ES2327430T3

ES2327430T3 - Proceso para la preparacion de l-aminoacidos utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas.

Info

Publication number: ES2327430T3
Application number: ES05701199T
Authority: ES
Inventors: Mechthild Rieping; Nicole Dusch
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2004-02-06
Filing date: 2005-01-27
Publication date: 2009-10-29
Anticipated expiration: 2025-01-27
Also published as: DE602005014846D1; CN1918283B; DE102004005836A1; WO2005075627A1; US7575905B2; DK1711593T3; ATE433483T1; EP1711593B1; US20050176112A1; CN1918283A; EP1711593A1

Abstract

Proceso para la preparación de L-aminoácidos seleccionados del grupo constituido por L-treonina, L-valina, Llisina y L-homoserina por la fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas, en donde a) los microorganismos que producen el L-aminoácido deseado, en los cuales el marco de lectura abierto yibD está sobreexpresado, se cultivan en un medio en condiciones en las cuales el L-aminoácido deseado se enriquece en el medio o en las células, y b) el L-aminoácido deseado se aísla, quedando los constituyentes del caldo de fermentación, y/o la totalidad o una parte (>= 0 a 100%) de la biomasa, en el producto aislado o eliminándose completamente, en donde el marco de lectura abierto yibD codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6 y que tiene la actividad de una glicosiltransferasa supuesta.

Description

Proceso para la preparación de L-aminoácidos utilizando cepas de la familia enterobacteriáceas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, utilizando microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas en la cual el marco de lectura abierto (ORF) designado por yibD está sobreexpresado, y a dichos microorganismos.

Estado de la técnica

Los L-aminoácidos, especialmente L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy particularmente en nutrición animal.

Es conocida la preparación de L-aminoácidos por la fermentación de cepas de Enterobacteriáceas, especialmente Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, están realizándose constantemente intentos para mejorar los procesos de preparación. Las mejoras en los procesos pueden referirse a medidas que implican la tecnología de la fermentación, v.g. agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutrientes, v.g. la concentración de azúcar durante la fermentación, o la elaboración hasta la forma del producto, v.g. por cromatografía de intercambio iónico, o las características intrínsecas de productividad del microorganismo propiamente dicho.

Las características de productividad de estos microorganismos se mejoran utilizando métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes para producir cepas que sean resistentes a antimetabolitos, v.g. el análogo de treonina ácido \alpha-amino-\beta-hidroxivalérico (AHV), o auxotróficas para metabolitos de importancia reguladora, y producir L-aminoácidos, v.g. L-treonina.

WO 02/077183 describe (véase SEQ ID No 20560, 56744, 39197, 75381 y las reivindicaciones 457, 471) microroganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli, que contienen un "ORF yibD" sobreexpresado.

Métodos de la tecnología de DNA recombinante han sido utilizados también desde hace algunos años para mejorar las cepas productoras de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriáceas por amplificación de genes individuales de la biosíntesis de los aminoácidos y estudio del efecto sobre la producción. Una revisión de la biología celular y molecular de Escherichia coli y Salmonella puede encontrarse en Neidhardt (ed.): Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 2nd edition, ASM Press, Washington DC, EE.UU.(1996).

WO 03/076637 describe un proceso para la preparación de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, por fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado y en las cuales el gen pepB está intensificado o sobreexpresado.

Objeto de la invención

El objetivo que se fijaron los inventores fue proporcionar nuevos procedimientos para mejorar la preparación de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, por fermentación.

Sumario de la invención

La descripción proporciona microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que contienen un marco de lectura abierto yibD sobreexpresado que codifica un polipéptido denominado glicosil-transferasa supuesta, o secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico, y que producen L-aminoácidos, especialmente L-treonina, de un modo intensificado.

Los microorganismos que no son recombinantes para el ORF yibD y no contienen ORF yibD intensificado sirven en todos los casos como el punto de partida para la comparación.

Estos microorganismos incluyen especialmente los de la familia Enterobacteriáceas en los cuales está intensificado un polinucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90%, especialmente al menos 95%, preferiblemente al menos 98% o al menos 99%, de modo particularmente preferible 99,7% y de modo muy particularmente preferible 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6.

Se prefieren secuencias de aminoácidos idénticas a las de SEQ ID No. 4 o SEQ ID No. 6.

Dichos microorganismos contienen polinucleótidos sobreexpresados seleccionados del grupo:

a): polinucleótido con la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5;

b): polinucleótido con una secuencia de nucleótidos correspondiente a SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 dentro de la degeneración del código genético;

c): polinucleótido con una secuencia que se hibrida en condiciones severas con la secuencia complementaria a la secuencia SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5;

d): polinucleótido con una secuencia SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 que contiene mutantes sentido neutros,

codificando los polinucleótidos una glicosil-transferasa supuesta.

La invención proporciona un proceso de fermentación para la preparación de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, que utiliza microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que, en particular, producen ya L-aminoácidos y en los cuales al menos el marco de lectura abierto (ORF) denominado yibD, o secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico, está (están) sobreexpresados.

Es preferible utilizar los microorganismos descritos.

El término "L-aminoácidos" o "aminoácidos" mencionado de aquí en adelante debe entenderse con el significado de uno o más aminoácidos, con inclusión de sus sales, seleccionados del grupo constituido por L-treonina, L-valina, L-lisina y L-homoserina. Es particularmente preferida L-treonina.

En este contexto, el término "intensificación" describe el aumento, en un microorganismo, de la actividad o concentración intracelular de una o más enzimas o proteínas codificadas por el DNA apropiado, por ejemplo por aumento del número de copias del o de los genes u ORF(s) en al menos una (1) copia, que enlaza funcionalmente un promotor fuerte al gen, o la utilización de un gen, alelo u ORF que codifica una enzima/proteína apropiada con una actividad alta, y opcionalmente combinación de estas medidas.

El marco de lectura abierto (ORF) se entiende con el significado de un segmento de una secuencia de nucleótidos que codifica o puede codificar una proteína/polipéptido o ácido ribonucleico al cual no puede asignarse función alguna de acuerdo con la técnica anterior.

