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ES2325908T3 - Manipulacion del contenido de acido fenolico y de la digestibilidad de paredes de celulas vegetales mediante la expresion dirigida de genes que codifican enzimas degradativas de la pared celular. - Google Patents

Manipulacion del contenido de acido fenolico y de la digestibilidad de paredes de celulas vegetales mediante la expresion dirigida de genes que codifican enzimas degradativas de la pared celular. Download PDF

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ES2325908T3
ES2325908T3 ES01273842T ES01273842T ES2325908T3 ES 2325908 T3 ES2325908 T3 ES 2325908T3 ES 01273842 T ES01273842 T ES 01273842T ES 01273842 T ES01273842 T ES 01273842T ES 2325908 T3 ES2325908 T3 ES 2325908T3
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ES
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polynucleotide
plant
promoter
gene
sequence
Prior art date
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ES01273842T
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Nigel Dunn-Coleman
Timothy Langdon
Phillip Morris
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Danisco US Inc
Original Assignee
Genencor International Inc
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Abstract

Procedimiento para aumentar la digestabilidad de una planta, comprendiendo el método la introducción en la planta de una cassette de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que codifica la esterasa de ácido ferúlico, en el que el cassette de expresión comprende además una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia señal que reconoce la expresión del polipéptido de esterasa de ácido ferúlico en la vacuola.

Description

Manipulación del contenido de ácido fenólico y de la digestibilidad de paredes de células vegetales mediante la expresión dirigida de genes que codifican enzimas degradativas de la pared celular.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimiento para aumentar la disponibilidad de carbohidratos fermentables.
Antecedentes de la invención
La presente crisis en la agricultura del ganado ha provocado un resurgimiento en el interés por animales que se alimentan de hierba. Sin embargo, aunque se puede desear una dieta alta en forraje, actualmente no satisface las demandas de producción moderna de animales. Para que el animal haga un uso eficaz del forraje que consume, debe satisfacerse la demanda de energía de los microorganismos en el rumen y sincronizarse con la disponibilidad de las proteínas de las plantas. En otro caso, la falta de sincronía conducirá a (a) proteínas y otros nutrientes que se utilizan escasamente en el rumen, b) pérdida de nitrógeno, en orina y heces y, por lo tanto, el medio y (c) la necesidad de administrar cantidades en exceso de concentrados proteicos como suplementos de la dieta del rumiante.
La celulosa y la hemicelulosa en los tejidos de hierba y maíz podrían cumplir con los requisitos de energía del rumiante o proporcionar nuevas reservas de alimentación para la fermentación industrial a etanol. Este potencial no se realiza actualmente ya que las paredes celulares se lignifican y los polisacáridos de la pared celular se reticulan a nivel elevado con residuos fenólicos y lignina, dando lugar a velocidades bajas de digestión de la pared celular de las plantas en comparación con las velocidad de rotura de las proteínas en los rumiantes. Este es un problema particular para los forrajes más importantes en Europa, la hierba de centeno Lolium perenne y L. mutiflorum, así como uno de los impedimentos principales para un uso más amplio de especies mejor adaptadas, tales como Festuca arundinacea, como cultivo de forraje. El aumento del índice de digestibilidad de la hierba ha sido por tanto un objetivo principal en el cultivo durante varias décadas, pero el progreso ha sido lento debido a las dificultades en la fijación de la variación natural en las variedades sintéticas derivadas de estas especies exogámicas (Hayward, et al., TAG 70:48 (1985)).
Se sabe que la eliminación de ácidos fenólicos lábiles mediante tratamiento químico con álcali aumenta la biodegradabilidad y el valor nutricional de la alimentación de baja calidad, tales como paja de cereal, y se utiliza comercialmente para mejorar la alimentación. La reducción de la reticulación fenólica de los carbohidratos de las paredes celulares es por lo tanto una manera predecible de mejorar la velocidad de digestión y la digestibilidad de la hierba de centeno. Sin embargo, la modificación química puede tener otras desventajas. Por lo tanto, la modificación genética sería un método preferible para el cambio de la química de la pared celular de variedades altamente digeribles. Mucha gente de este campo persigue esta estrategia. Sin embargo, una alternativa es utilizar modificaciones genéticas para reducir los niveles de ácidos fenólicos en las paredes celulares disponibles para la reticulación mediante la rotura directa de enlaces éster que unen los ácidos fenólicos y ligninas a los polisacáridos de la pared celular o evitando la ferulación excesiva de los carbohidratos de las paredes celulares antes de su incorporación en la pared celular.
La presente invención satisface ésta y otras necesidades mediante la utilización de la expresión dirigida de las enzimas degradativos de la pared celular en plantas.
Descripción resumida de la invención
En la presente invención se dan a conocer procedimientos para aumentar la disponibilidad de carbohidratos fermentables. En un aspecto, se proporciona un procedimiento para aumentar la digestibilidad de una planta, comprendiendo el procedimiento introducir en la planta un cassette de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica esterasa de ácido ferúlico. La secuencia de ADN que codifica la esterasa del ácido ferúlico está unida operativamente a una secuencia promotora. El promotor puede ser constitutivo o inducible. El cassette de expresión comprende una secuencia de reconocimiento que dirige la expresión del polipéptido esterasa del ácido ferúlico a la vacuola.
En una realización preferida, la enzima que degrada la pared celular deriva de una fuente fúngica. En una realización más preferida, la esterasa de ácido ferúlico fúngico es una esterada de ácido ferúlico de Aspergillus, preferiblemente A. niger.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una planta transformada con el cassette de expresión. La planta se puede seleccionar del grupo que consiste en Festuca, Lolium, Avena y Zea. En una realización preferida, la planta es hierba de forraje. En otra realización, la planta es maíz.
Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 ilustra un mapa de restricción de un fragmento de ADN que contiene el gen que codifica la esterasa de ácido ferúlico de 38 kd.
Las figuras 2A-E ilustran el ADN completo, con highlight para indicar la secuencia señal, el intrón y varios sitios de endonucleasas de restricción, y la secuencia de aminoácidos correspondiente al gen que codifica la esterasa de ácido ferúlico de 38 kd aislada de Aspergillus niger.
La figura 3 ilustra la secuencia de ADN del gen que codifica la esterasa de 38 kd.
La figura 4 ilustra la construcción de la esterasa de ácido ferúlico sin intrón aislado de Aspergillus niger.
La figura 5 ilustra que el solapamiento de los productos de PCR producidos con cebadores FAE-I5 FAE-I3 crea dos posibles marcas de lectura ininterrumpidos - la parte superior en la figura siguiente es funcional (la serina destacada es un sitio activo), la parte inferior está inactivada.
La figura 6 ilustra las posibles construcciones de vectores útiles en la presente invención. Son posibles varias combinaciones. Aunque se representa un gen FAE, se puede utilizar otra enzima que degrada la pared celular sola (es decir, en lugar de) o conjuntamente con el gen FAE. Amp = gen de resistencia a ampicilina
La figura 7 ilustra pCOR105
La figura 8 ilustra un vector ALE-TER genérico.
La figura 9 ilustra las secuencias de retención KDEL-COOH ER.
La figura 10 ilustra la estructura y secuencia de FAE-LINKER-FRAMESHIFT
La figura 11 ilustra los cassettes de transformación de plantas.
La figura 12 es una tabla de los vectores utilizados de la presente invención.
La figura 13 representa la secuencia señal vacuolar y en apoplasto de aleuraína de cebada.
La figura 14 ilustra la estructura y secuencia de sialil transferasa de rata.
La figura 15 ilustra la estructura y secuencia del motico del inhibidor II de proteasa de patata (PPI).
La figura 16 ilustra la expresión dirigida de gfp a compartimentos de células diferentes. También se muestran esquemas de los vectores utilizados.
La figura 17 ilustra la actividad FAE en hojas de Festuca arundinacea transgénica de diferentes edades bajo secuencias de reconocimiento ER y APO.
La figura 18 ilustra la actividad FAE en hojas de Festuca arundinacea transgénica de diferentes edades bajo secuencia de reconocimiento Vac.
La figura 19 ilustra la actividad FAE en hojas de Lolium mutflorum transgénica de diferentes edades.
La figura 20 ilustra la actividad FAE en hojas de Lolium mutflorum transgénica bajo secuencias de reconocimiento Vac, ER y APO.
La figura 21 ilustra los niveles de ácidos hidroxicinámicos monoméricos y diméricos esterificados en plantas de Festuca arundinacea que expresan FAE bajo la secuencia de reconocimiento Vac.
La figura 22 ilustra los niveles de ácidos hidroxicinámicos monoméricos y diméricos esterificados en plantas de Festuca arundinacea que expresan FAE bajo la secuencia de reconocimiento APO y ER.
La figura 23 ilustra la digestibilidad de materia seca in vitro de tejido de hoja de plantas Festuca arundinacea madura que expresan FAE bajo un promotor de actina.
La figura 24 ilustra la digestibilidad de materia seca in vitro de tejido de hoja de plantas Lolium mutflorum madura que expresan FAE bajo un promotor de actina.
La figura 25 ilustra la velocidad de fermentación y producción de gas acumulado en células de Festuca arundinacea.
La figura 26 ilustra la fermentación in vitro de paredes celulares de Festuca arundinacea de cultivos celulares que expresan FAE1 recombinante.
La figura 27 ilustra el tiempo para la velocidad de digestión máxima para células de Festuca arundinacea.
La figura 28 ilustra la producción de gas total en células de Festuca arundinacea.
La figura 29 ilustra la cinética de la actividad de FAE mediante la liberación de ácido ferúlico de las paredes celulares bajo la auto-digestión en Festuca arundinacea y estimulación por xilanasa.
La figura 30 ilustra la actividad de beta-glucoronidasa bajo el promotor de senescencia de Lolium See1 en hojas de plantas transgénicas de Lolium mutflorum.
La figura 31 ilustra la liberación de HCAs monoméricas y diméricas en la auto-digestión de hojas de plantas que expresan FAE dirigida vacuolar.
La figura 32 es un esquema del vector pTP10-1. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5338 pb.
La figura 33 es un esquema del vector pUA4-4. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5345 pb.
La figura 34 es un esquema del vector pTU4. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5337 pb.
La figura 35 es un esquema del vector pTT5.14. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5395 pb.
La figura 36 es un esquema del vector Ptt8-5. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5337 pb.
La figura 37 es un esquema del vector pTP5-1. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5277 pb.
La figura 38 es un esquema del vector pTP4a2. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5327 pb.
La figura 39 es un esquema del vector pTP3-1. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5338 pb.
La figura 40 es un esquema del vector pTU5. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5337 pb.
La figura 41 es un esquema del vector pGT6. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 4773 pb.
La figura 42 es un esquema del vector pJQ5. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5034 pb.
La figura 43 es un esquema del vector pJO6.1. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 4950 pb.
La figura 44 es un esquema del vector pJQ4. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 4974 pb.
La figura 45 es un esquema del vector pPQ10.1. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5164 pb.
La figura 46 es un esquema del vector pJQ3. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 4965 pb.
La figura 47 es un esquema del vector pUG4. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5295 pb.
La figura 48 es un esquema del vector pUB8.11. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5001 pb.
La figura 49 es un esquema del vector pTP11-1. También se observa la secuencia de nucleótidos del vector de 5387 pb.
La figura 50 ilustra el promotor de actina y su correspondiente secuencia de nucleótidos.
\newpage
La figura 51 ilustra la estructura de Aleuraína con NPIR eliminado. También se observan las secuencias de nucleótidos correspondientes.
La figura 52 ilustra la secuencia promotora de SEE1 (senescencia aumentada).
