ES2323571T3

ES2323571T3 - Proceso para aislar selectivamente an ticuerpos igy de yema de huevo de un ave anseriforme.

Info

Publication number: ES2323571T3
Application number: ES02254064T
Authority: ES
Inventors: Y-Neng Chiou
Original assignee: Good Biotech Corp
Current assignee: Good Biotech Corp
Priority date: 2002-06-11
Filing date: 2002-06-11
Publication date: 2009-07-21
Anticipated expiration: 2022-06-11
Also published as: EP1371665B1; EP1371665A1; ATE427964T1; DK1371665T3; DE60231861D1

Abstract

Un proceso para aislar selectivamente anticuerpos IgY de yema de huevo de un ave anseriforme, comprendiendo dicho proceso: (a) absorber anticuerpos de yema en una fracción miscible en agua obtenida a partir de la yema de huevo de un ave anseriforme con un constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria seleccionado de silicato, compuestos de silicio, carbono, fibra de celulosa y sintética, y en el que el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria está en una cantidad eficaz para separar los anticuerpos de yema de la fracción miscible en agua; y (b) hacer fluir el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria con un tampón para obtener una fracción acuosa que contiene los anticuerpos de yema.

Description

Proceso para aislar selectivamente anticuerpos IgY de yema de huevo de un ave anseriforme.

Proceso para aislar selectivamente anticuerpos IgY de yema de huevo de un ave anseriforme y anticuerpos IgY obtenidos de este modo.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para el aislamiento y la purificación rápida de anticuerpos de yema, en particular anticuerpo IgY, a partir de la yema de un ave anseriforme, y los anticuerpos de yema obtenidos de este modo. Más particularmente, la presente invención se refiere a un proceso para el aislamiento y la purificación de anticuerpos de yema a partir de la yema de un ave anseriforme mediante un procedimiento cromatográfico de adsorción, usando un absorbente no cargado insoluble en agua para conseguir una separación deseada de anticuerpos de yema, y mediante un procedimiento de precipitación salina, que precipita de forma diferencial los anticuerpos IgY.

2. Descripción de la técnica relacionada

Se usan muchos anticuerpos en muchas investigaciones biológicas y aplicaciones clínicas. Los sueros obtenidos de mamíferos hiperinmunizados son la fuente más común de anticuerpos policlonales. Los anticuerpos procedentes de dichos sueros inmunes pertenecen a un grupo de proteínas denominadas "inmunoglobulinas", de entre las que la inmunoglobulina G (IgG) es la más abundante. La molécula de IgG consiste en tres dominios, en concreto dos regiones Fab y una región Fc. La porción Fab está principalmente implicada en la unión a antígeno. La porción Fc, aunque no tiene capacidad de unirse a un antígeno, dirige varias actividades de un anticuerpo, tales como la fijación del complemento y la unión a receptor de Fc.

Los patos y sus parientes filogenéticamente cercanos y algunos reptiles, tales como tortugas, tienen tres clases de inmunoglobulinas séricas: una inmunoglobulina macromolecular IgM (de 800 kDa en el pato), y dos isoformas de IgG de bajo peso molecular con coeficientes de sedimentación de 7,8 S (en el pato, 180 kDa) y 5,7 S (en el pato, 1390 kDa), respectivamente. (E. R. Unanue et al., J. Exp. Med. 121: 697-7124, 1965; H. M. Grey, J. Immunol 98: 811-819, 1967); y B. Zimmerman et al., Biochemistry 10: 482-448, 1971). La IgG aviar se denomina muchas veces IgY debido a su existencia en la yema de huevo aparte de en sueros. La IgY 5,7 S, constituida por cadenas pesadas más cortas, es estructuralmente y antigénicamente similar al fragmento F(ab')_{2} de la IgY 7,8 S (Figura 1), y este hecho conduce a la nomenclatura de IgY (equivalente a IgY 7,8 S) e IgY(\DeltaFc) (equivalente a IgY 5,7 S) para representar ambas isoformas de IgY (K. E. Magor et al., J. Immunol. 149: 2627-2633, 1992).

Los estudios realizados en las aves infectadas o inmunizadas experimentalmente mostraban que los anticuerpos de pato carecen de varias funciones biológicas efectoras, incluyendo la fijación del complemento y la unión a receptores de Fc, sin sacrificar su actividad de unión a los antígenos correspondientes (G. W. Litman et al., Immunochemistry 10: 323, 1973; y T. E. Toth et al., Avian Dis. 25: 17-28, 1981). Razonablemente, esto puede ser el resultado de la ausencia aparente de la región equivalente a Fc del anticuerpo IgY(\DeltaFc), que constituye el componente cuantitativamente más importante de la respuesta de anticuerpos de aves anseriformes. Por lo tanto, se piensa que el anticuerpo IgY(\DeltaFc), que parece ser un análogo estructural y funcional del fragmento F(ab')_{2}, proporcionaría ventajas magníficas en usos inmunológicos si pudiera encontrarse un proceso prometedor para fabricar el anticuerpo y pudieran identificarse las necesidades físicas apropiadas para su actividad.

Se ha descrito que los anticuerpos de yema de ave presentan propiedades útiles tanto para aplicaciones de investigación como clínicas, al igual que los anticuerpos de mamífero (véanse, por ejemplo, los documentos U.S. 5.340.293; U.S. 5.585.098; U.S. 5.601.823; y U.S. 5.976.519). Las yemas de huevo obtenidas de una gallina ponedora son económicas y más convenientes y seguras de manipular en comparación con los sueros de mamíferos hiperinmunizados. Lo que es más importante, los anticuerpos de yema son capaces de hacer frente al examen detallado bajo las normas de protección animal modernas (A. Poison et al., Immunol. Commun. 9: 475, 1980; y B. Gottstein et al.). Estos hechos sugieren un uso potencial de la yema de huevo como una fuente comercial de anticuerpos.

