ES2324993T3 - Inhibidores del complemento de garrapatas. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido inhibidor del complemento derivado de la saliva de garrapata que inhibe la ruta clásica del complemento y la ruta alternativa del complemento mediante la inhibición de la escisión de C5 por la convertasa de C5 clásica y alternativa.

Description

Inhibidores del complemento de garrapatas.

La presente invención está relacionada con los inhibidores del complemento que inhiben la ruta clásica y la alternativa del complemento. En particular, la invención está relacionada con inhibidores del complemento derivados de las glándulas salivales de artrópodos hematófagos que inhiben la ruta clásica y la alternativa del complemento. La invención también está relacionada con el uso de dichos inhibidores del complemento en el tratamiento y prevención de enfermedades.

Todos los documentos mencionados en el texto y listados al final de esta descripción están incorporados aquí mediante referencia.

Las proteínas del complemento forman el principal brazo del sistema inmune efector (Law y Reid, 1995; Dodds y Sim, 1997; Whaley, 1993). Más de 30 proteínas en suero y en la superficie celular están involucradas en la función y regulación del sistema del complemento. El sistema está activado por la presencia de antígenos extraños. Existen dos rutas de activación: (1) la ruta clásica que se activa mediante IgM y complejos de IgG o mediante reconocimiento de carbohidratos; y (2) la ruta alternativa que se activa mediante endotoxinas no propias de las superficies (que carecen de moléculas reguladoras específicas) y bacterianas. Las dos rutas comprenden cascadas paralelas de eventos que resultan en la producción de la activación del complemento a través de la formación de convertasas C3 y C5 similares en las superficies celulares que resulta en la liberación de mediadores agudos de la inflamación (C3a y C5a) y la formación del complejo de ataque a membrana, como se muestra en la Figura 1.

Los efectos de la activación del complemento tienen un gran alcance e incluyen: iniciación de la inflamación especialmente a través de la liberación de mediadores agudos C3a y C5a; opsonisación y fagocitosis de patógenos mediante la deposición de C4b y C3b; eliminación de inmunocomplejos celulares mediante el reclutamiento de macrófagos; aumento de la eficiencia de la presentación de antígenos a los receptores de células B a través de la asociación covalente de antígenos y C3d; retención de antígenos en los centros germinales; aumento de la captación de antígenos mediante células presentadoras de antígenos; y disrupción mediada por el complejo de ataque a membrana (CAM) de células alteradas o extrañas (por ejemplo, bacterias, parásitos, células tumorales).

La activación del complemento debe estar estrechamente controlada para prevenir el daño en los propios tejidos corporales. Se controla mediante las cortas vidas medias de las proteínas activadas, y mediante el control de proteínas presentes en el plasma y en las membranas celulares. Cuando el control de complemento fracasa, el daño a los tejidos celulares puede provocar enfermedades. Sahu y Lambris (2000) compilaron una lista de 29 condiciones patológicas en las que participa el fallo en el control de la activación del complemento.

Incluyen: pancreatitis aguda, enfermedad de Alzheimer, encefalomielitis alérgica, alotransplante, asma, síndrome e distrés respiratorio en el adulto, daños por quemaduras, enfermedad de Crohn, glomerulonefritis, anemia hemolítica, hemodiálisis, angioedema hereditario, daños por reperfusión isquémica, fallo multiorgánico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, infarto de miocardio, psoriasis, artritis reumatoide, choque séptico, lupus eritematoso sistémico, apoplejía, síndrome de fuga vascular y xenotransplante. Los datos derivados de modelos animales (ratones "knockout" y transgénicos) que demostraron el papel esencial de la activación del complemento en algunas de estas enfermedades, se revisaron por Ward et al., 2000.

El daño tisular causado por la activación del complemento está mediado por el CAM y mediante las anafilatoxinas, C3a y C5a. Estos dos péptidos inducen daño a través de sus efectos en los neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, células microgliales, basófilos y mastocitos. Las células estimuladas por anafilatoxinas liberan mediadores proinflamatorios, enzimas degradadoras de tejidos, radicales libres de oxígeno y aumento de la expresión de moléculas de adhesión y citocinas inflamatorias (Ember et al., 1998). Esto a su vez dirige la elaboración de la respuesta inmune y la activación de los mecanismos hemostáticos como la coagulación y la fibrinolisis. El papel de las anafilatoxinas en enfermedades inflamatorias infecciosas y no infecciosas se ha revisado recientemente por Kohl (2001). La actividad proinflamatoria del CAM está mediado principalmente indirectamente por la inducción de la activación celular por el aumento de la expresión de moléculas de adhesión, factores tisulares y quimiocinas.

En vista de la importancia del control del complemento en el tratamiento de enfermedades y trastornos médicos, están en desarrollo numerosos inhibidores del complemento para su uso terapéutico (Tabla 1). Ninguno de estos inhibidores está disponible aunque algunos están actualmente en ensayos clínicos de fase I/II. Las moléculas inhibidoras en desarrollo son inhibidores naturales de alto peso molecular (Hebell et al., 1991; Weisman et al., 1990) que a menudo han sido diseñadas específicamente (Mulligan et al., 1999; Smith y Smith, 2001; Zhang et al., 2001). Son normalmente anticuerpos dirigidos contra componentes específicos del complemento (Frei et al., 1987; Link et al., 1999), las moléculas pequeñas que incluyen aptámeros de RNA (Biesecker et al., 1999) o moléculas dirigidas específicamente contra receptores del complemento. Se ha identificado un inhibidor del complemento derivado del virus de la vacuna (vaccinia virus) (McKenzie et al, 1992), así como inhibidores químicos como las indandionas (Asghar et al, 1986) y contaminantes pentacloropentano (White et al, 1985)

TABLA 1 (de Sahu y Lambris, 2000) Inhibidores del complemento en desarrollo

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En vista de la importancia de los inhibidores del complemento en el tratamiento de un amplio rango de enfermedades y condiciones, permanece una necesidad para inhibidores del complemento adicionales.

Resumen de la invención

De acuerdo con el primer aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido inhibidor del complemento derivado de la saliva de garrapata que inhibe la ruta clásica del complemento y la ruta alternativa del complemento al inhibir la escisión de C5 mediante las convertasas C5 clásica y alternativa.

Por "inhibe" se entiende que el efecto de la activación del complemento por las rutas clásica y alternativa se reduce. La capacidad de una molécula para reducir el efecto de la ruta clásica del complemento y la ruta alternativa del complemento puede determinarse mediante los ensayos hemolíticos estándar conocidos en la técnica, como los descritos en los Ejemplos y en Giclas et al (1994). Preferiblemente, la presencia de una molécula inhibidora del complemento de la invención reduce la lisis celular de los glóbulos rojos en ensayos hemolíticos estándar para las rutas clásica y alternativa de la activación del complemento en al menos un 20% en comparación con un ensayo estándar en ausencia de una molécula inhibidora del complemento, más preferiblemente en al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80%.

Preferiblemente, la molécula inhibidora del complemento de la invención inhibe la escisión de C5 mediante la convertasa C5 en la ruta clásica y la convertasa C5 en la ruta alternativa. Tal como se muestra en la Figura 1, la conversión de C5 en C5b mediante la convertasa C5 sucede en ambas rutas del complemento la alternativa y la clásica. La convertasa C5 en la ruta clásica es C4b3b2a y la convertasa C5 en la ruta alternativa es C3b2Bb. La inhibición de la escisión de C5 por ambas convertasas C5 inhibe así ambas rutas de activación del complemento, la ruta clásica y la alternativa. La capacidad de una molécula para inhibir la escisión de C5 mediante las convertasas C5 de las rutas clásica y alternativa puede determinarse mediante ensayos estándar in vitro. Preferiblemente, la presencia de una molécula inhibidora del complemento de la invención reduce la escisión de C5 mediante las convertasas C5 de las rutas clásica y alternativa en al menos un 20% en comparación con un ensayo estándar en ausencia de una molécula inhibidora del complemento, más preferiblemente en al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80%. Preferiblemente, las moléculas inhibidoras del complemento de la invención son capaces de inhibir la escisión de C5 mediante las convertasas C5 de las rutas clásica y alternativa en un rango de especies de mamíferos.

Tal como se describe aquí, el polipéptido inhibidor del complemento inhibe la escisión de C5 mediante una convertasa C5. La capacidad de una molécula de inhibir la escisión de C5 mediante la convertasa C5 de las rutas clásica y alternativa puede determinarse mediante ensayos estándar in vitro como se ha descrito antes. Preferiblemente, la presencia de una molécula inhibidora del complemento de la invención reduce la escisión de C5 mediante las convertasas C5 de las rutas clásica y alternativa en al menos un 20% en comparación con un ensayo estándar en ausencia de una molécula inhibidora del complemento, más preferiblemente en al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u
80%.

El polipéptido inhibidor del complemento de la invención inhibe la escisión de C5 mediante las convertasas C5 de ambas rutas clásica y alternativa mediante la unión directa a cualquier convertasa C5 o ambas convertasas C5. Preferiblemente, el polipéptido inhibidor del complemento de la invención inhibe la escisión de C5 mediante la unión directa a C5. Alternativamente, el polipéptido inhibidor del complemento puede inhibir la escisión de C5 mediante la unión de un complejo de C5 y una convertasa C5. La invención además proporciona un polipéptido inhibidor del complemento formando complejo con C5, formando complejo con una convertasa de C5, o formando complejo con ambos C5 y una convertasa C5. La convertasa C5 en estos complejos puede ser una convertasa C5 de cualquiera de las rutas clásica o alternativa.

Las moléculas inhibidoras del complementos descritas aquí pueden derivar de un artrópodo hematófago. El término "artrópodo hematófago" incluye a todos los artrópodos que se alimentan de sangre de un huésped adecuado, como insectos, garrapatas, piojos, pulgas y ácaros.

Las proteínas involucradas en la agregación plaquetaria (WO 93/17099), toxicidad (Man et al, 2002) y biogénesis granular (Man et al, 2001) se han aislado de la saliva de garrapata. El complemento es una de las primeras defensas de los sistemas inmunitarios encontrados por las garrapatas chupadoras de sangre cuando intentan alimentarse. Si las garrapatas que se están alimentando no asumen un rápido control de la activación del complemento, pueden ser dañadas por la respuesta inflamatoria del huésped. Se ha clonado y expresado una proteína de 18,5 kDa de la garrapata Ixodes scapularis que inhibe la ruta alternativa de la activación del complemento (Valenzuela et al., 2000). La actividad inhibidora del complemento también se ha descrito en extracto de glándula salival de Dermacentor andersoni (Ribeiro, 1987) y Ornithodoros moubata (Astigarraga et al., 1997) pero no se han identificado los componentes activos. Las moléculas que inhiben ambas rutas alternativa y clásica del complemento no se han identificado previamente en garrapatas.

El polipéptido inhibidor del complemento de la invención deriva de una garrapata. Preferiblemente, el polipéptido inhibidor del complemento deriva de la garrapata Ornithodoros moubata.

Preferiblemente, el polipéptido inhibidor del complemento que deriva de Ornithdoros moubata es una proteína que comprende los aminoácidos 19 a 168 de la secuencia de aminoácidos en la Figura 4, o un equivalente funcional de la misma. En particular, la molécula inhibidora del complemento es una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 168 de la secuencia de aminoácidos en la Figura 4 o un equivalente funcional de la misma.

La proteína que posee la secuencia de aminoácidos dada en la Figura 4, también referida aquí como "proteína OmCI", se aisló de las glándulas salivares de la garrapata Ornithodoros moubata y se ha encontrado que inhibe las rutas clásica y alternativa del complemento. Más particularmente, se ha encontrado que inhibe la escisión de C5 mediante las convertasas C5 de ambas rutas clásica y alternativa de la activación del complemento, dirigiéndose al paso de activación de C5 sin afectar a la activación de C3. La proteína OmCI inhibe la escisión de C5 mediante las convertasas C5 en un rango de mamíferos. Los primeros 18 aminoácidos de la secuencia de proteína de OmCI dada en la Figura 4 forma una secuencia señal que no es necesaria para la actividad inhibidora del complemento. El término "proteína OmCI", tal como se utiliza aquí, se refiere a la secuencia dada en la Figura 4 con o sin la secuencia señal.

