ES2322253T3 - Utilizacion de mezclas de lipopeptidos para la fabricacion de vacunas. - Google Patents
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Abstract
Utilización de una mezcla que contiene por lo menos lipopéptidos para la fabricación de una vacuna, caracterizada porque dichos lipopéptidos están constituidos por un compuesto peptídico unido mediante un enlace hidrazona por lo menos con un vector lipófilo de naturaleza no peptídica, y se ajustan a la siguiente fórmula general (I): en la que (R 1 )(R 2 )iD significa un vector lipófilo, en el que: - i significa el número 0 ó 1, - en el caso, en el que i sea igual a 0, D significa un enlace, [((R1 )(R2 )i )D H]P P (I) - en el caso, en el que i sea igual a 1, D significa un heterociclo saturado, insaturado o aromático, mono- o policíclico, - R 1 y R 2 , que pueden ser idénticos o diferentes, significan en cada caso un resto de la fórmula L-f-E-f'', en la que L significa el resto de un lípido, E significa un tramo espaciador y f y f'' significan grupos funcionales ligantes, respectivamente, L con E y E con D, y - P significa el compuesto peptídico, - H significa el enlace hidrazona formado por ligación en solución entre un grupo funcional aldehído perteneciente al vector lipófilo y un grupo funcional derivado de hidrazina perteneciente al compuesto peptídico, - j significa un número de 1 a 3.
Description
Utilización de mezclas de lipopéptidos para la
fabricación de vacunas.
La presente invención se refiere a la
utilización de una mezcla que contiene por lo menos lipopéptidos
para la fabricación de una vacuna, dichos lipopéptidos están
constituidos por un compuesto peptídico, que se ha unido en
solución, mediante un enlace hidrazona, por lo menos a un vector
lipófilo de naturaleza no peptídica.
Ya se ha descrito la utilización para la
fabricación de vacunas de lipopéptidos, por ejemplo en la solicitud
de patente PCT/FR98/02605 se describen micelas mixtas de
lipopéptidos para inducir una respuesta inmune. A partir de un
producto de composición química determinada, esta utilización
permite aportar al sistema inmune una colección diversificada de
antígenos peptídicos, que serán presentados simultáneamente por las
células presentadoras de antígenos (CPA) en asociación con las
moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (CMH) de la
clase I y de la clase II. De este modo es posible activar las
células específicas de los antígenos presentados: las células T
auxiliares (linfocitos
T "helper", HTL), las células B productoras de anticuerpos o las células T citotóxicas (linfocitos T citotóxicos, CTL).
T "helper", HTL), las células B productoras de anticuerpos o las células T citotóxicas (linfocitos T citotóxicos, CTL).
Para inducir en cada individuo vacunado la
respuesta inmune policlonal protectora, el incremento de la
diversidad de epítopes en la composición de la vacuna constituye
una de las estrategias más prometedoras.
Diversas experiencias han demostrado que las
respuestas celulares múltiples pueden inducirse de manera bastante
eficaz mediante la inmunización con diversos péptidos que presenten
múltiples epítopes modificados a nivel de su posición del extremo C
con una
N-\varepsilon-palmitoil-lisina.
Por ejemplo, se han empleado ciertos cócteles de
lipopéptidos que contienen de 7 a 8 constituyentes diferentes para
inducir la respuesta de células T específicas de un virus en los
primates (Bourgault-Villada y colaboradores, FEMS
Immunol. Med. Microbiol. 19, 81-87, 1997;
Mortara y colaboradores, J. Virol. 73,
4447-4451, 1999; Mortara y colaboradores, Virology
278, 551-561, 2000) y en el hombre
(Gahéry-Ségard y colaboradores, J. Virol. 74,
1694-1703, 2000; Pialoux y colaboradores, AIDS
15, 1239-1249, 2001).
El estudio de Pialoux y colaboradores ha
demostrado que es posible inducir respuestas HTL y CTL en la gran
mayoría de voluntarios sanos que habían recibido una dosis de 600
\mug a 3 mg de una mezcla de 6 lipopéptidos cuya longitud era de
24 a 33 restos (100 \mug a 500 \mug por péptido) en el modelo de
infección con el virus de la inmunodeficiencia humana (virus de
tipo 1, VIH-1). La tolerancia y la inmunogenicidad
del cóctel de 6 lipopéptidos empleado para los ensayos de fase
clínica de tipo I han confirmado que tales formulaciones sintéticas
constituyen una estrategia alternativa prometedora frente a las
vacunas convencionales y recombinantes.
Los lipopéptidos conocidos de la técnica
anterior se construyen por síntesis peptídica en fase sólida a nivel
del extremo C o del extremo N de los péptidos. Estos lipopéptidos
presentan un carácter lipófilo y por ello tienden a agregarse en
solución acuosa. Por consiguiente, la principal dificultad con la
que se tropieza en el momento de su producción a escala industrial
se sitúa en los pasos de purificación por HPLC-RP
preparativa, cuya resolución es muy limitada. La separación de los
productos deseados a partir de los productos secundarios solamente
puede lograrse introduciendo en la columna una carga limitada. Por
consiguiente, para preparar una vacuna a escala industrial y
tomando en consideración a los lipopéptidos ramificados en posición
del extremo C, la parte del león del trabajo se la lleva la
repetición de los pasos cromatográficos. De modo que los
rendimientos de la purificación son relativamente bajos y a nivel
de laboratorio se sitúan normalmente en torno a 10, este
rendimiento es probablemente más bajo a escala industrial
(10-100 mg), del 1 al 2% o incluso menos cuando se
aumenta el tamaño del lote o partida de vacuna en un factor de
10.
La preparación de micelas mixtas de lipopéptidos
tiene por finalidad la obtención de una distribución equitativa de
todos los ingredientes de la vacuna en cada célula presentadora del
antígeno, con el fin de permitir la cooperación celular entre
linfocitos T-auxiliares y
T-citotóxicos por comunicación física con la célula
presentadora del antígeno. Para conseguir una cooperación celular
eficaz, los linfocitos deben reconocer simultáneamente en la
superficie de una misma célula presentadora del antígeno los
epítopes presentados con complejos principales de
histocompatibilidad de tipo I y de tipo II. Los resultados obtenidos
en los ensayos clínicos confirman experimentalmente que se puede
obtener una respuesta inmune eficaz, durante la cual se identifica
un epítope T-auxiliar en un antígeno lipopeptídico
y un epítope T-citotóxico situado en otro
lipopéptido de la misma composición (Gahéry-Ségard
y colaboradores, J. Virol. 74, 1694-1703,
2000; Pialoux y colaboradores, AIDS 15,
1239-1249, 2001).
Para obtener micelas mixtas de lipopéptidos
según la técnica anterior, es necesario purificar y caracterizar
individualmente cada lipopéptido antes de realizar su mezcla. Para
realizar la mezcla según la técnica anterior se tiene que disolver
individualmente cada lipopéptido en condiciones que permitan obtener
la solvatación completa de cada lipopéptido que forma parte de la
vacuna (PCT/FR98/02605). Los estudios de resonancia magnética
nuclear de las soluciones han puesto de manifiesto que este estado
de disolución solo se consigue en concentraciones elevadas de ácido
acético en agua (80%). El procedimiento de la técnica anterior
implica, pues, una permanencia relativamente prolongada de los
lipopéptidos en ácido acético del 80% en agua, con el fin de
disolver individualmente cada ingrediente, preparar su mezcla,
homogeneizar y después realizar la filtración esterilizante en un
filtro de porosidad 0,22 \mum, antes de efectuar la dilución
seguida por de la liofilización. La duración de la permanencia
(residencia) de tal disolvente es poco compatible con ciertos
enlaces peptídicos o con ciertos vectores lipófilos sensibles a los
ácidos.
La empresa solicitante se plantea, pues, como
objetivo la fabricación de vacunas a escala industrial, dicha
fabricación no presenta los inconvenientes que tiene la fabricación
de vacunas de la técnica anterior.
La invención tiene, pues, como objeto la
utilización de una mezcla que contiene por lo menos lipopéptidos
para la fabricación de una vacuna, dichos lipopéptidos se obtienen
con preferencia por lipificación simultánea de una mezcla homogénea
de compuestos peptídicos y están constituidos por un compuesto
peptídico, unido mediante un enlace hidrazona, a por lo menos un
vector lipófilo de naturaleza no peptídica, y se ajustan a la
siguiente fórmula general
(I):
(I):
(I)[((R^{1})(R^{2})_{i})D-H]_{j}-P
en la que
(R^{1})(R^{2})_{i}D significa un vector lipófilo, en el
que:
- i significa el número 0 ó 1,
- en el caso, en el que i sea igual a 0, D
significa un enlace,
- en el caso, en el que i sea igual a 1, D
significa un heterociclo saturado, insaturado o aromático, mono- o
policíclico,
- R^{1} y R^{2}, que pueden ser idénticos o
diferentes, significan en cada caso un resto de la fórmula
L-f-E-f', en la que
L significa el resto de un lípido, E significa un tramo espaciador y
f y f' significan grupos funcionales ligantes, respectivamente, L
con E y E con D, y
- P significa el compuesto peptídico,
- H significa el enlace hidrazona formado por
ligación en solución entre un grupo funcional aldehído perteneciente
al vector lipófilo y un grupo funcional derivado de hidrazina
perteneciente al compuesto peptídico,
- j significa un número de 1 a 3.
Cuando j significa el número 2 ó 3, la mezcla de
lipopéptidos debe formar una solución o suspensión homogénea en
medio acuoso y poseer el carácter inmunogénico deseado.
En una forma preferida de ejecución, la
utilización por lo menos de una mezcla de lipopéptidos de la fórmula
(I) será con ventaja tal que i sea igual a 0, j sea igual a 1 y el
grupo L (de la fórmula
L-f-E-f' definida
antes con ocasión de R^{1} y R^{2}) significa por ejemplo un
esterol, un derivado de esterol (por ejemplo un derivado del
colesterol) o una cadena carbonada, saturada o insaturada, lineal o
ramificada, que contiene de 4 a 30 átomos de carbono. Dicha cadena
carbonada constituye la parte lipófila de un ácido graso, por
ejemplo del ácido palmítico (cuando L se ajusta a la fórmula
CH_{3}-(CH_{2})_{14}-) o del ácido oleico (cuando L se
ajusta a la fórmula
CH_{3}-(CH_{2})_{7}-CH=CH-(CH_{2})_{7}-).
En una forma muy preferida de ejecución de la
invención, el derivado de esterol es un derivado del colesterol y
la cadena carbonada se ajusta a la fórmula
CH_{3}-(CH_{2})_{14}-.