La figura 53 ilustra la secuencia promotora de SEE1 (senescencia aumentada) más la secuencia señal de aleuraína vacuolar/NPIR.
Descripción detallada de la invención
A continuación, se describirá la invención haciendo referencia únicamente a las siguientes definiciones y ejemplos.
A menos que se defina contrario, todos los términos científicos y técnicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la invención. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED, John Wiley and Sons, Nueva York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a un experto con un diccionario general de muchos los términos utilizados en la presente invención. Aunque en la práctica o ensayo se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferidos. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo, A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente. Para las definiciones y términos de la técnica los profesionales se pueden dirigir a Sambrook et al., 1989 y Ausubel FM et al., 1993. Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos descritos concretos, ya que éstos pueden variar.
Los encabezamientos que se proporcionan en la presente invención no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la invención que se pueden obtener por referencia a la memoria en su totalidad. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación están completamente definidos por referencia a la memoria en su totalidad.
Definiciones
Debe indicarse que, tal como se utiliza en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contento dictamine claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a una composición que contiene "un compuesto" incluye una mezcla de dos o más compuestos. Debe indicarse que el término "o" se utiliza generalmente en el sentido que incluye "y/o", a menos que el contenido dictamine claramente lo contrario.
"Variantes modificadas de manera conservativa" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de polinucleótidos. Con respecto a polinucleótidos concretos, las variantes modificadas de manera conservativa se refieren a aquellos polinucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el polinucleótido no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un mayor número de polinucléotidos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. De este modo, en cada posición en la que una alanina está especificada por un codón, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una muestra de variaciones modificadas de manera conservativa. Casa polinucleótido de la presente invención que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un polinucleótido (excepto AUG, que es normalmente el único codón para metionina) se puede modificar para obtener una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un polinucleótido que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita. Para los objetivos de la expresión de la proteína, existen "codones subóptimos". Estos son codones que no son preferidos por un género o especie particular. La alteración de estos "codones sub-óptimos" a "codones preferidos" es una mutación silenciosa en la que el aminoácido codificado por los codones es el mismo pero un codón es preferencialmente expresado por el género concreto, por ejemplo Triticum spp.
En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia de polinucleótido, péptido, polipéptido o proteína que altera, añade o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de manera conservativa", donde la alteración da lugar a la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidos en la técnica.
Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas por otros:
1)
Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2)
Ácido Aspártico (D), Ácido Glutámico (E);
3)
Asparagina (N), Glutamina (Q);
4)
Arginina (R), Lisina (K);
5)
Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y
6)
Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).
"Ácido Piroglutámico" es la amida interna ciclada del ácido L-glutámico.
La frase "que controla el nivel de ácido fenólicos" se refiere a la manipulación de la expresión de ácidos fenólicos en plantas, particularmente paredes celulares de plantas. La manipulación puede ser positiva; por ejemplo, aumentando los niveles de ácidos fenólicos; o negativa, por ejemplo, disminuyendo el nivel de ácidos fenólicos; o neutra, por ejemplo, cambiando las cantidades relativas de ácidos fenólicos específicos en las paredes celulares pero manteniendo la cantidad total relativamente igual. La acción de manipulación puede ser durante el crecimiento de las plantas o después del crecimiento de las plantas, por ejemplo, después de que la planta haya sido cortada o arrancada del suelo o ingerida. Las "paredes celulares de plantas" se refieren a las paredes celulares de cualquier célula de la
planta.
El término "derivado" significa que un polinucleótido o proteína se refiere a otro polinucleótido o proteína. Las relaciones pueden ser de homología, por ejemplo, nucleótidos y proteínas de ciertas especies son homólogos a polinucleótidos y proteínas similares de otras especies; analogía, por ejemplo, las proteínas realizan la misma función y, por tanto, se relacionan entre sí independientemente del organismo de origen. La relación pueden ser manipuladas, por ejemplo, una proteína (y un polinucleótido) se puede derivar de otra proteína mediante mutación; o manipulación química (peptidomiméticos). Además, se puede derivar una proteína o un polinucleótido de un organismo si, en el estado natural, la proteína o polinucleótido se encuentra en un organismo, pero se reproduce recombinantemente en otro.
El término "polinucleótido exógeno" se refiere a un polinucleótido que se introduce en la planta mediante algún medio diferente de un cruzamiento sexual o reproducción sexual. A continuación se describen ejemplos de medios mediante los cuales esto se puede realizar e incluyen transformación mediada por Agrobacterium, métodos biolísticos, electroporación, técnicas in planta, y similares. Dicha planta que contiene el polinucleótido exógeno se refiere en la presente invención como una planta transgénica de generación R1. Las plantas transgénicas que surgen del cruzamiento sexual o mediante autopolinización son la progenie de dicha planta.
El término "molécula de polinucleótido aislada" o "proteína aislada" se refiere a un polinucleótido o proteína que está esencialmente libre de otros componentes celulares con los que está asociada en el estado natural. Se encuentra preferiblemente en un estado homogéneo aunque puede estar en una solución pura o acuosa. La pureza y homogeneidad se determinan habitualmente utilizando técnicas de química analítica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto rendimiento. La proteína que es la especie predominante presente en una preparación se purifica sustancialmente. En particular, un gen FAE1 aislado se separa de los marcos de lectura abiertos que flanquean el gen y codifica una proteína diferente de FAE1.
Un "polinucleótido que codifica FAE1" es una secuencia de ácido nucleico que comprende (o consiste en) una región codificante de un gen FAE1 o que codifica un polipéptido de FAE1. Los polinucleótidos de FAE1 también se pueden identificar por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de baja fidelidad (ver a continuación) a sondas de ácidos nucleicos que tienen una secuencia de 8 a 300 bases, preferiblemente una secuencia de 80 a 100 bases en la secuencia descrita en WO 98/14594.
El término "ácido nucleico que codifica", "secuencia de ácido nucleico que codifica" o "polinucléotido que codifica" se refiere a un polinucleótido que dirige la expresión de una proteína o péptidos específico. Los polinucleótidos incluyen tanto la secuencia de la hebra de ADN que se transcribe en el ARN como la secuencia de ARN que se traduce en la proteína. Los polinucleótidos incluyen tanto los polinucleótidos de longitud completa como las secuencias más cortas derivadas de las secuencias de longitud completa. Se entiende que un polinucleótido concreto incluye los codones degenerados de la secuencia nativa o las secuencias que se pueden introducir para proporcionar la preferencia de codón en una célula huésped específica. El polinucleótido incluye la hebra tanto de sentido como antisentido como hebras únicas individuales o en forma de cadenas dobles.
El término "unido operativamente" se refiere a la unión funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en la que la secuencia promotora inicia la transcripción del ARN correspondiente a la segunda secuencia.
El término "plásmido" se refiere a una molécula de ADN de doble cadena circular que comprende la secuencia codificante de interés, elementos reguladores, un marcador de selección y opcionalmente un marcador de amplificación. Un plásmido puede transformar células procariotas o transfectar células eucariotas. Un "cassette de expresión" significa un parte de un plásmido (o el plásmido completo) que contiene los elementos reguladores deseados para la transcripción, traducción y/o expresión y la región codificante de un polinucléotido. Un plásmido puede contener uno o más cassettes de expresión. Si se introducen múltiples cassettes de expresión en una planta.
Se pueden introducir simultáneamente o a tiempos diferentes. Si se desea la introducción simultánea, los cassettes de expresión pueden ser en un plásmido o más. Habitualmente, un cassette de expresión comprende un promotor, una cola Poly A+ y secuencias señal que dirigen el polipéptido expresado a una región específica de una célula o para secretarse, si se desea. Entre los ejemplos de secuencias señal que "dirigen la expresión" de esterasa de ácido ferúlico se incluyen secuencias localizadas en dirección 5' de la secuencia codificante de FAE. El polinucleótido que codifica la secuencia señal se encuentra preferiblemente en los 100 nucleótidos "en dirección 5'" desde el codón de inicio (AUG). Más preferiblemente, el polinucleótido que codifica la secuencia señal se encuentra en los 50 nucleótidos en dirección 5' desde el codón de inicio. Los orgánulos celulares reconocidos por las secuencias señales utilizadas en la presente invención son vacuolas. Además de las secuencias señales en dirección 5, el cassette de expresión de la presente invención puede incluir un polinucleótido que codifica una secuencia señal en el extremo 3'. Preferiblemente, el polinucleótido que codifica la secuencia señal se encuentra directamente en dirección 3' desde la secuencia codificante, más preferiblemente menos de 100 pares de bases desde el codón de parada, más preferiblemente menos de 20 pares de bases desde el codón de parada.
El término "polinucleótido," "polinucleótido" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a desorribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de cadena individual o doble. A menos que se limite de manera específica, el término comprende polinucleótidos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que presentan propiedades de unión similares al polinucleótido de referencia y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique lo contrario, un polinucleótido de FAE1 particular se la presente invención también comprende implícitamente variantes modificadas de manera conservativa (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias y también la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden conseguir mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye por residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Cassol et al., 1992; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). El término polinucleótido se utiliza indistintamente con gen, ADNc, y ARNm codificado por el gen.
El término "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente y se refieren a aminoácidos conectados por enlaces peptídicos. Los polipéptidos pueden ser proteínas completas o partes de las mismas. Por ejemplo, un polipéptido de FAE1 puede referirse a la proteína de FAE1 completa o fragmentos de la proteína de FAE1. Una "esterasa de ácido ferúlico con un sitio de glicosilación alterado" se refiere a una proteína de FAE en la que una mutación ha cambiado el patrón de glicosilación de la proteína. Las mutaciones que realizan dichos cambios son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, sustituciones de aminoácidos, y mutaciones en las proteínas del Aparato de Golgi y retículo endoplasmático que realizan la glicosilación de las proteínas.
El término "promotor" se refiere a un polinucleótido que dirige la expresión de una secuencia codificante. Un promotor puede ser constitutivo, es decir, relativamente independiente de la etapa de diferenciación de la célula en la que está contenido o puede ser inducible, es decir, inducido por factor ambientales específicos, tales como la duración del día, la temperatura, etc., o un promotor puede ser específico de tejido, es decir, que dirige la expresión de la secuencia codificante en células de un cierto tipo de tejido. Un promotor de "senescencia" es un promotor inducible que provoca que se inicie la transcripción tras un cierto suceso referente a la edad del organismo. Un "promotor del choque térmico" es un promotor inducible que provoca que se inicie la transcripción tras un cambio en la temperatura. Un ejemplo de un promotor de proteína del choque térmico es el promotor Gmhsp de soja. Además de estos promotores inducibles, un experto entenderá que se pueden utilizar otros promotores inducibles. Por ejemplo, un promotor inducido por herida, como LAP, Patente de Estados Unidos No. 5.962.670.
El término "purificado" indica que un polinucleótido o proteína da lugar a esencialmente una banda en un gel electroforético. Particularmente, significa que el polinucleótido o proteína es por lo menos un 85% puro, más preferiblemente por lo menos un 95% puro, y lo más preferente por lo menos un 995 puro.
El término "se hibrida específicamente" se refiere a una sonda de ácidos nucleicos que hibrida, forma cadenas dobles o se une a una secuencia de ADN o ARN diana concreta cuando las secuencias diana están presentes en una preparación de ADN o ARN celular total. Secuencias de ácido nucleico "complementarias" o "diana" se refieren a aquellas secuencias de ácido nucleico que se hibridan selectivamente a una sonda de ácido nucleico. Las condiciones de hibridación más adecuadas dependen, por ejemplo, de la longitud de la sonda, la composición de bases, y el número de desapareamientos y su posición en la sonda, y frecuentemente se deben determinar de manera empírica. Para discusiones sobre el diseño de la sonda de ácidos nucleicos y las condiciones de hibridación, véase, por ejemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) ("Sambrook") o CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. Ausubel et al., ed. Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York (1987) ("Ausubel").
