ES2325911T3 - Fragmento genomico de streptococcus suis y usos clinicos del mismo. - Google Patents

Abstract

Un método para modular la virulencia de un Streptococcus que comprende modificar una secuencia nucleotídica de dicho Streptococcus donde dicha secuencia nucleotídica es identificable por hibridación a 65ºC con la secuencia de la figura 5A y/o 5B.

Description

Fragmento genómico de Streptococcus suis y usos clínicos del mismo.

La invención se refiere al campo del diagnóstico la vacunación contra infecciones Estreptocócicas y a la detección de marcadores de virulencia de Streptococcuss.

Las especies de Streptococcus, de las cuales hay una gran variedad que causan infecciones en animales domésticos y en el hombre, a menudo se agrupan según los grupos de Lancefield. El tipado según Lancefield ocurre en base a determinantes serológicos o antígenos que están entre otros, presentes en la cápsula de la bacteria y permiten sólo una determinación aproximada, a menudo las bacterias de un grupo diferente muestran reactividad cruzada con otras, mientras que otros Streptococcuss no pueden ser asignados a un determinante de grupo. Dentro de los grupos, la diferenciación adicional también es posible en base al serotipado: estos serotipos además contribuyen a la gran variabilidad antigénica de Streptococcuss, un hecho que crea una matriz de dificultades dentro del diagnóstico de vacunación frente a infecciones Estreptocócica.

Los Streptococcuss del grupo A de Lancefield (GAS, Streptococcus pyogenes), son comunes en niños, que causan infecciones nasofaríngeas y complicaciones de las mismas. Entre animales, el ganado es especialmente susceptible a GAS, donde normalmente se encuentra mastitis.

Los Streptococcuss del grupo A de Lancefield (GBS) se ven más frecuentemente en ganado, que causan mastitis, sin embargo, también son susceptibles los niños humanos, a menudo con consecuencias fatales. Los Streptococcuss del grupo B (GBS) constituyen una causa principal de sepsis y meningitis bacteriana entre neonatos humanos nacidos en los Estados Unidos y el oeste de Europa y, de la misma forma, están emergiendo como patógenos neonatales significativos en los países en desarrollo.

Las infecciones del grupo C de Lancefield, tales como aquellas de S. equi, S. zooepidermicus, y otros se ven principalmente en caballos, ganado y cerdos, pero también pueden cruzar la barrera de especies a los humanos.

Las infecciones del grupo D de Lancefield (S. bovis) se encuentran en todos los mamíferos y en algunos pájaros, a veces dan como resultado endocarditis o septicemia.

Los grupos E, G, L, P, U y V de Lancefield (S. porcinus, S. canis, S. dysgalactiae) se encuentran en varios hospedadores, causando infecciones neonatales, infecciones nasofaríngeas o mastitis.

Dentro de los grupos R, S y T de Lancefield (y con tipos no agrupados) se encontró S. suis, una importante causa de meningitis, septicemia, artritis y muerte súbita en cerdos jóvenes. A propósito, también puede causar meningitis en el hombre.

Las especies no agrupadas de Streptococcus, tales como S. mutans, que causan caries en seres humanos, S. uberis, que causa mastitis en el ganado, y S. pneumonia, que causa infecciones principales en seres humanos, y Enterococcus Faecalis y E. faecium, que contribuyen además al gran grupo de Streptococcuss. Streptococcus pneumoniae (el neumococo) es un patógeno humano que causa enfermedades invasivas, tales como neumonía, bacteremia, y
meningitis.

Poco se conoce sobre la patogénesis de la enfermedad causada por los Streptococcuss. Se han sugerido varios componentes celulares como factores virulentos, tales como la proteína liberada por muramidasa (MPR), el factor extracelular (EF) y las proteínas asociadas a la membrana celular, fimbrias, hemaglutininas y hemolisinas. Sin embargo, el papel exacto de estos componentes proteicos en la patogénesis de la enfermedad permanece confuso. Sin embargo, es bien conocido y generalmente aceptado que la cápsula de polisacáridos de varios Streptococcuss y otras bacterias gram-positivas juega un papel importante en la patogénesis. La cápsula permite a estos microorganismos resistir a la fagocitosis y por ello, es considerado un importante factor o marcador de virulencia.

En particular, el Estreptococcus suis es una importante causa de meningitis, septicemia, artritis y muerte súbita en cerdos jóvenes (6, 31). También puede causar meningitis en el hombre (2). Los intentos para controlar la enfermedad todavía están obstaculizados por la falta de conocimiento suficiente sobre la patogénesis de la enfermedad y la falta de vacunas eficaces y métodos de diagnóstico sensibles.

Hasta el momento, están descritos 35 serotipos de S. suis (8, 9, 10). La virulencia de S. suis puede diferir dentro y entre serotipos (29, 30, 32, 33). El serotipo 2 mundial de S. suis es el serotipo más frecuentemente aislado. Dentro del serotipo 2 de S. suis, se pueden encontrar cepas patógenas, patógenas débiles y no patógenas (32, 33). Las cepas patógenas causan severas señales clínicas de enfermedad en cerdos y un gran número de bacterias se pueden volver a aislar del sistema nervioso central (SNC) y las articulaciones tras infección experimental (32, 33). Las cepas patógenas débiles causan sólo signos clínicos suaves de la enfermedad y sólo se pueden volver a aislar bacterias de forma no frecuente del SNC y de las articulaciones tras infección experimental (32, 33). Las cepas no patógenas son completamente avirulentas en cerdos jóvenes tras infección experimental (32, 33).

