ES2328130T3 - Oligonucleotidos que proceden de las secuencias que codifican para la componente de superfcie de las protenias de cubierta de los ptlv y sus usos. - Google Patents
Oligonucleotidos que proceden de las secuencias que codifican para la componente de superfcie de las protenias de cubierta de los ptlv y sus usos. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de pares de oligonucleótidos degenerados en orientación 5'' y 3'' que comprenden entre 15 y 20 nucleótidos, comprendiendo dichos oligonucleótidos degenerados una mezcla de oligonucleótidos que codifican para las regiones determinadas siguientes que proceden de los fragmentos proteicos de las proteínas de cubierta de las diferentes cepas de los PTLV, tales como la proteína de cubierta de la cepa MT-2 de HTLV-1, o la cepa NRA de HTLV-2, o la cepa de STLV-3, o de secuencias complementarias a las secuencias de dichos oligonucleótidos que codifican para las regiones determinadas siguientes: que difieren entre sí por la sustitución de por lo menos un nucleótido por otro de manera que cada oligonucleótido sea susceptible de codificar para la región determinada mencionada anteriormente, para la realización de procedimientos de detección de cualquier cepa de PTLV (Primate T cell Lymphotrophic Virus), a saber, de cualquier cepa que pertenece a los HTLV-1, HTLV-2, STLV-1, STLV-2 y STLV-3, así como de cualquier cepa de virus emparentados con los PTLV, a saber, de cualquier cepa cuya secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia nucleotídica que codifica para la región aminoterminal de la componente de superficie (SU) de las proteínas de cubierta presenta un índice de homología de por lo menos 30% con las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias nucleotídicas correspondientes en los PTLV, en particular para la detección de nuevas variantes de los PTLV, o de virus que comprenden unas secuencias emparentadas con las SU de los PTLV, comprendiendo dichos procedimientos una etapa de amplificación, a partir de una muestra biológica susceptible de contener unos PTLV, y con la ayuda de los oligonucleótidos 5'' y 3'' degenerados mencionados anteriormente usados como cebadores, del número de copias de fragmentos nucleotídicos delimitados en posición 5'' por el oligonucleótido degenerado en orientación 5'', y en posición 3'' por el oligonucleótido degenerado en orientación 3'', y una etapa de identificación de la cepa de PTLV contenida en la muestra biológica a partir de los fragmentos nucleotídicos amplificados mencionados anteriormente.
Description
Oligonucleótidos que procede de las secuencias
que codifican para la componente de superficie de las proteínas de
cubierta de los PTLV y sus usos.
La presente invención tiene por objeto unos
oligonucleótidos que proceden de las secuencias nucleotídicas que
codifican para la región aminoterminal de la componente de
superficie de las proteínas de cubierta de los virus de los
linfomas/leucemias T en los primates, agrupados bajo la denominación
PTLV, y sus usos en el marco de la detección de cualquier cepa de
PTLV o de cepas víricas emparentadas.
La presente invención se deriva de la
identificación por los inventores de motivos peptídicos de la SU que
convienen para la síntesis de oligonucleótidos que se pueden usar
para la detección y la amplificación de secuencias
pan-PTLV que comprenden estos motivos. Los
inventores han desarrollado un método que permite la amplificación
de dichas secuencias, su clonación y su secuenciación. La presente
invención permite en particular la detección de secuencias
individuales presentes en una mezcla de secuencias de diferentes
tipos. La optimización para algunos de los motivos peptídicos así
identificados ya ha permitido la caracterización de variantes PTLV
todavía nunca descritas, así como la detección de unas secuencias
PTLV de cuya presencia no se sospechaba en las muestras ensayadas.
La aplicación generalizada de la presente invención permitirá la
detección y la caracterización de nuevas secuencias emparentadas
con las SU de PTLV, o de secuencias ya conocidas en nuevos
contextos patológicos o no.
La búsqueda de secuencias de los retrovirus
humanos o de primates es primordial en numerosos contextos. De
manera no exhaustiva, estas búsquedas se interesan en el cribado de
materiales biológicos (productos derivados de la sangre, por
ejemplo), el diagnóstico (búsqueda de la etiología de síndromes
múltiples que abarcan las leucemias, las enfermedades
degenerativas, las enfermedades autoinmunes, etc.), los estudios
epidemiológicos y antropológicos de los diferentes grupos humanos,
la secuenciación de los genomas (composición y marcadores
retrovíricos polimórficos de los genomas), el cribado de nuevos
medicamentos (definición de nuevas dianas), etc.
En el caso de los PTLV, se darán a conocer dos
ejemplos de los problemas asociados con la detección de sus
secuencias. En el primer ejemplo, unos individuos, generalmente
reunidos bajo el término de "seroindeterminados", presentan
una repuesta inmune anti-HTLV denominada
"incompleta", dirigida contra ciertos antígenos únicamente de
los PTLV, mientras que no se puede amplificar ninguna secuencia
correspondiente a unos PTLV a partir de muestras sanguíneas de
estos pacientes. En los casos más documentados, la búsqueda de
dichas secuencias se lleva a cabo sobre unas regiones conservadas
de los genes gag, pol, env y tax.
DUBE S. et al. ("Degenerate and
specific PCR assays for the detection of bovine leukaemia virus and
primate T cell leukaemia/lymphoma virus pol DNA and RNA:
phylogenetic comparisons of amplified sequences from cattle and
primates from around the world". JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY,
vol. 78, 1997, páginas 1389-1398) describe unos
oligonucleótidos degenerados (p. 1391, \NAK "Design of primer
and probe oligonucleotides") así como su uso para la detección
de cepas de PTLV o virus emparentados (BLV, virus de la leucemia
bovina) mediante la amplificación de secuencias pol que codifican
la polimerasa vírica de dichos virus.
En el caso del gen de cubierta, la parte
aminoterminal de la SU está apartada de este enfoque debido a su
variabilidad. La región aminoterminal de la componente de superficie
(SU) de las cubiertas de los retrovirus de primates humanos y
no-humanos de tipo HTLV y STLV (agrupados en la
presente memoria bajo el término PTLV), es en particular
responsable del reconocimiento del o de los receptores celulares
para la cubierta (Kim et al., 2000). En la actualidad, no se
ha descrito ningún método de amplificación en esta región
directamente aplicable a los tres tipos de PTLV (aplicación
denominada pan-PTLV). Así, generalmente sólo se
considera la amplificación de motivos presentes en las partes más
conservadas de la componente transmembranaria de la cubierta (TM).
Sin embargo, en la medida en que la variabilidad de la SU es un
elemento esencial de la biología adaptiva de los retrovirus, el
desarrollo de un enfoque basado en su detección representa un
objetivo particularmente interesante.
Un objeto descrito consiste en el uso de pares
de oligonucleótidos degenerados en orientación 5' y 3' que proceden
de las secuencias nucleotídicas que codifican para la región
aminoterminal de la componente de superficie (SU) de las proteínas
de cubierta de los virus de los linfomas/leucemias T en los
primates, agrupados bajo la denominación PTLV, siendo estos virus
denominados asimismo HTLV en el ser humano y STLV en el mono, a
saber, de la región que corresponde a los fragmentos proteicos
delimitados por el lado N-terminal por un aminoácido
situado entre las posiciones 75 a 90, y por el lado
C-terminal por un aminoácido situado entre las
posiciones 230 a 245 de las proteínas de cubierta de las diferentes
cepas de los PTLV, o de virus que contienen unas secuencias
emparentadas con las SU de los PTLV.