El término "condiciones de fidelidad" en el contexto de los experimentos de hibridación de polinucleótidos, tales como hibridaciones Southern y Northern se refiere a entornos de unión y lavado dependientes de la secuencia. Una amplia guía para la hibridación de polinucleótidos se encuentra en Tijssen (1993) LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY-HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES parte I capítulo 2 "overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York. Generalmente, las condiciones de hibridación y lavado con fidelidad elevada se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC inferior al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida a un sonda de emparejamiento perfecto. Las condiciones de fidelidad muy elevada se seleccionan para que sean iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación de fidelidad para la hibridación de polinucleótidos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en una transferencia Southern o Northern en formalina al 50% con 1 mg de heparina entre 40 y 50ºC, preferiblemente 42ºC, con la hibridación llevada a cabo durante toda la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado de fidelidad elevada es 0,15M NaCl de 70 a 80ºC, siendo preferible 72ºC durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado de fidelidad es un lavado 0,2x SSC a aproximadamente 60 a 70ºC, preferiblemente 65ºC durante 15 minutos (véase, Sambrook, supra para una descripción del tampón de SSC). A menudo, un lavado de fidelidad elevada está precedida por un lavado de fidelidad baja para eliminar la señal de sonda de fondo. Un ejemplo de lavado de fidelidad media para una doble cadena de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1x SSC de 40 a 50ºC, preferiblemente 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de fidelidad baja para una cadena doble de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6x SSC de 35 a 45ºC, siendo 40ºC preferible, durante 15 minutos. En general, una proporción de señal con respecto a ruido de 2x (o superior) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación concreto indica la detección de una hibridación específica. Los polinucleótidos que no se hibridan entre sí bajo condiciones de fidelidad son aún sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto tiene lugar, por ejemplo, cuando una copia de un polinucleótido se crea utilizando la máxima degeneración del codón permitida por el código genético.
El término "planta transgénica" se refiere a una planta en la que los polinucleótidos exógenos se han introducido y su progenie. Habitualmente, las células de una planta se transforman con el polinucleótido exógeno y se regenera una planta transgénica a partir de las células transformadas. A continuación, la planta regenerada se desarrolla para producir una cepa de plantas transgéncias.
"Xilanasa" (EC 3.2.1.8) se refiere a una clase bien descrita de glicosil hidrolasas que hidrolizan xilano. Las aplicaciones comerciales de xilanasa incluyen la degradación y blanqueamiento de la pulpa de madera para fabricar papel. La xilanasa también se puede añadir a la alimentación para animales para mejorar la digestibilidad de la materia vegetal. Habitualmente, la xilanasa comercial deriva de los hongos. Una xilanasa preferida deriva de Trichoderma.
Realizaciones preferentes
Las paredes de las células vegetales contienen un rango de ácidos fenólicos unidos a éster lábiles a álcali.
En particular, las paredes celulares de la hierba se caracterizan por la presencia de grandes cantidades de ácidos ferúlico y p-coumárico esterificados (principalmente en sus configuraciones E), unidos a arabinoxilanos en el C5 de arabinosa. Se liberan como oligosacáridos ferulados (FAX y PAX) mediante el tratamiento con celulasa, pero in vivo proporcionan un sustrato para la reticulación catalizada por peroxidasa de los polisacáricos de la pared celular y lignina. Los niveles elevados de estos ácidos fenólicos y sus dímeros tienen una fuerte influencia en las propiedades mecánicas, digestibilidad y velocidades de digestión de la hierba por los rumiantes.
Las investigaciones previas han mostrado que el ácido ferúlico es el ácido p-hidroxicinámico predominante esterificado con polisacárico de la hierba, pero hasta hace poco, el único deshidrodímero de ácido ferúlico que se había aislado era el ácido 5,5'-diferúlico. Recientemente, se han aislado dímeros de deshidrodiferulato y mezclas de dímeros del tipo ciclobutano a partir de las paredes de células vegetales (Waldron, et al., Phytochemical Analysis 7:305 (1996)). Tal como se puede observar en la figura 1, estas mezclas están presentes en grandes cantidades en células de hierba. También se han aislado a partir de paredes celulares dímeros ácido ferúlico unido a éter-coniferil alcohol (Jacquet, et al., Polyphenol Comm. Bordeaux pp 451 (1996)), estableciendo por primera vez que los esters de ferulato se copolimerizan de manera oxidativa con precursores de lignina que pueden anclar ligninas a los polisacáridos de las paredes celulares. La producción de estos dímeros en células de hierba indica que la reticulación de deshidrodímeros de ácido fenólico de los polisacáricos de las paredes celulares es mucho más amplia que lo que se pensaba anteriormente.
Se ha descrito un sistema de enzimas de endomembranas de perejil que cataliza la ferulación de aceptores de polisacáridos endógenos a partir de feruloil CoA, apuntando a ER/golgi como el sitio de esterificación de polisacáridos y el éster CoA como el cosustrato fisiológico (Meyer, et al., FEBS Lett. 290:209 (1991)). Se ha observado evidencias adicionales de esto en polisacáridos extracelulares solubles en agua excretados en grandes cantidades en el medio por los cultivos de células de hierba. Este material está muy esterificado con ácido ferúlico y p-coumárico a niveles similares a las paredes celulares de las células cultivadas.
Se ha detectado actividad de feruloil esterasa en varias muestras fúngicas incluyendo, hongos anaeróbicos de la tripa, levaduras, actinomicetos y varias bacterias ruminales que degradan la fibra, lo que permite desesterificar los arabinoxilanos y pectinas.
Se han aislado dos esterasas de ácido ferúlico (FAE) de Aspergillus niger, diferenciadas en base al peso molecular y la especificidad de sustrato, y se ha observado que hidrolizan cuantitativamente el ácido ferúlico y liberan dímeros de deshidroferulato de las paredes de las células vegetales. Además, se ha observado que las FAE actúan sinérgicamente con xilanasa para liberar ácido ferúlico de las paredes de células vegetales a una mayor velocidad. Recientemente, se ha clonado un gen de la esterasa de ácido ferúlico (FAE) de Aspergillus niger (Michelson, et. al. Solicitud de Patente Europea No. 9510370.1). Los inventores han observado que la enzima recombinante libera ácido ferúlico y dímeros de diferulato de paredes celulares de la hierba de una manera dependiente de la concentración y que esta enzima es estable a 30ºC pH 5,0 en presencia de sustrato y tiene una vida media de 61 h a 30ºC en presencia de extractos vacuolares (pH 4,6) de células de hierba. Por tanto, este gen era un candidato para la expresión dirigida e inducible de FAE en hierbas (por ejemplo, Lolium multiflorum).
La presente invención proporciona procedimientos de cambio de la estructura de la pared celular de plantas transgénicas y, por lo tanto, las hace más digeribles. El procedimiento comprende introducir una secuencia codificante de esterase de ácido ferúlico en las células de una planta. Unido operativamente a la secuencia codificante se encuentra un promotor que puede ser constitutivo o inducible y secuencias señales que sirven para dirigir la expresión de la secuencia codificante en los orgánulos deseados en la célula deseada de la planta. Las secuencias señales pueden ser N-terminal o C-terminal o ambas.
Opcionalmente, se introduce una segunda y/o tercera secuencia codificante en la planta. Se prefiere que una secuencia codificante de xilanasa fúngica se coexprese con la secuencia codificante de FAE.
La presente invención también proporciona plantas transgéncias que contienen las secuencias codificantes de FAE1, donde la expresión de la secuencia codificante de FAE1 está dirigida a la vacuola que conduce a las hierbas más digeribles.
En general, la nomenclatura y los procedimientos de laboratorio en la tecnología de ADN recombinante descritos a continuación son bien conocidos y se utilizan habitualmente en la técnica. Las técnicas estándar se utilizan para la clonación, el aislamiento, amplificación y purificación de ADN y ARN. En general, las reacciones enzimáticas que implican ADN ligasa, ADN polimerasa, endonucleasas de restricción y similares se realizan según las especificaciones del fabricante. Los textos bases que describen los métodos generales de uso en la presente invención incluyen Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ND ED. (1989); Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION: A LABORATORY MANUAL (1990); y Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1994)).
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A. Aislamiento de polinucleótidos
El aislamiento de los polinucleótidos, por ejemplo, FAE1 y xilanasa de la invención, puede llevarse a cabo mediante varias técnicas. Ver, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos 08/952,445 en trámite que describe el aislamiento de FAE a partir de Aspergillus niger, y la solicitud de Estados Unidos 09/658,772 en trámite que describe el aislamiento de una xilanasa a partir de T. reesei.
Por ejemplo, pueden utilizarse las sondas de oligonucleótidos basadas en las secuencias citadas en la presente invención para identificar el gen deseado en una biblioteca de ADNc o ADN genómico de una especie deseada. Para construir bibliotecas genómicas, se generan grandes segmentos de ADN genómico mediante fragmentación aleatoria, por ejemplo utilizando endonucleasas de restricción, y se ligan con un ADN de vector para formar concatémeros que pueden empaquetarse en el vector apropiado. Para preparar una biblioteca de ADNc a partir de un cultivo celular específico, por ejemplo, Aspergillus niger, se aisla ARNm del cultivo y se prepara a partir del ARNm una biblioteca de ADNc que contiene las transcripciones génicas del ARNm.
A continuación puede cribarse la biblioteca de ADNc o genómica utilizando una sonda basada en la secuencia de un polinucleótido conocido, tal como los polinucleótidos citados en la presente invención. Pueden utilizarse sondas para hibridarse con secuencias de ADN genómico o ADNc para aislar genes homólogos en especies vegetales iguales o diferentes. Además de las sondas derivadas de polinucleótidos conocidos, pueden utilizarse sondas degeneradas. Las técnicas de fabricación y utilización de sondas degeneradas son bien conocidas en el sector y pueden encontrarse en Sambrook y Ausubel.
De modo alternativo, los polinucleótidos de interés pueden amplificarse a partir de muestras de polinucleótidos utilizando técnicas de amplificación. Por ejemplo, puede utilizarse la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de los genes directamente a partir de ARNm, a partir de ADNc, a partir de bibliotecas genómicas o bibliotecas de ADNc. También pueden ser útiles la PCR y otros procedimientos de amplificación in vitro, por ejemplo, para clonar polinucleótidos que codifican para proteínas a expresar, para producir polinucleótidos para usarlos como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en muestras, para la secuenciación de polinucleótidos y para otros propósitos.
A partir de las comparaciones de las secuencias proporcionadas en la presente invención se generan cebadores y sondas apropiadas para identificar genes específicos de esterasa de ácido ferúlico, así como secuencias de xilanasa, de tejidos vegetales y fúngicos. Para una visión general de PCR ver PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, (Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. y White, T., eds.), Academic Press, San Diego (1990). Los componentes de la reacción habitualmente son: Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, cloruro potásico 50 mM, cloruro magnésico 1,5 mM, gelatina al 0,001%, dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dGTP 200 \muM, dTTP 200 \muM, cebadores 0,4 \muM, y 100 unidades por mL de Taq polimerasa. Programa: 96ºC durante 3 minutos, 30 ciclos de 96ºC durante 45 segundos, 50ºC durante 60 segundos, 72ºC durante 60 segundos, seguidos de 72ºC durante 5 minutos.