El término "equivalente funcional" se utiliza aquí para describir homólogos y fragmentos de la proteína OmCI que retiene la capacidad de inhibir las rutas clásica y alternativa del complemento. Preferiblemente, los equivalentes funcionales retienen la capacidad de inhibir la escisión de C5 mediante las convertasas C5 de las rutas clásica y alternativa. Los equivalentes funcionales también incluyen homólogos y fragmentos de la proteína OmCI que retiene la capacidad de inhibir la ruta clásica mediante la inhibición de la escisión de C5 mediante la convertasa C5 de la ruta clásica o que retiene la capacidad de inhibir la ruta alternativa del complemento mediante la inhibición de la escisión de C5 mediante la convertasa C5 de la ruta alternativa.

El término "homólogo" pretende incluir referencias a parálogos y ortólogos de la secuencia OmCI que se identifica explícitamente en la Figura 4, que incluye, por ejemplo, la secuencia de la proteína OmCI de otra especie de garrapata, que incluye Rhipicephalus appendiculatus, R. sanguineus, R. bursa, A. americanum, A. cajennense, A. hebraeum, Boofilusmicroplus, B. annulatus, B. decoloratus, Dermacentor reticulatus, D. andersoni, D. marginatus, D. variabilis, Haemaphysalisinermis, Ha. leachii, Ha. punctata, Hyalomma anatolicum anatolicum, Hy. dromedarii, Hy. marginatum marginatum, Ixodes ricinus, I. persulcatus, I. scapularis, L hexagonus, Argas persicus, A. reflexus, Ornithodoros erraticus, O. moubata moubata, O. m. porcinus, y O. savignyi. El término "homólogo" también pretende incluir la secuencia de la proteína OmCI de especies de mosquito, que incluye aquellas del género Culex, Anopheles y Aedes, particularmente Culex quinquefasciatus, Aedes aegypti y Anopheles gambiae; especies de pulgas, como Cteno- cephalides felis (pulga del gato); tábanos; mosca del dengue; sabandijas; mosca tse tse; piojos; ácaros; sanguijuelas; y platelmintos.

Los métodos para la identificación de homólogos de la secuencia de OmCI dada en la Figura 4 estarán claros para los expertos en la materia. Por ejemplo, los homólogos pueden identificarse mediante búsquedas de homología en las bases de datos de secuencias, públicas y privadas. Convenientemente, se utilizarán bases de datos públicas disponibles, aunque las bases de datos privadas o disponibles comercialmente serán igualmente útiles, particularmente si contienen datos no representados en las bases de datos públicas. Las bases de datos primarias son los sitios de depósito primario de datos de secuencias de nucleótidos o aminoácidos y pueden estar disponibles públicamente o comercialmente. Ejemplos de bases de datos primarias públicamente disponibles incluye la base de datos del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), la base de datos del EMBL (http://www.ebi.ac.uk/), la base de datos del DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/), la base de datos de proteínas del SWISS-PROT (http://expasy.hcuge.ch/), la base de datos PIR (http://pir.georgetown.edu/), la base de datos TrEMBL (http://www.ebi.ac.uk/), la base de datos TIGR (véase http://www.tigr.org/tdb/index.html), la base de datos NRL-3D (http://www.nbrfa.georgetown.edu), la base de datos de Proteínas (http://www.rcsb.org/pdb), la base de datos NRDB (ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README), la base de datos OWL (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/) y las bases de datos secundarias PROSITE (http://expasy.hcuge.chlsprot/prosite.html), PRINTS (http://iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html), Profiles (http://ulrec3.unil.ch/software/PFSCANform.html), Pfam (http://www.sanger.ac.uk/software/pfam), Identify (http://dna.stanford.edu/identify/) y Blocks (http://www.blocks.fhcrc.org). Ejemplos de bases de datos disponibles comercialmente o bases de datos privadas incluye PathoGenome (Genome Therapeutics Inc.) y PathoSeq (Incyte Pharmaceuticals Inc.).

Normalmente, una identidad superior al 30% entre dos polipéptidos (preferiblemente, sobre una región específica) se considera indicativo de una equivalencia funcional y así es indicativo que dos proteínas son homólogas. Preferiblemente, las proteínas que son homólogas poseen un grado de identidad de secuencia con la secuencia de proteína OmCI identificada en la Figura 4 superior al 60%. Los homólogos más preferidos poseen grados de identidad superiores al 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99%,respectivamente con la secuencia de proteína OmCI dada en la Figura 4. El porcentaje de identidad, como se refiere aquí, es como se determina utilizando BLAST versión 2.1.3 utilizando los parámetros por defecto especificados por el NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; gap open penalty=11 y gap extension penalty=1].

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Los homólogos de la secuencia de proteína OmCI dada en la Figura 4 incluye mutantes que contienen sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos de la secuencia salvaje, a menos que se retenga la inhibición de las rutas clásica o alternativa del complemento demostradas por la secuencia de proteína salvaje. Preferiblemente, los mutantes retienen la capacidad de inhibir ambas rutas clásica y alternativa del complemento. Preferiblemente, dichos mutantes retienen la capacidad de inhibir la escisión de C5 mediante convertasas C5 de ambas rutas clásica y alternativa. Los mutantes que retienen la capacidad de inhibir la tanto la ruta clásica como la alternativa del complemento también se incluyen en el término homólogo a menos que retengan la capacidad de inhibir la escisión de C5 por la convertasa C5 de la ruta alternativa o por la convertasa C5 de la ruta clásica. Los mutantes así incluyen proteínas que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas que no afectan la función o actividad de la proteína de forma adversa. Este término también pretende incluir variantes biológicas naturales (por ejemplo, variantes alélicas o variaciones geográficas dentro de las especies de las que derivan las proteínas OmCI). Los mutantes con actividad mejorada en la inhibición de las rutas clásica y alternativa en comparación con la de la secuencia de la proteína salvaje puede también diseñarse a través de la mutación sistemática o dirigida de residuos específicos en la secuencia de proteína. Preferiblemente, dichos mutantes muestran una inhibición mejorada de la escisión de C5 mediante la convertasa C5 de la ruta clásica o mediante la convertasa C5 de la ruta alternativa. Preferiblemente, estos mutantes muestran una inhibición mejorada de la escisión de C5 mediante las convertasas C5 de ambas rutas clásica y alternativa.

Los fragmentos de la proteína OmCI y de los homólogos de la proteína OmCI también se proporcionan por la invención. Se incluyen como fragmentos no solo los fragmentos de la proteína OmCI de O. moubata que se identifica explícitamente aquí en la Figura 4, sino también por los fragmentos de los homólogos de esta proteína, como se ha descrito antes. Dichos fragmentos de homólogos poseen normalmente más de un 60% de identidad con los fragmentos de la secuencia de proteína OmCI en la Figura 4, aunque los fragmentos más preferibles de los homólogos mostrarán grados de identidad mayores del 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99%, respectivamente con los fragmentos de la secuencia de proteína OmCI en la Figura 4. Los fragmentos de la proteína OmCI que comprenden la secuencia en la Figura 4 y los fragmentos de los homólogos de la misma preferiblemente inhiben las rutas clásica y alternativa del complemento, preferiblemente inhibiendo la escisión de C5 mediante las convertasas C5 de ambas rutas clásica y alternativa. Los fragmentos de la proteína OmCI y de los homólogos de la misma que inhiben la ruta clásica del complemento o la ruta alternativa del complemento también se incluyen en la invención, a menos que retengan la capacidad de inhibir la escisión de C5 mediante la convertasa C5 de la ruta clásica o por la convertasa C5 de la ruta alternativa. Los fragmentos con actividad mejorada en la inhibición de la ruta clásica o la ruta alternativa del complemento y en particular con actividad mejorada en la inhibición de la escisión de C5 mediante las convertasas C5 pueden, por supuesto, diseñarse racionalmente mediante la mutación sistemática o fragmentación de la secuencia salvaje seguida de los ensayos de actividad apropiados.

El término "equivalente funcional" también se refiere a moléculas que son estructuralmente similares a la proteína OmCI o que contienen una estructura terciaria similar o idéntica, particularmente en el contexto del sitio o sitios activos de OmCI. OmCI se cree que inhibe la escisión de C5 mediante las convertasas C5 mediante la unión directa a C5 o a ambas convertasas C5 o a complejos de C5 y convertasas C5. OmCI se muestra en los Ejemplos aquí que se une a C5, apoyando a la sugerencia que inhibe la escisión de C5 mediante las convertasas C5 mediante la unión directa a C5 solo o cuando C5 es parte de un complejo con una convertasa C5. Aunque el solicitante no desea adherirse a esta teoría, se postula que la unión de OmCI a C5 puede prevenir el acceso de las convertasas C5 al sitio de escisión de C5. Los equivalentes funcionales preferidos de OmCI incluye por lo tanto moléculas, como homólogos y fragmentos, que retienen la capacidad de unirse directamente a C5.

También se cree que OmCI es un miembro de la familia de proteínas de las lipocalinas que se unen internamente a ligandos pequeños. OmCI puede por lo tanto inhibir también la escisión de C5 y o deposición de CAM indirectamente, mediante la unión a un ligando pequeño que se uniría normalmente a C5, convertasa C5 o el CAM y que es necesario para la función normal. No se han descrito previamente ligandos pequeños como esenciales para la función del sistema del complemento aunque el componente gamma C8 del CAM es una lipocalina que se puede unir a un ligando pequeño. Los equivalentes funcionales incluyen así moléculas que contienen estructuras terciarias similares o idénticas a los sitios activos en la proteína OmCI que se unen a C5 o a las convertasas de C5 y/o el sitio activo en la proteína OmCI que se une a ligandos pequeños. En particular, las moléculas sintéticas que están diseñadas para imitar la estructura terciaria o sitio(s) activo(s) de la proteína OmCI se consideran equivalentes funcionales.

La invención proporciona además la proteína OmCI, o un fragmento o un equivalente funcional de la misma, formando complejos con C5, formando complejos con una convertasa de C5, o formando complejos con ambos C5 y una convertasa de C5. La convertasa C5 en estos complejos puede ser una convertasa de C5 de la ruta clásica o alternativa.

Tal como se ha descrito previamente en más detalle, continúan siendo necesarios los inhibidores del complemento y en particular los inhibidores del complemento que inhiben ambas rutas clásicas y alternativa de la activación del complemento. El polipéptido inhibidor del complemento de la invención, incluye la proteína OmCI y los equivalentes funcionales de la misma, tendrá un amplio rango de aplicaciones médicas, en el tratamiento, prevención y diagnóstico de enfermedades y condiciones, así como herramientas de investigación útiles en el estudio de la inhibición del complemento y de la inhibición de ambas rutas clásica y alternativa de la activación del complemento. La proteína OmCI en sí será particularmente útil para estas aplicaciones ya que inhibe la cascada del complemento de diversas especies de mamíferos.

El polipéptido inhibidor del complemento de la invención, incluye la proteína OmCI y equivalentes funcionales de la misma, puede prepararse de forma recombinante mediante la expresión en una célula huésped. Dichos métodos de expresión son bien conocidos por los expertos en la materia y están descritos en detalle por Sambrook et al (2000) y Fernandez & Hoeffler (1998). Las proteínas y fragmentos de la presente invención pueden también prepararse utilizando técnicas convencionales de química de proteínas. Por ejemplo, los fragmentos de proteína pueden prepararse mediante síntesis química.