Después que se ha asignado una función al segmento de secuencia nucleotídica en cuestión, se hace referencia generalmente al mismo como un gen. Los alelos se entienden generalmente con el significado de formas alternativas de un gen dado. Las formas se distinguen por diferencias en la secuencia de nucleótidos.

Un producto génico se entiende generalmente con el significado de la proteína codificada por una secuencia de nucleótidos, es decir un ORF, un gen o un alelo, o el ácido ribonucleico codificado.

Por las medidas de mejora, especialmente sobreexpresión, la actividad o concentración de la proteína apropiada se aumenta generalmente al menos en 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, y como máximo hasta 1000% o 2000%, basada en la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje o la de la proteína en el microorganismo o cepa parental que no es recombinante para la enzima/proteína apropiada. Microorganismo o cepa parental no recombinante se entiende con el significado del microorganismo sobre el cual se realizan las medidas de acuerdo con la invención.

La invención proporciona un proceso para la preparación de L-aminoácidos seleccionados del grupo constituidos por L-treonina, L-valina, L-lisina y L-homoserina por la fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas, en donde

a): los microorganismos que producen el L-aminoácido deseado, en los cuales el marco de lectura abierto yibD está sobreexpresado, se cultivan en un medio en condiciones en las cuales el L-aminoácido deseado se enriquece en el medio o en las células, y

b): el L-aminoácido deseado se aísla, quedando los constituyentes del caldo de fermentación, y/o la totalidad o una parte (\geq 0 a 100%) de la biomasa, en el producto aislado o eliminándose completamente,

en donde el marco de lectura abierto yibD codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6 y que tiene la actividad de una glicosiltransferasa supuesta.

Los microorganismos recombinantes, con un marco de lectura abierto (ORF) sobreexpresado denominado yibD, proporcionados también por la presente invención, pueden producir L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón u opcionalmente celulosa, o a partir de glicerol y etanol. Dichos microorganismos son representativos de la familia Enterobacteriáceas seleccionada de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros Escherichia y Serratia. Las especies Escherichia coli y Serratia marcescens pueden mencionarse en particular entre los géneros Escherichia y Serratia respectivamente.

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Los microorganismos recombinantes se producen generalmente por transformación, transducción o conjugación, o una combinación de estos métodos, con un vector que contiene el ORF deseado, el gen deseado, un alelo de este ORF o gen o partes del mismo, y/o un promotor que intensifica la expresión del ORF o el gen. Este promotor puede ser el promotor que se origina por mutación intensificadora de la secuencia reguladora inherente localizada aguas arriba del gen u ORE, o un promotor eficiente que se ha fusionado con el gen u ORF.

Ejemplos de cepas adecuadas, particularmente cepas productoras de L-treonina, del género Escherichia, y especialmente de la especie Escherichia coli son:

-: Escherichia coli H4581 (EP 0 301 572)

-: Escherichia coli KY10935 (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 61(11), 1877-1882 (1997))

-: Escherichia coli VNIIgenetika MG442 (US-A-4,278,765)

-: Escherichia coli VNIIgenetika M1 (US-A-4,321,325)

-: Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 (US-A-5,631,157)

-: Escherichia coli BKIIM B-3996 (US-A-5,175,107)

-: Escherichia coli kat 13 (WO 98/04715)

-: Escherichia coli KCCM-10132 (WO 00/09660)

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Ejemplos de cepas adecuadas productoras de L-treonina del género Serratia, y especialmente de la especie Serratia marcescens, son:

-: Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38(6), 1045-1051 (1979))

-: Serratia marcescens TLr156 (Gene 57(2-3), 151-158 (1987))

-: Serratia marcescens T-2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3), 255-265 (1992))

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Las cepas productoras de L-treonina de la familia Enterobacteriáceas poseen preferiblemente, inter alia, una o más características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo que comprende resistencia a ácido \alpha-amino-\beta-hidroxivalérico, resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a \alpha-metilserina, resistencia a ácido diaminosuccínico, resistencia a ácido \alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina, resistencia a ácido ciclopentano-carboxílico, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales como hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina tales como 6-dimetilaminopurina, necesidad de L-metionina, opcionalmente necesidad parcial y compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a refinado de treonina, resistencia a L-homoserina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad a fluoropiruvato, treonina-deshidrogenasa deficiente, opcionalmente capacidad para utilización de sacarosa, intensificación del operón treonina, intensificación de la homoserina-deshidrogenasa I-aspartato-quinasa I, preferiblemente de la forma resistente a la realimentación, intensificación de homoserina-quinasa, intensificación de treonina-sintasa, intensificación de aspartato-quinasa, opcionalmente de la forma resistente a la realimentación, intensificación de aspartato-semialdehído-deshidrogenasa, intensificación de fosfoenolpiruvato-carboxilasa, opcionalmente de la forma resistente a la realimentación, intensificación de fosfoenolpiruvato-sintasa, intensificación de transhidrogenasa, intensificación del producto del gen RhtB, intensificación del producto del gen RhtC, intensificación del producto del gen YfiK, intensificación de una piruvato-carboxilasa y atenuación de la formación de ácido acético.

Se ha encontrado que la producción de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, por microorganismos de la familia Enterobacteriáceas se mejora después de sobreexpresión del gen o marco de lectura abierto (ORF) yibD o sus alelos.

Las secuencias de nucleótidos de los genes o marcos de lectura abiertos (ORFs) de Escherichia coli pertenecen a la técnica anterior y pueden tomarse de la secuencia genómica de Escherichia coli publicada por Blattner et al (Science 277, 1453-1462 (1997)). Se sabe que el aminoácido metionina N-terminal puede ser escindido por enzimas específicas del hospedador (metionina-aminopeptidasa).

La secuencia de nucleótidos para el ORF yibD es conocida análogamente de Salmonella typhimurium, que pertenece también a la familia Enterobacteriáceas.