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La proteína liberada por muramidasa (MRP) de 136 kDa y el factor extracelular (EF) de 110 kDa generalmente se consideran como importantes marcadores de virulencia para las cepas de serotipo 2 de S. suis aisladas en Europa y los Estados Unidos (3, 7, 16, 21, 28, 35). Sin embargo, las diferencias en la virulencia entre cepas patógenas, patógenas débiles y no patógenas, no pueden ser explicadas de forma exclusiva por diferencias en sus patrones de expresión de MRP y EF (26). Además, se conoce que la cápsula del serotipo 2 de Streptococcus suis es un importante factor de virulencia (23). Sin embargo, ya que las cepas patogénica, patogénica débil y no patogénica parece que están totalmente encapsuladas tras hacerlas crecer in vivo e in vitro, no es probable que el nivel de encapsulación de estas cepas totalmente encapsuladas esté asociado con su diferencia en virulencia.

La invención proporciona un método para modular la virulencia de un Streptococcus que comprende modificar un fragmento genómico de dicho Streptococcus donde dicho fragmento genómico comprende al menos una parte funcional de un fragmento identificable por hibridación en Streptococcus suis con un ácido nucleico o fragmento del mismo tal como se muestra en la figura 5. Para tener a la vista las diferencias entre las cepas patógenas, patógenas débiles y no patógenas, que determinaban su diferencia en virulencia, la invención proporciona un sistema de complementación in vivo, a través del cual la virulencia puede ser modificada modificando dicho fragmento. Por ejemplo, se puede encontrar dentro del serotipo 2 de las cepas patógenas, patógenas débiles y no patógenas de S. suis. Se introdujo una biblioteca genómica de una cepa patogénica dentro de una cepa patogénica débil. Tras la infección de la biblioteca dentro de cochinillos jóvenes, se seleccionaron transformantes patogénicos. Un transformante específico, que contiene un fragmento de 3 kb de la cepa patogénica, V10, parecía estar dominantemente enriquecido en cerdos con la enfermedad. El enriquecimiento observado no era específico de tejido. El fragmento seleccionado, cuando se introdujo dentro de dos cepas patógenas débiles diferentes, aumentó considerablemente la virulencia de estas cepas. En particular, el fragmento identificado en la presente memoria como ORF2, o fragmentos funcionales del mismo, es un importante factor de virulencia. Por el contrario, la introducción del fragmento correspondiente a una cepa patogénica débil sólo tuvo efectos menores sobre la virulencia. De ese modo, la invención también proporciona un método para ensayar la virulencia de un Streptococcus que comprende ensayar una fragmento genómico de dicho Streptococcus donde dicho fragmento genómico comprende al menos una parte funcional de un fragmento identificable por hibridación en Streptococcus suis con un ácido nucleico o fragmento del mismo tal como se muestra en la figura 5, en particular el fragmento ORF2. El análisis de secuencia nucleotídica del fragmento seleccionado de la cepa patogénica reveló la presencia de dos marcos de lectura abierta potenciales que se encontró que estaban mutados en el correspondiente fragmento de la cepa patogénica débil. Previamente se mostró por ensayos de ribotipado y análisis de ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD), que las cepas de patogénica y patogénica débil del serotipo 2 de S. suis están estrechamente relacionadas genéticamente, mientras que las cepas no patógenas mostraron un alto grado de heterogeneidad genética (5, 24). Se construyó una biblioteca genómica de la cepa10 de S. suis patogénico en plásmidos y se introdujo la biblioteca plasmídica dentro de la cepa patogénica débil de referencia del serotipo 2 de S. suis, cepa S735 (34). Los cerdos se inocularon de forma intravenosa con los recombinantes y se recuperaron las bacterias del SNC y las articulaciones de los cerdos enfermos. Las bacterias vueltas a aislar se analizaron posteriormente para su contenido en plásmidos y su virulencia. Con este enfoque se identificó un fragmento de ADN de una cepa patogénica de serotipo 2 que transformaba cepas patógenas débiles en cepas altamente patógenas. El fragmento, tal como se proporciona en la presente memoria, comprende un determinante genético importante para la virulencia. Dicho fragmento está en otros Streptococcuss identificables por, por ejemplo, experimentos de hibridación tales como transferencia Northern o Southern o por experimentos de amplificación tales como PCR usando cebadores y/o sondas que derivan de un ácido nucleico proporcionado en la presente
memoria.

Con el fragmento, y partes del mismo, tal como los marcos de lectura abierta identificados en la figura 3, se proporciona en la presente memoria un marcador de virulencia. Dicho marcador está asociado a un ácido nucleico aislado y/o recombinante tal como se proporciona en la presente memoria y deriva de Streptococcus y se identifica por hibridación en Streptococcus (preferiblemente S. suis) con un ácido nucleico o fragmento del mismo tal como se muestra en la figura 5.