De acuerdo con otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une a un polipéptido inhibidor del complemento como se ha descrito antes. En particular, la invención proporciona un anticuerpo que se une a la proteína OmCI o a un equivalente funcional de la misma. Los antisueros y anticuerpos monoclonales pueden fabricarse mediante protocolos estándar utilizando una molécula inhibidora del complemento, como la proteína OmCI o un equivalente funcional de la misma, como un inmunógeno (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. By Harlow y Lane, Cold Spring Harbor Press, 1988). Tal como se utiliza aquí, el término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpos que también se unen específicamente a una molécula inhibidora del complemento. El término "anticuerpo" incluye además moléculas de anticuerpo quiméricas y humanizadas con una especificidad para una molécula inhibidora del complemento de la invención. En algunos casos, será deseable unir un grupo marcador al anticuerpo para facilitar la detección. Preferiblemente, el marcador es una enzima, un radiomarcaje o una cola fluorescente.

Los derivados del polipéptido inhibidor del complemento descrito anteriormente también está incluido como realizaciones de la invención. En particular, la invención proporciona derivados de la proteína OmCI o de equivalentes funcionales de la misma. Dichos derivados incluyen una proteína de fusión que comprende un polipéptido inhibidor del complemento que está genéticamente o químicamente fusionado a uno o más péptidos o polipéptidos. El propósito del péptido adicional o polipéptido puede ser para ayudar a la detección, expresión, separación o purificación de la proteína o puede proporcionar a la proteína de propiedades adicionales si se desea. Ejemplos de parejas de fusión potenciales incluye beta-galactosidasa, glutatión-S-transferasa, luciferasa, una cola de polihistidina, un fragmento de polimerasa T7 y un péptido señal de secreción. Otras parejas de fusión potenciales incluye biofármacos potenciales, como proteínas que están siendo desarrolladas para utilizarse como fármacos para tratar enfermedades específicas.

El polipéptido inhibidor del complemento pude también fusionarse a un dominio marcador. Preferiblemente, el dominio marcador es una cola fluorescente, una cola de epítopos que permite la purificación mediante unión por afinidad, una cola de enzima que permite el marcaje histoquímico o fluorescente, o una cola radioquímica. En una realización preferida, el dominio marcador es una cola radioquímica.

Los métodos para la generación de proteínas de fusión son estándar en la materia y son conocidos por el lector experto. Por ejemplo, la mayoría de técnicas generales de biología molecular, microbiología, tecnología de DNA recombinante y técnicas inmunológicas pueden encontrarse en Sambrook et al. (2000) o Ausubel et al. (1991). Generalmente, las proteínas de fusión pueden ser generadas más convenientemente de forma recombinante a partir de moléculas de ácido nucleico en que dos secuencias de ácido nucleico están fusionadas juntas en el mismo marco de lectura. Estas proteínas de fusión estarán codificadas por moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia codificante relevante de la proteína de fusión en cuestión.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con los aspectos anteriormente descritos de la invención. Dichas moléculas incluye DNA de cadena única o doble, cDNA y RNA, así como especies de ácidos nucleicos sintéticos. Preferiblemente, las secuencias de ácidos nucleicos comprende DNA.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína OmCI o un equivalente funcional de la misma, preferiblemente, dicha molécula de ácido nucleico comprende las bases 53 a 507 de la secuencia de nucleótidos en la Figura 4. Esta secuencia de nucleótidos codifica la proteína OmCI sin la secuencia señal. Las primeras 54 bases de la secuencia de nucleótidos en la Figura 4 codifican la secuencia señal de OmCI que no es necesaria para la actividad inhibidora del complemento. La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende las bases 1 a 507 de la secuencia de ácidos nucleicos en la Figura 4 que codifica la proteína OmCI con la secuencia señal. Tal como se utiliza aquí, la frase "moléculas de ácidos nucleicos que codifican la proteína OmCI" incluye ambas moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína OmCI con la secuencia señal y las moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína OmCI sin la secuencia señal.

La invención también incluye vectores de clonaje y expresión que comprende las moléculas de ácido nucleico de este aspecto de la invención. Dichos vectores de expresión pueden incorporar las secuencias de control de la transcripción y traducción apropiadas, por ejemplo elementos potenciadores, regiones promotor-operador, secuencias de terminación, secuencias de estabilidad de mRNA, codones de inicio o parada o sitios de unión a ribosomas, unidos en marco de lectura con las moléculas de ácido nucleico de la invención.

Adicionalmente, será conveniente provoca la secreción de la proteína recombinante en ciertos huéspedes. De acuerdo con esto, otros componentes de tales vectores puede incluir secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de secreción, señalización y procesamiento.

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Los vectores de acuerdo con la invención incluyen plásmidos y virus (incluyendo bacteriófagos y virus eucariotas), así como otros transportadores lineales o circulares de DNA, como aquellos que emplean elementos transponibles o tecnologóa homóloga de recombinación. Muchos de tales vectores y sistemas de expresión son conocidos y están documentados en la materia (Fernandez & Hoeffler, 1998). Los vectores virales particularmente adecuados incluye vectores basados en baculovirus, adenovirus y virus de la vaccinia.

Los huéspedes adecuados para la expresión recombinante incluye las especies procariotas más utilizadas, como E. coli, o levaduras eucariotas, que pueden expresar altos niveles de proteínas recombinantes y que pueden cultivarse fácilmente en grandes cantidades. Preferiblemente, la célula huésped es una célula de levadura eucariota. También son adecuadas para el cultivo in vitro las líneas celulares de mamíferos, particularmente cuando se usan sistemas de expresión dirigidos por virus. Otro sistema de expresión adecuado es el sistema de expresión de baculovirus que involucra el uso de células de insecto como huéspedes. Un sistema de expresión puede también constituir células huésped que poseen el DNA incorporado en su genoma. Proteínas, o fragmentos de proteína pueden también expresarse in vivo, por ejemplo en larvas de insecto o en tejidos de mamífero.

Se pueden utilizar una serie de técnicas para introducir los vectores de acuerdo con la presente invención en células procariotas o eucariotas. Las técnicas de transformación o transfección adecuadas están bien descritas en la bibliografía (Sambrook et al, 1989; Ausubel et al, 1991; Spector, Goldman & Leinwald, 1998). En células eucariotas, los sistemas de expresión pueden ser transitorios (por ejemplo, episomales) o permanentes (integración cromosómica) de acuerdo con las necesidades del sistema.

La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico antisentido que hibrida bajo condiciones de hibridación de alta astringencia a las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas inhibidoras del complemento. En particular, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico antisentido que hibrida bajo condiciones de hibridación de alta astringencia a las moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína OmCI. Las condiciones de hibridación de alta astringencia se definen aquí como incubación toda la noche a 42ºC en una solución que comprende formamida al 50%, 5XSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5x solución Denhardts, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado, seguido de lavados de los filtros en 0,1 X SSC a aproximadamente 65ºC.

En una realización preferible, un marcaje capaz de ser detectado se une a estas moléculas de ácido nucleico antisentido. Preferiblemente, el marcaje se selecciona de entre el grupo que consiste en radioisótopos, compuestos fluorescentes y enzimas.

La invención también incluye células huésped transformadas o transfectadas procariotas o eucariotas que comprende una molécula de ácido nucleico, una molécula de ácido nucleico antisentido o un vector como se ha definido antes. Cuando las células huésped son células procariotas, son preferiblemente células de E. coli. Las células huésped eucariotas preferibles incluyen células de levadura eucariota y células de mamífero.

La invención también proporciona un método para preparar un polipéptido inhibidor del complemento, como se ha definido antes, que comprende cultivar una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención bajo condiciones en las que la proteína se expresa y se recupera la proteína así producida. Preferiblemente, la célula huésped es una célula de levadura.

Tal como se ha descrito antes y en conexión con los equivalentes funcionales, se cree que OmCI es un miembro de la familia de proteínas de las lipocalinas y puede ejercer parte de sus efectos uniéndose a un ligando pequeño no identificado. Otras moléculas inhibidoras del complemento de la invención y equivalentes funcionales de las mismas pueden también ejercer sus efectos inhibitorios de las rutas de activación del complemento uniéndose a un ligando pequeño. La identificación de estos ligandos naturales es deseable ya que pueden actuar por sí mismos como agonistas o antagonistas de las rutas clásica y/o alternativa de activación del complemento. Dichos ligandos naturales pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con la activación anormalmente alta o baja de la ruta del complemento o pueden ser puntos de inicio útiles para el desarrollo de ligandos sintéticos para el tratamiento de dichas enfermedades. Alternativamente, los ligandos naturales pueden ser dianas útiles para el desarrollo de moléculas inhibidoras adicionales del complementos que se unen a este. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de identificación de un ligando de un polipéptido inhibidor del complemento o un equivalente funcional del mismo, tal como se descrito previamente, que comprende los pasos de: (a) contactar el polipéptido inhibidor del complemento o equivalente funcional del mismo con un ligando candidato; y (b) detectar la formación de un complejo ligando-polipéptido inhibidor del complemento.

Cualquier ligando candidato puede utilizarse en este método. El ligando candidato puede aislarse de, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas o mezclas de productos naturales. Una vez identificados los ligandos naturales de las moléculas inhibidoras del complemento, será deseable diseñar pequeñas moléculas sintéticas que imiten la estructura terciaria de los ligandos naturales. La capacidad de dichas moléculas sintéticas de unirse al polipéptido inhibidor del complemento puede también ensayarse utilizando el método de la invención.

El polipéptido inhibidor del complemento que se utiliza en este método puede estar libre en la solución, fijado a un soporte sólido, soportado en una superficie celular o localizado intracelularmente. Por ejemplo el polipéptido inhibidor del complemento puede estar fijado a un soporte sólido, con el ligando candidato añadido posteriormente. Alternativamente, uno o más ligandos candidatos pueden estar fijados a un soporte sólido y puestos en contacto con el polipéptido inhibidor del complemento

El paso de detección de la formación de un complejo entre el ligando candidato y el polipéptido inhibidor del complemento puede llevarse a cabo mediante un marcaje directamente o indirectamente asociado con el ligando candidato o en un ensayo que involucra la competición con un competidor del marcaje. En otra realización, pueden utilizarse los ensayos de cribaje competitivo, en los que anticuerpos neutralizantes que son capaces de unirse específicamente al polipéptido inhibidor del complemento, compiten con un ligando candidato por la unión. De esta manera, pueden utilizarse los anticuerpos para detectar la presencia de cualquier compuesto prueba que posea afinidad de unión específica para el polipéptido.

El método de la invención puede utilizar técnicas de cribaje de alto rendimiento conocidos en la materia para buscar múltiples ligandos candidatos simultáneamente por la capacidad de unión a un polipéptido inhibidor del complemento. Por ejemplo, la WO84/03564 describe la síntesis de gran número de diferentes ligandos candidatos en un sustrato sólido, que reaccionará entonces con el polipéptido inhibidor del complemento de la invención y se lavará. Tanto si el polipéptido inhibidor del complemento se ha unido o no a los ligandos candidatos, se detectará entonces utilizando métodos bien conocidos en la materia.

La invención también proporciona un ligando de un polipéptido inhibidor del complemento identificado o identificable mediante los métodos descritos anteriormente. Cuando el polipéptido inhibidor del complemento es una proteína OmCI o un equivalente funcional de la misma, se postula que el ligando puede ser una molécula pequeña que se une a C5 o a una convertasa de C5 o a un componente del CAM.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona una composición que comprende un polipéptido inhibidor del complemento, una proteína de fusión que comprende un polipéptido inhibidor del complemento, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor del complemento, o un ligando de una molécula inhibidora del complemento, de acuerdo con los aspectos de la invención anteriormente descritos, junto con un transportador farmacéuticamente aceptable. En particular, se proporciona una composición que comprende una proteína OmCI o un equivalente funcional de la misma, una proteína de fusión que comprende una proteína OmCI o un equivalente funcional de la misma, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína OmCI o un equivalente funcional de la misma, o un ligando de una proteína OmCI o un equivalente funcional de la misma junto con un transportador farmacéuticamente
aceptable.