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El ORF yibD de Escherichia coli K12 se describe inter alia por los datos siguientes:

Nombre:: marco de lectura abierto

Función:: glucosil-transferasa supuesta

Descripción:: el marco de lectura abierto yibD codifica una proteína de 40,5 kDa; el punto isoeléctrico es 9,4; el ORF yibD está localizado en un cromosoma v.g. en el caso de Escherichia coli K12 MG1655 en la región intergénica del marco de lectura abierto yibQ que codifica una proteína hipotética, y el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa

Referencia:: Blattner et al., Science 277 (5331), 1453-1474 (1997)

No. de acceso:: AE000439

Nombre alternativo del gen:: b3615

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Las secuencias de ácido nucleico pueden tomarse de los bancos de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, EE.UU.), el banco de datos de secuencias de nucleótidos de los European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania, o Cambridge, Reino Unido) o el banco de datos de DNA de Japón (DDBJ, Mishima, Japón).

Para mayor claridad, la secuencia conocida del ORF yibD de Escherichia coli se muestra como SEQ ID No. 3 y la secuencia conocida del ORF yibD de Salmonella typhimurium se muestra como SEQ ID No. 5. Las proteínas codificadas por estos marcos de lectura se muestran como SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6.

Los marcos de lectura abiertos descritos en las referencias bibliográficas citadas pueden utilizarse de acuerdo con la invención. Es asimismo posible utilizar alelos de los genes, o marcos de lectura abiertos, que resultan de la degeneración del código genético o de mutaciones sentido neutras. Se prefiere el uso de genes endógenos o marcos de lectura abierta endógenos.

El término "genes endógenos" o "secuencias de nucleótidos endógenas" debe entenderse con el significado de los genes, marcos de lectura abiertos o alelos, o secuencias de nucleótidos, presentes en la población de una especie.

Los alelos del ORF yibD que contienen mutaciones sentido neutras incluyen, inter alia, aquéllos que dan como máximo 40, como máximo 30 o como máximo 20, preferiblemente como máximo 10 o como máximo 5, de modo muy particularmente preferible como máximo 3 o como máximo 2 o al menos un cambio conservador de aminoácido en la proteína codificada por ellos.

En el caso de aminoácidos aromáticos, se hace referencia a cambios conservadores cuando se cambian unos por otros fenil-alanina, triptófano y tirosina. En el caso de aminoácidos hidrófobos, se hace referencia a cambios conservadores cuando se cambian unos por otros leucina, isoleucina y valina. En el caso de aminoácidos polares, se hace referencia a cambios conservadores cuando se cambian una por otra glutamina y aspargina. En el caso de aminoácidos básicos, se hace referencia a cambios conservadores cuando se cambian unos por otros arginina, lisina e histidina. En el caso de aminoácidos ácidos, se hace referencia a cambios conservadores cuando se cambian uno por otro ácido aspártico y ácido glutámico. En el caso de aminoácidos que contienen grupos hidroxilo, se hace referencia a cambios conservadores cuando se cambian una por otra serina y treonina.

Análogamente, es también posible utilizar secuencias de nucleótidos que codifican variantes de dichas proteínas que comprenden adicionalmente un alargamiento o acortamiento en al menos un (1) aminoácido en el término N o C. Este alargamiento o acortamiento asciende a no más de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 ó 2 aminoácidos o residuos de aminoácidos.

Alelos adecuados incluyen también aquéllos que codifican proteínas en las cuales se ha insertado (inserción) o delecionado (deleción) al menos un (1) aminoácido. El número máximo de tales cambios, denominados indels, puede afectar a 2, 3, 5, 10 ó 20 aminoácidos, pero en ningún caso más de 30 aminoácidos.

Alelos adecuados incluyen también aquéllos que pueden obtenerse por hibridación, especialmente en condiciones severas, utilizando SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 o porciones de las mismas, especialmente las regiones codificantes o las secuencias complementarias a las mismas.

Los expertos en la técnica encontrarán instrucciones acerca de la identificación de secuencias de DNA por medio de hibridación en, inter alia, el manual "The DIG System User's Guide for Filter Hybridization", de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar en condiciones severas, es decir, los únicos híbridos formados son aquéllos en los cuales la sonda y la secuencia diana, es decir los polinucleótidos tratados con la sonda, son al menos 80% idénticos. Es sabido que la severidad de la hibridación, con inclusión de los pasos de lavado, se ve influida o determinada por variación de la composición del tampón, la temperatura y la concentración de sales. La reacción de hibridación se lleva a cabo generalmente a severidad relativamente baja comparada con los pasos de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).

La reacción de hibridación puede llevarse a cabo utilizando v.g. un tampón correspondiente a 5x tampón SSC a una temperatura de aprox. 50ºC-68ºC. Es también posible en este caso hibridar sondas con polinucleótidos que son menos de 80% idénticos a la secuencia de la sonda. Tales híbridos son menos estables y se separan por lavado en condiciones severas. Esto puede realizarse v.g. por disminución de la concentración de sales a 2x SSC y opcionalmente 0,5x SSC posteriormente (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), ajustándose la temperatura a aprox. 50ºC-68ºC; aprox. 52ºC-68ºC, aprox. 54-68ºC, aprox. 56ºC-68ºC, aprox. 58ºC-68ºC, aprox. 60ºC-68ºC, aprox. 62ºC-68ºC, aprox. 64ºC-68ºC o aprox. 66ºC-68ºC. Se prefieren intervalos de temperatura de aprox. 64ºC-68ºC o aprox. 66ºC-68ºC. Opcionalmente es posible rebajar la concentración de sales hasta un valor correspondiente a 0,2x SSC o 0,1x SSC. Por aumento gradual de la temperatura de hibridación desde 50ºC a 68ºC en pasos de aprox. 1-2ºC, es posible aislar fragmentos de polinucleótidos que son v.g. al menos 80%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idénticos a la secuencia de la sonda utilizada o a las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5. Instrucciones adicionales sobre hibridación están disponibles comercialmente en forma de kit (v.g. DIG Easy Hyb de Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, catálogo no. 1603558).