La invención también proporciona un vector que comprende un ácido nucleico según la invención, y una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o un vector según la invención. Dicha célula hospedadora preferiblemente comprende un organismo fácilmente modificable tal como E. coli, sin embargo, también se proporcionan en la presente memoria otras células hospedadoras, tales como Streptococcus recombinante (preferiblemente derivado de uno de los Streptococcus agrupados o no agrupados tal como se identifica más arriba) que comprenden un vector o ácido nucleico según la presente invención. En particular, el Streptococcus recombinante tal como se proporciona en la presente memoria es útil para incluir en una vacuna.

Además, la invención proporciona una vacuna que comprende un ácido nucleico o un vector o una célula hospedadora según la invención, y uso de dicha vacuna en la prevención y/o tratamiento de infecciones Estreptocóci-
cas,

También se proporciona una proteína codificada por un ácido nucleico según la invención, dicha proteína codificada por ORF 2 u ORF 3 tal como se describe en la presente memoria. La invención también proporciona un anticuerpo dirigido contra una proteína según la invención y un antígeno reactivo con dicho anticuerpo, por ejemplo que comprende una proteína.

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Dicha proteína no necesita ser obtenida sólo por medios recombinantes, la síntesis de péptidos, según su secuencia de aminoácidos, es igualmente posible. Dichos antígenos y anticuerpos tal como se proporcionan en la presente memoria pueden ser usados en un ensayo de diagnóstico que comprende un anticuerpo según la invención, o con una vacuna o ensayo de diagnóstico que comprende un antígeno según la invención. Dicha vacuna y ensayos de diagnóstico pueden ser usados en el campo de diagnosis de y vacunación contra infecciones Estreptocócicas y para la detección de marcadores de virulencia de Streptococcuss.

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Descripción detallada

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento. Las cepas bacterianas y los plásmidos usados en este estudio están enumerados en la Tabla 1. Las cepas de S. suis se hicieron crecer en caldo Todd-Hewitt (código CM189, Oxoide), y se sembraron sobre base agar sangre Columbia (código CM331, Oxoide) que contiene sangre de caballo al 6% (v/v). Si se necesita, se añaden antibióticos a las siguientes concentraciones: eritromicina, 1 \mug/ml. Las cepas de E. coli se dejaron crecer en cultivo Luria (18) y se sembraron sobre cultivo Luria que contiene agar al 1,5% (p/v). Si se necesita, se añaden 200 \mug/ml de eritromicina.

PCOM1.pCOM1 (Fig. 1) está basado en las funciones de replicación de pWVO1 (18). Además, el vector contenía el gen de resistencia a eritromicina de pE194 (11) precedido por la región promotora del gen mrp (25) así como la parte SacI-PstI del sitio de clonación múltiple de pKUN19 (14). Como resultado, pCOM1 contenía un único sitio BamHI (Fig. 1).

Construcción de la biblioteca genómica de S. suis en pCOM1. Digeridos parciales con Sau03AI del ADN de la cepa 10 de serotipo 2 de S. suis patogénico se fraccionaron por tamaño (> 3 kb) por precipitación con PEG 6000 al 4,6% (BDH Chemicals, 19). Los fragmentos se ligaron a pCOM1 digerido con BamHI y las mezclas ligadas se transformaron en células azules de E. coli XL2. Se seleccionaron las colonias resistentes a eritromicina. Se obtuvieron aproximadamente 17000 clones independientes de E. coli. El análisis de 55 de los transformantes mostró que el 64% contenía un inserto > 3 kb. A partir del conjunto de transformantes de E. coli, se aisló ADN plasmídico, que posteriormente se usó para la electroporación de la cepa S735 de S. suis patogénico débil (27). Esto dio como resultado aproximadamente 30.000 transformantes independientes de S. suis. La biblioteca de S. suis se denominó S735 (pCOM-L). Los transformantes se agruparon y almacenaron a -80ºC.

Técnicas de ADN: Se llevaron a cabo manipulaciones rutinarias del ADN tal como se describe en Sambrook et al. (22). Las secuencias de ADN se determinaron en un Sistema De Secuenciación de ADN 373A (Applied Biosystems, Warrington, GB). Las muestras se prepararon usando un kit ABI/PRISM de tinción de terminación en ciclo de reacción lista de secuenciación (Applied Biosystems). Los cebadores de secuenciación adaptados se obtuvieron de Life Technologies. Los datos de secuenciación se reunieron y analizaron usando el paquete de software McMolly Tetra. Se usó el programa BLAST para buscar las secuencias proteicas homólogas a las secuencias aminoacídicas
deducidas.

Para las mezclas de reacción de la PCR (50 \mul) se usó el sistema de Alta Fidelidad de Expansión de la PCR (Boehringer, Mannheim, Alemania) tal como describe el proveedor. Se llevó a cabo la amplificación del ADN en un termociclador Perkin Elmer 9600 y el programa consistía en una incubación durante 2 minutos a 95ºC, 10 ciclos de 20 segundos a 95ºC, 1 minuto a 60ºC y 4 minutos a 68ºC, 30 ciclos de 20 segundos a 95ºC, 1 minutos a 60ºC y 4 minutos, extendidos con 20 segundos por cada ciclo, a 68ºC y 10 minutos a 72ºC.

