevo, se resuspendieron a una
concentración celular de 10^{8} células por ml en solución salina
tamponada con fosfato que contenía albúmina de suero bovino al 0,5%
(p/v) y EDTA 5 mM (tampón) y se tiñeron durante 10 min a +4ºC con
anti-IFN-\gamma-PE
o anti-IL-4-PE 5
\mug/ml, respectivamente. Las células se lavaron con tampón (300
x g, 10 min), se resuspendieron en 400 \mul de tampón y se
marcaron magnéticamente durante 15 min a +4ºC con 100 \mul de Ab
anti-PE-microbeads (Myltenyi Biotec,
Bergisch, Gladbach, Alemania). Después del lavado, las células se
aplicaron sobre una columna MS+ y se colocaron en un imán MiniMACS
(Miltenyi Biotec). La columna se aclaró con tampón y las células
retenidas se eluyeron a partir de la columna después de retirarlas
del campo magnético para conseguir un mayor índice de
enriquecimiento, las células eluidas de la primera columna se
aplicaron a otra columna de MS+ y se repitió la separación
magnética. Las muestras de células se analizaron en un citómetro de
flujo FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) usando el
programa informático CellQuest.
Para la detección, enumeración y fenotipado de
células secretoras de citoquinas, se usaron los siguientes
reactivos:
anti-IFN-\gamma-CD45
(anti-IFN-\gamma, clon 4SB3;
CD45, clon 5B1, W. Knapp, Viena, Austria),
anti-IFN-\gamma-PE
(clon 45-15),
anti-L-4-CD45
(anti-IL-4, clon 1
A-610; CD45, clon 5B1, W. Knapp Viena, Austria),
anti-IL-4-PE (clon
7A3-3), CD8-Cy5 (clon BM135/80,
Behring Diagnostics, Marburg, Alemania), CD4-Cy5
(clon M-T321, Behring), CD4-FITC
(clon SK3, Becton Dickinson), CD27-FITC (clon
M-T217, Pharmingen, San Diego, CA),
CD28-FITC (clon CD28.2, Pharmingen)
CD57-FITC (clon HNK-1, Becton
Dickinson), anti-V\beta17.FITC (clon
E17.5F3.15.13, Coulter-Immunotech, Marseille,
Francia). Meager et al., (1984) Interferon Res. 4:
619-625; Alkan et al., (1994) J.
Immunoassay 15: 217-225; y Bird et al.,
(1991) Cytokine: 3: 562-567.
Se analizó la actividad citotóxica de células
secretoras de citoquinas enriquecidas usando un ensayo basado en
citometria de flujo que se ha descrito previamente. Mattis et
al. (1997) J. Immunol. Met. 204: 135-142.
En resumen, se marcaron 1 x 10^{6} células T2
HLA-A2.1^{+} con 4 \mug por ml del colorante
verde fluorescente DiO (Molecular Probes, Eugene, OR) en solución
salina tamponada con fosfato que contenía EDTA 5 mM y suero fetal de
ternera al 3% durante 45 min a 37ºC. Las células se lavaron tres
veces con tampón, se resuspendieron en medio de cultivo de células
y se cargaron con péptido Flu 58-66 1 \muM o
péptido Melan A/MART 1 27-35 (Bachem, Heidelberg,
Alemania) durante una noche a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al
7,5% humidificada. Se expandieron células secretoras de citoquinas
enriquecidas durante 18 días en cultivos de tejidos en presencia de
IL-2 humana recombinante (Peprotech, Londres, Reino
Unido). Las células secretoras de citoquinas expandidas y células
T2 HLA-A2.1^{+} marcadas con DiO cargadas con
péptido se cocultivaron durante 16 h a una proporción de 1:1 a 37ºC
en una atmósfera de CO_{2} al 7,5% modificada. Después del periodo
de cultivo, las células se recogieron y se analizaron mediante
citometría de flujo. Para permitir la discriminación entre células
T2 marcadas con DiO vivas y muertas, las muestras se contratiñeron
con colorante de exclusión rojo fluorescente yoduro de propidio.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La capacidad para secretar citoquinas efectoras
como IFN-\gamma después de una reestimulación
antigénica a corto plazo con APC estimuladas con péptido sintético
o antígeno nativo es una característica típica de células T
CD4^{+} (tipo Th1) y CD8^{+} de memoria/efectoras. Salmon et
al. (1989) J. Immunol. 143: 907-912; y
Hamaan et al. (1997) 186: 1407-1418. Para
aislar células T CD4^{+} y CD8^{+} específicas de antígeno de
memoria/efectoras de baja frecuencia directamente a partir de
sangre periférica basándose en la secreción inducida por antígeno
de IFN-\gamma y en la tecnología de matriz de
afinidad celular, se estimularon células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) de donantes de sangre adultos sanos del mismo HLA
durante 5-6 h con: (a) el péptido FLU
58-66 restringido por HLA-A0201,
(b) una preparación de virus influenza A purificado y (c) rTT.C.
