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ES2320431T3 - Compuestos de captura, colecciones de los mismos y metodos para analizar el proteoma y composiciones complejas. - Google Patents

Compuestos de captura, colecciones de los mismos y metodos para analizar el proteoma y composiciones complejas. Download PDF

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ES2320431T3
ES2320431T3 ES02807357T ES02807357T ES2320431T3 ES 2320431 T3 ES2320431 T3 ES 2320431T3 ES 02807357 T ES02807357 T ES 02807357T ES 02807357 T ES02807357 T ES 02807357T ES 2320431 T3 ES2320431 T3 ES 2320431T3
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ES
Spain
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capture
collection
compounds
quad
biomolecules
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ES02807357T
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English (en)
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Hubert Koster
Suhaib Siddiqi
Daniel P. Little
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Original Assignee
caprotec bioanalytics GmbH
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Abstract

Una colección de compuestos de captura, que comprende una pluralidad de compuestos de captura diferentes, donde cada compuesto de captura en la colección tiene la fórmula: ** ver fórmula** en la que: m es un número entero que es de 1 a 100; n es un número entero de 1 a 100; la colección incluye al menos 10 compuestos de captura diferentes; el resto X se selecciona para unirse covalentemente a biomoléculas; el resto Y modula una o más de las propiedades de afinidad, propiedades estéricas y propiedades electrónicas del compuesto de captura aumentando de esta manera la selectividad de la unión mediante X de tal forma que el compuesto de captura se una a menos biomoléculas cuando el resto de selectividad Y está presente que en su ausencia; el resto Q permite la separación o inmovilización de los compuestos de captura en la colección; y el resto Z para presentar X, Y y Q; Z es un derivado de tritilo para presentar los restos funcionales X, Y y Q; y Z tiene la fórmula: ** ver fórmula**

Description

Compuestos de captura, colecciones de los mismos y métodos para analizar el proteoma y composiciones complejas.
Campo
En este documento se proporcionan compuestos y métodos que usan los compuestos para analizar específica y selectivamente biomoléculas. En particular, los compuestos y métodos son útiles para analizar el proteoma.
Antecedentes
El entendimiento de la base de la enfermedad y el desarrollo de tratamientos terapéuticos y preventivos ha evolucionado a lo largo del último siglo por la observación empírica y la experimentación para la exploración de mutaciones por todo el genoma. La revolución genómica ha proporcionado a los investigadores las herramientas para buscar una base genómica de las enfermedades. El esfuerzo del Genoma Humano ha generado una secuencia sin procesar de los 3 miles de millones de pares de bases del genoma humano y ha revelado aproximadamente 35.000 genes. Se están estudiando variaciones genéticas entre individuos diferentes y entre poblaciones para determinar la asociación con la predisposición a enfermedades o la correlación con la eficacia farmacológica y/o efectos secundarios. La promesa de una medicina personalizada basada en un panel de marcadores genéticos ha tentado a la comunidad sanitaria y proporciona un importante objetivo para los que se centran en proporcionar opciones de diagnóstico y tratamiento para asistentes sanitarios y pacientes.
Con el desarrollo de una diversidad de herramientas en biología molecular, tales como métodos de amplificación de ácidos nucleicos, sistemas y métodos de clonación y expresión, el análisis de enfermedades se ha basado en la genómica o en una estrategia de abajo hacia arriba. Esta estrategia presupone que un cambio genético o conjunto de cambios tendrá un efecto de largo alcance sobre la función proteica por afectación de la transcripción del ARNm o de la estructura y función de la proteína.
Se han desarrollado tecnologías para analizar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) a escala industrial (por ejemplo, MassARRAY^{TM} y el sistema MassARRAY®, Sequenom, Inc., San Diego, CA) y en muestras combinadas para estudiar la frecuencia de SNP en poblaciones de diversos sexos, etnia, edad y estado de salud. El último objetivo de estos esfuerzos es entender la etiología de las enfermedades a nivel molecular (por ejemplo, basándose en varianzas genéticas (farmacogenómica)) para desarrollar ensayos de diagnóstico y fármacos eficaces con pocos o ningún efecto secundario.
La genómica no ha cumplido la expectativa original de que esta estrategia podría usarse para estratificar una población con respecto a un fenotipo definido, incluyendo diferencias entre la población normal y la población de pacientes enfermos. Aunque se ha descubierto que marcadores genéticos individuales están asociados con o causan o predicen una patología específica, la información genómica puede no ser suficiente para estratificar poblaciones individuales por la asociación de un SNP (o varios SNP) con una enfermedad dada, efecto secundario farmacológico u otro fenotipo diana. Debido al gran número de dianas potenciales y señales reguladoras que afectan a la traducción de proteínas, no es suficiente el establecimiento de los perfiles de expresión diferenciales del ARN mensajero al comparar fenotipos o poblaciones, tales como un estado sano y patologías, tales como los análisis que usan microplacas de ADN de expresión (por ejemplo, la tecnología GeneChip^{TM}, Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA; la tecnología LifeArray^{TM}, Incyte Genomics, Inc., Palo Alto, CA). Las actividades metabólicas en una célula no se realizan por el ARNm sino más bien por las proteínas traducidas y los productos modificados postraduccionalmente posteriormente, tales como los productos alquilados, glicosilados y fosforilados.
El estudio de la proteómica incluye el estudio de proteínas individuales y cómo estas proteínas funcionan dentro de una ruta bioquímica. La proteómica también incluye el estudio de interacciones de proteínas, incluyendo cómo forman la arquitectura que constituye las células vivas. En muchas enfermedades de seres humanos tales como cáncer, enfermedad de Alzheimer, diabetes, así como de respuestas de hospedador frente a enfermedades infecciosas, el esclarecimiento de las proteínas reguladoras de interacciones complejas que pueden causar enfermedades es una etapa crítica para el descubrimiento de un tratamiento eficaz. Con frecuencia, aparecen SNP y otras mutaciones de ácidos nucleicos en genes cuyos productos son proteínas tales como (1) hormonas relacionadas con el crecimiento, (2) receptores de membrana para hormonas de crecimiento, (3) componentes de la ruta de señalización transmembrana y (4) proteínas de unión al ADN que actúan sobre la transcripción y la inactivación de genes supresores (por ejemplo, P53) que causan el comienzo de enfermedades.
Se analizan mezclas de proteínas complejas mediante electroforesis en gel bidimensional (2D) y posterior procesamiento de imágenes para identificar cambios en el patrón (cambios estructurales) o intensidad de diversas manchas de proteínas. La electroforesis en gel bidimensional es un método laborioso propenso a errores con una baja reproducibilidad y no puede automatizarse eficazmente. Esta tecnología en gel es incapaz de analizar eficazmente proteínas de membrana. Además, la resolución de geles 2D es insuficiente para analizar el perfil de todas las proteínas presentes en una mezcla.
\newpage
El documento EP0424819 describe métodos para modificar de forma reversible compuestos biológicos para permitir su detección, separación y purificación. En concreto, describe la unión de un grupo protector a un producto natural, biopolímero o sintón. Este grupo protector proporciona un medio para unir de forma reversible un grupo modificador al compuesto de interés.
El documento WO01/77684 que constituye técnica anterior según el Artículo 54 (3), EPC, describe métodos de análisis del proteoma. Los métodos comprenden el uso de sondas que tienen restos reactivos que están limitados en su reactividad a las proteínas activas diana, un ligando para el secuestro del conjugado de la sonda y la proteína diana y, opcionalmente, un identificador.
Ham et al. Bioconjugate Chem. 4:560-567 [1993] describen inhibidores de serina proteasa de isocumarina para detectar, localizar y aislar serina proteasas. Comprenden un grupo 4-cloro, un sustituyente biotinilado en la posición 7 y diferentes grupos 3-alcoxi que confieren selectividad hacia diferentes serina proteasas.
Las microplacas de proteínas disponibles están limitadas por su capacidad para capturar específicamente proteínas hidrófobas y de membrana que con frecuencia son dianas del desarrollo de fármacos. Una vez unidas a la microplaca, las proteínas son altamente inestables y sus estructuras con frecuencia no reflejan la conformación verdadera que se encuentra en condiciones fisiológicas.
Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar tecnologías para el análisis del proteoma, que permitan el aumento a escala a niveles industriales con las características de un proceso industrial: alta precisión, reproducibilidad y flexibilidad por el hecho de que el proceso sea de alto rendimiento, automatizable y rentable. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar tecnologías que permitan el sondaje y la identificación de proteínas y otras biomoléculas en su conformación nativa usando protocolos y sistemas automatizados. En particular, existe la necesidad de desarrollar estrategias y tecnologías para la identificación y caracterización de proteínas hidrófobas en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, entre los objetos de este documento, un objeto en este documento es proporcionar dichas tecnologías.
Sumario
En este documento se proporcionan métodos, compuestos de captura (también denominados en este documento agentes de captura) y colecciones de los mismos para el análisis del proteoma a nivel industrial en un formato de alto rendimiento. Los métodos, compuestos de captura y colecciones permiten la separación de mezclas complejas de biomoléculas. Además, permiten la identificación de estructuras proteicas predicativas o indicativas de fenotipos específicos, tales como patologías, eliminando de este modo la necesidad de un análisis de SNP aleatorio, generación de perfiles de expresión y métodos analíticos de proteínas. Los compuestos de captura, colecciones y métodos separan mezclas complejas al proporcionar una diversidad de agentes de captura diferentes. Además, pueden usarse para identificar "epítopos" estructurales que sirven como marcadores para patologías específicas, para estratificar poblaciones individuales en relación con fenotipos específicos, permitir una comprensión detallada de las proteínas que subyacen a la función molecular y proporcionar dianas para el desarrollo de fármacos. El mayor entendimiento de proteínas diana permite el diseño de agentes terapéuticos más eficaces.
Se proporcionan compuestos de captura, colecciones de los compuestos y métodos que usan los compuestos, por separado o en colecciones de los mismos, para capturar, separar y analizar biomoléculas incluyendo, pero sin limitación, mezclas de biomoléculas, incluyendo biopolímeros y macromoléculas tales como proteínas, biomoléculas individuales tales como proteínas, incluyendo proteínas individuales o de membrana. Las colecciones contienen una pluralidad, típicamente al menos 10, 50, 100, 1000 o más compuestos de captura diferentes. Los compuestos y colecciones se diseñan para permitir el sondaje de una mezcla de biomoléculas en virtud de la interacción de los compuestos de captura en la colección con los componentes de una mezcla en condiciones que preserven su configuración tridimensional. Cada miembro de la colección se diseña 1) para unirse covalentemente de modo que la unión sea irreversible o estable en condiciones de análisis espectrométrico de masas con menos de todas, típicamente de aproximadamente 5 a 20 ó más biomoléculas de componentes en una mezcla, dependiendo de la complejidad y diversidad de la mezcla, en condiciones fisiológicas, incluyendo condiciones hidrófobas y 2) distinguir entre biomoléculas basándose en características topológicas. Además, los compuestos de captura incluyen generalmente un grupo, tal como un oligonucleótido de cadena sencilla u oligonucleótido parcialmente de cadena sencilla que permite la separación de cada conjunto de compuestos de captura.
Los compuestos de captura y colecciones se usan en una diversidad de métodos, pero están particularmente diseñados para evaluar biomoléculas, tales como biopolímeros o componentes en mezclas procedentes de muestras biológicas. Las colecciones se usan en métodos imparciales de arriba hacia abajo ("top-down") que evalúan cambios estructurales, incluyendo cambios estructurales postraduccionales y, por ejemplo, se usan para comparar patrones, particularmente patrones proteicos postraduccionales en células enfermas frente a sanas a partir de células primarias generalmente del mismo individuo. Las células que sirven como las fuentes de biomoléculas pueden congelarse en un estado metabólico seleccionado o sincronizarse para permitir la comparación directa e identificación de biomoléculas específicas de fenotipo, tales como específicas de enfermedad, generalmente proteínas.
Un compuesto de captura incluye un grupo de reactividad química X (también denominado en este documento función o funcionalidad) que efectúa la unión covalente, y al menos una función de selectividad Y que modula la interacción de una biomolécula con la función de reactividad, y una función de separación Q para dirigirse a los componentes de la colección. Opcionalmente, se incluye la función de solubilidad W que altera la solubilidad del compuesto de captura, tal como por medio del aumento de la solubilidad del compuesto de captura en condiciones seleccionadas, tales como diversas condiciones fisiológicas, incluyendo condiciones hidrófobas de membranas celulares. Por lo tanto, por ejemplo, si se fijan como objetivo proteínas de membrana, entonces los compuestos de captura en la colección se diseñan con funciones de solubilidad que aumenten o proporcionen solubilidad en dicho entorno.
Por ejemplo, el grupo de reactividad (función de reactividad) incluye grupos que reaccionan o interaccionan específicamente con funcionalidades en la superficie de una proteína tal como grupos hidroxilo, amina, amida, sulfuro y ácido carboxílico o que reconocen áreas superficiales específicas tales como un anticuerpo, una lectina o un ligando específico de receptor, o interacciona con el sitio activo de enzimas. Los especialistas en la técnica pueden seleccionar a partir de una biblioteca de funcionalidades para conseguir esta interacción. Aunque esta interacción puede ser muy específica de reacción, estos compuestos pueden reaccionar múltiples veces dentro de la misma molécula proteica dependiendo del número de grupos funcionales accesibles superficiales. La modificación de las condiciones de reacción permite la identificación de grupos funcionales accesibles superficiales con una reactividad diferente, permitiendo por lo tanto la identificación de uno o más sitios altamente reactivos usados para separar una proteína individual de una mezcla. Las tecnologías disponibles no separan especies en la mezcla de reacción resultante. Las colecciones y compuestos que se proporcionan en este documento resuelven ese problema mediante una segunda funcionalidad, el grupo de selectividad, que altera la unión de los grupos de reactividad con la biomolécula.
Las funciones de selectividad incluyen una diversidad de grupos, así como el espaciamiento geométrico de la segunda funcionalidad, un oligonucleótido o análogo de oligonucleótido de cadena sencilla no protegido o convenientemente protegido. Por ejemplo, las funciones de selectividad interaccionan de forma no covalente con proteínas diana para alterar la especificidad o la unión de la función de reactividad. Dichas funciones incluyen grupos químicos y biomoléculas que pueden impedir estéricamente proteínas de un tamaño específico, compuestos o proteínas hidrófilas (por ejemplo, PEG y tritilos), compuestos o proteínas hidrófobas (por ejemplo, aromáticos polares, lípidos, glicolípidos, fosfodiéster, oligosacáridos), grupos cargados positiva o negativamente, o grupos o biomoléculas que generan una estructura secundaria o terciaria definida.
Los compuestos de captura también incluyen una función de separación para separar o abordar cada compuesto de captura de acuerdo con su estructura. La función de separación, por ejemplo, puede ser un oligonucleótido o análogo de oligonucleótido de cadena sencilla (o parcialmente de cadena sencilla) no protegido o convenientemente protegido, que contiene típicamente entre al menos aproximadamente 5 y hasta 25, 35, 50, 100 o cualquier número deseado de nucleótidos (o análogos de los mismos) que contienen una región de secuencia permutada y opcionalmente regiones flanqueantes. Cada uno de dichos bloques tiene una multitud de permutaciones de secuencia con o sin regiones flanqueantes conservadas, que es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico de cadena sencilla de bases complementarias. La función de separación también puede ser un marcador, tal como una simbología, incluyendo un código de barras, particularmente un código de barras legible mecánicamente, una marcador codificado por colores, tal como una perla pequeña coloreada que puede separarse en virtud de su color, un marcador de radiofrecuencia u otro marcador electrónico o un marcador químico. Se contempla cualquier funcionalidad que permita la separación de cada conjunto de compuestos de captura para permitir el análisis separado de biomoléculas unidas.
En ciertas realizaciones, cada biomolécula que se va a capturar se derivatiza con más de un compuesto de captura proporcionado en este documento, donde cada compuesto marcado proporciona un nivel adicional de capacidad de separación. En otras realizaciones, cada uno de la pluralidad de compuestos que derivatiza en una sola biomolécula es diferente, permitiendo la separación específica y eficaz de la mezcla de biomoléculas (véase, por ejemplo, la Figura 3).
Los compuestos de captura incluyen al menos una función de reactividad y una función de selectividad. Estos compuestos de captura incluyen funcionalidades de separación, que son uno o más restos adicionales que se unen covalentemente o no covalentemente a una molécula específica para permitir abordar los compuestos, tal como por separación en loci separados en un soporte sólido o separación de los compuestos en loci separados. Estos compuestos de captura también incluyen opcionalmente una o más funciones de solubilidad que son restos que influyen en la solubilidad del compuesto resultante para atenuar o alterar la hidrofobia/hidrofilia de los compuestos (función de solubilidad).
Los compuestos de captura (o agentes de captura) incluyen una función de reactividad y una función de separación. La primera es el grupo reactivo que interacciona específicamente con proteínas u otras biomoléculas (función de reactividad); y la otra es una entidad (funciones de separación) que se une covalentemente o no covalentemente a una molécula o moléculas específicas. Esta entidad puede ser una porción de ácido nucleico o una porción de análogo de ácido nucleico que incluye una región de cadena sencilla que puede hibridar específicamente con un oligonucleótido o análogo del mismo de cadena sencilla complementario.
Los compuestos de captura se proporcionan como colecciones, generalmente como colecciones de conjuntos de diferentes compuestos que difieren en todas las funcionalidades. Para la separación de mezclas complejas de biopolímeros, la colección incluye diversos miembros de compuestos de captura de modo que, por ejemplo, cuando se organizan en matrices, cada locus de la matriz contiene de 0 a 100, generalmente de 5 a 50 y de forma deseable de 1 a 20, típicamente de 5 a 20 biomoléculas diferentes en cada locus en la matriz.
En la práctica en una realización, una colección de compuestos de captura se pone en contacto con una mezcla de biomoléculas y las moléculas unidas se evalúan usando, por ejemplo, espectrometría de masas seguida de aplicación opcional de marcaje, tal como marcaje por fluorescencia, después de la organización en matrices para identificar proteínas poco abundantes.
También se proporcionan en este documento métodos para el descubrimiento e identificación de proteínas que se seleccionan basándose en un fenotipo definido. Los métodos permiten que las proteínas se unan a las moléculas diana en condiciones fisiológicas al tiempo que se mantiene la conformación secundaria y terciaria correcta de la diana. Los métodos pueden realizarse en condiciones fisiológicas y otras que permitan el descubrimiento de proteínas biológicamente importantes, incluyendo proteínas de membrana que se seleccionan basándose en un fenotipo definido.
Antes, durante o después de la exposición de una o una pluralidad de compuestos de captura a una mezcla de biomoléculas, incluyendo, pero sin limitación, una mezcla de proteínas, la porción oligonucleotídica o análogo de la misma de estos compuestos se deja hibridar con una cadena complementaria de uno o más oligonucleótidos inmovilizados o uno o más análogos de los mismos para permitir la separación, aislamiento y posterior análisis de biomoléculas unidas tales como proteínas, por ejemplo, por espectrometría de masas, tal como espectrometría de masas de desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), marcaje colorimétrico, fluorescente o quimioluminiscente, o para facilitar una mayor resolución por espectrometría de masas, incluyendo espectrometría de masas de MALDI-TOF.
Las colecciones de compuestos de captura pueden usarse para generar matrices de compuestos para capturar proteínas diana o proteínas relacionadas con grupos que pueden mimetizar estructuras biológicas tales como estructuras transmembrana nucleares y mitocondriales, membranas artificiales o paredes celulares intactas. Por lo tanto, los compuestos y matrices de compuestos que se proporcionan en este documento son capaces de mimetizar entidades biológicas y superficies biológicas, permitiendo de este modo la captura de biomoléculas, incluyendo pero sin limitación proteínas cuya captura sería de otro modo difícil o imposible, tales como las que se encuentran en regiones transmembrana de una célula.
Las muestras para análisis incluyen cualquier biomolécula, particularmente muestras que contienen proteínas, tales como mezclas de proteínas incluyendo, pero sin limitación, fuentes naturales y sintéticas. Las proteínas pueden prepararse por traducción a partir de cromosomas, genes, ADNc y genotecas genómicas aisladas. Las proteínas pueden aislarse a partir de células y otras fuentes. En ciertas realizaciones, los compuestos de captura que se proporcionan en este documento están diseñados para capturar selectivamente diferentes modificaciones postraduccionales de la misma proteína (es decir, patrones de fosforilación (por ejemplo, oncogenes) glicosilación y otras modificaciones postraduccionales).
También se proporcionan otros métodos que emplean las colecciones. En un método, las colecciones o uno o más compuestos de captura miembros se usan para distinguir entre dos o más conformaciones diferentes de una proteína y, por ejemplo, pueden usarse para la identificación fenotípica, tal como para diagnóstico. Por ejemplo, en enfermedades de agregación de proteínas, que son enfermedades que implican una proteína alterada conformacionalmente, tales como enfermedades amiloides, las colecciones pueden distinguir entre la forma implicada en la enfermedad de la proteína y la forma normal y por lo tanto diagnosticar la enfermedad en una muestra.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la hibridación, separación y análisis del espectro de masas de una mezcla de proteínas.
La Figura 2 proporciona una representación esquemática de una realización del aparato que se proporciona en este documento.
La Figura 3 ilustra una proteína marcada con cuatro compuestos que se proporcionan en este documento, permitiendo de este modo la separación específica de la proteína.
La Figura 4 muestra la hibridación aumentada y específica que es el resultado del uso de dos o más marcadores oligonucleotídicos.
La Figura 5 muestra el marcaje de una proteína individual con dos oligonucleótidos diferentes en una reacción.
La Figura 6 es un diagrama de flujo de producción de proteínas recombinantes.
La Figura 7 ilustra la producción de una genoteca de ADNc cebada con oligonucleótido dT adaptado.
La Figura 8 muestra la producción de una genoteca de ADNc específica de motivo de secuencia adaptada.
La Figura 9 muestra la producción de un ADNc específico de gen adaptado.
La Figura 10 ilustra la purificación de productos de amplificación a partir de una genoteca de molde.
La Figura 11 muestra una genoteca de ADNc cebada con oligonucleótido dT adaptada como un molde universal para la amplificación de subpoblaciones de genes.
La Figura 12 ilustra la disminución de la complejidad durante la amplificación por PCR.
La Figura 13 muestra la unión de una molecular bifuncional a una superficie sólida.
La Figura 14 muestra el análisis de proteínas purificadas a partir de la exploración de compuestos y la producción de anticuerpos.
La Figura 15 proporciona esquemas sintéticos para la síntesis de reactivos de captura ejemplares que se proporcionan en este documento (véase, por ejemplo, el ejemplo 4).
La Figura 16 proporciona funciones de reactividad ejemplares para el uso en los reactivos de captura que se proporcionan en este documento.
La Figura 17 proporciona funciones de selectividad ejemplares para el uso en los reactivos de captura que se proporcionan en este documento.
La Figura 18 representa puntos ejemplares para la regulación de mecanismos de control metabólico para la sincronización celular.
La Figura 19 representa un método de separación y sincronización celular; la Figura 19a representa métodos para la separación de células de la sangre de un paciente individual para separarlas por fenotipo; la Figura 19b muestra los resultados de la separación por citometría de flujo de células sanguíneas sin marcaje; la Figura 19c muestra un ejemplo en el que células sincronizadas en cultivo se separan de acuerdo con el contenido de ADN como un modo de separación de células por fase del ciclo celular.
La Figura 20 muestra un esquema de un ensayo de captura de biomoléculas y resultados usando compuestos de captura ejemplares y proteínas.
Descripción detallada A. Definiciones
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un especialista en la técnica a la que pertenece la invención o invenciones. En el caso de que exista una pluralidad de definiciones para los términos de este documento, prevalecerán las de esta sección. Cuando se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección de este tipo, se entiende que dichos identificadores pueden cambiar y que puede ir y venir información particular en Internet, pero puede encontrarse una información equivalente buscando en Internet. Las referencias a las mismas prueban la disponibilidad y difusión pública de dicha información.
Como se usa en este documento, un oligonucleótido significa una secuencia lineal de hasta aproximadamente 20, aproximadamente 50 o aproximadamente 100 nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster. Por encima de esta longitud empieza a utilizarse el término polinucleótido.
Como se usa en este documento, un análogo de oligonucleótido significa una secuencia lineal de hasta aproximadamente 20, aproximadamente 50 o aproximadamente 100 análogos de nucleótidos o una secuencia lineal de hasta aproximadamente 20, aproximadamente 50 o aproximadamente 100 nucleótidos unidos por un enlace de "estructura" distinto de un enlace fosfodiéster, por ejemplo, un enlace fosfotriéster, un enlace fosforamidato, un enlace fosforotioato, un enlace diéster de metilfosfonato, un enlace tioéster o un enlace peptídico (ácido péptido nucleico).
Como se usa en este documento, el ácido péptido nucleico (PNA) se refiere a análogos de ácido nucleico en los que la estructura de ribosa-fosfato se reemplaza por una estructura mantenida junta por enlaces amida.
Como se usa en este documento, el proteoma significa todas las proteínas presentes en el interior de una célula.
Como se usa en este documento, una biomolécula es cualquier compuesto que se encuentra en la naturaleza, o derivados del mismo. Las biomoléculas incluyen, pero sin limitación, oligonucleótidos, oligonucleósidos, proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos, esteroides, ácidos péptido nucleicos (PNA), oligosacáridos y monosacáridos.
Como se usa en este documento, MALDI-TOF se refiere a espectrometría de masas de desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo.
Como se usa en este documento, el término "acondicionado" o "acondicionamiento", como cuando se usa haciendo referencia a una proteína del mismo, significa que el polipéptido está modificado para disminuir la energía láser necesaria para volatilizar la proteína, para minimizar la probabilidad de fragmentación de la proteína o para aumentar la resolución de un espectro de masas de la proteína o de los aminoácidos componentes. La resolución de un espectro de masas de una proteína puede aumentarse por acondicionamiento de la proteína antes de la realización de la espectrometría de masas. El acondicionamiento puede realizarse en cualquier fase anterior a la espectrometría de masas y, en una realización, se realiza mientras la proteína está inmovilizada. Una proteína puede acondicionarse, por ejemplo, por tratamiento de la misma con un material de intercambio de cationes o un material de intercambio de aniones que puede reducir la heterogenicidad de carga de la proteína para eliminar de este modo el ensanchamiento de pico debido a la heterogenicidad en el número de cationes (o aniones) unidos a las diversas proteínas de una población. En una realización se realiza la eliminación de todos los cationes por intercambio iónico, excepto por iones H+ y de amonio. Poniendo en contacto un polipéptido con un agente alquilante tal como yoduro de alquilo, yodoacetamida, yodoetanol o 2,3-epoxi-1-propranol, puede prevenirse la formación enlaces de sulfuro, por ejemplo, en una proteína. Asimismo, pueden convertirse cadenas laterales de aminoácidos cargados en derivados no cargados empleando cloruros de trialquilsililo.
Puesto que los compuestos de captura contienen porciones de proteína y ácido nucleico, también se contempla un acondicionamiento adecuado para una o ambas porciones. Por lo tanto, es ventajosa una prepurificación para enriquecer las biomoléculas que se van a analizar y la eliminación de todos los cationes, tal como por intercambio iónico, excepto H+ y amonio, u otro tratamiento de acondicionamiento para mejorar la resolución, para el análisis de la porción de ácido nucleico así como de la porción proteica.
El acondicionamiento de proteínas generalmente es innecesario porque las proteínas son relativamente estables en condiciones ácidas de alta energía, de modo que las proteínas no requieren un acondicionamiento para los análisis espectrométricos de masas. Sin embargo, existen medios para mejorar la resolución en una realización para péptidos más cortos, tal como por medio de la incorporación de aminoácidos modificados que son más básicos que los restos no modificados correspondientes. Dicha modificación en general aumenta la estabilidad del polipéptido durante el análisis espectrométrico de masas. Además, pueden usarse la cromatografía de intercambio de cationes, así como procedimientos de lavado y purificación generales que eliminan proteínas y otros componentes de mezcla de reacción de la proteína para aumentar la resolución del espectro que es el resultado del análisis espectrométrico de masas de la proteína.
Como se usa en este documento, "matriz" se refiere al material con el que los conjugados de compuesto de captura-biomolécula se combinan para el análisis espectrométrico de masas de MALDI. Se contempla cualquier material de matriz, tal como ácidos sólidos, incluyendo ácido 3-hidroxipicolínico, y matrices líquidas tales como glicerol conocidas por los especialistas en la técnica para análisis de ácidos nucleicos y/o proteínas. Puesto que los conjugados de compuesto-biomolécula contienen ácido nucleico y proteína, puede usarse una mezcla (óptima para ácidos nucleicos y proteínas) de moléculas de matriz.
