ES2323099T3

ES2323099T3 - Protesis de injerto tubulares producidas por bioingenieria.

Info

Publication number: ES2323099T3
Application number: ES99955204T
Authority: ES
Inventors: Ginger A. Abraham; Robert M. Carr, Jr.
Original assignee: Organogenesis Inc
Current assignee: Organogenesis Inc
Priority date: 1998-06-05
Filing date: 1999-06-04
Publication date: 2009-07-06
Anticipated expiration: 2019-06-04
Also published as: US7214242B2; US20030171824A1; JP2002516701A; WO1999062424A2; AU754437B2; JP4341049B2; DE69940466D1; EP1082057B1; WO1999062424A3; AU4330099A; ATE423577T1; CA2334368C; EP1082057A4; CA2334368A1; MXPA00012064A; EP1082057A2

Abstract

Una prótesis que comprende una lámina única de matriz tisular intestinal procesada biorremodelable conformada en un tubo que, cuando se implanta en un paciente mamífero, sufre una biodegradación controlada que se produce con un reemplazo adecuado de células vivas de manera que la prótesis implantada original se remodela por las células vivas del paciente, en la que la matriz tisular intestinal procesada comprende telopéptido de colágeno acelular, 93% en peso seco, con menos de 5% de peso seco de glicoproteínas, glicosaminoglicanos, lípidos, proteoglicanos, proteínas no colagenosas y ácidos nucleicos y no contiene células ni restos celulares.

Description

Prótesis de injerto tubulares producidas por bioingeniería.

1. Campo de la invención

Esta invención se encuentra en el campo de la ingeniería de tejidos. La invención está dirigida a prótesis de injerto producidas por bioingeniería preparadas a partir de material tisular limpio obtenido a partir de fuentes animales. Las prótesis de injerto producidas por bioingeniería de la invención se preparan utilizando métodos que conservan la compatibilidad celular, firmeza y capacidad de bioremodelación de la matriz tisular procesada. Las prótesis de injerto producidas por bioingeniería se utilizan para implante, reparación o para utilizarse en un anfitrión mamífero.

2. Descripción breve de los antecedentes de la invención

El campo de la ingeniería de tejidos combina los métodos de ingeniería con los principios de la ciencia de la vida para entender las relaciones estructurales y funcionales en los tejidos de mamíferos normales y patológicos. El objetivo de la ingeniería de tejidos es el desarrollo y aplicación final de sustitutos biológicos para restaurar, mantener y mejorar las funciones tisulares.

El colágeno es la proteína estructural principal en el cuerpo y constituye aproximadamente un tercio de la proteína corporal total. Comprende la mayoría de la materia orgánica de la piel, tendones, huesos y dientes y aparece como inclusiones fibrosas en la mayoría de las demás estructuras corporales. Algunas de las propiedades del colágeno son su alta resistencia a la tensión; su capacidad de intercambio iónico; su baja antigenicidad, debida en parte al enmascaramiento de determinantes antigénicos potenciales por la estructura helicoidal; y su baja extensibilidad, semipermeabilidad y solubilidad. Además, el colágeno es una sustancia natural para la adhesión celular. Estas propiedades y otras hacen que el colágeno sea un material adecuado para la ingeniería de tejidos y la fabricación de sustitutos biológicos que se pueden implantar y prótesis biorremodelables.

Los métodos para obtener tejido y estructuras tisulares colagenosas a partir de tejidos de mamíferos extirpados y los procesos para construir prótesis a partir de tejido, se han investigado ampliamente para la reparación quirúrgica o para el reemplazo de tejidos u órganos. Todavía es un objetivo irresoluto de los investigadores el desarrollo de prótesis que puedan utilizarse con éxito para reemplazar o reparar tejidos de mamíferos.

Compendio de la invención

Los materiales colagenosos biológicos tales como la submucosa intestinal han sido propuestos por muchos investigadores para utilizarse en la reparación o reemplazo de tejidos. EEUU 5.733.337 A describe una prótesis para reemplazar una estructura corporal o tisular que funciona como una parte corporal sustituyente y también como un molde de bioremodelación para el crecimiento de células anfitrionas hacia el interior del tejido receptor. La prótesis puede ser tubular y comprende dos o más capas superpuestas y unidas de material colagenoso (especialmente la túnica submucosa del intestino delgado) que se prepara por un método que comprende el entrecruzamiento de la prótesis.

WO 95/22301 A describe prótesis que cuando se implantan en un anfitrión mamífero sirven como un reemplazo funcional de una estructura corporal o tisular y que sufrirá una biodegradación controlada que se produce de manera concomitante con la bioremodelación por las células vivas del anfitrión.

Se describen métodos para el procesamiento mecánico y químico del yeyuno proximal porcino para generar una capa única acelular de colágeno intestinal (ICL) que puede utilizarse para formar laminados para aplicaciones bioprostéticas. El procesamiento elimina las células y los restos celulares a la vez que mantiene la estructura nativa del colágeno. La lámina resultante de matriz tisular procesada se utiliza para fabricar construcciones laminadas con múltiples capas con unas especificaciones deseadas. Hemos investigado la eficacia de parches laminados para la reparación de tejidos blandos así como la utilización de ICL entubada como un injerto vascular. Este material proporciona el soporte físico necesario y es capaz de integrarse en el tejido nativo circundante y resultar infiltrado con células anfitrionas. La remodelación in vivo no afecta a la integridad mecánica. Las propiedades intrínsecas y funcionales del implante, tales como el módulo de elasticidad, retención de sutura y UTS son parámetros importantes que pueden manipularse para requerimientos específicos variando el número de capas de ICL y las condiciones de entrecruzamiento.

Descripción detallada de la invención

Esta invención está dirigida a una prótesis producida por ingeniería de tejidos, que, cuando se implanta en un anfitrión mamífero, puede servir como una parte corporal o estructura tisular de reparación, aumento o reemplazo funcional y que sufrirá una biodegradación controlada que se produce de manera concomitante con la remodelación por las células del anfitrión. La prótesis de esta invención, cuando se utiliza como un tejido de reemplazo, tiene así propiedades dobles: en primer lugar, funciona como una parte corporal sustituyente y, en segundo lugar, aún funcionando como una parte corporal sustituyente, funciona como un molde de remodelación para el crecimiento de las células anfitrionas hacia el interior del tejido receptor. Con el fin de hacer esto, el material prostético de esta invención es una matriz tisular procesada desarrollada a partir de tejido colagenoso obtenido de mamíferos que es capaz de unirse a sí misma o a otra matriz tisular procesada para formar una prótesis para ser injertada en un paciente.

La invención está dirigida hacia métodos para hacer prótesis producidas por ingeniería de tejidos a partir de material tisular limpio en los que los métodos no requieren adhesivos, suturas o grapas para unir las capas entre sí a la vez que se mantiene la capacidad de bioremodelación de la prótesis.

Una composición para preparar los injertos producidos por bioingeniería de la invención es una capa de colágeno intestinal obtenida de la túnica submucosa del intestino delgado. Las fuentes adecuadas del intestino delgado son organismos mamíferos tales como ser humano, vaca, cerdo, oveja, perro, cabra o caballo aunque la fuente preferida es el intestino delgado de cerdo.