Por otro lado, E significa con ventaja una
cadena carbonada lineal, ramificada o cíclica, saturada o
insaturada, que contiene de 1 a 18 átomos de carbono y,
eventualmente, de 1 a 16 heteroátomos (par ejemplo nitrógeno u
oxígeno) y/o de 1 a 7 grupos funcionales elegidos entre los grupos
carbonilo, los heterociclos, los heteroarilos, los carbociclos y
los arilos. E puede estar eventualmente sustituido por
1-8 grupos hidroxilo o amino y/o por
1-16 átomos de halógeno (por ejemplo cloro o
flúor).
De igual manera, f significa con ventaja un
enlace -CO-NH- o -CO-O- y f'
significa un enlace -NH-CO u
-O-CO-.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por:
- "carbociclo" (también llamado
"cicloalquilo") un anillo carbonado mono- o policíclico, que
tiene entre 3 y 8 átomos de carbono, por ejemplo el ciclopentilo o
el ciclohexilo;
- "arilo" es un anillo carbonado aromático,
mono- o policíclico, que tiene entre 5 y 14 átomos de carbono, por
ejemplo el fenilo, el naftilo o el cresilo;
- "heterociclo" es un carbociclo que uno o
varios heteroátomos elegidos entre nitrógeno, oxígeno y azufre, por
ejemplo la piperazina;
- "heteroarilo" es un arilo que tiene uno o
varios heteroátomos elegidos entre nitrógeno, oxígeno y azufre, por
ejemplo la piridina, la pirimidina o la pirazina.
\newpage
Los ejemplos de vectores lipófilos preferidos
según la invención se ajustan a las siguientes fórmulas (II) y
(III):
en la que L tiene el significado
definido anteriormente y es, por ejemplo, una cadena carbonada de la
fórmula CH_{3}-(CH_{2})_{14}- (es decir, la parte
lipófila del ácido
palmítico).
El compuesto peptídico P de la fórmula (I) puede
elegirse entre el grupo formado por uno o varios antígenos
peptídicos y uno o varios glucomiméticos dendrímeros de naturaleza
peptídica.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por "uno o varios" antígenos peptídicos o
glucomiméticos dendrímeros, el hecho de que el compuesto peptídico
P pueda estar formado por uno solo o por varios antígenos
peptídicos o glucomiméticos dendrímeros unidos entre sí, sin que
resulte modificada la actividad de la mezcla de lipopéptidos.
El antígeno peptídico se elige con ventaja entre
el grupo formado por los péptidos y los derivados de péptidos que
abarcan a los glucopéptidos y los pseudopéptidos.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por "péptido" cualquier serie de varios aminoácidos,
con independencia de su naturaleza y de su número; el término
"péptido" indica, pues, tanto a los oligopéptidos (dipéptidos
o tripéptidos) como a los polipéptidos o las proteínas. Se entiende
por "glucopéptidos" aquellos péptidos asociados mediante
enlace covalente con glúcidos, tanto si son monosacáridos (por
ejemplo las osas neutras) como polisacáridos. Se entiende por
"pseudopéptidos" aquellos péptidos, en los que uno o varios
enlaces peptídicos (-CO-NH-) se han reemplazado por
enlaces no peptídicos (como son los enlaces
-CO-NH-NH-,
-CH_{2}-NH- o
-CO-NH-O-).
En el sentido de la presente invención, se
entiende por "glucomiméticos dendrímeros de naturaleza
peptídica" a aquellos glucomiméticos, cuya estructura se basa en
aminoácidos o de sus derivados y se presenta en forma muy
ramificada, de tipo arborescente.
El glucomimético dendrímero de naturaleza
peptídica se ajusta a la siguiente fórmula general (IV):
(IV)(B^{2}M)_{m}(XN)_{n}A
en la
que:
- B^{2} se ajusta a una o varias de las
siguientes fórmulas generales (a) o (b):
en las que R_{1}, R_{2},
R_{3} y R_{4} con independencia entre sí significan un átomo de
hidrógeno o un grupo protector, y en la que W significa un enlace o
una cadena carbonada lineal, ramificada o cíclica, saturada o
insaturada, que tiene de 1 a 18 átomos de carbono y eventualmente de
1 a 12 átomos elegidos entre oxígeno, azufre y nitrógeno, dicha
cadena carbonada está eventualmente sustituida por
1-16 átomos de
halógeno,
- X significa el resto de un oligopéptido X' que
contiene de 1 a 6 aminoácidos,
- A significa el resto de un compuesto A' por lo
menos trifuncional que contiene una serie de aminoácidos, idénticos
o diferentes, elegidos entre el grupo formado por la lisina, la
hidroxilisina, la serina, la treonina, la cisteína, la ornitina, el
ácido aspártico y el ácido glutámico
- m es un número entero comprendido entre 1 y
32,
- n es un número entero comprendido entre 0 y
32, y
- M y N representan en cada caso un grupo de
enlace, respectivamente entre B^{2} y A cuando n = 0 o entre
B^{2} y X cuando n es diferente de 0, y entre X y A cuando n es
diferente de 0, y con independencia entre sí contienen un grupo
funcional elegido entre oxima, hidrazona, amida, éster, tioéster,
hidrazida, hidroxamato, éter, tioéter, amina, carbonato, carbamato,
tiocarbonato, tiocarbamato, urea, tiourea y tiazolidina.
El compuesto de la fórmula (IV) se describe en
la solicitud de patente internacional PCT/FR00/02194.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por grupo "protector" un grupo protector de un grupo
funcional hidroxilo o de un diol (en tal caso, dos grupos elegidos
entre R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} pueden estar unidos entre
mediante enlace covalente para formar, juntos, un anillo), tal como
se define en el manual Protective Groups in Organic Synthesis, T.W.
GREENE y P.G.M. WUTS, segunda edición, J. WILEY and Sons, 1991. A
título ilustrativo y no limitante, se pueden citar los grupos
trimetilsililo, trietilsililo, triisopropilsililo,
tert-butildimetilsililo,
tert-butildifenilsililo, éter de trimetilsililetilo,
tert-butoximetilo, metoxi-metilo,
benciloximetilo, 2-metoxietoximetilo,
metiltiometilo, acetilo o
2',3'-dimetoxibutano-2',3'-diilo.
A título ilustrativo y no limitante, en las
fórmulas generales (a) y (b):
- los átomos de halógeno convenientes son el
bromo, el cloro y el flúor y
- las cadenas carbonadas convenientes son los
grupos alquilo (metilo, etilo, propilo, isopropilo,
tert-butilo, penti-
lo, ...), los grupos alquenilo (vinilo, alilo, butenilo, pentenilo, ...), los grupos alquinilo (etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo, ...), los grupos cicloalquilo (ciclopentilo, ciclohexilo, ...), los heterociclos (piperazina, ...), los grupos arilo (fe-
nilo, cresilo, ...), los grupos heteroarilo (piridina, pirimidina, pirazina, ...), los grupos polietilenglicol o las poliaminas.
lo, ...), los grupos alquenilo (vinilo, alilo, butenilo, pentenilo, ...), los grupos alquinilo (etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo, ...), los grupos cicloalquilo (ciclopentilo, ciclohexilo, ...), los heterociclos (piperazina, ...), los grupos arilo (fe-
nilo, cresilo, ...), los grupos heteroarilo (piridina, pirimidina, pirazina, ...), los grupos polietilenglicol o las poliaminas.
Las fórmulas (a) y (b) representan restos de los
ácidos quínico y shikímico y de algunos de sus derivados, obtenidos
por protección de los hidroxilos de las posiciones 1, 3, 4 y/o 5 del
anillo.
En una forma preferida de ejecución de la
invención, el compuesto de la fórmula general (IV) es aquel, en el
que m es un número entero comprendido entre 4 y 16, n es un número
entero comprendido entre 2 y 8, X significa el resto de un
oligopéptido que contiene de 2 a 4 restos de aminoácidos, mientras
que A significa el resto de un eslabonamiento que contiene de 2 a 8
restos de lisina y se presenta en forma de un dendrímero, y B^{2}
significa el resto de uno o de varios compuestos elegidos entre el
ácido (-)-shikímico y el ácido
(-)-quínico.
En la mezcla de lipopéptidos de la fórmula (I),
la presencia de compuestos peptídicos de la fórmula (IV) permite
vectorizar selectivamente los lipopéptidos hacia las células que
poseen receptores de manosa o receptores del grupo de las
C-lectinas afines al receptor de la manosa. Por
tanto, la mezcla de lipopéptidos que contiene compuestos peptídicos
P constituidos por un antígeno peptídico y un glucomimético
dendrímero de la fórmula (IV) permiten disparar dicha mezcla de
lipopéptidos contra las células que expresan a los receptores del
grupo de las C-lectinas afines al receptor de la
manosa.
La utilización de una mezcla de lipopéptidos
según la presente invención consta con ventaja de 1 a 20
lipopéptidos diferentes, con preferencia de 1 a 10 lipopéptidos
diferentes.
La utilización según la presente invención de
una mezcla de lipopéptidos para la fabricación de vacunas se
entiende en el sentido de la utilización para la fabricación de
cualquier tipo de vacunas, es decir, de manera clásica las vacunas
profilácticas, pero también las "vacunas de uso terapéutico".
Estas vacunas pueden dirigirse contra enfermedades infecciosas de
origen bacteriano, vírico o parasitario o contra diferentes tipos de
cáncer. La utilización según la invención permite además fabricar
vacunas polivalentes que contienen una mezcla de antígenos
peptídicos correspondientes a diferentes enfermedades
infecciosas.
Las vacunas de la presente invención son, pues,
activas no solo desde el punto de vista de la vacunación preventiva
sino también desde el punto de vista terapéutico, en particular las
vacunas lipopeptídicas de la presente invención pueden utilizarse
para generar una respuesta contra nuevos epítopes y para polarizar o
reforzar la polarización de una respuesta inmune establecida. Los
resultados observados indican en efecto que los lipopéptidos son
capaces de inducir nuevas respuestas inmunes
anti-VIH, CD4, CD8, en los pacientes infectados.
El compuesto peptídico está constituido de modo
ventajoso por antígenos peptídicos derivados de un agente
infeccioso de tipo vírico, por ejemplo el VIH o el VHC.
La utilización para la fabricación de una vacuna
con una mezcla que contiene por lo menos lipopéptidos de la
invención se formula de modo preferido para la administración por
vía transmucosal o transcutánea, pero también parenteral
(intramuscular, subcutánea, intradérmica, intravenosa).
La mayor parte de las vacunas actualmente
disponibles se administran por vía parenteral, lo que implica la
intervención de un personal médico formado, costes elevados, puede
provocar reacciones en el punto de inyección y, en ciertas
circunstancias, puede ser el origen de infecciones por la
utilización de jeringuillas contaminadas (por ej. transmisión del
VIH, virus de las hepatitis).