Para la realización de procedimientos de
detección de cualquier cepa de PTLV, a saber, de cualquier cepa que
pertenece a HTLV-1, HTLV-2,
STLV-1, STLV-2, y
STLV-3, así como de cualquier cepa de virus
emparentados con PTLV, a saber, de cualquier cepa cuya secuencia de
aminoácidos deducida de la secuencia nucleotídica que codifica para
la región aminoterminal de la SU presenta un índice de homología de
por lo menos aproximadamente 30% con las secuencias de aminoácidos
codificadas por las secuencias nucleotídicas correspondientes en los
PTLV, en particular para la detección de nuevas variantes de los
PTLV, o de virus, nuevos o no, que comprenden unas secuencias
emparentadas con las SU de los PTLV, llegado el caso en nuevos
contextos patológicos, comprendiendo dichos procedimientos una
etapa de amplificación, a partir de una muestra biológica
susceptible de contener unos PTLV, y con la ayuda de los
oligonucleótidos 5' y 3' degenerados mencionados anteriormente
usados como cebadores, del número de copias de fragmentos
nucleotídicos delimitados en la posición 5' por el oligonucleótido
degenerado en orientación 5', y en posición 3' por el
oligonucleótido degenerado en orientación 3', y una etapa de
identificación de la cepa de PTLV contenida en la muestra biológica
a partir de los fragmentos nucleotídicos amplificados
mencionados
anteriormente.
anteriormente.
Un objeto descrito más particularmente consiste
en el uso mencionado anteriormente de pares de oligonucleótidos
degenerados tal como se han definido anteriormente, caracterizado
porque dichos oligonucleótidos se seleccionan de entre los que
comprenden entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 nucleótidos
que proceden de las secuencias nucleotídicas que codifican para
unos fragmentos proteicos delimitados por el lado
N-terminal por un aminoácido situado entre las
posiciones 75 a 90, y por el lado C-terminal por un
aminoácido situado entre las posiciones 230 a 254 de las proteínas
de cubierta de las diferentes cepas de los PTLV, tales como la
proteína de cubierta de la cepa MT-2 de
HTLV-1 representada por la SEC ID nº 43, o la cepa
NRA de HTLV-2 representada por la SEC ID nº 45, o
la cepa de STLV-3 representada por la SEC ID nº 47,
comprendiendo dichos oligonucleótidos degenerados una mezcla de
oligonucleótidos que proceden de secuencias que codifican para una
región determinada de aproximadamente 5 a 10 aminoácidos de las
proteínas de cubierta de las diferentes cepas de PTLV, y que
difieren entre sí por la sustitución de por lo menos un nucleótido
por otro de manera que cada oligonucleótido sea susceptible de
codificar para la región determinada mencionada anteriormente que
procede de los fragmentos proteicos de las proteínas de cubierta de
las diferentes cepas de los PTLV, tales como la proteína de cubierta
de la cepa MT-2 de HTLV-1, o de la
cepa NRA de HTLV-2, o de la cepa de
STLV-3 mencionadas anteriormente.
Un objeto descrito asimismo más particularmente
consiste en el uso mencionado anteriormente de pares de
oligonucleótidos degenerados tal como se han definido
anteriormente, que comprenden entre aproximadamente 15 y
aproximadamente 30 nucleótidos que proceden de secuencias
nucleotídicas que codifican para unos fragmentos polipeptídicos de
aproximadamente 5 a aproximadamente 10 aminoácidos procedentes de
fragmentos proteicos delimitados por los aminoácidos situados en
las posiciones 80 a 245, y más particularmente en las posiciones 83
a 241, de la proteína de cubierta de la cepa MT-2
de HTLV-1 (Gray et al., 1990, Virology, 177:
391-395; nº de registro Genbank M37747)
representada por la SEC ID nº 43.
Un objeto descrito más particularmente consiste
en el uso mencionado anteriormente de pares de oligonucleótidos
degenerados tal como se han definido anteriormente, procedentes de
secuencias nucleotídicas que codifican para los fragmentos
polipeptídicos 83-88, 140-145,
22-228 y 237-241, de la proteína de
cubierta de la cepa MT-2 de HTLV-1,
a saber, los siguientes fragmentos:
- \quad
- 83-YL/VFPHW-88
- \quad
- 140-NFTQ/REV-145
- \quad
- 222-NYS/TCl/MVC-228
- \quad
- 237-WHVLY-241
Un objeto descrito más particularmente consiste
asimismo en el uso mencionado anteriormente de oligonucleótidos
degenerados en orientación 5' que proceden de la hebra ADN(+) que
codifica para:
- -
-
\vtcortauna
- TAYBTNTTYCCNCAYTGG {}\hskip1cm (I)
- SEC ID nº 5
- \quad
- en la que
- \quad
- Y representa C o T,
- \quad
- B representa C, G o T,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 5' seleccionados de entre los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- siendo Y, B y N tal como se han definido anteriormente, o
\newpage
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que:
- \quad
- Y representa C o T,
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 5' seleccionados de entre los siguientes:
- \quad
- siendo Y y N tal como se han definido anteriormente.
Un objeto descrito más particularmente consiste
asimismo en el uso mencionado anteriormente de oligonucleótidos
degenerados en orientación 3' que proceden de la hebra ADN(-) que
codifica para:
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que:
- \quad
- Y representa C o T,
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 3' seleccionados de entre los siguientes:
- \quad
- siendo Y y N tal como se han definido anteriormente,
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que:
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- M representa A o C,
- \quad
- S representa C o G,
- \quad
- W representa A o T,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 3' seleccionados de entre los siguientes:
- \quad
- siendo R, M, S y N tal como se han definido anteriormente, o
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que:
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 3' seleccionados de entre los siguientes:
- \quad
- siendo R y N tal como se han definido anteriormente.
Asimismo, se describe el uso mencionado
anteriormente de oligonucleótidos tales como los definidos
anteriormente, que comprenden en su extremo 5' una secuencia que
comprende un sitio de restricción, tales como los sitios EcoRI, de
secuencia GAATTC, o BamHI, de secuencia GGATCC.
Para ello, se describe más particularmente el
uso mencionado anteriormente de oligonucleótidos tal como se han
definido anteriormente, caracterizados porque los oligonucleótidos
5' que proceden de la hebra ADN(+) que corresponde a los fragmentos
polipeptídicos 83-88 ó 140-145
comprenden en dirección 5' una secuencia GGAAGAATTC, y porque los
oligonucleótidos 3' que proceden de la hebra ADN(-) que corresponde
a los fragmentos polipeptídicos 140-145,
222-228 y 237-241 comprenden en
dirección 5' una secuencia GGAAGGATCC.