Como se usa en este documento, el término macromolécula se refiere a cualquier molécula que tenga un peso molecular desde cientos hasta millones. Las macromoléculas incluyen, pero sin limitación, péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono y otras moléculas de este tipo que se sintetizan generalmente por organismos biológicos, pero que pueden prepararse sintéticamente o usando métodos de biología molecular recombinantes.
Como se usa en este documento, el término "biopolímero" se refiere a una molécula biológica, incluyendo macromoléculas, compuesta por dos o más subunidades monoméricas o derivados de las mismas, que están unidas por un enlace o una macromolécula. Un biopolímero puede ser, por ejemplo, un polinucleótido, un polipéptido, un carbohidrato o un lípido o derivados o combinaciones de los mismos, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una porción de ácido péptido nucleico o una glicoproteína.
Como se usa en este documento, la biomolécula incluye biopolímeros y macromoléculas y todas las moléculas que pueden aislarse a partir de organismos vivos y virus, incluyendo, pero sin limitación, células, tejidos, priones, animales, plantas, virus, bacterias y otros organismos.
Como se usa en este documento, una partícula biológica se refiere un virus, tal como un vector viral o cápsida viral con o sin ácido nucleico empaquetado, fago incluyendo un vector de fago o cápsida de fago, con o sin ácido nucleico encapsulado, una célula individual incluyendo células eucariotas y procariotas o fragmentos de las mismas, un liposoma o agente micelar u otra partícula de empaquetamiento y otros materiales biológicos de este tipo. Para los fines de este documento, las partículas biológicas incluyen moléculas que no se consideran típicamente macromoléculas porque generalmente no se sintetizan, sino que proceden de células y virus.
Como se usa en este documento, un fármaco se refiere a cualquier compuesto que es un candidato para el uso como agente terapéutico o como compuesto principal para diseñar un agente terapéutico o que sea un agente farmacéutico conocido. Dichos compuestos pueden ser moléculas pequeñas, incluyendo moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, peptidomiméticos, moléculas antisentido, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o anticuerpos recombinantes. Son de interés particular "fármacos" que tienen propiedades de unión específicas de modo que pueden usarse como grupos de selectividad o pueden usarse para separar los compuestos de captura, ya sea una funcionalidad de separación que se une a una diana en un soporte o unida a un soporte sólido, donde la funcionalidad de separación es la diana del fármaco.
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Como se usa en este documento, la expresión "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos de cadena sencilla y/o doble cadena tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN), así como análogos o derivados de ARN o ADN. Las moléculas de ácido nucleico son polímeros lineales de nucleótidos unidos por enlaces 3',5'-fosfodiéster. En el ADN, el ácido desoxirribonucleico, el grupo azúcar es desoxirribosa y las bases de los nucleótidos son adenina, guanina, timina y citosina. El ARN, ácido ribonucleico, tiene ribosa como azúcar y uracilo sustituye a la timina. También se incluyen en la expresión "ácido nucleico" análogos de ácidos nucleicos tales como ácido péptido nucleico (PNA), ADN de fosforotioato y otros análogos de este tipo y derivados o combinaciones de los mismos.
Como se usa en este documento, el término "polinucleótido" se refiere un oligómero o polímero que contiene al menos dos nucleótidos o derivados de nucleótidos unidos, incluyendo un ácido desoxirribonucleico (ADN) un ácido ribonucleico (ARN) y un derivado de ADN o ARN que contiene, por ejemplo, un análogo de nucleótido o un enlace de "estructura" distinto de un enlace fosfodiéster, por ejemplo, un enlace fosfotriéster, un enlace fosforamidato, un enlace diéster de metilfosfonato, un enlace fosforotioato, un enlace tioéster o un enlace peptídico (ácido péptido nucleico). El termino "oligonucleótido" también se usa en este documento esencialmente como sinónimo de "polinucleótido", aunque los especialistas en la técnica reconocen que los oligonucleótidos, por ejemplo, cebadores de PCR generalmente tienen menos de aproximadamente cincuenta a cien nucleótidos de longitud.
Los análogos de nucleótidos contenidos en un polinucleótido pueden ser, por ejemplo, nucleótidos de masa modificada que permiten la diferenciación por masa de polinucleótidos; nucleótidos que contienen un marcador detectable tal como una marcador fluorescente, radiactivo, colorimétrico, luminiscente o quimioluminiscente, que permite la detección de un polinucleótido; o nucleótidos que contienen un grupo reactivo tal como biotina o un grupo tiol, que facilita la inmovilización de un polinucleótido en un soporte sólido. Un polinucleótido también puede contener uno o más enlaces de estructura que sean selectivamente escindibles, por ejemplo, químicamente, enzimáticamente o fotolíticamente. Por ejemplo, un polinucleótido puede incluir uno o más desoxirribonucleótidos seguidos de uno o más ribonucleótidos, que pueden ir seguidos de uno o más desoxirribonucleótidos, siendo escindible dicha secuencia en la secuencia de ribonucleótidos por hidrólisis de bases. Un polinucleótido también puede contener uno o más enlaces que sean relativamente resistentes a la escisión, por ejemplo, un cebador oligonucleotídico quimérico que puede incluir nucleótidos unidos por enlaces de ácido péptido nucleico y al menos un nucleótido en el extremo 3', que esté unido por un enlace fosfodiéster o similar y sea capaz de extenderse por una polimerasa. Pueden prepararse secuencias de ácido péptido nucleico
usando métodos bien conocidos (véase, por ejemplo, Weiler et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:2792-2799).
Un polinucleótido puede ser una porción de una molécula de ácido nucleico de mayor tamaño, por ejemplo, una porción de un gen que puede contener una región polimórfica o una porción de una región extragénica de un cromosoma, por ejemplo, una porción de una región de repeticiones de nucleótidos tal como un locus de repeticiones cortas en tándem (STR), un número variable de locus de repeticiones en tándem (VNTR), un locus de microsatélite o un locus de minisatélite. Un polinucleótido también puede ser de cadena sencilla o cadena doble incluyendo, por ejemplo, un híbrido de ADN-ARN, o puede ser de cadena triple o de cuatro cadenas. Cuando el polinucleótido es ADN bicatenario, puede estar en una configuración, A, B, L o Z y un polinucleótido individual puede contener combinaciones de dichas configuraciones.
Como se usa en este documento, una "modificación de masa" con respecto a una biomolécula que se va a analizar por espectrometría de masas se refiere a la inclusión de cambios en átomos o grupos constituyentes que cambien el peso molecular de la molécula resultante en incrementos definidos detectables por análisis espectrométrico de masas. Las modificaciones de masa no son radiomarcadores, tales como marcadores de isótopos o un grupo fluorescente u otros marcadores de este tipo usados normalmente para detección por medios distintos de espectrometría de masas.
Como se usa en este documento, el término "polipéptido" significa al menos dos aminoácidos o derivados de aminoácidos, incluyendo aminoácidos de masa modificada y análogos de aminoácidos que están unidos por un enlace peptídico y que pueden ser un enlace peptídico modificado. Un polipéptido puede traducirse a partir de un polinucleótido, que puede incluir al menos una porción de una secuencia codificante o una porción de una secuencia de nucleótidos que no se traduce de forma natural debido, por ejemplo, a que está localizada en una fase de lectura distinta de una fase codificante o a que es una secuencia intrónica, una secuencia no traducida 3' ó 5', o una secuencia reguladora tal como un promotor. Un polipéptido también puede sintetizarse químicamente y puede modificarse por métodos químicos o enzimáticos después de la traducción o síntesis química. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan esencialmente como sinónimos en este documento, aunque el especialista reconoce que los péptidos generalmente contienen menos de aproximadamente cincuenta a cien restos aminoacídicos y que las proteínas con frecuencia se obtienen a partir de una fuente natural y pueden contener, por ejemplo, modificaciones postraduccionales. Un polipéptido puede modificarse postraduccionalmente mediante, por ejemplo, fosforilación (fosfoproteínas), glicosilación (glicoproteínas, proteoglicanos) que puede realizarse en una célula o en una reacción in vitro.
Como se usa en este documento, el término "conjugado" se refiere a una unión estable, típicamente en virtud de una interacción química, incluyendo unión iónica y/o covalente. Entre los medios de conjugación está la interacción de estreptavidina o avidina con biotina; interacción hidrófoba; interacción magnética (por ejemplo, usando perlas magnéticas funcionalizadas tales como DYNABEADS, que son perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina comercializadas por Dynal, Inc. Great Neck, NY y Oslo Noruega); interacciones polares tales como asociaciones "humectantes" entre dos superficies polares o entre oligo/polietilenglicol; formación de un enlace covalente tal como un enlace amida, puente disulfuro, enlace tioéter, o mediante agentes reticulantes; y mediante un enlazador inestable frente a ácidos o fotoescindible.
Como se usa en este documento, "muestra" se refiere una composición que contiene un material que se va a detectar. Para los fines, la muestra se refiere a cualquier cosa que pueda contener una biomolécula. La muestra puede ser una muestra biológica tal como un fluido biológico o un tejido biológico obtenido a partir de cualquier organismo o una célula de o procedente de un organismo o una partícula viral o porciones de la misma. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen orina, sangre, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, moco, esperma, líquido amniótico o similares. Los tejidos biológicos son agregados de células, habitualmente de una clase particular, junto con su sustancia intercelular, que forman uno de los materiales estructurales de una estructura humana, animal, vegetal, bacteriana, fúngica o viral incluyendo tejidos conectivo, epitelial, muscular y nervioso. Los ejemplos de tejidos biológicos también incluyen órganos, tumores, ganglios linfáticos, arterias y células individuales.
Por lo tanto, las muestras incluyen muestras biológicas (por ejemplo, cualquier material obtenido a partir de una fuente procedente de un ser vivo (por ejemplo, un ser humano, animal, planta, bacteria, hongo, protista, virus). La muestra biológica puede estar en cualquier forma, incluyendo materiales sólidos (por ejemplo, tejido, sedimentos celulares y biopsias, tejidos de cadáveres) y fluidos biológicos (por ejemplo, orina, sangre, saliva, líquido amniótico y lavado bucal (que contiene células bucales)). En ciertas realizaciones, los materiales sólidos están mezclados con un fluido. En realizaciones de este documento, la muestra para análisis espectrométrico de masas incluye muestras que contienen una mezcla de matriz usada para análisis espectrométricos de masas y los complejos de compuesto de captura/biomolécula.
Como se usa en este documento, la expresión "soporte sólido" se refiere a un material no gaseoso no líquido que tiene una superficie. Por lo tanto, un soporte sólido puede ser una superficie plana construida, por ejemplo, de vidrio, silicio, metal, plástico o un material compuesto; o puede estar en forma de una perla tal como un gel de sílice, un vidrio de tamaño de poros controlado, una perla magnética o de celulosa; o puede ser un pin incluyendo una matriz de pines adecuada para síntesis o análisis combinatorio.
Como se usa en este documento, una colección se refiere a una combinación de 10, 50, 100, 500, 1000 o más miembros. En particular una colección se refiere a dicha combinación de los compuestos de captura como se proporciona en este documento.
Como se usa en este documento, una matriz se refiere a una colección de elementos, tales como los compuestos de captura. Una matriz direccionable es una en la que los miembros de la matriz son identificables, típicamente por colocación en un soporte en fase sólida pero también en virtud de un identificador o marcador detectable. Por lo tanto, en general, los miembros de una matriz se van a inmovilizar en loci identificables separados en la superficie en una fase sólida. Una pluralidad de los compuestos está unida a un soporte, tal como una matriz en la superficie de un soporte, tal como una microplaca de silicio u otra superficie, generalmente por unión de la funcionalidad de separación con un grupo o compuesto en la superficie del soporte. El direccionamiento puede conseguirse por marcaje de cada miembro electrónicamente, tal como con un marcador de radiofrecuencia (RF) mediante el uso de perlas de color codificado u otros marcadores identificables de este tipo y de color codificado y mediante el peso molecular. Estos marcadores para direccionamiento sirven como funciones de separación "Q". Por lo tanto, en general, los miembros de la matriz se inmovilizan en loci identificables separados en la superficie de una fase sólida o directamente o indirectamente unidos a o asociados de otro modo con el marcador identificable, tales como fijados a una microesfera u otro soporte particulado (denominado en este documento perlas) y suspendido en solución o extendido en una superficie.
Como se usa en este documento, "sustrato" se refiere a un soporte insoluble sobre el que se deposita una muestra y/o matriz. El soporte puede fabricarse de prácticamente cualquier material insoluble o sólido. Por ejemplo, gel de sílice, vidrio (ejemplo, vidrio de tamaño de poro controlado (CEPG)), nylon, resina de Wang, resina de Merrifield, dextrano reticulado con epiclorohidrina (por ejemplo, Sephadex®), agarosa (por ejemplo, Sepharose®), celulosa, perlas magnéticas, Dynabeads, una superficie metálica (por ejemplo, acero, oro, plata, aluminio, silicio y cobre), un material plástico (por ejemplo, polietileno, polipropileno, poliamida, poliéster y fluoruro de polivinilideno (PVDF)). El sustrato ejemplar incluye, pero sin limitación, perlas (por ejemplo, gel de sílice, vidrio de tamaño de poro controlado, magnético, de dextrano reticulado con epiclorohidrina (por ejemplo, Sephadex®), agarosa (por ejemplo, Sepharose®), celulosa), capilares, soportes planos tales como filtros de fibra de vidrio, superficies de vidrio, superficies metálicas (acero, oro, plata, aluminio, cobre y silicio), materiales plásticos incluyendo placas multipocillo o membranas (por ejemplo, de polietileno, polipropileno, poliamida o difluoruro de polivinilideno), pins (por ejemplo, matrices de pins adecuadas para síntesis o análisis combinatorio o perlas en hoyos de superficies planas tales como obleas (por ejemplo, obleas de silicio), con o sin placas de filtro. El soporte sólido está en cualquier forma deseada, incluyendo pero sin limitación una perla, capilar, placa, membrana, oblea, peine, pin, una oblea con hoyos, una matriz de hoyos o pocillos de nanolitros y otras geometrías y formas conocidas por los especialistas en la técnica. Los soportes incluyen superficies planas diseñadas para recibir o unir muestras en loci separados. En una realización, las superficies planas incluyen las que tienen regiones hidrófobas rodeando loci hidrófilos para recibir, contener o unirse a una muestra.
Los soportes pueden ser particulados o pueden estar en forma de una superficie continua, tal como una placa o pocillo de microtitulación, un portaobjetos de vidrio, una microplaca de silicio, una lámina de nitrocelulosa, una malla de nylon u otros materiales de este tipo. Cuando son particulados, típicamente las partículas tienen al menos una dimensión en el intervalo de 5-10 mm o inferior. Dichas partículas, denominadas en conjunto en este documento "perlas" son con frecuencia, pero no necesariamente, esféricas. La referencia a "perlas", sin embargo, no limita la geometría de la matriz que puede tener cualquier forma, incluyendo formas aleatorias, agujas, fibras y alargadas. También se contemplan las "perlas", particularmente microesferas que son suficientemente pequeñas para usarse en la fase líquida. Las "perlas" pueden incluir componentes adicionales tales como partículas magnéticas o paramagnéticas (véase, por ejemplo, Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega)) para la separación usando imanes, siempre que los componentes adicionales no interfieran con los métodos y análisis de este documento.
Como se usa este documento, "polimorfismo" se refiere a la coexistencia de más de una forma de un gen o porción del mismo. Una porción de un gen del que existen al menos dos formas diferentes, por ejemplo, dos secuencias de nucleótidos diferentes, se denomina "región polimórfica de un gen". Una región polimórfica puede ser un solo nucleótido, por ejemplo, un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) cuya identidad difiere en diferentes alelos. Una región polimórfica también puede tener varios nucleótidos de longitud.
Como se usa en este documento, la expresión "gen polimórfico" se refiere a un gen que tiene al menos una región polimórfica.
Como se usa en este documento "alelo", que se usa de forma indistinta en este documento con "variante alélica", se refiere a formas alternativas de un gen o porciones del mismo. Los alelos ocupan el mismo locus o posición en cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, se dice que el sujeto es homocigoto para el gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el sujeto es heterocigoto para el gen. Los alelos de un gen específico pueden diferir entre sí en un solo nucleótido o varios nucleótidos y pueden incluir sustituciones, deleciones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede ser una forma de un gen que contiene una mutación.
Como se usa en este documento, "alelo predominante" se refiere a un alelo que está representado en la mayor frecuencia para una población dada. El alelo o alelos que están presentes con menor frecuencia se denominan variantes alélicas.
Como se usa en este documento, el término "asociado" se refiere a la coincidencia con el desarrollo o manifestación de una enfermedad, afección o fenotipo. La asociación puede deberse a, pero sin limitación, genes responsables de funciones constitutivas cuya alteración puede proporcionar el fundamento para una diversidad de enfermedades y afecciones, los que son parte de una ruta que está implicada en una enfermedad, afección o fenotipo específico y los que contribuyen indirectamente a la manifestación enfermedad, afección o fenotipo.
Como se usa en este documento, el término "sujeto" se refiere a un organismo vivo, tal como un mamífero, una planta, un hongo, un invertebrado, un pez, un insecto, un organismo patógeno, tal como un virus o una bacteria e incluye seres humanos y otros mamíferos.
Como se usa en este documento, el término "gen" o "gen recombinante" se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene una fase de lectura abierta e incluye al menos un exón y (opcionalmente) una secuencia intrónica. Un gen puede ser ARN o ADN. Los genes pueden incluir regiones que preceden y siguen a la región codificante.
Como se usa en este documento, el término "intrón" se refiere a un fragmento de ADN presente en un gen dado que se elimina por corte y empalme durante la maduración del ARNm.
Como se usa en este documento, la expresión "secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos que se expone en la SEC ID Nº: x" se refiere a la secuencia nucleótidos de la cadena complementaria de una cadena de ácido nucleico que tiene la SEC ID Nº: x. La expresión "cadena complementaria" se usa en este documento de forma indistinta con el término "complementario". La complementaria de una cadena de ácido nucleico puede ser la complementaria de una cadena codificante o la complementaria de una cadena no codificante. Cuando se hace referencia a ácidos nucleicos de doble cadena, la complementaria de un ácido nucleico que tiene la SEC ID Nº: x se refiere a la cadena complementaria de la cadena que tiene la SEC ID Nº: x o a cualquier ácido nucleico que tenga la secuencia de nucleótidos de la cadena complementaria de la SEC ID Nº: x. Cuando se hace referencia a un ácido nucleico de cadena sencilla que tiene la secuencia de nucleótidos la SEC ID Nº: x, la complementaria de este ácido nucleico es un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la de la SEC ID Nº: x.
Como se usa en este documento, la expresión "secuencia codificante" se refiere a la porción de un gen que codifica un aminoácido que constituye un polipéptido o proteína.
Como se usa en este documento, la expresión "cadena con sentido" se refiere a la cadena de una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla que tiene la secuencia del ARNm que codifica la secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico de doble cadena.
Como se usa en este documento, la expresión "cadena antisentido" se refiere a la cadena de una molécula de ácido nucleico de doble cadena que es la complementaria de la secuencia del ARNm que codifica la secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico de doble cadena.
Como se usa en este documento, los aminoácidos que aparecen en las diversas secuencias de aminoácidos que aparecen en este documento se identifican de acuerdo con sus abreviaturas de tres letras o una letra bien conocidas. Los nucleótidos que aparecen en los diversos fragmentos de ADN se designan con las designaciones de una sola letra convencionales usadas de forma rutinaria en la técnica (véase la Tabla 1).
Como se usa en este documento, el resto aminoacídico se refiere a un aminoácido formado por digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Los restos aminoacídicos descritos en este documento están, en ciertas realizaciones, en la forma isomérica "L". Los restos en la forma isomérica "D" pueden sustituir a cualquier resto aminoacídico "L" siempre que la propiedad funcional deseada se conserve por el polipéptido. NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el extremo carboxilo de un polipéptido. De acuerdo con la nomenclatura polipeptídica convencional descrita en J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) y adoptada en la Norma 37 C.F.R. \NAK \NAK 1.821-1.822, en la siguiente Tabla se muestran abreviaturas para restos aminoacídicos:
TABLA 1
1
Debe señalarse que todas los secuencias de restos aminoacídicos representadas en este documento por fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del extremo amino al extremo carboxilo. Además, la expresión "resto aminoacídico" se define en sentido amplio para incluir los aminoácidos enumerados en la Tabla de correspondencia y aminoácidos modificados y poco habituales tales como los que se mencionan en la Norma 37 C.F.R. \NAK \NAK 1.821-1.822. Además, debe señalarse que un guión al comienzo o al final de una secuencia de restos aminoacídicos indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más restos aminoacídicos o con un grupo amino terminal tal como NH_{2} o con un grupo carboxilo terminal tal como COOH.
En un péptido o proteína, se conocen sustituciones conservativas adecuadas de aminoácidos por los especialistas en la técnica y pueden realizarse generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los especialistas en esta técnica reconocen que, en general, sustituciones de un solo aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., pág. 224).
Dichas sustituciones pueden realizarse de acuerdo con lo expuesto en la Tabla 2, de la forma siguiente:
TABLA 2
2
También pueden permitirse otras sustituciones y pueden determinarse empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservativas conocidas.
Como se usa en este documento, un homólogo de ADN o ácido nucleico se refiere a un ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos conservada preseleccionada, tal como una secuencia que codifica un polipéptido terapéutico. Mediante la expresión "sustancialmente homólogo" se entiende que tiene una homología de al menos el 80%, al menos el 90% y al menos el 95% con la misma o un porcentaje menor de homología o identidad y actividad o función biológica conservada.
Los términos "homología" e "identidad" se usan con frecuencia de forma indistinta. A este respecto, puede determinarse el porcentaje de homología o identidad, por ejemplo, por comparación de información de secuencia usando un programa informático GAP. El programa GAP usa el método de alineamiento de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443 (1970), revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)). En resumen, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (por ejemplo, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto del programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y de 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 por cada hueco y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalización para huecos terminales.
Puede determinarse si dos moléculas de ácido nucleico cualesquiera tienen secuencias de nucleótidos que tienen una "identidad" de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% usando algoritmos informáticos conocidos tales como el programa "FAST A" usando, por ejemplo, los parámetros por defecto de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988). Como alternativa, puede usarse la función BLAST de la base de datos del National Center for Biotechnology Information para determinar la identidad.
En general, las secuencias se alinean de modo que se obtiene el emparejamiento de mayor orden. La "identidad" por sí misma tienen un significado reconocido en la técnica y puede calcularse usando técnicas publicadas (véase, por ejemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Aunque existen varios métodos para medir la identidad entre dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, el término "identidad" es bien conocido por los especialistas en la técnica (Carillo, H. & Upton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)). Los métodos empleados comúnmente para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, los descritos en Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo, H. & Upton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988). Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos. Los métodos de programas informáticos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete del programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(l):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)).
Por lo tanto, como se usa en este documento, el término "identidad" representa una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de ensayo y uno de referencia. Por ejemplo, un polipéptido de ensayo puede definirse como cualquier polipéptido que tenga una identidad del 90% o superior con un polipéptido de referencia.
Como se usa en este documento, la expresión al menos "una identidad del 90%" se refiera a porcentajes de identidades del 90 al 99,99% con respecto a los polipéptidos de referencia. La identidad a un nivel del 90% o superior es indicativa del hecho de que, asumiendo con fines de ejemplificación, se comparan un polipéptido de ensayo y de referencia de una longitud de 100 aminoácidos. No más del 10% (por ejemplo, 10 de 100) de los aminoácidos en el polipéptido de ensayo difieren de los polipéptidos de referencia. Pueden realizarse comparaciones similares entre polinucleótidos de ensayo y de referencia. Dichas diferencias pueden presentarse como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente a lo largo de longitud completa de una secuencia de aminoácidos o pueden agruparse en una o más localizaciones de longitud variable hasta un máximo permisible, por ejemplo, una diferencia de 10/100 aminoácidos (identidad de aproximadamente el 90%). Las diferencias se definen como sustituciones de ácido nucleico o aminoácidos o deleciones.
Como se usa en este documento: la rigurosidad de hibridación en la determinación del porcentaje del emparejamiento erróneo es de la forma siguiente:
1) alta rigurosidad: SSPE 0,1 x, SDS al 0,1%, 65ºC
2) rigurosidad media: SSPE 0,2 x, SDS al 0,1%, 50ºC
3) rigurosidad baja: SSPE 1,0 x, SDS al 0,1%, 50ºC
Los especialistas en esta técnica saben que la etapa de lavado selecciona híbridos estables y también conocen los ingredientes del SSPE (véase, por ejemplo, Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, en: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), vol. 3, pág. B.13, véanse también numerosos catálogos que describen soluciones de laboratorio usadas comúnmente). El SSPE es NaCl 0,18 tamponado con fosfato a pH 7,4. Además, los especialistas en la técnica reconocen que la estabilidad de los híbridos se determina por la T_{m}, que es una función de la concentración de ión sodio y la temperatura (T_{m} = 81,5ºC-16,6 (log_{10}[Na^{+}]) + 0,41 (%G + C) - 600/l), de modo que los únicos parámetros en las condiciones de lavado críticos para la estabilidad del híbrido son la concentración de ión sodio en el SPPE (o SSC) y la temperatura.
Se entiende que pueden conseguirse rigurosidades equivalentes usando tampones alternativos, sales y temperaturas. A modo de ejemplo y sin limitación, son procedimientos que usan condiciones de baja rigurosidad los siguientes (véase también Shilo y Weinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792 (1981)): se pretratan filtros que contienen ADN durante 6 horas a 40ºC en una solución que contiene formamida al 35%, SSC 5X, Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP al 0,1%, Ficoll al 0,1%, BSA al 1% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado a una concentración de 500 \mug/ml (SSC 10X es cloruro de sodio 1,5 M y citrato de sodio 0,15 M, ajustado a un pH de 7).
Las hibridaciones se realizan en la misma solución con las siguientes modificaciones: PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2% y ADN de esperma de salmón a 100 \mug/ml, sulfato de dextrano al 10% (p/vol) y se usan 5-20 X 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. Los filtros se incuban en mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 40ºC y después de lavan durante 1,5 horas a 55ºC en una solución que contiene SSC 2X, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, y SDS al 0,1%. La solución de lavado se reemplaza con solución recién preparada y se incuba 1,5 horas adicionales a 60ºC. Los filtros se secan con papel secante y se exponen a autorradiografía. Si es necesario, los filtros se lavan una tercera vez a 65-68ºC y se vuelven a exponer a la película. Otras condiciones de baja rigurosidad que pueden usarse se conocen bien en la técnica (por ejemplo, como se emplean para hibridaciones entre especies).
A modo de ejemplo y sin limitación, los procedimientos que usan condiciones de rigurosidad moderada incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, los siguientes: se pretratan filtros que contienen ADN durante 6 horas a 55ºC en una solución que contiene SSC 6X, solución de Denhart 5X, SDS al 0,5% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 100 \mug/ml. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución y se usan 5-20 X 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. Los filtros se incuban en mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 55ºC y después se lavan dos veces durante 30 minutos a 60ºC en una solución que contienen SSC 1X y SDS al 0,1%. Los filtros se secan con papel secante y se exponen a autorradiografía. Otras condiciones de rigurosidad moderada que pueden usarse son bien conocidas en la técnica. El lavado de los filtros se realiza a 37ºC durante 1 hora en una solución que contiene SSC 2X y SDS al 0,1%.
A modo de ejemplo y no como limitación, son procedimientos que usan condiciones de alta rigurosidad los siguientes: se lleva a cabo una hibridación previa de filtros que contienen ADN durante un periodo de 8 horas a una noche a 65ºC en tampón compuesto por SSC 6X, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,02% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado a una concentración de 500 \mug/ml. Los filtros se hibridan durante 48 horas a 65ºC en mezcla de prehibridación que contiene 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 X 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. El lavado de los filtros se realiza a 37ºC durante 1 hora en una solución que contiene SSC 2X, PVP al 0,01%, Ficoll al 0,01% y BSA al 0,01%. Esto se continúa por un lavado en SSC 0,1 X a 50ºC durante por 45 minutos antes de la autorradiografía. Otras condiciones de alta rigurosidad que pueden usarse son bien conocidas en la técnica.
Las expresiones sustancialmente idéntica o sustancialmente homóloga o similares varían con el contexto como entienden los especialistas en la técnica pertinente y generalmente significan una identidad de al menos el 60% o el 70%, preferiblemente significa al menos el 80%, el 85% o más, preferiblemente al menos el 90% y más preferiblemente de al menos el 95%.
