ES2328441A1 - Procedure for the quantitative determination of desmopressin in organic fluids (Machine-translation by Google Translate, not legally binding) - Google Patents
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Abstract
Description
Procedimiento para la determinación cuantitativa de desmopresina en fluidos orgánicos.Procedure for quantitative determination of desmopressin in organic fluids.
Procedimiento para la rápida determinación del contenido de desmopresina en fluidos orgánicos mediante valoración colorimétrica.Procedure for the rapid determination of Desmopressin content in organic fluids by titration colorimetric
La 1-desamino-8-D-arginina-vasopresina o desmopresina, abreviada a dDAVP, es un péptido de uso farmacológico con estructura similar a la hormona humana vasopresina. La desmopresina se utiliza como medicamento de forma habitual en el tratamiento contra la enuresis o incontinencia de orina. También se utiliza en otros tratamientos, como por ejemplo, en ciertos tipos específicos de diabetes mellitus, o en condiciones producidas después de un traumatismo craneoencefálico o de cirugía en la glándula pituitaria, o bien para controlar la sensación de sed excesiva, o la deshidratación provocadas por lesiones, cirugías y ciertos trastornos médicos. Su administración se hace bajo la forma del trihidrato del acetato de desmopresina y la presentación galénica es variada: comprimidos, inyectables, nebulizador, o solución intranasal.The 1-desamino-8-D-arginine-vasopressin or desmopressin, abbreviated to dDAVP, is a peptide of use Pharmacological structure similar to the human hormone vasopressin Desmopressin is used as a medicine habitual in the treatment against enuresis or incontinence of urine. It is also used in other treatments, such as in certain specific types of diabetes mellitus, or in conditions produced after a head injury or surgery in the pituitary gland, or to control the sensation of excessive thirst, or dehydration caused by injuries, surgeries and certain medical disorders. Its administration is done under the Desmopressin acetate trihydrate form and presentation Galenic is varied: tablets, injectables, nebulizer, or intranasal solution
La eficacia del tratamiento con desmopresina se encuentra en relación directa con la cantidad de desmopresina libre presente en sangre o plasma del paciente.The efficacy of desmopressin treatment is found in direct relation to the amount of free desmopressin present in the patient's blood or plasma.
Por otro lado, el exceso de desmopresina en el cuerpo produce un cuadro de intoxicación acuosa que en ocasiones puede ser acompañada de hipertensión arterial, convulsiones y coma. No existe antídoto específico. La necesidad de controlar la evolución del tratamiento impone por tanto la obligación de conocer la cantidad de desmopresina en sangre o plasma del paciente continuamente durante dicho tratamiento.On the other hand, the excess desmopressin in the body produces a picture of water intoxication that sometimes It can be accompanied by high blood pressure, seizures and coma. There is no specific antidote. The need to control the evolution of the treatment therefore imposes the obligation to know the amount of desmopressin in the patient's blood or plasma continuously during said treatment.
El estado actual de la técnica provee de medios analíticos cuantitativos para la determinación de desmopresina en los fluidos biológicos, pero esos medios son costosos, lentos y complejos, habiéndose de recurrir a costosas técnicas de cromatografía líquida de alta resolución o radioinmuno ensayo (radioimmune assay, RIA), de coste económico muy elevado.The current state of the art provides the means quantitative analytics for the determination of desmopressin in biological fluids, but those means are expensive, slow and complex, having to resort to expensive techniques of high performance liquid chromatography or radioimmuno assay (radioimmune assay, RIA), of very high economic cost.