La composición para preparar la prótesis de la invención es una capa de colágeno intestinal procesada obtenida de la túnica submucosa del intestino delgado de cerdo. Para obtener la capa de colágeno intestinal procesada, se recoge el intestino delgado de un cerdo y los tejidos mesentéricos relacionados se diseccionan groseramente del intestino. La túnica submucosa se separa, o deslamina, preferiblemente de las otras capas del intestino delgado estrujando mecánicamente el material intestinal bruto entre rodillos opuestos para eliminar las capas musculares (túnica muscularis) y la mucosa (túnica mucosa). La túnica submucosa del intestino delgado es más dura y rígida que el tejido circundante y los rodillos estrujan los componentes más blandos y los separan de la submucosa. En los ejemplos siguientes, la túnica submucosa se recogió mecánicamente a partir del intestino delgado porcino utilizando una máquina limpiadora de intestino Bitterling y posteriormente se limpió químicamente para rendir una matriz tisular limpia. Esta capa de colágeno intestinal limpiada mecánicamente y químicamente se refiere en la presente memoria como "ICL".

La ICL procesada es esencialmente telopéptido de colágeno acelular; 93% en peso seco, con menos de 5% en peso seco de glicoproteínas, glicosaminoglicanos, proteoglicanos, lípidos, proteínas no colagenosas y ácidos nucleicos tales como ADN y ARN y no contiene células ni restos celulares. La ICL procesada retiene la mayor parte de su estructura de matriz y su firmeza. De manera importante, la capacidad de bioremodelación de la matriz tisular se conserva en parte por el proceso de limpieza ya que no contiene restos de detergente unidos que afectarían adversamente la capacidad de bioremodelación del colágeno. Además, las moléculas de colágeno han retenido sus regiones de telopéptido ya que el tejido no se ha sometido a tratamiento con enzimas durante el proceso de limpieza.

Las matrices tisulares procesadas pueden tratarse o modificarse, bien físicamente o químicamente, antes de la fabricación de una prótesis de injerto producida por bioingeniería. Pueden realizarse modificaciones físicas tales como moldeado, acondicionamiento por extensión y relajación, o perforando las matrices tisulares limpias así como modificaciones químicas tales como la unión de factores de crecimiento, componentes de la matriz extracelular seleccionados, material genético, y otros agentes que afectarían la bioremodelación y reparación de la parte corporal que se está tratando, reparando o reemplazando.

La túnica submucosa del intestino delgado porcino se utiliza como un material de partida para la prótesis de injerto producida por bioingeniería de la invención. El intestino delgado del cerdo se recoge, se eliminan sus tejidos circundantes y se limpia mecánicamente utilizando una máquina limpiadora de intestinos que elimina enérgicamente las capas de grasa, músculo y mucosa de la túnica submucosa utilizando una combinación de acción mecánica y lavado utilizando agua. La acción mecánica puede describirse como una serie de rodillos que comprimen y eliminan las capas sucesivas de la túnica submucosa cuando el intestino intacto se pone entre ellos. La túnica submucosa del intestino delgado es comparativamente más dura y rígida que el tejido circundante y los rodillos estrujan los componentes más blandos y los separan de la submucosa. El resultado de la limpieza con la máquina fue tal que sólo permaneció la capa submucosal del intestino.

Después de la limpieza mecánica, se empleó una limpieza química para eliminar los componentes celulares y de la matriz y se realizó preferiblemente en condiciones asépticas a temperatura ambiente. El intestino se corta longitudinalmente hacia el lumen y después se corta en secciones de lámina de aproximadamente 15 cm cuadrados. El material se pesó y se puso en contenedores en una proporción de aproximadamente 100:1 v/v de disolución respecto al material intestinal. En el tratamiento de limpieza química más preferido, tal como el método descrito en la Solicitud Internacional PCT WO 98/49969, el tejido colagenoso se pone en contacto con un agente quelante, tal como sal de tetrasodio del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en condiciones alcalinas, preferiblemente mediante la adición de hidróxido de sodio (NaOH); después se pone en contacto con un ácido en el que el ácido contiene una sal, preferiblemente ácido clorhídrico (HCl) que contiene cloruro de sodio (NaCl); después se pone en contacto con una disolución salina tamponada tal como 1 M cloruro de sodio (NaCl)/10 mM disolución salina tamponada con fosfato (PBS); seguido finalmente de una etapa de lavado utilizando agua.

Cada etapa del tratamiento se realiza preferiblemente utilizando una plataforma giratoria o de agitación. Después del lavado, el agua se elimina de cada contenedor y la ICL se seca para eliminar el exceso de agua utilizando toallitas absorbentes estériles. En este punto, la ICL puede almacenarse congelada a -80ºC, a 4ºC en tampón fosfato estéril o secarse hasta su utilización en la fabricación de una prótesis. Si se va a almacenar seca, las láminas de ICL se aplanan en una superficie tal como una placa plana, preferiblemente una placa o membrana, tal como una lámina de policarbonato rígida, y se elimina cualquier etiqueta linfática del lado abluminal del material utilizando un escalpelo y se deja que las láminas de ICL se sequen en una campana de flujo laminar a temperatura y humedad ambiente.

La ICL es una estructura laminar plana que puede utilizarse para fabricar varios tipos de construcciones que se pueden utilizar como una prótesis dependiendo la forma de la prótesis de su utilización pretendida. Para formar prótesis de la invención, las construcciones deben fabricarse utilizando un método que mantenga la capacidad de bioremodelación del material de matriz procesado pero que también sea capaz de mantener sus características de firmeza y estructurales en su comportamiento como un tejido de reemplazo. Las láminas de matriz tisular procesadas se ponen en capas para contactar otra lámina o en forma de tubos y se enrollan sobre sí mismas. El área de contacto es una región de unión en la que las capas entran en contacto. La región de unión debe ser capaz de aguantar la sutura y la extensión cuando se manipulan en la clínica, en el momento del implante y durante la fase de cicatrización inicial hasta que las células del paciente se dividan y biorremodelen posteriormente la prótesis para formar un tejido nuevo. Cuando se utilizan como un conducto o canal, la región de unión debe ser capaz de aguantar las presiones de la materia que contiene o que pasa a su través, particularmente cuando se utiliza como un injerto vascular bajo las presiones sistólicas y diastólicas del flujo sanguíneo sistémico.

El dispositivo prostético de esta invención es una construcción tubular formada por una lámina única, generalmente rectangular, de matriz tisular procesada. La matriz tisular procesada se enrolla de manera que un borde está en contacto y se superpone al borde opuesto. La superposición sirve como una región de unión. Tal y como se utiliza en la presente memoria, "región de unión" significa un área de contacto entre dos o más capas de la misma o diferente matriz tisular procesada tratada de manera que las capas se superponen entre sí y están lo suficientemente unidas mediante auto-laminación y unión química. Las construcciones tubulares pueden utilizarse para reparar órganos tubulares que sirven como conductos tales como vasculatura o estructuras del tracto digestivo o utilizarse como un tubo de crecimiento neuronal para guiar la regeneración de los nervios. Las prótesis de la invención también pueden implantarse para una acumulación y aumento de los tejidos. Pueden incorporarse varias capas de ICL en la construcción para las indicaciones de acumulación o refuerzo. Antes del implante, las capas pueden tratarse o recubrirse adicionalmente con colágeno u otros componentes de la matriz extracelular, ácido hialurónico, o heparina, factores de crecimiento, péptidos o células cultivadas.