Se describe asimismo el uso mencionado
anteriormente de oligonucleótidos tal como se han definido
anteriormente como sondas, llegado el caso marcadas, para llevar a
cabo procedimientos de detección mencionados anteriormente de PTLV
y de cepas emparentadas.
Se describe asimismo el uso mencionado
anteriormente de oligonucleótidos tal como se han definido
anteriormente, como pares de cebadores nucleotídicos para la
realización de reacciones de polimerización en cadena (PCR) para la
detección de cualquier cepa de PTLV, así como de cualquier cepa de
virus que comprende unas secuencias emparentadas con las SU de los
PTLV.
Se describe más particularmente el uso
mencionado anteriormente de pares de cebadores seleccionados de tal
manera que:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
entendiéndose que dichos cebadores
5' y 3' mencionados anteriormente no pueden ser complementarios
entre
sí.
Se refiere más particularmente al uso mencionado
anteriormente de pares de oligonucleótidos degenerados tal como se
han definido anteriormente, caracterizado porque los
oligonucleótidos degenerados 5' se seleccionan de entre los
oligonucleótidos 5' de fórmulas (I) y (II) mencionadas
anteriormente, y porque los oligonucleótidos degenerados 3' se
seleccionan de entre los oligonucleótidos 3' de fórmulas (III) a (V)
mencionadas anteriormente.
Se refiere más particularmente al uso mencionado
anteriormente de pares de cebadores tal como se han definido
anteriormente, caracterizado porque el cebador 5' se selecciona de
entre los oligonucleótidos 5' que proceden de la hebra ADN(+) que
corresponde a los fragmentos polipeptídicos 83-88 ó
140-145 definidos anteriormente, tales como los
cebadores PTLVE5' 83a y b y PTLVE5' 140a a d mencionados
anteriormente, y porque el cebador 3' se selecciona de entre los
oligonucleótidos 3' que proceden de la hebra ADN(-) que corresponde
a los fragmentos polipeptídicos 140-145,
222-228 ó 237-241 definidos
anteriormente, tales como los cebadores PTLVE3' 145a a d, PTLV3'
228a a h, y PTLVE3' 145a a d, PTLV3' 228a a h, y PTLVE3' 241 a y b
mencionados anteriormente.
Un objeto es más particularmente el uso
mencionado anteriormente de pares de oligonucleótidos degenerados
tal como se han definido anteriormente, siendo dichos
oligonucleótidos seleccionados de manera que permitan la
amplificación, a partir de una muestra biológica susceptible de
contener ADN de PTLV, de secuencias nucleotídicas que codifican
para unos fragmentos proteicos que comprenden una secuencia
delimitada por el lado N-terminal por el aminoácido
situado en la posición 89, y por el lado C-terminal
por el aminoácido situado en la posición 139 de la proteína de
cubierta de la cepa MT-2 de HTLV-1,
representada por la SEC ID nº 43, o que comprende una secuencia
análoga comprendida en la proteína de cubierta de otra cepa de PTLV
distinta de HTLV-1, tal como la secuencia
delimitada por el lado N-terminal por el aminoácido
situado en la posición 85, y por el lado C-terminal
por el aminoácido situado en la posición 135 de la proteína de
cubierta de la cepa NRA de HTLV-2 representada por
la SEC ID nº 45, o la secuencia delimitada por el lado
N-terminal por el aminoácido situado en la posición
88, y por el lado C-terminal por el aminoácido
situado en la posición 144 de la proteína de cubierta de la cepa
STLV-3 representada por la SEC ID nº 47.
Un objeto es más particularmente todavía el uso
mencionado anteriormente de pares de oligonucleótidos degenerados
tal como se han definido anteriormente, caracterizado porque los
oligonucleótidos degenerados 5' se seleccionan de entre los
oligonucleótidos 5' de fórmula (I) mencionada anteriormente, y
porque los oligonucleótidos 3' se seleccionan de entre los
oligonucleótidos 3' de fórmulas (III) a (V) mencionadas
anteriormente.
Se refiere más particularmente al uso mencionado
anteriormente de pares de oligonucleótidos degenerados tal como se
han definido anteriormente, caracterizado porque:
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- siendo Y, B y N tal como se han definido anteriormente,
\newpage
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- siendo Y y N tal como se han definido anteriormente.
Se refiere asimismo a los oligonucleótidos tal
como se han definido anteriormente, como tales.
Para ello, se describen más particularmente los
oligonucleótidos tal como se han definido anteriormente, que
corresponden:
- -
-
\vtcortauna
- *
- el fragmento polipeptídico 83-88 de la proteína de cubierta de la cepa MT-2 de HTLV-1, seleccionándose dichos oligonucleótidos de entre los de fórmula (I) siguiente:
- \quad
- en la que:
- \quad
- Y representa C o T,
- \quad
- B representa C, G o T,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 5' seleccionados de entre los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- siendo Y, B y N tal como se han definido anteriormente,
- *
- el fragmento polipeptídico 140-145 de la proteína de cubierta de la cepa MT-2 de HTLV-1, seleccionándose dichos oligonucleótidos de entre los de fórmula (II) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en la que:
- \quad
- Y representa C o T,
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 5' seleccionados de entre los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- siendo Y y N tal como se han definido anteriormente,
\newpage
- -
-
\vtcortauna
- *
- el fragmento polipeptídico 140-145 de la proteína de cubierta de la cepa MT-2 de HTLV-1, seleccionándose dichos oligonucleótidos de entre los de fórmula (III) siguiente:
- \quad
- en la que:
- \quad
- Y representa C o T,
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 3' seleccionados de entre los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- siendo Y y N tal como se han definido anteriormente,
- *
- el fragmento polipeptídico 222-228 de la proteína de cubierta de la cepa MT-2 de HTLV-1, seleccionándose dichos oligonucleótidos de entre los de fórmula (IV) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en la que:
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- M representa A o C,
- \quad
- S representa C o G,
- \quad
- W representa A o T,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 3' seleccionados de entre los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- siendo R, M, S y N tal como se han definido anteriormente,
\newpage
- *
- el fragmento polipeptídico 237-241 de la proteína de cubierta de la cepa MT-2 de HTLV-1, seleccionándose dichos oligonucleótidos de entre los de fórmula (V) siguiente:
- \quad
- en la que:
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 3' seleccionados de entre los siguientes:
- \quad
- siendo R y N tal como se han definido anteriormente.
Se describe asimismo un procedimiento de
detección de cualquier cepa de PTLV, a saber, de cualquier cepa que
pertenece a los HTLV-1, HTLV-2,
STLV-1, STLV-2, y
STLV-3, así como de cualquier cepa de virus que
comprende unas secuencias emparentadas con las SU de los PTLV, tal
como se han definido anteriormente, caracterizado porque
comprende:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Se refiere asimismo a un procedimiento de
detección de cualquier cepa de PTLV tal como se ha definido
anteriormente, caracterizado porque la etapa de amplificación
comprende la realización de dos reacciones de amplificación,
efectuándose la segunda reacción sobre una muestra de productos
obtenidos en el marco de la primera reacción con la ayuda de los
mismos oligonucleótidos 5' que en el caso de la primera reacción, y
de oligonucleótidos 3' diferentes de los usados en la primera
reacción, a saber, unos cebadores 3' denominados "anidados" que
se hibridan con una región situada más corriente arriba de la
secuencia que codifica para la SU que los cebadores 3' usados en la
primera reacción.