La OMS considera además que, en los países en
vías de desarrollo, el 50% de las inyecciones efectuadas con fines
de vacunación no son seguras debido a la repetida reutilización de
las jeringuillas no esterilizadas (Jodar, L. y col., Vaccine
19, 1594-1605, 2001; Kane, A. y col., Bull.
WHO 77, 801-807, 1999). Además, la
utilización de jeringuillas es en general, sobre todo para los
niños, sinónimo de sufrimiento. Parece, pues, necesario desarrollar
una nueva generación de vacunas, fáciles de administrar, económicas,
con métodos de inmunización fáciles de llevar a la práctica.
Las vacunas aplicadas en mucosas y las
transcutáneas representan una alternativa atractiva a las vacunas
administradas por vía parenteral. La administración en las mucosas,
por ejemplo por vía nasal, permite inducir respuestas inmunes en
los sitios que son la puerta de entrada de numerosos patógenos, y
constituye una alternativa eficaz a la administración por vía oral,
que permanece asociada a un acceso difícil hasta las células
presentadoras de antígenos, la degradación proteolítica se produce
a nivel del tracto intestinal y, por tanto, la respuesta inmune es
de poca amplitud.
La piel, nuestra principal interfase con el
entorno exterior, es también una barrera inmune contra la entrada
de numerosos patógenos. Posee células inmunocompetentes específicas,
que son los queratinocitos y, sobre todo, las células de
Langerhans, y está equipada con ganglios linfoides y con subgrupos
de linfocitos T, el conjunto constituye "el tejido linfoide
asociado a la piel" (Skin-associated lymphoid
tissue, SALT) (Bos, J.D. y col., Immunol. Today 14,
75-78, 1993).
Su capacidad para atravesar las membranas
celulares permite a los lipopéptidos actuar como vehículos de los
epítopes a través de las superficies de las mucosas, permitiendo de
este modo su transporte no solo a nivel del sistema inmunológico
local, sino también del sistémico (solicitud internacional nº WO
01/41797).
La utilización de una mezcla que contiene por lo
menos lipopéptidos de la presente invención para la fabricación de
una vacuna, contempla además el uso de otros constituyentes de
carácter anfífilos o de excipientes capaces de asegurar una buena
solvatación en el agua gracias a una parte polar y la interacción de
tipo Van der Waals con los lipopéptidos de carácter hidrófobo:
Estos excipientes o constituyentes anfífilos
pueden estar formados en su mayor parte por aminoácidos polares o
cargados.
En una forma preferida de ejecución de la
invención, la mezcla de lipopéptidos contiene además uno o varios
excipientes clínicamente aceptables.
De modo especialmente ventajoso, el excipiente
clínicamente aceptable es la manita o el Polisorbato 80 o una mezcla
de ambos.
La presente invención se refiere en especial a
las vacunas, que, como antígenos peptídicos, llevan por lo menos
dos secuencias procedentes de las proteínas Gag, Pol y Nef del virus
VIH, en especial un mezcla de las secuencias Gag
17-35, Gag 253-284, Pol
325-355, Nef 66-97, Nef
116-147 y de modo muy especial los lipopéptidos
descritos en el ejemplo 1.
En los lipopéptidos empleados se introduce con
preferencia una lisina suplementaria en el extremo C de cada
péptido y se amida el ácido carboxílico del extremo C. El grupo
funcional amina (e-NH2) de la cadena lateral de
esta lisina se modifica con un resto palmitoílo unido a través de un
espaciador que contiene un enlace hidrazona. En otro modo de
ejecución preferido, la utilización según la invención contiene como
antígenos peptídicos, las secuencias peptídicas siguientes:
- -
- VHC 1 HzAc: H-K(COCH_{2}NHNH_{2})GREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2
- -
- VHC 2 HzAC: H-K(COCH_{2}NHNH_{2})GHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2
- -
- VHC 3 HzAc: H-K(COCH_{2}NHNH_{2})GAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere además a las secuencias
nativas:
- \quad
- NS3 1007-1037: H-KGREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2
- \quad
- NS3 1174-1195: H-KGHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2
- \quad
- NS3 1524-1553: H-KGAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2,
que presentan carácter inmunogénico.
Aparte de las disposiciones precedentes, la
invención comprende además otras disposiciones que resultarán
evidentes a partir de la descripción que sigue, que se refiere a
ejemplos de ejecución de la utilización de una mezcla que contiene
por lo menos lipopéptidos de la invención para la fabricación de una
vacuna, así como a la figura 1 que ilustra los resultados del
análisis de la inmunogenicidad en el macaco después de la inyección
de dosis de la vacuna (VIS) del ejemplo 5.
En los ejemplos siguientes se emplean estas
abreviaturas: eq.: equivalentes; Boc:
tert-butiloxicarbonilo; Fmoc:
9-fluorenil-metoxicarbonilo; Mtt:
4-metil-tritilo; DMF:
dimetilformamida; TFA: ácido trifluoracético; CH_{2}Cl_{2}:
diclorometano; MeOH: metanol; EtOH: etanol; THF: tetrahidrofurano;
AcOH: ácido acético; AcOEt: acetato de etilo; H_{2}O: agua;
AcO-NH_{4}^{+}: acetato amónico; CDCl_{3}:
cloroformo deuterado; EDT: etanoditiol; TIS: triisopropilsilano;
DMSO-d6: sulfóxido de dimetilo-d6
(totalmente deuterado); NaIO_{4}: peryodato sódico; NaCl: cloruro
sódico; Na_{2}SO_{4}: sulfato sódico; MgSO_{4}: sulfato
magnésico; KH_{2}PO_{4}: dihidrogenofosfato potásico; PAL:
"engarce péptido-amida"; Bop: hexafluorofosfato
de
benzotriazol-1-il-oxi-tris(dimetilamino)fosfonio;
HOBt: N-hidroxibenzotriazol; HBTU: N-óxido de
hexafluorofosfato de
N-[(1H-benzotriazol-1-il)(dimetilamino)metileno]-N-metilmetanaminio;
DIEA: diisopropiletilamina; TEAP: fosfato de trietilamina; HPLC:
cromatografía de líquidos de alta eficacia;
RP-HPLC: cromatografía de líquidos de alta eficacia
en fase inversa; EM-ES: espectrometría de masas por
nebulización electrónica;
TOF-EM-PD: espectrometría de masas
con desorpción de plasma; EM-LC: espectrometría de
masas después de cromatografía de líquidos;
RMN-H^{1}: resonancia magnética nuclear del
protón; RMN-C^{13}: resonancia magnética nuclear
del carbono.
Se preparan cinco péptidos, derivados de las
proteínas Gag, Pol y Nef del virus HIV-1,
funcionalizadas con grupos
\alpha-hidrazinoacéticos a nivel de la cadena
lateral de una lisina introducida en el extremo C. Estos
hidrazinopéptidos se sintetizan en fase sólida en forma de sales
trifluoracetato. Se aplican las estrategias
Fmoc/tert-butilo (convencional), y un procedimiento
descrito recientemente (ácido
N,N',N'-tri(tert-butiloxicarbonil)-hidrazinoacético)
para introducir de modo específico un grupo hidrazinoacetilo en un
grupo \varepsilon-amino desprotegido de un resto
lisilamida en posición del extremo C (BONNET, D. y col., J. Org.
Chem. 2001 y solicitud de patente PCT/FR00/02336). Según las
secuencias, los rendimientos de la síntesis se sitúan entre el 10 y
el 50%. Después de la disgregación y desprotección, se verifica la
identidad de los péptidos por EM-ES. Se someten los
hidrazinopéptidos a un análisis de la composición de aminoácidos
después de la hidrólisis ácida total con ácido clorhídrico: HCl
6N/fenol = 10/1, a 110ºC durante 24 h.
Se purifican los hidrazinopéptidos por
RP-HPLC en una columna preparativa C3 (columna
Zorbax: 300 \ring{A}, 5 \muM, diámetro = 12,5 mm y longitud =
250 mm, con columna previa) en un equipo HPLC Shimatzu 6A. Los
análisis de RP-HPLC se realizan en una columna
preparativa C3 (columna Zorbax: 300 \ring{A}, 5 \muM, diámetro =
4.6 y longitud = 250 mm) en un equipo HPLC Shimatzu 10A.
Los eluyentes (disolventes A y B) son los
siguientes:
- disolvente A: agua desionizada que contiene un
0,05% de TFA,
- disolvente B (purificación): 0,05% de TFA en
una mezcla propan-2-ol/H_{2}O
(40:60).
- disolvente B (con reacción posterior,
análisis): 0,05% de TFA en una mezcla acetonitrilo/H_{2}O
(80:20).
El caudal de la elución es de 1 ml/min empleando
un gradiente lineal del 10 al 100% del tampón B en 30 minutos, el
100% de tampón B durante 10 minutos, el 10% de tampón B durante 10
minutos (detección a 215 nm, temperatura: 50ºC).
Los péptidos obtenidos, en forma de sales
trifluoracetato, se recogen en la siguiente tabla 1.
En la siguiente tabla II se recogen los tiempos
de elución de los hidrazinopéptidos obtenidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
2) Síntesis del vector lipófilo Pam
([3-(2-oxo-acetilamino)-propil]-amida
del ácido hexadecanoico, también presente en forma de "vector Pam
hidratado":
[3-(2,2-dihidroxi-acetilamino)-propil]-amida
del ácido hexadecanoico)
La síntesis de este vector, compuesto por un
grupo palmitoílo y por un grupo glioxililo, ha sido descrita por
MELNYK y colaboradores en la solicitud de patente nº PCT/FR01/02787
(ejemplo 4: síntesis del vector lipófilo "IIIa") y por Bonnet
y colaboradores (BONNET, D. y col., Tetrahedron Letters, 2000).
En un matraz de 500 ml se disuelven 10 g (66,6
mmoles) de ácido tartárico 1 en 200 ml de etanol absoluto, en
presencia de un 1% en peso de resina Amberlyst 15. El matraz está
equipado con un montaje soxhlet que contiene tamices moleculares
activados de 4 \ring{A}. Se calienta el etanol a reflujo durante
48 h. Después se filtra la mezcla reaccionante a través de una
frita de vidrio nº 4 para separar la resina. Se concentra a presión
reducida el líquido filtrado, formándose un aceite amarillo claro.
Se seca el residuo 2 con P_{2}O_{5} durante una noche y se
emplea sin más purificación (m = 13,46 g, rendimiento = 98,0%).
El análisis del compuesto 2, representado a
continuación, por cromatografía de capa fina arroja un índice
migración Rf = 0,76 en el eluyente
CH_{2}Cl_{2}/MeOH/H_{2}O/AcOH (90/10/0,1/0,05).