La intensificación puede realizarse por ejemplo por aumento de la expresión de los genes, marcos de lectura abiertos o alelos o intensificación de las propiedades catalíticas de la proteína. Ambas medidas pueden combinarse opcionalmente.

La sobreexpresión puede realizarse por ejemplo por aumento del número de copias de los genes o marcos de lectura abiertos apropiados o mutación del promotor y la región reguladora o el sitio de fijación de ribosoma localizado aguas arriba del gen estructural. Las casetes de expresión incorporadas aguas arriba del gen estructural actúan del mismo modo. Promotores inducibles hacen adicionalmente posible aumentar la expresión en el curso de la producción de L-treonina por fermentación; el uso de promotores para expresión génica que permite la expresión de otros genes transitorios puede ser también ventajoso. Medidas para prolongación de la vida del mRNA mejoran también la expresión. Adicionalmente, la actividad enzimática se intensifica también por prevención de la degradación de la proteína enzimática. Los ORFs, genes o constructos génicos pueden estar localizados en plásmidos de número de copias variable o estar integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente, es también posible conseguir la sobreexpresión de los genes en cuestión por cambio de la composición de los medios y la técnica de cultivo.

Métodos de sobreexpresión se describen adecuadamente en la técnica anterior, por ejemplo en Makrides et al. (Microbiological Reviews 60(3), 512-538 (1996)). El uso de vectores aumenta el número de copias al menos en una (1) copia. Plásmidos tales como los descritos v.g. en US 5.538.873 pueden utilizarse como vectores. Fagos, por ejemplo el fago mu, como se describe en EP 0332448, o el fago lambda (\lambda), pueden utilizarse también como vectores. El número de copias puede aumentarse también por incorporación de otra copia en otro sitio del cromosoma, por ejemplo en el sitio att del fago \lambda (Yu y Court, Gene 223, 77-81 (1998)). El documento US 5.939.307 describe que la expresión podría incrementarse por incorporación de casetes de expresión o promotores tales como el promotor tac, el promotor trp, el promotor lpp o el promotor P_{L} y el promotor P_{R} del fago \lambda, por ejemplo aguas arriba del operón cromosómico de treonina. Los promotores del fago T7, los promotores de "caja de cambios" (sic) o el promotor nar pueden utilizarse análogamente. Tales casetes de expresión o promotores pueden utilizarse también para sobreexpresar genes unidos a plásmidos, como se describe en EP 0 593 792. La expresión de genes unidos a plásmidos puede controlarse a su vez por utilización del alelo lacIº (Glascock y Weickert, Gene 223, 221-231 (1998)). Adicionalmente, es posible aumentar la actividad de los promotores por modificación de su secuencia por uno o más cambios de nucleótidos, por una o más inserciones y/o por una o más deleciones. Otra expresión de genes transitorios puede lograrse por utilización del promotor fis dependiente de la fase de crecimiento, por ejemplo como se describe en Walker et al (Journal of Bacteriology 181, 1269-80 (1999)).

Los expertos en la técnica encontrarán instrucciones generales relevantes inter alia en Chang y Cohen (Journal of Bacteriology 134, 1141-1156 (1978)), Hartley y Gregori (Gene 13, 347-353 (1981)), Amann y Brosius (Gene 40, 183190 (1985)), de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80, 21-25 (1983)), LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), PCT/US97/13359, Liosa et al. (Plasmid 26, 222-224 (1991)), Quandt y Klipp (Gene 80, 161-169 (1989)), Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171, 4617-4622 (1989)); Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) y libros de texto bien conocidos sobre genética y biología molecular.

Pueden utilizarse vectores plasmídicos replicables en Enterobacteriáceas, v.g. vectores de clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et al., Gene 102, 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al., Gene 69, 301-315 (1988)) o derivados de pSC101 (Vocke y Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21), 6557-6561 (1983)). En un proceso de acuerdo con la invención, es posible utilizar una cepa transformada con un vector plasmídico, llevando dicho vector plasmídico al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el ORF yibD o su producto génico, o alelo.

El término "transformación" debe entenderse con el significado de la absorción de un ácido nucleico aislado por un hospedador (microorganismo).

Asimismo, mutaciones que afectan a la expresión de los genes o marcos de lectura abiertos apropiados pueden transferirse a cepas diferentes por cambio de secuencia (Hamilton et al., Journal of Bacteriology 171, 4617-4622 (1989)), conjugación o transducción.

Detalles adicionales sobre los conceptos de genética y biología molecular pueden encontrarse en libros de texto bien conocidos sobre genética y biología molecular, por ejemplo el libro de texto de Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4th ed., Springer Verlag, Nueva York (EE.UU.), 2000), el libro de texto de Berg, Tymoczko y Stryer (Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company, Nueva York (EE.UU.), 2002) o el libro de texto de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual (conjunto de 3 volúmenes), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE.UU.), 2001).

Adicionalmente, para la producción de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, con cepas de la familia Enterobacteriáceas, puede ser ventajoso no sólo intensificar el marco de lectura abierto yibD, sino también intensificar una o más enzimas del camino conocido de biosíntesis de la treonina, o enzimas del metabolismo anaplerótico, o enzimas para la producción de nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato reducido, o enzimas glicolíticas, o enzimas PTS, o enzimas del metabolismo del azufre. Generalmente se prefiere el uso de genes endógenos.