Sin embargo, los altos contenidos de sustancias lipídicas, tales como ácidos grasos, colesterol y lecitina, en la yema de huevo hacen del aislamiento de anticuerpos de yema una tarea incómoda y laboriosa. Se han realizado muchos esfuerzos a este respecto. Por ejemplo, se usaron agentes de precipitación solubles en agua incluyendo agar, pectina (Patente Japonesa Kokai Nº 64-38098 publicada el 8 de febrero de 1989), sulfato de dextrano (J. C. Jensenius et al., J. Immunol. Methods 46: 63, 1981), gomas naturales (H. Hatta et al., J. Food Science 53: 425, 1988) y polietilenglicol (PEG) (A. Poison et al., Immunol. Invest. 14: 323, 1985; véase también el documento U.S. 4.550.019 expedido a A. Poison) para precipitar biomoléculas no acuosas, principalmente lípidos y gránulos de yema, para recoger de este modo una fase soluble en agua que contiene abundantes anticuerpos de yema de la población total. A. Hassl et al. desarrollaron un proceso cromatográfico de dos etapas, compuesto por cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de exclusión por tamaños para el aislamiento adicional de anticuerpos de yema de la población total a partir de una fracción purificada con PEG (A. Hassl y H Aspock, J. Immunol, Methods 110: 225, 1988). Akita et al. describieron un método mejorado para aislar IgY, en el que se extrajeron anticuerpos de yema a partir de huevos de pollos por dilución de las yemas de huevo con un gran volumen de agua y sometiendo el sobrenadante resultante a cromatografía de exclusión por tamaños y/o cromatografía de intercambio iónico (E. M. akita et al., J. Immunol. Methods. 160: 207, 1993; y E. M. Akita y S. Nakai, J. Food Sci. 57: 629, 1993).

Sin embargo, todos estos estudios y patentes se centran en el aislamiento de la población total de anticuerpos de yema (que al menos incluye IgY con región Fc presente o ausente) de huevos de ave, en lugar de sobre la purificación de anticuerpos IgY(\DeltaFc) e IgY selectivamente. Además, puesto que los anticuerpos IgY(\DeltaFc) están presentes solamente en aves que pertenecen al Orden Anseriformes, incluyendo pato y ganso, y puesto que se ha descrito que el contenido lipídico en la yema de huevo de las aves anseriformes es superior que el de las aves galliformes, tales como pollo y pavo, los métodos convencionales descritos anteriormente no proporcionan ninguna sugerencia de una purificación con éxito de anticuerpo IgY(\DeltaFc). El anticuerpo IgY(\DeltaFc) se purificó solamente por co-precipitación con IgY de suero de pato (D. A. Higgins et al., Veterinary Immunology and Immunopathology 41: 169-180, 1995) con procedimientos complejos y costosos, pero aun así no se aisló selectivamente el anticuerpo IgY(\DeltaFc) a partir de yema de huevo.

Por lo tanto, existe la necesidad de un proceso rápido, rentable y de alto rendimiento que proporcione un aislamiento fácil del anticuerpo IgY deseado de la combinación de anticuerpos de huevos de aves anseriformes, al tiempo que se mantiene la actividad del anticuerpo IgY. El anticuerpo IgY(\DeltaFc) sustancialmente purificado puede actuar como un nuevo tipo de anticuerpo F(ab')_{2} para diversos usos de inmunodiagnóstico e inmunoterapéuticos.

Sumario de la invención

Se ha llevado a cabo una investigación amplia para satisfacer las necesidades industriales de anticuerpos de yema como se ha indicado anteriormente. Se descubre inesperadamente que puede conseguirse fácilmente el aislamiento con éxito de anticuerpos de yemas de huevos de un ave anseriforme mediante un procedimiento cromatográfico de adsorción, usando un absorbente no cargado insoluble en agua, y mediante un procedimiento sencillo de precipitación salina que diferencia diferentes isoformas de los anticuerpos de yema. De acuerdo con el proceso de la presente invención, los anticuerpos de yema altamente purificados, en particular la IgY(\DeltaFc) altamente purificada, puede obtenerse fácilmente con alto rendimiento de una forma económica y están listos para una amplia diversidad de usos inmunológicos. El término "absorbente", como se usa en este documento, se refiere al constituyente activo en la fase estacionaria usada en una cromatografía de adsorción.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para aislar selectivamente anticuerpos IgY a partir de la yema de huevo de un ave anseriforme, comprendiendo dicho proceso:

(a): absorber anticuerpos de yema en una fracción miscible en agua obtenida a partir de la yema de huevo de un ave anseriforme con un constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria seleccionado de silicato, compuestos de silicio, carbono, fibra de celulosa y sintética, y en el que el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria está en una cantidad eficaz para separar los anticuerpos de yema de la fracción miscible en agua; y

(b): hacer fluir el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria con un tampón para obtener una fracción acuosa que contiene los anticuerpos de yema.

\vskip1.000000\baselineskip

Otro aspecto más de la invención es proporcionar un proceso para aislar selectivamente anticuerpos IgY de la yema de huevo de un ave anseriforme, comprendiendo dicho proceso:

(a): absorber anticuerpos de yema en una fracción miscible en agua obtenidos a partir de la yema de huevo de un ave anseriforme con un constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria seleccionado de silicato, compuestos de silicio, carbono, fibra de celulosa y sintética, y en el que el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria está en una cantidad eficaz para separar los anticuerpos de yema de la fracción miscible en agua;

(b): hacer fluir el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria con un tampón para obtener una fracción acuosa que contiene los anticuerpos de yema;

(c): realizar una precipitación salina de la fracción acuosa que contiene los anticuerpos de yema de la etapa (b) con (NH_{4})_{2}SO_{4} de una primera concentración que varía de aproximadamente el 15% (p/v) a aproximadamente el 24% (p/v), en base al volumen de la fracción acuosa; y

(d): realizar una precipitación salina de la fracción acuosa que contiene anticuerpos de yema tratada en la etapa (c) con (NH_{4})_{2}SO_{4} de una segunda concentración que varía de aproximadamente el 25% (p/v) a aproximadamente el 40% (p/v), en base al volumen de la fracción acuosa tratada en la etapa (c).