RMN-H^{1} (CDCl_{3}): 1,33
(t, 6H, H_{5,5'}, J_{5-4} = 7,2 Hz), 3,28 (s,
2H, H_{1,1'}), 4,33 (q, 4H, H_{4,4'}, J_{4-5}
= 7,1 Hz), 4,54 (s, 2H, H_{2,2'}). RMN-C^{13}:
14,14 (C_{5,5'}), 62,48 (C_{4,4'}), 72,08 (C_{2,2'}), 171,62
(C_{3,3'}).
Se disuelven 13,46 mg (65,26 mmoles) del
compuesto 2 en 155 ml de etanol absoluto y se añaden por goteo a 56
ml (665,26 mmoles) de
1,3-diamino-propano. Se agita la
mezcla reaccionante a temperatura ambiente durante 3 h. Se elimina
el exceso de 1,3-diaminopropano por evaporación a
presión reducida y arrastre azeotrópico en presencia de etanol (3 x
200 ml). Se seca el aceite amarillo resultante con P_{2}O_{5}
durante una noche, se recoge en una mezcla etanol/tolueno (1/1) y
se concentra a presión reducida (3 x 200 ml). De este modo se
obtiene un compuesto amarillo, de consistencia pastosa. Se precipita
este compuesto en 50 ml de una mezcla de éter etílico/etanol (5/1),
se filtra y se agita el precipitado blancuzco a 0ºC durante 1 h 30
min en presencia de éter etílico. Se filtra a través de una frita
de vidrio y se lava 2 veces con la cantidad mínima de éter etílico
frío. Se seca el sólido residual 3 con P_{2}O_{5} durante una
noche (m = 13,92 g, rendimiento = 81,3%).
El análisis del compuesto 3, representado a
continuación, arroja los valores siguientes: Rf = 0,34 en
THF/AcOH/
H_{2}O/AcO-NH_{4}^{+} (35/20/10/1% en peso). RMN-H^{1} (DMSO-d6): 1,48 (q, 4H, H_{6 \ y \ 6'}, J_{6-5,6,7 \ y \ 6'-5',6',7'} = 6,65 H_{2}), 2,51 (m, 4H, H_{7-7'}), 3,14 y 3,16 (t, 4H, H_{5 \ y \ 5'}, J_{5-6 \ y \ 5'-6'} = 6,3 Hz), 4,19 (s, 2H, H_{2,2}), 7,75 (t, 2H, H_{4,4'}, J_{4,4'} = 5,97 Hz). RMN-C^{13}: 33,51 (C_{6,6'}), 36,98 (C_{7,7'}), 40,06 (C_{5,5'}), 73,43 (C_{2,2'}), 172,87 (C_{5,5'}).
H_{2}O/AcO-NH_{4}^{+} (35/20/10/1% en peso). RMN-H^{1} (DMSO-d6): 1,48 (q, 4H, H_{6 \ y \ 6'}, J_{6-5,6,7 \ y \ 6'-5',6',7'} = 6,65 H_{2}), 2,51 (m, 4H, H_{7-7'}), 3,14 y 3,16 (t, 4H, H_{5 \ y \ 5'}, J_{5-6 \ y \ 5'-6'} = 6,3 Hz), 4,19 (s, 2H, H_{2,2}), 7,75 (t, 2H, H_{4,4'}, J_{4,4'} = 5,97 Hz). RMN-C^{13}: 33,51 (C_{6,6'}), 36,98 (C_{7,7'}), 40,06 (C_{5,5'}), 73,43 (C_{2,2'}), 172,87 (C_{5,5'}).
Se disuelven 996,9 mg (3,8 mmoles) del compuesto
3 en 15 ml de agua. Se ajusta el pH de la solución, que es de 8,5,
a 3,25 por adición de 1,46 g de ácido cítrico. Después se añaden en
cuatro porciones 1,06 g (4,9 mmoles) de NaIO_{4}, durante 5
minutos, a la mezcla reaccionante mantenida a temperatura ambiente
con un baño de agua. Después se agitar durante 10 minutos se añaden
570 mg de ácido tartárico (3,8 mmoles) para neutralizar el exceso
de NaIO_{4} que no haya reaccionado.
Después de agitar a temperatura ambiente durante
10 minutos se ajusta el pH a 8,6 con 24 ml de
N-metil-morfolina. Se diluye la
mezcla reaccionante con 70 ml de
2-metil-propan-2-ol
y 20 ml de agua. Entonces se añaden 2,16 g (1,6 eq.) de palmitoato
de succinimidilo a la solución que se agita a temperatura ambiente
durante una noche. Se ajusta el pH a 3,5 con 7,11 g de ácido
cítrico. Se diluye la mezcla con 40 ml de una solución saturada de
NaCl y se extrae con 140 ml de diclorometano, después con 100 ml de
cloroformo. Se lava la fase orgánica dos veces con 100 ml de una
solución saturada en KH_{2}PO_{4}, dos veces con 100 ml de una
solución saturada de NaCl, se seca con Na_{2}SO_{4}, se filtra
y se concentra a presión reducida. Se purifica el compuesto sólido
residual a través de gel de sílice empleando como eluyente una
mezcla de CH_{2}Cl_{2}/AcOEt/EtOH (70/22/5). De este modo se
obtienen 951,4 mg del vector lipófilo (IIIa), que equivalen a un
rendimiento del 42,3%.
El análisis del compuesto (IIIa), representado a
continuación en su forma hidratada, es la siguiente:
RMN-H^{1} (DMSO-d6): 0,87 (t, 3H,
H_{1}, J_{1,2} = 5,31 Hz), 1,25 (m, 24H, H_{2}), 1,83 (m, 4H,
H_{3}, H_{8}), 2,39 (m, 2H, H_{4}), 3,57 (m, 4H, H_{7},
H_{9}), 4,41 (s, 2H, H_{14,15}), 5,50 (m, 1H, H_{12}).
RMN-C^{13}: 14,31 (C_{1}), 22,96 (C_{2}), 26,
35 (C_{8}), 29,99 (C_{3}), 36, 79 (C_{4}), 37,14 (C_{7}),
92,18 (C_{12}), 173,42 (C_{5}), 175, 22 (C_{11}).
EM-ES: [M+H]^{+} calculado = 387,5; hallado
= 387, 2.
Se obtiene una mezcla homogénea de
hidrazinopéptidos por dilución individual de cada ingrediente en
agua o en ácido acético diluido, mezclado de las soluciones y
liofilización posterior. Se realiza una primera síntesis empleando
9,6 mg de una mezcla equiponderal de cada uno de los 5 péptidos VIH
(VIH 1 HzAc; VIH 2 HzAc; VIH 3 HzAc; VIH 4 HzAc y VIH 5 HzAc),
correspondiente a un valor de 2,22 micromoles de péptidos (teniendo
en cuenta los contraiones y de la concentración de los péptidos en
el liofilizado). Se añaden a esta mezcla 85 \mul de agua, de ello
resulta la formación de un gel. Entonces se añade el vector lipófilo
IIIa (977 \mug, 2,52 \mumoles) con agitación magnética con
esferillas de vidrio de 5 mm de diámetro, es decir, 1,14
equivalentes con respecto a los péptidos, en solución en 714 ml de
2-metil-propan-2-ol.
Se alcanza el volumen total de la mezcla reaccionante (1,7 ml) por
adición de
2-metil-propan-2-ol.
La desaparición de los hidrazinopéptidos con el
tiempo lleva asociada la aparición paralela de los lipopéptidos
correspondientes.
Se realiza un ensayo micropreparativo con el fin
de identificar los productos: se saca una muestra para realizar la
separación de los constituyentes por RP-HPLC en una
columna C3 (Zorbax, 4,6 mm x 250 mm), con recogida de los picos
principales con el fin de identificarlos por espectrometría de masas
MALDI-TOF (MALDI-TOF Voyager ABI
4192, modo positivo, reflector 25 kV, intervalo de extracción 300
ms, matriz de ácido \alpha-cianocinámico).
Después de 4 horas, la reacción ha finalizado,
entonces se diluye la mezcla con agua, se congela y se liofiliza.
Los lipopéptidos obtenidos se presentan en forma de polvo blanco. El
tiempo de retención (ret.) de los lipopéptidos obtenidos se recoge
en la siguiente tabla III.
Se disuelven los lipopéptidos en forma de sales
de TFA en una solución acuoso de ácido acético de pH 3, se
introducen en la columna de RP-HPLC (columna
Nucleoprep C4, 25 mm x 100 mm), se lavan con el mismo disolvente
(los lavados se efectúan con un volumen equivalente al de 5
columnas) y se eluyen mediante un paso sin transición hacia un
disolvente ácido acético de pH 3 en
agua/propan-2-ol (60:40).
Se disuelve la mezcla de lipopéptidos
liofilizados en una solución de ácido acético al 10% y después se
somete a una filtración esterilizante a través de una membrana de
0,22 micras (SLGV, Millipore).
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la incorporación de los excipientes
clínicamente aceptables (manita/lipopéptidos 10/1 (p/p) y
Polisorbato 80/lipopéptidos 2/7 (p/p)) se diluye la solución en
agua y se divide en partes alícuotas en viales de vidrio estériles
antes de la liofilización final.
Las dosis unitarias de vacuna destinadas al
ensayo clínico de fase I para el hombre son de 2,5 mg de cóctel
lipopeptídico.
Se preparan tres péptidos, derivados de la
proteína NS3 del virus VHC-1, funcionalizados con
grupos \alpha-hidrazinoacéticos a nivel de su
extremo N-terminal. Se sintetizan estos
hidrazinopéptidos en fase sólida, en forma de sales
trifluoracetato. Se aplican las estrategias
Fmoc/tert-butilo (convencional) y el procedimiento
descrito recientemente (ácido
N,N',N'-tri(tert-butiloxicarbonil)-hidrazinoacético)
para introducir de modo específico un grupo hidrazinoacetilo en el
grupo \varepsilon-amino desprotegido del resto
lisilamida en posición N-terminal del modo descrito
en el ejemplo 1. Según las secuencias, los rendimientos de la
síntesis se sitúan entre el 10 y el 50%.
Se verifica la identidad de los péptidos por
EM-ES. Se someten los hidrazinopéptidos a un
análisis para determinar la composición de aminoácidos después de
una hidrólisis ácida total con ácido clorhídrico: HCl 6N/fenol =
10/1 a 110ºC durante 24 h.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purifican los hidrazinopéptidos por
RP-HPLC en una columna preparativa C3 (columna
Zorbax: 300 \ring{A}, 5 \muM, diámetro = 12,5 mm y longitud =
250 mm, con columna previa) en un equipo HPLC Shimatzu 6A. Los
análisis de RP-HPLC se realizan en una columna
preparativa C3 (columna Zorbax:300 \ring{A}, 5 \muM, diámetro =
4,6 mm y longitud = 250 mm) en un equipo HPLC Shimatzu 10A.
Los eluyentes (disolventes A y B) son los
siguientes:
- disolvente A: agua desionizada que contiene un
0,05% de TFA,
- disolvente B (purificación): 0,05% de TFA en
un mezcla propan-2-ol/H_{2}O
(40:60).