Se describe asimismo un procedimiento de
detección de cualquier cepa de PTLV tal como se ha definido
anteriormente, caracterizado porque comprende:
- -
-
\vtcortauna
- *
- oligonucleótidos de fórmula (I)/oligonucleótidos de fórmula (IV), o
- *
- oligonucleótidos de fórmula (I)/oligonucleótidos de fórmula (V), o
- *
- oligonucleótidos de fórmula (II)/oligonucleótidos de fórmula (V), y
- -
-
\vtcortauna
- *
- oligonucleótidos de fórmula (I)/oligonucleótidos de fórmula (III), o
- *
- oligonucleótidos de fórmula (I)/oligonucleótidos de fórmula (III o IV), o
- *
- oligonucleótidos de fórmula (II)/oligonucleótidos de fórmula (IV),
\newpage
- -
-
\vtcortauna
Se refiere asimismo a un procedimiento de
detección de cualquier cepa de PTLV tal como se ha definido
anteriormente, caracterizado porque comprende:
- -
-
\vtcortauna
- *
- los oligonucleótidos degenerados 5' son los de fórmula (I) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- siendo Y, B y N tal como se han definido anteriormente,
- *
- los oligonucleótidos degenerados 3' son los de fórmula (V) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- siendo R y N tal como se han definido anteriormente,
- -
-
\vtcortauna
- *
- los oligonucleótidos degenerados 5' son los de fórmula (I) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- siendo Y, B y N tal como se han definido anteriormente,
- *
- los oligonucleótidos degenerados 3' son los de fórmula (III) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- siendo Y y N tal como se han definido anteriormente.
Se refiere más particularmente a un
procedimiento de detección tal como se ha definido anteriormente,
caracterizado porque la etapa de amplificación se lleva a cabo en
las siguientes condiciones:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- *
- una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 15 seg,
- *
- una etapa que combina apareamiento y alargamiento a una temperatura que varía entre 65ºC y 50ºC durante 20 seg,
\newpage
- \bullet
-
\vtcortauna
- *
- una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 15 seg,
- *
- una etapa de apareamiento a 50ºC durante 30 seg,
- *
- una etapa de alargamiento a 72ºC durante 30 seg,
- -
-
\vtcortauna
Se describe más particularmente un procedimiento
de detección tal como se ha definido anteriormente, caracterizado
porque la etapa de detección y, llegado el caso, de identificación,
se lleva a cabo en las siguientes condiciones:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Se refiere asimismo a un botiquín o kit para la
realización de un procedimiento de detección tal como se ha
definido anteriormente, caracterizado porque comprende un par de
oligonucleótidos degenerados mencionados anteriormente y, llegado
el caso, los agentes reactivos necesarios para la realización de la
reacción de amplificación por PCR y para la detección de los
fragmentos amplificados.
Se describe asimismo la aplicación del
procedimiento de detección definido anteriormente para el
diagnóstico de patologías relacionadas con una infección por un
PTLV, o por un virus que comprende unas secuencias emparentadas con
las SU de los PTLV, en el ser humano o en el animal, tales como las
hemopatías, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades
inflamatorias y las enfermedades degenerativas.
Para ello, se describe cualquier método de
diagnóstico in vitro de patologías mencionadas anteriormente
mediante la realización de un procedimiento de detección definido
anteriormente, pudiendo la detección de fragmentos de ADN
amplificados ser correlacionada con el diagnóstico de dichas
patologías.
Llegado el caso, los métodos de diagnóstico
in vitro descritos comprenden una etapa suplementaria de
identificación de PTLV o virus emparentados con los PTLV presentes
en la muestra biológica, mediante la secuenciación de los
fragmentos de ADN amplificados.
Se describe asimismo la aplicación del
procedimiento de detección definido anteriormente, al cribado y a la
identificación de nuevos agentes infecciosos en el ser humano o en
el animal, y más particularmente de nuevas cepas (o variantes) de
virus susceptibles de ser clasificados en los PTLV, o de virus que
comprenden unas secuencias emparentadas con las SU de los PTLV.
Los métodos de cribado y de identificación
mencionados anteriormente de nuevos agentes infecciosos se llevan a
cabo mediante la realización de un procedimiento de detección
definido anteriormente y que comprenden una etapa suplementaria de
identificación de las nuevas variantes de PTLV o de virus
emparentados mediante la secuenciación de los fragmentos de ADN
amplificados.
Se describe asimismo la aplicación del
procedimiento de detección definido anteriormente al cribado de
genes de predisposición o de resistencia a unas patologías en el
ser humano o en el animal relacionadas con la presencia de las
secuencias de los PTLV o de secuencias emparentadas, o con una
infección por un PTLV, tales como las hemopatías, las enfermedades
autoinmunes y las enfermedades degenerativas.
Se describe asimismo la aplicación del
procedimiento de detección definido anteriormente, al cribado o a la
concepción de nuevos agentes terapéuticos que comprenden unas
secuencias enteras o parciales de las proteínas de cubierta de
nuevas variantes de PTLV así detectadas.
Se describe asimismo la aplicación del
procedimiento de detección tal como se ha definido anteriormente, en
el cribado o en la concepción de nuevos vectores de terapia celular
que usan las propiedades de tropismo de las secuencias enteras o
parciales de las proteínas de cubierta de nuevas variantes de PTLV
así detectadas.