\vskip1.000000\baselineskip

Preferiblemente, la primera concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} no es superior a aproximadamente el 21% (p/v) en base al volumen de la fracción acuosa. Preferiblemente, la segunda concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} no es superior a aproximadamente el 31% (p/v) en base al volumen de la fracción acuosa tratada en la primera precipitación salina.

De acuerdo con el proceso de esta invención, puede obtenerse una abundante cantidad de una isoforma seleccionada de anticuerpos de yema, en particular anticuerpo IgY(\DeltaFc), disponible para diversas aplicaciones industriales, de una forma económica, eficaz y que ahorre tiempo.

Otro objeto más es proporcionar los usos clínicos y de investigación del anticuerpo IgY producido de este modo. Además de la rentabilidad y facilidad de preparación, el anticuerpo IgY(\DeltaFc) de acuerdo con la presente invención tiene las ventajas de ser inactivo para el sistema del complemento y factores reumatoides en sueros de mamíferos, y de tener una escasa reactividad cruzada con IgG de mamífero, y por lo tanto es particularmente útil para el uso en ensayos inmunológicos que implican sueros de mamíferos con una interferencia mínima. Debería apreciarse por los especialistas en la técnica que el anticuerpo IgY puede presentarse en forma de un solo reactivo para aplicaciones clínicas, de investigación y otras, o puede incluirse en un kit comercial como componente
activo.

Breve descripción de los dibujos

Los anteriores y otros objetos y características de la presente invención se harán evidentes con referencia a la siguiente descripción de las realizaciones preferidas tomadas junto con los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 ilustra un análisis de SDS-PAGE que compara las capacidades de captura de anticuerpos de cuatro absorbentes: carril 1, el extracto de anticuerpo parcialmente purificado; carril 2, la solución que fluye a través de sílice pirógena al 0,3%; carril 3, la solución que fluye a través de dióxido de sílice al 3%; carril 4, la solución que fluye a través de Celite diatomite al 3%; carril 5, la solución que fluye a través de Celite diatomite hyflo-Cel al 3%; y carril 6, la solución que fluye a través de Celite diatomite hyflo-Cel al 5%;

la Figura 2 ilustra los resultados de electroforesis de los anticuerpos de yema purificados usando sílice pirógena como la realización absorbente en un gel de SDS-poliacrilamida al 8%: carril 1, el extracto de anticuerpo parcialmente purificado; carril 2, la solución que fluye a través de sílice pirógena al 2%; carril 3, el eluido a partir del sedimento de sílice pirógena; carril 4, el producto de anticuerpo precipitado con sulfato de amonio al 21% (p/v) en la primera etapa de precipitación; y carril 5, el producto de anticuerpo precipitado con sulfato de amonio al 31% (p/v) en la segunda etapa de precipitación;

La Figura 3 ilustra los resultados de electroforesis de los anticuerpos de yema purificados usando Celite diatomite como la realización absorbente en un gel de SDS-poliacrilamida al 8%: carril 1, el extracto de anticuerpo parcialmente purificado; carril 2, filtrado de Celite diatomite; carril 3, el producto de anticuerpo precipitado con sulfato de amonio al 21% (p/v) en la primera etapa de precipitación; carril 4, el producto de anticuerpo precipitado con sulfato de amonio al 31% (p/v) en la segunda etapa de precipitación; y carril 5, el producto de anticuerpo precipitado con sulfato de sodio al 16% (p/v) en la segunda etapa de precipitación; y

la Figura 4 ilustra los resultados de electroforesis de los anticuerpos de yema purificados usando sílice pirógena como la realización absorbente en un gel de SDS-poliacrilamida al 8%: M, marcador de pesos moleculares; carril 1, el extracto de anticuerpo parcialmente purificado; carril 2, la solución que fluye a través de sílice pirógena al 0,3%; carril 3, el eluido a partir del sedimento de sílice pirógena; carril 4, el producto de anticuerpo precipitado con sulfato de amonio al 21% (p/v); y carril 5, el producto de anticuerpo purificado por cromatografía de afinidad.

Descripción detallada de la invención

Los anticuerpos de yema son abundantes en el suero de aves y los huevos puestos por el ave. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, habitualmente se prefiere la recogida del anticuerpo a partir del huevo debido al coste. La gallina ponedora transfiere tanto las isoformas IgY como IgY(\DeltaFc) del suero a la yema de huevo. En principio, cada huevo de pato contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 mg de IgY/ml y de aproximadamente 3 a aproximadamente 12 mg de IgY(\DeltaFc)/ml en la yema y, por lo tanto, se estima que la cantidad total de los anticuerpos contenidos en un solo huevo es de 15 a 80 mg de IgY y de 45 a 240 mg de IgY(\DeltaFc). El gran volumen de yema de huevo producida supera enormemente el volumen del suero que puede obtenerse con seguridad de las aves durante cualquier periodo de tiempo dado. Además, la extracción de anticuerpos de yema puede realizarse a gran escala sin una inversión costosa. Preferiblemente, los anticuerpos de la presente invención se obtienen a partir de huevos de un ave anseriforme inmunizada con un antígeno específico.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un proceso para aislar eficazmente anticuerpos de yema de huevo, en el que las denominadas "cromatografía de adsorción" o "precipitación salina diferencial", que pueden usarse en solitario o en combinación entre sí, actúan como etapas críticas en el aislamiento.