- disolvente B (con reacción posterior): 0,05%
de TFA en una mezcla de n-propanol/H_{2}O
(40:60).
El caudal de elución es de 1 ml/min empleando un
gradiente lineal del 0 al 100% de tampón B en 30 minutos, 100% de
tampón B durante 5 minutos, 0% de tampón B durante 10 minutos
(detección a 215 nm, temperatura: 50ºC). Les hidrazinopéptidos
obtenidos se recogen en la siguiente tabla IV.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los tiempos de retención de los
hidrazinopéptidos se indican en la siguiente tabla V.
La síntesis de este vector IIIa, compuesto por
un grupo palmitoílo y por un grupo glioxililo, se describe en el
ejemplo 1.
Se obtiene una mezcla homogénea de
hidrazinopéptidos por dilución individual de cada ingrediente en
agua o en ácido acético diluido, mezclado de estas diluciones y
después liofilización. Se realiza una primera síntesis empleando
41,8 mg de una mezcla equiponderal de cada uno de los 3
hidrazinopéptidos, correspondiente a un valor de 10,77 micromoles
de hidrazinopéptidos (teniendo en cuenta los contraiones y la
concentración de los péptidos en los liofilizados). A esta mezcla
se le añaden 415 \mul de agua, formándose un gel. Entonces se
añade el vector lipófilo IIIa (4757 \mug, 12,28 \mumoles, que
corresponden a 1,14 equivalentes referidos a los péptidos) con
agitación magnética con algunas esferillas de vidrio de 5 mm de
diámetro y se solubilizan en 950 \mul de
2-metil-propan-2-ol.
Se alcanza el volumen total de mezcla reaccionante (8,290 ml) por
adición de
2-metil-propan-2-ol.
La desaparición de los hidrazinopéptidos a lo
largo del tiempo va acompañada de la aparición paralela de los
lipopéptidos correspondientes.
Se realiza un ensayo micropreparativo para
identificar los productos: se saca una muestra para separar los
constituyentes por RP-HPLC en una columna C3
(Zorbax, 4,6 mm x 250 mm), recogiendo los picos principales con el
fin de identificarlos por espectrometría de masas
MALDI-TOF (MALDI-TOF Voyager ABI
4192, modo positivo, reflector 25 kV, intervalo de extracción: 300
ms, matriz de ácido
\alpha-ciano-cinámico).
Pasadas 4 horas, la reacción ha finalizado,
entonces se diluye la mezcla con agua, se congela y se liofiliza.
Los lipopéptidos obtenidos se presentan en forma de polvo
blanco.
Los lipopéptidos obtenidos tienen los tiempos de
retención que se indican en la siguiente tabla VI.
Esta síntesis se realiza a partir de la mezcla
de hidrazinopéptidos VHC obtenidos anteriormente con un
glucomimético ramificado de cuatro valencias (árbol
tetraquinoilado) obtenido a partir de un árbol de lisina sintetizado
mediante una estrategia Fmoc/tert-butilo, al que se
incorpora un grupo hidrazinoacetilo sobre el grupo
\varepsilon-amino desprotegido del resto
lisilamida C-terminal, de la fórmula (IV) de la
invención.
La síntesis de este glucomimético, llamado
[(Qui)_{4}AKHdz)], se describe en el ejemplo 2 de la
solicitud de patente nº PCT/FR01/02787).
Se obtiene una mezcla homogénea de
hidrazinopéptidos por dilución individual de cada ingrediente en
agua o ácido acético diluido, mezclado de las soluciones y
finalmente liofilización. Se añaden 8,9 mg de una mezcla
equiponderal de cada uno de los 3 hidrazinopéptidos, equivalente a
2,14 micromoles de hidrazinopéptidos, a 2,3 mg (es decir, 1,6
\mumoles) del glucomimético hidrazina. Al gel formado después de
la humidificación con 140 \mul de agua se le añade el vector
lipófilo IIIa (1640 microgramos, es decir, 1,14 equivalentes de
péptido) disuelto en
2-metil-propan-2-ol
(410 \mul), con agitación magnética y con algunas esferillas de
vidrio de 5 mm de diámetro, el volumen final es de 2,7 ml.
La desaparición de los hidrazinopéptidos a lo
largo del tiempo va acompañada de la aparición paralela de los
lipopéptidos correspondientes.
Pasadas 3 horas se diluye la mezcla con agua, se
congela y se liofiliza. Los lipopéptidos obtenidos se presentan en
forma de polvo blanco.
\vskip1.000000\baselineskip
Después del intercambio iónico descrito en el
ejemplo 1 se disuelven las mezclas de lipopéptidos liofilizados
obtenidas en 3) y 3') en una solución de ácido acético al 10% y
después se someten a una filtración esterilizante a través de una
membrana de 0,22 micras (SLGV, Millipore).
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la incorporación de los excipientes
clínicamente aceptables (manita/lipopéptidos 10/1 (p/p) y
Polisorbato 80/lipopéptidos 2/7 (p/p)) se diluye la solución con
agua y se divide en partes alícuotas en viales de vidrio estériles
antes de la liofilización final.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelve la mezcla liofilizada de
lipopéptidos y glucomimético lipidado [(Qui)_{4}AKHdz)] en
una solución de ácido acético al 10% y después se somete a una
filtración esterilizante a través de una membrana de 0,22 micras
(SLGV, Millipore).
Después de la incorporación de los excipientes
clínicamente aceptables (manita/lipopéptidos 10/1 (p/p)) se diluye
la solución con agua en un matraz estéril antes de la liofilización
final.
Las dosis unitarias de vacuna destinadas al
ensayo clínico de fase I para el hombre son de 2,5 mg de cóctel
lipopeptídico.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis es la misma que se ha descrito en el
ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purifican los hidrazinopéptidos por
RP-HPLC en una columna preparativa C3 (columna
Zorbax: 300 \ring{A}, 5 \muM, diámetro: 12,5 mm y longitud =
250 mm con columna previa) en un equipo HPLC Shimatzu 6A. Los
análisis de RP-HPLC se realizan en una columna
preparativa C3 (columna Zorbax: 300 \ring{A}, 5 \muM, diámetro =
4,6 y longitud = 250 mm) en un equipo HPLC Shimatzu 10A. Los
eluyentes (disolventes A y B) son los siguientes:
- disolvente A: agua desionizada que contiene un
0,05% de TFA,
- disolvente B: 0,05% de TFA en una mezcla
propan-2-ol/H_{2}O (40:60).
El caudal de elución es de 1 ml/min empleando un
gradiente lineal del 0 al 100% de tampón B en 30 minutos, 100% de
tampón B durante 5 minutos, 0% de tampón B durante 10 minutos
(detección a 215 nm, temperatura: 50ºC).
2) Síntesis del vector CChol
([3-(2,2-dihidroxi-acetilamino)-propil]-carbamato
de
17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo,
también en forma de "vector Cchol hidratado":
[3-(2-oxo-acetilamino)-propil]-carbamato
de
17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,
10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo).
10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo).
La síntesis de este vector ha sido descrita por
MELNYK y colaboradores en la solicitud de patente nº
PCT/FR01/
02787, ejemplo 4: síntesis del vector lipófilo "IIIc", correspondiente a la fórmula (II) de la presente invención.
02787, ejemplo 4: síntesis del vector lipófilo "IIIc", correspondiente a la fórmula (II) de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtiene una mezcla homogénea de
hidrazinopéptidos por dilución individual de cada ingrediente en
agua o en ácido acético diluido, mezclado de las soluciones y
después liofilización. Se realiza una primera síntesis empleando
12,2 mg de una mezcla equiponderal de cada uno de los 3 péptidos VHC
(VHC 1 HzAc; VHC 2 HzAc y VHC 3 HzAc), equivalente a 2,96
micromoles de péptidos (teniendo en cuenta los contraiones y la
concentración de los péptidos en los liofilizados). A esta mezcla
se le añaden 115 \mul de agua, formándose un gel. Entonces se
añade el vector lipófilo II (1926 \mug, 3,374 \mumoles, que
corresponden a 1,14 equivalentes referidos a los péptidos) con
agitación magnética con algunas esferillas de vidrio de 5 mm de
diámetro, solubilizado en 292 \mul de
2-metil-propan-2-ol.
Se alcanza el volumen total de la mezcla reaccionante (2,3 ml) por
adición de
2-metil-propan-2-ol.
La desaparición de los hidrazinopéptidos en el
curso del tiempo va acompañada de la aparición paralela de los
lipopéptidos correspondientes.
Se realiza un ensayo micropreparativo para
identificar los productos: se saca una muestra para separar los
constituyentes por RP-HPLC en una columna C3
(Zorbax, 4,6 mm x 250 mm), recogiendo los picos principales con el
fin de identificarlos por espectrometría de masas
MALDI-TOF (MALDI-TOF Voyager ABI
4192, modo positivo, reflector: 25 kV, intervalo de extracción 300
ms, matriz: ácido
\alpha-ciano-cinámico). Pasadas 4
horas, la reacción ha finalizado, entonces se diluye la mezcla con
agua, se congela y se liofiliza. Los lipopéptidos obtenidos se
presentan en forma de polvo blanco.
En la siguiente tabla VII se recogen los tiempos
de retención de los lipopéptidos obtenidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtiene una mezcla homogénea de
hidrazinopéptidos por dilución individual de cada ingrediente en
agua o en ácido acético diluido, mezclado de las soluciones y
después liofilización. Se realiza esta síntesis a partir de la
mezcla de hidrazinopéptidos con el glucomimético ramificado de
cuatro valencias [(Qui)_{4}AKHdz)]. Se añaden 12 mg de una
mezcla equiponderal de cada uno de los 3 hidrazinopéptidos
(descritos en 3)), correspondientes a 2,9 micromoles de
hidrazinopéptidos, a 3,3 mg (es decir, 2,2 \mumoles) del
glucomimético hidrazina. Al gel formado después de la
humidificación con 200 \mul de agua se le añade el vector lipófilo
(II) (3360 microgramos, es decir, 1,14 equivalentes de péptido)
disuelto en
2-metilpropan-2-ol
(510 \mul), con agitación magnética en unas pocas esferillas de
vidrio de 5 mm de diámetro. El volumen final de la mezcla
reaccionante es de 3,8 ml.
La desaparición de los hidrazinopéptidos en el
curso del tiempo va acompañada de la aparición paralela de los
lipopéptidos correspondientes.
Pasadas 4 horas se diluye la mezcla con agua, se
congela y se liofiliza. Los lipopéptidos obtenidos se presentan en
forma de polvo blanco.