Se describen las variantes de tipo
HTLV-1 tales como las obtenidas mediante la
realización de un procedimiento de detección definido
anteriormente, que corresponden:
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 89 a 139 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1, en la que el resto
arginina (R) en la posición 94, y el resto serina (S) en posición
101, están sustituidos por un resto prolina (P) y un resto leucina
(L) respectivamente, indicados en negrita y subrayados,
y
cuya secuencia nucleotídica que codifica para su
proteína de cubierta es tal que comprende la secuencia SEC ID nº 30
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los nucleótidos situados
en las posiciones 265 a 417 de la secuencia que codifica para la
proteína de cubierta de la cepa MT-2 de
HTLV-1, en la que G en la posición 281, C en la
posición 302 y G en la posición 333, están sustituidos por C, T y A
respectivamente, indicados en negrita y
subrayados,
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 89 a 139 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1, en la que el resto
isoleucina (I) en la posición 89, y el resto serina (S) en la
posición 101, están sustituidos por un resto valina (V) y un resto
leucina (L) respectivamente, indicados en negrita y subrayados,
y
cuya secuencia nucleotídica que codifica para su
proteína de cubierta es tal que comprende la secuencia SEC ID nº 32
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los nucleótidos situados
en las posiciones 265 a 417 de la secuencia que codifica para la
proteína de cubierta de la cepa MT-2 de
HTLV-1, en la que A en la posición 266, C en la
posición 302 y G en la posición 333, están sustituidos por G, T y A
respectivamente, indicados en negrita y
subrayados,
\newpage
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 89 a 139 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1, en la que el resto
serina (S) en la posición 101, está sustituido por un resto leucina
(L), indicado en negrita y subrayado,
y
cuya secuencia nucleotídica que codifica para su
proteína de cubierta es tal que comprende la secuencia SEC ID nº 34
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a saber, una secuencia que corresponde a la
secuencia delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones
265 a 417 de la secuencia que codifica para la proteína de cubierta
de la cepa MT-2 de HTLV-1, en la que
C en la posición 302, G en la posición 333 y G en la posición 408,
están sustituidos por T, A y A respectivamente, indicados en
negrita y subrayados,
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 89 a 139 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1, en la que el resto
alanina (A) en la posición 127, está sustituido por un resto
prolina (P), indicado en negrita y subrayado,
y
cuya secuencia nucleotídica que codifica para su
proteína de cubierta es tal que comprende la secuencia SEC ID nº 36
siguiente:
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los nucleótidos situados
en las posiciones 265 a 417 de la secuencia que codifica para la
proteína de cubierta de la cepa MT-2 de
HTLV-1, en la que G en la posición 379, está
sustituido por C, indicado en negrita y
subrayado,
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 89 a 145 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1, en la que el resto
tirosina (Y) en la posición 100, y el resto treonina (T) en la
posición 125, están sustituidos por un resto histidina (H) y un
resto alanina (A) respectivamente, indicados en negrita y
subrayados,
y
cuya secuencia nucleotídica que codifica para su
proteína de cubierta es tal que comprende la secuencia SEC ID nº 38
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a saber, una secuencia que corresponde a la
secuencia delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones
265 a 435 de la secuencia que codifica para la proteína de cubierta
de la cepa MT-2 de HTLV-1, en la que
T en la posición 298, A en la posición 373, T en la posición 426, A
en la posición 429 y T en la posición 435, están sustituidos por C,
G, C, G y A respectivamente, indicados en negrita y subrayados.
Se describe asimismo la variante de tipo
HTLV-2 tal como se obtiene mediante la realización
de un procedimiento de detección definido anteriormente,
caracterizado porque:
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 86 a 135 de la proteína de cubierta de la cepa
prototipo NRA de HTLV-2 (descrita por Lee et
al., 1993. Virology 196, 57-69; nº de registro
Genbank L20734.1), en la que los restos lisina (K) en la posición
86, cisteína (C) en la posición 113, glicina (G) en la posición
122, serina (S) en la posición 126 y lisina (K) en la posición 130,
están sustituidos por los restos arginina (R), serina (S), alanina
(A), treonina (T) y asparagina (N) respectivamente, indicados en
negrita y
subrayados.
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los nucleótidos situados
en las posiciones 253 a 405 de la secuencia que codifica para la
proteína de cubierta de la cepa NRA de HTLV-2, en la
que A en la posición 257, G en la posición 258, T en la posición
267, A en la posición 282, C en la posición 294, T en la posición
300, A en la posición 333, G en la posición 338, G en la posición
365, G en la posición 377, G en la posición 390 y C en la posición
396, están sustituidos por G, A, C, G, T, C, G, C, C, C, T y T
respectivamente, indicados en negrita y
subrayados.
Se refiere asimismo a los polipéptidos
delimitados por el lado N-terminal por un aminoácido
situado entre las posiciones 75 a 90, y por el lado
C-terminal por un aminoácido situado entre las
posiciones 230 a 245 de las proteínas de cubierta de las diferentes
cepas de los PTLV, tales como la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1 representada por la
SEC ID nº 43, o de la cepa NRA de HTLV-2
representada por la SEC ID nº 45, o de la cepa de
STLV-3 representada por la SEC ID nº 47, o de virus
que contienen unas secuencias emparentadas con las SU de los PTLV,
o delimitados por el lado N-terminal por un
aminoácido situado entre las posiciones 75 a 90, y por el lado
C-terminal por un aminoácido situado entre las
posiciones 135 a 150 de dichas proteínas de cubierta de las
diferentes cepas de los PTLV.
Se describen asimismo los polipéptidos definidos
anteriormente, seleccionados de entre:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Se refiere asimismo a los polipéptidos
codificados por los fragmentos de ADN amplificados en el marco del
procedimiento de detección definido anteriormente, de las variantes
de tipo HTLV-1 a HTLV-2 mencionadas
anteriormente, caracterizados porque comprenden las secuencias
peptídicas siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 89 a 139 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1, en la que el resto
arginina (R) en la posición 94, y el resto serina (S) en la
posición 101, están sustituidos por un resto prolina (P) y un resto
leucina (L) respectivamente, indicados en negrita y
subrayados,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 89 a 139 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1, en la que el resto
isoleucina (I) en la posición 89, y el resto serina (S) en la
posición 101, están sustituidos por un resto valina (V) y un resto
leucina (L) respectivamente, indicados en negrita y
subrayados,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 89 a 139 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1, en la que el resto
serina (S) en la posición 101 está sustituido por un resto leucina
(L), indicado en negrita y
subrayado,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 89 a 139 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1, en la que el resto
alanina (A) en la posición 127 está sustituido por un resto prolina
(P), indicado en negrita y
subrayado,
\newpage
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 89 a 145 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1, en la que el resto
tirosina (Y) en la posición 100, y el resto treonina (T) en la
posición 125, están sustituidos por un resto histidina (P), y un
resto alanina (A) respectivamente, indicados en negrita y
subrayados,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 85 a 135 de la proteína de cubierta de la cepa
prototipo NRA de HTLV-2, en la que los restos lisina
(K) en la posición 86, cisteína (C) en la posición 113, glicina (G)
en la posición 122, serina (S) en la posición 126 y lisina (K) en
la posición 130, están sustituidos por los restos arginina (R),
serina (S), alanina (A), treonina (T) y asparagina (N)
respectivamente, indicados en negrita y
subrayados.
Se describen asimismo los ácidos nucleicos,
caracterizados porque codifican para un polipéptido tal como se ha
definido anteriormente.