Después del periodo de estimulación, se generó una matriz de
afinidad para IFN-\gamma en la superficie celular
usando conjugados de anticuerpo (Ab)-Ab dirigidos
contra CD45 e IFN-\gamma y se dejó que las células
secretaran IFN-\gamma en cultivo durante 45 min.
Después, el IFN-\gamma relocalizado en la matriz
de afinidad de las células secretoras se tiñó con Ab específico de
IFN-\gamma conjugado con ficoeritrina (PE) y las
células marcadas con PE se enriquecieron mediante MACS usando
Microbeads con Ab anti-PE. Véase, también Brosterhus
et al. 10^{th} International Congress in Immunology, Nueva
Delhi, India, 1-6 Nov. 1998, págs.
1469-1473.
En comparación con las muestras de control no
estimuladas, una proporción significativamente superior de células
CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma era
detectable después del enriquecimiento en la muestra estimulada con
péptido FLU 58-66 (Figura 3A: 38,3% frente al
13,7%) y eran detectables proporciones significativamente
superiores de células CD4^{+} secretoras de
IFN-\gamma después del enriquecimiento en las
muestras estimuladas con la preparación de virus influenza A
(Figura 3B: 35,5% frente al 1,1%) y rTT.C (Figura 3C: 6,1% frente al
0,3%), respectivamente. Cuando se observan los números absolutos de
células T secretoras de IFN-\gamma enriquecidas y
sus frecuencias entre PBMC totales, son incluso más notables las
diferencias entre las muestras estimuladas y no estimuladas: (a) se
aislaron 12.500 células T CD8^{+} secretoras de
IFN-\gamma a partir de 5,3 x 10^{7} PBMC
estimuladas con péptido FLU 58-66 (frecuencia de 1
en 4.200) y se aislaron 1370 células T CD8^{+} secretoras de
IFN-\gamma a partir de 5,1 x 10^{7} PBMC no
estimuladas (frecuencia: 1 en 37.000); (b) se aislaron 351 células
T CD4^{+} secretoras de IFN-\gamma a partir de 5
x 10^{6} PBMC estimuladas con virus influenza A (frecuencia de 1
en 14.000) y se aislaron 4 células T CD4^{+} secretoras de
IFN-\gamma a partir de 5,0 x 10^{6} PBMC no
estimuladas (frecuencia de 1 en 1.250.000); y (c) se aislaron 132
células T CD4^{+} secretoras de IFN-\gamma a
partir de 1,8 x 10^{7} PBMC estimuladas con rTT.C (frecuencia: 1
en 136.000) y se aislaron 7 células CD4^{+} secretoras de
IFN-\gamma a partir de 1,9 x 10^{7} PBMC no
estimuladas (frecuencia: \sim1 en 2.710.000). Considerando estos
resultados experimentales, es evidente que pueden detectarse con
esta técnica células T secretoras de IFN-\gamma
presentes a frecuencias por debajo>> de 10^{-6}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Células T CD8^{+} de tipo tanto de memoria
como efectoras eran capaces de secretar
IFN-\gamma. Hamann et al. (1997). Para
determinar el fenotipo de células T CD8^{+} específicas de
péptido FLU 58-66, se analizaron células T CD8^{+}
secretoras de IFN-\gamma enriquecidas a partir de
la muestra estimulada con péptido FLU 58-66 y la
muestra se control se analizó mediante inmunofluorescencia de tres
colores para determinar la expresión de un panel de marcadores de
superficie de leucocitos que permite distinguir entre células T
CD8^{+} de tipo memoria y efectoras. Hamann et al. Como se
muestra en la Figura 2, la mayoría de las células T CD8^{+}
específicas de péptido FLU 58-66 eran (1997)
CD27^{+}, CD28^{+} y CD57^{-}, lo que concuerda con una
fenotipo de memoria, mientras que la mayoría de las CD8^{+}
secretoras de IFN-\gamma que se habían aislado
independientemente del péptido FLU 58-66 eran
CD27^{-}, CD28^{-}, CD57^{+}, lo que concuerda con un
fenotipo efector. Estas últimas podían haberse inducido in
vivo para secretar IFN-\gamma y por lo tanto
podrían reflejar respuestas inmunes en curso.