Así, por ejemplo, uno o más genes seleccionados del grupo que comprende:

\bullet: al menos un gen del operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa (US-A-4.278.765),

\bullet: el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato-carboxilasa (WO 99/18228),

\bullet: el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231(2), 332-336 (1992)),

\bullet: el ppc gen que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa (WO 02/064808),

\bullet: los genes pntA y pntB que codifican las subunidades de transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158, 647-653 (1986)),

\bullet: el gen rhtB que codifica la proteína que confiere resistencia a homoserina (EP-A-0 994 190),

\bullet: el gen rhtC que codifica la proteína que confiere resistencia a treonina (EP-A-1 013 765),

\bullet: el thrE gen de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína portadora de la exportación de treonina (WO 01/92545),

\bullet: el gdhA gen que codifica glutamato-deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11, 5257-5266 (1983); Gene 23, 199-209 (1983)),

\bullet: el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa (WO 03/004598),

\bullet: el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato-aldolasa (WO 03/004664),

\bullet: el gen ptsH del operón ptsHlcrr que codifica fosfohistidina-protein-hexosa-fosfotransferasa del sistema de fosfotransferasa PTS (WO 03/004674),

\bullet: el gen ptsI del operón ptsHlcrr que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa PTS (WO 03/004674),

\bullet: el gen crr del operón ptsHlcrr que codifica el componente IIA específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa PTS (WO 03/004674),

\bullet: el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa (WO 03/004670),

\bullet: el gen lrp que codifica el regulador del regulan leucina (WO 03/004665),

\bullet: el gen fadR que codifica el regulador del regulan fad (WO 03/038106),

\bullet: el gen ic1R que codifica el regulador del metabolismo central intermedio (WO 03/038106),

\bullet: el gen ahpC del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa (WO 03/004663),

\newpage

\bullet: el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa (WO 03/004663),

\bullet: el gen cysK que codifica cisteina-sintasa A (WO 03/006666),

\bullet: el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys (WO 03/006666),

\bullet: el gen cysJ del operón cysJIH que codifica la flavo-proteína de la NADPH-sulfito-reductasa (WO 03/006666),

\bullet: el gen cysI del operón cysJlH que codifica la hemo-proteína de la NADPH-sulfito-reductasa (WO 03/006666),

\bullet: el gen cysH del operón cysJIH que codifica adenilil-sulfato-reductasa (WO 03/006666),

\bullet: el gen rseA del operón rseABC que codifica una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE (WO 03/008612),

\bullet: el gen rseC del operón rseABC que codifica un regulador global del factor sigmaE (WO 03/008612),

\bullet: el gen sucA del operón sucABCD que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa (WO 03/008614),

\bullet: el gen sucB del operón sucABCD que codifica la subunidad dihidrolipoil-transsuccinasa E2 de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa (WO 03/008614),

\bullet: el gen sucC del operón sucABCD que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA-sintetasa (WO 03/008615),

\bullet: el gen sucD del operón sucABBD que codifica la subunidad \alpha de succinil-CoA-sintetasa (WO 03/008615),

\bullet: el gen aceE que codifica el componente El del complejo piruvato-deshidrogenasa (WO 03/076635),

\bullet: el gen aceF que codifica el componente E2 del complejo piruvato-deshidrogenasa (WO 03/076635),

\bullet: el gen rseB que codifica el regulador de la actividad del factor sigmaE (Molecular Microbiology 24(2), 355-371 (1997)),

\bullet: el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yodA de Escherichia coli (Número de Acceso AE000288 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), DE 10361192.4),

\bullet: el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yaaU de Escherichia coli (Número de Acceso AE005181 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), DE 10361268.8),

\bullet: el gen malT para el activador positivo de la transcripción del regulón maltosa (Gene 42, 201-208 (1986)) y

\bullet: el gen eno que codifica enolasa (The Journal of Biological Chemistry 246(22), 6797-6802 (1971)) pueden sobreexpresarse simultáneamente.

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Adicionalmente, para la producción de L-treonina, puede ser ventajoso no sólo intensificar el marco de lectura abierto yibD, sino también desactivar uno o más genes seleccionados del grupo que comprende:

\bullet: el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa (Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),

\bullet: el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa (E.C.1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),

\bullet: el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA de Escherichia coli (Número de Acceso AAC77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), WO 02/29080),

\bullet: el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP de Escherichia coli (Número de Acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), WO 02/29080),

\bullet: el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (WO 02/29080),

\bullet: el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa (WO 02/36797),

\bullet: el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa (WO 02/081721), que es conocido también como el gen mlc,

\bullet: el gen fruR que codifica el represor fructosa (WO 02/081698), que es conocido también como el gen cra,

\bullet: el gen rpoS que codifica el factor sigma3B (WO 01/05939), que es conocido también como el gen katF, y

\bullet: el gen aspA que codifica aspartato-amonio-liasa (WO 03/008603),

o reducir la expresión de los mismos.

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En este contexto, el término "atenuación" describe la disminución o desactivación de la actividad o concentración intracelular, en un microorganismo, de una o más enzimas/proteínas codificadas por el DNA apropiado, por ejemplo por utilización de un promotor más débil que en el microorganismo o cepa parental que no es recombinante para la enzima/proteína apropiada, o un gen o alelo que codifica una enzima/proteína apropiada con una actividad baja, o desactivación de la enzima/proteína, el marco de lectura abierto o el gen apropiados, y opcionalmente combinación de estas medidas.

Las medidas de atenuación reducen generalmente la actividad o concentración de la proteína apropiada en un 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje o de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo o cepa parental que no es recombinante para la enzima/proteína apropiada. Microorganismo o cepa parental no recombinante debe entenderse con el significado del microorganismo sobre el cual se realizan las medidas de acuerdo con la invención.

La atenuación puede realizarse por ejemplo por reducción o desactivación de la expresión de los genes o marcos de lectura abiertos o las propiedades catalíticas de las proteínas enzimáticas. Ambas medidas pueden combinarse opcionalmente.

La expresión de los genes puede reducirse por una técnica de cultivo apropiada, por modificación genética (mutación) de las estructuras señal de la expresión génica o bien por una técnica de RNA antisentido. Estructuras señal de la expresión génica son v.g. genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de fijación de ribosoma, el codón inicial y los terminadores. Los expertos en la técnica encontrarán información relevante inter alia en v.g. Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), Carrier y Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999)), Franch y Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000)) y libros de texto bien conocidos sobre genética y biología molecular, tales como el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6ª edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o el de Winnacker (From Genes to Clones, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990).