Se refiere más precisamente a los ácidos
nucleicos mencionados anteriormente, que comprenden las secuencias
nucleotídicas siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los nucleótidos situados
en las posiciones 265 a 417 de la secuencia que codifica para la
proteína de cubierta de la cepa MT-2 de
HTLV-1, en la que G en la posición 281, C en la
posición 302 y G en la posición 333, están sustituidos por C, T y A
respectivamente, indicados en negrita y subrayados,
o
cualquier secuencia nucleotídica derivada por
degenerescencia del código genético y que codifica para el
polipéptido 1 mencionado anteriormente,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los nucleótidos situados
en las posiciones 265 a 417 de la secuencia que codifica para la
proteína de cubierta de la cepa MT-2 de
HTLV-1, en la que A en la posición 266, C en la
posición 302 y G en la posición 333, están sustituidos por G, T y A
respectivamente, indicados en negrita y subrayados,
o
cualquier secuencia nucleotídica derivada por
degenerescencia del código genético y que codifica para el
polipéptido 2 mencionado anteriormente,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los nucleótidos situados
en las posiciones 265 a 417 de la secuencia que codifica para la
proteína de cubierta de la cepa MT-2 de
HTLV-1, en la que C en la posición 302, G en la
posición 333 y G en la posición 408, están sustituidos por T, A y A
respectivamente, indicados en negrita y subrayados
o,
cualquier secuencia nucleotídica derivada por
degenerescencia del código genético y que codifica para el
polipéptido 3 de la reivindicación 24,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los nucleótidos situados
en las posiciones 265 a 417 de la secuencia que codifica para la
proteína de cubierta de la cepa MT-2 de
HTLV-1, en la que G en la posición 379 está
sustituido por C, indicado en negrita y subrayado,
o
cualquier secuencia nucleotídica derivada por
degenerescencia del código genético y que codifica para el
polipéptido 4 mencionado anteriormente,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los nucleótidos situados
en las posiciones 265 a 435 de la secuencia que codifica para la
proteína de cubierta de la cepa MT-2 de
HTLV-1, en la que T en la posición 298, A en la
posición 373, T en la posición 426, A en la posición 429 y T en la
posición 435, están sustituidos por C, G, C, G y A respectivamente,
indicados en negrita y subrayados,
o
cualquier secuencia nucleotídica derivada por
degenerescencia del código genético y que codifica para el
polipéptido 5 mencionado anteriormente,
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
a saber, una secuencia que
corresponde a la secuencia delimitada por los nucleótidos situados
en las posiciones 253 a 405 de la secuencia que codifica para la
proteína de cubierta de la cepa NRA de HTLV-2, en la
que A en la posición 257, G en la posición 258, T en la posición
267, A en la posición 282, C en la posición 294, T en la posición
300, A en la posición 333, G en la posición 338, G en la posición
365, G en la posición 377, G en la posición 390 y C en la posición
396, están sustituidos por G, A, C, G, T, C, G, C, C, C, T y T
respectivamente, indicados en negrita y subrayados,
o
\newpage
cualquier secuencia nucleotídica derivada por
degenerescencia del código genético y que codifica para el
polipéptido 6 mencionado anteriormente,
Se refiere asimismo a los anticuerpos
policlonales o monoclonales dirigidos contra una nueva variante de
tipo HTLV-1 o HTLV-2 tal como se ha
definido anteriormente, o contra un polipéptido definido
anteriormente, siendo dichos anticuerpos tales como los obtenidos
mediante la inmunización de un animal apropiado con un polipéptido
mencionado anteriormente.
Se describe asimismo cualquier composición
farmacéutica, en particular vacunas o vectores terapéuticos,
concebidos a partir de las variantes de tipo HTLV-1
o HTLV-2 tal como se han definido anteriormente, y
más particularmente cualquier composición farmacéutica que
comprende un polipéptido tal como se ha definido anteriormente, en
particular los polipéptidos 1 a 6 definidos anteriormente, o un
ácido nucleico 1a a 6a definido anteriormente, o unos anticuerpos
mencionados anteriormente, llegado el caso, en asociación con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se refiere asimismo al uso de las variantes de
tipo HTLV-1 o HTLV-2 tal como se han
definido anteriormente, o de los polipéptidos tal como se han
definido anteriormente, en particular de los polipéptidos 1 a 6, o
de los ácidos nucleicos 1a a 6a definidos anteriormente, o de los
anticuerpos mencionados anteriormente, para la preparación de
medicamentos destinados a la prevención o al tratamiento de las
infecciones de un individuo por los PLTV mencionados anteriormente,
así como de las patologías definidas anteriormente relacionadas con
la infección por estos PTLV.
La invención se pondrá más claramente de
manifiesto a partir de la descripción detallada siguiente de la
obtención de cebadores según la invención y de su uso para la
detección de nuevas variantes de HTLV.
\vskip1.000000\baselineskip
La cuestión principal resuelta por los
inventores es el desarrollo de herramientas y de un método que
permitan amplificar, clonar e identificar cualquier secuencia
nucleotídica emparentada con la SU de los PTLV que es responsable
del reconocimiento de su receptor celular (Kim et al., 2000).
Para ello, los inventores han buscado unos motivos peptídicos
conservados en la SU de las cubiertas de PTLV para deducir de ellos
unas secuencias nucleotídicas que permitan representarlas a todas.
Estos motivos peptídicos debían responder idealmente a los 5
criterios siguientes, según su importancia decreciente:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Según estos criterios, los inventores han
identificado los motivos de aminoácidos siguientes, presentes en
todas o en casi todas las SU conocidas de PTLV, y que pueden
prestarse al desarrollo de esta estrategia:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\newpage
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de las secuencias de aminoácidos de los
motivos peptídicos conservados identificados anteriormente y
siguiendo el correspondiente nucleótido en aplicación del código
genético eucariota, los inventores han determinado unas secuencias
nucleotídicas degeneradas (SND) que han servido de base para la
concepción de oligonucleótidos de síntesis (OS). Varios criterios
han presidido la concepción de OS que corresponden a estas SND.
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Para el desarrollo de la amplificación de
secuencias reconocidas por los OS descritos anteriormente, los
inventores han usado unas preparaciones de ADN de control de
plásmido que contenían la secuencia de cubierta
HTLV-1 y unas preparaciones de control desprovistas
de esta secuencia. La estrategia de amplificación de ADN que ha
sido seleccionada consiste en encadenar dos reacciones de
amplificación mediante una mezcla de las polimerasas Taq y Pwo
sobre termociclador en las condiciones denominadas de "touch
down" y que combinan 2 pares de OS
diferentes.
diferentes.
Los primeros resultados de amplificación
concluyentes y reproducibles (amplificación específica de secuencias
HTLV sin amplificación sobre las preparaciones de control) son los
obtenidos con la combinación de los OS PTLVE5'83b y PTLVE3'240b,
para la primera reacción de amplificación, seguida de una 2ª
reacción que combina los OS PTLVE5'83b y PTLVE3'146a en una muestra
de la 1ª reacción. En los dos casos las condiciones de
"touch-down" incluyen 15 ciclos que
combinan cada uno una desnaturalización a 94ºC seguida de una etapa
de apareamiento y de alargamiento efectuada a la misma temperatura,
estando esta temperatura comprendida para cada ciclo entre 65 y
50ºC con un paso decreciente de 1ºC entre el 1º y el 15º ciclo.
Estos 15 ciclos están seguidos de 30 ciclos habituales de
amplificación con una temperatura de apareamiento a 50ºC y de
alargamiento a 72ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa una muestra de la 2ª reacción de
amplificación descrita anteriormente para generar un banco de las
secuencias amplificadas. Para ello, se usan 4 \mul de los 50
\mul de la 2ª reacción para la ligación en un vector de tipo
pCR4-TOPO (Invitrogen), y la transformación de
bacterias. Se reinoculan entre 10 y 100 colonias resistentes a la
kanamicina para cada ligación y se cultivan. El ADN plasmídico de
cada colonia se analiza mediante secuenciación usando unas
secuencias cebadores universales T3 y T7 del vector.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones descritas anteriormente se
aplicaron a tres tipos de muestras de ADN:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
La aplicación del método descrito anteriormente
ha permitido detectar la presencia de secuencias de tipo SU de PTLV
en los tres tipos de muestras, incluyendo en los "pacientes
seroindeterminados".