El término "transportador farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza aquí, incluye genes, polipéptidos, anticuerpos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y partículas de virus inactivo o de hecho cualquier otro agente a menos que el excipiente no induzca por sí efectos de toxicidad o provoque la producción de anticuerpos que sean dañinos para el individuo que reciba la composición farmacéutica. Los transportadores farmacéuticamente aceptables pueden contener además líquidos como agua, salina, glicerol, etanol o sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias tamponadoras del pH y similares. Los excipientes pueden permitir a las composiciones farmacéuticas formularse en comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, soluciones, suspensiones para ayudar a la toma del paciente. Una profunda discusión de transportadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

La composición puede utilizarse como una composición de vacuna y puede así opcionalmente comprender un agente inmunoestimulador, por ejemplo un adyuvante. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un proceso para la formulación de una composición de vacuna que comprende llevar un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con aspectos de la invención anteriormente descritos, como una proteína OmCI o un equivalente funcional de la misma, en asociación con un transportador farmacéuticamente aceptable, opcionalmente con un adyuvante. Los adyuvantes adecuados son bien conocidos en la materia e incluyen formulaciones de emulsión de agua en aceite, adyuvantes de saponina, adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA) y otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores para potenciar la efectividad de la composición.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido inhibidor del complemento, una proteína de fusión que comprende una molécula inhibidora del complemento, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inhibidor del complemento, o un ligando de un polipéptido inhibidor del complemento, como se ha descrito antes, para utilizar en terapia.

Se describe aquí un método para tratar un animal que padece de una enfermedad o trastorno mediada por el complemento o prevenir que un animal desarrolle una enfermedad o trastorno mediada por el complemento que comprende la administración a dicho animal un polipéptido inhibidor del complemento, una proteína de fusión que comprende una molécula inhibidora del complemento, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inhibidor del complemento, un ligando de un polipéptido inhibidor del complemento, o una composición farmacéutica de acuerdo con los aspectos de la invención anteriormente descritos en una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva.

Preferiblemente, dicho animal es un mamífero, más preferiblemente un humano.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de compuesto necesaria para tratar o mejorar una enfermedad o condición en concreto. El término "cantidad profilácticamente efectiva" utilizada aquí se refiere a la cantidad de compuesto necesaria para prevenir de una enfermedad o condición en. La dosificación exacta dependerá generalmente del estado del paciente en el momento de la administración. Se deben tener en cuenta factores para determinar la dosificación como la gravedad del estado de la enfermedad en el paciente, la salud general del paciente, la edad, peso, género, dieta, tiempo y frecuencia de la administración, combinaciones de fármacos, sensibilidades de reacción y la tolerancia del paciente o respuesta a la terapia. La cantidad exacta puede determinarse mediante experimentación rutinaria, pero reside en última instancia en el juicio del médico. Generalmente, una dosis efectiva estará entre 0,01 mg/kg (masa de fármaco en comparación con la masa del paciente) y 50 mg/kg, preferiblemente entre 0,05 mg/kg y 10 mg/kg. Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.

La invención también proporciona el uso de un polipéptido inhibidor del complemento, una proteína de fusión que comprende un polipéptido inhibidor del complemento, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inhibidor del complemento, o un ligando de un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno mediada por el complemento, en la que dicha enfermedad o trastorno es la enfermedad de Alzheimer, artritis reumatoide, glomerulonefritis, daño por reperfusión, rechazo de transplante, sepsis, trastorno por inmunocomplejos o hipersensibilidad de tipo retardada.

Las moléculas inhibidoras del complemento de la invención, y en particular la proteína OmCI y equivalentes funcionales de la misma, poseen un uso clínico potencial en el tratamiento de todas las condiciones patológicas en las que el complemento juega un papel (Sahu y Lambris, 2000).

El inhibidor del complemento preferible de acuerdo con la invención, como la proteína OmCI y equivalentes funcionales de la misma, inhiben las rutas clásica y alternativa del complemento mediante la inhibición de la escisión de C5 mediante las convertasas C5 de ambas rutas clásica y alternativa. La inhibición especifica de la escisión de C5 mediante ambas convertasas de C5 bloquea las tres rutas de activación del complemento provocando la generación de C5a y CAM pero conserva las funciones de eliminación inmunitaria y opsonisación del complemento que depende de C3b. Dicho perfil puede ser útil para la intervención terapéutica en ciertas enfermedades como la enfermedad de Alzheimer, artritis reumatoide, glomerulonefritis y trastornos de hipersensibilidad de tipo retardada (Kohl, 2001).

Por ejemplo, en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer (EA), que está asociada con inflamación prominente del cerebro (que puede estar parcialmente mediada por el complemento), la inhibición de C3 aumenta la tasa de deposición de las placas beta-amiloides (Wyss-Coray et al., 2002). Por lo tanto, inhibiendo C5, pero no C3, puede ser beneficioso en el tratamiento de la EA.

La investigación del papel de las convertasas de C5 revela que el polipéptido inhibidor del complemento de la invención que inhibe la escisión de C5 mediante las convertasas de C5, como la proteína OmCI y equivalentes funcionales de la misma, también serán útiles en el tratamiento de una amplia variedad de otras enfermedades y trastornos. Ya que no se han descrito inhibidores naturales de las convertasas de C5, los investigadores han tenido hasta ahora como objetivo este paso en el desarrollo de anticuerpos inhibidores anti-C5, aptámeros de RNA inhibidores y péptidos sintéticos dirigidos contra el receptor C5a (revisado en Sahu y Lambris, 2000). Estudios recientes, utilizando el mAb BB5.1 anti-C5 (Frei et al., 1987) han establecido claramente el papel patológico de C5a y el CAM en varios modelos de enfermedades incluyendo nefritis por inmunocomplejos (Wang et al., 1996), artritis inducida por colágeno (Wang et al., 1995), isquemia miocárdica y reperfusión (Vakeva et al., 1998) y pacientes con bypass cardiopulmonar (Rollins et al., 1998). El mAB anti-C5 (18A10) ha mostrado que mejora la supervivencia en injerto neural en ratas (Ciccheti et al., 2002).

El polipéptido inhibidor del complemento de la invención que inhibe las rutas clásicas y alternativas del complemento mediante la inhibición de la escisión de C5 mediante las convertasas de C5 de ambas rutas, como la proteína OmCI y equivalentes funcionales de la misma, será por lo tanto de uso en el tratamiento de estas enfermedades y trastornos en tres áreas clave: (1) control de enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide; (2) reducción del daño tisular debido al complemento tras una cirugía; y (3) supresión del rechazo de tejidos particularmente en el campo del trasplante de órganos transgénicos.

La patología de enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide y la glomerulonefritis poseen muchos factores causales. La ruta clásica de activación del complement posee un papel en ambas enfermedades debido a la presencia de auto-anticuerpos que resultan en inmunocomplejos de anticuerpos IgG y IgA con antígeno dentro del líquido sinovial y del glomérulo (Daha, 1993) que provocan la activación inapropiada del complemento y daño tisular. La sobreexpresión de Crry soluble (homólogo de CR1 en ratón) protege a los ratones transgénicos del fallo renal agudo inducido por anticuerpos (Schiller et al., 2001). Los inmunocomplejos de la artritis reumatoide son complicados por la presencia de factores IgM reumatoides que pueden impedir la inhibición de la inmunoprecipitación mediada por el complemento (Jarvis et al, 1993) y mediante la disminución de la protección de las células sinoviales frente a los efectos celulares y la lisis mediada por el CAM (Kontinnen, 1996). El C5 que actúa a través de la ruta alternativa del complemento parece tener un papel crucial en el modelo K/BxN murino de la artritis reumatoide (Solomon et al., 2002). Las moléculas inhibidoras del complemento de la invención, como la proteína OmCI y equivalentes funcionales de la misma, serán así útiles en el tratamiento de estas enfermedades autoinmunes.

La activación del complemento provoca la disminución de la función miocárdica y un aumento de la presión de la perfusión coronaria y tasa de flujo linfática. Muchos de estos cambios pueden estar mediados por el CAM (Homeister, 1992). La proteína CR1 soluble producida mediante tecnología de DNA recombinante es efectiva en la inhibición de la activación del complemento y de la posterior actividad inflamatoria en un modelo de rata de daño por reperfusión de isquemia miocárdica transitoria (Weisman et al., 1990). Crry reduce el daño por reperfusión de isquemia en el intestino de ratón (Rehrig et al., 2001). En humanos, la inhibición de C5 mediante el anticuerpo humanizado h5G1.1-ScFV de cadena única, atenúa significativamente el daño miocárdico postoperatorio, déficit cognitivo y pérdida de sangre en pacientes que sufren de un bypass cardiopulmonar (Fitch et al, 1999). El polipéptido inhibidor del complemento de la invención que inhibe la actividad de las convertasas de C5 de las rutas clásica y alternativa será así útil en la prevención y tratamiento de daños miocárdicos postoperatorios como los daños por reperfusión.

Existe un interés continuado en los inhibidores del complemento clásico y alternativo que puede ser efectivo en el rechazo hiperagudo de aloinjerto y xenoinjerto de órganos (corazón e hígado) (Diamond et al., 1995; Thomas et al., 1996; Pratt et al., 1996; Tanaka et al., 1996; Fiorante et al., 2001; Bao et al., 2002). La principal barrera inmunológica para el xenotransplante entre humanos y cerdos es un proceso de rechazo rápido mediado por anticuerpos naturales preformados y complemento, es decir mediante la activación de la ruta clásica. Los injertos de órganos xenogénicos son especialmente susceptibles al daño mediado por el complemento debido a que las proteínas reguladoras del complemento, que normalmente protegen a las células del daño, funcionan pobremente en la regulación de complemento heterólogo. El polipéptido inhibidor del complemento de la invención será así útil en la prevención del rechace de transplantes. La proteína OmCI y los equivalentes funcionales de la misma serán particularmente útiles en la prevención del rechace de transplantes ya que la proteína OmCI inhibe las convertasas de C5 de un amplio rango de especies de mamífero (roedores y primates examinados hasta la fecha).

Se ha visto que la anafilotoxina C5a, que se produce durante la conversión de C5 mediante las convertasas de C5 está involucrada en sepsis, enfermedad por inmunocomplejo e hipersensibilidad de tipo retardada. La proteína OmCI y los equivalentes funcionales de la misma, así como otros polipéptidos inhibidores del complemento de la invención que inhiben las convertasas de C5 serán útiles en el tratamiento de estos trastornos. La proteína OmCI y los equivalentes funcionales de la misma podrían ser útiles como terapia adyuvante durante el xenotransplante mediante la prevención de la formación de C5a y parando la deposición del CAM que puede provocar la sobreregulación de factor tisular y la expresión de P-selectina en modelos animales de transplante (Fecke et al., 2002).

Otro posible uso específico incluye: (1) prevención de la activación de plaquetas mediante el complemento durante el almacenamiento de concentrado de plaquetas (Miletic y Popovic, 1993), (2) activación del complemento mediante superficies de biomaterial durante la transfusión de sangre, (3) tratamiento de fertilidad (Bedford y Witkin, 1983) y (4) protección de los vectores retrovirales de terapia génica de la lisis mediante anticuerpos naturales y complemento durante la terapia génica (Rollins et al., 1996).

Los artrópodos hematófagos, como las garrapatas, son extremadamente efectivos como transmisores de enfermedades. Convencionalmente, las técnicas para controlar las poblaciones de garrapatas han utilizado el tratamiento de animales con sustancias químicas como los acaricidas. Esta estrategia ha provocado la aparición de garrapatas resistentes, lo que indica que deben introducirse nuevas clases de sustancias químicas. Además, las sustancias químicas poseen un pequeño efecto residual, lo que indica que aplicarse frecuentemente. Una segunda aproximación es criar animales resistentes a garrapatas, pero el grado de resistencia que resulta está lejos del ideal.

En un esfuerzo de combatir las enfermedades transmitidas por parásitos, se han realizado una serie de intentos para inmunizar animales frente a las garrapatas utilizando extractos de garrapatas enteras o de intestino de garrapata. Ciertos informes han utilizado proteínas recombinantes de garrapata (véase, por ejemplo, solicitud de patente Internacional WO88/03929). No obstante, pese a estas investigaciones, la única vacuna comercialmente disponible contra las garrapatas está activa sólo frente al estadío adulto de las garrapatas B. microplus y muestra variación en la eficacia dependiendo de la localización geográfica de esta especie.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método par vacunar a un animal frente a una enfermedad o trastorno transmitido por un artrópodo hematófago, que comprende la administración a dicho animal de un polipéptido inhibidor del complemento, una proteína de fusión que comprende un polipéptido inhibidor del complemento, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor del complemento, o una composición de acuerdo con los aspectos de la invención anteriormente descritos.