Como se usa en este documento, la expresión "cromatografía de adsorción" se refiere a un tipo de método de separación que implica el uso de una fase estacionaria para recoger y concentrar selectivamente los solutos deseados a partir de una fase móvil. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, un absorbente no cargado insoluble en agua actúa como el constituyente activo en la fase estacionaria para separar los anticuerpos de yema por adsorción de los anticuerpos de yema en el absorbente no cargado insoluble en agua acompañada de captura de impurezas lipídicas miscibles en agua normalmente presentes en la yema de huevo.

En una realización preferida de la presente invención, la yema se separa primero a partir de la clara del huevo, y después se lava con agua destilada para eliminar todo el albumen que sea posible. Se perfora la membrana vitelina que encapsula la yema y la fracción de yema separada se diluye después con una cantidad eficaz de un tampón acuoso o agua para formar una suspensión de la yema de huevo. Preferiblemente, la yema de huevo recogida se diluye con una solución tampón acuosa o agua destilada que varía de aproximadamente 2 partes a aproximadamente 40 partes en volumen, más preferiblemente de aproximadamente 5 partes a aproximadamente 30 partes en volumen, por 1 parte de la yema de huevo. Se describe que el valor de pH es un factor crítico durante la fase de purificación parcial (E. M. Akita y S. Nakai, J. Food Sci. 57: 629, 1993). Para la mejor recuperación de anticuerpos de yema, el pH se ajusta preferiblemente en un intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 7. Idealmente, la temperatura en esta etapa está en un intervalo de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 60ºC. La suspensión de la yema de huevo se agita suavemente para formar una mezcla homogénea y después se deja reposar durante un periodo de tiempo suficiente para formar las fases acuosas y no acuosas. Los materiales insolubles en agua, incluyendo biomoléculas no acuosas tales como lipoproteínas, fosfolípidos, esteroles y similares, se eliminan después de la suspensión de yema acuosa por centrifugación. Después, el sobrenadante que contiene anticuerpo resultante puede separarse del precipitado viscoso por decantación, succión u otros métodos similares conocidos en la técnica.

En general, el contenido lipídico de la fracción miscible en agua obtenida de este modo todavía es tan alto que es desfavorable para la manipulación posterior. De acuerdo con la presente invención, una fase estacionaria que contiene un absorbente no cargado insoluble en agua se incuba con la fracción miscible en agua en una cantidad suficiente para absorber los anticuerpos de yema y para absorber la mayoría de las sustancias lipídicas miscibles en agua que quedan en la fracción miscible en agua. Los absorbentes adecuados incluye, pero sin limitación, silicato, compuesto de silicio, carbonato, sulfato, fosfato, carbono, fibra de celulosa y sintética, cerámicos y óxido metálico, y en el que el silicato incluye arcillas sintéticas o naturales, caolín, talco y silicato de calcio; el compuesto de silicio incluye sílice pirógena, sílice amorfa, dióxido de sílice, gel de sílice, silicatos, tierra de diatomeas y tierra de Fuller; el carbonato incluye carbonato de calcio y carbonato de bario; el sulfato incluye sulfato de calcio; el fosfato incluye fosfato de calcio; el carbono incluye carbono activado y fibra de carbono, la fibra de celulosa y sintética incluye polvo de celulosa; los cerámicos incluyen cerámicos porosos; y el óxido metálico incluye óxido de aluminio y óxido de titanio. Son absorbentes particularmente preferidos sílice pirógena, dióxido de sílice y tierra de diatomeas. La relación de funcionamiento del absorbente con respecto a la fracción miscible en agua puede variar a lo largo de un amplio intervalo dependiendo de las propiedades del absorbente seleccionado. Cuando se usa sílice pirógena en este proceso, se añade preferiblemente a una concentración igual a o superior a aproximadamente el 0,1% en peso, y más preferiblemente que varía entre aproximadamente el 0,3 y aproximadamente el 5,0% en peso, en base al volumen de la fracción miscible en agua a tratar. Cuando el absorbente es dióxido de sílice o tierra de diatomeas, la cromatografía de adsorción de acuerdo con esta invención se lleva a cabo preferiblemente a más de aproximadamente el 1% en peso y, más preferiblemente, en un intervalo de aproximadamente el 3 a aproximadamente el 20% en peso, del absorbente basado en el volumen de la fracción miscible en agua que se va a tratar.

La cromatografía de adsorción de acuerdo con esta invención puede efectuarse por cualquier medio convencional, tal como tratamiento en lote de la fracción miscible en agua con un absorbente o haciendo fluir la fracción miscible en agua sobre una columna de cromatografía empaquetada con el absorbente, siempre que la cantidad de los anticuerpos de yema retenidos en las superficies del absorbente sea satisfactoria. El tiempo de reacción y la temperatura durante el tratamiento no son críticos para los resultados y habitualmente son factibles una temperatura de reacción de aproximadamente 4 a aproximadamente 30ºC y un tiempo de reacción de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 minutos. Aunque si es necesario el procedimiento de adsorción puede repetirse varias veces, cada una con absorbente recién preparado, normalmente es suficiente una sola operación. Por medio de este procedimiento, los lípidos y la mayoría de las sustancias no lipídicas pueden separarse con éxito en dos fases inmiscibles, mientras que también pueden absorberse anticuerpos de yema.

Dependiendo de la capacidad del absorbente seleccionado para capturar inmunoglobulinas, los anticuerpos de yema pueden recuperarse a partir de un eluido obtenido por elución de la fase estacionaria o la "solución de flujo continuo" que, como se usa en este documento, pretende representar la solución que pasa a través de la fase estacionaria. Como se muestra en las realizaciones preferidas proporcionadas en el texto, los anticuerpos de yema están principalmente presentes en la fase estacionaria cuando se usa sílice pirógena o dióxido de sílice como el absorbente, mientras que la tierra de diatomeas deja más de aproximadamente el 60% de los anticuerpos en la solución de flujo continuo.