Transferencia Southern e hibridación. Se aisló ADN cromosómico como se describe en Sambrook et al. (22). Los fragmentos de ADN se separaron en geles de agarosa al 0,8% y se transfirieron a membranas Gene-Screen Plus (NEN) como se describe en Sambrook et al. (22). Las sondas de ADN se marcaron con [(\alpha-32P]dCTP (3000 Ci mmol-1; Amersham) usando un kit de marcaje cebado al azar (Boehringer). El ADN de las transferencias se hibridó a 65ºC con las sondas de ADN apropiadas, como recomendó el proveedor de las membranas Gene Screen Plus. Tras la hibridación, las membranas se lavaron dos veces con una solución de fosfato sódico 40 mM, pH 7,2, EDTA 1 mM, SDS al 5% durante 30 minutos a 65ºC y dos veces con una solución de fosfato sódico 40 mM, pH 7,2, EDTA 1 mM, SDS al 1% durante 30 minutos a 65ºC.

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Construcción de pCOM-V10-ORF2 y pCOM-V10-ORF3

Para construir pCOM-V10-ORF2 se usaron los cebadores 5'-CGAGCTCGGAAGAATTGGTTATTGCGCGTG-3' y 5'-CGGGATCCCGGGGGATGACCTGTTGCTTG-3', en una reacción de PCR sobre ADN cromosómico de la cepa 10 de S. suis para amplificar la región codificante de ORF 2. El fragmento resultante se purificó, digirió con SacI y BamHI y se clonó dentro de pCOM1 digerido con SacI y BamHI. Para construir pCOM-V10-ORF3 se usaron los cebadores 5'-TCCCCCGGGGGACAAGCAACGGGTCATCCCC-3' y 5'-CGGGATCCCGGTTGAATGCCCGG
CAAAGCG-3' para amplificar la región codificante de ORF3. El fragmento resultante se digirió con SmaI y BamHI y se clonó dentro de pKUN19. El plásmido resultante se denominó pKUN-ORF3. Debido a que las regiones codificantes de ORF2 y ORF3 son más probablemente co-transcritas, se amplificó posteriormente la región promotora de ORF 2 usando los cebadores 5'-CGAGCTCGGAAGAATTGGTTATTGCGCGTG-3' y 5'-TCCCCCGGGG
GAGTCGTGTGTATTCGACAGCGG-3'. El fragmento se digirió con SacI y SmaI y se clonó dentro de pKUN-ORF3 digerido con SacI y SmaI. El plásmido resultante se digirió con SacI y BamHI, se purificó el fragmento inserto y se clonó dentro de pCOMI digerido con SacI y BamHI. Esto dio como resultado pCOM-V10-ORF3.

Infecciones experimentales. Se obtuvieron cerdos libres de gérmenes, híbridos de Gran Yorkshire e Iandrace holandés a partir de cerdas por secciones cesáreas. La cirugía se llevó a cabo en aisladores estériles de película flexible. Los cerdos se asignaron en grupos, cada uno consistiendo en 4 o 5 cerdos, y se alojaron en incubadores estériles de acero inoxidable. Las condiciones de alojamiento y los regímenes de alimentación son como se describen más arriba (30, 33). Si inocularon cerdos de 1 semana de vida de forma intravenosa con cepas de S. suis como se describe anteriormente (30, 33). Los cerdos recibieron eritromicina dos veces al día de forma oral (estearato de eritromicina, Abbott B. V., Amstelveen, Países Bajos, 40 mg/kg de peso corporal). Dos horas tras la infección, los cerdos se trataron con eritromicina por primera vez. Los cerdos se monitorizaron dos veces al día para signos clínicos de enfermedad, tales como fiebre, signos nerviosos y debilidad. Se recogieron muestras de sangre tres veces a la semana para cada cerdo. Se contaron los leucocitos con un contador celular. Para monitorizar la infección con S. suis se recogieron diariamente frotis de la nasofaringe y las heces. Los frotis se sembraron directamente sobre agar Columbia que contiene sangre de caballo al 6%. Tras sacrificar a los cerdos, se examinaron para cambios patológicos. Además, se recogieron especímenes de tejido del sistema nervioso central, serosa, articulaciones, pulmones, hígado, riñón, bazo, corazón y amígdalas. Los tejidos se homogeneizaron en presencia de medio Todd-Hewitt usando un homogenizador de tejidos Ultra-Turrax (Omni International, Waterbury, USA), se centrifugaron durante 5 minutos a 3000 rpm y los sobrenadantes se congelaron a -80ºC en presencia de glicerol al
15%.

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Resultados

Sistema de complementación. Se construyó una biblioteca genómica de la cepa 10 de S. suis patogénica dentro de la cepa S735 patogénica débil como se describe en Materiales y Métodos. El plásmido pCOM1 permitió la inserción de grandes fragmentos de ADN dentro del único sitio BamHI (Fig. 1). El plásmido lleva el origen de replicación de pWVO1, que funciona en E. coli así como en S. suis (27). Esto permitió la construcción de una biblioteca de ADN primero en E. coli. El ADN del plásmido, aislado del grupo de transformantes de E. coli, posteriormente se electrotransformó dentro de la cepa S735 de S. suis. Se obtuvieron 30.000 clones individuales de S. suis. Tal como se determinó por análisis de 24 transformantes seleccionados al azar, más del 30% de los transformantes S735(pCOM-L) contenían un inserto > 3 kb.