Debe entenderse que los compuestos proporcionados en este documento pueden contener centros quirales. Dichos centros quirales pueden ser de la configuración (R) o (S) o pueden ser una mezcla de las mismas. Por lo tanto, los compuestos que se proporcionan en este documento pueden ser enantioméricamente puros o ser mezclas estereoisoméricas o diastereoméricas. En el caso de restos aminoacídicos, dichos restos pueden ser la forma L o D. En una realización, la configuración para restos aminoacídicos naturales es L.
Como se usa en este documento, sustancialmente puro significa suficientemente homogéneo para aparecer libre de impurezas fácilmente detectables como se determina por métodos convencionales de análisis tales como cromatografía de capa fina (TLC), electroforesis en gel, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y espectrometría de masas (MS), usados por los especialistas en la técnica para evaluar dicha pureza, o suficientemente puro para que una purificación adicional no alterare de forma detectable las propiedades físicas y químicas, tales como actividades enzimáticas y biológicas de la sustancia. Los especialistas en la técnica conocen métodos para la purificación de los compuestos para producir compuestos químicamente puros de manera sustancial. Un compuesto químicamente puro de manera sustancial puede, sin embargo, ser una mezcla de estereoisómeros. En dichos casos, una purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.
Como se usa en este documento, un enlace o resto escindible se refiere a un enlace o resto que se escinde o puede escindirse en las condiciones específicas, tales como químicamente, enzimáticamente o fotolíticamente. Cuando no se especifique en este documento, dicho enlace es escindible en condiciones de análisis de MALDI-MS, tal como por un láser UV o IR.
Como se usa en este documento, un resto "selectivamente escindible" es un resto que puede escindirse selectivamente sin afectar o alterar la composición de las otras porciones del compuesto de interés. Por ejemplo, un resto escindible L de los compuestos que se proporcionan en este documento es uno que puede escindirse por medios químicos, enzimáticos, fotolíticos u otros sin afectar o alterar la composición (por ejemplo, la composición química) de la biomolécula conjugada, incluyendo una proteína. Los restos "no escindibles" son los que no pueden escindirse selectivamente sin afectar o alterar la composición de las otras porciones del compuesto de interés.
Como se usa en este documento, la unión con alta afinidad se refiere a una unión que tiene una constante de asociación k_{a} de al menos 10^{9} y generalmente de 10^{10}, 10^{11} litros/mol o superior, o una K_{eq} de 10^{9}, 10^{10}, 10^{11}, 10^{12} o superior. Para los fines de este documento, son enlaces de alta afinidad formados por los grupos de reactividad los que son estables al láser (UV e IR) usados en análisis de MALDI-MS.
Como se usa en este documento, "alquilo", "alquenilo" y "alquinilo", si no se especifica, contienen de 1 a 20 carbonos, o de 1 a 16 carbonos y son cadenas de carbono lineales o ramificadas. Las cadenas de carbono de alquenilo son de 2 a 20 carbonos y, en ciertas realizaciones, contienen de 1 a 8 dobles enlaces. Las cadenas de carbono de alquenilo de 1 a 16 carbonos, en ciertas realizaciones, contienen de 1 a 5 dobles enlaces. Las cadenas de carbono de alquinilo son de 2 a 20 carbonos y en una realización contienen de 1 a 8 triples enlaces. Las cadenas de carbono de alquinilo de 2 a 16 carbonos, en ciertas realizaciones, contienen de 1 a 5 triples enlaces. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo ejemplares incluyen, pero sin limitación, metilo, etilo, propilo, isopropilo, isobutilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo, isopentilo, neopentilo, terc-pentilo e isohexilo. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, a menos que se especifique otra cosa, pueden sustituirse opcionalmente con uno o más grupos, incluyendo sustituyentes de grupo alquilo que pueden ser iguales o diferentes.
Como se usa en este documento, "alquilo inferior", "alquenilo inferior" y "alquinilo inferior" se refieren a cadenas de carbono que tienen menos de aproximadamente 6 carbonos.
Como se usa en este documento, "alqu(en)(in)ilo" se refiere a un grupo alquilo que contiene al menos un doble enlace y al menos un triple enlace.
Como se usa en este documento, un "sustituyente de grupo alquilo " incluye, pero sin limitación, halo, haloalquilo, incluyendo halo alquilo inferior, arilo, hidroxi, alcoxi, ariloxi, alquiloxi, alquiltio, ariltio, aralquiloxi, aralquiltio, carboxi alcoxicarbonilo, oxo y cicloalquilo.
Como se usa en este documento, "arilo" se refiere a grupos aromáticos que contienen de 5 a 20 átomos de carbono y pueden ser un sistema de anillos mono-, multicíclicos o condensados. Los grupos arilo incluyen, pero sin limitación, fenilo, naftilo, bifenilo, fluorenilo y otros que pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes.
Como se usa en este documento, "arilo" también se refiere a grupos arilo, incluyendo, pero sin limitación, grupos ariloxi, ariltio, arilcarbonilo y arilamino.
Como se usa en este documento, un "sustituyente de grupo arilo" incluye, pero sin limitación, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, arilo, heteroarilo opcionalmente sustituido con 1 o más, incluyendo de 1 a 3, sustituyentes seleccionados entre halo, halo alquilo y alquilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquenilo que contiene de 1 a 2 dobles enlaces, alquinilo que contiene de 1 a 2 triples enlaces, grupos alqu(en)(in)ilo, halo, pseudohalo, ciano, hidroxi, haloalquilo y polihaloalquilo, incluyendo halo alquilo inferior, especialmente trifluorometilo, formilo, alquilcarbonilo, arilcarbonilo que está opcionalmente sustituido con 1 o más, incluyendo de 1 a 3, sustituyentes seleccionados entre halo, halo alquilo y alquilo, heteroarilcarbonilo, carboxi, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, diarilaminocarbonilo, aralquilaminocarbonilo, alcoxi, ariloxi, perfluoroalcoxi, alqueniloxi, alquiniloxi, arilalcoxi, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo, arilaminoalquilo, amino, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alquilarilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, azido, nitro, mercapto, alquiltio, ariltio, perfluoroalquiltio, tiociano, isotiociano, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfinilo, arilsulfonilo, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo, dialquilaminosulfonilo y arilaminosulfonilo.
Como se usa en este documento, "aralquilo" se refiere a un grupo alquilo en el que uno de los átomos de hidrógeno del alquilo se reemplaza por un grupo arilo.
Como se usa en este documento, "heteroaralquilo" se refiere a un grupo alquilo en el que uno de los átomos de hidrógeno del alquilo se reemplaza por un grupo heteroarilo.
Como se usa en este documento, "cicloalquilo" se refiere a un sistema de anillos mono- o multicílicos saturados, en una realización, de 3 a 10 átomos de carbono o de 3 a 6 átomos de carbono; cicloalquenilo y cicloalquinilo se refieren a sistemas de anillo mono- o multicíclicos que incluyen respectivamente al menos un doble enlace y al menos un triple enlace. Los grupos cicloalquenilo y cicloalquinilo pueden contener, en una realización, de 3 a 10 átomos de carbono, con grupos cicloalquenilo, en otras realizaciones, que contienen de 4 a 7 átomos de carbono y grupos cicloalquinilo, en otras realizaciones, que contienen de 8 a 10 átomos de carbono. Los sistemas de anillo de los grupos cicloalquilo, cicloalquenilo y cicloalquinilo pueden estar compuestos por un anillo o por dos o más anillos que pueden unirse de una forma condensada, enlazada o espiro-conectada, y pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes de grupo alquilo. "Cicloalqu(en)(in)ilo" se refiere a un grupo cicloalquilo que contiene al menos un doble enlace y al menos un triple enlace.
Como se usa en este documento, "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclicos o multicíclicos, en una realización de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 miembros donde uno o más, o de 1 a 3, de los átomos del sistema de anillos es un heteroátomo, que es un elemento distinto de carbono, por ejemplo, átomos de nitrógeno, oxígeno y azufre. El heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más, incluyendo de 1 a 3, sustituyentes de grupo arilo. El grupo heteroarilo puede estar opcionalmente condensado con un anillo de benceno. Los grupos heteroarilo ejemplares incluyen, pero sin limitación, pirroles, porfirinas, furanos, tiofenos, selenofenos, pirazoles, imidazoles, triazoles, tetrazoles, oxazoles, oxadiazoles, tiazoles, tiadiazoles, indoles, carbazoles, benzofuranos, benzotiofenos, indazoles, bencimidazoles, benzotriazoles, benzoxatriazoles, benzotiazoles, benzoselenozoles, benzotiadiazoles, benzoselenodiazoles, purinas, piridinas, piridazinas, pirimidinas, pirazinas, pirazinas, triazinas, quinolinas, acridinas, isoquinolinas, cinnolinas, ftalazinas, quinazolinas, quinoxalinas, fenazinas, fenantrolinas, imidazinilo, pirrolidinilo, pirimidinilo, tetrazolilo, tienilo, piridilo, pirrolilo, N-metilpirrolilo, quinolinilo e isoquinolinilo.
Como se usa en este documento, "heteroarilo" también se refiere a grupos que contienen heteroarilo, incluyendo, pero sin limitación, heteroariloxi, heteroariltio, heteroarilcarbonilo y heteroarilamino.
Como se usa en este documento, "heterocíclico" se refiere a un sistema de anillos monocíclicos o multicíclicos, en una realización de 3 a 10 miembros, en otra realización de 4 a 7 miembros, incluyendo de 5 a 6 miembros, donde uno o más, incluyendo de 1 a 3 de los átomos del sistema de anillos es un heteroátomo, que es un elemento distinto de carbono, por ejemplo, átomos de nitrógeno, oxígeno y azufre. El heterociclo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más, o de 1 a 3 sustituyentes de grupo arilo. En ciertas realizaciones, los sustituyentes del grupo heterocíclico incluyen hidroxi, amino, alcoxi que contiene de 1 a 4 átomos de carbono, halo alquilo inferior, incluyendo trihalometilo, tal como trifluorometilo, y halógeno. Como se usa en este documento, el término heterociclo puede incluir referencia a heteroarilo.
Como se usa en este documento, la nomenclatura alquilo, alcoxi, carbonilo, etc., se usa tal como se entiende de forma general por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, como se usa en este documento, alquilo se refiere a cadenas de carbonos saturadas que contienen uno o más carbonos; las cadenas pueden ser lineales o ramificadas, incluir porciones cíclicas o ser cíclicas.
Cuando no se especifica el número de cualquier sustituyente dado (por ejemplo, "haloalquilo"), puede haber uno o más sustituyentes presentes. Por ejemplo, "haloalquilo" puede incluir uno o más de los mismos o distintos halógenos. Como otro ejemplo, "alcoxifenilo C_{1-3}" puede incluir uno o más de los mismos o distintos grupos alcoxi que contienen 1, 2 ó 3 carbonos.
Cuando los sustituyentes nombrados tales como carboxi o sustituyentes representados por variables tales como W se encierran por separado entre paréntesis, y sin embargo no poseen ningún subíndice fuera del paréntesis que indique el valor numérico y que sigue a los sustituyentes que no están entre paréntesis, por ejemplo, "alquil C_{1-4}(W)(carboxi)", cada uno de "W" y "carboxi" está unido directamente al alquilo C_{1-4}.
Como se usa en este documento, "halógeno" o "haluro" se refiere a F, Cl, Br o I.
Como se usan en este documento, los pseudohaluros son compuestos que se comportan de forma sustancialmente similar a los haluros. Dichos compuestos pueden usarse de la misma manera y tratarse de la misma manera que los haluros (X^{-}, donde X es a halógeno, tal como Cl o Br). Los pseudohaluros incluyen, pero sin limitación, cianuro, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, selenocianato, trifluorometoxi y azida.
Como se usa en este documento, "haloalquilo" se refiere a un radical alquilo inferior en el que uno o más de los átomos de hidrógeno se reemplazan por halógeno, incluyendo, pero sin limitación, clorometilo, trifluorometilo, 1-cloro-2-fluoroetilo y similares.
Como se usa en este documento, "haloalcoxi" se refiere a RO^{-} donde R es un grupo haloalquilo.
Como se usa en este documento, "sulfinilo" o "tionilo" se refiere a -S(O)-. Como se usa en este documento, "sulfonilo" o "sulfurilo" se refiere a -S(O)_{2}-. Como se usa en este documento, "sulfo" se refiere a -S(O)_{2}O-.
Como se usa en este documento, "carboxi" se refiere a un radical divalente, -C(O)O-. Como se usa en este documento, "aminocarbonilo" se refiere a -C(O)NH_{2}.
Como se usa en este documento, "alquilaminocarbonilo" se refiere a -C(O)NHR donde R es hidrógeno o alquilo, incluyendo alquilo inferior.
Como se usa en este documento "dialquilaminocarbonilo", como se usa en este documento, se refiere a -C(O)NR'R donde R' y R se seleccionan independientemente entre hidrógeno o alquilo, incluyendo alquilo inferior. Como se usa en este documento, "carboxamida" se refiere a grupos de fórmula -NR'COR.
Como se usa en este documento, "diarilaminocarbonilo" se refiere a -C(O)NRR' donde R y R' se seleccionan independientemente entre arilo, incluyendo arilo inferior, tal como fenilo.
Como se usa en este documento, "aralquilaminocarbonilo" se refiere a -C(O)NRR' donde uno de R y R' es arilo, incluyendo arilo inferior, tal como fenilo, y el otro de R y R' es alquilo, incluyendo alquilo inferior.
Como se usa en este documento, "arilaminocarbonilo" se refiere a -C(O)NHR donde R es arilo, incluyendo arilo inferior, tal como fenilo.
Como se usa en este documento, "alcoxicarbonilo" se refiere a -C(O)OR donde R es alquilo, incluyendo alquilo inferior.
Como se usa en este documento, "ariloxicarbonilo" se refiere a -C(O)OR donde R es arilo, incluyendo arilo inferior, tal como fenilo.
Como se usa en este documento, "alcoxi" y "alquiltio" se refieren a RO- y RS-, donde R es alquilo, incluyendo alquilo inferior.
Como se usa en este documento, "ariloxi" y "ariltio" se refieren a RO- y RS-, donde R es arilo, incluyendo arilo inferior, tal como fenilo.
Como se usa en este documento, "alquileno" se refiere a un grupo hidrocarbonado divalente alifático, lineal ramificado o cíclico, en una realización lineal o ramificado, que en ciertas realizaciones tiene de 1 a aproximadamente 20 átomos de carbonos, en otras realizaciones de 1 a 12 carbonos, incluyendo alquileno inferior. El grupo alquileno está opcionalmente sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo alquilo". Pueden insertarse opcionalmente a lo largo del grupo alquileno uno o más átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno sustituidos o sin sustituir, donde el sustituyente del nitrógeno es alquilo como se ha descrito previamente. Los grupos alquileno ejemplares incluyen metileno (-CH_{2}-), etileno (-CH_{2}CH_{2}-), propileno (-(CH_{2})_{3}-), ciclohexileno (-C_{6}H_{10}-), metilendioxi (-O-CH_{2}-O-) y etilendioxi (-O-(CH_{2})_{2}-O-). El término "alquileno inferior" se refiere a grupos alquileno que tienen de 1 a 6 carbonos. En ciertas realizaciones, los grupos alquileno son alquileno inferior, incluyendo alquileno de 1 a 3 átomos de carbono.
Como se usa en este documento, "alquenileno" se refiere a un grupo hidrocarbonado divalente alifático, lineal ramificado o cíclico, en una realización lineal o ramificado, que tiene, en ciertas realizaciones de 2 a aproximadamente 20 átomos de carbono y al menos un doble enlace, en otras realizaciones de 1 a 12 carbonos, incluyendo alquenileno inferior. El grupo alquenileno está opcionalmente sustituido con uno o más "sustituyentes de grupo alquilo". Pueden insertarse opcionalmente a lo largo del grupo alquenileno uno o más átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno sustituidos o sin sustituir, donde el sustituyente de nitrógeno es alquilo como se ha descrito previamente. Los grupos alquenileno ejemplares incluyen -CH=CH-CH=CH- y -CH = CH-CH_{2}-. El término "alquenileno inferior" se refiere a grupos alquenileno que tienen de 2 a 6 carbonos. En ciertas realizaciones, los grupos alquenileno son alquenileno inferior, incluyendo alquenileno de 3 a 4 átomos de carbono.
Como se usa en este documento, "alquinileno" se refiere a un grupo hidrocarbonado divalente alifático, lineal ramificado o cíclico, en una realización lineal o ramificado, que en ciertas realizaciones tiene de 2 a aproximadamente 20 átomos de carbono y al menos un triple enlace, en otras realizaciones de 1 a 12 carbonos, incluyendo alquinileno inferior. El grupo alquinileno está opcionalmente sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo alquilo". Pueden insertarse opcionalmente a lo largo del grupo alquinileno uno o mas átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno sustituido o sin sustituir, donde el sustituyente de nitrógeno es alquilo como se ha descrito previamente. Los grupos alquinileno ejemplares incluyen -C=C-C=C-, -C=C- y -C=C-CH_{2}-. El término "alquinileno inferior" se refiere a grupos alquinileno que tienen de 2 a 6 carbonos. En ciertas realizaciones, los grupos alquinileno son alquinileno inferior, incluyendo alquinileno de 3 a 4 átomos de carbono.
Como se usa en este documento, "alqu(en)(in)ileno" se refiere a un grupo hidrocarbonado divalente alifático, lineal ramificado o cíclico, en una realización lineal o ramificado, que en ciertas realizaciones tiene de 2 a aproximadamente 20 átomos de carbono y al menos un triple enlace, y al menos un doble enlace; en otras realizaciones de 1 a 12 carbonos, incluyendo alqu(en)(in)ileno inferior. El grupo alqu(en)(in)ileno está opcionalmente sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo alquilo". Pueden insertarse opcionalmente a lo largo del grupo alquinileno uno o mas átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno sustituido o sin sustituir, donde el sustituyente de nitrógeno es alquilo como se ha descrito previamente. Los grupos alqu(en)(in)ileno ejemplares incluyen -C=C-(CH_{2})_{n}-C=C-, donde n es 1 ó 2. El término "alqu(en)(in)ileno inferior" se refiere a grupos alqu(en)(in)ileno que tienen hasta 6 carbonos. En ciertas realizaciones, los grupos alqu(en)(in)ileno son alqu(en)(in)ileno inferior, incluyendo alqu(en)(in)ileno de 4 átomos de carbono.
Como se usa en este documento, "arileno" se refiere a un grupo aromático divalente, monocíclico o policíclico, en una realización monocíclico, que tiene en ciertas realizaciones de 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono y al menos un anillo aromático, en otras realizaciones de 5 a 12 carbonos, incluyendo arileno inferior. El grupo arileno está opcionalmente sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo alquilo". Puede insertarse opcionalmente alrededor del grupo arileno uno o mas átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno sustituido o sin sustituir, donde el sustituyente de nitrógeno es alquilo como se ha descrito previamente. Los grupos arileno ejemplares incluyen 1,2-, 1,3- y 1,4-fenileno. El término "amileno inferior" se refiere a grupos arileno que tienen 5 ó 6 carbonos. En ciertas realizaciones, los grupos arileno son amileno inferior.
Como se usa en este documento, "heteroarileno" se refiere a un sistema de anillos monocíclicos o multicíclicos divalentes, en una realización de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 miembros donde uno o más, o de 1 a 3 de los átomos del sistema de anillos es un heteroátomo, que es un elemento distinto de carbono, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre. El grupo heteroarileno puede estar opcionalmente sustituido con uno o más, o 1 a 3, sustituyentes del grupo arilo.
Como se usa en este documento, "alquilideno" se refiere a un grupo divalente, tal como =CR'R'', que se une a un átomo de otro grupo, formando un doble enlace. Los grupos alquilideno ejemplares son metilideno (=CH_{2}) y etilideno (=CHCH_{3}). Como se usa en este documento, "aralquilideno" se refiere a un grupo alquilideno en el que R' o R'' es un grupo arilo.
Como se usa en este documento, "amido" se refiere al grupo divalente -C(O)NH-. "Tioamido" se refiere al grupo divalente -C(S) NH-. "Oxiamido" se refiere al grupo divalente -OC(O)NH-. "Tiaamido" se refiere al grupo divalente -SC(O)NH-. "Ditiaamido" se refiere al grupo divalente -SC(S)NH-. "Ureido" se refiere al grupo divalente -HNC(O)NH-. "Tioureido" se refiere al grupo divalente -HNC(S)NH-.
Como se usa en este documento, "semicarbazida" se refiere a -NHC(O)NHNH-. "Carbazato" se refiere al grupo divalente -OC(O) NHNH-. "Isotiocarbazato" se refiere al grupo divalente -SC(O)NHNH-. "Tiocarbazato" se refiere al grupo divalente -OC (S)NHNH-. "Sulfonilhidrazida" se refiere al grupo -SO_{2}NHNH-. "Hidrazida" se refiere al grupo divalente -C(O)NHNH-. "Azo" se refiere al grupo divalente -N =N-. "Hidrazinilo" se refiere al grupo divalente -NH-NH-.
Como se usa en este documento, el término "aminoácido" se refiere a \alpha-aminoácidos que son racémicos, o de la configuración D- o L-. La designación "d" que precede a la designación de un aminoácido (por ejemplo, dAla, dSer, dVal, etc.) se refiere al isómero D del aminoácido. La designación "dl" que precede a una designación de un aminoácido (por ejemplo, dlAla) se refiere a una mezcla de los isómeros L- y D- del aminoácido.
Como se usa en este documento, cuando se especifica cualquier grupo particular, tal como fenilo o piridilo, esto significa que el grupo está sin sustituir o sustituido. Cuando no se especifican, los sustituyentes son halo, halo alquilo inferior y alquilo inferior.
Como se usa en este documento, una enfermedad causada por proteína alterada conformacionalmente (o una enfermedad de agregación de proteínas) se refiere a enfermedades asociadas con una proteína o polipéptido que tiene una conformación asociada con enfermedades. Los métodos y colecciones que se proporcionen en este documento permiten la detección de un confórmero asociado con una enfermedad que se va a detectar. Las enfermedades y proteínas asociadas que presentan dos o más conformaciones diferentes en las que al menos una conformación es una proteína alterada conformacionalmente incluyen, pero sin limitación, enfermedades amiloides y otras enfermedades neurodegenerativas conocidas por los especialistas en la técnica y expuestas a continuación.
Como se usa en este documento, la separación de células se refiere a un ensayo en el que las células se separan y se recuperan a partir de una suspensión basándose en propiedades medidas en un análisis de citometría de flujo. La mayoría de los ensayos usados para análisis pueden servir como base para experimentos de separación, siempre que las ventanas y regiones que definen las subpoblaciones que se van a separar no solapen lógicamente. Las velocidades de procesamiento máximas son típicamente de 5000 células/segundo (18 x 10^{6} células/hora). La velocidad de recogida de la población o poblaciones separadas depende principalmente de la condición de las células y del porcentaje de reactividad.
Como se usan en este documento, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácidos y otros compuestos están, a menos que se indique otra cosa, de acuerdo con su uso común, abreviaturas reconocidas o la Comisión IUPAC-IUB de Nomenclatura Bioquímica (véase, Biochem. 1972, 11:942). Por ejemplo, DMF = N,N-dimetilformamida, DMAc = N,N-dimetilacetamida; THF = tetrahidrofurano; TRIS = tris(hidroximetil)-aminometano; SSPE = tampón de solución salina-fosfato sódico EDTA; EDTA = ácido etilendiaminatetraacético; SDS = dodecil sulfato sódico.
B. Colecciones de compuestos de captura
Se proporcionan colecciones de compuestos de captura que se unen selectivamente a biomoléculas en muestras, tales como biomoléculas, particularmente, aunque no exclusivamente, un lisado celular o polipéptidos traducidos in vitro a partir de un lisado celular. Cada compuesto de captura en la colección puede unirse a grupos o clases específicas de biopolímeros y está diseñado para unirse covalentemente a un subconjunto de todas las biomoléculas en la muestra. Por ejemplo, una muestra puede contener miles de miembros, por ejemplo, un lisado celular. Las colecciones de compuestos permiten una selectividad suficiente de modo que, por ejemplo, aproximadamente 10-20 de los componentes de la muestra se unen a cada miembro de la colección. El número exacto es un número lo bastante pequeño para análisis de rutina para identificarlos, generalmente en una etapa, tal como mediante espectrometría de masas.
Las colecciones permiten una estrategia holística de arriba a abajo para el análisis del proteoma, incluyendo proteínas modificadas postraduccionalmente y otras biomoléculas. Los patrones de proteína y otras biomoléculas son el punto de partida para análisis que usan estas colecciones; en lugar de ácidos nucleicos y el genoma (de abajo hacia arriba). Las colecciones pueden usarse para evaluar los componentes de biomoléculas de una muestra, tal como una muestra biológica, para identificar componentes específicos para un fenotipo particular, tal como una patología, para identificar una función estructural, rutas bioquímicas y mecanismos de acción. Las colecciones y métodos de uso permiten un análisis imparcial de biomoléculas puesto que los métodos no evalúan necesariamente clases específicas de dianas, sino que se detectan o identifican cambios en muestras. Las colecciones permiten que se separen los componentes de una mezcla compleja de biomoléculas (es decir, un mezcla de 50, 100, 500, 1000, 2000 y más) en loci separados que contienen números reducidos, típicamente una reducción del 10%, 50% o superior en la complejidad, o de aproximadamente 1 a 50 biomoléculas diferentes por locus en una matriz, de modo que los componentes en cada sitio pueden analizarse, tal como mediante análisis espectrométrico de masas en solitario o en combinación con otros análisis. En algunas realizaciones, tal como para análisis fenotípicos, la homogeneidad de la muestra de partida, tal como células, puede ser importante. Para proporcionar homogeneidad, se comparan células con diferentes fenotipos, tales como
enfermas frente a sanas, del mismo individuo. Se proporcionan en este documento métodos para realizar esto.
En virtud de la estructura de compuestos en las colecciones, las colecciones pueden usarse para detectar cambios estructurales tales como los del procesamiento postraduccional de proteínas, y pueden usarse para detectar cambios en proteínas de membrana que estén implicadas en los procesos más fundamentales, tales como traducción de señales, canales iónicos, receptores para interacción de ligandos e interacciones célula a célula. Cuando las células enferman, se producen con frecuencia en proteínas de membrana cambios asociados con la enfermedad, tales como transformación.
Las colecciones contienen conjuntos de compuestos de captura de miembros. En general, los miembros de cada conjunto difieren al menos en un grupo funcional y generalmente en dos o tres, de los miembros de otros conjuntos. Por lo tanto, por ejemplo, los compuestos incluyen una función de reactividad, una función de selectividad y una función de separación, difiriendo cada conjunto en al menos la función de separación, típicamente al menos en la función de separación y selectividad y generalmente en las tres funciones. Las funciones de solubilidad, si están presentes, que se seleccionan para permitir el ensayo en un entorno seleccionado pueden diferir entre los compuestos o pueden ser iguales entre todos los conjuntos.
En la realización de los métodos, las colecciones se ponen en contacto con una muestra o componentes parcialmente purificados o purificados de la misma para efectuar la unión de biomoléculas a compuestos de captura en la colección. Los compuestos de captura pueden estar en una matriz direccionable, tal como unidos a un soporte sólido antes del contacto, o pueden organizarse en matrices después del contacto con la muestra. La matriz resultante se trata opcionalmente con un reactivo que escinde específicamente los polímeros unidos, tal como una proteasa, y se somete a análisis, particularmente a análisis espectrométrico de masas para identificar componentes de las biomoléculas unidas en cada locus. Una vez que se determina el peso molecular de una biomolécula, tal como una proteína o porción de la misma de interés, la biomolécula puede identificarse. Los métodos para la identificación incluyen comparación de los pesos moleculares con bases de datos, por ejemplo bases de datos de proteínas que incluyen fragmentos de proteasa y sus pesos moleculares.
Los compuestos de captura incluyen grupos funcionales que confieren reactividad, propiedades selectivas y de separación, dependiendo de la especificidad de separación y del análisis necesario (que depende la complejidad de la mezcla que se va a analizar). A medida que se añaden más grupos funcionales a los compuestos, los compuestos pueden presentar una selectividad aumentada y desarrollar un distintivo para moléculas diana similar a un sitio de unión a antígeno (Ag) en un anticuerpo. Los compuestos proporcionados en este documento incluyen grupos funcionales (funciones) de función: una función de reactividad, que se une a biopolímeros covalentemente, una función de selectividad, que en virtud de interacciones no covalentes altera, generalmente aumenta, la especificidad de la función de reactividad; una función de separación, que permite que los compuestos puedan dirigirse (organizarse en matrices o separarse de otro modo de acuerdo con la estructura del compuesto de captura; y opcionalmente una función de solubilidad, que cuando se selecciona altera la solubilidad de los compuestos dependiendo del entorno en el que se realizan las reacciones, permitiendo que las condiciones simulen condiciones fisiológicas. En general, la función de reactividad es el grupo reactivo que interacciona específicamente de forma covalente con biomoléculas particulares tales como proteínas o porciones de las mismas; y la otra funcionalidad, la función de selectividad, altera típicamente aumentando la especificidad de la función de reactividad. En general, la función reactiva interacciona covalentemente con grupos en una biomolécula particular, tales como grupos amina en la superficie de una proteína. La función de reactividad interacciona con biomoléculas para formar un enlace covalente. Las condiciones de análisis incluyen, pero sin imitación, análisis espectrofotométrico de masas tal como espectrometría de masas de desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI, TOF). La función de selectividad influye en los tipos de biomoléculas que pueden interaccionar con la función de reactividad mediante una interacción no covalente. La función de selectividad altera la especificidad para los grupos particulares, generalmente reduciendo el número de dichos grupos con los que reaccionan las funciones de reactividad. Un objetivo es reducir el número de proteínas o biomoléculas unidas en un locus, de modo que las proteínas puedan separarse después, tal como mediante espectrometría de masas.