Una lámina de ICL se conforma en una prótesis tubular. El tubo de ICL puede fabricarse con varios diámetros, longitudes y número de capas y puede incorporar otros componentes dependiendo de la indicación para su utilización. La construcción de ICL tubular puede utilizarse como un injerto vascular. Para esta indicación, el injerto comprende al menos una capa con al menos un 5% de superposición para actuar como una región de unión que forma una juntura firme y la superficie luminal se trata preferiblemente con heparina o un agente que previene la trombosis. En la técnica de la fabricación de construcciones vasculares se conocen otros medios para prevenir la trombosis. En otra indicación vascular, la construcción de ICL tubular puede utilizarse como una prótesis externa en los casos en los que se transplantan autoinjertos venosos en el cuerpo y se desea un soporte externo para la vena transplantada. En otra indicación vascular más, la construcción de ICL tubular se conforma en una prótesis metálica para proporcionar una cubierta para la prótesis. Cuando se implanta, la ICL es beneficiosa para el receptor ya que proporciona un recubrimiento protector suave para la prótesis, para prevenir un daño adicional del tejido anfitrión durante el despliegue. Las prótesis de ICL tubular también pueden utilizarse para reparar o reemplazar otras estructuras normalmente tubulares tales como secciones del tracto gastrointestinal, uretra, canales, etc. También puede utilizarse en la reparación del sistema nervioso cuando se fabrica en un tubo para el crecimiento de los nervios empaquetado con componentes de la matriz extracelular, factores de crecimiento o células cultivadas.

Para formar una construcción tubular, se elige un mandril con una medida de diámetro que determinará el diámetro de la construcción formada. El mandril tiene preferiblemente una sección transversal cilíndrica u oval y está hecho de vidrio, acero inoxidable o de una composición no reactiva de grado médico. El mandril puede ser lineal, curvo o anguloso, puede tener ramificaciones o bifurcaciones o varias de estas cualidades. El número de capas pretendido para la construcción tubular que se va a formar se corresponde con el número de veces que una ICL se enrolla alrededor de un mandril y sobre sí misma. El número de veces que la ICL puede enrollarse depende del ancho de la lámina de ICL procesada. Para una construcción tubular de dos capas, el ancho de la lámina debe ser suficiente para enrollar la lámina alrededor del mandril al menos dos veces. Es preferible que el ancho sea suficiente para enrollar la lámina alrededor del mandril el número requerido de veces y un porcentaje adicional más como una superposición que sirva como una región de unión, entre 5% a 20% de la circunferencia del mandril para servir como una región de unión y para formar una juntura firme. De manera similar, la longitud del mandril dictará la longitud del tubo que puede formarse en él. Para facilitar el manejo de la construcción en el mandril, el mandril debería ser más largo que la longitud de la construcción de manera que sea el mandril, y no la construcción que se está formando, lo que se toque durante el manejo.

La ICL tiene una cualidad de lateralidad derivada de su estado tubular nativo. La ICL tiene dos superficies opuestas: una superficie mucosal que da al lumen intestinal y una superficie serosal que previamente tenía tejidos intestinales exteriores unidos a ella, tal como mesentérico y vascular. Se ha encontrado que estas superficies tienen características que pueden afectar al rendimiento post-operatorio de la prótesis pero que pueden aprovecharse para un rendimiento incrementado del dispositivo. En la formación de una construcción tubular para utilizarse como un injerto vascular, se prefiere que la superficie mucosal del material sea la superficie luminal del injerto tubular cuando se forma. El hecho de que la superficie mucosal esté en contacto con el flujo sanguíneo proporciona una ventaja ya que tiene algunas propiedades no trombogénicas que se prefieren para prevenir la oclusión del injerto cuando se ha implantado en un paciente. En otras construcciones tubulares, la orientación de las superficies de la ICL en la construcción completada depende de la utilización pretendida y de si se permiten o son inaceptables la trombogenicidad o las adhesiones.

Se prefiere que el mandril se proporcione con un recubrimiento de un material no reactivo, con una calidad de grado médico, elástico, de goma o látex en la forma de un manguito. Cuando puede formarse una construcción de ICL tubular directamente en la superficie del mandril, el manguito facilita la separación del tubo formado del mandril y no se adhiere a, reacciona con o deja restos en la ICL. Para separar la construcción formada, se puede tirar del manguito desde un extremo hacia fuera del mandril para arrastrar la construcción fuera del mandril con él. Debido a que la ICL procesada sólo se adhiere ligeramente al manguito y es más adherente a otras capas de ICL, se facilita la fabricación de tubos de ICL ya que la construcción tubulada puede separarse del mandril sin extender o estresar de otra forma o presentar un riesgo de daño para la construcción. En la realización más preferida, el manguito comprende KRATON® (Shell Chemical Company), una goma termoplástica compuesta por copolímeros estireno-etileno/butileno-estireno con un bloque central saturado muy estable.

Para simplificar la ilustración, se forma una construcción tubular de dos capas con un diámetro de 4 mm y una superposición de 10% en un mandril que tiene un diámetro de aproximadamente 4 mm. El mandril se proporciona con un manguito KRATON® aproximadamente tan largo como la longitud del mandril y más largo que la construcción que se va a formar en él. Una lámina de ICL se ajusta de manera que la dimensión del ancho es aproximadamente 28 mm y la dimensión de longitud puede variar dependiendo de la longitud deseada de la construcción. En al ámbito estéril de una cabina de flujo laminar, la ICL se conforma en un tubo de ICL de colágeno por el proceso siguiente. La ICL se humedece a lo largo de un borde y se alinea con el mandril recubierto con el manguito y, aprovechando la naturaleza adhesiva de la ICL, se "marca" a lo largo de la longitud del mandril recubierto con el manguito y se seca en posición durante al menos 10 minutos o más. La ICL marcada se hidrata y se enrolla alrededor del mandril y luego sobre sí misma una vuelta completa más 10% de la circunferencia, para una superposición de 110%, para servir como una región de unión y para proporcionar una juntura firme. Para obtener una construcción tubular con el lado mucosal de la ICL como el lumen de la construcción formada, el lado mucosal de la ICL se humedece a lo largo de un borde, se marca en el mandril y se enrolla de manera que el lado mucosal de la ICL está orientado hacia el mandril.

Para la formación de construcciones tubulares con una única capa, la ICL debe ser capaz de enrollarse alrededor del mandril una vuelta completa y al menos aproximadamente un 5% de una vuelta adicional como superposición para proporcionar una región de unión que es igual a aproximadamente 5% de la circunferencia de la construcción. Para una construcción de dos capas, la ICL debe ser capaz de enrollarse alrededor del mandril al menos dos veces y preferiblemente un 5% a 20% de vuelta adicional como una superposición. Mientras que el enrollamiento de dos capas proporciona una región de unión de 100% entre las superficies de la ICL, el porcentaje adicional para superposición asegura una juntura firme e impermeable. Para una construcción de tres capas, la ICL debe ser capaz de enrollarse alrededor del mandril al menos tres veces y preferiblemente un 5% a 20% de vuelta adicional como una superposición. La construcción puede prepararse con cualquier número de capas dependiendo de las especificaciones para un injerto requeridas por la indicación pretendida. Típicamente, una construcción tubular tendrá 10 capas o menos, preferiblemente entre 2 a 6 capas y más preferiblemente 2 ó 3 capas con diferentes grados de superposición. Después del enrollamiento, cualquier burbuja de aire, pliegue y arruga se elimina de debajo del material y entre las
capas.

La ICL puede enrollarse bien manualmente o con la ayuda de un aparato que facilite más la tensión y eliminación de burbujas de aire o agua o arrugas que pueden producirse por debajo del mandril o entre las capas de ICL. El aparato tendrá una superficie con la que el mandril pueda contactar a lo largo de su longitud al girarse para enrollar la ICL.