El análisis de las secuencias y de sus
capacidades codificantes a nivel de la región de SU en cuestión ha
permitido realizar las observaciones siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Aplicando el método descrito anteriormente sobre
el ADN de un "paciente seroindeterminado" (muestra nº 424),
descrito como que no contiene ninguna secuencia de tipo HTLV, los
inventores han podido amplificar y caracterizar sin embargo unas
secuencias de tipo SU de PTLV.
A nivel nucleotídico, las secuencias
identificadas a partir de la muestra nº 424 son de varios tipos:
unas secuencias HTLV-1 idénticas a las ya descritas
en la bibliografía, y nuevas variantes. A nivel codificante, las
secuencias nucleotídicas se traducen en tres tipos de
secuencias:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
A nivel nucleotídico, las secuencias
amplificadas a partir de la muestra que procede del "paciente
HTLV-1" (muestra nº 422) son o bien típicamente
HTLV-1, tales como las descritas en la bibliografía,
o bien unas variantes con unas repercusiones sobre la capacidad
codificante. A nivel codificante, las secuencias nucleotídicas se
traducen en tres tipos de secuencias:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
El método de la invención permitió asimismo
amplificar unas secuencias de tipo SU de PTLV en todos los Mangabey
Ágiles (Cercocebus Agilis) ensayados que fueron identificados
como seropositivos para PTLV. A nivel nucleotídico, las secuencias
amplificadas a partir de estos monos son las de los aislados ya
descritos anteriormente, o bien unas variantes nucleotídicas con
repercusiones sobre la capacidad codificante. A nivel codificante,
las secuencias nucleotídicas se traducen en tres tipos de
secuencias:
- -
-
\vtcortauna
\newpage
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
1. Battini, J. L., O. Danos, y J.
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domain of murine leukemia virus envelope glycoproteins. J
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envelope glycoproteins of amphotropic, xenotropic, and polytropic
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amino-terminal demain of the human
T-cell leukemia virus type 1 envelope surface unit
that extends the fusogenic range of an ecotropic murine leukemia
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downstream of the receptor binding domain modulates conformation and
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a cell entry pathway common to type C mammalian retroviruses by
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Complete Sequence of a Novel Highly Divergent Simian
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(Cercocebus torquatus) from Cameroon: a New Primate
T-Lymphotropic Virus Type 3 Subtype. J.
Virol. 76(1):259-268.
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Ellerbrok, C. Andre, J. Nishio, S.
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<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> OLIGONUCLEÓTIDOS QUE PROCEDEN DE LAS
SECUENCIAS QUE CODIFICAN EL COMPONENTE DE SUPERFICIE DE LAS
PROTEÍNAS DE CUBIERTA DE LOS PTLV, Y SUS USOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> IFB 02 BC CNR PTLV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> FR 02/05001
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
22-04-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222>(2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L o V
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Q o R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I o M
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido 5' que procede de la
hebra de ADN (+) que corresponde al fragmento polipeptídico
83-88 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C, G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A, C, G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A, C, G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido 5' que procede de la
hebra de ADN (+) que corresponde al fragmento polipeptídico
83-88 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C, G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A, C, G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A, C, G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido 5' que procede de la
hebra de ADN (+) que corresponde al fragmento polipeptídico
83-88 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C, G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A, C, G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222>(9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A, C, G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido 5' que procede de la
hebra de ADN (+) que corresponde al fragmento polipeptídico
140-145 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1
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<220>
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<222> (3)..(3)
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<223> C o T
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<220>
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<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> A, C, G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> oligonucleótido 5' que procede de la
hebra de ADN (+) que corresponde al fragmento polipeptídico
140-145 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1
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<223> oligonucleótido 5' que procede de la
hebra de ADN (+) que corresponde al fragmento polipeptídico
140-145 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1
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<222> (6)..(6)
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<223> C o T
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<222> (9)..(9)
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la hebra de ADN (-) que corresponde al fragmento polipeptídico
140-145 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1
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140-145 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1
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MT-2 de HTLV-1
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<223> oligonucleótido 3' que procede de la
hebra de ADN(-) que corresponde al fragmento polipeptídico
140-145 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1
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la hebra de ADN (-) Que corresponde al fragmento polipeptídico
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hebra de ADN (-) que corresponde al fragmento polipeptídico
222-228 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1
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<223> oligonucleótido 3' que procede de la
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<223> A o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A, C, G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido 3' que procede de la
hebra de ADN (-) que corresponde al fragmento polipeptídico
237-241 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A, C, G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A, C, G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido 3' que procede de la
hebra de ADN (-) que corresponde al fragmento polipeptídico
237-241 de la proteína de cubierta de la cepa
MT-2 de HTLV-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A, C, G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A, C, G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(153)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<212> AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(153)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-oeil
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(153)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<212> AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(153)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<212> AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rumen T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(171)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(153)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 924
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(924)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 308
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lympnotropic virus type 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 912
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-ce11
1ympnotropic virus type 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(912)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 304
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human T-cell
lymphotropic virus type 2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 930
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Simian T-cell
lymphotropic virus type 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(930)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 310
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Simian T-cell
lymphotropic virus type 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (14)
1. Uso de pares de oligonucleótidos degenerados
en orientación 5' y 3' que comprenden entre 15 y 20 nucleótidos,
comprendiendo dichos oligonucleótidos degenerados una mezcla de
oligonucleótidos que codifican para las regiones determinadas
siguientes que proceden de los fragmentos proteicos de las proteínas
de cubierta de las diferentes cepas de los PTLV, tales como la
proteína de cubierta de la cepa MT-2 de
HTLV-1, o la cepa NRA de HTLV-2, o
la cepa de STLV-3, o de secuencias complementarias a
las secuencias de dichos oligonucleótidos que codifican para las
regiones determinadas siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
que difieren entre sí por la
sustitución de por lo menos un nucleótido por otro de manera que
cada oligonucleótido sea susceptible de codificar para la región
determinada mencionada
anteriormente,
para la realización de procedimientos de
detección de cualquier cepa de PTLV (Primate T cell Lymphotrophic
Virus), a saber, de cualquier cepa que pertenece a los
HTLV-1, HTLV-2,
STLV-1, STLV-2 y
STLV-3, así como de cualquier cepa de virus
emparentados con los PTLV, a saber, de cualquier cepa cuya secuencia
de aminoácidos deducida de la secuencia nucleotídica que codifica
para la región aminoterminal de la componente de superficie (SU) de
las proteínas de cubierta presenta un índice de homología de por lo
menos 30% con las secuencias de aminoácidos codificadas por las
secuencias nucleotídicas correspondientes en los PTLV, en particular
para la detección de nuevas variantes de los PTLV, o de virus que
comprenden unas secuencias emparentadas con las SU de los
PTLV,
PTLV,
comprendiendo dichos procedimientos una etapa de
amplificación, a partir de una muestra biológica susceptible de
contener unos PTLV, y con la ayuda de los oligonucleótidos 5' y 3'
degenerados mencionados anteriormente usados como cebadores, del
número de copias de fragmentos nucleotídicos delimitados en posición
5' por el oligonucleótido degenerado en orientación 5', y en
posición 3' por el oligonucleótido degenerado en orientación 3', y
una etapa de identificación de la cepa de PTLV contenida en la
muestra biológica a partir de los fragmentos nucleotídicos
amplificados mencionados anteriormente.