Uno de los problemas metodológicos que se plantean a la hora de determinar la desmopresina es que al ser un análogo sintético de la vasopresina que actúa sobre los receptores VI y V2 de la vasopresina con una constante de disociación muy alta (5x10^{-3} M), es decir con baja afinidad, no resulta útil el uso de dichos receptores como ligadores de desmopresina en un sistema ELISA (Enzyme-Linked ImmunoadSorbent Assay), a pesar de las ventajas simplificadoras que el reconocido sistema ELISA, con sus variantes, ofrece en las metodologías de numerosos análisis bioquímicos.One of the methodological problems that pose when determining desmopressin is that being a synthetic analogue of vasopressin that acts on receptors VI and V2 of vasopressin with a very high dissociation constant (5x10 -3 M), that is to say with low affinity, the use is not useful of said receptors as desmopressin linkers in a system ELISA (Enzyme-Linked ImmunoadSorbent Assay), to despite the simplifying advantages that the recognized system ELISA, with its variants, offers in the methodologies of numerous biochemical analysis
Otro de los problemas que se plantean a la hora de determinar desmopresina es que, al ser la molécula de desmopresina de tamaño comparativamente pequeño mientras que las moléculas de los anticuerpos habituales usados en las metódicas analíticas son comparativamente grandes, se hace inseguro que una misma molécula de desmopresina pueda estar unida simultáneamente a dos de estos anticuerpos, pues el volumen del primero de los dos puede estar impidiendo con cierta eficacia que el segundo se acerque lo suficiente hasta establecer el nuevo enlace. Por tanto, en el estado actual de la técnica tampoco existe un sistema ELISA de tipo sándwich fiable para la determinación cuantitativa de la desmopresina.Another problem that arises at the time to determine desmopressin is that, being the molecule of comparatively small size desmopressin while the usual antibody molecules used in methodics analytics are comparatively large, it becomes insecure that a same desmopressin molecule can be simultaneously bound to two of these antibodies, because the volume of the first of the two it may be preventing with some efficiency that the second one approaches enough to establish the new link. Therefore, in the current state of the art there is also no type ELISA system reliable sandwich for quantitative determination of the desmopressin
Existe una metodología ELISA en la que, recubriendo con la molécula de desmopresina y poniendo un anticuerpo específico marcado, se detecta cualitativamente si hay desmopresina fijada en la placa. Este ensayo no es útil para cuantificar la desmopresina exógena, ya que normalmente ésta no está pura y porque se recubre la placa con un exceso de desmopresina que al desprenderse de ésta, introduce un "ruido de fondo" en el ensayo que lo inutiliza a tal fin.There is an ELISA methodology in which, coating with the desmopressin molecule and putting a specific labeled antibody, is detected qualitatively if there is desmopressin fixed on the plate. This essay is not useful for quantify exogenous desmopressin, since normally it does not it is pure and because the plate is coated with an excess of desmopressin that when it detaches from it, introduces a "noise of background "in the essay that makes it useless for that purpose.
El presente objeto de invención resuelve las complejidades y problemas actuales en el sistema ELISA para la determinación cuantitativa de la desmopresina recurriendo a los siguientes pasos o fases:The present object of the invention resolves the complexities and current problems in the ELISA system for quantitative determination of desmopressin using the following steps or phases:
- a) to)
- la derivatización de una desmopresina de referencia mediante la incorporación de un brazo espaciador y la purificación de la desmopresina derivatizada mediante cromatografía líquida de alta presión.derivatization of a reference desmopressin by incorporating a spacer arm and purification of derivatized desmopressin by liquid chromatography of high pressure.
- b) b)
- la preparación de diferentes disoluciones o mezclas de valoración, con cantidades conocidas y diferentes de la desmopresina derivatizada y purificada previamente según la fase a) y de desmopresina libre.the preparation of different solutions or mixtures of valuation, with known and different amounts of the derivatized and previously purified desmopressin according to phase a) and free desmopressin.
- c) C)
- el recubrimiento de una placa ELISA o placa de pocillos con una disolución de un anticuerpo y a continuación con un tampón de bloqueo.the coating of an ELISA plate or plate wells with a solution of an antibody and then with a blocking buffer.
- d) d)
- la colocación en los pocillos de valoración de unos volúmenes determinados del fluido orgánico cuyo contenido en desmopresina se desea cuantificar y otros volúmenes determinados de las disoluciones en cantidad conocida de desmopresina derivatizada y desmopresina libre.placement in the evaluation wells of some determined volumes of the organic fluid whose content in Desmopressin is desired to quantify and other determined volumes of the solutions in known quantity of derivatized desmopressin and free desmopressin.
- e) and)
- la incubación de la placa con los pocillos rellenados a temperatura moderada durante un tiempo y a una temperatura determinados, de forma que la desmopresina libre y la desmopresina derivatizada compiten libremente por unirse al anticuerpo asegurándose que la cantidad de desmopresina derivatizada que se une al anticuerpo en cada pocillo es inversamente proporcional a la cantidad de desmopresina libre presente.incubation of the plate with the wells filled at moderate temperature for a while and at a certain temperature, so that free desmopressin and derivatized desmopressin freely compete to join the antibody making sure that the amount of derivatized desmopressin that binds to the antibody in each well is inversely proportional to the amount of free desmopressin Present.