Las capas de la ICL enrollada se unen entre sí deshidratándolas mientras están en una disposición enrollada en el mandril recubierto con el manguito. La deshidratación hace que los componentes de la matriz extracelular, tales como las fibras de colágeno, de las capas se junten cuando se elimina el agua de los espacios entre las fibras de la matriz. La deshidratación puede realizarse en aire, en vacío o por medios químicos tales como con acetona o un alcohol tal como alcohol etílico o alcohol isopropílico. La deshidratación puede hacerse a humedad ambiente, normalmente entre 10% Rh a 20% Rh, o menos; ó 10% a 20% de humedad en peso. La deshidratación puede realizarse fácilmente orientando el mandril con las capas de ICL hacia el flujo de aire entrante de la cabina de flujo laminar durante al menos 1 hora hasta 24 horas a temperatura ambiente, aproximadamente 20ºC, y a humedad ambiente. En este punto, las construcciones de ICL enrolladas y deshidratadas pueden sacarse del mandril mediante el manguito o dejarse para un procesamiento adicional. Las construcciones pueden rehidratarse en una disolución acuosa, preferiblemente agua, transfiriéndolas a un contenedor a temperatura ambiente que contiene un agente de rehidratación durante al menos 10 a 15 minutos para rehidratar las capas sin separarlas o deslaminarlas.

Las construcciones se entrecruzan entre sí poniéndolas en contacto con un agente de entrecruzamiento, preferiblemente un agente de entrecruzamiento químico, que mantiene la capacidad de bioremodelación del material ICL. Como se ha mencionado anteriormente, la deshidratación hace que los componentes de la matriz extracelular de las capas de ICL adyacentes se junten para entrecruzar entre sí las capas de la envoltura para formar enlaces químicos entre los componentes y unir así las capas entre sí. Alternativamente, las construcciones pueden rehidratarse antes del entrecruzamiento poniéndolas en contacto con una disolución acuosa, preferiblemente agua, transfiriéndolas a un contenedor a temperatura ambiente que contiene un agente de rehidratación durante al menos 10 a 15 minutos para rehidratar las capas sin separarlas o deslaminarlas. El entrecruzamiento del dispositivo prostético unido también proporciona al dispositivo firmeza y durabilidad para mejorar las propiedades de manejo. En la técnica se conocen varios tipos de agentes de entrecruzamiento y pueden usarse tal como ribosa y otros azúcares, agentes oxidantes y métodos deshidrotermales (DHT). Un agente de entrecruzamiento preferido es hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). En otro método preferido, se añade sulfo-N-hidroxisuccinimida al agente EDC de entrecruzamiento como describe Staros, J.V., Biochem. 21, 3950-3955, 1982. Aparte de los agentes de entrecruzamiento químicos, las capas pueden unirse entre sí por otros medios tales como pegamentos basados en fibrina o adhesivos de grado médico tales como poliuretano, acetato de vinilo o poliepoxi. En el método más preferido, EDC se solubiliza en agua a una concentración preferiblemente entre 0,1 mM y 100 mM, más preferiblemente entre 1,0 mM y 10 mM, lo más preferiblemente a aproximadamente 1,0 mM. Aparte del agua, puede utilizarse disolución salina tamponada con fosfato o tampón de ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico (MES) para disolver el EDC. Además, pueden añadirse otros agentes a la disolución tales como acetona o un alcohol hasta 99% v/v en agua para hacer que el entrecruzamiento sea más uniforme y eficaz. La disolución de entrecruzamiento de EDC se prepara inmediatamente antes de utilizarse ya que EDC perderá su actividad con el tiempo. Para poner en contacto el agente de entrecruzamiento y la ICL, las construcciones de ICL hidratadas y unidas se transfieren a un contenedor tal como una batea poco profunda y el agente de entrecruzamiento se decanta con cuidado en la batea asegurando que las capas de ICL estén cubiertas y que floten libremente y que no estén presentes burbujas de aire por debajo o en las capas de las construcciones de ICL. La batea se cubre y se deja que las capas de ICL se entrecrucen durante entre 4 y 24 \pm 2 horas después de lo cual la disolución de entrecruzamiento se decanta y se desecha.

Las construcciones se lavan en la batea poniéndolas en contacto con un agente de lavado para eliminar el agente de entrecruzamiento residual. Un agente de lavado preferido es agua u otra disolución acuosa. Preferiblemente, se consigue un lavado suficiente poniendo en contacto las construcciones unidas químicamente tres veces con volúmenes iguales de agua estéril durante aproximadamente cinco minutos para cada lavado. Si las construcciones no se han separado de los mandriles, pueden separarse en este punto tirando de los manguitos de los mandriles. Se deja que las construcciones se sequen y cuando están secas puede separarse el manguito del lumen de las construcciones simplemente tirando de él desde uno de los extremos libres.

En las realizaciones en las que la construcción se va a utilizar como un injerto vascular, la construcción se convierte en no trombogénica aplicando heparina al lumen del tubo formado. La heparina puede aplicarse a la prótesis mediante diferentes técnicas muy conocidas. Como ilustración, la heparina puede aplicarse a la prótesis de las tres maneras siguientes. En primer lugar, se aplica una disolución de heparina benzalconio (BA-Hep) en alcohol isopropílico a la prótesis rellenando verticalmente el lumen o sumergiendo la prótesis en la disolución y secándola al aire. Este procedimiento trata el colágeno con un complejo BA-Hep unido iónicamente. En segundo lugar, puede utilizarse EDC para activar la heparina y para unir covalentemente la heparina a la fibra de colágeno. En tercer lugar, puede utilizarse EDC para activar el colágeno, unir covalentemente protamina al colágeno y unir iónicamente heparina a la protamina. También podrían utilizarse muchos otros procedimientos de recubrimiento, unión y enlace muy conocidos en la técnica.

Las construcciones se esterilizan finalmente utilizando medios conocidos en la técnica de la esterilización de dispositivos médicos. Un método preferido para la esterilización es poner en contacto las construcciones con tratamiento de ácido peracético (PA) al 0,1% estéril neutralizado con una cantidad suficiente de hidróxido de sodio (NaOH) 10 N, según la Patente de EEUU No. 5.460.962. La descontaminación se realiza en un contenedor en una plataforma agitadora, tal como contenedores Nalge de 1 L, durante 18 \pm 2 horas. Las construcciones se lavan poniéndolas en contacto con tres volúmenes de agua estéril durante 10 minutos cada lavado.

Las construcciones de la invención pueden esterilizarse por irradiación gamma. Las construcciones se envasan en contenedores hechos de material adecuado para irradiación gamma y se sellan utilizando un sellador de vacío, que se pusieron a su vez en bolsas herméticas para irradiación gamma entre 25,0 y 35,0 kGy. La irradiación gamma disminuye significativamente, pero no perjudicialmente, el módulo de Young y la temperatura de contracción. Las propiedades mecánicas después de la irradiación gamma son todavía suficientes para utilizarse en un espectro de aplicaciones y gamma es un medio preferido para esterilizar ya que se utiliza ampliamente en el campo de los dispositivos médicos implantables.

En otra realización preferida más, después de que la ICL se vuelve a conformar en una construcción para la reparación o reemplazo tisular, puede poblarse con células para formar una construcción tisular celular que comprende capas unidas de ICL y células cultivadas. Las construcciones tisulares celulares pueden formarse para mimetizar los órganos que van a reparar o reemplazar.

Los cultivos celulares se establecen a partir de fuentes de tejidos de mamíferos disociando el tejido o por el método del explante. Los cultivos primarios se establecen y se conservan en frío en bancos de células principales de los que partes del banco se descongelan, siembran y subcultivan para aumentar el número de células. Para poblar una construcción de ICL acelular con células, la construcción se pone en una placa o matraz de cultivo y se pone en contacto por inmersión con medio que contiene células suspendidas. Como el colágeno es una sustancia natural para la adhesión celular, las células se unen a la construcción de ICL y proliferan sobre y dentro de la matriz colagenosa de la construcción.