Los compuestos para usar en los métodos de este documento pueden separarse en al menos dos conjuntos: uno para reacciones en solución acuosa (por ejemplo, para reacción con biomoléculas hidrófilas) y el otro para reacción de disolventes orgánicos (por ejemplo, cloroformo) (por ejemplo, para reacción con biomoléculas hidrófobas). Por lo tanto, en cierta realizaciones, los compuestos que se proporcionan en este documento discriminan entre biomoléculas hidrófilas e hidrófobas incluyendo, pero sin imitación, proteínas y permiten el análisis de ambas clases de biomoléculas.
C. Compuestos de Captura
Se proporcionan compuestos de captura (también denominados agentes de captura). Los compuestos de captura incluyen un núcleo "Z" que es un derivado de tritilo como se define en la reivindicación 1 que presenta una o más funciones de reactividad "X" y al menos una función de selectividad "Y" y una función de separación "Q", y también opcionalmente una o más funciones de solubilidad "W". Además, se incluyen enlazadores escindibles y otras funciones en las moléculas. La forma particular en la que se presentan las funciones en el núcleo o armazón es una cuestión de elección de diseño, pero se seleccionan de modo que la molécula resultante tenga la propiedad de que capture biomoléculas, particularmente proteínas, con una especificidad suficiente y covalentemente para permitir el análisis, tal como por espectrometría de masas, incluyendo análisis espectrométrico de masas de MALDI.
X, la funcionalidad de reactividad, se selecciona para ser cualquier cosa que forme dicho enlace covalente. La funcionalidad de selectividad Y es un grupo que "examina" la topología de la proteína alrededor de los sitios de unión de reactividad y selecciona grupos particulares en biomoléculas de entre los que pueden formar un enlace covalente con un grupo de reactividad. Por ejemplo, un grupo de selectividad puede causar impedimento estérico o permitir la unión especifica a un epítopo, o cualquier cosa entre medias. Puede ser un sustrato para un fármaco, lípido o péptido. Selecciona el entorno de los grupos con los que interacciona la función de reactividad. La funcionalidad de selectividad Y puede ser una mediante la que un compuesto de captura forma un enlace covalente con una biomolécula en una mezcla de modo que la afinidad de unión del compuesto de captura con la biomolécula a través de la funcionalidad reactiva en presencia de la funcionalidad de selectividad sea al menos diez veces o 100 veces superior que en ausencia de la funcionalidad de selectividad.
Q es una función de separación que puede ser cualquier cosa que proporcione un medio para separar cada conjunto de compuestos de captura de los otros, tal como por organización en matrices, e incluye grupos que pueden seleccionarse entre biotina, generalmente un espaciador, que se une a avidina en una matriz superficial (viceversa), oligonucleótidos para unión a matrices de oligonucleótidos o cualquier molécula que tenga un compañero de unión afín con el que se una con una afinidad suficiente para sobrevivir al análisis espectrométrico de masas, tal como análisis de MALDI-MS. Para cualquier colección puede usarse una diversidad de diferentes grupos de separación; cada conjunto de compuestos de captura debería tener Q únicos en comparación con los otros conjuntos. Además, pueden usarse medios de marcaje que pueden separarse en virtud del marcador, tales como marcadores RF, marcadores fluorescentes, marcadores codificados por color o perlas, codificados por barras u otros marcadores marcados con simbología y otros marcadores de este tipo. Por ejemplo, los compuestos de captura o las funcionalidades X, Y, Z, W pueden estar en una superficie que esté unida a un marcador RF o un marcador coloreado. Éstos pueden separarse fácilmente después de la reacción de modo que cada conjunto puede analizarse por separado para identificar biomoléculas unidas. Por lo tanto, las colecciones pueden incluir compuestos de captura que tengan una diversidad de grupos de separación.
La función de solubilidad, W, permite la alteración en propiedades de los componentes de compuesto de captura de la colección. Por ejemplo, W puede seleccionarse de modo que los compuestos de captura sean solubles o no en un medio o entorno de reacción particular, tal como un entorno hidrófobo, permitiendo de este modo reacciones con componentes de membrana. Las colecciones incluyen conjuntos de compuestos de captura, difiriendo cada uno de dichos conjuntos en Q y al menos uno o ambos de X e Y.
Como se indica, entre los compuestos de captura que se proporcionan están los que tienen al menos tres funcionalidades: reactividad, separación y selectividad. La función de separación puede escindirse selectivamente para permitir su eliminación. Estos compuestos también incluyen una función de selectividad para alterar el intervalo de unión de la función de reactividad que se une covalentemente a biomoléculas y, opcionalmente una función de solubilidad.
A continuación se proporciona una descripción y discusión más detallada de cada funcionalidad y realizaciones ejemplares no limitantes.
1. Z. El Núcleo
Todos los compuestos incluyen una función Z para presentar el grupo funcional que es un derivado tritilo definido en la reivindicación 1. En ciertas realizaciones de este documento, en los compuestos de captura para el uso en los métodos que se proporcionan en este documento, Z es un resto que se puede escindir antes de o durante el análisis de la biomolécula, incluyendo el análisis del espectro de masas, sin alterar la estructura química de la biomolécula, incluyendo, pero sin limitación, una proteína.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos que se proporcionan en este documento incluyen una etapa de análisis del espectro de masas de biomoléculas, incluyendo proteínas, que se presentan en un formato direccionable. En ciertas realizaciones, los compuestos se unen después a una matriz de oligonucleótidos individuales que incluye porciones de cadena sencilla (o porciones que pueden hacerse de cadena sencilla) que son complementarias a las porciones oligonucleotídicas, o porciones de análogos de oligonucleótidos (Q, la función de separación) de los compuestos de captura. En estas realizaciones, Z puede seleccionarse para ser un grupo que sea (i) estable en las condiciones de reacción necesarias para la reacción de los compuestos que se proporcionan en este documento con la biomolécula, tal como una proteína, (ii) estable en las condiciones necesarias para la hibridación del resto Q con los oligonucleótidos de cadena sencilla, y (iii) escindible antes o durante el análisis de la biomolécula.
En otra realización, Z con los grupos funcionales unidos puede diseñarse de modo que con los Q, X, W e Y se disuelva en bicapas lipídicas de una membrana celular, poniendo en contacto de este modo porciones internas de proteínas de la membrana celular mediante las funciones X e Y. En esta realización, el soporte captura proteínas, tales como proteínas de membrana y proteínas de orgánulos, incluyendo proteínas en el interior de membranas celulares. Los compuestos de captura y el grupo funcional pueden seleccionarse de modo que los compuestos de captura resultantes funcionen en condiciones fisiológicas seleccionadas. Por lo tanto, la selección de Z, Q, X, W e Y permite el diseño de superficies y soportes que imiten las membranas celulares y otras membranas biológicas.
En algunas realizaciones, puede proporcionarse una bicapa lipídica tal como las usadas para formar liposomas y otras micelas, en la superficie de un soporte como una forma de mantener las estructuras de proteínas de membrana para preparar una bicapa lipídica en la superficie. Esto puede emplearse cuando el soporte es la función "Z" y las otras funciones están unidas a la misma o cuando los compuestos están unidos a un soporte mediante un grupo Q, tal como mediante oligonucleótidos de doble cadena. Los compuestos de captura inmovilizados resultantes pueden recubrirse con o disolverse en un recubrimiento lipídico. Como resultado, los compuestos y colecciones que se proporcionan en este documento pueden actuar como una membrana artificial, puede emplearse química de polímeros dendriméricos para la síntesis controlada de membranas que tengan dimensiones de poro y espesores de membrana uniformes mediante la síntesis de copolímeros de bloque dendriméricos anfífilos o hiperramificados que puedan autoensamblarse para formar membranas de película orgánica ultrafinas sobre soportes porosos. En una realización, una membrana de película orgánica está compuesta por un copolímero dibloque dendrítico lineal compuesto por dendrímero de poliamidoamina (PAMAM) unido en un extremo de un bloque de óxido de polietileno lineal (PEO).
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Z puede escindirse en las condiciones de análisis espectrométrico de masas
En una realización, Z es un grupo fotoescindindible que se escinde con un láser usado en espectrometría de masas MALDI-TOF. En otra realización, Z es un grupo lábil para ácidos que se escinde tras la aplicación de una matriz para el análisis espectrométrico de masas para organizarse en matrices, tales como conjugados compuesto-biomolécula hibridados, o por exposición a ácidos (por ejemplo, ácidos trifluoroacético o clorhídrico) en forma de vapor o líquido, antes del análisis. En esta realización, la matriz mantiene la integridad espacial de la serie, permitiendo el análisis dirigible de la serie.
Z no puede escindirse en las condiciones de análisis espectrométrico de masas
En ciertas realizaciones, los compuestos de captura para uso en los métodos proporcionados en este documento tienen un resto Z que no puede escindirse en las condiciones usadas para el análisis de biomoléculas, incluyendo, pero sin limitación, espectrometría de masas, tal como espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Los compuestos de captura de estas realizaciones pueden usarse, por ejemplo, en los métodos proporcionados en este documento para identificar biomoléculas en mezclas de los mismos, para determinar las interacciones biomolécula-biomolécula, incluyendo proteína-proteína, y para determinar las interacciones biomolécula-molécula pequeña, incluyendo proteína-fármaco o proteína-candidato a fármaco. En estas realizaciones, no es necesario que el grupo Z se escinda para el análisis.
Por lo tanto, como se ha indicado, Z es un resto tritilo que sirve como núcleo para presentar la unión (las funciones de selectividad y reactividad) y la solubilidad y funciones de separación). En este documento se ejemplifican una diversidad.
Restos Z modificados por masa
En otras realizaciones, incluyendo realizaciones en las que Z es un resto escindible, Z incluye un marcador modificador de masas. Los marcadores modificadores de masas para uso en este documento incluyen, pero sin limitación, grupos de fórmula -X^{1}R^{10}-, en la que X^{1} es un grupo divalente tal como -O-, -O-C(O)-(CH_{2})_{y}-C(O)O-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-(CH_{2})_{y}-C(O)O-, -NH-C(S)-NH-, -O-P(O-alquil)-O-, -O-SO_{2}-O-, -O-C(O)-CH_{2}-S-, -S-, -NH- y
4
y R^{10} es un grupo divalente que incluye -(CH_{2}CH_{2}O)_{z}-CH_{2}CH_{2}O-, -(CH_{2}CH_{2}O)_{z}-CH_{2}CH_{2}O-alquileno, alquileno, alquenileno, alquinileno, arileno, heteroarileno, -(CH_{2})_{z}-CH_{2}-O-, -(CH_{2})_{z}-CH_{2}-O-alquileno, -(CH_{2}CH_{2}NH)_{z}-CH_{2}CH_{2}
NH-, -CH_{2}-CH (OH)-CH_{2}O-, -Si(R^{12})(R^{13})-, -CHF- y -CF_{2}-; donde y es un número entero de 1 a 20; z es un número entero de 0 a 200; R^{11} es la cadena lateral de un \alpha-aminoácido; y cada uno de R^{12} y R^{12} se selecciona independientemente entre alquilo, arilo y aralquilo.
En otras realizaciones, -X^{1}R^{10}- se selecciona entre -S-S-, -S-, -(NH-(CH_{2})_{y}-NH-C(O)-(CH_{2})_{y}-C (O))_{z}-NH-(CH_{2})_{y}-NH-C(O)-(CH_{2})_{y}-C(O)O-, -(NH-(CH_{2})_{y}-C(O))_{z}-NH-(CH_{2})_{y}-C(O)O-, -(NH-CH(R^{11})-C(O))_{z}-NH-CH (R^{11})-C(O)O-, y -(O-(CH_{2})_{y}-C(O))_{z}-NH-(CH_{2})_{y}-C(O)O-.
En las realizaciones anteriores, en las que R^{10} es un derivado de oligo-/polietilenglicol, el incremento en la modificación de masa es 44, es decir, pueden generarse especies de masa modificada diferentes cambiando z de 0 a 4, añadiendo de esta manera unidades de masa de 45 (z = 0), 89 (z = 1), 133 (z = 2), 177 (z = 3) y 221 (z = 4) a los compuestos. Los oligo oligo/polietilenglicoles también pueden estar monoalquilados con un alquilo inferior tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, t-butilo y similares.
Otros marcadores modificadores de masas incluyen, pero sin limitación, -CHF-, -CF_{2}-, -Si(CH_{3})_{2}-, -Si(CH_{3})(C_{2}H_{5})- y -Si (C_{2}H_{5})_{2}- En otras realizaciones, los marcadores modificadores de masas incluyen homo- o heteropéptidos. Un ejemplo no limitante que genera especies de masa modificada con un incremento de masa de 57 es una oligoglicina, que produce modificaciones de masa de, por ejemplo, (y = 1, z = 0), 131 (y = 1, z = 2), 188 (y = 1, z = 3) o 245 (y = 1, z = 4). También pueden usarse oligoamidas, por ejemplo, pueden obtenerse modificaciones de masa de 74 (y = 1, z = 0), 88 (y = 2, z = 0), 102 (y = 3, z = 0), 116 (y = 4, z = 0), etc. Los especialistas en la técnica apreciarán que existen numerosas posibilidades además de las ejemplificadas en este documento para introducir, de una manera predeterminada, muchos marcadores modificadores de masa diferentes en los compuestos proporcionados en este documento.
En otras realizaciones, R^{15} y/o S^{2} pueden funcionalizarse con -X^{1}R^{10}H o -X^{1}R^{10}-alquilo, donde X^{1} y R^{10} son como se han definido anteriormente, para servir como marcadores modificadores de masas.
2. Funciones de Reactividad "X"
Las funciones de reactividad ("X") confieren a los compuestos la capacidad de unirse de forma covalente a una biomolécula, particularmente a proteínas, incluyendo grupos funcionales que se encuentran en ellas, que incluyen grupos añadidos post-traslacionalmente. En general, la unión es covalente y estable en las condiciones de análisis, tal como análisis espectral de masas, incluyendo MALDI-TOF. Los grupos ejemplares se indican en este documento (véase, por ejemplo, la Figura 16, y el análisis que se muestra a continuación).
En los compuestos proporcionados en este documento, X es un resto que se une a o interactúa con la superficie de una biomolécula, incluyendo, pero sin limitación, la superficie de una proteína. Una cadena lateral de aminoácidos de una proteína; o un sitio activo de una enzima (proteína) o grupos funcionales de otra biomolécula, incluyendo lípidos y polisacáridos.
Por lo tanto, por ejemplo, X es un grupo que reacciona o interactúa con funcionalidades sobre la superficie de una proteína para formar un enlace covalente. Está disponible una gran selección de grupos funcionales diferentes para que X interactúe con la proteína. Por ejemplo, X puede actuar como un nucleófilo o un electrófilo para formar enlaces covalentes después de la reacción con los restos de aminoácidos de la superficie de una proteína. Los reactivos ejemplares que se unen de forma covalente a las cadenas laterales de aminoácidos incluyen, pero sin limitación, grupos protectores para restos hidroxilo, carboxilo, amino, amida y tiol, incluyendo, por ejemplo, los que se describen en T.W. Greene y P.G.M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3ª ed. (1999, Wiley Interscience); grupos fotorreactivos, pares de Diels Alder (es decir, un dieno sobre un lado y un doble enlace sobre el otro lado).
Los grupos protectores de hidroxi para uso como grupos X en este documento incluyen, pero sin limitación:
(i)
éteres tales como metilo, metilo sustituido (metoximetilo, metiltiometilo, (fenildimetilsilil)metoximetilo, benciloximetilo, p-metoxibenciloximetilo, p-nitrobenciloximetilo, o-nitrobenciloximetilo, (4-metoxifenoxi)metilo, guaiacolmetilo, t-butoximetilo, 4-penteniloximetilo, siloximetilo, 2-metoxietoximetilo, 2,2,2,-tricloroetoximetilo, bis(2-cloroetoximetilo), 2-(trimetilsilil)etoximetilo, metoximetilo, tetrahidropiranilo, 3-bromotetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, 1-metoxiciclohexilo, 4-metoxitetrahidropiranilo, 4-metoxitetrahidrotiopiranilo, S,S-dióxido de 4-metoxitetrahidrotiopiranil, 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-ilo, 1-(2-fluorofenil)-4-metoxipiperidin-4-ilo, 1,4-dioxan-2-ilo, tetrahidrofuranoílo, tetrahidrotiofuranilo, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-octahidro-7,8,8-trimetil-4,7-metanobenzofuran-2-ilo), etilo sustituido (1-etoxietilo, 1-(2-cloroetoxi)etilo, 1-[2-(trimetilsilil)etoxi]etilo, 1-metil-1-metoxietilo, 1-metil-1-benciloxietilo, 1-metil-1-benciloxi-2-fluoroetilo, 1-metil-1-fenoxietilo, 2,2,2-tricloroetilo, 1,1-dianisil-2,2,2-tricloroetilo, 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-fenilisopropilo, 2-trimetilsililetilo, 2-(benciltio)etilo, 2-(fenilselenil)etilo), t-butilo, alilo, propargilo, p-clorofenilo, p-metoxifenilo, p-nitrofenilo, 2,4-dinitrofenilo, 2,3,5,6-tetrafluoro-4-(tri-fluor-ometil)fenilo, bencilo, bencilo sustituido (p-metoxibencilo, 3,4,-dimetoxibencilo, o-nitrobencilo, p-nitrobencilo, p-halobencilo, 2,6-diclorobencilo, p-fenilbencilo, p-fenilenzilo, 2,6-difluorobencilo, p-acil-aminobencilo, p-azido-bencilo, 4-azido-3-clorobencilo, 2-trifluorometilbencilo, p-(metilsulfinil)bencilo), 2- y 4-picolilo, N-óxido de 3-metil-2-picolilo, 2-quinolinilmetilo, 1-pirenilmetilo, difenilmetilo, p,p'-dinitro-benzhidrilo, 5-dibenzosuberilo, trifenilmetilo, \alpha-naftildifenilmetilo, p-metoxifenildifenilmetilo, di(p-meto-xifenil)fenilmetilo, tri(p-metoxifenil)metilo, 4-(4-'-bromofenaciloxi)fenildifenilmetilo, 4,4',4''-tris(4,5-dicloroftalimidofenil)metilo, 4,4',4''-tris(levulinoiloxifenil)metilo, 4,4',4''-tris(benzoiloxifenil)metilo, 4,4'-dimetoxi-3''-[N-(imidazolilmetil)]tritilo, 4,4'-dimetoxi-3''-[N-(imidazoliletil)carbamoil]tritilo, 1,1-bis(4-metoxifenil-1'-pirenil-metilo, 4-(17-tetrabenzo[a,c,g.i]fluorenilmetil)-4,4''-dimetoxitritilo, 9-antrilo, 9-(9-fenil)xantenilo, 9-(9-fenil-10-oxo)antrilo, 1,3-benzoditiolan-2-ilo, s,s-dióxido de bencisotiazolilo, éteres de sililo (trimetilsililo, trietilsililo, triisopropilsililo, dimetilisopropilsililo, dietilisopropilsililo, dimetiltexilsililo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, tribencilsililo, tri-p-xililsililo, trifenilsililo, difenilmetilsililo, di-t-butilmetilsililo, tris(trimetilsilil)sililo (sisilo), (2-hidroxistiril)dimetilsililo, (2-hidroxistiril)diisopropilsililo, t-butilmetoxifenilsililo, t-butoxidifenilsililo);
(ii)
ésteres tales como formiato, benzoilformiato, acetato, acetato sustituido (cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato, metoxiacetato, trifenilmetoxiacetato, fenoxiacetato, p-clorofenoxiacetato, fenilacetato, p-P-fenilacetato, difenilacetato), nicotinato, 3-fenilpropionato, 4-pentenoato, 4-oxopentanoato (levulinato), 4,4-(etilenoditio)pentanoato, 5-[3-bis(4-metoxifenil)hidroximetilfenoxi]levulinato, pivaloato, 1-adamantoato, crotonato, 4-metoxicrotonato, benzoato, p-fenilbenzoato, 2,4,6-trimetilbenzoato (mesitoato), carbonatos (metilo, metoximetilo, 9-fluorenilmetilo, etilo, 2,2,2-tricloroetilo, 1,1,-dimetil-2,2,2-tricloroetilo, 2-(trimetilsilil)etilo, 2-(fenilsulfonil)etilo, 2-(trifenilfosfonio)etilo, isobutilo, vinilo, alilo, p-nitrofenilo, bencilo, p-metoxibencilo, 3,4,-dimetoxibencilo, o-nitrobencilo, p-nitrobencilo, 2-dansiletilo, 2-(4-nitrofenil)etilo, 2-(2,4-dinitrofenil)etilo, 2-ciano-1-feniletilo, S-bencil tiocarbonato, 4-etoxi-1-naftilo, metil ditiocarbonato), 2-yodobenzoato, 4-azidobutirato, 4-nitro-4-metilpentanoato, o-(dibromometil)benzoato, 2-formil-bencenosulfonato, 2-(metiltiometoxi)etil carbonato, 4-(metiltiometoxi)butirato, 2-(metiltiometoximetil)benzoato, 2-(cloroacetoximetil)benzoato, 2-[(2-cloroacetoxi)etil]benzoato, 2-[2-(benciloxi)etil]benzoato, 2-[2-(4-metoxibenciloxiletil]benzoato, 2,6-dicloro-4-metilfenoxiacetato, 2,6-dicloro-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenoxiacetato, 2,4-bis(1,1-dimetilpropil)fenoxiacetato, clorodifenilacetato, isobutirato, monosuccionoato, (E)-2-metil-2-butenoato (tigloato), o-(metoxicarbonil)benzoato, p-P-benzoato, \alpha-naftoato, nitrato, alquilo N,N,N',N'-tetrametilfosforodiamidato, 2-clorobenzoato, 4-bromobenzoato, 4-nitrobenzoato, 3'5'-dimetoxibenzoina, un éster fluorescente silvestre y completamente fotolábil, N-fenilcarbamato, borato, dimetilfosfinotioílo, 2,4-dinitrofenilsulfenato; y
(iii)
sulfonatos (sulfato, alilsulfonato, metanosulfonato (mesilato), bencilsulfonato, tosilato, 2-[(4-nitrofenil)etil]sulfonato).
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.950000\baselineskip
Los grupos protectores de carboxilo para uso como grupos X en este documento incluyen, pero sin limitación:
(i)
ésteres tales como ésteres que pueden escindirse enzimáticamente (heptilo, 2-N-(morfolino)etilo, colina, (metoxietoxi)etilo, metoxietilo), metilo, metilo sustituido (9-fluorenilmetilo, metoximetilo, metiltiometilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranoílo, metoxietoximetilo, 2-(trimetilsilil)etoximetilo, benciloximetilo, pivaloiloximetilo, fenilacetoximetilo, triisopropilsililmetilo, cianometilo, acetol, fenacilo, p-bromofenacilo, \alpha-metilfenacilo, p-metoxifenacilo, desilo, carboxamidometilo, p-azobencenocarboxamidometilo, N-ftali-midometilo), 2-etilo sustituido (2,2,2-tricloroetilo, 2-haloetilo, \omega-cloroalquilo, 2-(trimetilsilil)etilo, 2-metiltioetilo, 1,3-ditianil-2-metilo, 2-(p-nitrofenilsulfenil)etilo, 2-(p-toluenosulfonil)etilo, 2-(2'-piridil)etilo, 2-(p-metoxifenil)etilo, 2-(difenilfosfino)etilo, 1-metil-1-feniletilo, 2-(4-acetil-2-nitrofenil)etilo, 2-cianoetilo), t-butilo, 3-metil-3-pentilo, diciclopropilmetilo, 2,4-dimetil-3-pentilo, diciclopropilmetilo, ciclopentilo, ciclohexilo, alilo, metalilo, 2-metilbut-3-en-2-ilo, 3-metilbut-2-(prenilo), 3-buten-1-ilo, 4-(trimetilsilil)-2-buten-1-ilo, cinnamilo, \alpha-metilcinnamilo, prop-2-inilo (propargilo), fenilo, 2,6-dialquilfenilo (2,6,-dimetilfe-nilo, 2,6,diisopropilfenilo, 2,6-di-t-butil-4-metilfenilo, 2,6-di-t-butil-4-metoxifenilo, p-(metiltio)fenilo, pentafluorofenilo, bencilo, bencilo sustituido (trifenilmetilo; difenilmetilo; bis(o-nitrofenil)metilo, 9-antrilmetilo, 2-(9,10-dioxo)antrilmetilo, 5-dibenzosuberilo, 1-pirenilmetilo, 2-(trifluorometil)-6-cromonilmetilo, 2,4,6-trimetilbencilo, p-bromobencilo, o-nitrobencilo, p-nitrobencilo, p-metoxibencilo, 2,6-dimetoxibencilo, 4-(metilsulfinil)bencilo, 4-sulfobencilo, 4-azidometoxibencilo, 4-{N-[1-(4,4,-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutil]amino}bencilo, piperonilo, 4-picolilo, p-P-bencilo), sililo (trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, i-propildimetilsililo, fenildimetilsililo, di-t-butilmetilsililo, triisopropilsililo), (tiol) activado, oxazoles, 2-alquil-1,3-oxazoline, 4-alquil-5-oxo-1,3-oxazolidina, 2,2,-bistrifluorometil-4-alquil-5-oxo-1-,3-oxazolidina, 5-alquil-4-oxo-1,3-dioxolano, dioxanonas, orto ésteres, orto éster de Braun, complejo de pentaaminocobalto (iii), estannilo (trietilestannilo, tri-N-butilestannilo);
(ii)
amidas (N,N-dimetilo, pirrolidinilo, piperidinilo, 5,6-dihidrofenantridinilo, o-nitroanilido, N-7-nitroindolilo, N-8-nitro-1,2,3,4-tetrahidroquinolilo, amida de 2-(2-aminofenil)acetaldehído dimetil acetal, p-P-bence-nosulfonamida;
(iii)
hidrazidas (N-fenilo, N,N-diisopropilo); y
(iv)
sales de tetraalquilamonio.