Los candidatos adecuados para la vacunación incluye humanos y animales domésticos como ganado vacuno, cabras, ovejas, perros, gatos y otros animales que requieren de protección frente a artrópodos hematófagos, especialmente garrapatas, y a las infecciones que transmiten. La vacuna puede administrarse de forma única, o en combinación con otros inmunógenos. El método de este aspecto de la invención puede utilizarse para vacunar al animal frente cualquier enfermedad o trastorno transmitido por el artrópodo hematófago. Preferiblemente, el artrópodo hematófago es una garrapata, preferiblemente O. moubata. Las enfermedades y trastornos transmitidos por las garrapatas del género Ornithodoros incluye fiebre recurrente (Borreliosis) y virus humano del Nilo occidental, y virus de la fiebre porcina Africana.

La invención proporciona además el uso de un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con los aspectos de la invención anteriormente descritos como herramienta de diagnóstico. La identificación del polipéptido inhibidor del complemento de la invención permitirá a los investigadores estudiar los efectos de inhibición simultánea de ambas rutas clásica y alternativa del complemento. En particular, la identificación de la proteína OmCI permitirá a los investigadores estudiar los efectos de inhibición simultánea de ambas rutas clásica y alternativa del complemento mediante la inhibición de la convertasa de C5.

La invención también proporciona un método para inhibir las rutas clásica y alternativa del complemento en una célula, tejido u organismo no humano que comprende la administración a dicha célula, tejido u organismo, un polipéptido inhibidor del complemento, una proteína de fusión que comprende un polipéptido inhibidor del complemento, o una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido inhibidor del complemento, de acuerdo con los aspectos de la invención anteriormente descritos. En particular, la invención proporciona un método para inhibir la actividad de la convertasa C5 en una célula, tejido u organismo no humano, que comprende la administración a dicha célula, tejido u organismo, una proteína OmCI o equivalente funcional de la misma, una proteína de fusión que comprende una proteína OmCI o equivalente funcional de la misma, o una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína OmCI o equivalente funcional de la misma. Este método permitirá a los investigadores descubrir el papel de C5 en varias enfermedades y trastornos. Por ejemplo, se ha sugerido que C5 puede jugar un papel positivo en la prevención del asma (Kohl,
2001). Los inhibidores de la convertasa de C5 de la invención pueden utilizarse para determinar si este es el caso.

Varios aspectos y realizaciones de la presente invención se describirán a continuación en más detalle a modo de ejemplo.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Diagrama esquemático de las rutas clásica y alternativa de la activación del complemento. Componentes enzimáticos, gris oscuro. Anafilatoxinas en cajas estrelladas.

Figura 2: Purificación de inhibidor del complemento de O. moubata (OmCI). a. Cromatografía de intercambio de cationes. El pico que contiene inhibidor está indicado por una flecha. b. Ensayo hemolítico clásico. Muestra 1 (barra negra), 100% lisis; muestra 2, 0% lisis; muestra 3, (barra con entramado) sólo suero; muestra 4, suero más 1 \mul SGE; muestra 5-23 (barras grises) suero más 10 \mul; fracciones 10-28 mostradas en panel a. Media de 3 replicados.

Figura 3: Análisis de OmCI purificado por a. SDS-PAGE desnaturalizante, b. isoelectroenfoque (IEF) y c. cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Fracciones f15 y f17 en paneles a. y b. son los mismos. Fracción f15 se recuperó y analizó mediante HPLC, panel c. Marcadores de peso y marcadores de punto isoeléctrico (PI) se indican a la izquierda de los paneles a. y b.

Figura 4: Secuencia primaria de OmCI. Secuencia señal subrayada. Residuos de cisteína en negrita. Número de nucleótido y aminoácido indicado a la derecha.

Figura 5: Alineamiento de secuencia Clustal X de OmCI con proteínas 2 y 3 (TSGP2 y 3) de glándula salival de garrapata y moubatina. Los residuos idénticos se resaltan en gris (cisteínas en negro) y con asterisco.

Figura 6: Actividad inhibidora en a. sobrenadante y b. botón celular de clones de levadura con OmCI insertado en el genoma (13.1- 13.5), y clon con sólo vector insertado en el genoma (control).

Figura 7: Expresión (a) y desglicosilación (b) de rOmCI expresado en célula de levadura. a. SDS PAGE de las fracciones 9-13 a partir de columna de filtración en gel Superdex-75. b. Efecto del tratamiento PNGasaF en la movilidad de rOmCI altamente glicosilado (fracciones 9-11 en panel a). Las flechas indican PNGasaF (flecha superior) y OmCI nativo (flecha inferior). EV504 está distantemente relacionada con OmCI y se sabe que está glicosilada. Los marcadores de peso (kDa) indicados a la izquierda del panel.

Figura 8: Inhibición de la lisis provocada por las rutas clásicas (CH50) y alternativa (AH50) de la activación del complemento por diferentes concentraciones de OmCI nativo. Media de 4 replicados.

Figura 9: Efecto de OmCI en la adición de C8 y C9 a complejo de ataque a membranas (CAM) parcialmente formado. Absorbancia mostrada debida al 100% y 0% de lisis y en ausencia (PBS) y presencia (SGE) de inhibidor. Media de 6 replicados.

Figura 10: Seguimiento a lo largo del tiempo que muestra la ausencia de efecto de OmCI en la escisión de C3a en la ruta clásica a partir de C3\alpha analizado por a. SDS-PAGE desnaturalizante y b. inmunoblot con antisuero específico de C3a. a. Minutos (min) desde el inicio de la reacción indicada. Reacciones realizadas con (OmCI) o sin (PBS) inhibidor, o en presencia de EDTA 10 mM. Posiciones mostradas de suero de albúmina bovina (BSA) y hemoglobina (HAE). Marcadores de peso (kDa) indicados a la izquierda del panel. b. Como el panel a., posiciones mostradas de C3a y C3\alpha.

Figura 11: Efecto de OmCI en la escisión de la convertasa de C5 clásica, alternativa y por el factor de veneno de cobra (CVF) de C5a a partir de C5\alpha analizado mediante ELISA. Picogramos/\mul de C5a liberado medido tras 100% lisis de glóbulos rojos de oveja con agua, 0% lisis en GVB^{2+} sólo, y reacciones con (OmCI) o sin (PBS) inhibidor. Media de 4 replicados.

Figura 12: Efecto de la adición de C3 y C5 puros a suero sin C3 y C5 en la ruta de lisis clásica de glóbulos rojos de oveja en presencia (+) y ausencia (-) de cantidad mínima de OmCI que proporciona la inhibición completa de lisis en un exceso de 1 log. Media de 4 replicados.

Figura 13: Efecto de ebullición en el ensayo CH50 de la actividad inhibidora de OmCI.

Figura 14: Efecto de tratamiento con pH en el ensayo CH50 de la actividad inhibidora de OmCI..

Figura 15: Detección de la unión de C5 a nOmCI. La transferencia de nOmCI y RaHBP2 (control) a nitrocelulosa se demostró con un autoradiograma de C3 o C5 marcados con I^{125}. Los marcadores de peso de proteína (kDa) se indican a la izquierda del panel.

Figura 16: Detección de la unión de nOmCI a C5 mediante cromatografía de filtración en gel. nOmCI radiomarcado a. con o sin C3 y C5 purificado (C3/C5 puro) y b. con o sin NHS, y suero sin C3 o C5 (delta C3/C5). Los marcadores de peso de proteína (kDa) se indican con flechas.

Ejemplos Materiales y métodos Materiales

Los glóbulos rojos de oveja y conejo se obtuvieron de los servicios de cultivo de tejidos. Hemolisina, de suero humano normal (NHS) y suero deplecionado se obtuvieron de Stigma. El suero de conejillo de indias se obtuvo de animales propios. C3, C4, C5,C8 y C9 puros y los factores B y D, se compraron a Calbiochem. El antisuero policlonal de conejo anti-C3a humano de Calbiochem y el factor de veneno de cobra (CVF) de Quidel. El equipo ELISA de detección de C5a se compró a Immuno-Biological Laboratories (IBL).

Garrapatas

Las garrapatas Ornithodorus moubata se criaron de acuerdo con Jones et al. (1988).

Preparación y purificación de muestras de glándula salival

Las glándulas salivales se diseccionaron al microscopio, se enjuagaron brevemente n tampón PBS frío (tampón fosfato 0,01 M y NaCl 0,15 M pH 7,2) y se transfirieron a tubos Eppendorf mantenidos en hielo seco y se almacenaron a -20ºC. Cuando se necesitaron, se descongelaron 30 pares de glándulas salivales y se trocearon en 500 \mul de PBS utilizando 1 ml de homogenizador Dounce. El homogenado se centrifugó a 15K RPM en una centrífuga de poyata y se recogió el sobrenadante (referido como extracto de glándula salival, SGE) y se guardó -70ºC, o se analizó para la actividad inhibidora del complemento y se utilizó para aislar la fracción activa.

Ruta clásica del ensayo hemolítico del complemento (CH50)

Cinco ml de sangre fresca de oveja en solución de Alsever (1:1 vol/vol) se lavó una vez en 50 ml de Gelatina veronal barbital-EDTA (GVB-EDTA) y tres veces en 50 ml de GVB^{2+} tampón (GVB tampón con Mg^{2+} y Ca^{2+}). La sangre se diluyó a una concentración de 1 x 10^{9} células ml^{-1}. Los eritrocitos se sensibilizaron utilizando hemolisina de conejo, se titularon como se describe en (Coligan, 1994). Los ensayos se realizaron en un volumen total de 200 \mul utilizando 100 \mul NHS diluido 1:40 o de suero de conejillo de indias en GVB^{2+} como fuente de complemento y 100 \mul 2x10^{8} de eritrocitos sensibilizados (EA) de acuerdo con los protocolos estándar (Giclas, 1994). SGE, OmCI nativo o recombinante (nOmCI o rOmCI) o PBS (1-5Pl) se añadieron al final, y las reacciones se incubaron a 37ºC. Al final del tiempo de seguimiento (hasta 32 min.) las células se centrifugaron a 12000 x g durante 5 segundos y la hemólisis se midió mediante espectrofotometría a 412 nm (Coligan, 1994). Todos los ensayos se llevaron a cabo al menos tres veces.

Ruta alternativa del ensayo hemolítico del complemento (AH50)

Cinco ml de sangre fresca de conejo en solución de Alsever (1:1 vol/vol) se lavó tres veces en 50 ml tampón GVB/Mg (10 mM) EGTA centrifugando a 1500 x g durante 10 min entre lavados. La sangre de conejo se diluyó a 2 x 10^{8} células ml^{-1}. NHS se diluyó en tampón GVB/Mg EGTA. El volumen de ensayo fue de 150 \mul con 50 \mul de sangre preparada. 1-5 \mul de SGE, PBS, OmCI nativo o OmCI recombinante se añadieron a las reacciones en último lugar, y las reacciones se incubaron a 37ºC. Al final del tiempo de seguimiento (hasta 60 min.) las células se centrifugaron a 12000 x g durante 5 segundos y la hemólisis se midió mediante espectrofotometría a 412 nm (Coligan, 1994). Todos los ensayos se llevaron a cabo al menos tres veces.

Ensayos líticos utilizando suero carente de componentes del complemento específicos

Se utilizó suero humano deplecionado de acuerdo con las instrucciones del fabricante pero el volumen total de cada reacción se redujo a 200 \mul. Los volúmenes y diluciones de componentes del complemento puros que proporcionaron un 90% de lisis se determinaron empíricamente. Las reacciones se incubaron durante 30 min. a 37ºC. Todos los ensayos se llevaron a cabo al menos tres veces.