También pueden sintetizarse polinucleótidos mediante técnicas bien conocidas como las descritas en la literatura técnica. Ver, por ejemplo, Carruthers, et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418 (1982), y Adams, et al., J. Am. Chem. Soc. 105:661 (1983). Por tanto, pueden obtenerse fragmentos de ADN de doble cadena mediante la síntesis de la cadena complementaria y la hibridación de las cadenas juntas bajo condiciones apropiadas, o mediante la adición de la cadena complementaria utilizando ADN polimerasa con una secuencia de cebador apropiada.
En esta invención las fuentes adecuadas de la esterasa de ácido ferúlico utilizadas incluyen, pero sin limitación, Neurospora crassa, Aspergillus spp. y específicamente, Aspergillus niger. La xilanasa utilizada en esta invención puede derivarse de cualquier fuente adecuada incluyendo, pero sin limitación, Trichoderma, preferiblemente Trichoderma reesei y Aspergillus spp.
B. Preparación de Vectores Recombinantes
Para utilizar secuencias aisladas en las técnicas anteriores, se preparan vectores de ADN recombinante adecuados para la transformación de células vegetales. En la literatura técnica y científica se conocen bien y se describen las técnicas para transformar una amplia variedad de especies vegetales. Ver, por ejemplo, Weising, et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988). Una secuencia de ADN que codifica el polipéptido deseado, por ejemplo una secuencia de ADNc que codifica la proteína FAE1 de longitud completa, preferiblemente se combinará con el inicio transcripcional y traduccional y las secuencias reguladoras de reconocimiento que dirigirán la transcripción de la secuencia del gen en los tejidos pretendidos de la planta transformada bajo las condiciones deseadas.
Los cassettes de expresión utilizados en la presente invención comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia señal que reconoce la expresión de esterasa de ácido ferúlico a la vacuola.
Pueden identificarse promotores mediante el análisis de las secuencias 5' de un gen deseado. Pueden utilizarse secuencias características de las secuencias de promotor para identificar el promotor. Se han estudiado ampliamente las secuencias que controlan la expresión de genes eucariotas. Por ejemplo, los elementos de secuencias de promotor incluyen la secuencia de consenso caja TATA (TATAAT), la cual tiene normalmente de 20 a 30 pares de bases en dirección 5' del sitio de inicio de transcripción. En la mayoría de los casos, la caja TATA es necesaria para la iniciación de la transcripción precisa. En las plantas, más arriba en dirección 5' de la caja TATA, en las posiciones de -80 a -100, hay habitualmente un elemento promotor con una serie de adeninas que rodean el trinucleótido G (o T) N G. Messing, et al., in GENETIC ENGINEERING IN PLANTS, pp. 221-227 (Kosage, Meredith and Hollaender, eds. (1983)).
Se conocen varios procedimientos por los expertos en la materia para identificar y caracterizar regiones promotoras en ADN genómico vegetal (ver, por ejemplo, Jordano, et al., Plant Cell 1:855-866 (1989); Bustos, et al., Plant Cell 1:,839-854 (1989); Green, et al., EMBO J. 7:4035-4044 (1988); Meier, et al., Plant Cell 3:309-316 (1991); y Zhang, et al., Plant Physiology 110:1069-1079 (1996)).
En la construcción de cassettes de expresión recombinantes de la invención, puede emplearse un fragmento de promotor vegetal que dirigirá la expresión del gen en todos los tejidos de una planta regenerada. Dichos promotores en la presente invención son referidos como promotores "constitutivos" y son activos bajo la mayoría de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Como ejemplos de promotores constitutivos se incluyen la región de iniciación de la transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor 1'- o 2'- derivado de T-ADN de Agrobacterium tumafaciens, los promotores de actina y ubiqüitina y otras regiones de iniciación de transcripción de varios genes de plantas conocidos por los expertos en la materia. Un promotor constitutivo particularmente preferente es el promotor de actina del arroz (ver, McElroy, Plant Cell, 2:163 (1990)).
Alternativamente, el promotor de plantas puede dirigir la expresión del polinucleótido de la invención en un tejido específico (promotores específicos de tejido) o de lo contrario puede estar bajo un control ambiental más preciso (promotores inducibles). Como ejemplos de promotores específicos de tejido bajo control de desarrollo se incluyen promotores que inician la transcripción sólo en ciertos tejidos, tales como las hojas, las raíces o las semillas.
En un aspecto de la presente invención, la expresión de FAE tiene lugar tras haber cortado la planta, haberla arrancado del suelo o ingerida. De este modo, un promotor apropiado sería un promotor de senescencia. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que BFN1 es una nucleasa expresada en hojas senescentes, Perez-Amador, et al., Plant Physiol. 122:169 (2000). De un modo similar, SAG12, una cisteína proteasa también se encuentra en hojas senescentes (Noh & Amasino, Plant Mol. Biol. 41:181 (1999). En una realización preferente, se utiliza el promotor del gen gem de Festuca pratensis para dirigir la expresión de FAE en hojas senescentes.
En otro aspecto, el FAE se expresaría tras la ingestión por un animal de forraje. Como promotores de ejemplo para este aspecto se incluiría el promotor Soybean Gmhsp 17.5 y el promotor de la leucina aminopeptidasa (LAP). El promotor GMhsp es de un gen de una proteína de choque térmico e inicia la expresión si se incrementa la temperatura del ambiente. En el laboratorio, el choque térmico preferido es un incremento de 15ºC durante 2 horas. No obstante, en condiciones que no son de laboratorio se darán incrementos adecuados de temperatura en silos y en el rumen de animales que han ingerido las plantas de la presente invención. El promotor LAP inicia la expresión del gen de FAE después de dañar a la planta. Dicho daño tendrá lugar después de cortar la planta o después de la masticación por parte de un animal de forraje. Los promotores específicos de tejido que podrían utilizarse en esta invención incluyen promotores de genes que están expresados diferencialmente en las hojas de las hierbas. Un ejemplo de un promotor específico de hoja es el promotor rbcS de tomate (Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:7104 (1987)). Este promotor normalmente regula un gen determinado por tener importancia en la fotosíntesis.
Para una expresión correcta del polipéptido, debe incluirse una región de poliadenilación en el extremo 3' de la región codificante. La región de poliadenilación puede derivarse del gen fúngico natural, de una serie de genes fúngicos o vegetales, o del T-ADN. Estas secuencias son bien conocidas y están disponibles fácilmente para los expertos en la materia.
Los vectores de expresión de la presente invención también contienen secuencias señal. Éstas son polinucleótidos hallados en los extremos 5' y/o 3' de la región codificante y sirven para dirigir la expresión del gen a los orgánulos celulares específicos. Estas secuencias señal pueden estar ambas en dirección 5' ó 3' de la región codificante. Algunos ejemplos preferentes de secuencias señal en dirección 5' incluyen la secuencia de aleuraína de cebada (Rogers, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:6512 (1985) que reconoce vacuolas.
El vector que comprende los cassettes de expresión (por ejemplo, promotores y/o regiones codificantes) de la invención comprenderá habitualmente un gen marcador que conferirá un fenotipo seleccionable en las células vegetales. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocida, particularmente resistencia a antibiótico, tal como resistencia a la higromicina, la canamicina, el G418, la bleomiciina, o resistencia a herbicida, tal como la resistencia a clorosluforon o Basta.
C. Producción de Plantas Transgénicas
Las construcciones de ADN de la presente invención se pueden introducir en el genoma de la planta huésped deseada mediante una variedad de técnicas convencionales. Por ejemplo, la construcción de ADN se puede introducir directamente el tejido vegetal utilizando métodos balísticos, tales como el bombardeo de partículas de ADN o las construcciones se pueden introducir directamente en el ADN genómico de la célula vegetal utilizando técnicas, tales como electroporación y microinyección de protoplastos de células vegetales. Alternativamente, las construcciones de ADN se pueden combinar con regiones flanqueantes de T-ADN adecuadas e introducir en un vector huésped Agrobacterium tumefaciens convencional. Las funciones de virulencia del Agrobacterium tumefaciens del huésped dirigirán la inserción de la construcción y el marcador adyacente en el ADN de la célula vegetal cuando la célula es infectada por la bacteria.
Véase, Dalton et al. (Co-transformed, diploid Lolium perenne (Perennial Ryegrass), Lolium multiflorum (Italian Ryegrass) and Lolium temulentum (Darnel) plants produced by microprojectile bombardment. Plant Cell Reports (1999) 18(9), 721-726) para métodos de ejemplo para el cultivo y transformación de hierbas.
Las técnicas de microinyección son conocidas en el sector y están bien descritas en la literatura científica y de patentes. La introducción de construcciones de ADN utilizando la precipitación con polietilenglicol se describe en Paszkowski, et al., Embo J. 3:2717-2722 (1984). Las técnicas de electroporación se describen en Fromm, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824 (1985).
Las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluyendo el desarme y la utilización de vectores binarios, están bien descritas en la literatura científica. Véase, por ejemplo, Horsch, et al., Science 233:496-498 (1984), y Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983). La Patente de Estados Unidos 5.591.616 describe técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium en monocotiledóneas.
Las técnicas de transformación balísticas se describen en Klein, et al., Nature 327:70-73 (1987). En una realización preferida, se utiliza una pistola de bombardeo de partículas (PIG) para transformar las células vegetales de la presente invención.
Las células vegetales transformadas que se derivan mediante cualquiera de las técnicas de transformación anteriores se pueden cultivar para regenerar una planta completa que posee el genotipo transformado y, de este modo, el fenotipo deseado, tal como una digestibilidad mejorada. Dichas técnicas de regeneración dependen de la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento para cultivos de tejidos, habitualmente dependen de un marcador de biocida y/o herbicida que se han introducido juntos con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de plantas de protoplastos cultivados se describe en Evans, et al., PROTOPLASTS ISOLATION AND CULTURE, HANDBOOK OF PLANT CELL CULTURE, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; y Binding, REGENERATION OF PLANTS, PLANT PROTOPLASTS, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La regeneración también se puede obtener de callos de plantas, explantes, órganos, o partes de los mismos. Dichas técnicas de regeneración se describen en general en Klee, et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987).
Para determinar la presencia o el aumento de la actividad de FAE1, se puede utilizar un ensayo enzimático o un ensayo para medir los aumentos y disminuciones en las velocidades de fermentación. Estos ensayos están fácilmente disponibles en la literatura y los expertos en la materia los pueden encontrar fácilmente.
Un experto reconocerá que se pueden utilizar otros ensayos para detectar la presencia o ausencia de FAE1. Estos ensayos incluyen, pero sin limitación, inmunoensayos y ensayos de detección electroforética (con tinción o transferencia western).
Los polinucleótidos de la presente invención se pueden utilizar para conferir características deseadas esencialmente en cualquier planta. Sin embargo, la principal utilidad de la presente invención se encuentra en la mejor digestibilidad de las plantas de forraje. De este modo, se prevé que las plantas transgénicas de la presente invención incluirán, pero sin limitación, los siguientes géneros Lolium, Festuca, Triticum, Avena, y Medicago. Los genes FAE1 de la presente invención son particularmente útiles en la producción de plantas transgénicas en el género Lolium.
Un experto en la material reconocerá que después de que el cassette de expresión se incorpore de manera estable en plantas transgénicas y se confirme que sea operable, se puede introducir en otras plantas mediante cruzamiento sexual. Se puede utilizar cualquiera de un conjunto de técnicas de reproducción estándar dependiendo de la especie a cruzar.