Selección de fragmentos genómicos asociados a virulencia. Para seleccionar determinantes genéticos de la cepa 10 de S. Suis patogénica que puede aumentar la virulencia de la cepa S735 patogénica débil, se inocularon cerdos con la biblioteca S735(pCOM-L) de S. suis. Se usó una dosis de cada 10^{7} o 10^{8} cfu, y los cerdos se trataron con eritromicina como se describe en Materiales y Métodos. Todos los cerdos mostraron síntomas específicos de S. suis (Tabla 2A) de 3 a 7 días tras la infección y excepto uno, todos los cerdos murieron durante el curso del experimento. A partir de cinco de los cerdos se pudieron volver a aislar bacterias del SNC y a partir de los otros dos cerdos, las bacterias se aislaron de las articulaciones (Tabla 2A). En experimentos previos, en los que los cerdos se inocularon con cepas patógenas débiles, se observaron síntomas específicos de S. suis con una muy baja frecuencia (33, 34). Además, a partir de estos cerdos nunca se pudieron volver a aislar bacterias del SNC ni delas articulaciones. Por lo tanto, estos datos indican que, comparada con la virulencia de la cepa S735, las bacterias aisladas de cerdos inoculados con la biblioteca S735(pCOM-L) de S. suis, son más virulentas debido a la presencia de un fragmento de ADN de la cepa 10 patogénica. El contenido en plásmido de 90 clones seleccionados al azar aislados del SNC o las articulaciones de los siete cerdos enfermos se analizó por PCR y análisis de restricción. Los resultados mostraron que 88 de los 90 clones analizados (19 de los cuales se muestran en la Fig. 2) contenían un inserto de aproximadamente 3 kb y tenían patrones de restricción idénticos. Además, los insertos de 10 clones seleccionados al azar, que tienen patrones de restricción idénticos, también mostraron secuencias de ADN idénticas (resultados no mostrados). El ADN de plásmido de 10 clones seleccionados al azar de la biblioteca S735(pCOM-L) original mostraron 10 patrones de restricción diferentes (Fig. 2). Estos datos sugieren que un clon específico, que se denominó S735(pCOM-V10), estaba enormemente enriquecido en siete cerdos diferentes. Por tanto, este clon en particular se aisló del SNC así como de las articulaciones de varios cerdos, indicando que el enriquecimiento observado no era específico de
tejido.

Propiedades asociadas a la virulencia del fragmento V10 seleccionado. Para analizar con más detalle las propiedades de virulencia de la cepa S735(pCOM-V10), se inocularon cerdos de forma intravenosa con 10^{6} cfu de la cepa S735(pCOM1) o la cepa S735(pCOM-V10). Los resultados (Tabla 2B) muestran claramente que, comparada con la virulencia de la cepa S735(pCOM1), la virulencia de la cepa S735(pCOM-V10) estaba enormemente potenciada. Todos los cerdos inoculados con la cepa S735(pCOM-V10) mostraron síntomas específicos de S. suis y murieron un días después de la infección. Por el contrario, excepto uno, ninguno de los cerdos inoculados con la cepa control S735(pCOM1) mostraron síntomas clínicos específicos y tres cerdos sobrevivieron hasta el final del experimento (15 días tras la infección). Estos datos probaron que la introducción del fragmento V10 de la cepa 10 dentro de S735 transformó la cepa S735 patogénica débil en una cepa altamente patogénica. Esto fuertemente sugiere que la(s) proteína(s)
codificada(s) por V10 es(son) importantes() determinante(s) de la virulencia y juega(n) un papel importante en la patogénesis de las infecciones con el serotipo 2 de S. suis en cerdos.

Para averiguar si el aumento observado del fragmento V10 en la virulencia era específico para la cepa S735, se introdujo pCOM1 y pCOM-V10 dentro de otra cepa patogénica débil: la cepa 24 (33). Posteriormente se determinaron las propiedades de virulencia de las cepas 24(pCOM1) y 24(pCOM-V10). Como se muestra en la Tabla 2C y 2D, se observaron efectos similares de V10 en la virulencia de las cepas S735 y 24. Ambas cepas 24(pCOM-V10) y S735(pCOM-V10) eran altamente patógenas en cochinillos jóvenes, mientras que las cepas 24(pCOM1) y S735(pCOM1) mostraron ser sólo patógenas débiles (Tabla 2C y 2D). Esto indica fuertemente que V10 tiene más capacidad general de transformar cepas de serotipo 2 patógenas débiles en cepas altamente patógenas.