- f) F)
- el vaciado y lavado de los pocillos para eliminar todos los residuos de la reacción anterior, de forma que en cada pocillo permanecen únicamente las moléculas de desmopresina (tanto derivatizada como no derivatizada) unidas al anticuerpo.emptying and washing the wells to eliminate all residues of the previous reaction, so that in each well only desmopressin molecules remain (both derivatized as not derivatized) bound to the antibody.
- g) g)
- la adición de una disolución conteniendo un nuevo ligando de alta afinidad con algún grupo funcional presente en el brazo espaciador presente en la desmopresina derivatizada y con capacidad de reaccionar posteriormente con un reactivo cromógeno.the addition of a solution containing a new high affinity ligand with some functional group present in the spacer arm present in derivatized desmopressin and with ability to react later with a reagent chromogen
- h) h)
- la incubación subsiguiente de la placa con los pocillos rellenados a temperatura ambiente durante un tiempo determinado durante el que un grupo funcional en el brazo espaciador reacciona con el reactivo cromógeno.subsequent incubation of the plate with the wells filled at room temperature for a while determined during which a functional group in the arm spacer reacts with the chromogen reagent.
- i) i)
- el vaciado y lavado de los pocillos para eliminar todos los residuos de la reacción anterior, de forma que en cada pocillo permanecen únicamente las moléculas del nuevo ligando referenciado en la fase g) encadenadas a la desmopresina derivatizada.emptying and washing the wells to eliminate all residues of the previous reaction, so that in each well only the molecules of the new ligand remain referenced in phase g) chained to desmopressin derivatized
- j) j)
- la adición a cada pocillo de un reactivo cromógeno que genere un color de intensidad proporcional a la desmopresina derivatizada presente en el pocillo.the addition to each well of a chromogenic reagent that generates a color of intensity proportional to desmopressin derivatized present in the well.
- k) k)
- La placa se deja reposar a temperatura ambiente durante un determinado tiempo. Durante este tiempo se genera un color. Finalmente se añade un reactivo para concluir la reacción de color.The plate is allowed to stand at room temperature for a certain time. During this time a color. Finally a reagent is added to conclude the reaction of color.
- l) l)
- la determinación cuantitativa de la concentración de desmopresina en el fluido orgánico mediante la cuantificación en un colorímetro, a una determinada longitud de onda, de las absorbancias medias generadas en los diferentes pocillos en los que se colocaron las muestras de dicho fluido orgánico, para comparar a continuación dichas absorbancias medias con los valores de absorbancia media en una curva debidamente calibrada en cuya abscisa a escala logarítmica se representan unas concentraciones conocidas de desmopresina y en cuya ordenada a escala decimal se representa la absorbancia que corresponde a cada concentración.quantitative determination of the concentration of desmopressin in the organic fluid by quantification in a colorimeter, at a certain wavelength, of the average absorbances generated in the different wells in which Samples of said organic fluid were placed to compare then said average absorbances with the values of average absorbance in a properly calibrated curve in whose abscesses on a logarithmic scale represent concentrations known as desmopressin and whose ordinate scale is represents the absorbance that corresponds to each concentration.
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Esta desmopresina derivatizada según el presente objeto de invención dispone de tres cualidades importantes para asegurar el resultado analítico:This derivatized desmopressin according to the present object of invention has three important qualities for ensure the analytical result:
- 1. one.
- La cinética de reacción de tanto la desmopresina como la de la desmopresina derivatizada es la misma frente a un número de anticuerpos de alta afinidad para la desmopresina. Cualquiera de estos anticuerpos de alta afinidad para la desmopresina será utilizado para retapizar las paredes de los pocillos en las metódicas ELISA previamente tapizadas con una IgG anti IgG.The reaction kinetics of both desmopressin as that of derivatized desmopressin is the same as against a high affinity antibody number for desmopressin. Any of these high affinity antibodies for Desmopressin will be used to reupholster the walls of wells in ELISA methods previously upholstered with an IgG anti IgG.