La elección de un método particular para obtener anticuerpos de yema puede determinarse por el especialista. Típicamente, los anticuerpos de yema se obtienen en una fracción acuosa haciendo fluir el absorbente no cargado insoluble en agua con un tampón, y en la que el tampón está a un pH de menos de aproximadamente 4 o superior a aproximadamente 8 o que contiene un agente caótropo, que puede utilizarse en la presente invención para obtener los anticuerpos de yema a partir de la fase estacionaria sin disociar sustancialmente las sustancias lipídicas de la fase estacionaria, de modo que se forma un eluido que contiene anticuerpo. Como se usa en este documento, el término "eluido" se refiere a una solución que contiene las sustancias deseadas no unidas por el eluyente de la fase estacionaria. La expresión "agente caótropo" o "caótropo" se refiere a un producto químico capaz de inducir un cambio conformacional en una molécula proteica, tal como una molécula de anticuerpo, que por lo tanto se conoce con frecuencia como proteína desnaturalizante. De acuerdo con la invención, la mayoría de los anticuerpos unidos pueden eluirse con éxito con cualquier tampón neutro que contenga una concentración moderada (>1 M) de un agente caótropo. En la mayoría de los casos, la eliminación del caótropo después de la elución restituirá la estructura de la proteína nativa.

El tampón útil incluye, pero sin limitación, glicina-HCl, 0,1 M, pH 2,3; glicina-HCl 0,1 M, pH 10,0; guanidina-HCl de 3 M a 6 M, pH 3,0; cloruro de potasio 3,0 M; yoduro de potasio 5 M; cloruro de magnesio 3,5 M; tiocinato de amonio/sodio/potasio 1-3 M y urea 6 M. Con respecto a la actividad de los anticuerpos recuperados, sin embargo, un tampón de fuerza iónica moderada que contiene un caótropo y de pH neutro, tal como tiocinato de sodio 3 M tamponado en tampón MES 20 mM (pH 5,8) o Tris(hidroximetil)-aminometano 20 mM (pH 7,5), es más adecuado para practicar la invención. El estado activo de los anticuerpos recogidos puede restaurarse fácilmente, por ejemplo, por diálisis exhaustiva contra un tampón de baja fuerza iónica, que no contiene caótropos y débilmente
ácido.

De acuerdo con un aspecto de la invención, la fracción acuosa que incluye el eluido o la solución de flujo continuo, que está enriquecida con anticuerpos, puede someterse posteriormente a un procedimiento de precipitación salina diferencial para separar isoformas de anticuerpos de yema.

La expresión "precipitación salina", como se usa en este documento, asume su significado común en la técnica de la química de proteínas y se refiere a la adición de una sal o sales no desnaturalizantes a una mezcla o lote de producción para disminuir la solubilidad de proteínas, que conduce la precipitación o coagulación de las proteínas. Mediante la expresión "precipitación salina diferencial" se entiende un proceso de precipitación salina que precipita o coagula de forma diferencial dos o más proteínas de una mezcla variando la concentración de la sal o sales añadidas. En la presente invención, las proteínas que se pretende precipitar de forma diferencial son las isoformas de anticuerpos de yema, es decir, IgY e IgY(\DeltaFc). Los ejemplos de las sales no desnaturalizantes útiles para la precipitación de los anticuerpos de yema, incluyen, pero sin limitación, NaCl, Na_{2}SO_{4}, (NH_{4})_{2}SO_{4}, KCl, CaCl_{2} y MgSO_{4}. Preferiblemente, la sal no desnaturalizante es Na_{2}SO_{4} o (NH_{4})_{2}SO_{4} y la más preferida es (NH_{4})_{2}SO_{4}. La concentración salina para precipitar de forma diferencial isoformas de anticuerpos de yema depende del tipo de la sal y puede determinarse por un especialista mediante ensayos sencillos. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, en la que se emplea (NH_{4})_{2}SO_{4}, la IgY se precipita primero por precipitación salina a una concentración que varía de aproximadamente el 15% (p/v) a aproximadamente el 24% (p/v), y en la que preferiblemente es igual a o inferior a aproximadamente el 21% (p/v) de la sal en base al volumen tratado de la fracción acuosa, mientras que la IgY(\DeltaFc) se precipita cuando la concentración de la sal varía de aproximadamente el 25% (p/v) a aproximadamente el 40% (p/v), y en la que preferiblemente es de aproximadamente el 31% (p/v) en base al volumen tratado de la fracción acuosa. Debería apreciarse que la secuencia de precipitación de las dos isoformas de anticuerpos también podría ser variable dependiendo de la sal seleccionada. El uso combinado de dos o más sales en este procedimiento, por ejemplo, precipitando primero una primera isoforma con una sal seguida de precipitación de una segunda isoforma con otra sal, también es factible. El procedimiento de precipitación salina diferencial de acuerdo con la presente invención logra notablemente un objeto principal de la presente invención, es decir, la separación selectiva esencial de la IgY deseada que comprende anticuerpos IgY e IgY(\DeltaFc) de la población total de anticuerpos de yema, constituida tanto por IgY como por IgY(\DeltaFc).

Si se desea obtener los anticuerpos con una mayor pureza, los anticuerpos precipitados pueden volver a disolverse en un sistema tampón adecuado y someterse a procedimientos de purificación adicionales, tales como cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de inmunoafinidad.

Como se usa en este documento, las expresiones "purificación por inmunoafinidad" o "cromatografía de inmunoafinidad" se refieren a un tipo de método de separación basado en las características de unión de anticuerpos para un antígeno específico. Es decir, los anticuerpos que se unen a un antígeno específico en una condición particular se separan de los anticuerpos no unidos en esa condición. La presente invención contempla el uso de purificación por inmunoafinidad para eliminar proteínas irrelevantes, en particular, la inmunoglobulina que no se une a antígeno.