\vskip1.000000\baselineskip
Los grupos protectores de tiol para uso como grupos X en este documento incluyen, pero sin limitación:
(i)
tioéteres (S-alquilo, S-bencilo, S-p-metoxibencilo, S-o- o p-hidroxi- o acetoxibencilo, S-p-nitrobencilo, S-2,4,6-trimetilbencilo, S-2,4,6-trimetoxibencilo, S-4-picolilo, S-2-quinolinilmetilo, N-óxido de S-2-picolilo, S-9-antrilmetilo, S-9-fluorenilmetilo, S-xantenilo, S-ferrocenilmetilo); S-difenilmetilo, S-difenilmetilo sustituido y S-trifenilmetilo (S-difenilmetilo, S-bis(4-metoxifenil)metilo, S-5-dibenzosuberilo, S-trifenilmetilo, S-difenil-4-piridilmetilo), S-fenilo, S-2,4-dinitrofenilo, S-t-butilo, S-1-adamantilo, S-metilo sustituido incluyendo monotio, ditio y aminotioacetales (S-metoximetilo, S-isobutoximetilo, S-benciloximetilo, S-2-tetrahidro-piranilo, S-benciltiometilo, S-feniltiometilo, tiazolidina, S-acetamidometilo, S-trimetilacetomidometilo, S-benzamidometilo, S-aliloxicarbonilaminometilo, S-fenilacetamidometilo, S-ftalimidometilo, S-acetil-, S-carboxil- y S-cianometilo), S-etilo sustituido (S-(2-nitro-1-fenil)etilo, S-2-(2,4-dinitrofenil)etilo, S-2-(4'-piridil)etilo, S-2-cianoetilo, S-2-(trimetilsilil)etilo, S-(1-m-nitrofenil-2-benzoil)etilo, S-2-fenilsulfoniletilo, S-1 -(4-metilfenilsulfonil)-2-metilprop-2-ilo, sililo;
(ii)
tioésteres (S-acetilo, S-benzoílo, S-trifluoroacetilo, S-N-[[(p-bifenilil)isopropoxi]carbonil]-N-metil-y-ami-notiobutirato, S-N-(t-butoxicarbonil-N-metil-y-aminotiobutirato), tiocarbonatos (S-2,2,2-tricloroetoxicarbonilo, S-t-butoxicarbonilo, S-benciloxicarbonilo, S-p-metoxibenciloxicarbonilo), tiocarbamatos (S-(N-etilo), S-(N-metoximetilo));
(iii)
disulfuros asimétricos (S-etil, S-t-butil, S-fenil disulfuros sustituidos);
(iv)
derivados de sulfenilo (S-sulfonato, S-sulfeniltiocarbonato, S-3-nitro-2-piridinasulfenil sulfuro, S-[tricarbo-nil[1,2,3,4,5-\eta]-2-,4-ciclohexadien-1-il]-hierro (1 +), oxatiolona); y
(v)
sal de S-metilsulfonio, sal S-bencil- y S-4-metoxibencilsulfonio, sal S-1-(4-ftalimidobutil)sulfonio, S-(di-metilfosfinol)tioílo, S-(difenilfosfino)tioilo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los grupos protectores de amino para uso como grupos X en este documento incluyen, pero sin limitación:
(i)
carbamatos (metilo, etilo, 9-fluorenilmetilo, 9-(2-sulfo)fluorenilmetilo, 9-(2,7-dibromo)fluorenilmetilo, 17-tetrabenzo[a,c,g,i]fluorometilo, 2-cloro-3-indenilmetilo, benc[f]inden-3-ilmetilo, 2,7-di-t-butil-[9-(10,10-di-oxo-10,10,10,10-tetrahidrotiox, 1,1-dioxobenzo[b]tiofeno-2-ilmetilo, etilo sustituido (2,2,2-tricloroetilo, 2-trimetilsililetilo, 2-feniletilo, 1-(1-adamantil)-1-metiletilo, 2-cloroetilo, 1,1-dimetil-2-haloetilo, 1,1-dimetil-2, 2-dibromoetilo, 1,1-dimetil-2,2,2-tricloroetilo, 1-metil-1-(4-bifenilil)etilo, 1-(3,5-di-t-butilfenil)-1-metiletilo, 2-(2'- y 4'-piridil)etilo, 2,2-bis(4'-nitrofenil)etilo, N-(2-pivaloilamino)-1,1-dimetiletilo, 2-[(2-ni-trofenil)ditio]-1 -feniletilo, 2-(N,N-diciclohexilcarboxamido)etilo), t-butilo, 1-adamantilo, 2-adamantilo, vinilo, alilo, 1-isopropilalilo, cinnamilo, 4-nitrocinnamilo, 3-(3'-piridil)prop-2-enilo, 8-quinolilo, N-hidroxipiperidinilo, alquilditio, bencilo, p-metoxibencilo, p-nitrobencilo, p-bromobencilo, p-clorobencilo, 2,4-diclorobencilo, 4-metilsulfinilbencilo, 9-antrilmetilo, difenilmetilo, 2-metiltioetilo, 2-metilsulfoniletilo, 2-(p-toluenosulfonil)etilo, [2-(1,3-ditianil)metilo, 4-metiltiofenilo, 2,4-dimetiltiofenilo, 2-fosfonioetilo, 1-metil-1-(trifenilfosfonio)etilo, 1,1-dimetil-2-cianoetilo, 2-dansiletilo, 2-(4-nitrofenil)etilo, 4-fenilacetoxibencilo, 4-azidobencilo, 4-azidometoxibencilo, m-cloro-p-aciloxibencilo, p-(dihidroxiboril)bencilo, 5-bencisoxazolilmetilo, 2-(trifluorometil)-6-chromonilmetilo, m-nitrofenilo, 3,5-dimetoxibencilo, 1-metil-1-(3,5-dimetoxifenil)etilo, \alpha-metilnitropiperonilo, o-nitrobencilo, 3,4-dimetoxi-6-nitrobencilo, fenil(o-nitrofenil)metilo, 2-(2-nitrofenil)etilo, 6-nitroveratrilo, 4-metoxifenacilo, 3',5'-dimetoxibenzoina, ureas (derivadas de fenotiacinil-(10)-carbonilo, N'-p-toluenosulfonilaminocarbonilo, N-fenilaminotiocarbonilo), t-amilo, S-bencil tiocarbamato, butinilo, p-cianobencilo, ciclobutilo, ciclohexilo, ciclopentilo, ciclopropilmetilo, p-deciloxibencilo, diisopropilmetilo, 2,2-dimetoxicarbonilvinilo, o-(N',N-dimetilcarboxamido)bencilo, 1,1-dimetil-3-(N',N-dimetilcarboxamido)propilo, 1,1-dimetil-propinilo, di(2-piridil)metilo), 2-furanilmetilo, 2-lodoetilo, isobornilo, isobutilo, isonicotinilo, p-(p'-metoxifenilazo)bencilo, 1-metilciclobutilo, 1-metilciclohexilo, 1-metil-1-ciclopropilmetilo, 1-metil-1-(p-fenilazofenil)etilo, 1-metil-1-feniletilo, 1-metil-1 -(4'-piridil)etilo, fenilo, p-(fenilazo)bencilo, 2,4,6-tri-t-butilfenilo, 4-(trimetilamonio)bencilo, 2,4,6-trimetilbencilo);
(ii)
amidas (N-formilo, N-acetilo, N-cloroacetilo, N-tricloroacetilo, N-trifluoroacetilo, N-fenilacetilo, N-3-fenilpropionilo, N-4-pentenoílo, N-picolinoílo, n-3-piridilcarboxamido, derivado de N-benzoilfenilalanilo, N-benzoílo, N-p-fenilbenzoílo, N-o-nitrofenilacetilo, N-o-nitrofenoxiacetilo, N-3-(o-nitrofenil)propionilo, N-2-metil-2-(o-nitrofenoxi)propionilo, N-3-metil-3-nitrobutirilo, N-o-nitrocinnamoílo, N-o-nitrobenzoílo, N-3-(4-t-butil-2,6-dinitrofenil-2,2-dimetilpropionilo, N-o-(benzoiloximetil)benzoílo, N-(2-acetoximetil)benzoílo, N-2-[(t-butildifenilsiloxi)metil]benzoílo, N-3-(3',6'-dioxo-2',4',5'-trimetilciclohexa-1',4'-dieno)-3,3-dimetilpropionilo, N-o-hidroxi-trans-cinnamoílo, N-2-metil-2-(o-fenilazofenoxi)propionilo, N-4-clorobutirilo, N-acetoacetilo, N-3-(p-hidroxifenil)propionilo, (N-ditiobenciloxicarbonilamino)acetilo, derivado de N-acetilmetionina, 4,5-difenil-3-oxazolin-2-ona), imidas cíclicas (N-ftaloílo, N-tetracloroftaloílo, N-4-nitroftaloílo, N-ditiasuccinoílo, N-2,3-difenilmaleoílo, N-2,5-dimetilpirrolilo, N-2,5-bis(triisopropilsiloxi)pirrolilo, aducto de N-1,1,4,4-tetrametildisililazaciclopentano, N-1,1,3,3-tetrametil-1,3-disilaisoindolilo, 1,3-dimetil-1,3,5-triazaciclohexan-2-ona 5-sustituido, 1,3-dibencil-1,3,5-triazaciclohexan-2-ona 5-sustituido, 3,5-dinitro-4-piridonilo 1-sustituido, 1,3,5-dioxazinilo);
(iii)
N-alquil y N-aril aminas (N-metilo, N-t-butilo, N-alilo, N-[2-(trimetilsilil)etoxi]metilo, N-3-acetoxipropilo, N-cianometilo, N-(1-isopropil-4-nitro-2-oxo-3-pirrolin-3-ilo), N-2,4-dimetoxibencilo, N-2-azanorbornenilo, N-2,4-dinitrofenilo, sales de amonio cuaternario, N-bencilo, N-4-metoxibencilo, N-2,4-dimetoxibencilo, N-2-hidroxibencilo, N-difenilmetilo, N-bis(4-metoxifenil)metilo, N-5-dibenzosuberilo, N-trifenilmetilo, N-(4-metoxi-fenil)difenilmetilo, N-9-fenilfluorenilo, N-ferrocenilmetilo, N-óxido de N-2-picolilamina);
(iv)
iminas (N-1,1-dimetiltiometileno, N-bencilidina, N-p-metoxibencilideno, N-difenilmetileno, N-[(2-piridil)mesitil]metileno, N-(N,N-dimetilaminometileno), N-(N',N'-dibencilaminometileno), N-(N-t-butilami-no-metileno), N,N-isopropilideno, N-p-nitrobencilideno, N-salicilideno, N-5-clorosalicilideno, N-(5-cloro-2-hidroxifenil)fenilmetileno, N-ciclohexilideno, N-t-butilideno);
(v)
enaminas (N-(5,5-dimetil-3-oxo-1-ciclohexenilo, N-2,7-dicloro-9-fluorenilmetileno, n-2-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etilo, N-4,4,4-trifluoro-3-oxo-1-buterilo, N-1-isopropil-4-nitro-2-oxo-3-pirrolin-3-ilo);
(vi)
derivados de N-heteroátomos (derivados de N-borano, derivado de ácido N-difenilborínico, derivado de ácido N-dietilborínico, derivado de ácido N-difluoroborínico, derivado de ácido N,N-3,5-bis(trifluorometil)fenilbórico, N-[fenil(penta-carbonilcromo- o -tungsteno)]carbenilo, quelante de N-cobre o N-cinc, derivado de 18-corona-6, N-nitro, N-nitroso, N-óxido, derivado de triazeno, N-difenilfosfinilo, N-dimetil- y difeniltiofosfinilo, N-dialquilo fosforilo, N-dibencilo y difenilo fosforilo, derivado de iminotrifenilfosforano, N-bencenosulfenilo, N-o-nitrobencenosulfenilo, N-2,4-dinitrobencenosulfenilo, N-pentaclorobencenosulfeni-lo, N-2-nitro-4-metoxibencenosulfenilo, N-trifenilmetilsulfenilo, N-1-(2,2,2-trifluoro-1,1-difenil)etilsulfenilo, N-3-nitro-2-piridinasulfenilo, N-p-toluenosulfonilo, N-bencenosulfonilo, N-2,3-6-trimetil-4-metoxibencenosulfonilo, N-2,4,6-trimetoxibencenosulfonilo, N-2,6-dimetil-4-metoxibencenosulfonilo, N-penta-metilbencenosulfonilo, N-2,3,5,6-tetrametil-4-metoxibencenosulfonilo, N-4-metoxibencenosulfonilo, N-2,4,6-trimetilbencenosulfonilo, N-2,6-dimetoxi-4-metilbencenosulfonilo, N-3-metoxi-4-t-butilbencenosulfonilo, N-2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo, N-2- y 4-nitrobencenosulfonilo, N-2,4-dinitrobencenosulfonilo, N-benzotiazol-2-sulfonilo, N-piridina-2-sulfonilo, N-metanosulfonilo, N-2-(trimetilsilil)etanosulfonilo, N-9-antracenosulfonilo, N-4-(4',8'-dimetoxinaftilmetil)bencenosulfonilo, N-bencilsulfonilo, N-tri-fluorometilsulfonilo, N-fenacilsulfonilo, N-t-butilsulfonilo);
(vii)
grupos protectores de imidazol incluyendo derivados de N-sulfonilo (N,N-dimetilsulfonilo, N-mesitylene-sulfonilo, N-p-metoxifenilsulfonilo, N-bencenosulfonilo, N-p-toluenosulfonilo); carbamatos (2,2,2-tricloroetilo, 2-(trimetilsilil)etilo, t-butilo, 2,4-dimetilpent-3-ilo, ciclohexilo, 1,1-dimetil-2,2,2-tricloroetilo, 1-adamantilo, 2-adamantilo); derivados de N-alquilo y N-arilo (N-vinilo, N-2-cloroetilo, N-(1-etoxi)etilo, N-2-(2'-piridil)etilo, N-2-(4'-piridil)etilo, N-2-(4'-nitrofenil)etilo), derivados de sililo N-trialquilo (N-t-butildimetilsililo, N-triisopropilsililo), N-alilo, N-bencilo, N-p-metoxibencilo, N-3,4-dimetoxibencilo, N-3-metoxibencilo, N-3,5-dimetoxibencilo, N-2-nitrobencilo, N-4-nitrobencilo, N-2,4-dinitrofenilo, N-pihenacilo, N-trifenilmetilo, N-difenilmetilo, N-(difenil-4-piridilmetilo), N-(n',n'-dimetilamino)), derivados de amino acetal (N-hidroximetilo, N-metoximetilo, N-dietoximetilo, N-etoximetilo, N-(2-cloroetoxi)metilo, N-[2-(trimetilsilil)etoxi]metilo, N-t-butoximetilo, N-t-butildimetilsiloximetilo, N-pivaloiloximetilo, N-benciloxi-metilo, N-dimetilaminometilo, N-2-tetrahidropiranilo), amidas (aducto de dióxido de carbono, N-formilo, N-(n',n'-dietilureidilo), N-dicloroacetilo, N-pivaloílo, N-difeniltiofosfinilo); y
(viii)
grupos protectores de amida -NH incluyendo amidas (N-alilo, N-t-butilo, N-diciclopropilmetilo, N-metoxi-metilo, N-metiltiometilo, N-benciloximetilo, N-2,2,2-tricloroetoximetilo, N-t-butildimetilsiloximetilo, N-pivaloiloximetilo, N-cianometilo, N-pirrolidinometilo, N-metoxi, N-benciloxi, N-metiltio, N-trifenilmetiltio, N-t-butildimetilsililo, N-triisopropilsililo, N-4-metoxifenilo, N-3,4-dimetoxifenilo, N-4-(metoximatoxi)fenilo, N-2-metoxi-1-naftilo, N-bencilo, N-4-metoxibencilo, N-2,4-dimetoxibencilo, N-3,4-dimetoxibencilo, N-o-nitrobencilo, N-bis(4-metoxifenil)metilo, N-bis(4-metoxifenil)fenilmetilo, N-bis(4-metilsulfinilfenil)metilo, N-trifenilmetilo, N-9-fenilfluorenilo, N-bis(trimetilsilil)metilo, N-t-butoxicarbonilo, N-benciloxicar-bonilo, N-metoxicarbonilo, N-etoxicarbonilo, N-p-toluenosulfonilo, N,O-isopropilideno acetal, N,O-benci-lideno acetal, N,O-formilideno acetal, N-butenilo, N-etenilo, N-[(e)-(2-metoxicarbonil)vinil], N-dietoxime-tilo, N-(1-metoxi-2,2-dimetilpropilo), N-2-(4-metilfenilsulfonil)etilo).
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Estos grupos protectores reaccionan con cadenas laterales de aminoácidos tales como hidroxilo (serina, treonina, tirosina); amino (lisina, arginina, histidina, prolina); amida (glutamina, asparagina); ácido carboxílico (ácido aspártico, ácido glutámico); y derivados de azufre (cisteína, metionina), y se adaptan fácilmente para el uso en los compuestos de captura como el resto reactivo X.
Además de la gran diversidad de reactivos específicos de grupo que se conocen por los especialistas en la técnica, los reactivos que se conocen en la técnica de productos naturales también pueden servir como base para X en la formación de enlaces covalentes. Otras selecciones para X incluyen tintes de purificación de proteínas, tales como azul de acridina o metileno, que tienen una fuerte afinidad para ciertas proteínas.
La reactividad de X puede verse influenciada por una o más funciones de selectividad Y del núcleo.
La función Y, que se analiza a continuación, se emplea para efectos electrónicos (por ejemplo, mesoméricos, inductivos) y/o efectos estéricos para modular la reactividad de X y la estabilidad del enlace X-biomolécula resultante. En estas realizaciones, las mezclas de biomoléculas, incluyendo, pero sin limitación, mezclas de proteínas, pueden reaccionar y analizarse debido a la modulación producida por Y, que cambia las propiedades electrónicas o estéricas de X y, por lo tanto, aumenta la selectividad de la reacción de X con la biomolécula.
En ciertas realizaciones, X es un éster activo, tal como -C(=O)O-Ph-pNO_{2}, -C(=O)O-C_{6}F_{5} o -C(=O)-O-(N-succinimidilo); un resto halo activo, tal como un \alpha-halo éter o un grupo \alpha-halo carbonilo, incluyendo, pero sin limitación, -OCH_{2}-I, -OCH_{2}-Br, -OCH_{2}-Cl, -C(O)CH_{2}I, -C(O)CH_{2}Br y -C(O)CH_{2}Cl; grupos funcionales específicos de cadena lateral de aminoácidos, tales como maleimido (para cisteína), un complejo metálico, incluyendo complejos de oro o mercurio (para cisteína o metionina), un epóxido o isotiocianato (para arginina o lisina); reactivos que se unen a sitios activos de enzimas, incluyendo, pero sin limitación, análogos de estados de transición.
3. Funciones de Selectividad "Y"
Las funciones de selectividad ("Y") sirven para modular la función de reactividad reduciendo el número de grupos a los que se unen las funciones de reactividad, tal como por obstaculización estérica y otras interacciones. Es un grupo que modifica las propiedades estéricas y/o electrónicas (por ejemplo, efectos mesoméricos, inductivos) así como las afinidades resultantes del compuesto de captura. Las funciones de selectividad incluyen cualquier grupo funcional que aumente la selectividad del grupo de reactividad de manera que se una a menos biomoléculas diferentes que en ausencia de la función de selectividad o se una con una mayor afinidad a las biomoléculas que en su ausencia. En los compuestos de captura proporcionados en este documento, Y se deja variar ampliamente dependiendo del objetivo a conseguir con respecto a la obstaculización estérica y a factores electrónicos ya que se relacionan con la modulación de la funcionalidad reactiva X. Por ejemplo, una función de reactividad X puede seleccionarse para que se una a grupos amina sobre proteínas; la función de selectividad puede seleccionarse para garantizar que sólo puede accederse a los grupos expuestos sobre la superficie. La función de selectividad es tal que los compuestos se unen a o reaccionan con (a través de la función de reactividad) menos biomoléculas diferentes cuando es parte de la molécula que cuando está ausente y/o los compuestos se unen con mayor especificidad y mayor afinidad. La función de selectividad puede unirse directamente a un compuesto o puede unirse mediante un enlazador, tal como CH_{2}CO_{2} o CH_{2}-O-(CH_{2})_{n}-O, donde n es un número entero de 1 a 12, o de 1 a 6, o de 2 a 4, véase, por ejemplo, la Figura 17 y el análisis que se muestra a continuación para funciones de selectividad ejemplares.
En ciertas realizaciones, cada Y es independientemente un grupo que modifica las propiedades de afinidad y/o las propiedades estéricas y/o electrónicas (por ejemplo, efectos mesoméricos, inductivos) del compuesto de captura resultante. Por ejemplo, Y, en ciertas realizaciones, se selecciona entre análogos e inhibidores de ATP; péptidos y análogos de péptidos; polietilenglicol (PEG); ésteres activados de aminoácidos, aislados o dentro de un péptido; citocromo C; y grupos tritilo hidrófilos.
En otra realización, Y es un resto de molécula pequeña, un producto natural, un agonista o antagonista de proteínas, un péptido o un anticuerpo (véase, por ejemplo, la Figura 17). En otra realización, Y es un compuesto o proteína hidrófila (por ejemplo, PEG o tritil éter), un compuesto o proteína hidrófoba (por ejemplo, aromáticos polares, lípidos, glicolípidos, fosfotriésteres, oligosacárido), un grupo cargado positiva o negativamente, una molécula pequeña un compuesto farmacéutico o un biomolécula que crea estructura secundarias o terciarias definidas.
En otras realizaciones, Y es un grupo que es un componente de un sistema luminiscente, incluyendo fluorescente, fosforescente, quimioluminiscente y bioluminiscente, o es un grupo que puede detectarse en un ensayo colorimétrico. En ciertas realizaciones, Y es un grupo monovalente seleccionado entre alquilo de cadena lineal o ramificada, alquenilo de cadena lineal o ramificada, alquinilo de cadena lineal o ramificada, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, heterociclilo, heterocicloalquilo de cadena lineal o ramificada, heterociclilalquenilo de cadena lineal o ramificada, heterociclilalquinilo de cadena lineal o ramificada, arilo, arilalquilo de cadena lineal o ramificada, arilalquenilo de cadena lineal o ramificada, arilalquinilo de cadena lineal o ramificada, heteroarilo, heteroarilalquilo de cadena lineal o ramificada, heteroarilalquenilo de cadena lineal o ramificada, heteroarilalquinilo de cadena lineal o ramificada, halo, haloalquilo de cadena lineal o ramificada, pseudohalo, azido, ciano, nitro, OR^{60}, NR^{60}R^{61}, COOR^{60}, C(O)R^{60}, C(O)NR^{60}R^{61}, S(O)_{q}R^{60},S(O)_{q}OR^{60}, S(O)_{q}NR^{60}R^{61}, NR^{60}C(O)R^{61}, NR^{60}C(O)NR^{60}R^{61}, NR^{60}S(O)qR^{60}, SIR^{60}R^{61}R^{62},
P(R60)_{2i} p(O)(R^{60})_{2}, P(OR^{60})2, P(O)(OR^{60})_{2}, P(O)(OR^{60}) (R^{61}) y P(O)NR^{60}R^{61}, donde q es un número entero de 0 a 2;
cada R^{60}, R^{61} y R^{62} es independientemente hidrógeno, alquilo de cadena lineal o ramificada, alquenilo de cadena lineal o ramificada, alquinilo de cadena lineal o ramificada, arilo, aralquilo de cadena lineal o ramificada, aralquenilo de cadena lineal o ramificada, aralquinilo de cadena lineal o ramificada, heteroarilo, heteroaralquilo de cadena lineal o ramificada, heteroaralquenilo de cadena lineal o ramificada, heteroaralquinilo de cadena lineal o ramificada, heterociclilo, heterociclilalquilo de cadena lineal o ramificada, heterociclilalquenilo de cadena lineal o ramificada o heteorciclilalquinilo de cadena lineal o ramificada.
Los grupos fluorescentes, colorimétricos y fosforescentes se conocen por los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.274.337; Sapan et al. (1999) Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2): 99-108; Sittampalam et al. (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1(3): 384-91; Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance Energy Transfer Microscopy, in: Fluorescence Microscopy of Living Cells en Culture, Parte B, Methods en Cell Biology, vol. 30, ed. Taylor, D. L. & Wang, Y. -L, San Diego: Academic Press (1989), pp. 219-243; Turro, N. J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings Publishing Col, Inc. (1978), pp. 296-361 y el Molecular Probes Catalog (1997), OR, USA). Los restos fluorescentes incluyen, pero sin limitación, 1- y 2-aminonaftaleno, p,p'-diaminostilbenos, pirenos, sales de fenantridina cuaternarias, 9-aminoacridinas, p,p'-di-aminobenzofenona iminas, antracenos, oxacarbocianina, merocianina, 3-aminoequilenina, perileno, bis-benzoxazol, bis-p-oxazolilo benceno, 1,2-benzofenazina, retinol, sales bis-3-aminopiridinio, helebrigenina, tetraciclina, esterofenol, bencimidazolilfenilamina, 2-oxo-3-cromen, indol, xanteno, 7-hidroxicoumarina, fenoxazina, calicilato, estrofantidina, porfirinas, triarilmetanos y flavina. Los compuestos fluorescentes que tienen funcionalidades para unirse a un compuesto proporcionado en este documento, o que puede modificarse para incorporar dichas funcionalidades, incluyen, por ejemplo, cloruro de dansilo, fluoresceínas tales como 3,6-dihidroxi-9-fenilxantidrol; isotiocianato de rodamina; N-fenil 1-amino-8-sulfona-tonaftaleno; N-fenil 2-amino-6-sulfonatonaftaleno; ácido 4-acetamido-4-isotiocianato-estilbeno-2,2'-disulfónico; ácido pireno-3-sulfónico; 2-toluidinonaftaleno-6-sulfonato; N-fenil-N-metil-2-aminoaftaleno-6-sulfonato; bromuro de etidio; estebrin; auromina-0,2-(9'-antroil)palmitato; dansil fosfatidiletanolamina; N,N'-dioctadecil oxacarbocianina: N,N'-dihexil oxacarbocianina; merocianina, 4-(3'-pirenil)estearato; d-3-aminodesoxi-equilenina; 12-(9'-antroil)estearato; 2-metilantraceno; 9-vinilantraceno; 2,2'(vinileno-p-fenileno)bisbenzoxazol; p-bis(2-(4-metil-5-fenil-oxazolil))benceno; 6-dimetilamino-1,2-benzofenazina; retinol; bis(3'-aminopiridinio) yoduro de 1,10-decandiilo; sulfonaftilhidrazona de helibrienina; clorotetraciclina; N-(7-dimetilamino4-metil-2-oxo-3-cromenil)maleimida; N-(p-(2-bencimidazolil)-fenil)maleimida; N-(4-fluoranthil)maleimida; bis(ácido homovanílico); resazarina; 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazol; merocianina 540; resorufina; rosa de bengala; y 2,4-difenil-3(2H)-furanona. Muchas marcas fluorescentes están disponibles en el mercado en SIGMA chemical company (Saint Louis, Mo.), Molecular Probes, R&D systems (Minneapolis, Minn.), Pharmacia LKB Biotechnology. (Piscataway, N.J.), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wis.), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, Md.), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland) y Applied Biosystems (Foster City, Calif.) así como otras fuentes comerciales conocidas por un especialista en la técnica.
Los grupos quimioluminiscentes destinados al uso en este documento incluyen cualquier componente de sistemas de generación de luz que se catalizan mediante una peroxidasa y requieren un anión superóxido (O_{2}) (y/o peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2})) (véase, por ejemplo, Musiani et al. (1998) Histol. Histopathol. 13(1): 243-8). Los sistemas de generación de luz incluyen, pero sin limitación, luminol, isoluminol, peroxioxalato-fluoróforo, éster de acridinio, lucigenina, dioxetanos, ésteres de oxalato, ésteres de indoxilo incluyendo ésteres de 3-O-indoxilo, derivados de naftaleno, tales como ácido 7-dimetilamino-naftaleno-1,2-dicarbónico hidrazida y análogos de luciferina cipiridina, incluyendo 2-metil-6-[p-metoxifenil]-3,7-dihiroimidazo[1,2-\alpha]pirazin-3-ona, 2-metil-6-fenil-3,7-dihiroimidazo[1,2-\alpha]pirazin-3-ona y 2-metil-6-[p-[2-[3-carboxilato sódico-4-(6-hidroxi-3-xantenona-9-il]feniltiourefeniltioureilenoetilenooxi]fenil]-3,7-dihiroimidazo[1,2-\alpha]pirazin-3-ona. En otras realizaciones, los restos quimioluminiscentes destinados al uso en este documento incluyen, pero sin limitación, luminol, isoluminol, N-(4-aminobutil)-N-etil isoluminol (ABEI, N-(4-aminobutil)-N-metil isoluminol (ABMI), que tienen las siguientes estructuras y participan en las siguientes reacciones:
5
donde se representa el luminol, cuando R es NH_{2} y R^{1} es H; isoluminol, cuando R es H y R^{1} es NH_{2}; para ABEI ((6-[N-(4-aminobutil)-N-etilamino]-2,3-dihiroftalazina-1-4-diona), cuando R es H y R^{1} es C_{2}H_{5}-N-(CH_{2})_{4}NH_{2}; y para ABMI ((6-[N-(4-aminobutil)-N-metilamino]-2,3-dihyroftalazina-1-4-diona), cuando R es H y R^{1} es CH_{3}-N-(CH_{2})_{4}NH_{2}.