Más del 54,8% de las células T CD8^{+}
secretoras de IFN-\gamma de la muestra estimulada
con péptido FLU 58-66 expresaban la cadena
V\beta17 TCR en comparación con menos del 2,2% de las células T
CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma de la muestra
de control (Figura 4). Esto confirma los informes previos que
muestran un sesgo de células T CD8^{+} específicas de péptido FLU
58-66 se han restringidas por
HLA-A0201 hacia el uso de cadena de V\beta17 TCR,
primero en CTL clonados y después, usando tetrámeros fluorescentes
de moléculas HLA-A2.1 cargadas con péptido FLU
58-66, también en PBMC. Lehner et al. (1995)
J. Exp. Med. 181: 79-91; y Dunbar et
al. (1998).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Para confirmar adicionalmente la especificidad
de las células T CD8^{+} secretoras de
IFN-\gamma enriquecidas a partir de las PBMC
estimuladas con péptido FLU 58-66 y para estudiar
su actividad citolítica, las células se expandieron durante 18 días
en cultivos de tejidos en presencia de IL-2 y
después se ensayaron para determinar la actividad de CTL a una
proporción de efector:diana de 1:1. Como se muestra en la Figura 5,
se observó una destrucción significativa cuando las células diana
se cargaron con péptido FLU 58-66 pero no cuando
las células diana se cargaron con un péptido de control (Melan
A/MART 1 27-35).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se cultivaron PBMC de 49 individuos
HLA-A2+ con o sin el péptido FLU
58-66 y se sometieron al procedimiento de
enriquecimiento para células secretoras de
IFN-\gamma como se describe en el Ejemplo 3. En 45
casos, se aislaron de media aproximadamente 80 veces más células T
CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma a partir de la
muestra estimulada con péptido FLU 58-66 en
comparación con la muestra de control. Sólo en tres casos, no se
detectaron diferencias significativas entre ambas muestras. La
frecuencia mediana de células T CD8^{+} específicas de péptido FLU
58-66 entre PBMC, según se determinó por resta de
las frecuencias de las muestras de control de las frecuencias de las
muestras estimuladas con péptido FLU 58-66, era de
1 en 30.000 (intervalo entre 1 en 600.000 y 1 en 1000). Estos
resultados concuerdan completamente con los informes previos en los
que las frecuencias de células T CD8+ específicas de péptido FLU
58-66 se determinaron usando inmunoensayos ligados
a enzimas en manchas (ELISPOT) para liberación de
IFN-\gamma de una sola célula o tetrámeros de
moléculas HLA-A2.1 cargadas con péptido
FLU-58-56. Lalvani et al.
(1997) y Dunbar et al. (1998).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Para demostrar que esta estrategia aísla células
T CD4^{+} tipo Th2 específicas de antígeno vivas, se estimularon
PBMC con TT purificado y células T CD4^{+} secretoras de
IL-4. Se aislaron células usando un conjugado
Ab-Ab dirigido contra CD45 e IL-4.