De acuerdo con la presente invención, la purificación por inmunoafinidad se realiza mediante el uso de una "matriz antigénica" compuesta por antígeno inmovilizado sobre un soporte insoluble. El tipo del soporte no es crítico para la purificación por inmunoafinidad de la invención. Es útil cualquier material de soporte convencional adecuado para la unión covalente de un antígeno e inerte a la interacción entre el anticuerpo deseado y el antígeno inmovilizado sobre el mismo. Habitualmente, el soporte está hecho de agarosa reticulada o dextrano reticulado, tal como la Sepharose 4B activada con CNBr disponible en el mercado en Pharmacia.

Los anticuerpos purificados por precipitación salina diferencial se disuelven en un "tampón de unión" y se aplican sobre la matriz antigénica, de modo que se forman los inmunocomplejos del antígeno inmovilizado y los anticuerpos de yema. Cualquier sistema tampón inerte para la interacción antígeno-anticuerpo y eficaz para mantener la condición de unión deseada es útil en la presente invención. Preferiblemente, el tampón de unión se selecciona del grupo que consiste en un tampón fosfato, un tampón MES (ácido 2[N-morfolino]etanosulfónico) y un tampón bis-Tris, entre los que el más preferido es un tampón MES a una concentración de 20 mM.

Preferiblemente, la purificación por inmunoafinidad se realiza en un entorno de ácido débil y fuerza iónica reducida, es decir, a un pH en un intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 y en una fuerza iónica de menos de aproximadamente 50 mM. Más preferiblemente, los anticuerpos se dejaron interaccionar con el antígeno inmovilizado a un pH en un intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 y, más preferiblemente, en un intervalo de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 5,8. Los anticuerpos de yema pueden disociarse de la matriz antigénica por una sal caotrópica o a un pH de menos de aproximadamente 4 o superior a aproximadamente 8. La actividad de los anticuerpos recogidos puede restituirse, por ejemplo, mediante diálisis exhaustiva contra un tampón de baja fuerza iónica que no contiene caótropos y débilmente ácido.

La IgY(\DeltaFc) purificada de acuerdo con el proceso de la invención ni activa el sistema del complemento ni se une al factor reumatoide de sueros de mamíferos. La reactividad cruzada inmunológica entre IgY(\DeltaFc) y la IgG de mamíferos no es significativa. Por lo tanto, la invención también proporciona un nuevo tipo de anticuerpo adecuado para usos clínicos y de investigación.

La descripción también proporciona una amplia diversidad de usos clínicos y de investigación del anticuerpo IgY preparado de acuerdo con la invención. Por ejemplo, la presente descripción proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento o la profilaxis de un animal (que incluye aves domésticas, animales de granja y de compañía) o pacientes humanos que comprenden una cantidad terapéutica del anticuerpo IgY de la presente invención para la protección o profilaxis de los mismos de diversos agentes etiológicos, incluyendo microorganismos tales como bacterias, virus nativos, recombinantes o peptídicos sintéticos, hongos, protozoos, nematodos y similares y sustancias proteicas y no proteicas, tales como alergenos, nativos, recombinantes o peptídicos sintéticos, toxinas, venenos, hormonas y cualquier otro inmunógeno capaz de provocar una respuesta inmune. Preferiblemente, el anticuerpo IgY purificado se aplica en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como agua, solución salina y similares. La composición farmacéutica puede administrarse por medios que comprenden administración oral, inyección, administración externa y tratamiento inmunizante.

El anticuerpo IgY también es útil para detectar un agente etiológico de interés, incluyendo, por ejemplo, un organismo patógeno o no patógeno, tal como Escherichia coli, Salmonella enteritidis y otros organismos bacterianos; una hormona nativa, recombinante o peptídico sintética, tal como estrógeno, progesterona, tiroxina y similares; un antígeno de complejo mayor de histocompatibilidad y similares; un marcador tumoral nativo, recombinante o peptídico sintético tal como alfa-fetoproteína, antígeno prostático específico y similares; un marcador patológico tal como proteína C-reactiva, ferritina y similares; una acumulación o un residuo de materiales extraños tales como fármacos de Teofilina y digoxina; en una muestra corporal tal como un fluido, tejido, extracto celular y similares, que procede del ser humano o animal. Para obtener anticuerpos específicos solamente contra los agentes etiológicos, el agente etiológico puede inyectarse en los patos como antígenos para inducir la producción de anticuerpos deseados, y los que los antígenos comprenden antígenos naturalmente purificados, antígenos recombinantes, antígenos peptídicos sintéticos y ADN plasmídico. Usando el anticuerpo IgY obtenido, puede detectarse cuantitativamente o cualitativamente un agente etiológico de interés por cualquier método convencional conocido en la técnica, tal como los métodos de Ouchternoly (MO), el método de inmunodifusión radial simple (SRID), el método de inmunoelectroforesis (EP), el método de radioinmunoensayo (RIA), el método de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el método de transferencia de Western (WB), el método de inmunoensayo turbidimétrico, el método de ensayo turbidimétrico potenciado con partículas, un inmunoensayo enzimático, un inmunoensayo nefelométrico, un inmunoensayo quimioluminiscente, un inmunoensayo con nanopartículas de oro o un ensayo de inmunocromatografía.

El anticuerpo IgY también está adaptado al uso en biochips y biosensores.