Tal como se ha mencionado anteriormente, las plantas transgénicas de la presente invención se pueden utilizar como un cultivo de forraje para animales, tales como ganado, ovejas, cabras y caballos. Además, los procedimientos de la presente invención se pueden utilizar para transformar cualquier planta en la cual se desee la expresión de FAE. Por ejemplo, resulta ventajoso romper las paredes celulares durante la conversión de la biomasa o durante el procesado de las plantas para alimentación. La presente invención ayudaría a conseguir este objetivo de manera eficaz y económica.
Los procedimientos de la presente invención también se pueden utilizar para proporcionar enzimas adicionales para aumentar la disponibilidad de azúcares fermentables en plantas. Los carbohidratos de las plantas se pueden someter a una modificación adicional, de manera exógena o endogena, mediante la acción de otras enzimas. Entre dichas enzimas se incluyen, pero sin limitación, endoglucanasas, xilosidasas y/o biohidrolasas celulares. Estas enzimas se pueden disponer en un cassette de expresión proporcionado para la presente invención (es decir, endógeno) o aplicado a las paredes de células vegetales (es decir, exógeno) para aumentar la disponibilidad de monosacáridos y/o disacáridos.
Otras plantas diferentes a hierbas pueden ser útiles en la presente invención. Por ejemplo, se considera específicamente que el maíz es útil. La hierba Festuca es similar al maíz en la estructura de la pared celular y, por tanto, proporciona un buen modelo de la capacidad para aumentar los carbohidratos fermentables en el maíz. Otras plantas útiles que se consideran para su uso en la presente invención son Festuca, Lolium, Zea, Avena, Sorghum, Millet (cereales tropicales), Miscanthus (una hierba con potencial para su uso como cultivo para energía como biomasa), Cenchrus, Dichanthium, Brachiaria y Paspalum (hierbas de tipo tropical apomíctica) y Poa (Kentucky bluegrass).
Las paredes celulares de hierbas de forraje forman un 30-80% de materia seca de forraje que representa un fuente principal de energía para los rumiantes, pero menos de un 50% de esta fracción es digerida por el animal. La conversión de la biomasa de poco valor en azúcares y etanol también es inferior a óptimo debido a la indisponibilidad de los carbohidratos de los alimentos, incluyendo, pero sin limitación, bagazo, paja de arroz, forraje de maíz y fibras de maíz.
El ácido ferúlico y otros ácidos hidroxicinámicos son ésteres unidos a redifuso arabinosilo en arabinoxilanos, y juegan un papel principal en la reticulación de xilanos con lignina, dando lugar a paredes celulares menos degradables. La esterasa del ácido ferúlico (FAE) puede liberar ácido ferúlico (FA) tanto monomérico como dimérico a partir de arabinoxilanos, haciendo la pared celular más susceptible de un ataque enzimático posterior. Las plantas transgéncias se produjeron expresando un gen de FAE siguiendo un bombardeo de microproyectilos de cultivos celulares. Las mediciones del nivel de actividad de FAE de diferentes vectores que dirigen FAE a la vacuola, ER y apoplasto bajo promotores constitutivos o inducibles (choque térmico) muestra que por lo menos para la expresión constitutiva de FAE dirigido a la vacuola, la actividad era la más elevada en hojas jóvenes y aumentaba a lo largo de las láminas de las hojas. También se demuestra que la expresión de FAE da lugar a la liberación de FA monomérico y dimérico de las paredes celulares en la muerte celular y esto se aumentó varias veces mediante la adición de xilanasa. Se observa un efecto de la expresión de FAE en el contenido de ferulato monomérico y dimérico unido a éster de la pared celular en comparación con las plantas de control (no transformadas). En general, cuanto más bajos son los niveles de monómeros y, en particular, dímeros de ácidos hidroxicinámicos en las hojas, mayor es la digestabilidad y/o disponibilidad de carbohidratos complejos para la conversión.
La senescencia es la fase terminal en el desarrollo de las hojas y aparece sin crecimiento o morfogénesis. Por lo tanto, el metabolismo/la fisiología de esta etapa de la vida de las hojas se puede dirigir directamente para la alteración con el impacto perjudicial mínimo sobre un desarrollo inicial. La senescencia prosigue a la madurez de las hojas y esta asociada con la expresión de genes específicos. Estos genes y sus elementos de control se pueden aprovechar para manipular las características de desarrollo, adaptación, productividad y calidad en plantas de cosecha. Parece haber una buena conversación de la fisiología de la senescencia a lo largo del rango de especies de plantas superiores y, de este modo, estos promotores son útiles en la presente invención.
Los siguientes parámetros y ejemplos se ofrecen para permitir a un experto en la material entender más claramente y llevar a la práctica la presente invención.
En la siguiente descripción experimental. Se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (Molar); \muM (micromolar); N (Normal); mol (moles); mmol (milimoles); \mumol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); kg (kilogramos); \mug (microgramos); L (litros); ml (mililitros); \mul (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); \mum (micrómetros); nm (nanómetros); ºC. (grados Centígrados); h (horas); min (minutos); s (segundos); ms (milisegundos); Ci (Curies) mCi (miliCuries); \muCi (microCuries); TLC (cromatografía de capa fina); Et (etilo), Me (metilo).
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Ejemplo 1
Preparación de secuencias de ADN que codifican enzimas
Se utiliza un clon genómico para FAE 1 (véase las figuras 1-3) como el punto de partida para la preparación de una secuencia de ADN que codifica FAE1 sin intrón. La secuencia para el clon genómico se proporciona en las figuras 2 y 3. Los fragmentos separados para ambos exones de FAE se recuperaron por PCR a partir de un fragmento EcoRI de 5,5 kb del clon genómico en pLITMUS28, y se creó "ADNc" mediante el solapamiento de PCR. Véase la
figura 4.
Se utilizaron dos cebadores 5'. FAE-S5 que amplifica el marco de lectura completo (incluyendo la señal de Aspergillus), y FAE-N5 que amplifica sólo la proteína madura (es decir, no tiene señal). Se optimizan un conjunto de codones (subrayados en las secuencias de cebadores siguientes=. El producto de solapamiento puede derivar de cebadores FAE-I5 (tipo salvaje) o FAe-I3 (Ser conservada cambiada a Ala), lo que permite la producción de proteína enzimáticamente inactiva para comprobar la toxicidad. Tal como se observa en la figura 5, el solapamiento de los productos de PCR realizado con FAE-I5 y FAE-I3 crea dos posibles marcos de lectura ininterrumpidos. Si el complemento a FAE-15 sirve como plantilla cuando se recombina, entonces la proteína codificada mantiene el grupo serina y la esterasa es funcional (la serina destacada está en el sitio activo). Si el cebador FAE-I3 sirve como plantilla, la serina se sustituye con una alanina y la esterase se inactiva (la alanina destacada en la secuencia de aminoácidos inferior se proporciona en la figura 5).
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Cuando sea posible se ha optimizado el uso de los codones en los marcos de lectura construidos (elección del codón en base a las preferencias de cebada publicadas).
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Ejemplo 2
Preparación de vectores
Los vectores presentaban la estructura general mostrada en la figura 6.
A. Serie de vectores para la transformación de plantas
Los vectores de expresión iniciales se basaron en pCOR105 [promotor de la actina del arroz - McElroy et al. MGG 231:150-160 (1991)] (Figura 7). Los sitios Not y Sstll de pCOR105 se destruyeron en primer lugar [cortados con Notl y Sstl, seguido por inactivación por calor y tratamiento con T4 ADN polimerasa en presencia de dNTPs] utilizando métodos estándar tal como se describe en Maniatis et al. o siguiendo las instrucciones para enzimas del fabricante para simplificar posteriormente la manipulación del cassette Not y permitir el uso de un único sitio Sst (ver continuación).
Los terminadores nos de pMA406 (Ainley & Key (1990) PMB 14:949-60) se amplificó por PCR utilizando los cebadores TER5 y TER3 para generar un fragmento con la siguiente secuencia (SEC ID NO:_):
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Una redundancia en el cebador TER5 (GCGKAA) crea fragmentos que tienen o un codón de parada (TAA) o un codón de glutamato (GAA) en un marco de lectura. El codón de glutamato se encuentra en el marco con un motivo KDEL en dirección 3'.
El fragmento y vector pCOR105 modificado se cortaron con Pstl y Xbal, según las instrucciones de los fabricantes, se purificaron en gel los fragmentos relevantes, se ligaron con T4 ADN ligasa y se transformaron en E. coli. A continuación, los clones resultantes se secuenciaron para establecer qué TER5 alternativas estaban presentes.
A continuación, los vectores de expresión FAE iniciales se construyeron a partir de estos vectores mediante la inserción de productos PCR FAE-S5/FAE-3 (T4 ADN polimerasa "pulida" en presencia de dNTPs, purificados y digeridos con Notl, clonados en un vector digerido con EcoRV y Notl) o productos PCR FAE-N5/FAE-3 (purificados y digeridos con Notl, clonados en un vector digerido con Notl y tratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternera).
Los clones terminadores pCOR105-nos también se modificaron mediante la adición de productos PCR Ale-5/ALE-3 (que codifican péptidos señal de aleuraína de cebada de tipo salvaje y modificados, véase a continuación para más detalles). Los productos se "pulieron" con T4 ADn polimerasa en presencia de dNTPs, se purificaron y cortaron con Notl, a continuación se clonaron en vectores digeridos con EcoRV y Notl. La adición de las secuencias ALE crea una serie de vectores que pueden expresar un marco de lectura insertado en los sitios Notl o Ncol como una fusión a la señal de aleuraína de cebada, con o sin el motivo de reconocimiento vacuolar, y con o sin un motivo de retención en ER. Los sitios HindIII que flanquean el codón de inicio de la traducción y el terminador transcripcional permiten un sencillo movimiento de las unidades de transcripción entre los vectores de expresión que proporcionan secuencias promotoras diferentes. (Véase la figura 8 que representa el vector ALE-TER genérico).
Las secuencias de los vectores se confirmaron mediante secuenciación. Se encontraron dos artefactos. En primer lugar, se observó que el codón redundante en TER5 era AAA en un clon, el cual se utilizó posteriormente como la fuente de todas las fusiones de KDEL (es decir, la secuencia del péptido es KPLKDEL, en lugar de EPLKDEL tal como se diseñó). Véase la figura 9. En segundo lugar, se observa una base adicional en el sitio del codón redundante en un clon, creando un péptido terminal desplazado en el marco de lectura (ETTEG, Figura 10) que se utilizó como control en algunas construcciones.
La explotación de la disposición modular de los péptidos señales en la serie de vectores anteriores permitió que se crearan varias combinaciones de FAE y motivos de reconocimiento utilizando procedimientos estándar de biología molecular (es decir, digesto de restricción, purificación de fragmentos relevantes y unión según sea apropiado). Por ejemplo, el fragmento Notl que contenía el marco de lectura de FAE se insertó en el sitio Notl del clon desplazado en el marco de lectura descrito anteriormente para crear el vector pTP3.1. Se insertó COOH terminal de Aspergillus nativo en un clon FAE-S5/FAE-3 como un fragmento Sphl (T4 ADN polimerasa pulida) - Ncol del gen genómico FAE (sustituyendo el fragmento Notl (T4 ADN polimerasa pulida) - NcoI, creando el vector pTP4a2, que a continuación codifica la FAE de Aspergillus completa no modificada. La sustitución del fragmento Sall/Xbal de pTP3.1 con el de pTP4a2 creó entonces pTP11.1, que no codifica la FAE con un COOH terminal de Aspergillus nativo, sino una señal N-terminal de aleuraína de cebada.