Los tipos de células preferidos para utilizarse en esta invención se obtienen a partir del mesénquima. Los tipos de células más preferidos son fibroblastos, células del estroma y otras células de tejido conectivo de soporte o fibroblastos dérmicos humanos. Las cepas de células de fibroblastos humanos pueden obtenerse de varias fuentes, incluyendo, pero sin estar limitadas a, prepucio neonatal, dermis, tendón, pulmón, cordones umbilicales, cartílago, uretra, estroma de la córnea, mucosa oral e intestino. Las células humanas pueden incluir pero no necesitan estar limitadas a: fibroblastos, células de músculo liso, condrocitos y otras células de tejido conectivo de origen mesenquimal. Se prefiere, pero no se requiere, que el origen de la célula que produce la matriz utilizada en la producción de una construcción de tejido se obtenga a partir de un tipo de tejido al que debe parecerse o mimetizarse después de emplear los métodos de cultivo de la invención. Por ejemplo, una construcción de lámina de múltiples capas se cultiva con fibroblastos para formar una construcción de tejido conectivo vivo; o mioblastos, para una construcción de músculo esquelético. Puede utilizarse más de un tipo de célula para poblar una construcción de ICL, por ejemplo, una construcción de ICL tubular puede cultivarse en primer lugar con células de músculo liso y después el lumen de la construcción poblado con el primer tipo de células se cultiva con células endoteliales vasculares como segundo tipo de células para formar un dispositivo de reemplazo celular vascular. De manera similar, una prótesis de parche de la pared de la vejiga urinaria se prepara de manera similar en construcciones de lámina de ICL de múltiples capas utilizando células de músculo liso como primer tipo de células y células endoteliales urinarias como segundo tipo de células. Los donantes de células pueden variar en el desarrollo y la edad. Las células pueden obtenerse a partir de tejidos donantes de embriones, neonatos o individuos de más edad incluyendo adultos. Las células progenitoras embrionarias tales como células madre mesenquimales pueden utilizarse en la invención y se inducen para diferenciarse y convertirse en el tejido deseado.

Aunque se prefieren las células humanas para utilizarse en la invención, las células que se van a utilizar en el método de la invención no están limitadas a células de fuentes humanas. Pueden utilizarse células de otras especies de mamíferos incluyendo, pero sin limitarse a, fuentes equina, canina, porcina, bovina, ovina y murina. Además, también pueden utilizarse en esta invención, células modificadas por ingeniería genética transfectadas espontáneamente, químicamente o viralmente. Para las realizaciones que incorporan más de un tipo de células, pueden utilizarse mezclas de células normales y modificadas genéticamente o transfectadas y pueden utilizarse mezclas de células de dos o más especies o fuentes de tejido, o ambas.

Pueden utilizarse células recombinantes o modificadas por ingeniería genética en la producción de la construcción de la matriz celular para crear una construcción de tejido que actúe como un injerto de administración de fármaco para un paciente que necesite unos niveles incrementados de productos celulares naturales o tratamiento con un agente terapéutico. Las células pueden producir y administrar al paciente a través del injerto productos celulares recombinantes, factores de crecimiento, hormonas, péptidos o proteínas durante una cantidad continuada de tiempo o como se necesite cuando esté indicado biológicamente, químicamente o termalmente debido a las condiciones presentes en el paciente. Las células también pueden modificarse por ingeniería genética para expresar proteínas o diferentes tipos de componentes de la matriz extracelular que son bien "normales" pero expresados a niveles altos o modificados de alguna manera para hacer un dispositivo de injerto que comprende matriz extracelular y células vivas que es ventajoso terapéuticamente para mejorar la cicatrización de heridas, neovascularización facilitada o dirigida o para minimizar la formación de cicatrices o queloide. Estos procedimientos se conocen generalmente en la técnica y están descritos en Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), que se incorpora en la presente memoria por referencia. Todos los tipos de células mencionados anteriormente pueden utilizarse en esta invención para la producción de una construcción tisular celular formada a partir de una construcción acelular formada a partir de capas de ICL unidas.

Las prótesis tubulares pueden utilizarse, por ejemplo, para reemplazar secciones transversales de órganos tubulares tales como vasculatura, esófago, traquea, intestino y trompas de falopio. Estos órganos tienen una forma básica tubular con una superficie exterior y una superficie interior luminal. También pueden utilizarse láminas planas para el soporte de órganos, por ejemplo, para soportar órganos prolapsados o hipermóviles utilizando la lámina como un cabestrillo para los órganos, tales como vejiga o útero. Además, las láminas planas y las estructuras tubulares pueden formarse juntas para formar una estructura compleja para reemplazar o aumentar las válvulas cardíacas o venosas.

Las prótesis de injerto obtenidas por bioingeniería de la invención pueden utilizarse para reparar o reemplazar estructuras corporales que se han dañado o enfermas en el tejido anfitrión. A la vez que funciona como una parte o soporte corporal sustitutivo, la prótesis también funciona como un armazón de matriz biorremodelable para el crecimiento de células anfitrionas hacia el interior del tejido receptor. "Biorremodelado" se utiliza en la presente memoria para significar la producción de colágeno estructural, vascularización y repoblación celular mediante el crecimiento de células anfitrionas hacia el interior del tejido receptor a una velocidad funcional igual aproximadamente a la velocidad de biodegradación, reformado y reemplazo de los componentes de la matriz de la prótesis implantada por las células y enzimas del anfitrión. La prótesis de injerto retiene sus características estructurales mientras que se remodela por el anfitrión completamente, o sustancialmente, en tejido del anfitrión y como tal es funcional como un análogo del tejido que repara o al que reemplaza.

La temperatura de contracción (ºC) de la prótesis de matriz tisular es un indicador del grado de entrecruzamiento de la matriz. Cuanto más alta sea la temperatura de contracción más entrecruzado está el material. La ICL no entrecruzada tiene una temperatura de contracción de 68 \pm 0,3ºC. En la realización preferida, las prótesis entrecruzadas con EDC deberían tener una temperatura de contracción entre 68 \pm 0,3ºC y 75 \pm 1ºC.

Las propiedades mecánicas incluyen la integridad mecánica de manera que la prótesis resista la fluencia durante el biorremodelado y adicionalmente es flexible y suturable. El término "flexible" significa buenas propiedades de manejo para facilitar el uso en la clínica.

El término "suturable" significa que las propiedades mecánicas de la capa incluyen la retención de la sutura que permite que las agujas y los materiales de sutura atraviesen el material de la prótesis en el momento de la sutura de la prótesis a secciones del tejido nativo, un proceso conocido como anastomosis. Durante la sutura, dichas prótesis no deben romperse como resultado de las fuerzas de tensión aplicadas en ellas por la sutura, ni deben romperse cuando se anuda la sutura. La suturabilidad de las prótesis, es decir, la capacidad de las prótesis para resistir la rotura cuando se suturan, está relacionada con la fuerza mecánica intrínseca del material de la prótesis, el espesor del injerto, la tensión aplicada a la sutura y la velocidad con la que el nudo se cierra. La retención de la sutura para una prótesis plana altamente entrecruzada de 6 capas entrecruzada en 100 mM EDC y 50% acetona es al menos aproximadamente 6,5 N. La retención de la sutura para una prótesis tubular de 2 capas entrecruzada en 1 mM EDC en agua es 3,9 N \pm 0,9 N. La fuerza más baja de la retención de la sutura preferida es aproximadamente 2 N para una prótesis plana entrecruzada de 2 capas; la fuerza de anudado de un cirujano cuando sutura es aproximadamente 1,8 N.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "anti-fluencia" significa que las propiedades biomecánicas de la prótesis imparten durabilidad de manera que la prótesis no se alargue, distienda o expanda más allá de los límites normales después del implante. Como se describe más adelante, la extensión total de la prótesis implantada de esta invención está dentro de los límites aceptables. La prótesis de esta invención adquiere una resistencia al alargamiento como función del biorremodelado celular posterior al implante por el reemplazo del colágeno estructural por las células anfitrionas a una velocidad mayor que la pérdida de fuerza mecánica de los materiales implantados debida a la biodegradación y remodelado.