Mutaciones que dan como resultado una modificación o reducción de las propiedades catalíticas de las proteínas enzimáticas son conocidas por la técnica anterior. Ejemplos que pueden mencionarse son los documentos de Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272, 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 5511-5515 (1998)) y Wente y Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991)). Pueden encontrarse revisiones en libros de textos bien conocidos sobre genética y biología molecular, por ejemplo el publicado por Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Mutaciones posibles son transiciones, transversiones, inserciones y deleciones de al menos un (1) par de bases/nucleótido. Dependiendo del efecto del cambio de aminoácido causado por la mutación de la actividad enzimática, se utiliza el término "mutaciones de sentido erróneo" o "mutaciones sin sentido". Una mutación de sentido erróneo da como resultado un cambio de un aminoácido dado en una proteína por otro aminoácido, siendo dicho cambio de aminoácido particularmente no conservador. Esto deteriora la aptitud o actividad funcional de la proteína y reduce la misma a un valor de 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5%. Una mutación sin sentido da como resultado un codón de parada en la región codificante del gen y por tanto una terminación prematura de la traducción. Inserciones o deleciones de al menos un par de bases en un gen dan como resultado mutaciones de desplazamiento de marco, cuya consecuencia es que se incorporan aminoácidos falsos o se termina prematuramente la traducción. Si se produce un codón de parada en la región codificante como consecuencia de la mutación, esto da también como resultado una terminación prematura de la traducción. Deleciones de al menos uno (1) o varios codones dan como resultado también típicamente una pérdida completa de la actividad enzimática.

Instrucciones acerca de la producción de tales mutaciones pertenecen a la técnica anterior y pueden encontrarse en libros de texto bien conocidos sobre genética y biología molecular, tales como el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6a edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker (From Genes to Clones, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Mutaciones adecuadas en los genes pueden incorporarse en cepas adecuadas por cambio de genes o alelos.

Un método común es el de cambio de gen con ayuda de un derivado pMAK705 de pSC101 que se replica condicionalmente, como ha sido descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171, 4617-4622 (1989)). Pueden utilizarse análogamente otros métodos descritos en la técnica anterior, por ejemplo el de Martínez-Morales et al(Journal of Bacteriology 181, 7143-7148 (1999)) o el de Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)).

Son asimismo posibles mutaciones en los genes particulares, o mutaciones que afectan a la expresión de los genes o marcos de lectura abiertos particulares, que son transferidas a cepas diferentes por conjugación o transducción.

Adicionalmente, para la producción de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, puede ser ventajoso no sólo intensificar el marco de lectura abierto yibD, sino también desactivar reacciones secundarias indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).

Los microorganismos preparados de acuerdo con la invención pueden cultivarse por el proceso de lotes, el proceso de lote alimentado ("fed batch"), el proceso de lote alimentado repetido, o un proceso continuo (DE 102004028859.3 o US 5.763.230). Un sumario de métodos de cultivo conocidos se proporciona en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo a utilizar debe cumplir adecuadamente las exigencias de las cepas particulares. Descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos se contienen en "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington DC, EE.UU., 1981).

Fuentes de carbono que pueden utilizarse son azúcares y carbohidratos, v.g. glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y opcionalmente celulosa, aceites y grasas, v.g. aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos, v.g. ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, v.g. glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, v.g. ácido acético. Estas sustancias pueden utilizarse individualmente o en forma de mezcla.

Fuentes de nitrógeno que pueden utilizarse son compuestos orgánicos nitrogenados tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz, harina de semilla de soja y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o en forma de mezcla.

Fuentes de fósforo que pueden utilizarse son ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato dipotásico, o las sales de sodio correspondientes. El medio de cultivo debe contener también sales metálicas, v.g. sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, pueden utilizarse sustancias esenciales promotoras del crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas además de las sustancias arriba mencionadas. Pueden añadirse también al medio de cultivo precursores adecuados. Dichos materiales de alimentación pueden añadirse al medio de cultivo en una sola vez o dosificarse adecuadamente durante el cultivo.

La fermentación se lleva a cabo generalmente a un pH de 5,5 a 9,0, especialmente de 6,0 a 8,0. El pH del cultivo se controla por el uso apropiado de compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o amoníaco acuoso, o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. La formación de espuma puede controlarse utilizando antiespumantes tales como ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. La estabilidad de los plásmidos pueden mantenerse por adición al medio de sustancias de acción selectiva adecuadas, v.g. antibióticos. Se mantienen condiciones aerobias por introducción de oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, v.g. aire, en el cultivo. La temperatura del cultivo es normalmente de 25ºC a 45ºC y preferiblemente 30ºC a 40ºC. El cultivo se continúa hasta que la formación de L-aminoácidos o L-treonina ha alcanzado un máximo. Este objetivo se consigue normalmente dentro de 10 horas a 160 horas.

Los L-aminoácidos pueden analizarse por cromatografía de intercambio aniónico seguida por derivatización con ninhidrina, como se describe por Spackman et al. (Analytical Chemistry 30, 1190-1206 (1958)), o por HPLC en fase inversa, como se describe por Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51, 1167-1174 (1979)).

El proceso de acuerdo con la invención se utiliza para preparar los L-aminoácidos L-treonina, L-valina, L-homoserina y L-lisina, especialmente L-treonina, por fermentación. El microorganismo siguiente ha sido depositado en la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Brunswick, Alemania) de acuerdo con los términos del Convenio de Budapest:

\bullet: cepa de Escherichia coli E. coli MG442 como DSM16574.

La presente invención se ilustra a continuación con mayor detalle con ayuda de ejemplos.

El medio mínimo (M9) y el medio completo (LB) utilizados para Escherichia coli han sido descritos por J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). El aislamiento de DNA plasmídico a partir de Escherichia coli y todas las técnicas para restricción, ligación, tratamiento Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina se llevan a cabo de acuerdo con Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). A no ser que se indique otra cosa, la transformación de Escherichia coli se lleva a cabo de acuerdo con Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86, 2172-2175 (1989)).