Debido a que se usó un sistema de plásmido para el enfoque de complementación, no se pueden excluir los efectos de dosis génicas. El plásmido pCOM1 está basado en las funciones de replicación de pWVO1. En bacterias gram-positivas, el último plásmido tiene un número de copia entre 3 y 6 (13). Para averiguar si los efectos de la copia juegan un papel, se clonó la región genómica de la cepa S735 homóloga al fragmento V10 de la cepa 10 (véase más abajo) dentro del plásmido pCOM1. Este plásmido se denominó pCOM-V735. La virulencia de las cepas S735(pCOM-VS735), y 24(pCOM-V735) posteriormente se comparó con la de S735(pCOM-V10), S735(pCOM1), 24(pCOM-V10) y 24(pCOM1). Los resultados (Tabla 2C y 2D) claramente muestran que, en contraste con pCOM-V10, el plásmido pCOM-VS735, no llevaba la actividad de potenciación de la virulencia. Los cerdos infectados con cepas S735(pCOM-V10) y 24(pCOM-V10) murieron en los días uno o dos tras la infección, mientras que muchos de los cerdos infectados con las cepas S735(pCOM-V735), 24(pCOM-V735), S735(pCOM1) y 24(pCOM1) sobrevivieron hasta el final del experimento (17 días tras la infección). Comparados con los cerdos infectados con cepas que contienen pCOM1, los cerdos infectados con cepas que contienen pCOM-V735 desarrollaron más signos generales y específicos de la enfermedad, pero mucho menores que los cerdos infectados con cepas que contienen pCOM-V10 (Tabla 2C y 2D). A partir de estos datos se concluyó que las diferencias en la virulencia observadas entre las cepas que contienen pCOM-V10 y las cepas que contienen pCOM-VS735 están causadas por diferencias entre los fragmentos V10 y V735 (véase más abajo). Las diferencias en la virulencia observadas entre las cepas que contienen pCOM1 y las cepas que contienen pCOM-VS735 pueden ser debidas a efectos de dosis
génicas.

Análisis de secuencia de los fragmentos V10 y V735. Usando el fragmento V10 como una sonda de 3,1 kb, se identificó un fragmento PstI-HindIII de la cepa S735 (V735) y se clonó dentro de pCOM1 (Fig. 3). Para analizar las diferencias entre los fragmentos V10 y V735, se determinaron las secuencias nucleotídicas de los fragmentos V10 y V735 y se analizaron las secuencias para la homología con genes conocidos comparando con bases de datos GenBank/EMBL y SWISSPROT. La secuencia de V10 reveló dos marcos de lectura abierta completos y dos marcos de lectura abierta incompletos (Fig. 3). ORF 1 (nucleótidos 1 a 461) codificaba un polipéptido de 153 aminoácidos. Esta proteína mostró homología (49% de identidad) con la región C-terminal de la acetato quinasa de Clostridium thermocellum (número de acceso AF041841) y otras varias especies bacterianas (12). ORF 2 (nucleótidos 625 a 1327) codificaba una proteína de 233 aminoácidos. No se encontraron similitudes significativas entre la secuencia aminoacídica predicha de esta proteína y las proteínas presentes en las bibliotecas de datos. ORF 3 (nucleótidos 1382 a 2639) codificaba una proteína de 418 aminoácidos. Esta proteína mostraba homología (36% de identidad) con FoIC (folilpoliglutamato sintetasa) de Bacillus subtilis (15, 17). Comparados con los otros ORFs, el ORF 4 se transcribe en la dirección opuesta. ORF 4 (nucleótidos 2684 a 2972) codificaba un polipéptido de 96 aminoácidos. Este polipéptido mostró homología (67% de identidad) con la parte C-terminal de PepA (glutamil-aminopeptidasa) de Lactococcus lactis (1). Ambos ORFs, 2 y 3, poseían codones de iniciación putativos y sitios de unión al ribosoma. Las secuencias putativas -35 (TGGACA) y -10 (TACAAT), que pueden funcionar como secuencias promotoras, se encontraron precediendo a ORF 2. Los ORFs 2 y 3 estaban separados por 55 nucleótidos. En esta región no se pudieron observar secuencias promotoras putativas. Esto puede indicar que los ORFs 2 y 3 están co-transcritos. Aguas debajo de los ORFs 1 y 3 se encontraron regiones de simetría de pareja extendida, que probablemente pueden funcionar como señales de terminación de transcripción.

La secuencia del fragmento V735 se determinó y comparó con la secuencia del fragmento V10. No se encontraron deleciones o inserciones principales entre las regiones secuenciadas. Los ORFs 1, 3 y 4 de las cepas 10 y S735 fueron altamente homólogas. Los fragmentos de proteína putativa codificados por los ORFs 1 diferían en 2 (1,3%) aminoácidos; las proteínas putativas codificadas por los ORFs 3 diferían en 19 (4,5%) aminoácidos (Fig. 4B), mientras que los fragmentos de proteína putativa de los ORFs 4 eran idénticos. Sin embargo, se observaron las diferencias principales entre los ORFs 2 de las cepas 10 y S735. En la cepa 10 patogénica se encontró un ORF de 699 bases, que predice un producto de proteína de 233 aminoácidos. Por el contrario, debido a una mutación de cambio de marco, se encontró en la cepa S735 patogénica débil un ORF de 569 bases, que codifica un polipéptido de 183 aminoácidos. Comparada con la proteína putativa codificada por la cepa 10, la proteína putativa codificada por la cepa S735 carecía de 50 aminoácidos en el extremo N-terminal (Fig. 4A). Al lado de estas diferencias en el extremo N-terminal, las proteínas putativas diferían en 9 posiciones de aminoácidos (4,9%). Además, las regiones putativas -35 que pueden ser parte de las secuencias promotoras, implicadas en la expresión de ORFs 2 y 3, diferían entre las dos cepas. Se encontró una secuencia TGGACA en la cepa 10, mientras que se encontró una secuencia TGGTCA en la cepa S735. Los datos de secuencias sugieren que las diferencias en los efectos potenciadores de la virulencia de los fragmentos V10 y V735 pueden ser los resultados de diferencias funcionales entre las proteínas putativas expresadas por los ORFs 2 y/o 3, y/o por diferencias en sus niveles de expresión. ORF 2 u
ORF 3?.