- 2. 2.
- La distancia espacial entre el grupo funcional de la parte desmopresina que reaccionará con el anticuerpo y el grupo funcional en el brazo espaciador, que intervendrá en la siguiente reacción, se incrementa lo suficiente para que esta reacción siguiente ocurra sin impedimentos estéricos.The spatial distance between the functional group of the desmopressin part that will react with the antibody and the group functional in the spacer arm, which will intervene in the following reaction, is increased enough for this reaction Next occur without steric hindrances.
- 3. 3.
- El grupo funcional que intervendrá en la siguiente reacción tendrá afinidad específica por alguno de los grupos funcionales en el "brazo espaciador". Esta afinidad no existe en la desmopresina sin el brazo espaciador, lo que permite acabar obteniendo los valores cuantitativos deseados.The functional group that will intervene in the following reaction will have specific affinity for any of the groups functional in the "spacer arm". This affinity does not exist in desmopressin without the spacer arm, which allows to finish obtaining the desired quantitative values.
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El procedimiento incluye la preparación de diferentes disoluciones cada una de ellas con una cantidad conocida de desmopresina derivatizada, que mezcladas con cantidades conocidas de desmopresina libre se usarán, después de las reacciones cromógenas oportunas, para trazar una curva calibrada en la que la absobancia o intensidad de color se relaciona con la concentración de desmopresina libre. Estas mezclas de valoración se preparan preferiblemente en un número de pocillos de la placa ELISA. El resto de pocillos de la placa ELISA son utilizados para la valoración cuantitativa del contenido en desmopresina libre en el fluido orgánico.The procedure includes the preparation of different solutions each with a known quantity of derivatized desmopressin, which mixed with amounts known free desmopressin will be used, after the reactions opportune chromogens, to draw a calibrated curve in which the absobance or intensity of color is related to concentration of free desmopressin. These titration mixtures are prepared preferably in a number of wells of the ELISA plate. The rest of wells of the ELISA plate are used for titration Quantitative content of free desmopressin in the fluid organic.
Éstas y otras características de la invención recogidas en las reivindicaciones se comprenderán con mayor facilidad a la vista de la realización preferente que se describe a continuación.These and other features of the invention collected in the claims will be more fully understood ease in view of the preferred embodiment described in continuation.
La superficie interior de las placas de pocillos se recubre de inmunoglobulina G (IgG) policlonal Ab de cabra usando para ello una disolución de dicho anticuerpo.The inner surface of the well plates Coated with goat polyclonal G immunoglobulin G (IgG) using for this a solution of said antibody.
Para evitar la unión no deseada de moléculas al fondo y paredes de la placa se usa un tampón de bloqueo, conteniendo una alta concentración de albúmina bovina. Finalmente los pocillos se lavan con disolución salina.To avoid unwanted binding of molecules to the bottom and walls of the plate a blocking buffer is used, containing a high concentration of bovine albumin. Finally The wells are washed with saline.
La desmopresina se hace reaccionar con el biotinoil-6-amino-n-hexanoil-6-amino-n- hexanoato de N-hidroxi-succinimidilo (C_{26}H_{41}N_{5}O_{7}S, peso molecular 567,70, número CAS 89889-52-1) a pH 6,5-8,5 y temperatura ambiente.Desmopressin is reacted with the biotinoyl-6-amino-n-hexanoyl-6-amino-n- N-hydroxy-succinimidyl hexanoate (C 26 H 41 N 5 O 7 S, molecular weight 567.70, CAS number 89889-52-1) at pH 6.5-8.5 and room temperature.
Posteriormente la desmopresina derivatizada (en este caso desmopresina biotinilada) es purificada mediante cromatografía líquida de alta presión. El producto purificado es usado en el ensayo.Subsequently derivatized desmopressin (in this case biotinylated desmopressin) is purified by high pressure liquid chromatography. The purified product is used in the test
Se preparan seis disoluciones de referencia con desmopresina en concentraciones respectivas de 16.00, 6.40, 2.56, 1.02, 0.40 y 0.00 ng de desmopresina por mililitro.Six reference solutions are prepared with desmopressin in respective concentrations of 16.00, 6.40, 2.56, 1.02, 0.40 and 0.00 ng desmopressin per milliliter.