El material tisular procesado de la presente invención es "semipermeable", incluso si se ha hecho capas y unido. La semipermeabilidad permite el crecimiento de células anfitrionas hacia el interior del tejido receptor para el remodelado o para la deposición de agentes y componentes que afectarán la capacidad de bioremodelación, crecimiento celular hacia el interior del tejido receptor, prevención o estimulación de la adhesión o flujo sanguíneo. La cualidad "no porosa" de la prótesis previene el paso de fluidos que quieren retenerse mediante el implante de la prótesis. A la inversa, los poros pueden formarse en la prótesis si se requiere una cualidad porosa o perforada para una aplicación de la prótesis.

La integridad mecánica de la prótesis de esta invención permite que sea recubierta o plegada, así como la capacidad de cortar o recortar la prótesis obteniendo un borde limpio sin deslaminar o deshilachar los bordes de la construcción.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para explicar mejor la práctica de la presente invención y no deberían interpretarse de ninguna manera como límite del alcance de la presente invención. Se apreciará que el diseño del dispositivo en su composición, forma y espesor debe seleccionarse dependiendo de la indicación final para la construcción.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Limpieza Química del Intestino Delgado Porcino Limpiado Mecánicamente

El intestino delgado de un cerdo se recogió y se limpió mecánicamente utilizando una máquina limpiadora de intestino Bitterling (Nottingham, UK) que elimina enérgicamente las capas de grasa, músculo y mucosales de la túnica submucosa utilizando una combinación de acción mecánica y lavado utilizando agua. La acción mecánica puede describirse como una serie de rodillos que comprimen y arrancan las capas sucesivas de la túnica submucosa cuando el intestino intacto pasa entre ellos. La túnica submucosa del intestino delgado es comparativamente más dura y rígida que el tejido circundante y los rodillos estrujan los componentes más blandos eliminándolos de la submucosa. El resultado de la limpieza de la máquina fue tal que sólo permaneció la capa submucosal del intestino. El resto del procedimiento se realizó en condiciones asépticas y a temperatura ambiente. Las disoluciones químicas se utilizaron todas a temperatura ambiente. El intestino se cortó entonces a lo largo hasta el lumen y después se cortó en secciones de 15 cm. El material se pesó y se puso en contenedores en una proporción de aproximadamente 100:1 v/v de disolución respecto al material intestinal.

A. A cada contenedor que contiene intestino se añadió aproximadamente 1 L de disolución de etilendiaminotetraacético sal tetrasodio (EDTA) 100 mM /disolución de hidróxido de sodio (NaOH) 10 mM esterilizada con un filtro de 0,22 \mum (micrómetros). Los contenedores se pusieron en una mesa agitadora durante aproximadamente 18 horas a aproximadamente 200 rpm. Después de agitar, la disolución EDTA/NaOH se eliminó de cada botella.

B. A cada contenedor se añadió aproximadamente 1 L de disolución de ácido clorhídrico (HCl) 1 M/disolución de cloruro de sodio (NaCl) 1 M esterilizada con un filtro de 0,22 \mum. Los contenedores se pusieron en una mesa agitadora durante entre aproximadamente 6 y 8 horas a aproximadamente 200 rpm. Después de agitar, la disolución HCl/NaCl se eliminó de cada contenedor.

C. A cada contenedor se añadió aproximadamente 1 L de disolución de cloruro de sodio (NaCl) 1 M/disolución salina tamponada con fosfato (PBS) 10 mM esterilizada con un filtro de 0,22 \mum. Los contenedores se pusieron en una mesa agitadora durante aproximadamente 18 horas a 200 rpm. Después de agitar, la disolución NaCl/PBS se eliminó de cada contenedor.

D. A cada contenedor se añadió aproximadamente 1 L de disolución de PBS 10 mM esterilizada con un filtro de 0,22 \mum. Los contenedores se pusieron en una mesa agitadora durante aproximadamente dos horas a 200 rpm. Después de agitar, la disolución salina tamponada con fosfato se eliminó de cada contenedor.

E. Finalmente, a cada contenedor se añadió aproximadamente 1 L de agua esterilizada con un filtro de 0,22 \mum. Los contenedores se pusieron en una mesa agitadora durante aproximadamente una hora a 200 rpm. Después de agitar, el agua se eliminó de cada contenedor.

Las muestras de ICL procesadas se cortaron y se fijaron para análisis histológicos. La tinción con hemotoxilina y eosina (H y E) y tricrómico de Masson se realizó tanto en las muestras de sección transversal como longitudinal de los tejidos control y de los tratados. Las muestras de ICL procesadas aparecieron sin células ni restos celulares mientras que las muestras control no tratadas aparecieron como era normal y esperado con muchas células.

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Ejemplo 2

Estudio Comparativo de Otros Tratamientos de Limpieza para Tejido Colagenoso

Se compararon otros métodos para desinfectar y esterilizar tejidos colagenosos descritos en la Patente de EEUU No. 5.460.962 de Kemp con métodos similares descritos por Cook, et al. en la solicitud PCT Internacional WO 98/22158. Se hicieron los ejemplos 1,2 y 3, de Kemp, además de un método con ácido peracético no tamponado.

Se recogieron los intestinos delgados de 4 cerdos grandes. Los intestinos se obtuvieron, se eliminó la capa mesentérica exterior y los intestinos se limpiaron con agua.

El estudio incluyó siete condiciones: la Condición A se realizó según la descripción del Ejemplo 1 en Cook et al. en la Solicitud PCT Internacional WO 98/22158. La Condición B fue una variación de A respecto a que el material intestinal se limpió mecánicamente antes de emplear el tratamiento químico descrito. Las Condiciones C, D y E se realizaron según los métodos de los Ejemplos 1, 2 y 3 de la Patente de EEUU No. 5.460.962 de Kemp. En todas las condiciones, se utiliza una proporción de diez a uno de disolución a material, esto es, 100 g de material tisular se trata con 1 L de disolución.

A. Se puso material de cada uno de los 4 intestinos en botellas separadas (n=5) que contienen un litro de disolución de ácido peracético al 0,2% en etanol al 5% (pH 2,56) y se agitó en una plataforma agitadora. Después de dos horas de agitación, la condición A se limpió mecánicamente en la máquina limpiadora de intestinos Bitterling.

Para las otras seis condiciones, B a G, el intestino se limpió mecánicamente utilizando la máquina limpiadora de intestinos Bitterling antes del tratamiento químico. Después de la limpieza mecánica, se pusieron piezas representativas de los 4 intestinos en botellas que contienen disolución para el tratamiento químico. Las botellas se agitaron 18 \pm 2 horas en una plataforma. Las seis condiciones restantes, B a G, fueron como sigue:

B. Una disolución de un litro de ácido peracético al 0,2% en etanol al 5% (pH 2,56) (n=5).

C. Una disolución de un litro de ácido peracético al 0,1% en disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,2) (n=3).

D. Una disolución de un litro de ácido peracético al 0,1% y cloruro de sodio 1M (NaCl) (pH 7,2) (n=3).

E. Una disolución de un litro de ácido peracético al 0,1% y 1M NaCl (pH 2,9) (n=3).

F. Una disolución de un litro de disoluciones de "limpieza química" como se ha mencionado anteriormente en el Ejemplo 1 (n=4).