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Para examinar si el aumento observado del fragmento V10 sobre la virulencia resultó de ORF 2 u ORF 3 o de ambos, se construyeron los Plásmidos pCOM-V10-ORF2 y pCOM-V10-ORF3, que contienen las regiones codificantes individuales de ORF 2 y ORF 3. Debido a que más probablemente ORF 3 está co-transcrito con ORF 2, en pCOM-V10-ORF3 la región codificante de ORF 3 se precedió por la región promotora de ORF 2. Posteriormente, se determinaron las propiedades de virulencia de las cepas S735(pCOM-V10), S735(pCOM-V10-ORF2), S735(pCOM-V10-ORF3) y S735(pCOM1). Como se muestra en la Tabla 2E, Los fragmentos V10 y ORF 2 mostraron efectos similares sobre la virulencia de la cepa S735. No se pudo observar el efecto de ORF 3 sobre la virulencia de la cepa S735. Estos datos muestran que ORF 2 es responsable del efecto observado sobre la virulencia y que la proteína ORF 2 es un importante factor de virulencia.

Distribución de las secuencias orf2 y orf3 entre todos los 35 serotipos conocidos de S. suis. Para examinar la homología entre los genes orf2 y orf3 de otros serotipos de S. suis, se llevaron a cabo experimentos de hibridación cruzada. Los fragmentos de ADN de los genes orf2 y orf3 se amplificaron por PCR, se marcaron con 32P, y se hibridaron con ADNs cromosómicos de las cepas de referencia de los 35 diferentes serotipos de S. suis. Como control positivo se usó una sonda específica para ARNr 16S (24). La sonda de ARNr 16S hibridó con intensidades casi iguales con todos los serotipos ensayados (resultados no mostrados). Las sondas orf2 y orf3 hibridaron con todos los serotipos, excepto con los serotipos 32 y 34 (resultados no mostrados). Esto indica que las proteínas codificadas por orf2 y 3 son comunes entre muchas de las especies de Streptococcus.

Así, aquí se proporciona el desarrollo y la aplicación con éxito de un enfoque de complementación in vivo para la identificación de importantes determinantes moleculares que determinan las diferencias en virulencia entre cepas patógenas y patógenas débiles de Streptococcus. Usando el enfoque de complementación, se seleccionó un único clon que contiene un fragmento de 3,0 kb de la cepa patogénica (V10). El fragmento seleccionado estaba enormemente enriquecido en siete cerdos diferentes y el enriquecimiento observado no era específico de tejido. El fragmento seleccionado mostraba efectos potenciadores similares sobre la virulencia de dos cepas patógenas débiles. Se observaron grandes diferencias entre los efectos del fragmento V10 seleccionado de la cepa 10 patogénica ávida del correspondiente fragmento V735 aislado de la cepa S735 patogénica débil sobre la virulencia. En contraste con V10, que tuvo un fuerte efecto potenciador de la virulencia en cepas patógenas débiles, V735 solo mostró efectos menores. Por tanto, las diferencias entre estos dos fragmentos son consideradas responsables de las diferencias observadas sobre la virulencia. Los datos de secuencias mostraron que los fragmentos V10 y V735 eran altamente homólogos. Ambos fragmentos contenían dos ORFs completos (ORF 2 y 3), que potencialmente pueden expresar proteínas que además pueden contribuir al efecto observado sobre la virulencia. Los ORFs 3 son altamente homólogos y difieren en sólo 19 aminoácidos. Las proteínas codificadas por los ORFs 3 muestran homología con FoIC (folilpoliglutamato sintetasa) de varios organismos pro- y eucarióticos. La folilpoliglutamato sintetasa cataliza la conversión de folatos a derivados de poliglutamato (4). Las bacterias necesitan folatos para la biosíntesis de glicina, metionina, formilmetionina, timina, purinas y pantotenato (4). Si las proteínas FoIC codificadas por los fragmentos V10 y V735 tienen diferentes actividades enzimáticas o diferentes especificidades de sustrato no se conoce hasta la fecha: En E. Coli, un mutante foIC es deficiente en metionina (4), sin embargo, no se ha descrito un papel de FoIC en la virulencia. También se observaron diferencias significativas entre los ORFs 2 de los fragmentos V10 y V735. Comparada con la proteína putativa ORF 2 codificada por la cepa 10, la proteína putativa codificada por la cepa S735 carecía de los 50 aminoácidos N-terminales. En la cepa S735 un fuerte sitio de unión a ribosoma precede al codón de inicio de metionina de ORF 2. Sin embargo, por el contrario, en la cepa 10, la secuencia no indicó la presencia de un fuerte sitio de unión a ribosoma precediendo al codón de inicio de la metionina de ORF 2. Por tanto, aunque ORF 2 de la cepa 10 está extendido en comparación con ORF 2 de la cepa S735, no está claro si las proteínas expresadas por estos dos ORFs difieren en longitud. Serán necesarios experimentos futuros para analizar en detalle las proteínas expresadas. Además de las diferencias putativas en el extremo N-terminal, las proteínas putativas ORF 2 diferían en las posiciones del aminoácido 9 (4,9%). Excepto uno, estas sustituciones de aminoácidos se agruparon en dos posiciones diferentes en la proteína putativa. La función de la proteína ORF 2 no se conoce en la actualidad. Ni siquiera se encontraron homologías distantes o parciales entre las secuencias de la proteína ORF 2 y las secuencias de la proteína presente en los datos de las bibliotecas. Los perfiles de hidrofobicidad mostraron que ORF 2 codificaba proteína(s)
muy hidrofóbicas. Así, se sugirió un papel de la proteína ORF 2 en la membrana celular. La región putativa -35 que precede los ORFs 2 y 3 diferían entre las cepas S735 y 10. Por tanto, no se puede excluir que las diferencias en los niveles de expresión más que las diferencias funcionales son las responsables de los efectos observados sobre la
virulencia.