Para los lipopéptidos CChol (con o sin
glucomimético) según 3) y 3') es necesario un paso suplementario de
purificación para eliminar una cantidad no despreciable de productos
previos de síntesis hidrazina que no hayan reaccionado.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Esta purificación de la mezcla reaccionante se
realiza por RP-HPLC en un equipo Shimadzu 6A, con
una columna C4 Deltapak WATERS 15 \muM 300 \ring{A}, 8 mm de
diámetro y 100 mm de longitud.
Los eluyentes (disolventes A y B) son los
siguientes:
- disolvente A: agua desionizada que contiene un
0,05% de TFA,
- disolvente B (purificación): 0,05% de TFA en
una mezcla propan-2-ol/H_{2}O
(40:60).
El caudal de la elución es de 2 ml/min empleando
un gradiente lineal del 0 al 80% de tampón B en 12 minutos, después
100% de tampón B. La fracción de lipopéptido eluido se congela y se
liofiliza.
\vskip1.000000\baselineskip
Después del intercambio iónico descrito en el
ejemplo 1 se disuelve las mezclas de lipopéptidos liofilizados
obtenidos en 3) y 3') en una solución de ácido acético al 10% y
después se someten a una filtración esterilizante a través de una
membrana de 0,22 micras (SLGV, Millipore).
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la incorporación de excipientes
clínicamente aceptables (manita/lipopéptidos 10/1 (p/p) y
Polisorbato 80/lipopéptidos 2/7 (p/p)) se diluye la solución de
lipopéptidos con agua en un matraz estéril y después se realiza la
liofilización final.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la incorporación de los excipientes
clínicamente aceptables (manita/lipopéptidos 10/1 (p/p)) se diluye
la solución de lipopéptidos y glucomimético lipidado con agua en un
matraz estéril y después se realiza la liofilización final.
Las dosis unitarias de vacuna destinadas al
ensayo clínico de fase I para el hombre son de 2,5 mg de cóctel
lipopeptídico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se lipidan con el vector Pam tres péptidos
derivados de la proteína NS3 del virus VHC-1,
funcionalizados con grupos
\alpha-hidrazinoacéticos a nivel de su extremo
N-terminal (véase el ejemplo 2) o de su extremo
C-terminal (ver procedimiento de síntesis del
ejemplo 1).
Se analiza la inmunogenicidad de estos
lipopéptidos en ratones singénicos Balb/c y C57bl/6 por inyección
subcutánea de los 3 lipopéptidos N-terminal o
C-terminal vector Pam (1,2 mg de la mezcla para
ratones, equivalentes a 100 \mug de lipopéptidos), o bien de 3
péptidos nativos (100 \mug para ratones) + montanida ISA 720, o
bien 3 péptidos nativos solos (100 \mug para ratones).
La medición de la linfoproliferación se realiza
después de cultivar las células de bazo murino, del modo indicado a
continuación:
Se recuperan los bazos y se incuban a 4ºC en un
medio RPMI 1640 (GIBCO BRL). A continuación se aplastan las células
contra una membrana de poliamida (nylon). Se centrifugan las células
a 1500 rpm a 4ºC durante 10 min. Se efectúa la lisis de los
hematíes en presencia de tampón de lisis a 4ºC durante 10 minutos.
Después se centrifugan las células y se recogen en un medio
HL-1 (Biowhittaker) que contiene un 4% de suero de
ratones autólogos. Después se reparten las células en placas de
cultivo de 96 hoyos de poliestireno, de fondo en forma de U
(Costar), a razón de 100 \mul por hoyo. Se diluyen los péptidos
sintéticos nativos (Néosystem) en un medio HL-1
(Biowhittaker) y después se añade a razón de 100 \mul por hoyo
hasta una concentración final de 25 \mug/ml. Se incuban las
placas de cultivo a 37ºC durante 72 horas en atmósfera húmeda y un
5% de CO2. Se diluye la metil-timidina tritiada
(Amersham) en un medio HL-1 (Amersham) y después se
añade a cada hoyo a razón de 1 \muCurie en 25 \mul. Después de
16 horas de incubación se recogen las células en un filtro de fibra
de vidrio (Wallac) con un equipo TOMTEC. La incorporación de la
timidina tritiada se determina seguidamente con un contador beta
(Wallac 140 microbeta).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los resultados de este análisis se recogen en la
siguiente tabla VIII.
Tablas VIIIa y VIIIb: medición de la
linfoproliferación (expresada como índice de estimulación).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de estos análisis indican que los
dos tipos de construcciones (posición N-terminal y
posición C-terminal) inyectados por vía subcutánea
a ratones singénicos Balb/c y C57bl/6 son capaces de inducir una
respuesta linfo-proliferativa específica de las
secuencias peptídicas del VHC.
Se ensayan los 3 lipopéptidos en posición
N-terminal empleados en A/para inducir una respuesta
humoral en los ratones. Se ensayan también a título comparativo los
3 péptidos nativos y la montanida ISA 720.
Se inmunizan los ratones por administración
subcutánea de 1,2 mg (equivalentes a 100 \mug de lipopéptidos,
vector Pam + manita + Tween o 100 \mug de una mezcla de péptidos
nativos en presencia de montanida). Se realiza la inmunización con
un recordatorio los días d15 y d29. Se extraen los sueros los días
d14, d28 y d42 después de la primera administración de los
antígenos.
La dosificación de las inmunoglobulinas
específicas de antígenos se efectúa del modo siguiente:
Se solubilizan los antígenos peptídicos en
tampón fosfato 0,1 M, de pH 8,2, en una concentración de 10
\mug/ml. Se introducen 100 \mul de esta solución por hoyo, en
una placa de 96 hoyos Maxisorb (NUNC). Después de la incubación a
4ºC durante una noche y dos lavados con tampón
PBS-Tween 0,01%, se saturan los hoyos en presencia
de un tampón PBS que contiene un 3% de albúmina de suero bovino
(BSA). Después de incubar a temperatura ambiente durante 2 horas se
realizan 2 lavados de los hoyos con tampón
PBS-Tween. A continuación se añaden 100 \mul de
de suero, diluido a razón de 1/100, y se incuban a 4ºC durante una
noche. Después se realizan 3 lavados con PBS-Tween.
Se incuba el anticuerpo secundario, marcado con peroxidasa
(anti-IgG (H+L) de ratón, Sanofi Pasteur), en
tampón PBS-BSA 1% a razón de 100 \mul por hoyo, a
temperatura ambiente durante una hora. Después de 4 lavados con
PBS-Tween, se realiza el revelado en presencia de
diclorhidrato de ortofenildiamina (OPD, SIGMA) diluido en tampón de
revelado (tampón fosfato-citrato con perborato
sódico, SIGMA). Después de una incubación de 30 minutos en la
oscuridad se interrumpe la reacción la reacción con HCl 1M, a razón
de 50 \mul por hoyo.
La lectura se realiza a una longitud de onda de
492 nm.
Los resultados se recogen en la siguiente tabla
IX.
Los resultados demuestran que los lipopéptidos
utilizados son incapaces de inducir una respuesta humoral
caracterizada por la producción de anticuerpos específicos en los
mismos modelos murinos después de una inmunización seguida por dos
recordatorios. Este resultado es tanto más original por el hecho de
que estas mismas secuencias, cuando se administran en presencia de
un adyuvante aceitoso, como es la montanida ISA 720n, inducen una
respuesta de anticuerpos muy importante, detectable a partir de la
primera inmunización. Este resultado indica que los lipopéptidos
orientan la inmunidad muy intensamente hacia una respuesta de tipo
celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha evaluado la inmunogenicidad de las mezclas
de lipopéptidos en los ratones. Se han comprobado diferentes
formulaciones indicadas en los anteriores ejemplos 2 y 3 (3
lipopéptidos, vector Pam; 3 lipopéptidos + glucomimético, vector
Pam; 3 lipopéptidos, vector CChol; 3 lipopéptidos + glucomimético,
vector CChol).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizan los ratones por vía sublingual con
480 \mug de cada mezcla lipopeptídica disuelta en 5 \mul de
agua para la preparación inyectable (H_{2}O ppi). Se administra
una dosis de recordatorio a los 14 días de la primera inmunización
en las mismas condiciones que antes. Después de 14 días se
sacrifican los animales, se les extraen los bazos y se cultivan las
células esplénicas en presencia de diferentes péptidos nativos,
solos o en forma de mezcla, con una concentración de 10
\mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuban los anticuerpos primarios específicos
de la IL-2 murina (IL-2 de rata
anti-ratón, Pharmingen 18161D) en tampón fosfato
0,1M, pH 8,2, en una concentración de 2 \mug/ml. Se añaden 50
\mul por hoyo de esta solución a una placa de 96 hoyos Maxisorb
(NUNC). Después de una incubación a 4ºC durante una noche y dos
lavados con tampón PBS-Tween 0,01%, se saturan los
pozos en presencia de un tampón PBS que contiene un 3% de albúmina
de suero bovino (BSA). Después de 2 horas de incubación a
temperatura ambiente se realizan 2 lavados con tampón
PBS-Tween. Se añaden a continuación 100 \mul de
líquido sobrenadante del cultivo y se incuban a 4ºC durante una
noche. Se prepara una gama de diluciones de la IL-2
murina recombinante en PBS-BSA 1% (de 20 ng a 0,3
\mug) y se depositan en cada hoyo 100 \mul de esta preparación.
A continuación se efectúan 3 lavados con
PBS-Tween.
Se incuba el anticuerpo secundario biotinilado
específico de la IL-2 murina (IL-2
de rata biotininilada anti-ratón, Pharmingen
18172D) en tampón PBS-BSA 1% a razón de 100 \mul
por hoyo a temperatura ambiente durante una hora. Después de 3
lavados con PBS-Tween, se añade a cada hoyo la
estreptavidina-peroxidasa (Jackson Immunoresearch),
diluida con PBS-Tween hasta 1 mg/ml, en un volumen
de 100 \mul, a temperatura ambiente, durante 30 minutos. Después
de 4 lavados con PBS-Tween, se realiza el revelado
en presencia del diclorhidrato de la ortofenildiamina (OPD, SIGMA)
diluido en tampón de revelado (tampón
fosfato-citrato con perborato sódico, SIGMA).
Después de una incubación de 30 minutos en la oscuridad se
interrumpe la reacción con HCl 1M, a razón de 50 \mul por hoyo.
Se realiza la lectura a una longitud de onda de 492 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizan los ratones (Balb/c) por
administración sublingual de 5 \mul de una mezcla de lipopéptidos
(480 \mug de polvo, equivalentes a aprox. 40 \mug de
lipopéptidos). Se realiza una administración de recordatorio a los
14 días de esta primera inmunización, con las mismas cantidades de
la mezcla de lipopéptidos. Se forman grupos de 5 ratones Balb/c
(IFFA-CREDO) a los que se administra cada una de las
cuatro formulaciones: [3 lipopéptidos + glucomimético, vector
CChol]; [3 lipopéptidos, vector CChol]; [3 lipopéptidos +
glucomimético, vector Pam]; [3 lipopéptidos + glucomimético, vector
Pam].