G. Una disolución de un litro de ácido peracético al 0,1% en agua desionizada, tamponada a pH 7,0 (n=2).

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Después de los tratamientos químicos y mecánicos, todas las condiciones se lavaron durante un total de 4 veces con agua purificada esterilizada por filtración. El material tratado mecánicamente y químicamente se tiñó groseramente para examinar los restos celulares con hematoxilina de Mayer. La evaluación morfológica incluyó técnicas de tinción de Hematoxilina y Eosina, Tricrómico de Masson y Rojo de Alizarina. Los resultados histológicos de los diferentes tratamientos muestran que el método de la condición A rindió un material del que fue difícil eliminar las capas mucosales en Bitterling después del tratamiento químico. El material se tuvo que someter a Bitterling aproximadamente 10-12 veces más. El material estaba muy hinchado al principio y tenía una cantidad significativamente grande de restos celulares en la superficie y en la vasculatura del material. El método de la condición B también estaba muy hinchado y también demostró una cantidad significativamente grande de restos celulares en la superficie y en la vasculatura del material. Los métodos de las condiciones C y D rindieron un material no hinchado que tenía restos celulares mínimos en la vasculatura. La condición E rindió un material que estaba ligeramente hinchado y que contenía restos celulares mínimos en la vasculatura.

Se utilizó un kit de aislamiento de ADN/ARN (Amersham Life Sciences) para cuantificar el ADN/ARN residual contenido en los tejidos limpiados. Los resultados se resumen en la Tabla 1.

1

Los análisis morfológicos se correlacionan con la cuantificación de ADN/ARN para mostrar que los regímenes de limpieza de las condiciones A y B resultan en una matriz tisular colagenosa que todavía tiene un alto contenido celular y que contiene ADN residual como resultado de esto. Los métodos de limpieza de Kemp son mucho más eficaces para eliminar las células y restos celulares de las matrices tisulares colagenosas. Finalmente, el método de limpieza química de la Condición F, descrito en la Solicitud PCT Internacional No. WO 98/49969 de Abraham, et al. y mostrado en el Ejemplo 1 anterior, elimina todas las células y restos celulares y su ADN/ARN hasta un nivel indetectable por estos métodos.

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Ejemplo 3

Método para Hacer una Construcción de ICL en Tubo

En el campo estéril de una cabina de flujo laminar, la ICL se conformó en tubos de ICL de colágeno por el proceso siguiente. Las etiquetas linfáticas se recortan de la superficie serosal de la ICL. La ICL se secó con toallitas absorbentes estériles para absorber el exceso de agua del material y se pulverizó en una lámina de policarbonato porosa y se secó en el flujo de aire entrante de la cabina de flujo laminar. Una vez seca, la ICL se cortó en piezas de 28,5 mm x 10 cm para un injerto de 2 capas con aproximadamente un 10% de superposición. Para proporcionar un soporte para la ICL en la formación de los tubos, se cubrió un mandril cilíndrico de acero inoxidable con un diámetro de aproximadamente 4 mm con KRATON®, un material de manguito elástico que facilita la separación del tubo de colágeno formado del mandril y no se adhiere ni reacciona con la ICL. El borde largo de la ICL se humedeció con agua estéril y se adhirió al mandril y se dejó secar durante aproximadamente 15 minutos para formar una "marca". Una vez adherida, la ICL se enrolló alrededor del mandril y sobre sí misma una vuelta completa. Después de terminar el enrollamiento, se eliminaron las burbujas de aire, plegamientos y arrugas de debajo del material y entre las capas. Los mandriles y las construcciones enrolladas se dejaron en el flujo de aire entrante de la cabina de flujo laminar y se dejó que se secaran durante aproximadamente una hora en la cabina a temperatura ambiente, aproximadamente 20ºC.

Inmediatamente antes del entrecruzamiento, se preparó una disolución de entrecruzamiento químico bien de 1 mM EDC ó 10 mM EDC/25% acetona v/v en agua entrecruzados, en volúmenes de aproximadamente 50 mL de disolución de entrecruzamiento por tubo; EDC pierde su actividad con el tiempo. Los tubos de ICL hidratados se transfirieron a uno cualquiera de dos recipientes cilíndricos que contienen cualquiera de los agentes de entrecruzamiento. El recipiente se cubrió y se dejó durante aproximadamente 18 \pm 2 horas en una campana de humos, después de lo cual la disolución de entrecruzamiento se decantó y se desechó. Los tubos de ICL se lavaron tres veces con agua estéril durante aproximadamente 5 minutos por lavado.

Los tubos de ICL entrecruzados se separaron del mandril tirando del manguito de Kraton hacia fuera del mandril desde un extremo. Una vez separados, los tubos de ICL que contienen el Kraton se secaron durante una hora en la campana. Una vez secos, el manguito se separó del lumen del tubo de ICL tirando simplemente de él desde un extremo.

Los tubos de ICL se esterilizaron en ácido peracético al 0,1% a aproximadamente pH 7,0 toda la noche según los métodos descritos en la Patente de EEUU de propiedad conjunta No. 5.460.962. Los tubos de ICL se lavaron para eliminar la disolución de esterilización tres veces con agua estéril durante aproximadamente 5 minutos por lavado. Los tubos de ICL de colágeno esterilizados con ácido peracético se secaron en la campana de flujo laminar y se envasaron en tubos cónicos estériles de 15 mL hasta el implante.

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Ejemplo 4

Ensayo Mecánico de las Prótesis de ICL en Tubo

Se midieron varias propiedades mecánicas de una construcción tubular de ICL de 2 capas formada a partir de una única lámina de ICL enrollada alrededor de un mandril con una superposición de 20%, entrecruzada a 1 mM EDC en agua. Se realizaron ensayos de retención de sutura, rotura, porosidad (goteo/permeabilidad integral al agua) y distensibilidad según la "Guidance for the Preparation of Research and Marketing Applications for Vascular Graft Prostheses", FDA Draft Document, Agosto 1993. Los análisis de retención de sutura, rotura y distensibilidad se realizaron utilizando un sistema de ensayo servohidráulico MTS con el programa informático TestStar-SX. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Brevemente, el ensayo de retención de sutura consistió en tirar de una sutura 2,0 mm desde el borde de un injerto a una proporción constante. Se midió el pico de fuerza cuando la sutura se desgarró del injerto. La medida media obtenida estuvo por encima de los límites requeridos lo que indica que la construcción puede soportar las presiones físicas de sutura en la clínica.

En el ensayo de rotura, se aplicó presión al injerto en incrementos de 13,8 kPa (2,0 psi) durante intervalos de un minuto hasta que el injerto se rompió. Como referencia, la presión sistólica es aproximadamente 120 mmHg (16,0 kPa) en una persona normotensiva. La fuerza de rotura obtenida por el ensayo demostró que la construcción podría soportar presiones de aproximadamente 7,75 veces la presión sistólica indicando así que la construcción puede injertarse para indicaciones vasculares y que soporta el rigor de la circulación sanguínea.

Para el ensayo de distensibilidad, el injerto se llevó a 80 y 120 mmHg sucesivamente. El diámetro del injerto se midió a cada presión utilizando programas informáticos de análisis por imagen y la distensibilidad se calculó como (D_{120}-D_{80})/(D_{80} x 40 mmHg) x 100%. La distensibilidad de una arteria carótida de conejo es aproximadamente 0,07%/mmHg, de arteria humana es aproximadamente 0,06%/mmHg y de vena humana es aproximadamente 0,02%/mmHg, lo que indica que la construcción presenta la distensibilidad requerida para servir como un injerto vascular.