En experimentos previos, se encontró que cerdos infectados con cepas patógenas débiles mostraron sólo suaves signos clínicos de enfermedad y que las bacterias nunca pudieron volverse a aislar del SNC y de las articulaciones (33, 34). Sorprendentemente, en los experimentos descritos en este artículo, en los que se usaron cepas patógenas débiles que contienen el plásmido control pCOM1, las bacterias se pudieron volver a aislar (con una baja frecuencia) del SNC y de las articulaciones. Existen varias explicaciones posibles para estas diferencias observadas. Una explicación en que la presencia del plásmido de alguna forma afecta a las propiedades (de virulencia) de las cepas. Otra posibilidad es que el tratamiento de los cerdos con eritromicina hace a los cerdos más sensibles a infecciones por S. suis y una tercera posibilidad es que comparado con los cerdos usados previamente, los cerdos usados en los experimentos actuales eran más sensibles a las infecciones por S. suis.

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TABLA 1 Cepas y Plásmidos bacterianos

1

2

3

Leyenda de las Figuras

Fig. 1. El vector pCOM1 usado en este estudio. pCOM1 contiene las funciones de replicación de pWVO1 (13), el gen de resistencia a eritromicina de pE194 (119 precedido de la región promotora del gen mpr (25) así como la parte SacI-PstI del sitio de clonación múltiple de pKUN19 (14).

Fig. 2. Plásmidos digeridos con SmaI y XbaI en un gel de agarosa al 0,8%. Biblioteca: Plásmidos aislados de 10 clones seleccionados al azar de la biblioteca original; clones enriquecidos en cerdos: Plásmidos aislados de 19 clones enriquecidos en cerdos seleccionados independientemente; c: pCOM1; m: marcador de peso molecular.

Fig. 3. Representación esquemática de los fragmentos V10 y S735. Las flechas indican los potenciales ORFs. ae P, indica la posición de la secuencia promotora potencial; +, indica las posiciones de las secuencias reguladoras de la transcripción potenciales. Se indican las homologías (% de identidad) entre las proteínas potenciales codificadas por los ORFs y las proteínas presentes en las bibliotecas de datos.

Fig. 4. A, B. Homología entre los ORFs 2 (A) y 3 (B) que codifican proteínas de fragmentos V10 y V735. Los asteriscos indican los aminoácidos no idénticos.

Fig. 5. A, B, C, D, E, F. Secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de los fragmentos de V10 y V735.

Claims (13)

1. Un método para modular la virulencia de un Streptococcus que comprende modificar una secuencia nucleotídica de dicho Streptococcus donde dicha secuencia nucleotídica es identificable por hibridación a 65ºC con la secuencia de la figura 5A y/o 5B.

2. Un método para ensayar la virulencia de un Streptococcus que comprende ensayar una secuencia nucleotídica de dicho Streptococcus, donde dicha secuencia nucleotídica es identificable por hibridación a 65ºC con la secuencia de la figura 5A y/o 5B.

3. Un ácido nucleico aislado y/o recombinante de Streptococcus suis donde dicha secuencia es identificable por hibridación a 65ºC con la secuencia de la figura 5A y/o 5B, y lavando dos veces con una solución de fosfato sódico 40 mM (pH 7,2), EDTA 1 mM y dodecil sulfato sódico al 5% durante 30 minutos a 65ºC y lavando dos veces con una solución de fosfato sódico 40 mM (pH 7,2), EDTA 1 mM y dodecil sulfato sódico al 1% durante 30 minutos a 65ºC, y donde dicho ácido nucleico es capaz de transformar cepas de Streptococcus patógenas débiles en cepas altamente patógenas.

4. Un ácido nucleico aislado y/o recombinante según la reivindicación 3, donde dicha secuencia comprende la secuencia de la figura 5A.

5. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 3 o 4.

6. Una célula hospedadora que comprende un vector según la reivindicación 5.

7. Una célula hospedadora según la reivindicación 6, donde dicha célula hospedadora es un Streptococcus.

8. Una vacuna que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 3 o 4 o un vector según la reivindicación 5 o una célula hospedadora según la reivindicación 6 o 7.

9. Una proteína como se muestra en las figuras 5C-5F.

10. Un anticuerpo dirigido contra una proteína según la reivindicación 9.

11. Un ensayo de diagnóstico que comprende un anticuerpo según la reivindicación 10.

12. Una vacuna o ensayo de diagnóstico que comprende una proteína según la reivindicación 9.

13. Un método según la reivindicación 1 o 2, donde dicha secuencia comprende la secuencia de la figura 5A.