Los grupos bioluminiscentes para el uso en este documento incluyen parejas de luciferasa/luciferina, incluyendo luciferasa de luciérnaga [Photinus pyralis], el sistema Aequorin (es decir, la fotoproteína de medusa purificada, aequorina). Se han estudiado muchas luciferasas y sustratos y están bien caracterizados y disponibles en el mercado (por ejemplo, la luciferasa de luciérnaga está disponible en Sigma, St. Louis, MO, y Boheringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN; la luciferasa de luciérnaga producida de forma recombinante y otros reactivos basados en este gen o para el uso con esta proteína están disponibles en Promega Corporation, Madison, WI; la fotoproteína luciferasa aequorina de medusa y la luciferasa de Renilla están disponibles en el mercado en Sealite Sciences, Bogart, GA; la coelenterazina, el sustrato de origen natural para estas luciferasas, está disponible en Molecular Probes, Eugene, OR]. Otros sistemas bioluminiscentes incluyen sistemas de crustáceos tales como Cyrpidina (Vargula); incluyendo los sistemas generadores de bioluminiscencia de insectos incluyendo luciérnagas, escarabajos de resorte y otros sistemas de insectos; sistemas bacterianos; sistemas generadores de bioluminiscencia de dinoflagelados; sistemas de moluscos tales como Latia y Pholas; lombrices y otros anélidos; gusanos relucientes; sistemas de gusanos poliquetos marinos; escarabajos ferrocarril sudamericanos (género Phrixothrix); peces (es decir, los que se encuentran en especies de Aristostomias, tales como A. scintillans (véase, por ejemplo, O'Day et al. (1974) Vision Res. 14:545-550), Pachystomias, y Malacosteus, tales como M. niger; los emisores azul/verde incluyen cilotona, mictófidos, pez hacha (agyropelecus), vinciguerria, howella, florenciella y Chauliodus); y proteínas fluorescentes, incluyendo las proteínas fluorescentes verde (es decir, GFP, incluyendo las de Renilla y de Ptilosarcus), roja y azul (es decir, BFP, incluyendo las de Vibrio fischeri, Vibrio harvevy o Photobacterium phosphoreum) (incluyendo luciferasa de Renilla mulleri, luciferasa de especies de Gaussia y luciferasa de especies de Pleuromamma) y ficobiliproteínas
Las funciones de selectividad ejemplares incluyen, pero sin limitación, ligandos que se unen a receptores tales como insulina y otros receptores (véase, por ejemplo, la Tabla de ligandos mostrada a continuación); ciclodextrinas; sustratos enzimáticos; estructuras lipídicas; prostaglandinas; antibióticos; esteroides; fármacos terapéuticos; inhibidores enzimáticos; análogos de estado de transición; péptidos específicos que se unen a superficies de biomoléculas incluyendo péptidos adhesivos; lectinas (por ejemplo, de tipo manosa, de tipo lactosa); péptidos miméticos; estatinas; funcionalidades tales como colorantes y otros compuestos y restos empleados para purificación de proteínas y cromatografía de afinidad. Véase, por ejemplo, la Figura 17 y la siguiente tabla de ligandos peptídicos:
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9
10
11
Otras selecciones para Y pueden identificarse por los especialistas en la técnica e incluyen, por ejemplo, las descritas en Techniques in Protein Chemistry, Vol. I (1989) T. Hugli ed. (Academic Press); Techniques in Protein Chemistry, Vol. 5 (1994) J.W. Crabb ed. (Academic Press); Lundblad Techniques in Protein Modification (1995) (CRC Press, Boca Raton, FL); Glazer et al. (1976) Chemical Modification of Proteins (Norte de Holanda (Amsterdam)) (American Elsevier, Nueva York); y Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques (Academic Press, San Diego, CA).
4. Funciones de Separación "Q"
Los compuestos que se proporcionan en este documento incluyen una función de separación ("Q") que permite que los compuestos se dirijan, tal como mediante captura en una matriz 2-D. Las funciones de separación son "marcadores", tales como marcadores oligonucleotídicos, de modo que cuando los compuestos se usan para bañar una matriz de oligonucleótidos complementarios unidos a soportes sólidos, tales como perlas o microplacas en condiciones de unión adecuadas, los oligonucleótidos hibridan. La identidad del compuesto de captura puede conocerse gracias a la posición en la matriz. Otras funciones de separación pueden estar codificadas ópticamente, incluyendo perlas codificadas por color o codificadas por barras que pueden separarse o una marcada electrónicamente, tal como proporcionando soportes de micro-reactor con marcadores electrónicos o soportes codificados por barras (véase, por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 6.025.129; la Patente de Estados Unidos Nº 6.017.496; la Patente de Estados Unidos Nº 5.972.639; la Patente de Estados Unidos Nº 5.961.923; la Patente de Estados Unidos Nº 5.925.562; la Patente de Estados Unidos Nº 5.874.214; la Patente de Estados Unidos Nº 5.751.629; y la Patente de Estados Unidos Nº 5.741.462), o marcadores químicos (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.432.018; la Patente de Estados Unidos Nº 5.547.839) o marcadores coloreados u otros métodos de dirección de este tipo que pueden usarse en lugar de matrices físicamente direccionables. La función de separación se selecciona para permitir la generación de matrices físicas u otro método de separación direccionable adecuado para el análisis, particularmente análisis espectrométrico de masas incluyendo, MALDI.
Otras funciones de separación para el uso en los compuestos que se proporcionan en este documento incluyen biotina, 6-His, BODIPY, oligonucleótidos, nucleósidos, nucleótidos, conjugados de anticuerpos-inmunotoxina, péptidos adhesivos, lectinas, liposomas, PNA, dextranos activados y péptidos. En una realización, la función de separación es un oligonucleótido, particularmente, un oligonucleótido de cadena sencilla o parcialmente de cadena sencilla para permitir la hibridación con regiones de cadena sencilla en oligonucleótidos complementarios en soportes sólidos.
En una realización de los compuestos de captura que se proporcionan en este documento, Q es un oligonucleótido de cadena sencilla no protegido o convenientemente protegido o un análogo de oligonucleótido (por ejemplo, PNA) de hasta 50 componentes básicos, que es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla de bases complementarias. En ciertas realizaciones, Q contiene de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10, 15, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 componentes básicos.
Las mezclas de biomoléculas, incluyendo, pero sin limitación, mezclas de proteínas, pueden tener diferentes hidrofobias (solubilidad) que los compuestos que se proporcionan en este documento. En ciertas realizaciones, para conseguir altos rendimientos de reacción entre la funcionalidad X en los compuestos que se proporcionan en este documento y la superficie proteica, la reacción se realiza en solución. En otras realizaciones, la reacción se realiza en una interfaz sólido/líquido o líquido/líquido. En ciertas realizaciones, las propiedades de solubilidad de los compuestos que se proporcionan en este documento están dominadas por el resto Q. Un cambio en la estructura de Q puede, en estas realizaciones, albergar diferentes solubilidades. Por ejemplo, si la mezcla de proteínas es muy soluble en agua, Q puede tener enlaces fosfodiéster naturales; si la mezcla biomolecular es muy hidrófoba (lípidos, glicolípidos, proteínas de membrana, lipoproteínas), Q puede tener sus enlaces fosfodiéster protegidos como fosfotriésteres o, como alternativa, estos enlaces pueden ser metilfosfonatodiésteres o ácidos péptido nucleicos (PNA). Si la mezcla de biomoléculas es de una hidrofobia intermedia, se consigue la solubilidad, por ejemplo, con enlaces fosfotioato diéster. También puede obtenerse una solubilidad intermedia por mezcla de enlaces fosfodiéster con fosfotriéster. Los especialistas en la técnica pueden imaginar fácilmente otros medios para conseguir este objetivo, incluyendo, pero sin limitación, la adición de sustituyentes en Z como se describe en otra parte en este documento.
La flexibilidad de ser capaces de cambiar la solubilidad de los compuestos es una ventaja significativa sobre los métodos actuales. Por el contrario, la electroforesis en gel 2D es útil solamente para el análisis de proteínas solubles en agua con el resultado de que por este método no pueden analizarse de aproximadamente el 30 al 35% de todas las proteínas celulares, tales como las que residen en la membrana celular. Esta es una limitación grave de la electroforesis en gel 2D puesto que muchas proteínas, incluyendo pero sin limitación las implicadas en contactos célula-célula específicos de tejido, transducción de señales, canales iónicos y receptores, se localizan en la membrana celular.
En una realización, después de la reacción o formación de complejos de los compuestos que se proporcionan en este documento con una biomolécula incluyendo, pero sin limitación, una proteína, los compuestos se ponen en contacto con un conjunto de secuencias complementarias resueltas espacialmente en un soporte plano, perlas o placas de microtitulación en condiciones de hibridación.
En ciertas realizaciones, Q es un grupo de oligonucleótido o de análogo de oligonucleótido monovalente que es al menos parcialmente de cadena sencilla o incluye una región que puede ser de cadena sencilla para la hibridación con oligonucleótidos complementarios en un soporte. Q puede tener la fórmula:
N^{1}_{m}-B_{i}-N^{2}_{n}-
en la que N^{1} y N^{2} son regiones de secuencias conservadas; B es una región de permutaciones de secuencia; m, i y n son el número de componentes básicos de N^{1}, B y N^{2}, respectivamente; y la suma de m, n e i es un número de unidades capaz de hibridar con una secuencia de ácido nucleico complementaria para formar un híbrido estable. Por lo tanto, en realizaciones en las que B es un ADN o ARN de cadena sencilla, el número de permutaciones de secuencia es igual a 4^{i}. En una realización, la suma de m, n e i es de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10, 15, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50. En ciertas realizaciones m y n son cada una, de forma independiente, de 0 a aproximadamente 48 o son cada una, de forma independiente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ó 15, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5. En otras realizaciones, i es de aproximadamente 2 a aproximadamente 25, o es de aproximadamente 3 a aproximadamente 12, o es de aproximadamente 3 a aproximadamente 5, 6, 7 u 8.
La porción oligonucleotídica o porción de análogo de oligonucleótido, de los compuestos (N^{1}_{m}-B_{i}-N^{2}_{n}-) puede variarse para permitir un tamaño óptimo para la unión y el reconocimiento de secuencias. La diversidad de la región de permutación de secuencia B puede ser relativamente baja si la mezcla de biomolécula, incluyendo, pero sin limitación, mezclas de proteínas, es de baja complejidad. Si la mezcla es de alta complejidad, la región de secuencia B tiene que ser de alta diversidad para proporcionar un poder de resolución suficiente para separar todas las especies. Las regiones conservadas flanqueantes N^{1}_{m} y N^{2}_{n} sólo deben ser de longitud suficiente para proporcionar una formación de híbridos eficaz y estable. Existe, sin embargo, flexibilidad en el diseño de estas regiones: N^{1}_{m} y N^{2}_{n} puede tener la misma longitud y secuencia, ser de la misma longitud y diferente secuencia o ser de diferente longitud y diferente secuencia. En ciertas realizaciones, incluyendo aquéllas en las que B es de una longitud suficiente para proporcionar una formación de híbridos estable, N^{1} y/o N^{2} están ausentes. En estas realizaciones, la porción oligonucleotídica de los compuestos o porción de análogo de oligonucleótido de los compuestos, tiene la fórmula N^{1}_{m}-B_{i} o B_{i}-N^{2}_{n}-, o B_{i}-.
En una realización ejemplar (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1.a.), B tiene una secuencia trinucleotídica embebida en el interior de una secuencia oligonucleotídica de 11 nucleótidos, donde las secuencias tetranucleotídicas N^{1}_{m} y N^{2}_{n} proporcionan regiones idénticas (conservadas) flanqueantes. Esta disposición para N^{1}_{m}-B_{i}-N^{2}_{n}- proporciona 64 compuestos diferentes donde cada compuesto lleva la misma funcionalidad reactiva X. En otra realización ejemplar (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1.b.), B tiene una secuencia tetranucleotídica embebida en el interior de una secuencia oligonucleotídica de 12 nucleótidos, donde las secuencias oligonucleotídicas N^{1}_{m} y N^{2}_{n} proporcionan secuencias octanucleotídicas flanqueantes pero no idénticas. Esta disposición para N^{1}_{m}-B_{i}-N^{2}_{n}- proporciona 256 compuestos diferentes que llevan, cada uno, la misma funcionalidad reactiva X. En una realización ejemplar adicional (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1.c.), B tiene una secuencia octanucleotídica embebida en el interior de una secuencia oligonucleotídica de 23 nucleótidos, donde las secuencias oligonucleotídicas N^{1}_{m} y N^{2}_{n} proporcionan secuencias octanucleotídicas flanqueantes pero no idénticas. Esta disposición para N^{1}_{m}-B_{i}-N^{2}_{n}- proporciona 65.536 compuestos diferentes donde cada uno leva la misma funcionalidad reactiva X y supera la complejidad estimada del proteoma humano (por ejemplo, 30.000-35.000 proteínas diferentes). En ciertas realizaciones, se usa una B con un exceso de permutaciones para la complejidad de la mezcla de proteína, ya que para reducir los emparejamientos erróneos pueden usarse para el análisis los oligonucleótidos con las mejores propiedades de hibridación.
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5. Funciones de Solubilidad "W"
Los compuestos proporcionados en este documento pueden incluir una función de solubilidad, W, para conferir propiedades de solubilidad deseadas, tales como solubilidad en medios hidrófobos o medios hidrófilos para permitir la investigación de las biomoléculas en medios fisiológicos, tal como en membranas. Las funciones de solubilidad ejemplares para uso en los compuestos proporcionados en este documento incluyen polietilenglicoles, sulfatos, polisulfatos, fosfatos, sulfonamatos, polisulfonatos, carbohidratos, dextrina, polifosfatos, ácidos policarboxílicos, trietanolamina, alcoholes, polímeros solubles en agua, sales de ácidos de alquilo y arilo carboxílicos y glicoles.
También pueden usarse compuestos anfifílicos, tales como sales de amonio cuaternario (es decir, betaína, colina, espingomielina, sales de tetrametil (o tetrabutil) alquil amonio, ténsidos catiónicos, iónicos y neutros como función de solubilidad W.
En otras realizaciones, W puede usarse para modular la solubilidad de los compuestos para conseguir soluciones homogéneas, si se desea, cuando reacciona con mezclas de biomoléculas, incluyendo, pero sin limitación, mezclas de proteínas. En ciertas realizaciones, W es un sulfonato, una funcionalidad polar que puede usarse para preparar compuestos más solubles en agua. En otras realizaciones, W es un grupo hidrófobo, incluyendo alquilo inferior, tal como terc-butilo, terc-amilo, isoamilo, isopropilo, n-hexilo, sec-hexilo, isohexilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo y n-amilo, o un grupo arilo, incluyendo fenilo o naftilo.
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6. Realizaciones Ejemplares
Lo siguiente proporciona compuestos de captura ejemplares que muestran las propiedades descritas anteriormente. Se entiende que estos son únicamente ejemplares y que también se contemplan para el uso en las colecciones los compuestos que se muestran a continuación dentro del alcance de las reivindicaciones y que pueden reaccionar de forma covalente con una biomolécula.
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a. Realización ejemplar 1
En una realización, los compuestos para uso en los métodos proporcionados en este documento tienen la fórmula:
300
en la que
Q es un oligonucleótido o análogo de oligonucleótido monocatenario no protegido o protegido adecuadamente (por ejemplo, ácido nucleico peptídico (PNA)) de hasta 50 componentes básicos, que es capaz de hibridarse con una molécula de ácido nucleico bicatenaria complementaria de base;
Z es un resto que puede escindirse antes o durante el análisis de una biomolécula, incluyendo el análisis espectral de masas, sin alterar la estructura de la biomolécula, incluyendo, pero sin limitación, una proteína;
es un grupo funcional que interactúa con y/o reacciona con funcionalidades sobre la superficie de una biomolécula, incluyendo, pero sin limitación, un proteína, para formar enlaces covalentes, e
Y es un grupo funcional que interactúa con y/o reacciona imponiendo una selectividad única mediante la introducción de funcionalidades que interactúan de forma no covalente con las proteínas diana.
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b. Realización ejemplar 2
En una realización, los compuestos para uso en los métodos proporcionados en este documento tienen la fórmula:
301
en la que
Q una función de separación que es un compuesto, o una o más biomoléculas (por ejemplo, una preparación de sustancias farmacéuticas, una biomolécula, fármaco u otro compuesto que inmoviliza el sustrato y captura las biomoléculas diana), que es o son capaces de unirse de forma no covalente y específica a un compuesto conocido para producir un compuesto de captura fuertemente unido;
Z es un resto que puede escindirse antes o durante el análisis de una biomolécula, incluyendo análisis espectral de masas, sin alterar la estructura de la biomolécula, incluyendo, pero sin limitación, una proteína;
X es un grupo funcional que interactúa con y/o reacciona con funcionalidades sobre la superficie de una biomolécula, incluyendo, pero sin limitación, una proteína para formar enlaces covalentes; e
Y es un grupo funcional que interactúa con y/o reacciona imponiendo una selectividad única mediante la introducción de funcionalidades que interactúan de forma no covalente con las proteínas diana.
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c. Realización ejemplar 4
En otra realización, los compuestos para uso en los métodos proporcionados en este documento tienen la fórmula:
302
en la que Q, Z, X e Y son como se han definido anteriormente; m es un número entero de 1 a 100, en una realización de 1 a 10, en otra realización de 1 a 3, 4 ó 5; y n es un número entero de 1 a 100, en una realización de 1 a 10, en otra realización de 1 a 3, 4 ó 5.
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d. Otras Realizaciones Ejemplares
En otras realizaciones, X es un fármaco farmacéutico. Los compuestos de estas realizaciones pueden usarse en la selección de fármacos mediante capturación de biomoléculas, incluyendo, pero sin limitación, proteínas, que se unen a la sustancia farmacéutica. Se identifican mutaciones en la biomolécula que interfieren con la unión a la sustancia farmacéutica, determinando de esta manera posibles mecanismos de resistencia a fármacos. Véase, por ejemplo, Hessler et al. (November 9-11, 2001) Ninth Foresight Conference on Molecular Nanotechnology (Abstract) (http://www.foresight.org/Conferences/-MNT9/Abstracts/Hessler/).
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En otra realización, los compuestos para uso en los métodos proporcionados en este documento incluyen las fórmulas:
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en las que cada uno de L y M es independientemente O, S o NR^{3}; X es una función de reactividad, como se ha descrito anteriormente; Y es una función de selectividad, como se ha descrito anteriormente; Q es una función de separación, como se ha descrito anteriormente;
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En otra realización, los compuestos de captura proporcionados en este documento tienen la fórmula:
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en la que L, M, X, Y y Q son como se han definido anteriormente.
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En otras realizaciones, los compuestos para el uso en los métodos proporcionados en este documento incluyen:
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Los compuestos específicos dentro de estas realizaciones son los que se producen como resultado de todas las combinaciones de los grupos indicados anteriormente para las variables contenidas en esta fórmula y todos incluyen grupos Q. En este documento, se desea que cada uno de estos compuestos específicos esté dentro del alcance de la descripción de este documento.
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D. Preparación de los Compuestos de Captura
Los compuestos de captura se diseñan evaluando las biomoléculas diana y las condiciones de reacción. Por ejemplo, si las biomoléculas diana son proteínas, se seleccionan funciones X adecuadas para realizar la unión o la unión covalente a las proteínas con gran afinidad. Y se selecciona de acuerdo con la complejidad de la mezcla diana y la especificidad de unión deseada por X. Q se selecciona de acuerdo con el número de divisiones de la mezcla que se desean; y W se selecciona basándose en el medio de las biomoléculas que se explora. Se diseñan una diversidad de compuestos de captura de acuerdo con dichos criterios.
Cuando se diseñan los compuestos de captura, éstos pueden sintetizarse por métodos disponibles para los especialistas en la técnica. La preparación de compuestos de captura ejemplares se describe a continuación. Cualquier compuesto de captura o un compuesto de captura similar puede sintetizarse de acuerdo con un método analizado en general a continuación o mediante una modificación mínima de los métodos seleccionando los materiales de partida apropiados o por métodos conocidos por los especialistas en la técnica.
En general, los compuestos de captura pueden prepararse partiendo con un resto central Z como se describe en las reivindicaciones. Después, este grupo Z se derivatiza para que tenga una funcionalidad para el acoplamiento con un oligonucleótido o análogo de oligonucleótido Q (por ejemplo, una fosforamidita, H-fosfonato o un grupo triéster fosfórico). El grupo Q estará generalmente N-protegido sobre las bases para evitar reacciones competitivas después de la introducción del resto X. En una realización, el grupo Z se hace reaccionar con una mezcla de todas las permutaciones posibles de un oligonucleótido o análogo de oligonucleótido Q (por ejemplo, 4^{i} permutaciones donde i es el número de nucleótidos o análogos de nucleótidos en B). El compuesto de captura o los compuestos de captura Q-Z resultantes se derivatizan después de forma que posean un grupo X para la reacción con una biomolécula, tal como una proteína. Si se desea, después se retiran los grupos N-protectores sobre el resto Q. Como alternativa, los grupos N-protectores pueden retirarse después de la reacción del compuesto de captura con una biomolécula, incluyendo una proteína. En otras realizaciones, Q puede sintetizarse sobre Z. En una realización adicional, Q se presintetiza mediante técnicas convencionales en estado sólido, y después se une a Z. Como alternativa, Q puede sintetizarse por etapas sobre el resto Z.
A continuación se proporcionan ejemplos comparativos de síntesis de compuestos de captura que contienen enlazadores lábiles alcalinos y fotoescindibles. Un especialista en la técnica puede preparar compuestos de captura por modificación rutinaria de los métodos presentados en este documento, o por otros métodos conocidos por los especialistas en la técnica.
Para la síntesis de un compuesto proporcionado en este documento que contiene un enlazador lábil alcalino, se mono-protege 1,4-di(hidroximetil)benceno, por ejemplo, en forma del mono-terc-butildimetilsilil éter correspondiente. El alcohol libre restante se derivatiza en forma de la 2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita correspondiente por reacción con 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamidita. La reacción de esta amidita con un oligonucleótido (es decir, Q) se sigue de la retirada del grupo protector para proporcionar el alcohol correspondiente. La reacción con, por ejemplo, cloroformiato de triclorometilo, produce el cloroformiato ilustrado (por ejemplo, X).
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Para la síntesis de un compuesto proporcionado en este documento que contiene un enlazador fotoescindible, se hace reaccionar 2-nitro-5-hidroxibenzaldehído con, por ejemplo, 3-bromo-1-propanol, para dar el éter-alcohol correspondiente. Después, el alcohol se protege, por ejemplo, en forma de terc-butildimetilsilil éter. La reacción de este compuesto con trimetilaluminio da el alcohol bencílico correspondiente, que se derivatiza en forma de su fosforamidita usando el procedimiento descrito anteriormente. La amidita se hace reaccionar con un oligonucleótido (es decir, Q) seguido de retirada del grupo protector y derivatización del alcohol resultante en forma del cloroformiato correspondiente (es decir, X).
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Para la síntesis de compuestos que contienen un enlazador lábil para ácidos, por ejemplo, un tritil éter heterobifuncional, el tritil éter de fosforamidita requerido se hace reaccionar con el oligonucleótido o análogo de oligonucleótido Q, seguido de desprotección del éter de tritilo y captura de una biomolécula, por ejemplo, una proteína, sobre el alcohol mediante un derivado reactivo del alcohol (X), como se ha descrito anteriormente.
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Las síntesis anteriores son únicamente ejemplares y no están dentro del alcance de la invención. Un especialista en la técnica será capaz de modificar la síntesis anterior de una manera rutinaria para sintetizar compuestos que estén dentro del alcance de la presente descripción. Las síntesis de los compuestos de captura proporcionados en este documento están dentro del conocimiento del especialista.
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E. Métodos de Uso de los Compuestos
Los compuestos de captura proporcionados en este documento pueden usarse para el análisis, cuantificación, purificación y/o detección de los componentes de mezclas de biomoléculas incluyendo, pero sin limitación, mezclas de proteínas. Pueden usarse para explorar bibliotecas de moléculas pequeñas para identificar candidatos a fármacos y pueden usarse para evaluar interacciones biomolécula-biomolécula y para identificar complejos de biomoléculas e intermedios, tales como los de rutas bioquímicas y otros intermedios biológicos.
Para iniciar un proceso analítico, se obtienen o preparan mezclas de biomoléculas. Después pueden purificarse previamente o purificarse parcialmente según sea necesario de acuerdo con procedimientos convencionales. Las biomoléculas se aíslan a partir de muestras usando métodos convencionales. La Figura 20a representa un ensayo de captura ejemplar en el que los compuestos de captura se unen a biomoléculas y se analizan mediante MALDI-TOF MS. El Ejemplo 9 y las Figuras 20b-f muestran resultados de ensayos ejemplares usando una diversidad de compuestos de captura y proteínas conocidas.
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1. Métodos generales
Las colecciones que se proporcionan en este documento tienen una amplia diversidad de aplicaciones, incluyendo reducir la complejidad de mezclas de moléculas, particularmente biomoléculas, por contacto de la colección con las mezclas para permitir la unión covalente de moléculas en las mezclas. Los compuestos de captura pueden organizarse en matrices en virtud de la función de separación antes, durante o después del contacto. Después del contacto y de la organización en matrices de los loci de la matriz, cada uno contiene un subconjunto de las moléculas en la mezcla. Después, la matriz puede analizarse, tal como mediante el uso de espectrometría de masas.
Por ejemplo, las proteínas se aíslan a partir de fluidos biológicos y/o tejidos por lisis celular seguida, por ejemplo, de métodos de precipitación (por ejemplo, sulfato de amonio) o degradación enzimática de los ácidos nucleicos y carbohidratos (si es necesario) y el material de bajo peso molecular se elimina por tamizado molecular. También pueden obtenerse proteínas a partir de bibliotecas de expresión. Se hacen reaccionar alícuotas de la mezcla de proteínas con las colecciones de compuestos de captura, generalmente miembros de la colección que tienen diferentes funcionalidades, tales como diferente reactividad y/o selectividad, para separar la mezcla en familias de proteínas separadas de acuerdo con la reactividad seleccionada de X o la función de reactividad más la función de selectividad. La diversidad (número de diferentes) seleccionada para la función de separación Q depende de la complejidad de la mezcla diana de biomoléculas, tales como proteínas. Por lo tanto, por ejemplo, cuando existen conjuntos de compuestos que difieren en X e Y, la función de solubilidad, y Q es un oligonucleótido, se selecciona B de una longitud apropiada para proporcionar un número suficiente de loci en la matriz resultante de modo que en última instancia cada "mancha" en la matriz tenga de aproximadamente 5 a 50 o un número similar de biomoléculas unidas a un compuesto de captura particular. En general, aunque no necesariamente, todos los compuestos de captura con una "Q" particular son iguales de modo que cada "mancha" en la matriz resultante contiene los mismos compuestos de captura. Sin embargo, existen realizaciones en las que una pluralidad de compuestos de captura diferentes puede tener la misma funcionalidad Q.
Como se indica, una matriz incluye no solamente matrices 2-D en soportes sólidos, sino cualquier colección que sea direccionable o en la que los miembros sean identificables, tal como por marcaje con perlas coloreadas o marcadores RF o marcadores químicos o simbologías en perlas. Se separan "manchas" o loci en la matriz, colecciones en las que se separan los compuestos de captura de acuerdo con su función "Q".
En ciertas realizaciones, el análisis se realiza usando el número más pequeño posible de reacciones necesarias para analizar completamente la mezcla. Por lo tanto, en estas realizaciones, la selección de la diversidad de Q y del número de grupos X e X/Y de diferente reactividad será una función de la complejidad de la mezcla de biomoléculas que se vaya a analizar. La minimización de la diversidad de B y del número de grupos X y/o X/Y permite el análisis completo de la mezcla con una complejidad mínima.
La separación de proteínas a partir de una mezcla compleja se consigue en virtud de los productos de compuesto-proteína unidos a diferentes miembros de la colección. El sobrenadante, que contiene los productos de compuesto de captura-proteína, se pone en contacto con moléculas receptoras unidas a un soporte o marcadas o dirigidas de otro modo, tal como oligonucleótidos en un soporte, y se permite la unión, tal como por hibridación con una matriz de oligonucleótidos complementarios. En una realización, un soporte sólido plano que lleva en localizaciones espacialmente diferentes una matriz de oligonucleótidos o análogos de oligonucleótidos que es complementaria al oligonucleótido o análogo de oligonucleótido N^{1}_{m}-B_{i}-N^{2}_{n} seleccionado, hibrida con los productos de compuesto de captura-biomolécula.
Después de la reacción o formación de complejos de los compuestos con las proteínas, cualquier compuesto en exceso puede eliminarse por adición de un reactivo diseñado para actuar como "agente de captura". Por ejemplo, una molécula pequeña biotinilada que tiene una funcionalidad idéntica o similar a la que ha reaccionado con la X seleccionada, se deja reaccionar con cualquier exceso de compuesto. La exposición de esta mezcla a estreptavidina unida a una perla magnética permite la eliminación del exceso de los compuestos.
La hibridación de los productos de compuesto-proteína con una secuencia complementaria se efectúa de acuerdo con condiciones convencionales (por ejemplo, en presencia de sales caotrópicas para equilibrar los valores de T_{m} de los diversos híbridos). Cualquier material no hibridado puede retirarse por lavado y el material hibridado puede analizarse.