Purificación de inhibidor del complemento de O. moubata (OmCI) a partir de SGE

Se diluyeron 150 \mul de SGE en 5 ml de tampón fosfato sódico 25 mM a pH 6,8, NaCl 50 mM y se cargaron en 1 ml de columna de intercambio de cationes Q-Sepharose HP (Pharmacia) a una tasa de flujo de 1 ml/min. Tras lavar con otros 10 volúmenes de columna de tampón de ensayo, las proteínas unidas se eluyeron utilizando un gradiente durante 40 min. de 0,05-0,75M de NaCl a una tasa de flujo de 0,5 ml/min. y se monitorizó a 280 nm. Se recogieron fracciones de un ml y se analizaron 10 \mul por la actividad inhibidora del complemento en 200 \mul de volumen total de CH50. Las fracciones activas e inactivas representativas se concentraron a 50 \mul utilizando un dispositivo de filtración Centricon 3 (Amicon), se añadió 2 ml de PBS, las fracciones se concentraron a 50 \mul de nuevo y 1,5 \mul de cada se cargó en un gel desnaturalizante SDS Tris-Tricina 4-12% (Invitrogen). Se analizaron cinco \mul por carril de ambas fracciones activa e inactiva en un gel IEF pH 3-7 (Invitrogen) y se cargaron en un electroblot Immobilon^{TM}-P (Millipore) utilizando ácido acético al 0,7%. La membrana se tiñó con Ponceau-S, y las bandas más grandes se cortaron y eluyeron en 200 \mul, 50 mM de Tris pH 8, 2% de Triton-X100 vorteadas 1 min. y centrifugadas durante 10 min. a 15K rpm tres veces. El Triton-X100 se eliminó repurificando las proteínas en columnas de Q-Sepahrose HP utilizando las condiciones descritas anteriormente. Tras la concentración en Centricon 3 y el intercambio de tampón a PBS, las muestras se analizaron para la actividad inhibidora del complemento y se examinaron en geles al 4-12% o se sometieron a fraccionamiento por HPLC y análisis de la secuencia de proteínas.

Detección de la producción de C3a durante los ensayos hemolíticos

Los ensayos CH50/AH50 se ajustaron en un volumen total de 200 \mul utilizando una dilución final de NHS de 1:80 o suero de conejillo de indias con o sin OmCI nativo. Las reacciones que estaban a 37ºC se retiraron del baño de agua en determinados tiempos, después se centrifugaron a 12000 g durante 10 segundos y el sobrenadante se retiró para un posterior análisis mediante inmunoblot. 10 \mul de cada muestra de sobrenadante reducido se sometió a electroforesis en un gel Bis-Tris al 4-12% con tampón de ensayo MES (Invitrogen) y después se transfirió a nitrocelulosa. La confirmación de carga equivalente y transferencia a todos los carriles se evaluó por la intensidad de la banda de suero de albúmina tras la tinción con Ponceau. La escisión de C3a a partir de C3 se detectó mediante inmunoblot utilizando antisuero monoespecífico de conejo anti-C3a humano (Calbiochem). La membrana de nitrocelulosa se bloqueó durante la noche con tampón fosfato salino con Tween 20 al 0,1%, leche en polvo desnatada al 5% (PBSTM). Este tampón se utilizó para todas las posteriores diluciones y pasos de lavado a no ser que se indique de otra manera. El antisuero anti-C3a se diluyó a 1:500 y se incubó con la membrana durante 2h. La membrana se lavó entonces dos veces durante 20 minutos antes de añadir una dilución 1:3000 de conjugado fosfatasa alcalina anti-conejo (Sigma) en PBSTM. Tras otras 2h de incubación, la membrana se lavó dos veces durante 5 minutos, se enjuagó brevemente en agua y se añadió 10 ml de sustrato de fosfatasa alcalina líquido púrpura BCIP/NBT
(Sigma).

Detección de la producción de C5a durante los ensayos hemolíticos

Los ensayos hemolíticos se realizaron como se describe para la detección de C3a. Se utilizó un quipo de ELISA C5a (IBL) para detectar la escisión de C5a a partir de C5. Para prevenir reacción cruzada con C5 no escindido, el C5 presente en el sobrenadante de los ensayos hemolíticos se precipitaron utilizando el reactivo proporcionado por los fabricantes del equipo. El rango de medición del equipo se extiende desde 0,1 a 10 \mug/L. El límite inferior de detección es de 0,02 \mug/L.

Descomplementación de suero con factor de veneno de cobra (CVF)

Se añadió 0,25 \mug de CVF (0,25 \mug/\mul de solución de reserva) y 1 \mul de OmCI nativo o 1 \mul de PBS a 5 \mul de suero humano y se incubó durante 1 hora a 37ºC. La mitad del suero tratado con CVF se añadió a 97,5 \mul de GVB^{2+} y 100 \mul de EA. Tras la incubación durante 20 min. a 37ºC, se determinó el porcentaje de lisis y concentración de C5a (véase arriba) en los sobrenadantes de la reacción.

HPLC de la fracción activa, análisis de la secuencia de proteínas y digestión con tripsina

Veinte \mul de la fracción activa eluída de la proteína resuelta por IEF se analizó en una columna Jupiter C4/150 x 1,0 mm, y un gradiente de acetonitrilo al 10-40% (ACN) con ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA), tasa de flujo de 1 ml/min. con 0,5% de ACN/incrementos min., y se monitorizó a 215 nm. Los cuatro picos de análisis cercanos en el min. c.53 se transfirieron a una membrana Immobilon-P y se secuenció utilizando un cartucho Mini-Blott de Applied Biosystems. Se realizaron veinticinco ciclos en cada proteína.

Para el análisis de secuencias de productos digeridos con tripsina, el principal pico a 53 min. (que comprende los cuatro picos observados en la primera separación de HPLC) se secó en un SpeedVac y se redisolvió en guanidina 6M, Tris 0,5 M pH 8,0, después se redujo y se alquiló utilizando 4-vinilpiridina. Se reanalizó en la misma columna Jupiter C4. No se notó un cambio en el tiempo de retención. El principal pico se secó en SpeedVac y se redisolvió en bicarbonato amónico 0,1 M a pH 8,1. Se añadieron diez \mul de tripsina inmovilizada de Pierce y la mezcla se incubó a 37ºC durante 5 horas con mezclado intermitente. La mezcla se centrifugó entonces a 10K rpm y el sobrenadante se cargó en un microblot de HPLC 173a (Aquapore columna C18/100 x 0,5 mm). Los picos de interés se cortaron de la membrana y se secuenciaron. Se realizaron quince ciclos en cada proteína.

Construcción de una biblioteca de cDNA de O. moubata

Se escindieron sesenta pares de glándulas salivales de O. moubata recogidas de ninfas tras su 3ª o 4ª comida, como se ha descrito antes y se colocaron en 1 ml de RNAlater^{TM} (Ambion) (en lugar de PBS) y se guardaron a -20ºC. Se aisló el mRNA utilizando el equipo de aislamiento de mRNA FastTrack^{TM} 2.0 (Invitrogen) y se sintetizó el cDNA utilizando el equipo de síntesis de cDNA de Stratagene (Nº Cat. 200401-5). Tras el fraccionamiento en cDNA de tamaño grande y pequeño en una columna CL-2B de sepharose, el etanol precipitó el cDNA, y los botones se resuspendieron en 3,5 \mul de ddH_{2}O. Las proporciones de cDNA fueron de aproximadamente de 3,0 ng/\mul y 5 ng/\mul para las moléculas de tamaño grande y pequeño, respectivamente. El resto de cDNA de tamaño grande y pequeño se ligaron en el vector fágico UniZAP XR de Stratagene (Nº Cat. 237211) y se empaquetaron con extracto de empaquetamiento Gigapack® III Gold. Hubieron 11500 placas primarias en la biblioteca de cDNA grandes y 480500 placas primarias en la biblioteca de cDNA pequeños. Tras la amplificación, la titulación de las bibliotecas grande y pequeña fue de 1,5 x 10^{8} pfu/ml y 4 x 10^{9} pfu/ml, respectivamente.

Se picaron veinte placas de cada una de las bibliotecas en 0,5 ml de tampón SM (NaCl 0,1 M, MgSO_{4} 8 mM, TRIS.HCl 50 mM pH 7,5, gelatina al 0,01%) cloroformo al 1% y se eluyó de las láminas de agarosa por agitación al vórtex. Los tamaños de los insertos de fago se examinaron mediante PCR utilizando cebadores T7 (T7 5'TAA TAC GAC TCA CTA TAG 3') y T3 (5'AAT TAA CCC TCA CTA AAG 3'). Cada 100 \mul de reacción comprende 2 \mul de fago eluído, 2 \mul de dNTP 10 mM, 2 \mul de cada cebador (de soluciones de reserva 0,5 \mug/ml), 10 \mul de tampón de reacción de PCR 10X REDTaq (Sigma) (Tris-HCl 100 mM pH 8,3, KCl 500 mM, MgCl_{2} 11 mM, gelatina al 0,1%), 3 \mul de polimerasa de DNA REDTaq (Sigma) (1 unidad/\mul en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, KCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Tween 20 al 0,5%, Igepal CA-630 al 0,5%, tinte inerte, glicerol 50%) y 79 \mul de ddH_{2}O. Los parámetros de los ciclos térmicos (termociclador Hybaid Touchdown) fueron 1X 94ºC 4 min., 30X 94ºC 1 min., 48,5ºC 45 s., 72ºC 90 s., y 1X 72ºC 5 min. La electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR mostró que los insertos grandes de la biblioteca fueron \geq1000 pares de bases y los insertos pequeños de la biblioteca fueron \leq1000 pares de bases.

Clonaje de cDNA que codifica un inhibidor del complemento

Las secuencias N-terminal determinadas para los dos picos principales eluídos a 53 min. a partir de la HPLC se utilizaron para diseñar un cebador degenerado (OF4) para utilizar con el cebador T7 (que se une al vector UniZAP XR), para amplificar el cDNA que codifica el inhibidor del complemento. La secuencia de OF4 fue de 5' GTAC WSN GGN WSN GAR CCN GT 3' (en el que: N = A o C o G o T; R = G o A; S = G o C; y W = A o T). Los 100 \mul de la reacción comprenden 3 \mul de cDNA de la biblioteca grande o pequeña, 3 \mul dNTP 10 mM, 2 \mul de T7 y 4 \mul de OF4 (de una solución stock de 0,5 \mug/ml), 10 \mul de 10X tampón de reacción de PCR REDTaq, 3 \mul de polimerasa de DNA REDTaq y 75 \mul de dH_{2}O. Los parámetros de los ciclos térmicos fueron 1X 94ºC 4 min., 30X 94ºC 1 min., 48,5ºC 45 s., 72ºC 90 s., y 1X 72ºC 5 min.

La electroforesis en gel de agarosa reveló un rango de productos de PCR. Se purificaron dos productos derivados del cebador OF4 utilizando un equipo de extracción de gel Qiaex II (Qiagen) y se secuenció con el equipo de secuenciación de ABI PRISM^{TM} "dye terminator cycle sequencing ready reaction kit" y el secuenciador ABI (Perkin Elmer).

La traducción conceptual del producto de PCR más grande (c.500 pb) y más intenso, derivado de la biblioteca de cDNA pequeños utilizando el cebador OF4 con T7, reveló una coincidencia significativa con BlastX (Altschul et al., 1997) con la secuencia C-terminal de la moubatina o inhibidor de la agregación plaquetaria de O. moubata (Waxman y Connolly, 1993). La secuencia se extiende más allá del codón de parada del cDNA que codifica el péptido. Se utilizó un cebador reverso (OR1 5' GGG AGG CTT TCT GTA TCC 3') que coincide con la región más allá del codón de parada con el cebador T3 (que se une al vector UniZAP XR) para obtener el extremo 5' del cDNA. El producto de PCR de 650 pb se clonó en el vector pGEM®-T Easy (Promega) y después se secuenció utilizando cebadores adicionales OR3 5' CGT CCA ATC GGT TGA AG 3' y OF6 5' GAC TCG CAA AGT CAT CAC 3'.