Brevemente, otros vectores fabricados en esta serie fueron: pTP8.5, el fragmento Notl de FAE insertado en el sitio Notl de una construcción de COOH terminal desplazado en el marco-ALE, N-terminal de aleuraína; pTP5.1, sustitución del COOH terminal de Aspergillus nativo por un péptido KDEL (intercambio de fragmentos Notl/Xbal), la señal N-terminal de Aspergillus permanece; pTU4.4, fragmento BamHI de pTP11.1 sustituye el fragmento BamHI de pTP5.1, crea el marco de lectura de FAE fusionado a los extremos N y C terminales heterólogos (señal de aleuraína y KDEL).
Los vectores en los que el motivo de reconocimiento vacuolar de aleuraína NPIR se sustituyó por NPGR (hallado como inactivo en algunos ensayos con plantas) se crearon mediante la sustitución de un fragmento EcoRV/NotI por un producto PCR de ALE que había sido cortado con Accl (T4 ADN polimerasa pulida) y Notl (vectores pTT5.5 y pTT5.14, extremo COOH de Aspergillus). El fragmento BamHI de pTT5.5 se utiliza para sustituir el de pTP5.1 para producir pTU5, creando un marco de lectura de FAE fusionado a los extremos N y C terminales heterólogos (modificación NPGR de la señal de aleuraína y KDEL). La señal de aleuraína también se modificó mediante mutagénesis de PCR para eliminar el motivo NPIR de reconocimiento vacuolar en su totalidad (dirigido por el cebador ALECUT, que contiene un sitio Notl para permitir el intercambio de fragmentos BgIII/Notl. La eliminación de NPIR se creó de esta manera en pTP11.1 (creando pUA4.4), y en pTP5.1 mediante el intercambio de fragmentos BamHI por pUA4.4 (creando pUG4).
Finalmente, la mutagénesis por PCR, utilizando el solapamiento de fragmentos generados por los cebadores GLY3 y GLYB, también se utilizó para alterar un sitio de glicosilación potencial (un codón de asparagina cambió a aspartato, tal como se lleva a cabo por ejemplo en Chen, H.M., C. Ford & P. J. Reilly (1994) Biochem J 301 275-281 Substitution of asparagine residues in Aspergillus awamori glucoamylase by site-directed mutagenesis to eliminate N-glycosylation and inactivation by deamidation; véase los datos de las secuencias para el cambio exacto, vector pTP10.1).
Cebadores de PCR
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B. Construcción de diferentes vectores promotores.
Se utilizaron diversos promotores para optimizar la expresión y para establecer la constitutividad, la inducción al choque térmico y el aumento de la senescencia.
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i. Promotor de actina de arroz y primer intrón
Se construyeron los vectores iniciales (figures 11 y 12) a partir de pCOR105 que se observó posteriormente que contenía una eliminación de 5 pb en relación con la secuencia publicada que destruye el sitio Accl (GTAGGTAGAC, bases eliminadas subrayadas) y puede afectar al corte y empalme en el sitio 3' adyacente. La secuencia de actina de arroz original en esta región (GTAGGTAG) se restauró por tanto utilizando el oligonucleótido NCO-ACT (CTCACCATGGTAAGCTTCTACC TACAAAAAAGCTCCGCA) mediante la sustitución del fragmento BgIII/HindIII por un producto PCR para producir el vector pPQ10.1 .
Se encuentra presente un elemento repetitivo del arroz en la región de dirección 5' del promotor de actina utilizado en pCOR105; dado que esto podría tener efectos impredecibles sobre el vector de expresión, se extrajo de pPQ10.1 mediante la eliminación del fragmento KpnI/EcoRI (completado en el extremo con T4 polimerasa y unido tras el digesto, restaurando EcoRI, pero no KpnI), para producir el vector pGT6. El fragmento HindIII que contenía el marco de lectura de FAE y el terminador nos de pTP3.1 (véase el Ejemplo 2A) se insertó a continuación en pGT6 para producir la construcción pJO6.3 .
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ii. Promotor del choque térmico de soja
Se obtuvo un promotor de choque térmico de soja de un HSP de 23 kD a partir de pMA406 (Ainley & Key (1990) PMB 14: 949-60). Se había observado previamente que cuando este promotor se fusionaba a \beta-glucuronidasa (Jefferson et al 1987 EMBO J 6:3901-3907) era inducible por un choque térmico a 10ºC y mostraba una expresión estable durante 24-48 horas (datos no mostrados). Las fusiones con \beta-glucuronidasa son un marcador de fusión sensible y versátil en plantas superiores. La construcción de los vectores HS de cointegración se indica a continuación.
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iii. Promotor de expresión del aumento de la senescencia (See1) de Lolium multiflorum
El promotor y la secuencia señal (incluyendo el motivo NPIR) del gen LSee1 se amplificó a partir de cv Tribune de Lolium multiflorum con los oligonucleótidos SEE-NCO y SEE-VAC, y se clonaron como una sustitución Asp718/Notl de la región promotora del vector pTP11.1. Tras la secuenciación para cribar los artefactos de PCR, se eligió uno de los tres clones idénticos (pUB8.11).
El promotor See1 del maíz se clonó previamente y el número de acceso EMBL es AX050343. Véase WO0070061.
La versión de See1 de Lolium también se clonó previamente (Qiang Li (2000) Studies on leaf senescence and its genetic manipulation in Lolium mutiflorum PhD Thesis University of Wales, Aberystwyth) y se ha observado que era inducible por senescencia cuando se utilizaba para dirigir tanto la \beta-glucuronidasa como el gen ipt de Agrobacterium.
Se construyó un derivado dirigido a apoplastos mediante la amplificación del motivo del Inhibidor de Proteasa de Patata (PPI) con los cebadores PPI-AP6 y SEE-ATG y la clonación del producto como un fragmento NgoMIV/Notl en pUB8.11 (digesto parcial de NgoMIV), para producir un vector pJQ5.2. Este vector presenta tanto el promotor inducido por senescencia como la secuencia dirigida de apoplasto con el gen a expresar insertado en la zona de dirección 3' de la secuencia del apoplasto.
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Cebadores de PCR
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C. Construcción de secuencias de reconocimiento
Con el fin de examinar si la localización de la enzima tendría efecto o no sobre el contenido de ácido fenólico de la pared celular, se utilizaron varias secuencias señal. Las secuencias de reconocimiento se añadieron al extremo N-terminal o al extremo c-terminal del gen de interés.
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i. Secuencias señal N-terminal
Se utilizaron seis secuencias señal N-terminal
(a) El extreme de FAE de Aspergillus nativo más la señal de excreción [localización de apoplasto]
Es del clon original y tiene la secuencia de péptido:
MKQFSAKHVLAVVVTAGHALAASTQGI.
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(b) El extreme de Aspergillus maduro sin señal de excreción [localización citoplasmática]
La secuencia del péptido es MAAASTQGI (el motivo subrayado es común en todas las construcciones). El truncamiento de la secuencia señal en (a) anterior se llevó a cabo mediante PCR con el cebador mutagénico FAE-N5.
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(c) La señal de aleuraína de cebada, incluyendo el motivo NPIR intacto [localización de la vacuola]
La secuencia señal vacuolar de aleuraína de cebada (véase la figura 13; Base de datos Swissprot de número de acceso P05167) derivaba completamente del solapamiento de los cebadores (ALE-5, ALE-3, ALE-CUT ALE-CAP-5 y ALE CAP-3). Tras la hibridación de cebadores a 37ºC y la extensión con T4 ADN polimerasa en presencia de dNTPs según las instrucciones del fabricante, se llevó a cabo la PCR con los cebadores flanqueantes ALE-5 y ALE-3. El producto se "pulió" con T4 ADN polimerasa, se purificó, se digirió con Notl y se clonó en el vector pCOR105-terminador nos digerido con EcoRV/Notl (ver anteriormente). ALE-3 contiene redundancias, de manera que se pueden recuperar los clones que codifican los motivos NPIR o NPGR. Se produjeron dos versiones de la señal, son y sin el motivo de reconocimiento de la vacuola, para obtener posibles secuencias señales NPIR vacuolar y de apoplasto (NPGR).
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Cebadores de PCR
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(d) La señal de aleuraína de cebada mutada a un motivo NPGR [localización citoplasmática]
(e) El motivo de reconocimiento en golgi de la sialil transferasa de rata [localización en golgi]
Se fabricó un vector de reconocimiento del golgi, pJQ3.2 , mediante la inserción de un marco de lectura que codifica el motivo de sialil transferasa de rata (RST) pertinente (Véase la figura 14. Se observa que el motivo RST actúa en plantas según Boevink P, Oparka K, Cruz SS, Martin B, Betteridge A, Hawes C, (1998) PLANT JOURNAL 15 441-447 Stacks on tracks: the plant Golgi apparatus traffics on an actin/ER network) en el vector pPQ10.1, y la sustitución del fragmento promotor/señal EcoRI/Notl de pJO6.3 por el fragmento de este vector. Brevemente, el motivo RST se construyó mediante la hibridación de oligonucleótidos RST-F1A, RST-F1 B, RST-F2A y RST-F2B, y la amplificación del producto con RST-5AD y RST-3A. Este producto se clonó y secuenció. Se observó que los clones presentaban una eliminación que se corrigió mediante PCR con RST-RPT, seguido de solapamiento PCR y la clonación de los productos.
Cebadores de PCR
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(f) Motivo [localización citoplasmática]
(g) El motivo en apoplasto del inhibidor de proteasa de patata II (PPI) [localización en apoplasto]
Se diseñó un marco de lectura de reconocimiento en apoplasto para codificar el motivo de inhibidor de proteasa de patata II (PPI) relevante (véase la figura 15) y se clonó en pJO6.3, para producir el vector pJQ4.9 . Brevemente, el motivo PPI se construyó mediante la hibridación de los oligonucleótidos PPI-AP1, PPI-AP2, PPI-AP3, PPI-AP4, PPI-AP5 y PPI-AP6, y la clonación de este producto como un fragmento HindIII/NotI en el vector pPQ10.1; el fragmento de promotor/señal EcoRI/Notl de pJO6.3 se sustituyó a continuación por el fragmento equivalente del vector pPQ10.1 modificado.
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ii. Secuencias señal de los extremos C-terminal
Se utilizaron cuatro secuencias señal C-terminales
(a) Extremo de Aspergillus nativo, [CTW] (vectores de vacuola y apoplasto). Derivaba directamente del clon genómico (véase el ejemplo 1) como un fragmento Nco1-Sph1 (extremo Sph completado con T4 polimerasa) que sustituye la región Nco1-Not1 de un vector estándar de actina-FAE (extremo Not1 completado con T4 ADN polimerasa).
(b) Enlazador del vector de expresión solo [CTW-PVAAA] (extreme C-terminal optimizado de planta para vectores de vacuola, golgi y apoplasto)
CTW es la secuencia peptídica del extreme COOH de FAE de Aspergillus y se proporciona aquí mediante el oligo FAE3. En este cebador el marco de lectura se extiende para proporcionar los aminoácidos adicionales PVAAA que son codificados parcialmente por el sitio Not1 utilizado para clonar las señales en dirección 3'. Véase c) y d) a continuación. Algunos aminoácidos/motivos con COOH pueden afectar al reconocimiento de compartimento, se espera que las secuencias PVAAA sean neutras en este aspecto aunque el extremo de Aspergillus puede no serlo.