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Los pasos descritos son secuenciales.The steps described are sequential.
B1.- A los diferentes pocillos de la placa ELISA preparada según los puntos A1 y A2 se añade una cantidad medida de desmopresina biotinilada y otra cantidad medida de anti-desmopresina de oveja.B1.- To the different wells of the ELISA plate prepared according to points A1 and A2 a measured amount of biotinylated desmopressin and another measured amount of sheep anti-desmopressin.
B2.- A cada tres de estos pocillos se agrega una cantidad medida de cada una de las disoluciones de referencia: 3 pocillos con una cantidad medida de disolución de desmopresina con 16,00 ng/ml, otros tres con 6,40 ng/ml, y así hasta completar un total de 18 pocillos.B2.- To each three of these wells is added one measured quantity of each of the reference solutions: 3 wells with a measured amount of desmopressin solution with 16.00 ng / ml, three others with 6.40 ng / ml, and so on until completing a total of 18 wells.
B3.- A cada tres de los pocillos restantes se agrega una cantidad medida de fluido cuyo contenido en desmopresina libre se desea cuantificar. La cantidad medida varía cada tres pocillos.B3.- Every three of the remaining wells are add a measured amount of fluid whose desmopressin content free you want to quantify. The amount measured varies every three wells.
B4.- La placa se cubre con una película adhesiva y se incuba a 37ºC durante 4 horas.B4.- The plate is covered with an adhesive film and incubate at 37 ° C for 4 hours.
B5.- Los pocillos se vacían y se lavan 4 veces seguidas con una disolución salina. En las paredes de los pocillos han quedado ligadas unas cantidades de desmopresina y de desmopresina biotinilada.B5.- The wells are emptied and washed 4 times followed with a saline solution. In the walls of the wells amounts of desmopressin and of biotinylated desmopressin.
B6.- Los pocillos se llenan con una disolución del ligando streptavidina modificado con peroxidasa de rábano picante (conocido como streptavidina-HRP por el acrónimo de la expresión inglesa horseradish peroxidase).B6.- The wells are filled with a solution of the streptavidin ligand modified with horseradish peroxidase spicy (known as streptavidin-HRP by the acronym for the English expression horseradish peroxidase).
B7.- La placa se cubre con una película adhesiva y se incuba a temperatura ambiente (20-30ºC) durante 30 minutos. Durante la incubación la placa se somete a rotación. Durante este tiempo el grupo funcional oportuno de la biotina modificada reacciona con el grupo funcional oportuno de la streptavidina modificada.B7.- The plate is covered with an adhesive film and incubate at room temperature (20-30 ° C) for 30 minutes. During incubation the plate is subjected to rotation. During this time the appropriate functional group of biotin modified reacts with the appropriate functional group of the modified streptavidin.
B8.- Los pocillos se vacían y se lavan 4 veces seguidas con una disolución salina. En las paredes de los pocillos han quedado ligadas unas cantidades de desmopresina y de desmopresina biotinilada ligada a streptavidina. Quedará tanta streptavidina como desmopresina biotinilada se había ligado a la IgG policlonal de oveja, ligada a su vez a la IgG de cabra ligada a las paredes de los pocillos.B8.- The wells are emptied and washed 4 times followed with a saline solution. In the walls of the wells amounts of desmopressin and of biotinylated desmopressin linked to streptavidin. There will be so much streptavidin as biotinylated desmopressin had bound to the Polyclonal sheep IgG, in turn linked to goat IgG linked to the walls of the wells.
B9.- Los pocillos se llenan con una disolución acuosa del clorhidrato de o-fenilendiamina conteniendo peróxido de hidrógeno al 0,015%. La placa se deja reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Durante este tiempo se genera un color.B9.- The wells are filled with a solution aqueous o-phenylenediamine hydrochloride containing 0.015% hydrogen peroxide. The plate is left stand at room temperature for 15 minutes. During this Time a color is generated.
B10.- Se agrega una disolución de ácido sulfúrico 1 molar para cortar la reacción de color.B10.- An acid solution is added 1 molar sulfuric acid to cut the color reaction.
B11.- En un colorímetro se mide la intensidad de color o absorbancia en cada pocillo a 492 nm.B11.- In a colorimeter the intensity of color or absorbance in each well at 492 nm.