Análisis de secuencia

Los análisis se llevaron a cabo utilizando el grupo de programas del GCG (Paquete Wisconsin Versión 10.1, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin) y también el servidor de proteómica ExPASy (Expert Protein Analysis System) del Instituto Suizo de Bioinformática (http://expasy.hcuge.ch/). Las secuencias se compararon con la base de datos de proteínas no redundantes del GenBank (NR) utilizando el programa BlastX (Altschul et al., 1997) y se buscaron frente a los dominios de proteína Pfam (Bateman et al., 2000) y SMART (Schultz et al., 2000). Se realizó un alineamiento de secuencia múltiple con Clustal X (Jeanmougin et al., 1998).

Expresión y purificación de OmCI en levaduras

La región codificante de OmCI se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; 95ºC durante 30'', 50ºC durante 30'', 72ºC durante 30''; 18 ciclos), utilizando el cebador directo OM1Y (5'-ATAGAGCT
CAAAATGCTGGTTTTGGTGACC-3') y los cebadores reversos OR7a (5'ACTGAGCGGCCGCCTAGTGATGGT
GATGGTGATGACCGCAGTCCTTGAGATGGGG 3' para productos con colas de his) o OR6 (5' ACT GAGCGGCC
GCCTAGCAGTCCTTGAGATGGGG3' para productos sin colas). Los cebadores se construyeron en sitios de restricción, por lo que se añadió el sitio Sac I corriente arriba del codón de inicio y un sitio Not I corriente abajo del codón de parada. El producto se ligó entre los sitios Sac I y Not I del vector de transferencia pMETa C (Invitrogen). El plásmido - amplificado en células XL1-Blue (Stratagene) - se transformó en las cepas de Pichia methanolica pMAD16 y pMAD11, de acuerdo con las instrucciones del suministrador (Invitrogen). Los clones positivos se cultivaron en medio complejo tamponado con dextrosa BMDY, y la expresión de proteína se indujo en en medio complejo tamponado con metanol. Se analizó la expresión de proteína en el sobrenadante y en las células de 6 clones positivos cada 24 horas durante 5 días mediante ensayo lítico CH50.

Tras 96 horas de incubación, se centrifugó 500 ml de medio de células de levadura a 6370 g durante 15 min. y el inhibidor precipitó del sobrenadante mediante la adición de PEG-8000 al 30% (p/v) y se agitó en hielo durante 1 hora. Tras la centrifugación a 23700 g durante 1 hora, el botón de proteína se resuspendió en 50 ml de tampón fosfato sódico 25 mM pH 6,8, NaCl 50 mM antes de centrifugar a 6000 rpm para eliminar el material insoluble. La solución clarificada se aplicó a una columna de intercambio de cationes de 1 ml Q-Sepharose HP y la actividad inhibidora del complemento de las fracciones se determinó como se ha descrito antes. Las fracciones activas se juntaron y se intercambiaron con 300 \mul de PBS utilizando dispositivos de filtración Centricon 3 (Amicon), se centrifugó a 18900 g durante 10 minutos y después se aplicó a una columna Superdex^{TM} 75 (Pharmacia) a una tasa de flujo de 0,5 ml/min. utilizando Tris 20 mM pH 7,6, NaCl 200 mM como tampón de ensayo. Se monitorizaron fracciones de 0,5 ml a 280 nm y se recogieron durante 30 minutos. Se analizó 5 \mul de cada fracción para la actividad inhibidora y las fracciones activas se cambiaron a PBS antes de la visualización mediante SDS-PAGE desnaturalizante.

Se trató el rOmCI con el péptido N-glicosidasa F (PNGasaF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (New England Biolabs). Se repurificó el rOmCI desglicosilado mediante filtración en gel como se ha descrito antes. Se identificaron cinco fracciones inhibidoras mediante CH50 y se analizaron 15 \mul de cada en un SDS PAGE bajo condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes.

Estabilidad térmica y estabilidad al pH de OmCI nativa

Se determinó la cantidad mínima de OmCI nativo que inhibe la lisis celular mediada por la ruta clásica mediante c.90% a una dilución 1:40 de suero de conejillo de indias en 25 ng en un volumen de reacción total de 100 \mul. Para examinar la estabilidad térmica, se hirvió 1 \mul de OmCI nativo (250 ng) en 9 \mul de PBS. Las muestras se hirvieron durante 0, 3, 9 o 27 min., se enfriaron rápidamente en hielo, y se añadió 1 \mul (25 ng) a 100 \mul de ensayos CH50 (dilución 1:40 de suero de conejillo de indias). Para examinar la estabilidad al pH, se diluyó 1 \mul de OmCI nativo (250 ng) en 9 \mul de tampón acetato sódico 10 mM (pH 4,5 y 5,5), tampón Tris.Cl 10 mM (pH 7 y 8,2) o tampón CAPS 10 mM (pH 10 y 11). Tras la incubación durante 30 min. a 37ºC, se añadió 1 \mul (25 ng) a 100 \mul de ensayos CH50 (dilución 1:40 de suero de conejillo de indias). Los controles incluyen 1 \mul de cada uno de los tampones sólo en presencia y ausencia de la dilución 1:40 de suero. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Método para la detección de la unión de C5 a OmCI

0,5 \mug de OmCI nativo y 5 \mug de RaHBP2 se sometieron a SDS-PAGE no desnaturalizante, después se transfirieron a nitrocelulosa y se bloquearon durante la noche en PBS, Tween 20 al 0,05%, leche en polvo descremada al 5% (PBSTM). C3 y C5 s marcaron con I^{125} utilizando Iodogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce). Los blots se incubaron con 2 \mug de C3 marcado con I^{125} (1440 kcpm/min.), y 2 \mug de C5 marcado con I^{125} (2160 kcpm/min.) en 15 ml de PBSTM durante 4 horas a temperatura ambiente. Tras 3 lavados de 20 min. en PBSTM a temperatura ambiente las membranas de nitrocelulosa se secaron, y se autoradiografiaron.

Para la cromatografía de filtración en gel, se incubaron 0,07 \mug de OmCI marcado con I^{125} (1687 kcpm/min.) con 2 \mug de C3 o C5 puro, o 23,8 \mul de NHS o suero carente de C3 o C5. Se añadió PBS a un volumen total de 100 \mul y la mezcla se incubó durante 10 min. antes de la cromatografía a través de una columna Superose 12 10/30 a una tasa de flujo de 1 ml/min de PBS. Se recogieron de fracciones de 1 ml y se midió las cpm a una distancia fijada desde el contador Geiger de mano.

Resultados Purificación e identificación de las fracciones activas de SGE de O. moubata

Tras la cromatografía de intercambio de cationes, la fracción activa eluyó a NaCl 0,25 M (Fig. 2a y b, flecha). La fracción activa una fracción control (Fig. 3a) se sometieron a electroblot a partir de un gel IEF (Fig. 3b) en una membrana de PVDF que se tiñó con Ponceau-S. Se escindienron las bandas principales, se eluyeron, repurificaron mediante cromatografía de intercambio de cationes y se analizaron para la actividad inhibidora del complemento. El SDS PAGE desnaturalizante mostró que la actividad inhibidora está asociada con un triplete de proteínas con masas de alrededor de 19 kDa (Fig. 3a). El IEF mostró que la actividad inhibidora está asociada con una banda única dominante con un pI de aproximadamente 4,2 (Fig. 3b, banda superior proveniente de la fracción 17). HPLC de la fracción eluída de PVDF reveló cuatro picos adyacentes (Fig. 3c). Se utilizo la secuencia N-terminal de 17 aminoácidos (DSESDXSGSEPVDAFQA) obtenida del pico más grande (Fig. 3c, pico D) para diseñar cebadores degenerados que generan un producto de PCR de la biblioteca de cDNA de O. moubata que coincide con la secuencia N-terminal.

Estructura primaria del cDNA que codifica OmCI

La secuencia del clon de longitud completa muestra que OmCI tiene una longitud de 168 aminoácidos (Fig. 4). La proteína tiene una señal de secreción N-terminal que comprende los primeros 18 residuos. El análisis de la secuencia N-terminal indica que el punto de escisión del péptido señal está entre la Ala18 y el Asp19. El peso molecular esperado de la proteína madura es de 16,77 kDa y el punto isoeléctrico 4,3. Existen dos puntos de N-glucosilación esperados (Asn78 y Asn102) y doce puntos de potencial fosforilación (Ser 20, 22, 25, 84, 113, 115, 156, Thr 90, Tyr 17, 43, 111, 130, 162). Sin embargo, tales puntos tienen todos ellos una elevada probabilidad de aparición (dianas de la quinasa de proteínas C, quinasa de caseína II y quinasa de tirosinas) y la predicción de una diana no necesariamente indica una modificación genuina.

La secuencia primaria de OmCI muestra un 58% de identidad con las proteínas 2 y 3 de la glándula salival de la garrapata (TSGP 2 y 3) de la garrapata blanda Ornithodorus savignyi (Mans et al, 2001), y un 49% de identidad con la moubatina de Ornithodorus moubata (Waxmanand Connolly, 1993). Todos los residuos de cisteína y por lo tanto presumiblemente el patrón de puentes disulfuro, están conservados en estas cuatro proteínas (Fig. 5). El alineamiento muestra que OmCI posee dos cortas inserciones de aminoácidos obvias: SESD en el extremo aminoterminal y PD alrededor de dos tercios de la secuencia del péptido maduro (Fig. 5). La secuencia primaria no posee una identidad significativa con ninguna otra secuencia de las bases de datos públicas, lo que incluye la proteína anticomplemento de I. scapularis (Valenzuela et al., 2000). Se cree que la moubatina y TSGP2 y 3 son miembros de la familia de la lipocalina, unas proteínas que forman láminas beta, lo que incluye proteínas específicas de la familia de proteínas de unión a la histamina de la garrapata (Paesen et al., 2000).

Expresión y purificación del OmCI (r) recombinante

Los 6 clones de levadura positivos analizados mostraron niveles variables de expresión de OmCI (Fig. 6a y b). En todos los casos en los que se detectó expresión, la actividad inhibidora aumentó de forma continua hasta el momento de final del ensayo en el día 5. Aproximadamente el 90% de la proteína expresada se encontraba en el sobrenadante (Fig. 6b). El clon 13.1 resultó en el mayor nivel de expresión y se utilizó en los subsiguientes estudio de expresión. Tras la precipitación con PEG y dos pasos de cromatografía, el rOmCI activo parcialmente purificado está presente en formas altamente glucosiladas (Fig. 7a, fracciones 9, 10 y 11) y no glucosiladas (Fig 7a, fracciones 12 y 13). Se demostró que la forma glucosilada se correspondía con la forma no glucosilada mediante el tratamiento con PNGasa F (Fig. 7b). El rOmCi glucosilado y no glucosilado o desglucosilado, y el OmCI nativo son igualmente activos en los ensayos CH50 (datos no mostrados). El rendimiento final de rOmCi fue de aproximadamente 0,3 \mug/ml de medio.

Mecanismo de acción del OMCI

El OmCI inhibe ambas vías del complemento. Sin embargo, mientras la ruta clásica puede inhibirse completamente, incluso un exceso de OmCI inhibe la lisis de glóbulos rojos mediante la vía alternativa en un máximo del 80%
(Fig. 8).

El OmCI no evita la incorporación de C8 y C9 a C5b-7 o C5b-8 preformados, respectivamente (Fig. 9). Tampoco afecta la tasa de escisión de C3\alpha para dar lugar a C3a mediante las rutas clásica o alternativa (Fig. 10). El OmCI evita la producción de C5a a partir de C5 mediante ambas vías (Fig. 11). El C5 puro en exceso, pero no el C3, consigue superar al inhibidor OmCI en el ensayo hemolítico clásico (Fig. 12). El OmCI no evita la descomplementación del suero por CVF (datos no mostrados). Tampoco evita la producción de C5a por la convertasa de C3/C5 del CVF (CVFBb) (Fig. 11).