(c) Enlazador más KPLKDEL [primer K es el artefacto cebador que presente ser E] {vectores de retención en ER)
Estas secuencias son proporcionadas por el cebador TER5 introducido durante la PCR para generar el fragmento terminador nos, e identificado mediante secuenciación en un clon específico. El reconocimiento de KDEL se ha demostrado en plantas según Denecke et al. ((1992) EMBO J 11: 2345-2355 Plant and mammalian sorting signals for protein retention in the endoplasmic reticulum contain a conserved epitope).
(d) Enlazador más ETTEG [desplazamiento del marco de (c)] (pérdida de vectores de vacuola de retención en ER)
Estas secuencias son proporcionadas por el cebador TER5 introducido durante la PCR para generar el fragmento terminador nos, e identificado mediante la secuenciación en un clon específico (véase el Ejemplo 2A).
La señal de KDEL es para la retención en ER, mientras que otras proporcionan controles. Se utilizó un desplazamiento del marco en la región [A adicional] en las posteriores construcciones para destruir la señal de retención KDEL en ER.
El enlazador utilizado en las secuencias de reconocimiento C-terminal fue PVAAA.
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D. Vectores de co-integración y co-transformación Vectores de co-transformación
Se utilizó un gen de resistencia a higromicina dirigido por un promotor CaMV345S (pRob5) (35S-HYG-CMV en pUC18 (HYG modificado, derivado de pGL2) Bilang et al (1991) Gene 100:247-50) para experimentos de co-transformación con vectores pTT3 y pTP3.1, pJQ4.9, pJQ3.2, pJO6.3, pJQ5.2, pUB8.1 1.
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Vectores de Co-integración 1. Construcciones de promotores de actina - pTR2.22, pTR6.1, pTR8.1, pTR9.4, pTR7.1, pTT5.5 y 5.1
La región CAMV35S-hyg de pAJEB64TCA [un vector de expresión de planta construido por Andy Bettany en IGER que contiene CaMV-HYG de pTRA151 (Zheng et al 1991 Plant Physiol 97: 832-835) (CaMV35S-HYG-terminador tml como cassette clonable en pUC4) clonado en un sitio Kpnl de pCOR105] se añadió como un fragmento HindIII en el sitio Kpnl (extremo romo de T4 polimerasa) de pTP4a2, en orientación divergente a FAE para crear pTR2.22. El fragmento FAE/Nos HindIII de este vector se sustituyó tal como se indica en los vectores de co-expresión. De pTP5.1 por pTR6.1, de pTP10.1 por pTR8.1, de pTP11.1 por pTR9.4, las secuencias señales de FAE en pTR2.22 se sustituyeron como fragmentos HindIII/BgIII en pTR7.1 (fragmento de pT09.1). Los productos PCR (ALE5/ALE-G) se digirieron con Acc1 y T4 polimerasa, se pulió, seguido de la digestión con Not1 y la clonación en pTR2.22 digerido con EcoRV/Not1 para producir los clones pTT5.5 y 5.1.
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2. Construcciones de promotores de actina -pUF1, pUA1 K3, pUH4, pUH5, pUH6, pUH7, pUH8, pUH9
El gen HygR de pAJEB64TCA, dirigido por el promotor CaMV, se clonó en primer lugar como un fragmento HindIII de extremo completo en el sitio Xbal de extremo completo de pTP3.1 para producir pHOX3. Para facilitar la clonación el sitio HindIII en dirección 3' se destruyó para crear pUA1 K3 y la sustitución del fragmento HindIII con FAE/terminador Nos en este vector se llevó a cabo tal como se indica a continuación. De pTP5.1 por pUF1, de pTP11.1 por pUH4, de pTP8.5 por UH5, de pTT5 por pUH6, de pUA4.4 por pUH7, de pTU5 por pUH8 y de pUG4 por pUH9.
3. Construcciones de promotores del choque térmico - pUH10, pUH12, pUC5.11
Se fabricó un vector de co-transformación en el que la FAE se expresa a partir del promotor de choque térmico de la soja mediante la modificación de pMA406 para eliminar el terminador nos (linealizado con Bglll y purificado por gel, digerido con KpnI, pulido con T4 ADN polimerasa en presencia de dNTPs y recirculado),y a continuación la inserción del fragmento HindIII de la FAE de pTP11.1, creando pTT3.1, que codifica la señal de aleuraína completa y el extremo COOH de Aspergillus nativo.
Después de los ensayos de varias construcciones, se construyeron los vectores de co-integración con genes de FAE y HygR dispuestos en tándem.
El gen HygR de pAJEB-64-TCA, dirigido por el promotor CaMV, se clonó en primer lugar como un fragmento HindIII de extremo completo en el sitio XbaI de extremo completo de pTP3.1 para obtener pHOX3 y posteriormente escindirse como un fragmento HindIII/Sacl (digestión parcial con Sacl, sitios pertinentes hallados en las secuencias pTP3.1 flanqueantes), el cual se clonó en los sitios HindIII/Sacl de pMA406, en orientación tandem (vector pUH1a20). A continuación, las secuencias de FAE se clonaron en el sitio HindIII de pUH1a20 en dirección 3' con respecto del promotor de choque térmico (fragmento HindIII de pTU5 por pUH10, fragmento HindIII de pTT5 por pUH12). Se fabricó un derivado pTP3.1 mediante la clonación del cassette CaMV/HygR Hindlll de pAJEB-64-TCA en orientación tándem en dirección 3' con respecto al gen de FAE en pTP3.1, la inactivación del sitio HindIII central mediante la digestión parcial y el relleno del extremo, y la escisión del cassette FAE/HygR combinado como un fragmento HindIII único, el cual se insertó en el sitio HindIII en pMA406 para producir pUC5.11.
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Ejemplo 3
Transformación de células vegetales
Se bombardearon cultivos de suspensiones de F. arundinacea y L. multiflorum de ocho a 10 semanas de vida embriogénica con un único vector de ADN plasmídico de co-integración que contenía los genes de FAE y resistencia a hyg o con un vector de co-transformación que contenía la FAE y con el plásmido pROB5 que confería resistencia a higromicina (CAMV35S-hpt-nos) utilizando una pistola de bombardeo de partículas (PIG) (Finer et al. (1992) Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells Plant Cell Reports 11:323-328) y partículas de oro de 1,5-3,0 \mum como en Dalton et al (Dalton et al. (1999) Co-transformed diploid Lolium perenne (Perennial ryegrass), Lolium multiflorum (Italian ryegrass) and Lolium temulentum (Damel) plants produced by microprojectile bombardment. Plant Cell Reports. 18: 721-726) y Kuai et al (Regeneration of fertile transgenic tall fescue (Festuca arundinacea) plants with a stable highly expressed foreign gene. Plant Cell Tissue and Organ Culture (1999) 58:149-154). Los transformantes se seleccionan con higromicina (25 a 50 mg/l) durante un periodo de selección de 10-12 semanas a 25ºC bajo una luz blanca fluorescente continua (60 \muE m^{2} s^{-1}) y las plantas se regeneran a través de la embriogénesis somática como en Dalton et al 1999, supra. Las plantas regeneradas se cribaron según la actividad FAE en la trasferencia a la tierra y la expresión de plantas desarrolladas hasta la madurez en una habitación de crecimiento de contención a 18ºC bajo luces fluorescentes durante 16 horas (350 \muE m^{2}s^{-1}). Se volvió a analizar en las plantas maduras (6-8 semanas de vida) la actividad FAE y se recogió nuevo tejido para un análisis Southern, Northern y Western y para el análisis por autodigestión. El tejido restante se liofilizó y se pulverizó para el análisis de la estructura de la pared celular, determinaciones de la digestibilidad de la materia seca in vitro (IVDMD) y para las determinaciones con la producción de gas in vitro de las velocidades de digestión del tejido.
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Ejemplo 4
Reconocimiento del producto de expresión
Para verificar que las secuencias de reconocimiento son eficaces en la liberación del gen, las secuencias de reconocimiento se unieron operativamente a una proteína verde fluorescente GFP. Las construcciones de vectores se muestran en la figura 16. Las células se transformaron mediante el bombardeo de partículas como en el ejemplo 3. La localización de la GFP se podía visualizar bajo un microscopio 1 día después del bombardeo (es decir, el disparo). Véase la figura 16.
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Ejemplo 5
Actividad FAE1
Las plantas regeneradas a partir de células transformadas mostraron actividad FAE en todos los tejidos vegetales evaluados. Las células se transformaron como se ha indicado anteriormente bajo la dirección de las secuencias de reconocimiento en ER y APO. La actividad FAE en hojas de Festuca arundinacea transformadas de diferentes edades se evaluó en comparación con las plantas de control (no transformadas). Ver Figuras 17 y 18.
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Se observaron resultados similares con hojas de Lolium mutiflorum de diferentes edades transformadas como se ha indicado anteriormente bajo la dirección de la secuencia de reconocimiento vacuolar, ER y APO. Ver Figuras 19 y 20.
También puede inducirse la expresión de FAE bajo un promotor de choque térmico. (Datos no mostrados).
De este modo, hemos demostrado la expresión de FAE en hojas de Festuca y Lolium bajo promotores constitutivos y HS con el reconocimiento eficaz de FAE en vac, ER y apo.
Ensayo de FAE
Se determinó la actividad FAE en extractos solubles de hojas frescas (o congeladas a -70ºC) o cultivos celulares frescos (0,5 g) con NaAc 0,1 M, tampón de extracción de pH 5,0. Se incubaron los extractos con EF 24 mM (4-hidroxi-3-metoxicinamato de etilo) o FAXX al 1% como sustrato, a 28ºC durante 24 horas y se calculó la actividad FAE como la cantidad de ácido ferúlico liberado. También se determinó la actividad FAE mediante la medida de la liberación de ácido ferúlico monomérico y dimérico de muestras de hojas cultivo celular auto-digeridas. Se molieron hojas o cultivos celulares frescos, o congelados (0,5 g) en NaAc 0,1 M, tampón de extracción de pH 5,0 en presencia o ausencia de xilanasa (1000 U GC140/muestra) sin sustrato añadido y se incubaron a 28ºC durante 72 horas. Después de la incubación, y la centrifugación, se cargaron los extractos solubles en una columna C18 \muNova sep-pak (Waters) de fase inversa activada, se eluyó con MeOH al 100% y se analizó la muestra de MeOH mediante HPLC.
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Ejemplo 6
Análisis Químico de Extractos de Paredes Celulares
Se extrajeron los componentes de enlace éster de hojas en polvo liofilizadas o cultivos celulares (50-100 mg) con NaOH (5 ml de 1 M) seguido de la incubación a 25ºC durante 23 horas bajo N2. Tras la centrifugación y la acidificación del extracto soluble con HCl concentrado, se cargaron los compuestos fenólicos extraídos en una columna C18 \muNova seppak (Waters) de fase inversa activada y se eluyó con MeOH al 100% y la muestra de MeOH se analizó mediante HPLC.
El HPLC se llevó a cabo con metanol: ácido acético al 5% ya sea con un gradiente de MeOH al 35-65% en 15 minutos (ensayo de FAE) o con un gradiente de MeOH al 30-70% en 25 minutos (componentes monoméricos y diméricos de la pared celular) a 2 ml/min en una \muNova Pak C18 8x10 RCM (Waters). Se detectaron y se cuantificaron los extractos con un detector de red de diodos (240-400 nm Waters 996PDA) monitorizado a 280 nm para aldehídos y 340 nm para ácidos hidroxicinámicos.
Se reducen los niveles de ácidos hidroxicinámicos monoméricos y diméricos en plantas Festuca arundinacea que expresan FAE bajo secuencias de reconocimiento en VAC, ER y APO en comparación con plantas de control (no transformados). Pueden verse los resultados en las Figuras 21 y 22, respectivamente. De este modo, demostramos que esto no da lugar a una reducción de los compuestos fenólicos de la pared celular en plantas en desarrollo con reconocimiento en vac pero sí da lugar a una reducción de compuestos fenólicos con reconocimiento en ER y apo.