Después de 10 h de estimulación con TT, podían aislarse 150 células
T CD4^{+} secretoras de IL-4 a partir de 2,2 x
10^{7} PMBC con una pureza del 6,89% (Figura 6). Esto se
corresponde con una frecuencia de células Th2 específicas de TT
entre células T CD4^{+} totales de 1 en 94.000. La frecuencia de
células T CD4^{+} secretoras de IL-4 en el cultivo
de control sin TT era de aproximadamente 10 veces inferior.
Claims (19)
1. Un método de marcaje de células T específicas
de antígeno con un producto secretado y liberado por las células,
en el que el producto se secreta en respuesta a estimulación
antigénica, comprendiendo dicho método:
(a) exponer una población mixta de células que
comprenden células T a al menos un antígeno en condiciones eficaces
para generar una estimulación específica de antígeno de al menos
una célula T y permitir la expresión de al menos un producto por la
célula T estimulada, en el que el producto se secreta en respuesta
a la estimulación antigénica;
(b) modificar la superficie de las células para
que contenga un resto de captura específico para el producto de
modo que el resto de captura se acople a la superficie celular,
(c) cultivar la población en condiciones en las
que el producto se secreta, se libera y se une específicamente al
resto de captura, marcando de este modo las células secretoras de
producto; y
en el que las etapas (a) y (b) pueden realizarse
en cualquier orden.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el resto de captura es un anticuerpo o es un fragmento de
unión a antígeno de un anticuerpo.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
2 ó 3, en el que resto de captura se acopla a la superficie de las
células mediante:
(a) un anclaje lipídico unido al resto de
captura opcionalmente a través de un resto de enlace;
(b) un anticuerpo o fragmento de unión a
antígeno del mismo unido al resto de captura, opcionalmente a
través de un enlazador;
(c) acoplamiento químico directo del resto de
captura con componentes en la superficie celular, opcionalmente a
través de un enlazador; o
(d) unión especifica del anticuerpo a la
célula.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, 2 ó 3, en el que la superficie de las células se modifica en la
etapa (b) por combinación de las células con al menos un anticuerpo
biespecífico que tiene sitios de combinación específicos para una
molécula de superficie celular y el producto.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación
5, en el que la molécula de superficie celular es CD2, CD3, CD4,
CD5, CD8, CD11b, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD38, CD40L,
CD45RO, CD45RA, LAG3, TI/ST2, SLAM, una molécula de MHC Clase I,
molécula de MHC Clase II; receptor de antígeno de célula T o
\beta_{2}-microglobulina.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
a 6, que comprende además la etapa de marcar el producto con un
resto marcador.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación
7, en el que el resto marcador es un anticuerpo específico para el
producto.
9. Un método de la reivindicación 7 u 8, en el
que el resto marcador se marca directamente o indirectamente con un
fluoróforo, un isótopo radioactivo, un cromóforo, un resto
magnetizable o comprende partículas magnéticas.
10. Un método de la reivindicación 9, en el que
el resto marcador comprende partículas magnéticas coloidales con un
diámetro de aproximadamente 5 a 200 nm.
11. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que las condiciones de incubación
incluyen un medio de alta viscosidad o formador de gel.
12. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, que comprende además separar las células
de acuerdo con el grado en el que estén marcadas.
13. Un método de la reivindicación 12, en el
que las células se separan de acuerdo con el grado en el que estén
marcadas con el producto por separación celular para obtener una
población de células enriquecidas al menos 50 veces en células T
específicas de antígeno.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación
13, que comprende además la etapa de expandir la población de
células que está enriquecida al menos 50 veces en células T
específicas de antígeno.
15. Una población de células marcadas de
acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11.
16. Una población de células separadas de
acuerdo con el método de la reivindicación 12.
17. Una población de células obtenidas de
acuerdo con el método de la reivindicación 13 ó 14, en el que la
población está enriquecida al menos 50 veces en células T
específicas de antígeno.
18. Una población de células de acuerdo con la
reivindicación 17, para el uso en el tratamiento de un trastorno
autoinmune, rechazo de injertos o una respuesta alérgica.
19. Una población de células de acuerdo con la
reivindicación 17, para el uso en el tratamiento del cáncer o de
una infección.
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