Se sacrifican los ratones 7 días de la
administración del recordatorio, se les extraen los bazos y se
reagrupan por grupos de animales.
Se reestimulan las células de cada grupo de
ratones con diferentes péptidos nativos, ya sea a título individual,
ya sea en forma de mezcla (concentración: 10 \mug/ml). 24 horas
después del inicio del cultivo de las células, se sacan los
líquidos sobrenadantes para efectuar la dosificación de su contenido
en IL-2. Los resultados se expresan en picogramos
de IL-2 por ml de líquido sobrenadante.
En la siguiente tabla X se recogen los
resultados del análisis de la inmunogenicidad de diferentes mezclas
lipopeptídicas en los ratones.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que
los lipopéptidos, resultantes de la lipidación con el vector CChol,
inducen una respuesta mejor que los lipopéptidos resultantes de la
lipidación con el vector Pam.
Se constata que estos lipopéptidos CChol son
especialmente inmunógenos cuando se administran por vía mucosa y
muy especialmente por vía sublingual.
\vskip1.000000\baselineskip
En el ejemplo 1 de la solicitud de patente
PCT/FR01/02787 se describe la síntesis de péptidos funcionalizados
con grupos \alpha-hidrazinoacéticos, a partir de
secuencias peptídicas derivadas de proteínas Nef y Gag del virus de
la inmunodeficiencia símica (SIV).
Las secuencias peptídicas aquí utilizadas son
las mismas que las descritas en la solicitud de patente
PCT/FR01/
02787, excepto la secuencia SIV1 (véase la nueva secuencia en la siguiente tabla XI).
02787, excepto la secuencia SIV1 (véase la nueva secuencia en la siguiente tabla XI).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El vector lipófilo que se emplea es el vector
IIIa descrito en el ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En el ejemplo 8 de la solicitud de patente
PCT/FR01/02787 se describe el método de unión entre
hidrazinopéptidos y vector lipófilo.
En la siguiente tabla XII se recogen las
denominaciones y los pesos moleculares de los lipopéptidos
sintetizados de este modo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Después del intercambio iónico descrito en el
ejemplo 1 por RP-HPLC, empleando un gradiente corto,
se disuelven las mezclas de lipopéptidos liofilizados resultantes
de 3) en una solución de ácido acético al 5% y después se someten a
una filtración esterilizante a través de una membrana de 0,22 micras
(SLGV, Millipore).
\vskip1.000000\baselineskip
Después del paso 4) se introduce la manita y
también el Tween 80 en una cantidad suficiente para la preparar 10
dosis unitarias, cuya composición por dosis es la siguiente:
\bullet 1 dosis contiene 3,5 mg de equivalente
péptido (0,5 mg por péptido), es decir, aprox. 4,2 mg de
lipopéptido.
\bullet manita libre de pirógenos: aprox. 42
mg por dosis.
\bullet Polisorbato 80: aprox. 1 mg por
dosis.
\bullet cantidad total de polvo por dosis:
aprox. 47 mg.
\bullet Conservar a -20ºC.
La posterior disolución de las dosis obtenidas
según esta formulación permite obtener una solución ligeramente
opalescente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara la mezcla por lipidación simultánea
(descrita en el ejemplo 3, parte 3')) de una mezcla de
hidrazinopéptidos (trifluoracetato) (5,8 mg por hidrazinopéptido)
al que se añade un glucomimético ramificado
([(Qui)_{4}AKHdz)], 12,9 mg).
Después de la lipidación se diluye la mezcla y
se liofiliza. Se reeemplaza el contraión trifluoracetato por un
contraión acetato mediante RP-HPLC, aplicando un
gradiente corto.
Después de la liofilización se disuelve el polvo
en agua y ácido acético del 5%; después se somete la preparación a
una filtración esterilizante a través de una membrana de 0,22 micras
(SLGV, Millipore). Se introduce la manita en una cantidad
suficiente para la preparación de 11 dosis unitarias, cuya
composición por dosis es la siguiente:
\bullet 1 dosis contiene 3,4 mg de equivalente
péptido + glucomimético (0,5 mg por péptido), es decir, 4,2 mg de
lipopéptido.
\bullet manita libre de pirógenos: aprox. 42
mg por dosis.
\bullet cantidad total de polvo por dosis:
aprox. 47 mg.
\bullet Conservar a -20ºC.
La posterior disolución de las dosis obtenidas
con arreglo a esta formulación proporciona una solución ligeramente
opalescente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se emplea una dosis unitaria por animal, que se
aplica por inyección. Se diluye la dosis en agua para preparar el
inyectable (1 ml por dosis): se obtiene una solución
opalescente.
Se administra el producto (sin adyuvante) por
vía intradérmica en 10 puntos de inyección (100 \mul por punto)
(4 macacos), por vía intramuscular (4 macacos). Se efectúan las 3
inyecciones a intervalos de 3 semanas y se practica una
administración 2 meses después de la última inyección. Se comprueba
la respuesta inmune con extracciones de sangre efectuadas en la
fase de pre-inmunización, 15 días después la 3ª
inmunización y 14 días después del recordatorio.
Se comprueba la eficacia de la inmunización
evaluando el número de efectores circulantes y de sus precursores
segregadores del interferón gamma (IFN-\gamma)
mediante un ensayo ELISPOT después de una reestimulación previa
"in vitro" de las células mononucleadas de sangre total
(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells) por acción de los
péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aíslan las PBMC por centrifugación en
gradiente en un medio de separación de linfocitos (Flow
Laboratories, Glasgow, UK o Pharmacia, Upsala, Suecia) y se
utilizan inmediatamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se depositan las PBMC (16.106 células) en un
medio RPMI 1640 completo a razón de 5 millones/ml; y se dividen en
partes alícuotas en 4 tubos de 4 millones de células, que se incuban
a 37ºC durante una noche con los lipopéptidos (10 \mug/ml).
Se establecen varias castas:
- -
- casta 0: sin péptidos;
- -
- casta 1: con VIS1 HzPam (LP1) y VIS2 HzPam (LP2);
- -
- casta 2: con VIS3 HzPam (LP3), VIS4 HzPam (LP4) y VIS5 HzPam (LP5);
- -
- casta 3: con VIS6 HzPam (LP6) y VIS7HzPam (LP7).
Después de 1 lavado al día siguiente se
introducen las castas en placas de 24 hoyos, a razón de 2 millones
de células por ml y a razón de 2 ml por hoyo. En los días 3 y 7 se
añade la interleucina-2 (IL-2, 10
UI/ml) cambiando el medio en el día 7. Se comprueban estos
efectores al cabo de 12 días de cultivo y se lavan 2 veces
inmediatamente antes del ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar se estabilizan placas de 96
hoyos de nitrocelulosa (Millipore) a 4ºC durante una noche con un
anticuerpo monoclonal de ratón
anti-IFN-\gamma símico (clon
GZ-4, de mabtech) (dilución 1/1000 en tampón
fosfato (PBS): concentración 1 microgramo/ml al final). Después de
los lavados con tampón PBS estéril y saturación con el medio
completo a 37ºC en atmósfera de CO_{2} durante 2 horas, se
disponen las células efectoras por duplicado (100000 células por
hoyo) con los diferentes péptidos (ver párrafo siguiente), sin
IL-2, con una concentración final de 5 microgramos
por ml (o sin péptido para los controles negativos). Se mantiene la
incubación a 37ºC durante 24 horas. Entonces se lavan las placas
varias veces con PBS y después con PBS-Tween 0,05%.
Después de estos lavados se incuban las placas a 4ºC durante una
noche o a 37ºC durante 2 horas, con un anticuerpo monoclonal de
ratón anti anti-IFN-\gamma símico
biotinilado, diluido hasta 1/1000 con PBS-Tween
0,05%; BSA 1% (clon 7-B6-1, de
mabtech, 1 microgramo/ml final).
Después de varios lavados se realiza el revelado
mediante estreptavidina-fosfatasa alcalina (SIGMA) a
razón de 2,5 microgramos por ml (incubación: 1 h a temperatura
ambiente). Después de los lavados suplementarios se revela
formándose una coloración medible con un sustrato de azul nitro de
tetrazolio (BioRad) durante un tiempo de 15 a 30 minutos. Se
enjuagan las placas con agua y se secan. Se realiza la lectura del
ensayo contando las manchas (centro contrastado y contorno difuso)
con un estereomicroscopio x 40 (Leica MZ6). Cada mancha violeta
corresponde a una célula secretora de IFN-\gamma,
es decir, una SFC (Spot Forming Cell).
Mezclas de péptidos pequeños empleados para el
ensayo ELISPOT: (mezclas de
9-15-meros):
- \quad
- L3.P1 (epítopes de nef 155-178) = 156-165; 168-177; 165-174
- \quad
- L3.P2 (epítopes de nef 155-178) = 157-165; 169-178; 166-174
- \quad
- L3.P3 (epítopes de nef 155-178) = 158-167; 162-171; 167-175
- \quad
- L4.P1 (epítopes de nef 201-225) = 201-211; 205-213; 211-219; 215-225
- \quad
- L4.P2 (epítopes de nef 201-225) = 201-210; 205-212; 214-223; 210-219
- \quad
- L4.P3 (epítopes de nef 201-225) = 203-211; 206-215; 215-223; 204-212
- \quad
- L5.P1 (epítopes de nef 221-247) = 222-229; 236-244; 225-233
- \quad
- L5.P2 (epítopes de nef 221-247) = 224-233; 239-247. Mix6 (epítopes de nef 201-225) = 201-211; 205-213;
- \quad
- 211-219; 215-225; 201-210; 205-212
- \quad
- L7P1 (epítopes de gag 246-281) = 250-257; 255-263; 261-269; 268-276; 253-262
\vskip1.000000\baselineskip
En la siguiente tabla XIII se indican para cada
animal las mezclas de péptidos que permiten detectar las SFC de
manera significativa 15 días después de la 3ª inmunización o 14 días
de la administración del recordatorio.
El 1er grupo (macacos nº 1053, 1059, 1060, 1066)
recibe la mezcla de los 7 lipopéptidos administrada por vía
intradérmica. Los resultados demuestran respuestas positivas de 2
macacos (1053 y 1066), que reconocen 1 conjunto (pool) de péptidos
pequeños cada uno. Estas respuestas son visibles 15 días después de
la última inmunización.
El 2º grupo (macacos nº 1051, 1062, 1068, 1077)
reciben la mezcla de los 7 lipopéptidos administrada por vía
intramuscular. Tres de los 4 macacos presentan respuestas CD8 contra
1 conjunto de péptidos pequeños (2 macacos nº 1051 y 1062), el 3º
efectúa respuestas dirigidas contra 3 conjuntos (macaco nº 1077).