Los siguientes Ejemplos se proporcionan solamente con el fin de una ilustración y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1

Procedimiento de inmunización para estimulación de la producción de anticuerpos específicos

Doce patos domésticos (Anas platyrhynchos var. domestica) de 16 semanas de edad se alojaron individualmente para producción de anticuerpos y huevos. Los patos recibieron una inyección subcutánea inicial de 1-5 mg/ml de proteína C-reactiva humana (CRP; purificada a partir de líquido ascítico humano) en tampón fosfato a pH 7,5 emulsionada con un volumen equivalente de adyuvante completo de Freund. Generalmente, la concentración del antígeno usado estaba en el intervalo de 1 a 5 mg/ml. Después de la inyección inicial, hembras jóvenes recibieron tres inyecciones adicionales de 1-5 mg de antígeno cada dos semanas. Una semana después, los huevos comenzaron a recogerse, marcarse y almacenarse a 4ºC hasta procesarse para la extracción y purificación de anticuerpo. El procedimiento de refuerzo se repitió cada cuatro semanas durante el experimento. Se extrajeron muestras de sangre el séptimo día después de cada inyección de refuerzo. Cada muestra de sangre se centrifugó y se recogió el suero resultante.

Ejemplo 2

Extracción de anticuerpos a partir de yemas de pato

Las yemas recogidas de los huevos puestos por los patos hiperinmunizados del Ejemplo 1 se lavaron minuciosamente mediante un chorro débil de agua destilada, para eliminar de este modo el albumen. El volumen de yema se midió y después se mezcló minuciosamente con agua destilada en una cantidad de diez veces la cantidad medida de yema. Después, la mezcla se mantuvo durante al menos dos horas a 4ºC y posteriormente se centrifugó a 10.000 rpm en una centrífuga Hitachi CR-22F durante una hora. Se formó una capa de sobrenadante clara y una capa flexible semisólida en los tubos de centrífuga.

Ejemplo 3

Tratamiento con absorbentes

Al extracto bruto preparado en el Ejemplo 2 se añadió uno de los absorbentes: sílice pirógena al 2% (p/v) (adquirida en Sigma), dióxido de silicio al 3% (p/v) (sigma), Celite diatomite al 3% (p/v) (adquirido en Celite Corporation) y Celite diatomite hyflo-Cel al 3 ó 5% (p/v) (Celite Corporation). Las suspensiones resultantes se incubaron a 4ºC durante 60 minutos con agitación suave. Después de la finalización de la incubación, los absorbentes se precipitaron a 4ºC a 20.000 rpm en una centrífuga Hitachi CR-22F y los sobrenadantes y sedimentos se recogieron por separado. Se sometieron muestras de diez \mul tomadas de cada sobrenadante a una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) no reductor.

Como se muestra en la Figura 1, en términos de la cantidad de los anticuerpos adsorbidos por los absorbentes, la sílice pirógena tiene la mejor actividad de adsorción y no quedaba casi ningún anticuerpo en la solución de flujo continuo.

El dióxido de sílice presenta una afinidad ligeramente inferior por inmunoglobulinas, que quizá es un resultado de su menor porosidad (y que, por lo tanto, comprende un área superficial menos amplia), que la sílice pirógena. Por otro lado, se capturaron menos del 10% de los anticuerpos de yema por cualquiera de los tipos de las tierras de
diatomeas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Precipitación salina diferencial de anticuerpos de yema

El sedimento de sílice pirógena obtenido en el Ejemplo 3 se trató con tiocianato de sodio 2,5 M (pH 7,4) para eluir los anticuerpos unidos sobre el mismo. El eluido resultante se precipitó primero con sulfato de amonio a una concentración de aproximadamente el 21% (p/v) en base al volumen del eluido, seguido de una segunda precipitación con adición de sulfato de amonio a aproximadamente el 31% (p/v). Los productos de anticuerpos precipitados se volvieron a disolver en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se realizó una SDS-PAGE analítica en un gel de acrilamida no reductor al 8%, en el que se cargaron 2237 \mug del extracto bruto del ejemplo 2 (carril 1), 10 \mul del flujo continuo recogido en el Ejemplo 3 (carril 2), 1122,25 \mug del eluido del sedimento de sílice pirógena (carril 3) y 153 \mug y 372,85 \mug de los productos de anticuerpos obtenidos en la primera y segunda etapas de precipitación (carril 4 y carril 5, respectivamente). El resultado se muestra en la Figura 2. Los porcentajes de recuperación y pureza se determinaron por densitometría de barrido del gel y se resumen en la Tabla 1.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

1

\vskip1.000000\baselineskip

Como se ilustra en la Tabla 1, los anticuerpos IgY(\DeltaFc) resultantes se recuperaron en un rendimiento de aproximadamente el 76% (72,05 mg/119,86 mg x 100%) en una pureza superior al 96%. Lo que es más importante, este esquema de purificación conduce ventajosamente a la separación esencial de los anticuerpos IgY(\DeltaFc) deseados a partir de la población total de anticuerpos de yema constituida principalmente tanto por IgY como por IgY(\DeltaFc).

Ejemplo 5 IgY(\DeltaFc) parcialmente purificada con Celite diatomite

Beneficiándose de la capacidad de la tierra de diatomeas para atraer lípidos y repeler anticuerpos, el extracto bruto preparado en el Ejemplo 2, se vertió sobre una columna de filtración empaquetada con el 10% en peso de Celite diatomite en base al volumen vertido del extracto. La solución que fluye a través de la columna se recogió y se sometió a una primera precipitación con sulfato de amonio al 21% (p/v) en base al volumen de la solución de flujo continuo. Los anticuerpos precipitados se recogieron y el sobrenadante se dividió en dos partes. Una parte del sobrenadante se precipitó con sulfato de amonio a una concentración de aproximadamente el 31% (p/v) mientras que la otra parte se precipitó con sulfato de sodio al 16% (p/v). Los productos de anticuerpos precipitados se volvieron a disolver en PBS. Se realizó una SDS-PAGE analítica en un gel de acrilamida no reductor al 8% en el que se cargaron 2012,5 \mug del extracto bruto del Ejemplo 2 (carril 1), 1678 \mug del flujo continuo recogido por filtración en Celite diatomite (carril 2), 94,9 \mug del eluido obtenido en la primera etapa de precipitación (carril 3) y 169,65 \mug y 357,75 \mug de los productos de anticuerpos obtenidos en la segunda etapa de precipitación por sulfato de amonio al 31% y sulfato de sodio al 16% (carriles 4-5). El resultado se muestra en la Figura 3. Los porcentajes de recuperación y pureza se determinaron por densitometría de barrido del gel y se resumen en la Tabla 2.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

2

\vskip1.000000\baselineskip

Como se ilustra en la Tabla 2, los anticuerpos IgY(\DeltaFc) resultantes se recuperaron en una pureza de aproximadamente el 77% (cuando se usó sulfato de sodio en la segunda etapa de precipitación) y del 69% (cuando se usó sulfato de amonio en la segunda etapa de precipitación), respectivamente, con altos rendimientos.