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Se anotan las absorbancias medias (intensidades de color promediadas) para los pocillos conteniendo las disoluciones de referencia, que contienen concentraciones conocidas de desmopresina, representando las concentraciones de desmopresina en la abscisa a escala logarítmica y las absorbancias en la ordenada a escala decimal. Así se dispone de la conveniente curva calibrada.The average absorbances are recorded (intensities averaged color) for wells containing reference solutions, containing known concentrations of desmopressin, representing desmopressin concentrations in the logarithmic scale abscissa and the absorbances in the ordered in decimal scale. Thus the convenient curve is available calibrated.
Se anotan las absorbancias medias para los pocillos conteniendo las disoluciones cuya concentración en desmopresina se desea cuantificar. Proyectando sobre la curva calibrada según el párrafo anterior la absorbancia media medida para cada trío de pocillos, se podrá leer en la abscisa la concentración correspondiente. Conociendo los volúmenes implicados en cada trío de pocillos se calculará la concentración de desmopresina en el fluido orgánico a cuantificar.The mean absorbances for the wells containing the solutions whose concentration in Desmopressin is desired to quantify. Projecting on the curve calibrated according to the previous paragraph the average absorbance measured for each trio of wells, the abscissa can be read corresponding concentration. Knowing the volumes involved in each trio of wells the concentration of desmopressin in the organic fluid to be quantified.
Una curva calibrada típica y sus valores, calculados según este procedimiento, tienen el aspecto siguiente:A typical calibrated curve and its values, calculated according to this procedure, they look next:
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El límite de detección de desmopresina según el presente procedimiento corresponde a 0,2 ng/ml.The limit of detection of desmopressin according to This procedure corresponds to 0.2 ng / ml.
Claims (10)
- a) to)
- la derivatización de una desmopresina de referencia mediante la incorporación de un brazo espaciador y la purificación de la desmopresina derivatizada mediante cromatografía líquida de alta presión.derivatization of a reference desmopressin by incorporating a spacer arm and purification of derivatized desmopressin by liquid chromatography of high pressure.
- b) b)
- la preparación de diferentes disoluciones o mezclas de valoración, con cantidades conocidas y diferentes de la desmopresina derivatizada y purificada previamente según la fase a) y de desmopresina libre.the preparation of different solutions or mixtures of valuation, with known and different amounts of the derivatized and previously purified desmopressin according to phase a) and free desmopressin.
- c) C)
- el recubrimiento de una placa ELISA o placa de pocillos con una disolución de un anticuerpo y a continuación con un tampón de bloqueo.the coating of an ELISA plate or plate wells with a solution of an antibody and then with a blocking buffer.
- d) d)
- la colocación en los pocillos de valoración de unos volúmenes determinados del fluido orgánico cuyo contenido en desmopresina se desea cuantificar y otros volúmenes determinados de las disoluciones en cantidad conocida de desmopresina derivatizada y de desmopresina libre.placement in the evaluation wells of some determined volumes of the organic fluid whose content in Desmopressin is desired to quantify and other determined volumes of the solutions in known quantity of derivatized desmopressin and free desmopressin.
- e) and)
- la incubación de la placa con los pocillos rellenados a temperatura moderada durante un tiempo y a una temperatura determinados, de forma que la desmopresina libre y la desmopresina derivatizada compiten libremente por unirse al anticuerpo asegurándose que la cantidad de desmopresina derivatizada que se une al anticuerpo en cada pocillo es inversamente proporcional a la cantidad de desmopresina libre presente.incubation of the plate with the wells filled at moderate temperature for a while and at a certain temperature, so that free desmopressin and derivatized desmopressin freely compete to join the antibody making sure that the amount of desmopressin derivatized that binds to the antibody in each well is inversely proportional to the amount of free desmopressin Present.
- f)F)
- el vaciado y lavado de los pocillos para eliminar todos los residuos de la reacción anterior, de forma que en cada pocillo permanecen únicamente las moléculas de desmopresina (tanto derivatizada como no derivatizada) unidas al anticuerpo).emptying and washing the wells to eliminate all residues of the previous reaction, so that in each well only desmopressin molecules remain (both derivatized as not derivatized) linked to antibody).