La temperatura de incubación en la preparación de las cepas y los transformantes es 37ºC.

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Ejemplo 1 Construcción del plásmido de expresión pTrc99AyibD

El gen yibD de E. coli K12 se amplifica utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y oligonucleótidos sintéticos. La secuencia de nucleótidos del ORF yibD en E. coli K12 MG1655 (Número de Acceso AE000439, Blattner et al. (Science 277, 1453-1474 (1997))) se utiliza como material de partida para sintetizar los iniciadores de la PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Las secuencias de los iniciadores se modifican para proporcionar sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción. La secuencia de reconocimiento para SacI se selecciona para el iniciador yibD-ex1 y la secuencia de reconocimiento para HindIII se selecciona para el iniciador yibD-ex2, estando subrayadas dichas secuencias en las secuencias de nucleótidos que se muestran a continuación:

1

El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655 utilizando para la PCR se aísla con "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un fragmento de DNA de aproximadamente 1114 pb puede amplificarse con los iniciadores específicos en condiciones PCR estándar (Innis et al (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press) utilizando DNA polimerasa Vent (New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Alemania) (SEQ ID No. 3).

El fragmento yibD amplificado se liga con el vector pCR-Blunt II-TOPO (Zero Topo TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Países Bajos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se transforma en la cepa TOP10 de E. coli. Las células portadoras de plásmido se seleccionan en agar LB complementado con 50 \mug/ml de kanamicina. Después de aislamiento del DNA plasmídico, el vector se escinde con las enzimas PvuI y HindIII/SacI y, después que se ha comprobado la escisión en gel de agarosa al 0,8%, se denomina pCRBluntyibD.

El vector pCRBluntyibD se escinde luego con las enzimas HindIII y SacI y, después de separación en gel de agarosa al 0,8%, el fragmento yibD se aísla del gel (QIA-quick Gel Extraction Kit, QIAGEN, Hilden, Alemania) y se liga con el vector pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) que se ha digerido con las enzimas HindIII y SacI. La cepa de E. coli XL1Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, EE. UU.) se transforma con la mezcla de ligación y se seleccionan las células portadoras del plásmido en agar LB complementado con 50 \mug/ml de ampicilina.

El éxito de la clonación puede demostrarse, después de aislamiento del DNA plasmídico, por escisión controlada con la enzima PvuI.

El plásmido se denomina pTrc99AyibD (Figura 1).

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Ejemplo 2 Preparación de L-treonina con la cepa MG442/pTrc99AyibD

La cepa de E. coli MG442 productora de L-treonina se describe en la patente US-A-4.278.765, y está depositada en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, Moscú, Rusia) como CMIM B-1628 y en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células (DSMZ, Brunswick, Alemania) como DSM 16574 bajo los términos del Convenio de Budapest.

La cepa MG442 se transforma con el plásmido de expresión pTrc99AyibD, descrito en el Ejemplo 1, y con el vector pTrc99A, y las células portadoras del plásmido se seleccionan en agar LB complementado con 50 \mug/ml de ampicilina. Este procedimiento produce las cepas MG442/pTrc99AyibD y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales seleccionadas se multiplican luego adicionalmente en medio mínimo de la composición siguiente: 3,5 g/l de Na_{2}HPO_{4}\cdot
2H_{2}O, 1,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de NH_{4}Cl, 0,1 g/l de MgSO_{4}.7H_{2}O, 2 g/l de glucosa, 20 g/l de agar, 50 mg/l de ampicilina. La formación de L-treonina se verifica en cultivos lote de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100 ml. Esto se realiza por inoculación de 10 ml de medio de precultivo de la composición siguiente: 2 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/1 de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 15 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina, e incubación durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza). Se transfieren 250 \mul de cada uno de estos precultivos a 10 ml de medio de producción (25 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de MgSO_{4}.7H_{2}O, 0,03 g/l de FeSO_{4}.7H_{2}O, 0,018 g/l de MnSO_{4}.1H_{2}O, 30 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina) y se incuban durante 48 horas a 37ºC. La formación de L-treonina por la cepa original MG442 se verifica del mismo modo excepto que no se añade cantidad alguna de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo utilizando un fotómetro LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de medida de 660 nm.

La concentración de L-treonina formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en condiciones estériles utilizando un analizador de aminoácidos de Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por medio de cromatografía de intercambio iónico y reacción poscolumna con detección por ninhidrina.

La Tabla 1 muestra el resultado del experimento.

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TABLA 1

2

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Breve descripción de la figura

Figura 1: Mapa del plásmido pTrc99AyibD que contiene el ORF yibD

Las longitudes indicadas deben entenderse como aproximadas. Las abreviaturas y símbolos utilizados se definen como sigue:

\bullet bla:: gen codificante de resistencia a ampicilina

\bullet lac Iq:: gen para la proteína represora del promotor trc

\bullet trc:: región promotora trc, inducible por IPTG

\bullet yibD:: región codificante del gen yibD

\bullet 5S:: región de rRNA 5S

\bullet rrnBT:: región del terminador rRNA

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Las abreviaturas para las enzimas de restricción se definen como sigue:

\bullet PvuI:: endonucleasa de restricción de Proteus vulgaris

<110> Deguasa AG

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<120> Proceso de fermentación para la preparación de L-aminoácidos utilizando cepas de la familia Enterobacteriáceas

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<130> 030375 BT

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.1

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Iniciador

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<222> (1)..(31)

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<223> yibD-ex1

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\hskip1cm

3

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> Iniciador

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<222> (1)..(32)

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<223> yibD-ex2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\hskip1cm

4

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 1114

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<212> DNA

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<213> Escherichia coli

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Producto PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1114)

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<223> Producto PCR de yibD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (45)..(1079)

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<223> Región codificante de yibD

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Iniciador fijación

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<222> (1)..(31)

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<223> Iniciador yibD-ex1

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Iniciador fijación

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<222> (1083)..(1114)

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<223> Iniciador yibD-ex2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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5

6

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 344

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<212> ART

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<213> Escherichia coli

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1035

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Salmonella typhimurium

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1035)

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<223> yibD-Orf

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<400> 5

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9

10

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<210> 6

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<211> 344

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<212> PRT

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<213> Salmonella typhimurium

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<400> 6

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11

12

Claims

1. Proceso para la preparación de L-aminoácidos seleccionados del grupo constituido por L-treonina, L-valina, L-lisina y L-homoserina por la fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas, en donde

2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los microorganismos contienen un polinucleótido sobreexpresado correspondiente al marco de lectura abierto yibD y seleccionado del grupo:

c): polinucleótido con una secuencia que se híbrida en condiciones severas con la secuencia complementaria a la secuencia SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5;

d): polinucleótido con una secuencia SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 que contiene mutantes sentido neutros.