Termoestabilidad y estabilidad al pH del OmCI nativo

La ebullición del OmCI durante hasta 9 minutos no tuvo un efecto significativo en la actividad inhibidora de la proteína, aunque a los 27 minutos la actividad inhibidora disminuyó (Fig. 13). El OmCI nativo no se vio afectado por la exposición a tampones alcalinos de hasta pH 11 (Fig. 14). La exposición a un tampón de pH 4,5 redujo de forma marcada la actividad inhibidora del OmCI (Fig 14). Los geles con tinción de plata mostraron que no era debido simplemente a la precipitación de OmCI a este pH (datos no mostrados).

Detección de la unión de C5 a OmCI

El Western blot con C3 y C5 marcados con I^{125} indica que OmCI se une directamente a C5 pero no a la proteína relacionada C3 (Fig. 15).

Se obtuvo una evidencia adicional de la interacción directa entre OmCI y C5 mediante cromatografía de gel filtración. Se observó un aparente cambio de masa en una proporción del nOmCI marcado con I^{125} en presencia de C5 purificado pero no de C3 (Fig. 16a). Un cambio de masa similar fue evidente en presencia de NHS y suero carente de C3 pero no con suero carente de C5 (Fig. 16b). El cambio de masa se mantuvo en presencia de NaCl 1 M pero no con NaCl 2 M lo que indica una fuerte interacción electrostática entre el inhibidor y C5 (datos no mostrados).

Discusión Relación con otras proteínas y con inhibidores del complemento conocidos

El OmCI está relacionado de forma muy cercana con las proteínas 2 y 3 de glándula salival de la garrapata (TSGP2 y 3) de la garrapata blanda O. savignyi (Mans et al., 2001) y con el inhibidor de la agregación plaquetaria moubatina (Waxman y Connolly, 1993). No se ha demostrado, o sugerido que ninguna de estas tres proteínas (Fig. 5) inhiban el complemento. Las dos pequeñas inserciones de aminoácidos presentes en el OmCI pero no en las proteínas muy relacionadas (Fig. 5) son los puntos obvios donde enfocar futuros estudios de mutagénesis para definir los puntos de unión del complemento en el OmCI.

TSGP2 y 3 tienen una identidad de aminoácidos del 95% y se ha propuesto que poseen un papel en la biogénesis de gránulos de las glándulas salivales de la garrapata (Mans et al, 2001). TSGP2 es tóxica para los ratones; TSGP3 no lo es (Mans et al, 2002). Es altamente improbable que OmCI sea una toxina ya que O. moubata no es tóxica (Astigarraga et al., 1997) mientras O. savignyi causa toxicosis del tampán de la arena en una gran variedad de mamíferos (Mans et al, 2002). Además, la inoculación de conejillos de indias con 100 \mug de OmCI nativo purificado, durante el proceso de obtención de antisueros, no causó efectos patofisiológicos obvios (observación personal).

El OmCI probablemente es un miembro de la familia de proteínas de la lipocalina, lo que incluye las proteínas específicas de la familia de proteínas de unión a la histamina de la garrapata (Paesen et al., 2000). Las lipocalinas se unen predominantemente a ligandos pequeños, hidrofóbicos, extracelulares con sus estructuras en lámina beta. Sin embargo, la proteína de unión a la histamina de la garrapata Rhipicephalus appendiculatus muestra diferencias estructurales significativas respecto a las lipocalinas normales que le permiten unirse a moléculas hidrofílicas (Paesen et al., 1999; Paesen et al., 2000). Aún no se conoce si el OmCI se une a algún ligando pequeño.

La secuencia primaria del OmCI no posee una similitud detectable con los dominios de proteína de control del complemento (CCP) (repeticiones múltiples de 60 aminoácidos) que forman muchos de inhibidores del complemento propios del cuerpo, lo que incluye el factor H, C4BP,CR1, CR2, MCP y DAF). Tampoco es similar a ninguno de los inhibidores del complemento conocidos de las bases de datos públicas, lo que incluye el Isac, la proteína salivar inhibidora de la ruta alternativa del complemento de Ixodes scapularis (Valenzuela et al., 2000). Tampoco está relacionada con la secuencia N-terminal del antígeno 20A1 de O. moubata (Baranda et al., 2000) que se ha propuesto como el factor responsable de la potente inhibición del complemento que se había observado previamente en el SGE de O. moubata y O. erraticus (Astigarraga et al., 1997).

Mecanismo de inhibición del complemento

El rOmCI glucosilado y desglucosilado expresado en levaduras es tan potente como la proteína nativa purificada del SGE. El OmCI con una cola de histidina C-terminal expresado en células de insecto no es tan potente (datos no mostrados). El OmCI inhibe tanto la ruta clásica como la alternativa de activación del complemento tanto en humanos como en conejillos de indias, y presumiblemente también en otros mamíferos. Esta propiedad debería resultar útil en la definición precisa del funcionamiento del OmCI, y será de valor incalculable para el desarrollo de modelos animales de las enfermedades mediadas por el complemento, en los que la especificidad de especie de los actuales inhibidores de C5 han limitados los estudios in vivo a la utilización de roedores (Link et al., 1999).

El OmCI no inhibe la convertasa clásica (C4bC2a) o la convertasa de C3 alternativa (C3bBb) ya que no tiene ningún efecto sobre la tasa de escisión de C3\alpha (Fig. 10). El OmCI evita la producción de C5a a partir de C5 (Fig. 11). Como un exceso de C5 supera al inhibidor OmCI (Fig. 12) deben formarse convertasas funcionales de C5 clásicas (C4bC2aC3b) y alternativas (C3b^{2}Bb) en presencia del inhibidor de garrapata. Es improbable que el OmCI sea un inhibidor directo de la serinproteasa de los componentes catalíticos de la convertasa C2a y Bb o evitaría la producción de C3a al igual que la de C5a. El inhibidor no evita la producción de C5a mediante la convertasa de C3/C5 del CVF (CVFBb) (Fig. 11) lo que sugiere que el OmCI no se une a C5 y bloquea el sitio de escisión de C5a. Este último hallazgo no excluye la posibilidad de que el OmCI se una a un punto en C5 que evite su unión a las convertasas de suero normales de C5 pero no a la convertasa del CVF (Sandoval et al., 2000).

Dos líneas de evidencia independientes sugieren que la actividad del OmCI está mediada a través de la unión directa a C5 (Fig. 15 y Fig. 16).

Aunque OmCI inhibe ambas las vías del complemento, incluso con un exceso de inhibidor la ruta alternativa se inhibe en un máximo del 80% (Fig. 8). Esto puede explicarse en términos de las diferentes convertasas de C5 utilizadas en la ruta clásica (C4bC2aC3b) y alternativa (C3b^{2}Bb), pero el mecanismo permanece sin explorar.

En resumen, el OmCI probablemente se une a C5 y evita su interacción con las convertasas de C5, o bien se une a las convertasas de C5 y a C5, y evita la escisión de C5. Actualmente no existe una evidencia indiscutible que apoye una posibilidad frente a la otra.

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Estabilidad térmica y estabilidad al pH del OmCI nativo

El OmCI es termoestable pero la actividad empieza a perderse tras someterse a ebullición durante 27 minutos. El OmCI parece ser sensible a los ácidos e insensible a los álcalis. Tanto la ebullición prolongada como la exposición a los ácidos probablemente inducen cambios conformacionales que inactivan la proteína.

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Claims (30)

1. Un polipéptido inhibidor del complemento derivado de la saliva de garrapata que inhibe la ruta clásica del complemento y la ruta alternativa del complemento mediante la inhibición de la escisión de C5 por la convertasa de C5 clásica y alternativa.

2. Un inhibidor del complemento de acuerdo con la reivindicación 1 que inhibe la escisión de C5 mediante la unión a C5.

3. Un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con la reivindicación 2 que forma complejos con C5.

4. Un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha garrapata es Ornithodoros moubata.

5. Un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende los aminoácidos de 19 a 168 de la secuencia de aminoácidos en la Figura 4.

6. Un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende los aminoácidos de 1 a 168 de la secuencia de aminoácidos en la Figura 4.

7. Un polipéptido inhibidor del complemento que inhibe la ruta clásica del complemento y la ruta alternativa del complemento, y dicho inhibidor del complemento es: a) una proteína que comprende los aminoácidos de 19 a 168 o los aminoácidos de 1 a 168 de la secuencia de aminoácidos de la Figura 4; b) un homólogo de una proteína como la que se define en a) con al menos un 60% de identidad con ésta; o c) un fragmento activo de una proteína como la que se define en a) anteriormente o de un homólogo como se define en b) anteriormente.

8. Un polipéptido inhibidor del complemento que inhibe la escisión de C5 por una convertasa de C5, en el que dicho inhibidor del complemento es: a) una proteína que comprende los aminoácidos de 19 a 168 o los aminoácidos de 1 a 168 de la secuencia de aminoácidos de la Figura 4; b) un homólogo de una proteína como se define en a) con al menos un 60% de identidad a ésta; o c) un fragmento activo de una proteína como la que se define en a) anteriormente o de un homólogo como se define en b) anteriormente.

9. Un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con la reivindicación 8 que inhibe la escisión de C5 mediante la unión directa a C5.

10. Un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con la reivindicación 9 que forma complejos con
C5.

11. Un anticuerpo que se une a un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10.

12. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11 que está fusionado genéticamente o químicamente a uno o más péptidos o polipép-
tidos.

13. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 12 en la que dicho polipéptido inhibidor del complemento está fusionado genéticamente o químicamente a un dominio marcador.

14. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 13 en la que dicho dominio marcador es una cola radioquímica.

15. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11 o una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 14.

16. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15 que comprende los nucleótidos de 53 a 507 de la secuencia de nucleótidos de la Figura 4.

17. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15 que comprende los nucleótidos de 1 a 507 de la secuencia de nucleótidos de la Figura 4.

18. Una molécula de ácido nucleico antisentido que hibrida bajo condiciones de hibridación de elevada astringencia con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 15 a 17.

19. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 15 a 18.

20. Una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 15 a 17, una molécula de ácido nucleico antisentido de acuerdo con la reivindicación 18 o un vector de acuerdo con la reivindicación 19.

21. Un método para la obtención de un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10 o una proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones de 12 a 14 que comprende el cultivo de una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 20 bajo condiciones en las que dicha proteína se expresa y la recuperación de la proteína así producida.

22. Un método de identificación de un ligando de un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10 que comprende el paso de: (a) poner en contacto el polipéptido inhibidor del complemento con un ligando candidato; y (b) detectar la formación de un complejo ligando-polipéptido inhibidor del complemento.

23. Una composición que comprende un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 14, o un ácido nucleico polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 15 a 17 en conjunto con un transportador farmacéuticamente aceptable.

24. Una composición de acuerdo con la reivindicación 23 que además comprende un adyuvante.

25. Un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 14, o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 15 a 17 para su uso en terapia.

26. La utilización de un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 14 o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 15 a 17 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno mediados por el complemento, en el que dicha enfermedad o trastorno son enfermedad de Alzheimer, artritis reumatoide, glomerulonefritis, daño por reperfusión, rechazo de un transplante, sepsis, trastornos de complejo inmune o hipersensibilidad de tipo retardado.

27. La utilización de un polipéptido inhibidor del complemento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 14 o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 15 a 17 en la elaboración de una vacuna para la protección de un animal frente a una enfermedad o trastorno que se transmite por una garrapata.

28. La utilización de acuerdo con la reivindicación 27, en la que la garrapata es O. moubata.

29. La utilización de acuerdo con la reivindicación 28 en la que la enfermedad o trastorno es la fiebre recurrente, fiebre porcina africana o fiebre del Nilo occidental.

30. Un método in vitro para la inhibición de las rutas clásica y alternativa del complemento en una célula o tejido que comprende la administración a dicha célula o tejido de un inhibidor del complemento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación de 12 a 14, o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 15 a 17.