En realizaciones adicionales, los métodos de este documento usan mezclas de los compuestos que se proporcionan en este documento que tienen grupos Q permutados para conseguir la separación de las biomoléculas después de la reacción con los compuestos. En ciertas realizaciones, estas mezclas de compuestos tienen subconjuntos (por ejemplo, 64 ó 256 ó 1024) de reactivos X diferentes de las 4^{i} permutaciones en Q, donde i es el número de nucleótidos o análogos de los mismos contenidos en el resto B de Q (por ejemplo, 65.536 permutaciones para i = 8). La reacción de los subconjuntos por separado con una alícuota de la mezcla de biomoléculas que se va a analizar da como resultado mezclas de conjugado que pueden alinearse con, por ejemplo, un formato de placa de microtitulación (por ejemplo, 96, 384, 1536, etc.). El análisis realizado usando estos subconjuntos de mezclas de compuesto proporciona una separación adicional de las biomoléculas antes del análisis.
En otras realizaciones, puede realizarse una combinación selectiva de los productos de diferentes reactivos que contienen restos X (por ejemplo, grupos X reactivos con amino y tiol; etc.) para el análisis combinado en un solo ensayo (por ejemplo, en una sola microplaca).
La Figura 1 representa un método ejemplar para la separación y el análisis de una mezcla compleja de proteínas mediante el uso de espectrometría de masas de MALDI-TOF. La exposición de un compuesto como se describe en este documento a una mezcla de biomoléculas, incluyendo, pero sin limitación, proteínas (P1 a P4) proporciona una matriz de compuesto-proteína (NA = resto oligonucleotídico o resto de análogo de oligonucleótido, L = enlazador escindible, P = proteína). La separación de la matriz se efectúa por hibridación de la porción Q de la matriz con una secuencia complementaria unida a un soporte, tal como una microplaca de oligonucleótidos. Las proteínas (P1 a P4) se analizan después mediante espectrometría de masas de MALDI-TOF.
Cuando la complejidad de una mezcla de biomoléculas incluyendo, pero sin limitación, proteínas es baja, pueden aplicarse métodos cromatográficos de afinidad o de filtración por afinidad para separar los productos de compuesto-proteína de la mezcla de proteínas. Si las proteínas que se van a analizar estuvieron marcadas con fluorescencia antes de (o después) de la reacción con el compuesto pero antes de la hibridación, estas proteínas marcadas también pueden detectarse en la matriz. De esta forma las posiciones que llevan un híbrido pueden detectarse antes de la exploración sobre la matriz con espectrometría de masas de MALDI-TOF y el tiempo para analizar la matriz se minimiza. Pueden aplicarse espectrómetros de masas de diversas clases para analizar las proteínas (por ejemplo, lineal o con reflexión, con o sin extracción retrasada, con TOF, Q-TOF o analizador de transformada de Fourier con láseres de diferentes longitudes de onda y fases de muestra xy).
Los formatos de espectrometría masas para el uso en este documento incluyen, pero sin limitación, desorción e ionización por láser asistida por matriz (MALDI), ionización por electropulverización (ES) continua o de pulsos, pulverización iónica, pulverización térmica o espectrometría de masas por impacto masivo de grupos y un formato de detección tal como tiempo de vuelo lineal (TOF), tiempo de vuelo de reflectrón, un solo cuadrupolo, múltiple cuadrupolo, sector magnético simple, sector magnético múltiple, transformada de Fourier, resonancia de ciclotrón de ión (ICR), trampa de iones y combinaciones de los mismos tales como espectrometría de MALDI-TOF. Por ejemplo, para ES las muestras disueltas en agua o en un tampón volátil se inyectan de forma continua o discontinua en una interfaz de ionización de presión atmosférica (API) y después se realiza el análisis de masas mediante un cuadrupolo. La generación de múltiples picos de iones que pueden obtenerse usando espectrometría de masas ES puede aumentar la precisión de la determinación de masas. Puede obtenerse información incluso más detallada sobre la estructura específica usando una configuración de cuadrupolo MS/MS.
Los especialistas en la técnica conocen métodos para realizar MALDI. También se conocen numerosos métodos para mejorar la resolución. Por ejemplo, la resolución en espectrometría de masas de MALDI-TOF puede mejorarse reduciendo el número de colisiones de alta energía durante la extracción de iones (véase, por ejemplo, Juhasz et al. (1996) Analysis, Anal. Chem. 68:941-946, véase también, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.777.325, Patente de Estados Unidos Nº 5.742.049, Patente de Estados Unidos Nº 5.654.545, Patente de Estados Unidos Nº 5.641.959, Patente de Estados Unidos Nº 5.654.545, Patente de Estados Unidos Nº 5.760.393 y Patente de Estados Unidos Nº 5.760.393 para descripciones de MALDI y protocolos de extracción retardada). También puede emplearse el acondicionamiento de moléculas que se van a analizar de las biomoléculas unidas al compuesto de captura antes del análisis.
En espectrometría de masas de MALDI (MALDI-MS) pueden usarse diversos analizadores de masa, por ejemplo, instrumentos de sector magnético/deflexión magnética en modo de un solo o de triple cuadrupolo (MS/MS), transformada de Fourier y tiempo de vuelo (TOF), incluyendo configuraciones de tiempo de vuelo ortogonal (O-TOF) como se conocen en la técnica de la espectrometría masas. Para el proceso de desorción/ionización, pueden usarse numerosas combinaciones de matriz/láser. También pueden emplearse configuraciones de trampa de iones y reflectrón.
El MALDI-MS requiere que la biomolécula se incorpore en una matriz. Esto se ha hecho en polipéptidos y en ácidos nucleicos mezclados en una matriz sólida (es decir, cristalina). La matriz se selecciona de modo que absorbe la radiación láser. En estos métodos, se usa un láser tal como un láser UV o IR que incide en la mezcla de biomolécula/matriz que se cristaliza en una punta de sonda u otro soporte adecuado, efectuando este modo la desorción e ionización de la biomolécula. Además, se ha realizado MALDI-MS en polipéptidos, glicerol y otros líquidos en forma de matriz.
Puede diseccionarse selectivamente una mezcla compleja de proteínas y tomando todos los datos en conjunto, analizarse completamente mediante el uso de compuestos con diferentes funcionalidades X. Las proteínas presentes en una mezcla de origen biológico pueden detectarse porque todas las proteínas tienen funcionalidades reactivas presentes en sus superficies. Si en cada posición en la matriz de compuesto-proteína existe la misma proteína escindible en las mismas condiciones que L o se añade sin unión covalente al soporte sólido y sirve como un patrón de peso molecular interno, puede determinarse la cantidad relativa de cada proteína (o péptido si la matriz de proteínas se digirió enzimáticamente). Este proceso permite la detección de cambios en proteínas expresadas cuando se comparan con tejidos de individuos sanos y enfermos, o cuando se comparan con el mismo tejido en condiciones fisiológicas diferentes (por ejemplo, estudios dependientes del tiempo). El proceso también permite la detección de cambios en proteínas expresadas cuando se comparan diferentes secciones de tejidos (por ejemplo, tumores) que pueden obtenerse, por ejemplo, por biopsia por láser.
Pueden estudiarse interacciones proteína-proteína y proteína-molécula pequeña (por ejemplo, fármaco) por contacto de la matriz de compuesto-proteína con una mezcla de las moléculas de interés. En este caso, se usará un compuesto que no tenga un enlace L escindible o que tenga un enlace L que sea estable en condiciones de MALDI-TOF MS. La posterior exploración de la matriz con el espectrómetro de masas demuestra que las proteínas hibridadas de la matriz de proteínas han interaccionado eficazmente con las mezclas de proteínas o moléculas pequeñas de interés.
También es posible el análisis usando la metodología bien conocida de doble híbrido y puede detectarse mediante espectrometría de masas. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.512.473, 5.580.721, 5.580.736, 5.955.280, 5.695.941. Véase también Brent et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3341-3347.
En las realizaciones anteriores, incluyendo aquéllas en las que Z contiene un enlace escindible, los compuestos pueden contener un marcador modificador de masas. En estas realizaciones, se usa el marcador modificador de masas para analizar las diferencias en estructura (por ejemplo, modificación de cadenas laterales tal como fosforilación o desfosforilación) y/o en los niveles expresión de biomoléculas, incluyendo proteínas. En una realización, se usan dos compuestos (o dos conjuntos de compuestos que tienen restos B permutados idénticos) que sólo difieren en la presencia o ausencia de un marcador modificador de masas (o tienen dos marcadores de masa con diferencias de masa apropiadas). Un compuesto (o un conjunto de compuestos) se hace (o hacen) reaccionar con tejido "sano" y el compuesto (o compuestos) modificado(s) de masa modificada se hace(n) reaccionar con el tejido "enfermo" en condiciones por lo demás idénticas. Las dos reacciones se combinan y se analizan en un modo doble. Las diferencias de masa esclarecerán las proteínas que están estructuralmente alteradas o expresadas en diferente cantidad en el tejido enfermo. Pueden usarse tres o más marcadores modificadores de masa en reacciones separadas y combinarse para análisis múltiples para realizar un seguimiento de las diferencias durante fases diferentes del desarrollo de enfermedad (es decir, marcador modificador de masa 1 en el punto de tiempo 1, marcador modificador de masa 2 en el punto de tiempo 2, etc.) o, como alternativa, para analizar diferentes secciones tisulares de un tejido enfermo tal como una muestra de tumor.
La selectividad en la reacción de los compuestos que se proporcionan en este documento con una biomolécula, tal como una mezcla de proteínas, también puede conseguirse por realización de las reacciones bajo control cinético y por retirada de alícuotas a diferentes intervalos de tiempo. Como alternativa, pueden realizarse diferentes reacciones en paralelo (por ejemplo, diferenciándose todas en el resto B del grupo Q) y realizarse con diferentes proporciones estequiométricas o detenerse a diferentes intervalos de tiempo y analizarse por separado.
En realizaciones en las que los compuestos de captura que se proporcionan en este documento poseen un grupo luminiscente o colorimétrico, puede visualizarse el conjugado de compuesto-biomolécula inmovilizado en el soporte insoluble antes del análisis. La visualización del conjugado proporciona información acerca de dónde ha hibridado el conjugado (tal como para un análisis espectrométrico de masas de MALDI-TOF posterior). En ciertas realizaciones, con reactivos seleccionados puede determinarse la cantidad de una proteína dada de experimentos separados (por ejemplo, sano frente a enfermo, punto de tiempo 1 frente a punto de tiempo 2, etc.) mediante el uso de colorantes que pueden diferenciarse espectrofotométricamente.
En otras realizaciones, los métodos se realizan por marcaje de las biomoléculas que se van a analizar incluyendo, pero sin limitación, proteínas, con más de uno, en una realización de tres a cinco, de los compuestos que se proporcionan en este documento. Dichos compuestos poseen funcionalidad diseñada para dirigir características químicas más pequeñas de las biomoléculas en lugar de una característica macromolecular. Véase, por ejemplo, la Figura 3. Dichas características químicas más pequeñas incluyen, pero sin limitación, NH_{2}, SH, SS (después de la protección terminal con SH, puede fijarse como diana SS, por ejemplo, por oro) y OH. En un ejemplo no limitante, el OH fenólico de tirosina se captura selectivamente usando un compuesto diazo, tal como una sal de arildiazonio. En esta realización, la reacción puede realizarse en agua. Por ejemplo, podría usarse una sal de diazonio funcionalizada cuando la funcionalidad permita la captura posterior de un compuesto proporcionado en este documento, proporcionando de este modo una biomolécula marcada con oligonucleótido. Una sal de de diazonio funcionalizada de este tipo es:
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Una biomolécula modificada con este reactivo se marca después con un oligonucleótido que posee un resto dieno. Se aprecia por los especialistas en la técnica que en estas realizaciones pueden usarse muchas parejas de reactivos distintas de dienófilo/dieno. En el caso del dienófilo/dieno, la reacción del dienófilo con el dieno puede realizarse en presencia de muchos otros grupos funcionales incluyendo oligonucleótidos activados con N-hidroxisuccinimido que reaccionan con un grupo NH_{2}. Por lo tanto, estas dos reacciones de marcaje específicas pueden realizarse en una reacción. Véase, por ejemplo, la Figura 5.
Posteriormente, las biomoléculas marcadas de forma múltiple hibridan en una matriz de oligonucleótidos antisentido, en una realización una microplaca que contiene una matriz de oligonucleótidos antisentido. Dichas biomoléculas marcadas múltiples pueden separarse con mayor selectividad que biomoléculas marcadas de forma sencilla. Véase, por ejemplo, la Figura 4.
En realizaciones en las que los compuestos para el uso en los métodos que se proporcionan en este documento son insolubles o escasamente solubles en agua o tampones acuosos, se añaden disolventes orgánicos a los tampones para mejorar la solubilidad. En una realización, la proporción de tampón:disolvente orgánico es tal que no se produce la desnaturalización de la biomolécula. En otra realización, los disolventes orgánicos usados incluyen, pero sin limitación, acetonitrilo, formamida y piridina. En otra realización, la proporción de tampón: disolvente orgánico es de aproximadamente 4:1. Para determinar si se necesita un co-disolvente orgánico, se mide la proporción de reacción de los compuestos que se proporcionan en este documento con una amina hidrosoluble tal como 5'-aminotimidina. Por ejemplo, la siguiente reacción se realiza en una diversidad de mezclas de disolventes bien conocidos para los especialistas en la técnica para determinar las condiciones óptimas para el posterior marcaje y análisis de biomoléculas:
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2. Análisis Fenotípico
Las colecciones de captura permiten una estrategia holística de arriba hacia abajo para analizar el proteoma y otras biomoléculas. Como se indica, las colecciones y métodos de uso proporcionan una forma imparcial de analizar biomoléculas, ya que los métodos no evalúan necesariamente clases específicas de dianas sino que, en su lugar, detectan o identifican cambios en las muestras. Los cambios identificados incluyen cambios estructurales que están relacionados con las secuencias primarias y modificaciones incluyendo modificaciones postraduccionales. Además, puesto que los compuestos de captura pueden incluir una función de solubilidad, pueden diseñarse para reacción en condiciones hidrófobas, permitiendo de este modo el análisis de moléculas unidas a la membrana y asociadas a la membrana, particularmente proteínas.
Los problemas con el análisis de proteoma surgen de la variación genética que no está relacionada con un fenotipo diana, la variación del proteoma debida a diferencias tales como el género, edad, estado metabólico, las mezclas complejas de células en tejidos diana y variaciones de la fase del ciclo celular. Por lo tanto, para identificar o detectar cambios, tales como cambios relacionados con enfermedad, entre los componentes de biomolécula de tejidos y células, puede ser importante la homogeneidad de la muestra. Para proporcionar homogeneidad, se comparan células con diferentes fenotipos tales como enfermas frente a sanas, del mismo individuo. Como resultado, las diferencias en patrones de biomoléculas pueden atribuirse a las diferencias en el fenotipo en lugar de diferencias entre individuos. Por lo tanto, pueden obtenerse muestras a partir de un solo individuo y células con diferentes fenotipos, tales como sanas frente a enfermas, y se separan las que responden de las que no responden. Además, las células pueden sincronizarse o congelarse en un estado metabólico para reducir adicionalmente diferencias de fondo.
Por lo tanto, las colecciones de compuestos de captura pueden usarse para identificar proteínas específicas de fenotipo o modificaciones de las mismas u otras biomoléculas específicas de fenotipo y patrones de las mismas. Esto puede conseguirse por comparación de muestras de biomoléculas de células o tejidos con un fenotipo con las células equivalentes a muestras de biomoléculas de células o tejidos con otro fenotipo. Se comparan los fenotipos en células del mismo individuo y tipo celular. En particular, se comparan células primarias, cultivo de células primarias y/o células sincronizadas. Pueden identificarse patrones de unión de biomoléculas de las células con miembros de compuestos de captura de la colección y usarse como un distintivo o perfil de una enfermedad o estado de salud u otros fenotipos. También puede identificarse la biomolécula unida particular, tal como una o más proteínas, y pueden identificarse nuevos marcadores asociados con enfermedad, tales como proteínas o estructuras particulares de los mismos. El Ejemplo 6 proporciona una realización ejemplar en la que se separan células. Véase también la
Figura 19.
\newpage
Los fenotipos para comparación incluyen, pero sin limitación:
1)
muestras de células o tejidos enfermos frente a sanos para identificar proteínas u otras biomoléculas asociadas con la enfermedad o que son marcadores para enfermedad;
2)
muestras de los que responden y no responden a fármacos (es decir, un 20-30% de pacientes con melanoma maligno responden a interferón alfa y otros no lo hacen) para identificar biomoléculas indicativas de respuesta;
3)
muestras de células o tejidos con un perfil de toxicidad para fármacos o condiciones ambientales para identificar biomoléculas asociadas con la respuesta o un marcador de la respuesta; y
4)
muestras de células o tejidos expuestos a cualquier condición o que presentan cualquier fenotipo para identificar biomoléculas, tales como proteínas, asociadas con la respuesta o fenotipo o que son un marcador para las mismas.
Generalmente, las muestras para cada fenotipo se obtienen a partir del mismo organismo, tal como del mismo mamífero, de modo que las células se emparejan esencialmente y cualquier variación debería reflejar la variación debida al fenotipo y no a la fuente de las células. Pueden obtenerse muestras de células primarias (o tejidos). En todos los casos, las muestras pueden obtenerse del mismo individuo antes de la exposición o tratamiento o de tejido sano o enfermo para permitir la identificación de biomoléculas asociadas al fenotipo.
Las células pueden separarse por cualquier método adecuado que permita la identificación de un fenotipo particular y después la separación de las células basada en el mismo. Puede usarse cualquier método de separación, tal como, por ejemplo, selección o selección negativa (donde se capturan las células no deseadas y las células deseadas permanecen en sobrenadante) por el que se recuperan las células vivas. Estos métodos incluyen, pero sin limitación:
1)
citometría de flujo;
2)
captura específica;
3)
selección negativa en la que se capturan las células no deseadas y las células diana permanecen en sobrenadante y se recuperan células vivas para análisis; y
4)
microdisección mediante captura por láser (LCM) (Arcturus, Inc Mountain View, CA).
Por lo tanto, los criterios de clasificación incluyen, pero sin limitación, potencial de membrana, flujo iónico, actividad enzimática, marcadores de superficie celular, marcadores de enfermedad y otros criterios de este tipo que permiten la separación de células de un individuo basándose en el fenotipo.
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a) Métodos de separación ejemplares 1) Microdisección mediante Captura por Láser
La microdisección mediante captura por láser (LCM) (Arcturus, Inc Mountain View, CA) usa una plataforma de microscopio combinada con un láser IR de baja energía para activar una película de captura plástica sobre células de interés seleccionadas. Después, las células se levantan suavemente del tejido circundante. Esta estrategia impide cualquier absorción de radiación láser por células microdiseccionadas o tejido circundante, asegurando de este modo la integridad de ARN, ADN y proteína preparada a partir de las muestras microdiseccionadas para un análisis posterior.
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2) Citometría de flujo para separación
La citometría de flujo es un método, análogo en alguna medida a la microscopía fluorescente, en el que se realizan mediciones sobre partículas (células) en suspensión líquida que fluye de una en una a través de un haz de láser centrado a velocidades de hasta varios miles de partículas por segundo. Se recogen la luz dispersada y la fluorescencia emitida por las partículas (células), se filtra, se digitaliza y se envía a un ordenador para su análisis. Típicamente, la citometría de flujo mide la unión de una sonda marcada con un fluorocromo a células y la comparación de la fluorescencia resultante con la fluorescencia de fondo de células no teñidas. Las células pueden separarse usando una versión de citometría de flujo, la separación por flujo, en la que las partículas (células) se separan y recuperan a partir de una suspensión basándose en propiedades medidas de flujo. Las células que se recuperan mediante la separación por flujo son viables y pueden recogerse en condiciones estériles. Típicamente, las subpoblaciones recuperadas presentan una pureza superior al 99,5% (véanse las Figuras 19a y 19b).
La citometría de flujo permite que las células se diferencien usando diversos parámetros incluyendo características físicas y/o químicas asociadas con células o propiedades de reactivos asociados con células o sondas, midiéndose cualquiera de ellas mediante instrumentos detectores. Separación: Vivas frente a Muertas. Se usa dispersión frontal y lateral para la identificación preliminar y se generan ventanas de poblaciones celulares. Se usan parámetros de dispersión para excluir residuos, células muertas y agregados no deseados. En una muestra de sangre periférica o médula ósea, pueden definirse poblaciones de linfocitos, monocitos y granulocitos y pueden crearse ventanas por separado y analizarse en base a la dispersión frontal y lateral. Las células que se recuperan mediante separación por flujo son viables y pueden recogerse en condiciones estériles. Típicamente, las subpoblaciones recuperadas tienen una pureza superior al 99,5%.
Los experimentos de separación celular comunes habitualmente implican ensayos de inmunofluorescencia, es decir, tinción de células con anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes para detectar antígenos. Además, la separación puede realizarse usando construcciones con el indicador GFP para aislar poblaciones puras de células que expresen un gen/construcción dada.
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a. Fluorescencia
La medición del parámetro de fluorescencia permite la investigación de estructuras y funciones celulares basándose en la tinción directa, reacciones con sondas marcadas con fluorocromos (por ejemplo, anticuerpos) o la expresión de proteínas fluorescentes. Pueden medirse señales de fluorescencia como parámetros individuales o múltiples que se corresponden con diferentes longitudes de onda de excitación láser y emisión de fluorescencia. Cuando se usan diferentes fluorocromos de forma simultánea, puede producirse un excedente de señal entre canales de fluorescencia. Esto se corrige mediante la compensación. Ciertas combinaciones de fluorocromos no pueden usarse simultáneamente; los especialistas en la técnica pueden identificar dichas combinaciones.
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b. Inmunofluorescencia
La inmunofluorescencia implica la tinción de células con anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes tales como FITC (fluoresceína), PE (ficoeritrina), APC (aloficocianina), y conjugados en tándem basados en PE (R670, CyChrome y otros). Las dianas habituales en estos ensayos son antígenos de la superficie celular, pero también pueden dirigirse anticuerpos a antígenos o citoquinas en el citoplasma.
La tinción de ADN se usa principalmente para la generación de un perfil del ciclo celular o como un método para medir la apoptosis. El yoduro de propidio (PI), el tinte de ADN usado más comúnmente, no puede entrar en células vivas y por lo tanto puede usarse para ensayos de viabilidad. Para ensayos del ciclo celular o apoptosis usando PI, las células deben fijarse primero para que tenga lugar la tinción (véase el protocolo). La cantidad relativa de tinción de ADN con PI se corresponde con la proporción de células en las fases GO/G1, S y G2/M, indicando menores cantidades de tinción células apoptóticas/necróticas. La tinción con PI puede realizarse simultáneamente con ciertos fluorocromos, tales como FITC y GFP, en ensayos para caracterizar adicionalmente la apoptosis o la expresión
génica.
Puede medirse la expresión y transfección de genes indirectamente mediante el uso de un gen indicador en la construcción. Por ejemplo, pueden usarse construcciones de tipo proteína verde fluorescente (EGFP, proteínas roja y azul fluorescentes) y \beta-galactosidasa para cuantificar las poblaciones de células que expresen el gen/construcción. Actualmente están disponibles mutantes de GFP que pueden excitarse a frecuencias comunes, pero emiten fluorescencia a diferentes longitudes de onda. Esto permite la medición de co-transfección, así como la detección simultánea de expresión de genes y anticuerpos. Deberían incluirse controles negativos apropiados (de fondo) para experimentos que impliquen construcciones de tipo GFP. Los controles incluyen, por ejemplo, el mismo tipo celular, usando el inserto génico menos la construcción de tipo GFP.
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3) Estudios metabólicos y otros estudios
La anexina-V puede marcarse con diversos fluorocromos para identificar células en fases tempranas de apoptosis. La CFSE se une a membranas celulares y se distribuye igualmente cuando se dividen las células. Después puede contarse el número de divisiones que experimentan las células en un periodo de tiempo. El CFSE puede usarse con ciertos fluorocromos para inmunofluorescencia. Puede medirse el flujo de calcio usando marcadores Indo-1. Esto puede combinarse con tinción inmunofluorescente. Pueden realizarse ensayos de conjugación intercelulares usando combinaciones de colorantes tales como calceína e hidroetidina.
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b) Sincronización de ciclos celulares
Una vez que se obtienen células clasificadas o separadas pueden cultivarse y pueden sincronizarse o congelarse en un estado metabólico particular. Esto aumenta la capacidad para identificar biomoléculas específicas de fenotipo. Dichas células para separarse mediante los métodos anteriores, incluyendo mediante citometría de flujo. Además, pueden separarse en grupos células en el mismo ciclo celular, en el mismo estado metabólico u otro estado sincronizado usando citometría de flujo (véase la Figura 19c).
Pueden sincronizarse o congelarse ciclos celulares mediante una diversidad de métodos incluyendo, pero sin limitación, la quelación celular de iones críticos, tal como por eliminación de magnesio, cinc, manganeso, cobalto y/o otros iones que realizan funciones específicas mediante EDTA u otros quelantes (véase, por ejemplo, los Ejemplos). Otros métodos incluyen controlar diversas rutas metabólicas o bioquímicas. La Figura 18 representa puntos ejemplares de regulación de mecanismos de control metabólico para la sincronización celular. Los ejemplos de sincronización o "congelación" del control metabólico para sincronizar células incluyen, pero sin limitación, los siguientes:
1)
control de la expresión génica;
2)
regulación de reacciones enzimáticas;
3)
control negativo: inhibición por retroalimentación o represión del producto final e inducción enzimática son mecanismos de control negativo que conducen a una disminución en la transcripción de proteínas;
4)
control positivo: la represión de catabolitos se considera una forma de control positivo porque afecta a un aumento en la transcripción de proteínas;
5)
control de la traducción de proteínas individuales:
a)
los oligonucleótidos que hibridan con el sitio terminal 5' inhiben la síntesis de proteínas por inhibición de la interacción inicial entre el ARNm y la subunidad 40S del ribosoma;
b)
los oligonucleótidos que hibridan en la UTR 5' hasta, e incluyendo, el codón de inicio de la traducción inhiben la exploración de la subunidad 40S (o 30S) o el ensamblaje del ribosoma completo (80S para eucariotas o 70S para sistemas bacterianos);
6)
control de modificaciones postraduccionales;
7)
control de enzimas alostéricas, cuando el sitio activo se une al sustrato de la enzima y lo convierte en un producto. El sitio alostérico está ocupado por alguna molécula pequeña que no es un sustrato. Si la proteína es una encima, cuando el sitio alostérico está ocupado, la enzima es inactiva, es decir, la molécula efectora disminuye la actividad de la enzima. Algunas enzimas alostéricas multicomponente tienen varios sitios ocupados por diversas moléculas efectoras que modulan la actividad enzimática a lo largo de un intervalo de condiciones.
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3. Análisis de proteínas de baja abundancia
Los marcadores y dianas asociados con enfermedad importantes podrían ser proteínas de baja abundancia que podrían no detectarse mediante espectrometría de masas. Para asegurar la detección, puede realizarse un primer experimento de presentación de compuesto de captura. La matriz resultante de proteínas capturadas se hace reaccionar con un colorante no selectivo, tal como un colorante fluorescente, que iluminará o hará visible más proteínas sobre la matriz. El colorante puede proporcionar una estimación semicuantitativa de la cantidad de proteína. Pueden determinarse las diferentes proteínas detectadas por el colorante y después compararse el número detectado mediante análisis espectrométrico de masas. Si se detectan más proteínas usando el colorante, los experimentos pueden repetirse usando un mayor número de células de partida de modo que puedan detectarse proteínas de baja abundancia e identificarse mediante el análisis espectrométrico de masas.
Por ejemplo, proteínas constitutivas tales como actina y otras proteínas de este tipo están presentes en alta abundancia y pueden enmascarar a las proteínas de baja abundancia. Pueden usarse compuestos de captura u otro compuesto de purificación seleccionado o diseñado para capturar o eliminar las proteínas de alta abundancia o biomoléculas de una mezcla antes de usar una colección para evaluar los componentes de la mezcla. Una vez que se eliminan las proteínas de alta abundancia, las proteínas de baja abundancia tienen una concentración eficazmente superior y pueden detectarse. Estos métodos, por lo tanto, tienen dos etapas: una primera etapa para capturar componentes de alta abundancia de mezclas de biomoléculas tales como las actinas. Por ejemplo, un lisado celular puede ponerse en contacto con moléculas de captura que incluyen un grupo de reactividad tal como biotina u otra función de reactividad general unida a un grupo de clasificación para eliminar dichas proteínas de alta abundancia, y después se puede usar una colección de compuestos de captura adecuada para identificar compuestos de menor abundancia que permanezcan en el lisado.