3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que comprende SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6.

4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos que es 100% idéntica a la de SEQ ID No. 4 o SEQ ID No. 6.

5. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en donde los microorganismos se producen por transformación, transducción o conjugación, o una conjugación de estos métodos, con un vector que contiene el marco de lectura abierto yibD, y/o un promotor.

6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 5 en el cual el número de copias del marco de lectura abierto yibD se incrementa al menos en 1.

7. Proceso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el aumento en el número de copias del marco de lectura abierto yibD de al menos 1 se consigue por integración del marco de lectura abierto en el cromosoma de los microorganismos.

8. Proceso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el aumento en el número de copias del marco de lectura abierto yibD de al menos 1 se consigue por un vector de replicación extracromosómico.

9. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sobreexpresión se realiza por

a): mutación del promotor y la región reguladora o el sitio de fijación de ribosoma aguas arriba del marco de lectura abierto yibD, o

b): incorporación de casetes de expresión o promotores aguas arriba del ORF yibD.

10. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el marco de lectura abierto yibD se halla bajo el control de un promotor que intensifica la expresión del gen.

11. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, en donde la sobreexpresión del marco de lectura abierto yibD aumenta la concentración del producto del gen yibD al menos en un 10%, basado en la concentración del producto génico en el microorganismo o cepa parental que no es recombinante para el marco de lectura abierto yibD.

12. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11, en donde los microorganismos se seleccionan de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia.

13. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12, en donde, para preparar L-treonina, se fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales adicionalmente uno o más genes seleccionados del grupo que comprende:

13.1: al menos un gen del operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,

13.2: el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato-carboxilasa,

13.3: el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa,

13.4: el ppc gen que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa,

13.5: los genes pntA y pntB que codifican las subunidades de transhidrogenasa,

13.6: el gen rhtB que codifica la proteína que confiere resistencia a homoserina,

13.7: el gen rhtC que codifica la proteína que confiere resistencia a treonina,

13.8: el thrE gen de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína portadora de la exportación de treonina,

13.9: el gdhA gen que codifica glutamato-deshidrogenasa,

13.10: el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa,

13.11: el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato-aldolasa,

13.12: el gen ptsH del operón ptsHlcrr que codifica fosfohistidina-protein-hexosa-fosfotransferasa del sistema de fosfotransferasa PTS,

13.13: el gen ptsl del operón ptsHlcrr que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa PTS,

13.14: el gen crr del operón ptsHlcrr que codifica el componente IIA específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa PTS,

13.15: el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa,

13.16: el gen lrp que codifica el regulador del regulón leucina,

13.17: el gen fadR que codifica el regulador del regulón fad,

13.18: el gen iclR que codifica el regulador del metabolismo central intermedio,

13.19: el gen ahpC del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa,

13.20: el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa,

13.21: el gen cysK que codifica cisteína-sintasa A,

13.22: el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys,

13.23: el gen cysJ del operón cysJIH que codifica la flavoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa,

13.24: el gen cysI del operón cysJIH que codifica la hemoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa,

13.25: el gen cysH del operón cysJIH que codifica adenilil-sulfato-reductasa,

13.26: el gen rseA del operón rseABC que codifica una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE,

13.27: el gen rseC del operón rseABC que codifica un regulador global del factor sigmaE,

13.28: el gen sucA del operón sucABCD que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa,

13.29: el gen sucB del operón sucABCD que codifica la subunidad dihidrolipoil-transsuccinasa E2 de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa,

13.30: el gen sucC del operón sucABCD que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA-sintetasa,

13.31: el gen sucD del operón sucACBD codifica la subunidad \alpha de succinil-CoA-sintetasa,

13.32: el gen aceE que codifica el componente El del complejo piruvato-deshidrogenasa,

13.33: el gen aceF que codifica el componente E2 del complejo piruvato-deshidrogenasa,

13.34: el gen rseB que codifica el regulador de la actividad del factor sigmaE,

13.35: el producto génico del marco de lectura abierto yodA de Escherichia coli,

13.36: el producto génico del marco de lectura abierto yaaU de Escherichia coli,

13.37: el gen malT para el activador positivo de la transcripción del regulón maltosa, y

13.38: el gen eno que codifica enolasa

Se sobreexpresan simultáneamente.

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14. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque, para preparar L-treonina, se fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales adicionalmente uno o más genes seleccionados del grupo que comprende:

14.1: el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,

14.2: el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,

14.3: el producto génico del marco de lectura abierto yjfA de Escherichia coli,

14.4: el producto génico del marco de lectura abierto ytfP de Escherichia coli,

14.5: el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa,

14.6: el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa,

14.7: el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,

14.8: el gen fruR que codifica el represor fructosa,

14.9: el gen rpoS que codifica el factor sigma^{38}, y

14.10: el gen aspA que codifica aspartato-amonio-liasa, se desactivan simultáneamente, o se reduce la expresión de los mismos.

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15. Microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que contienen un marco de lectura abierto yibD sobreexpresado, en donde el marco de lectura abierto yibD codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6, y que tiene la actividad de una glicosil-transferasa supuesta, y simultáneamente un gen tdh, que codifica treonina-deshidrogenasa, que está desactivado o cuya expresión se reduce.