2. Uso según la reivindicación 1, de los
oligonucleótidos degenerados en orientación 5' siguientes:
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en la que:
- \quad
- Y representa C o T,
- \quad
- B representa C, G o T,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 5' seleccionados de entre los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que:
- \quad
- Y representa C o T,
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 5' seleccionados de entre los siguientes:
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, de los
oligonucleótidos degenerados en orientación 3' siguientes:
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que:
- \quad
- Y representa C o T,
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 3' seleccionados de entre los siguientes:
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que:
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- M representa A o C,
- \quad
- S representa C o G,
- \quad
- W representa A o T,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 3' seleccionados de entre los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que:
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 3' seleccionados de entre los siguientes:
4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque:
- -
-
\vtcortauna
- *
- los oligonucleótidos de SEC ID nº 5 que codifican para la SEC ID nº 1,
- *
- los oligonucleótidos de SED IC nº 8 que codifican para la SEC ID nº 2,
- -
-
\vtcortauna
- *
- los oligonucleótidos de SEC ID nº 13 de secuencias complementarias a las secuencias que codifican para la SEC ID nº 2,
- *
- los oligonucleótidos de SEC ID nº 18 de secuencias complementarias a las secuencias que codifican para la SEC ID nº 3,
- *
- los oligonucleótidos de SEC ID nº 27 de secuencias complementarias a las secuencias que codifican para la SEC ID nº 4.
5. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 4,
en el que los oligonucleótidos se seleccionan de manera que
permitan la amplificación, a partir de una muestra biológica
susceptible de contener ADN de PTLV, de secuencias nucleotídicas
que codifican para unos fragmentos proteicos que comprenden una
secuencia delimitada por el lado N-terminal por el
aminoácido situado en la posición 89, y por el lado
C-terminal por el aminoácido situado en la posición
139 de la proteína de cubierta de la cepa MT-2 de
HTLV-1 representada por la SEC ID nº 43, o que
comprende una secuencia análoga comprendida en la proteína de
cubierta de otra cepa de PTLV distinta de HTLV-1,
tal como la secuencia delimitada por el lado
N-terminal por el aminoácido situado en la posición
85, y por el lado C-terminal por el aminoácido
situado en la posición 135 de la proteína de cubierta de la cepa
NRA de HTLV-2 representada por la SEC ID nº 45, o la
secuencia delimitada por el lado N-terminal por el
aminoácido situado en la posición 88, y por el lado
C-terminal por el aminoácido situado en la posición
144 de la proteína de cubierta de la cepa de STLV-3
representada por la SEC ID nº 47.
6. Uso según la reivindicación 5,
caracterizado porque:
- -
-
\vtcortauna
- *
- los oligonucleótidos de SEC ID nº 5 que codifican para la SEC ID nº 1,
- -
-
\vtcortauna
- *
- los oligonucleótidos de SEC ID nº 13 de secuencias complementarias a las secuencias que codifican para la SEC ID nº 2,
- *
- los oligonucleótidos de SEC ID nº 18 de secuencias complementarias a las secuencias que codifican para la SEC ID nº 3,
- *
- los oligonucleótidos de SEC ID nº 27 de secuencias complementarias a las secuencias que codifican para la SEC ID nº 4,
7. Uso según la reivindicación 5 ó 6,
caracterizado porque:
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- siendo Y, B y N tal como se definen en la reivindicación 2,
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- siendo Y y N tal como se definen en la reivindicación 3.
8. Oligonucleótidos según una de las
reivindicaciones 2 a 7, que corresponden:
- -
-
\vtcortauna
- *
- los oligonucleótidos que codifican para la SEC ID nº seleccionados de entre los de la secuencia SEC ID nº 5 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en la que:
- \quad
- Y representa C o T,
- \quad
- B representa C, G o T,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 5' seleccionados de entre los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que:
- \quad
- Y representa C o T,
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 5' seleccionados de entre los siguientes:
- -
-
\vtcortauna
- *
- los oligonucleótidos de secuencias complementarias a las secuencias que codifican para la SEC ID nº 2 seleccionados de entre los de la secuencia SEC ID nº 13 siguiente:
- \quad
- en la que:
- \quad
- Y representa C o T,
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 3' seleccionados de entre los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que:
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- M representa A o C,
- \quad
- S representa C o G,
- \quad
- W representa A o T,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 3' seleccionados de entre los siguientes:
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que:
- \quad
- R representa A o G,
- \quad
- N representa A, C, G o T,
- \quad
- tales como los cebadores oligonucleotídicos 3' seleccionados de entre los siguientes:
9. Procedimiento de detección de cualquier cepa
de PTLV, a saber, de cualquier cepa que pertenece a los
HTLV-1, HTLV-2,
STLV-1, STLV-2 y
STLV-3, así como de cualquier cepa de virus que
comprende unas secuencias emparentadas con las SU de los PTLV, tal
como se definen en la reivindicación 1, caracterizado porque
comprende:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
10. Procedimiento de detección de cualquier cepa
de PTLV según la reivindicación 9, caracterizado porque la
etapa de amplificación comprende la realización de dos reacciones de
amplificación, efectuándose la segunda reacción sobre una muestra
de productos obtenidos en el marco de la primera reacción con la
ayuda de los mismos oligonucleótidos 5' que en el caso de la
primera reacción, y de oligonucleótidos 3' diferentes de los usados
en la primera reacción, a saber, unos cebadores 3' denominados
"anidados" que se hibridan con una región situada más
corriente arriba de la secuencia que codifica para la SU que los
cebadores 3' usados en la primera reacción.
11. Procedimiento de detección de cualquier cepa
de PTLV según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque
comprende:
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
12. Procedimiento de detección de cualquier cepa
de PTLV según una de las reivindicaciones 9 a 11,
caracterizado porque comprende:
- -
-
\vtcortauna
- *
- los oligonucleótidos degenerados 5' son los siguientes:
- \quad
- siendo Y, B y N tal como se definen en la reivindicación 2,
- *
- los oligonucleótidos degenerados 3' son los siguientes:
- \quad
- siendo R y N tal como se definen en la reivindicación 3,
- -
-
\vtcortauna
- *
- los oligonucleótidos degenerados 5' son los siguientes:
- \quad
- siendo Y, B y N tal como se definen en la reivindicación 2,
- *
- los oligonucleótidos degenerados 3' son los siguientes:
- \quad
- siendo Y y N tal como se definen en la reivindicación 3.
13. Botiquín o kit para la realización de un
procedimiento de detección según una de las reivindicaciones 9 a
12, caracterizado porque comprende un par de cebadores tal
como se definen en una de las reivindicaciones 1 a 7, y llegado el
caso, los agentes reactivos necesarios para la realización de la
reacción de amplificación por PCR y para la detección de los
fragmentos amplificados.
14. Aplicación del procedimiento de detección
según una de las reivindicaciones 9 a 12:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
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