Para medir la porosidad, se aplicó PBS bajo presión hidrostática de 120 mmHg al injerto. El volumen de PBS que permeó a través del injerto durante un periodo de 72 horas se normalizó con el tiempo y el área superficial del injerto para calcular la porosidad.

La temperatura de contracción se utilizó para evaluar el grado de entrecruzamiento en un material colagenoso. Cuanto más entrecruzado esté un injerto, mayor energía se requiere, y por lo tanto mayor es la temperatura de contracción. Se utilizó un calorímetro diferencial de barrido para medir el flujo de calor a y desde una muestra bajo condiciones termales controladas. La temperatura de contracción se definió como la temperatura de inicio del pico de desnaturalización en la gráfica temperatura-energía.

La retención de sutura está muy por encima de 2 N sugerida para suturar una prótesis en un paciente; la fuerza de estiramiento de un cirujano cuando sutura es aproximadamente 1,8 N. La fuerza de rotura está siete veces por encima de la presión sistólica. La distensibilidad está en el intervalo de las arterias y venas humanas. La porosidad del tubo de ICL es baja comparada con un injerto de tejido; el tubo de ICL no requiere precoagulación. La temperatura de contracción, una medida de la temperatura de desnaturalización del colágeno, es próxima a la de ICL no entrecruzada lo que indica una baja cantidad de entrecruzamiento. En la Tabla 2 se presenta un resumen de los resultados de los diferentes ensayos de características mecánicas y físicas de construcciones de ICL de 2 capas.

2

Ejemplo 5

Recubrimiento de Prótesis Endovascular Utilizando Prótesis de ICL Tubulares

El tubo de ICL puede utilizarse como un recubrimiento protector para una prótesis endovascular de aleación de metales o dispositivo endovascular. Para recubrir una prótesis endovascular metálica, la lámina de ICL se preparó para proporcionar una envuelta de 105%, para un recubrimiento de una capa para la prótesis endovascular.

La ICL procesada mecánicamente y químicamente en un estado hidratado se aplanó y se cortaron las etiquetas linfáticas del lado serosal de la ICL. La ICL se puso en una lámina plana de policarbonato, con el lado mucosal hacia arriba y expuesto al aire. Después del secado, la ICL se cortó en 28 mm perpendicular al lumen y 100 mm paralelo al lumen para una prótesis endovascular con un diámetro de 4 mm con una longitud de 100 mm. La prótesis endovascular se deslizó en un mandril y se humedeció a lo largo de su longitud con agua desionizada. Para tener la superficie serosal de la ICL hacia el lumen de la prótesis endovascular, se aplicó un borde largo del lado serosal de la lámina de ICL al mandril de acero inoxidable con la prótesis endovascular metálica para "marcar" ésta en el mandril y se dejó que la prótesis endovascular se secara durante aproximadamente 10-15 minutos. Una vez adherida, la ICL se humedeció con agua estéril y se enrolló en el mandril y en la prótesis endovascular y sobre sí misma. Se dejó que la prótesis endovascular y el mandril recubiertos con ICL formados se secaran en el flujo de aire de la campana de flujo laminar. Una vez secos, se quitó de la prótesis endovascular y mandril recubiertos con ICL el exceso de ICL alrededor de los extremos de la prótesis endovascular y la ICL unida al mandril se despegó del mandril. La prótesis endovascular recubierta con ICL se separó del mandril y se entrecruzó el tubo de ICL en el mandril de acero inoxidable, el tubo de ICL que recubre la prótesis endovascular. Para entrecruzar la ICL unida a la prótesis endovascular, se sumergieron en un agente de entrecruzamiento de 10 mM EDC en 25% acetona durante aproximadamente 18 \pm 2 horas. Después del entrecruzamiento, la prótesis endovascular recubierta con ICL se lavó en tres volúmenes de 100 mL de agua estéril para eliminar los restos del agente de entrecruzamiento y los subproductos de la reacción de entrecruzamiento. El dispositivo resultante fue una prótesis vascular de aleación de metales con un diámetro de 4 mm y una longitud de 100 con una única capa de recubrimiento de ICL con una región de unión de 5% entrecruzada con EDC. La prótesis endovascular recubierta se envasó en un tubo de ensayo estéril para el transporte.

Claims

1. Una prótesis que comprende una lámina única de matriz tisular intestinal procesada biorremodelable conformada en un tubo que, cuando se implanta en un paciente mamífero, sufre una biodegradación controlada que se produce con un reemplazo adecuado de células vivas de manera que la prótesis implantada original se remodela por las células vivas del paciente, en la que la matriz tisular intestinal procesada comprende telopéptido de colágeno acelular, 93% en peso seco, con menos de 5% de peso seco de glicoproteínas, glicosaminoglicanos, lípidos, proteoglicanos, proteínas no colagenosas y ácidos nucleicos y no contiene células ni restos celulares.

2. La prótesis de la reivindicación 1 en la que la primera capa de la matriz tisular intestinal procesada conformada en un tubo tiene bordes opuestos de la capa que se superponen para formar una región de unión entre 5% y 20% de la circunferencia del tubo.

3. La prótesis tubular biorremodelable de las reivindicaciones 1 y 2 en la que la matriz tisular intestinal procesada se obtiene a partir de la túnica submucosa del intestino delgado.

4. La prótesis tubular biorremodelable de las reivindicaciones 1 y 2 en la que la región de unión está entrecruzada con EDC.

5. Un método para producir una construcción en tubo prostética biorremodelable que comprende una única lámina de matriz tisular intestinal procesada en el que la matriz tisular intestinal procesada comprende telopéptido de colágeno acelular, 93% en peso seco, con menos de 5% de peso seco de glicoproteínas, glicosaminoglicanos, proteoglicanos, lípidos, proteínas no colagenosas y ácidos nucleicos y no contiene células ni restos celulares en el que el método comprende:

a): marcar la única lámina de matriz tisular intestinal procesada alrededor de un mandril cubierto con un manguito hidratando un borde de la matriz tisular intestinal procesada y poniendo en contacto el mandril recubierto con un manguito con el borde hidratado de la matriz tisular intestinal procesada;

b): secar la matriz tisular intestinal procesada en el mandril recubierto con un manguito;

c): rehidratar la matriz tisular intestinal procesada con un agente de hidratación para formar la matriz tisular intestinal procesada hidratada;

d): girar el mandril dos veces para enrollar la matriz tisular intestinal procesada hidratada para formar dos capas hidratadas enrolladas de matriz tisular intestinal procesada;

e): deshidratar las capas de la matriz tisular intestinal procesada; y

f): poner en contacto las capas de la matriz tisular intestinal procesada con un agente de entrecruzamiento para entrecruzar el colágeno.

6. Una prótesis que comprende una capa de matriz tisular intestinal procesada conformada en un tubo en la que la matriz tisular intestinal procesada es biorremodelable y en la que la matriz tisular intestinal procesada comprende telopéptido de colágeno acelular, 93% en peso seco, con menos de 5% de peso seco de glicoproteínas, glicosaminoglicanos, proteoglicanos, lípidos, proteínas no colagenosas y ácidos nucleicos y no contiene células ni restos celulares, para reparar o reemplazar tejidos dañados.

7. Utilización de una capa de matriz tisular intestinal procesada conformada en un tubo en la que la matriz tisular intestinal procesada es biorremodelable y en la que la matriz tisular intestinal procesada comprende telopéptido de colágeno acelular, 93% en peso seco, con menos de 5% de peso seco de glicoproteínas, glicosaminoglicanos, proteoglicanos, lípidos, proteínas no colagenosas y ácidos nucleicos y no contiene células ni restos celulares, en la fabricación de una prótesis para reparar o reemplazar tejidos dañados.