Estas respuestas eran visibles 15 días después de la última
inmunización en el caso de los macacos 1051 y 1062 y 15 días después
del recordatorio en el caso de los macacos 1051, 1062 y 1077.
Los resultados detallados obtenidos con la casta
2 derivada del animal 1051 se representan en la figura 1.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> INSTITUT PASTEUR DE LILLE
\hskip1cm CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE (CNRS)
\hskip1cm SOCIÉTÉ D'ÉTUDES ET DE DEVELOPPEMENT
DES ANTIGÈNES
\hskip1cm COMBINATOIRES (SEDAC
THERAPEUTICS)
\hskip1cm INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ y DE
LA RECHERCHE MÉDICALE (INSERM)
\hskip1cm UNIVERSITÉ DE LILLE II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Utilización de mezclas de
lipopéptidos para la fabricación de vacunas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D21144
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/FR 03/00 821
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-03-14
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 02/03 189
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-03-14
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 1 HzAc,
derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 2 HzAc,
derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 3 HzAc,
derivado de la proteína Pol
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 4 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 5 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico, derivado de la
proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VHC 1 HzAc,
derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico, derivado de la
proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VHC 2 HzAc,
derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico, derivado de la
proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VHC 3 HzAc,
derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 1 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 2 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 3 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 4 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 5 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Acetilación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 6 HzAc,
derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 7 HzAc,
derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> INSTITUT PASTEUR DE LILLE
\hskip1cm CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE (CNRS)
\hskip1cm SOCIÉTÉ D'ÉTUDES ET DE DEVELOPPEMENT
DES ANTIGÈNES COMBINATOIRES (SEDAC THERAPEUTICS)
\hskip1cm INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ y DE
LA RECHERCHE MÉDICALE (INSERM)
\hskip1cm UNIVERSITÉ DE LILLE II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Utilización de mezclas de
lipopéptidos para la fabricación de vacunas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D21144
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/FR 03/00 821
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 02/03 189
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 1 HzAc,
derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 2 HzAc,
derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 3 HzAc,
derivado de la proteína Pol
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 4 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIH 5 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico, derivado de la
proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VHC 1 HzAc,
derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico, derivado de la
proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm50
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VHC 2 HzAc,
derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico, derivado de la
proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm52
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VHC 3 HzAc,
derivado de la proteína NS3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 1 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm54
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 2 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm55
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 3 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm56
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 4 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm57
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 5 HzAc,
derivado de la proteína Nef
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Acetilación
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm58
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 6 HzAc,
derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm59
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Antígeno peptídico VIS 7 HzAc,
derivado de la proteína Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Lípido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto palmitoílo unido al aminoácido
mediante un espaciador que contiene un enlace hidrazona
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm60
Claims (24)
1. Utilización de una mezcla que contiene por lo
menos lipopéptidos para la fabricación de una vacuna,
caracterizada porque dichos lipopéptidos están constituidos
por un compuesto peptídico unido mediante un enlace hidrazona por
lo menos con un vector lipófilo de naturaleza no peptídica, y se
ajustan a la siguiente fórmula general (I):
(I)[((R^{1})(R^{2})_{i})D-H]_{j}-P
en la que
(R^{1})(R^{2})_{i}D significa un vector lipófilo, en el
que:
- i significa el número 0 ó 1,
- en el caso, en el que i sea igual a 0, D
significa un enlace,
- en el caso, en el que i sea igual a 1, D
significa un heterociclo saturado, insaturado o aromático, mono- o
policíclico,
- R^{1} y R^{2}, que pueden ser idénticos o
diferentes, significan en cada caso un resto de la fórmula
L-f-E-f', en la que
L significa el resto de un lípido, E significa un tramo espaciador y
f y f' significan grupos funcionales ligantes, respectivamente, L
con E y E con D, y
- P significa el compuesto peptídico,
- H significa el enlace hidrazona formado por
ligación en solución entre un grupo funcional aldehído perteneciente
al vector lipófilo y un grupo funcional derivado de hidrazina
perteneciente al compuesto peptídico,
- j significa un número de 1 a 3.
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque i es igual a 0, j es igual a 1 y porque
L significa un esterol, un derivado de esterol o una cadena
carbonada saturada o insaturada, lineal o ramificada, que contiene
entre 4 y 30 átomos de carbono.
3. Utilización según la reivindicación 2,
caracterizada porque dicho derivado de esterol es un derivado
del colesterol y porque dicha cadena carbonada se ajusta al fórmula
CH_{3}-(CH_{2})_{14}-.
4. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 3, caracterizada porque E significa
una cadena carbonada lineal, ramificada o cíclica, saturada o
insaturada, que lleva de 1 a 18 átomos de carbono y, eventualmente,
1 a 16 heteroátomos y/o de 1 a 7 grupos elegidos entre los grupos
carbonilo, heterociclo, heteroarilo, carbociclo y arilo.
5. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 4, caracterizada porque f significa
un enlace -CONH- o -CO-O- y f' significa un enlace
-NH-CO- u -O-CO-.
6. Utilización según la reivindicación 5,
caracterizada porque el vector lipófilo se ajusta a la
fórmula (II):
7. Utilización según la reivindicación 5,
caracterizada porque el vector lipófilo se ajusta a la
fórmula (III):
en la que L tiene el significado
definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a
3.
8. Utilización según la reivindicación 7,
caracterizada porque L significa una cadena carbonada de la
fórmula
CH_{3}-(CH_{2})_{14}-
en la fórmula
(III).
9. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 8, caracterizada porque el compuesto
peptídico P se elige entre el grupo formado por un o varios
antígenos peptídicos y un o varios glucomiméticos dendrímeros de
naturaleza peptídica.
10. Utilización según la reivindicación 9,
caracterizada porque el antígeno peptídico se elige entre el
grupo formado por los péptidos y les derivados de péptidos que
incluyen a los glucopéptidos y los pseudopéptidos.
11. Utilización según la reivindicación 9,
caracterizada porque el glucomimético dendrímero de
naturaleza peptídica se ajusta a la siguiente fórmula general
(IV):
(IV)(B^{2}M)_{m}(XN)_{n}A
en la
que:
- B^{2} se ajusta a una o varias de las
siguientes fórmulas generales (a) o (b):
en las que R_{1}, R_{2},
R_{3} y R_{4} con independencia entre sí significan un átomo de
hidrógeno o un grupo protector, y en la que W significa un enlace o
una cadena carbonada lineal, ramificada o cíclica, saturada o
insaturada, que tiene de 1 a 18 átomos de carbono y eventualmente de
1 a 12 átomos elegidos entre oxígeno, azufre y nitrógeno, dicha
cadena carbonada está eventualmente sustituida por
1-16 átomos de
halógeno,
- X significa el resto de un oligopéptido X' que
contiene de 1 a 6 aminoácidos,
- A significa el resto de un compuesto A' por lo
menos trifuncional que contiene una serie de aminoácidos, idénticos
o diferentes, elegidos entre el grupo formado por la lisina, la
hidroxilisina, la serina, la treonina, la cisteína, la ornitina, el
ácido aspártico y el ácido glutámico,
- m es un número entero comprendido entre 1 y
32,
- n es un número entero comprendido entre 0 y
32, y
- M y N representan en cada caso un grupo de
enlace, respectivamente entre B^{2} y A cuando n = 0 o entre
B^{2} y X cuando n es diferente de 0, y entre X y A cuando n es
diferente de 0, y con independencia entre sí contienen un grupo
funcional elegido entre oxima, hidrazona, amida, éster, tioéster,
hidrazida, hidroxamato, éter, tioéter, amina, carbonato, carbamato,
tiocarbonato, tiocarbamato, urea, tiourea y tiazolidina.
12. Utilización según la reivindicación 11,
caracterizada porque el compuesto de la fórmula general (IV)
es tal que m es un número entero comprendido entre 4 y 16, n es un
número entero comprendido entre 2 y 8, X significa el resto de un
oligopéptido que tiene de 2 a 4 restos aminoácido, mientras que A
significa el resto de un eslabonamiento que tiene de 2 a 8 restos
lisina y se presenta en forma de dendrímero, y B^{2} significa el
resto de uno o varios compuestos elegidos entre el ácido
(-)-shikímico y el ácido
(-)-quínico.
13. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 12, caracterizada porque la mezcla de
lipopéptidos contiene de 1 a 20 lipopéptidos diferentes, con
preferencia de 1 a 10 lipopéptidos diferentes.
\newpage
14. Utilización según la reivindicación 13,
caracterizada porque los lipopéptidos están en forma de
micelas mixtas.
15. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 14, caracterizada porque el compuesto
peptídico está formado por un antígeno derivado de un agente
infeccioso o de un cáncer.
16. Utilización según la reivindicación 15,
caracterizada porque el agente infeccioso es de tipo
bacteriano, parasitario o vírico.
17. Utilización según la reivindicación 16,
caracterizada porque el agente infeccioso de tipo vírico es
el VIH o el VHC.
18. Utilización según la reivindicación 17,
caracterizada porque el compuesto peptídico es una secuencia
procedente de las proteínas Gag, Pol o Nef del virus VIH.
19. Utilización según la reivindicación 18,
caracterizada porque la mezcla de lipopéptidos contiene por
lo menos dos secuencias procedentes de las proteínas Gag, Pol y Nef
del virus HIV.
20. Utilización según la reivindicación 19,
caracterizada porque la mezcla de lipopéptidos contiene una
mezcla de lipopéptidos, cuyos péptidos tienen las secuencias:
- Gag 17-35
- Gag 253-284
- Pol 325-355
- Nef 66-97 y
- Nef 116-147.
21. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la vacuna
se formula para la administración a las mucosas, por vía
transdérmica o por vía intramuscular.
22. Utilización según la reivindicación 21,
caracterizada porque la mezcla contiene además uno o varios
excipientes clínicamente aceptables.
23. Utilización según la reivindicación 22,
caracterizada porque el excipiente es la manita o el
Polisorbato 80 o una mezcla de ambos.
24. Utilización según la reivindicación 17,
caracterizada porque los compuestos peptídicos P del agente
infeccioso VHC están formados por las secuencias peptídicas
siguientes:
- VHC 1 HzAc:
- \quad
- H-K(COCH_{2}NHNH_{2})GREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2
\vskip1.000000\baselineskip
- VHC 2 HzAc:
- \quad
- H-K(COCH_{2}NHNH_{2})GHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2
\vskip1.000000\baselineskip
- VHC 3 HzAc:
- \quad
- H-K(COCH_{2}NHNH_{2})GAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2.
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|---|---|---|---|
| FR0203189A FR2837104B1 (fr) | 2002-03-14 | 2002-03-14 | Utilisation de melange de lipopeptides pour la fabrication de vaccins |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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