- g) g)
- la adición de una disolución conteniendo un nuevo ligando de alta afinidad con algún grupo funcional presente en el brazo espaciador presente en la desmopresina derivatizada y con capacidad de reaccionar posteriormente con un reactivo cromógeno.the addition of a solution containing a new high affinity ligand with some functional group present in the spacer arm present in derivatized desmopressin and with ability to react later with a reagent chromogen
- h) h)
- la incubación subsiguiente de la placa con los pocillos rellenados a temperatura ambiente durante un tiempo determinado durante el que un grupo funcional en el brazo espaciador reacciona con el reactivo cromógeno.subsequent incubation of the plate with the wells filled at room temperature for a while determined during which a functional group in the arm spacer reacts with the chromogen reagent.
- i) i)
- el vaciado y lavado de los pocillos para eliminar todos los residuos de la reacción anterior, de forma que en cada pocillo permanecen únicamente las moléculas del nuevo ligando referenciado en la fase g) encadenadas a la desmopresina derivatizada.emptying and washing the wells to eliminate all residues of the previous reaction, so that in each well only the molecules of the new ligand remain referenced in phase g) chained to desmopressin derivatized
- j) j)
- la adición a cada pocillo de un reactivo cromógeno que genere un color de intensidad proporcional a la desmopresina derivatizada presente en el pocillo.the addition to each well of a chromogenic reagent that generates a color of intensity proportional to desmopressin derivatized present in the well.
- k) k)
- La placa se deja reposar a temperatura ambiente durante un determinado tiempo. Durante este tiempo se genera un color. Finalmente se añade un reactivo para concluir la reacción de color.The plate is allowed to stand at room temperature for a certain time. During this time a color. Finally a reagent is added to conclude the reaction of color.
- l)l)
- la determinación cuantitativa de la concentración de desmopresina en el fluido orgánico mediante la cuantificación en un colorímetro, a una determinada longitud de onda, de las absorbancias medias generadas en los diferentes pocillos en los que se colocaron las muestras de dicho fluido orgánico, para comparar a continuación dichas absorbancias medias con los valores de absorbancia media en una curva debidamente calibrada en la que se representa dicha absorbancia media frente a la concentración de desmopresina libre.quantitative determination of the concentration of desmopressin in the organic fluid by quantification in a colorimeter, at a certain wavelength, of the average absorbances generated in the different wells in which Samples of said organic fluid were placed to compare then said average absorbances with the values of average absorbance in a properly calibrated curve in which represents said average absorbance against the concentration of free desmopressin
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| ES200800178A ES2328441B1 (en) | 2008-01-24 | 2008-01-24 | PROCEDURE FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF DESMOPRESIN IN ORGANIC FLUIDS. |
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| ES200800178A ES2328441B1 (en) | 2008-01-24 | 2008-01-24 | PROCEDURE FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF DESMOPRESIN IN ORGANIC FLUIDS. |
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Family Applications (1)
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| ES200800178A Withdrawn - After Issue ES2328441B1 (en) | 2008-01-24 | 2008-01-24 | PROCEDURE FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF DESMOPRESIN IN ORGANIC FLUIDS. |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| US5521319A (en) * | 1993-01-27 | 1996-05-28 | Huber; Erasmus | Biotinylation reagent and method of use thereof |
-
2008
- 2008-01-24 ES ES200800178A patent/ES2328441B1/en not_active Withdrawn - After Issue
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5521319A (en) * | 1993-01-27 | 1996-05-28 | Huber; Erasmus | Biotinylation reagent and method of use thereof |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MEIKLE, PJ. et al. O-Antigen biotin conjugates. Preparation and use in direct competitive enzyme immunoassays. Journal of Immunological Methods,132(1990) pág.255-261 (ver resumen; pág. 257 "{}Conjugation of biotin and aminated O-polysaccharide"{} and "{}direct EIA"{}) * |
| MEIKLE, PJ. et al. O-Antigen biotin conjugates. Preparation and use in direct competitive enzyme immunoassays. Journal of Immunological Methods,132(1990) pág.255-261 (ver resumen; pág. 257 "Conjugation of biotin and aminated O-polysaccharide" and "direct EIA") * |
| MELKAMU, G. et al. LC-MS determination of desmopressin acetate in human skin samples. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 35 (2004) pág. 921-927 (ver resumen). * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2328441B1 (en) | 2010-08-12 |
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