Ejemplo 6

Purificación por inmunoafinidad de anticuerpos de yema

Se preparó una solución de proteína C reactiva (CRP) en tampón carbonato 0,1 M a pH 8,5 a una concentración de 5 mg/ml. Sepharose 4B activada con CNBr adquirida en Pharmacia se lavó inicialmente con HCl frío 1 mM en una cantidad de diez veces el volumen de matriz y se dejó reaccionar con la solución de CRP en una cantidad de dos veces el volumen de matriz a 4ºC durante una noche. La matriz antigénica se suspendió en una solución de etanolamina 0,5 M en Tris-HCl 20 mM (pH 8,5) en una proporción de 1:1 (v/v) durante 2 horas a 4ºC para bloquear los sitios reactivos con proteína restantes. La matriz antigénica se lavó después con PBS que contenía azida sódica al 0,02% y se almacenó a 4ºC.

Se usaron los anticuerpos de pato precipitados con sulfato de amonio al 21% (p/v) en el Ejemplo 4 y la matriz antigénica preparada anteriormente. Se empaquetó un ml de la matriz antigénica en una columna convencional y se empapó en 20 mM de tampón MES (ácido 2[N-morfolino]etanosulfónico) (pH 5,8). La matriz antigénica se dejó reaccionar con 0,25 ml de los anticuerpos formulados en el mismo tampón de unión. La matriz antigénica se lavó con el tampón de unión hasta que el efluente estaba sustancialmente libre de proteína. Los anticuerpos unidos se eluyeron inmediatamente con guanidina-HCl 6 M y se midió la densidad óptica de los mismos a 280 nm después de una diálisis completa. El análisis de SDS-PAGE que se muestra en la Figura 4 indica que los anticuerpos purificados por afinidad están constituidos principalmente por anticuerpo IgY(\DeltaFc), que está representado por una sola banda en el gel.

Aunque se han ilustrado y descrito realizaciones de la presente invención, pueden realizarse diversas modificaciones y mejoras por especialistas en la técnica. Las realizaciones de la presente invención se escriben por lo tanto en un sentido ilustrativo pero no restrictivo. Se pretende que la presente invención no esté limitada a las formas particulares que se ilustran.

Claims

1. Un proceso para aislar selectivamente anticuerpos IgY de yema de huevo de un ave anseriforme, comprendiendo dicho proceso:

(a) absorber anticuerpos de yema en una fracción miscible en agua obtenida a partir de la yema de huevo de un ave anseriforme con un constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria seleccionado de silicato, compuestos de silicio, carbono, fibra de celulosa y sintética, y en el que el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria está en una cantidad eficaz para separar los anticuerpos de yema de la fracción miscible en agua; y

(b) hacer fluir el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria con un tampón para obtener una fracción acuosa que contiene los anticuerpos de yema.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el silicato comprende arcilla sintética o natural, caolín, talco o silicato de calcio; el compuesto de silicio comprende sílice pirógena, sílice amorfa, dióxido de sílice, gel de sílice, silicatos, tierra de diatomeas o tierra de Fuller; el carbono comprende carbono activado o fibra de carbono; y la fibra de celulosa o sintética polvo de celulosa.

3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el tampón para hacer fluir el constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria en la etapa (b) comprende una sal caotrópica, y en el que la sal caotrópica comprende guanidina-HCl de 3 M a 6 M o tiocianato de sodio de 1 M a 3 M.

4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fracción acuosa que contiene los anticuerpos de yema en la etapa (b) es una solución de flujo continuo que ha fluido a través del constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria.

5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la fracción acuosa que contiene los anticuerpos de yema en la etapa (b) es un eluido obtenido por elución del constituyente activo no cargado insoluble en agua en la fase estacionaria.

6. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además:

(c) precipitación salina de la fracción acuosa que contiene anticuerpos de yema en la etapa (b) con (NH4)_{2}SO_{4} de una primera concentración que varía del 15% (p/v) al 24% (p/v) en base al volumen de la fracción acuosa; y

(d) precipitación salina de la fracción acuosa que contiene anticuerpos de yema tratada en la etapa (c) con (NH_{4})_{2}
SO_{4} de una segunda concentración que varía del 25% (p/v) al 40% (p/v) en base al volumen de la fracción acuosa tratada en la etapa (c).

7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la primera concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} no es superior al 21% (p/v) en base al volumen de la fracción acuosa.

8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en el que la segunda concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} no es superior al 31% (p/v) en base al volumen de la fracción acuosa tratada en la primera precipitación salina.

9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ave anseriforme es un pato o un ganso.

10. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los anticuerpos de yema se recuperan a partir de la fracción acuosa.

11. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa de purificación mediante una cromatografía de inmunoafinidad a un valor de pH que varía de 4 a 7 en una fuerza iónica de menos de 50 mM.

12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el valor de pH varía de 5 a 6 en una fuerza iónica de menos de 50 mM.

13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el valor de pH varía de 5, 6 a 5,8 en una fuerza iónica de menos de 50 mM.

14. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los anticuerpos IgY comprenden anticuerpos con regiones Fc y anticuerpos sin regiones Fc.