No se reducen significativamente los niveles de ácidos hidroxicinámicos monoméricos y diméricos esterificados en plantas Festuca arundinacea que expresan FAE cuando se reconoce FAE en VAC (Fig 21) que está tal y como se predijo para el recocimiento vacuolar correcto, pero se reducen significativamente, tal y como se predijo, en algunas plantas cuando FAE estaba reconocido en ER y APO, en comparación con las plantas de control (no transformadas). Pueden verse los resultados en la Figura 22.
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Ejemplo 7
Digestibilidad de materia seca in vitro. (IVDMD)
La digestibilidad de la materia seca in vitro (IVDMD) se estimó en 1,0 g de peso en seco de tejido de hoja o tejido de cultivo celular utilizando el procedimiento de pepsina/celulasa de Jones y Hayward (The effect of pepsin treatment of herbage on the prediction of dry matter digestibility from solubility in fungal cellulase solutions. Journal of the Science of Food and Agriculture (1975) 26:711-718).
Demostramos que la presencia de FAE en las plantas da lugar a una mayor digestibilidad de las hojas. Esto puede deberse a actividad de FAE interna que actúa en las paredes celulares normales con FAE localizada en las vacuolas y tanto a la actividad de FAE como a la menor reticulación de la pared celular con FAE de ER y reconocido en APO (como también se encuentra con cultivos celulares).
El punto final de la digestibilidad tal y como se determina mediante IVDMD fue mayor en tejido de hoja de algunas plantas transformadas de Festuca que expresan FAE, en comparación con las plantas de control (no transformadas). Los ejemplos se muestran allí donde el FAE dirigido a vacuola, ER o apoplasto bajo un promotor de actina ha sido efectiva en el incremento de IVDMD. Se obtuvieron resultados similares con hojas de Lolium, pero menos pronunciados.
En las Figuras 23 y 24 pueden verse los resultados.
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Ejemplo 8
Mediciones de producción de gas in vitro
En cada experimento, se fermentaron 1,0 g de muestras de tejido o cultivo celular de hoja en polvo liofilizado en tres botellas de suero de 165 ml de capacidad de acuerdo con la técnica del transductor de presión de Theodorou et al. (Theodorou et al. (1994) A new gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminant feeds. Animal Feed Science and Technology 48: 185-197). Se tomaron muestras al azar de la digestión en el rumen a las 8.00 h antes de la alimentación matinal de carneros fistulados alimentados con heno de hierba, y transportados al laboratorio en un frasco de vacío precalentado (39ºC). Se prepararon el inóculo microbiano y el medio de cultivo tal y como se describe en Theodorou et al. (1994). Cada botella de suero recibió 10 ml de inóculo microbiano, 85 ml de tampón y 4 ml de agente reductor.
Al final del periodo de incubación, (144 h) se filtró el contenido de cada botella de suero a través de embudos de cristal sinterizado pre-pesados y se liofilizó hasta peso constante. Se calculó la pérdida de materia seca como la diferencia entre el peso seco de la muestra antes y después de la incubación. Adicionalmente, se determinó la concentración de ácidos grasos volátiles (VFA) en la fracción líquida de los medios de cultivo al final del periodo de incubación de 144 h mediante cromatografía de gas. Para la cuantificación de VFA se utilizó un cromatógrafo Chrompack CP 9000 acoplado con un tomador de muestras automático (Chrompack 911) y un detector de ionización de llama, conectado a un PC Dell con software de integración A1-450.
Los datos de producción de gas se ajustaron al modelo de France et al. (France, J., Dhanoa, M.S., Theodorou, M.K, Lister, S.J., Davies. D.R. and Isac, D. 1993. A model to interpret gas accumulation profiles associated with in vitro degradation of ruminant feeds. Journal of Theoretical Biology. 163: 99-111.) utilizando el paquete MLP (Ross, G.J.S. 1987. MLP, Maximum Likelihood Program Version 3.08. Oxford Numerical Algorithms Group). La ecuación está en la forma, Y = A{1 - e^{[-b(t-T) - c(\sqrt t-\sqrt T)]}} donde Y es la producción de gas acumulado (ml), A es la asíntota (es decir el conjunto de gas), T es el intervalo de tiempo, y b (h^{-1}) y c (h^{-0,5}) son constantes de la velocidad de descomposición. Se calculó una velocidad fraccional combinada (h^{-1}) de producción de gas (\mu) como, \mu = b + c/2 \sqrtt, donde t es el tiempo de incubación (h).
Puede observarse que en la Festuca arundiancea (indicada como BN en la Figura 25) los cultivos celulares tienen una mayor velocidad de digestión y producción de gas acumulado en presencia de FAE y que la adición de una xilanasa exógena mejora adicionalmente la disponibilidad de los carbohidratos fermentables. Se encuentran resultados similares en cultivos de expresión de FAE sin FAE añadido. Se incrementan adicionalmente las velocidades de fermentación en comparación con los controles mediante la adición de FAE o xilanasa exógenos ya que estos cultivos que expresan FAE presentaban una composición fenólica reducida de la pared celular celular frente a los controles. Figuras 26-28.
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Ejemplo 9
Plantas transformadas con FAE y xilanasa
La adición de xilanasa exógena (GC140) incrementó enormemente la liberación mediada por FAE de compuestos fenólicos de hojas de Festuca y Lolium que expresan FAE de A. niger. Ver Figuras 29-31 que demuestran que se incrementa la liberación de compuestos fenólicos desde las paredes celulares de las hojas en todas las plantas que expresan FAE en la muerte celular y es estimulada por xilanasa independientemente del reconocimiento. Por tanto, se analiza la expresión de una xilanasa fúngica en células vegetales.
Se modifica el cassette de expresión de FAE para comprender un gen de la xilanasa fúngica (ya sea T. reesei o A. niger) para producir un cassette de expresión de FAE-xilanasa. Se utiliza el cassette de expresión de FAE-xilanasa para transformar células vegetales de un modo similar a los descritos en el Ejemplo 3. Las células transformadas se dejan crecer y se seleccionan en un medio apropiado. Las enzimas así expresadas incrementan la disponibilidad de carbohidratos fermentables hasta una extensión mayor que el cassette de expresión de FAE.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.
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Claims (50)

1. Procedimiento para aumentar la digestabilidad de una planta, comprendiendo el método la introducción en la planta de una cassette de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que codifica la esterasa de ácido ferúlico, en el que el cassette de expresión comprende además una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia señal que reconoce la expresión del polipéptido de esterasa de ácido ferúlico en la vacuola.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido que codifica la esterasa de ácido ferúlico deriva de Aspergillus niger.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el polinucleótido codifica FAE1 de Aspergillus niger.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el polinucleótido codifica una esterasa de ácido ferúlico con un sitio de glicosilación alterado.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el polinucleótido codifica una esterasa de ácido ferúlico con una sustitución, de manera que se altera la glicosilación.
6. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el polinucleótido comprende además un polinucleótido que codifica CTWPVAAA en el extremo 3'.
7. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que los codones subóptimos se modifican a codones preferidos de Triticum spp.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el promotor es un promotor inducible.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el promotor es un promotor de senescencia.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el promotor es un promotor de choque térmico.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el promotor es un promotor constitutivo.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia señal se encuentra en la dirección del extremo 5' del polinucleótido que codifica la esterasa de ácido ferúlico.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el polinucleótido que codifica la secuencia señal deriva de un gen de reconocimiento vacuolar.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el gen de reconocimiento es un gen de aleuraína de cebada.
15. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el polinucleótido que codifica la secuencia señal deriva de un gen de senescencia de reconocimiento vacuolar.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el gen de senescencia es un gen de Lolium Seel.
17. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido que codifica la secuencia señal deriva de Solanum tuberosum.
18. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia señal se encuentra en la dirección del extremo 3' del polinucleótido de esterasa de ácido ferúlico.
19. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la introducción simultánea en la planta de un segundo cassette de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un polinucléotido que codifica un gen de xilanasa.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el segundo polinucleótido codifica una xilanasa fúngica.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que el polinucleótido que codifica la xilanasa es de Trichoderma reesei.
22. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el primer y segundo cassette de expresión están presentes en plásmidos separados.
23. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la planta se selecciona del grupo que consiste en Festuca, Lolium, Zea y Avena.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que la planta es Festuca arundinacea.
25. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la introducción del polinucleótido de esterasa de ácido ferúlico en la planta es mediante la transformación de cultivos celulares.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que los cultivos celulares se regeneran en plantas.
27. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el promotor es un promotor de actina.
28. Planta transgénica que comprende un cassette de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que codifica la esterasa de ácido ferúlico, en la que el cassette de expresión comprende además una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia señal que reconoce la expresión del polipéptido de esterasa de ácido ferúlico en la vacuola.
29. Planta según la reivindicación 28, en la que el polinucleótido que codifica la esterasa de ácido ferúlico deriva de Aspergillus niger.
30. Planta según la reivindicación 29, en la que el polinucleótido codifica FAE1 de Aspergillus niger.
31. Planta según la reivindicación 30, en la que el polinucleótido codifica una esterasa de ácido ferúlico con un sitio de glicosilación alterado.
32. Planta según la reivindicación 30, en la que el polinucleótido codifica una esterasa de ácido ferúlico con una sustitución, de manera que se altera la glicosilación.
33. Planta según la reivindicación 30, en la que el polinucleótido comprende además un polinucleótido que codifica CTWPVAAA en el extremo 3'.
34. Planta según la reivindicación 28, en la que el promotor es un promotor inducible.
35. Planta según la reivindicación 28, en la que el promotor es un promotor de senescencia.
36. Planta según la reivindicación 28, en la que el promotor es un promotor de choque térmico.
37. Planta según la reivindicación 28, en la que el promotor es un promotor constitutivo.
38. Planta según la reivindicación 28, en la que la secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia señal se encuentra en la dirección del extremo 5' del polinucleótido que codifica la esterasa de ácido ferúlico.
39. Planta según la reivindicación 38, en la que el polinucleótido que codifica la secuencia señal deriva de un gen de reconocimiento vacuolar.
40. Planta según la reivindicación 39, en la que el gen de reconocimiento es un gen de aleuraína de cebada.
41. Planta según la reivindicación 39, en la que el polinucleótido que codifica la secuencia señal deriva de un gen de senescencia de reconocimiento vacuolar.
42. Planta según la reivindicación 41, en la que el gen de senescencia es un gen de Lolium Seel.
43. Planta según la reivindicación 28, en la que el polinucleótido que codifica la secuencia señal deriva de Solanum tuberosum.
44. Planta según la reivindicación 28, en la que la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia señal se encuentra en la dirección del extremo 3' del polinucleótido de esterasa de ácido ferúlico.
45. Planta según la reivindicación 28, que comprende además un segundo cassette de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un polinucléotido que codifica un gen de xilanasa.
46. Planta según la reivindicación 45, en la que el segundo polinucleótido codifica una xilanasa fúngica.
47. Planta según la reivindicación 46, en la que el polinucleótido que codifica la xilanasa es de Trichoderma reesei.
48. Planta según la reivindicación 28, en la que la planta se selecciona del grupo que consiste en Festuca, Lolium, Zea y Avena.
49. Planta según la reivindicación 48, en la que la planta es Festuca arundinacea.
50. Planta según la reivindicación 37, en la que el promotor es un promotor de actina.
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