Además, como se ha analizado anteriormente, pueden diseñarse compuestos de captura, tal como mediante la selección apropiada de W, para interaccionar con orgánulos intactos antes de romperlos en células que se han lisado suavemente o tratado de otra forma para permitir el acceso a los orgánulos y membranas internas. Después, los orgánulos capturados pueden romperse, pudiendo incluirse una membrana artificial, tal como una bicapa lipídica o recubrimiento de micelas, para capturar las proteínas de orgánulos y otras biomoléculas en un entorno que conserve su estructura tridimensional. Estas proteínas capturadas pueden analizarse. Esto permite que los compuestos de captura interaccionen con las proteínas capturadas y otras biomoléculas en su estructura terciaria nativa.
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4. Control de la conformación de proteínas como un indicador de enfermedad
Las colecciones y/o miembros de las mismas pueden usarse para detectar o diferenciar confórmeros específicos de proteínas. Por lo tanto, por ejemplo, si una conformación particular de una proteína se asocia con una enfermedad (o estado de salud), las colecciones o miembros de las mismas pueden detectar un confórmero o diferenciar confórmeros basándose en un patrón de unión a los compuestos de captura en una colección. Por lo tanto, las colecciones y/o miembros de las mismas pueden usarse para detectar enfermedades causadas por proteínas conformacionalmente alteradas (o enfermedades de agregación de proteínas), donde una proteína o polipéptido asociada a enfermedad tiene una conformación asociada a enfermedad. Los métodos y colecciones proporcionados en este documento permiten la detección de un confórmero asociado con una enfermedad que se va a detectar. Estas enfermedades incluyen, pero sin limitación, enfermedades amiloides y enfermedades neurodegenerativas. Otras enfermedades y proteínas asociadas que presentan dos o más conformaciones diferentes en las que menos una conformación es con enfermedad, incluyen las expuestas en la siguiente Tabla:
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23 
\newpage
Las colecciones pueden ponerse en contacto con una mezcla de los confórmeros y pueden identificarse los miembros que se unen o conservan cada forma, y por lo tanto, puede asociarse un patrón con cada confórmero. Como alternativa, pueden identificarse los que se unen solamente a un confórmero, tal como el confórmelo asociado con enfermedad, y pueden usarse subcolecciones de uno o más de dichos compuestos de captura como un reactivo de diagnóstico para la enfermedad.
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5. Identificación de moléculas pequeñas e investigación de interacciones biomolécula-biomolécula
Las biomoléculas, tales como proteínas, se separan usando una interacción covalente o no covalente con compuestos de captura inmovilizados. Después, pueden usarse colecciones, tales como matrices de compuestos de captura unidos a biomoléculas, tales como lisados celulares, para explorar bibliotecas u otras mezclas de candidatos a fármacos o para explorar adicionalmente mezclas de biomoléculas para ver qué se une a las biomoléculas unidas. Los complejos de biomolécula de captura-biomolécula o los complejos de biomolécula-candidato a fármaco pueden analizarse para identificar rutas bioquímicas y también para identificar dianas con el fármaco candidato.
Por ejemplo, se exponen interacciones proteína-proteína o proteína-biomolécula a compuestos de ensayo, típicamente moléculas pequeñas incluyendo moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, peptidomiméticos, moléculas antisentido o ARNds, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos recombinantes y sintéticos y fragmentos de los mismos y otros de dichos compuestos que pueden servir como candidatos a fármacos o compuestos importantes. Las moléculas pequeñas unidas se identifican mediante espectrometría de masas u otros métodos analíticos.
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F. Sistemas
En realizaciones adicionales, los compuestos y los métodos descritos en este documento están diseñados para situarse en un sistema integrado que normalice y automatice las siguientes etapas de proceso:
\bullet
Aislamiento de biomoléculas a partir de una fuente biológica, incluyendo aislamiento de las proteínas a partir de lisados celulares (lisis, digestión enzimática, precipitación, lavado).
\bullet
Opcionalmente, eliminación de materiales de bajo peso molecular.
\bullet
Opcionalmente, división en alícuotas de la mezcla de biomoléculas, tal como una mezcla de proteínas.
\bullet
Reacción de la mezcla de biomoléculas, tal como una mezcla de proteínas con compuestos de diferente reactividad química (X) y diversidad de secuencia (B) proporcionados en este documento; esta etapa puede realizarse en paralelo usando alícuotas de la mezcla de biomoléculas.
\bullet
Opcionalmente, eliminación del exceso de compuesto.
\bullet
Hibridación del conjugado del compuesto-biomolécula, tal como un conjugado de compuesto-proteína con oligonucleótidos de cadena sencilla o análogos de oligonucleótidos que sean complementarios al resto Q del compuesto; los oligonucleótidos de cadena sencilla o análogos de oligonucleótidos se presentan opcionalmente en un formato de matriz y opcionalmente se inmovilizan en un soporte insoluble.
\bullet
Opcionalmente, posterior tratamiento químico o enzimático de la matriz de proteína.
\bullet
Análisis de la matriz de biomoléculas, incluyendo pero sin limitación, las etapas de (i) deposición de matriz, y (ii) espectrometría de masad de MALDI-TOF punto por punto usando un espectrómetro de masas de matriz (con o sin patrón de peso molecular interno, por ejemplo, en una microplaca para calibrado y cuantificación).
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El sistema incluye las colecciones que se proporcionan en este documento, opcionalmente matrices de dichas colecciones, un programa informático para el control del proceso de preparación de muestra y análisis instrumental y para análisis de los datos resultantes e instrumentación, tal como un espectrómetro de masas para el análisis de las biomoléculas. El sistema incluye otros dispositivos tales como dispositivos de cromatografía líquida de modo que una mezcla de proteínas se separa al menos parcialmente. El eluyente se recoge en una serie continua de alícuotas en, por ejemplo, placas de microtitulación, y cada alícuota se hace reaccionar con un compuesto de captura suministrado.
En reacciones múltiples, pueden hacerse reaccionar simultáneamente alícuotas en cada pocillo con uno o más de los compuestos de captura suministrados en este documento que, por ejemplo, difieren cada uno en X (es decir, funcionalidad específica amino, tiol, lectinas) teniendo cada uno un resto de selectividad específico y diferencial Y y en el grupo Q. Puede realizarse cromatografía en medio acuoso u orgánico. Las mezclas de reacción resultantes se combinan y se analizan directamente. Como alternativa, se realizan reacciones secundarias posteriores o estudios de interacción molecular antes del análisis, incluyendo análisis espectrométrico de masas.
Los sistemas proporcionados en este documento pueden contener una línea de ensamblaje tal como robots de pipeteo en fases xy y módulos de suministro de reactivo/lavado que están relacionados con un dispositivo de separación central y un espectrómetro de masas terminal para el análisis y la interpretación de datos. Los sistemas pueden programarse para realizar etapas de proceso que incluyen (véase, por ejemplo, la Figura 2), por ejemplo:
1) Se proporcionan cultivos celulares (o muestras tisulares) en placas de microtitulación (MTP) con 1, 2... i pocillos. A cada pocillo, se añaden soluciones para lisis de células liberando de este modo las proteínas. En algunas realizaciones, se incluyen etapas de lavado apropiadas así como adición de enzimas para digerir ácidos nucleicos y otros componentes no proteicos. En realizaciones adicionales, en lugar de MTP normales, se usan MTP con placas de filtro en el fondo de los pocillos. Se eliminan los residuos celulares por filtración o centrifugación. Se añade una solución de acondicionamiento para el proceso de separación apropiado y el material de cada pocillo se carga por separado en el dispositivo de separación.
2) La separación utiliza diferentes principios de separación tales como carga, determinación del tamaño molecular, adsorción, intercambio iónico y principios de exclusión molecular. Dependiendo del tamaño de la muestra, se utilizan dimensiones apropiadas adecuadas tales como cromatografía líquida de alto rendimiento de (HPLC) de microperforación. En ciertas realizaciones, se usa un proceso de flujo continuo y el efluente se divide continuamente en alícuotas en MPT 1, 2... n.
3) Reacción con Reactivos del Proteoma. Cada MTP a su vez se transfiere a una Estación de Reactivos de Proteoma que alberga 1, 2, .... m reactivos que se diferencian solamente en parte de la secuencia oligonucleotídica (es decir, Q) o/y en la naturaleza química de la funcionalidad que reacciona con las proteínas (es decir, X). Si hay más de una MTP que viene de una muestra de tejido, entonces se añade reactivo 1 en el mismo pocillo de las MTP 1, 2... n respectivas, es decir, en el pocillo A1, reactivo 2 en el pocillo A2, etc. En realizaciones en las que las MTP tienen 86 pocillos
(i = 1-96), se suministran 96 Reactivos del Proteoma diferentes (es decir, 96 compuestos diferentes proporcionados en este documento, m = 1-96) a través de 96 boquillas diferentes de la Estación de Reactivos del Proteoma para evitar la contaminación cruzada.
4) Combinación: El exceso de Reactivo de Proteoma se desactiva, se combinan alícuotas de cada pocillo que pertenecen a una misma muestra de tejido y el material restante se almacena en condiciones que conserven la estructura (y si es necesario la conformación) de las proteínas intactas, sirviendo de este modo como MTP maestras para posteriores experimentos.
5) Se elimina el exceso de Reactivo de Proteoma en la muestra combinada, usando por ejemplo, el sistema de biotina/estreptavidina con personas magnéticas, después el sobrenadante se concentra y se acondiciona para hibridación.
6) Se transfiere a una Microplaca de Oligonucleótidos. Después de una etapa de lavado para eliminar material no hibridado y otro de bajo peso molecular, se añade una matriz. Como alternativa, antes de la adición de matriz, se realiza una digestión con, por ejemplo, tripsina y/o quimiotripsina. Después de la retirada por lavado de la enzima y de los productos de digestión, se añade la matriz.
7) Transferencia de microplaca a espectrómetro de masas. En una realización, se realiza una espectrometría de masas de MALDI-TOF. También pueden aplicarse otras configuraciones espectrométricas de masa adecuadas para el análisis de proteínas. El espectrómetro de masa tiene una fase xy y por lo tanto barre sobre cada posición en una mancha para análisis. El Reactivo del Proteoma puede diseñarse de forma que la mayor parte del reactivo (incluyendo la parte que hibrida con la matriz de microplaca de oligonucleótido) se escinde antes o durante la espectrometría de masas y por lo tanto se detectará en el área de bajo peso molecular del espectro y por lo tanto estará bien separado del péptido (en caso de digestión enzimática) o de señales de peso molecular de proteína en el espectro de masas.
8) Por último, las señales de peso molecular pueden procesarse para reducción de las interferencias, restar el fondo y otras etapas de procesamiento de este tipo. Los datos obtenidos pueden archivarse e interpretarse. Los valores de peso molecular de las proteínas (o los péptidos obtenidos después de la digestión enzimática) se asocian con la información de secuencia de ADN humano y la información de secuencia de proteínas derivada de las regiones codificantes de proteína. Una interacción con bases de datos disponibles revelará si ya se conocen las proteínas y sus funciones. Si la función es desconocida, la proteína puede expresarse a partir de la secuencia de ADN conocida en una escala suficiente usando métodos convencionales para aclarar su función y posterior localización en una ruta bioquímica, donde desempeña su papel metabólico en un individuo sano o en la ruta de enfermedad para un individuo con enfermedad.
Puesto que se han almacenado y están disponibles placas maestras que contienen alícuotas de las diferentes proteínas dentro de una muestra de tejido dada, pueden realizarse experimentos posteriores de una forma preseleccionada ahora, por ejemplo, las proteínas se presentan en la superficie de microplaca para estudios de interacción proteína-proteína (biomolécula) para validación de diana o/y para estudiar la interacción con bibliotecas combinatorias de moléculas pequeñas para selección de candidatos a fármacos.
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G. Bioinformática
Los datos sin procesar generados a partir del análisis, tales como el análisis de espectrometría de masas, de la especie de compuesto-proteínas se procesan para restar el fondo, reducción de la interferencia, calibrado del peso molecular y perfeccionamiento de picos (por ejemplo, integración de picos). Los valores de peso molecular de las proteínas escindidas o los productos de digestión se interpretan y comparan con bases de datos de proteínas existentes para determinar si la proteína en cuestión se conoce y, si es así, qué modificaciones están presentes (glicosilada o no glicosilada, fosforilada o no fosforilada, etc.). Se componen, comparan e interpretan los conjuntos diferentes de experimentos que pertenecen a un conjunto de compuestos. Por ejemplo, un conjunto de experimentos usa un conjunto de compuesto con un resto X y restos Q diferentes. Este conjunto de experimentos proporciona datos para una porción del proteoma, puesto que no todas las proteínas en el proteoma reaccionarán con un resto X dado. La superposición de los datos de este conjunto de experimentos con datos de otros conjuntos de experimentos con diferentes restos X proporciona datos para el proteoma completo.
Se investigan conjuntos de experimentos que comparan tejidos de individuos sanos y enfermos o de diferentes fases fisiológicas o del desarrollo (por ejemplo, progresión tumoral, dependencia de tratamientos farmacológicos para controlar los resultados de la terapia, respuesta inmune a infección de virus o bacterias) o áreas tisulares diferentes (por ejemplo, de un tumor), y los datos finales se archivan.
Los siguientes ejemplos se incluyen con fines ilustrativos solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Los disolventes y reactivos de calidad comercial se usaron sin purificación a menos que se especifique otra cosa, y se adquirieron de los siguientes proveedores: THF Anhidro (Aldrich), CH_{2}Cl_{2} (Aldrich, Acros, EM Science), CHCl_{3} (Aldrich, Mallinckrodt), Hexanos (Acros, EM science), Acetato de etilo (Alrich, Acros), Acetona (Aldrich, EM science), Alcohol metílico (Aldrich), Éter dietílico (Fisher scientific), Ácido 4-Bromobenzoico (Aldrich), 2-amino-2-metil-1-propanol (Acros), 1,3-diciclocarbodiimida (Aldrich), N-hidroxisuccinimida (Aldrich), Maleimida (Aldrich), Clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida (Acros), Cloruro de Tionilo (Aldrich), Piridina (Aldrich), Limaduras de magnesio (Acros), Ácido 4-(Difenilhidroximetil)benzoico (Fluka), Etaóxido de sodio (Acros), Carbonato de Potasio, Yoduro de sodio, Tetracloruro de carbono, yoduro de metilo, RED-AI (Aldrich), Na_{2}SO_{4} anhidro (Acros), Ácido acético (EM science), Hidróxido de sodio (Acros), Tamices moleculares Aº_{4} (Aldrich) y Cloruro de acetilo (Aldrich). Se obtuvieron los datos del espectro de RMN ^{1}H a partir de un fotómetro de espectro de RMN de 500 MHz usando CDCl_{3} como disolvente. Los datos del espectro de masas se analizaron usando el método de electropulverización.
Ejemplo 1 Ejemplos para N^{1}_{m}-B_{i}-N^{2}_{n} a. N^{1} y N^{2} como tetrámeros idénticos, B como un trímero
N^{1} = N^{2}, m = n = 4, i = 3, B = 64 permutaciones de secuencia
303
b. N^{1} y N^{2} como tetrámeros no idénticos, B como un tetrámero
N^{1} \neq N^{2}, m = n = 4, i = 4, B = 256 permutaciones de secuencia
304 
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c. N^{1} como un heptámero, N^{2} como un octámero, B como un octámero
N^{1} \neq N^{2}, m = 7, n = 8, i = 8, B = 65.536 permutaciones de secuencia
305
Ejemplo 2
Separación de proteínas en una matriz de ADN usando un agente de captura ejemplar que no está dentro del alcance de la invención
N^{1}_{m}-B_{i}-N^{2}_{n}-(S^{1})_{t}-M(R^{15})_{a}-(S^{2})_{b}-L-X-Proteína donde B es a trímero; m = n = 4, i = 3, t = b = 1; las secuencias subrayadas son N^{1} y N^{2}
306
Ejemplo 3 I. Preparación de mezclas de proteína a partir de células o mediante traducción de proteínas de una genoteca de ADNc preparada a partir de células o tejidos
Las mezclas de proteínas pueden dividirse selectivamente en las técnicas de separación física o bioquímica.
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1. Preparación de combinaciones de proteínas de complejidad limitada usando cultivo de células o tejido
Pueden aislarse proteínas a partir de cultivos celulares o tejidos de acuerdo con métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Las proteínas aisladas se purifican usando métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica (por ejemplo, TPAE, precipitación de proteínas diferencial (precipitación por sales, pH y polímeros iónicos), cristalización diferencial de proteínas, fraccionamiento en masa, electroforesis (PAGE, concentración isoeléctrica, capilar) y cromatografía (por inmunoafinidad, HPLC, LC)). Se recogen fracciones de columna individuales que contienen mezclas de proteínas de complejidad limitada para el uso como antígeno.
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2. Preparación de combinaciones de proteína de complejidad limitada usando bibliotecas de expresión de ADNc con (Figura 6) a. Aislamiento de ARN i. Aislamiento de ARN Total
Se homogeneizan células cultivadas o tejidos en una solución desnaturalizante que contiene tiocianato de guanidina 4 M. El homogeneizado se mezcla secuencialmente con acetato de sodio 2 M (pH 4), fenol, y por último cloroformo/alcohol isoamílico o bromocloropropano. La mezcla resultante se centrifuga dando una fase acuosa superior que contiene el ARN total. Después de la precipitación con isopropanol, el sedimento de ARN se disuelve en solución desnaturalizante (que contiene tiocianato de guanidina 4 M), se precipita con isopropanol y se lava con etanol al
75%.
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ii. Aislamiento de ARN citoplásmico
Las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato enfriada en hielo y se mantienen en hielo durante todas las manipulaciones posteriores. El sedimento de células recogidas se resuspende en un tampón de lisis que contiene el detergente no iónico Nonidet P-40. La lisis de las membranas plasmáticas se produce casi inmediatamente. Los núcleos intactos se retiran mediante una centrifugación breve en microcentrífuga y se añade dodecil sulfato de sodio al sobrenadante citoplásmico para desnaturalizar la proteína. La proteína se digiere con proteasa y se retira por extracciones con fenol/cloroformo y cloroformo. El ARN citoplásmico se recupera mediante precipitación con
etanol.
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b. Purificación de ARNm
Se purifica el ARN mensajero a partir de una preparación de ARN total o citoplasmático usando procedimientos convencionales. Puede separarse el ARN Poli(A)^{+} del ARN total mediante unión de oligo(dT) a la cola Poli(A) del ARNm. Se desnaturaliza el ARN total para exponer las colas Poli(A) (poliadeniladas). El ARN que contiene Poli(A) se une después a perlas magnéticas recubiertas con oligo(dT) y se separa del ARN total o citoplasmático mediante fuerzas magnéticas. La población de ARN puede enriquecerse adicionalmente con respecto a la presencia de moléculas de longitud completa mediante la selección de una especie de ARNm que contenga la protección terminal 5'.
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c. Síntesis de ADNc
Pueden usarse diferentes tipos de cebadores para la síntesis de genotecas de ADNc de longitud completa o que contienen el extremo 5' del ARNm aislado.
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i. Cebador oligo (dT) que generará ADNc de todas las especies de ARNm (Figura 7)
En la Figura 7 se proporciona un ejemplo de la producción de una genoteca de ADNc cebada con oligo dT adaptada.
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ii. Oligonucleótidos degenerados específicos de motivo proteico funcional.
Estos cebadores generarán un número limitado de genes que pertenecen a la misma familia de proteínas o de proteínas funcionalmente relacionadas (Figura 8).
En la Figura 8 se proporciona un ejemplo de la producción de una genoteca de ADNc específico de motivo de secuencia adaptada.
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iii. Un oligonucleótido específico de gen producirá ADNc para sólo una especie de ARNm (Figura 9)
Los oligonucleótidos usados para la producción de ADNc pueden contener secuencias adicionales, 1) secuencias específicas de marcador de proteína para una purificación más sencilla de las proteínas recombinantes (6x HIS), 2) sitios de enzimas de restricción, 3) extremo 5' modificado con el objetivo de purificación de ADNc o construcción de ADN (Figura 10).
La conversión de ARNm en ADNc bicatenario para la inserción en un vector se lleva a cabo en dos partes. En primer lugar, se hibrida ARNm intacto con un cebador oligonucleotídico, se copia mediante una transcriptasa inversa y los productos se aíslan mediante extracción con fenol y precipitación con etanol. El ARN en el híbrido de ARN-ADN se elimina con ARNasa H a medida que la ADN polimerasa de E. coli rellena los huecos. Los fragmentos de segunda cadena producidos de este modo se ligan mediante ADN ligasa de E. coli. Se completa la síntesis de la segunda cadena, se degrada el ARN residual y el ADNc se hace romo con ARNasa H, ARNasa A, ADN polimerasa T4 y ADN ligasa de E. coli.
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d. Ligación de adaptador
Pueden ligarse moléculas adaptadoras a ambos extremos del ADNc bicatenario de extremos romos o en sólo un extremo del ADNc. Podría conseguirse una ligación de adaptador dirigida mediante el uso de oligonucleótidos modificados en posición 5' (por ejemplo, biotinilados, aminados) durante la síntesis de ADNc que evita la ligación del adaptador al extremo 3' del ADNc. Las moléculas de ADNc resultantes contienen una genoteca de ADNc de extremo 5' compuesta por la región no traducida 5', el codón de inicio de la traducción AUG que codifica una metionina, seguido de la región codificante del gen o genes. Las moléculas de ADNc están flanqueadas por una secuencia ADN conocida en sus extremos 5' y 3' (Figuras 14, 15 y 16).
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e. Amplificación de ADNc
Pueden sintetizarse cebadores de PCR para las secuencias terminales 5' y 3' conocidas o secuencias internas conocidas y usarse para la amplificación de la genoteca completa o subpoblaciones específicas de ADNc usando cebador de amplificación 5' o 3' extendido en combinación con el cebador localizado en el sitio opuesto de las moléculas de ADNc (Figura 11).
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f. Diseño de cebadores para la amplificación de subpoblaciones de genes
Los cebadores de subpoblaciones contienen dos porciones (Figura 12). La parte 5' del cebador es complementaria a la secuencia de una secuencia conocida, prolongándose con su extremo 5' hacia la secuencia de ADNc desconocida. Puesto que cada nucleótido en la parte de ADNc de la genoteca puede tener un resto de adenosina, citidina, guanosina o timidina, existen cuatro posibilidades de nucleótidos diferentes para cada posición nucleotídica. Pueden sintetizarse cuatro cebadores de amplificación diferentes conteniendo cada uno la misma secuencia conocida y prolongándose por un nucleótido hacia el área de ADNc de la genoteca. Los 4 cebadores difieren solamente en su nucleótido más 3', que es A, C, G o T. Si se supone que cada nucleótido (A, C, G, T) está igualmente representado en un tramo de ADN, cada uno de los 4 cebadores de amplificación amplificará un cuarto de los genes totales representados en la genoteca de ADNc. Prolongando la secuencia de cebador de amplificación adicionalmente y aumentando el número de cebadores de amplificación, puede reducirse adicionalmente la complejidad de los productos de amplificación. La prolongación de la secuencia en 2 nucleótidos requiere la síntesis de 16 cebadores diferentes disminuyendo la complejidad en 16 veces, 3 nucleótidos requieren 64 cebadores diferentes y la extensión de nucleótidos requiere n^{4} cebadores diferentes.
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g. Amplificación por PCR
La amplificación por PCR implica mezclar ADN molde, dos cebadores oligonucleotídicos apropiados (cebadores de extremos 5' y 3' localizados en las secuencias añadidas conocidas dirigidas en orientación complementaria), Tag u otra ADN polimerasa termoestable, desoxirribonucleósido trifosfatos (dNTP) y un tampón. Los productos de PCR se analizan después del ciclado en geles de ADN o mediante análisis en un ABI 377 usando el programa informático de análisis Genescan. Estos métodos de análisis permiten la determinación de la complejidad de la combinación de ADNc amplificada.
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h. Producción de una genoteca de expresión de proteína
Cada subpoblación de genoteca de ADNc amplificada se clona en orientación 5' a 3' en un sistema de expresión de proteína bacteriano (E. coli, etc.) o eucariota (Baculovirus, levadura, mamífero). El gen se introduce con su propia señal de inicio de la traducción y un marcador 6xHis en las 3 fases. Por ejemplo, el ADNc se limita con dos enzimas de restricción de puntos de corte poco frecuentes diferentes (BgIII de extremo 5' y Not I de extremo 3') y se clona en la orientación 5' a 3' en el vector de transferencia de Baculovirus pVL 1393 bajo el control directo del promotor de polihedrina.
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i. Expresión de proteína
Se cotransfectó ADN de Baculovirus linealizado y ADN de vector de transferencia recombinante en células de insecto Sf9 susceptibles con fosfato de calcio. Para la cotransfección, se prepararon 10 \mug de ADN plasmídico purificado. Se preparó una reserva de Baculovirus recombinante inicial y se infectaron células Sf9 para la producción de proteína recombinante.
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j. Purificación de proteína
Las proteínas recombinantes expresadas contienen un marcador de afinidad (un ejemplo es un marcador 6xHis). Se purifican en agarosa Ni-NTA. Se obtienen de forma rutinaria aproximadamente de 1 a 2 mg de proteína de fusión recombinante 6xHis por litro de cultivo de células de insecto.
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k. Eliminación de marcador de purificación
Si el vector de expresión o el cebador de amplificación se construyeron con un sitio de escisión proteolítico para trombina, el marcador de purificación puede eliminarse de las proteínas recombinantes después de la etapa de purificación por afinidad de proteína.
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II. Generación de anticuerpos por inmunización de animales diferentes con mezclas de proteína individuales
3. La preparación de reactivos de captura de proteína de anticuerpos es con fines descriptivos solamente y no se incluye en el alcance de la invención.
Se inyecta una preparación de proteína purificada traducida a partir de una combinación de ADNc por vía intramuscular, intradérmica o subcutánea en presencia de adyuvante en un animal de la especie seleccionada (conejo). Las inmunizaciones de refuerzo se comienzan de 4 a 8 semanas después de la inmunización de sensibilización y se continúa a intervalos de 2 a 3 semanas. El antisuero policlonal se purifica usando normas conocidas por los especialistas en la técnica.
Los lotes de anticuerpo purificado pueden usarse directamente como reactivos de captura de proteínas sin modificación. En este caso, los lotes de anticuerpo de diferentes animales deben mantenerse por separado (cada lote es un reactivo de captura).
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III. Las proteínas de anticuerpos se aíslan y conjugan con secuencias de ácido nucleico que se corresponden a la preparación de antígenos original dando como resultado reactivos de captura de anticuerpos
Generación de moléculas de captura/separación bifuncionales para separación de la mezcla de proteínas compleja en una fase sólida.
El dominio C_{H}^{2} glicosilado de los anticuerpos policlonales se conjuga con oligonucleótidos modificados en posición 5' usando métodos de conjugación convencionales. La molécula resultante tiene un resto de captura de proteína (anticuerpo) y un resto de ácido nucleico (oligonucleótido) (Figura 13).
Los lotes de anticuerpo después de la inmunización de un animal con una combinación de proteína de complejidad reducida se conjugan con la secuencia oligonucleotídica. Los anticuerpos producidos a partir de múltiples acontecimientos de inmunización con diferentes combinaciones de proteínas se conjugan con un oligonucleótido con una secuencia diferente (Figura 13).
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4. Captura de proteínas diana usando funcionalidad de reactividad y separación mediante hibridación de oligonucleótidos
Se han desarrollado dos métodos diferentes para generar oligonucleótidos unidos a un soporte sólido: pueden sintetizarse in situ o sintetizarse previamente y unirse al soporte. En cualquier caso, es posible usar los oligonucleótidos unidos al soporte en una reacción de hibridación con oligonucleótidos en la fase líquida para formar dúplex; el exceso de oligonucleótido en solución puede eliminarse después por lavado.
El soporte puede adoptar la forma de partículas, por ejemplo esferas de vidrio o perlas magnéticas. En este caso, las reacciones pueden llevarse a cabo en tubos o en los pocillos de una placa de microtitulación. Se conocen métodos para la síntesis de oligonucleótidos y para la unión de oligonucleótidos sintetizados previamente a estos materiales (véase, por ejemplo, Stahl y col. (1988) Nuclei Acids Research 16(7):3025-3039).
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a. Preparación de soporte sólido funcionalizado con amina
Se sintetizan oligonucleótidos de una secuencia definida en un soporte de vidrio funcionalizado con amina. Una función amina se unió en localizaciones separadas sobre el portaobjetos de vidrio usando solución de 700 \mul de H_{2}N(CH_{2})_{3} Si(OCH_{2}CH_{3})_{3} en 10 ml de etanol al 95% a temperatura ambiente durante 3 horas. El soporte tratado se lavó una vez con metanol y después una vez con éter etílico. El soporte se secó a temperatura ambiente y después se horneó a 110ºC durante 15 horas. Después se lavó con agua, metanol y agua, y después se secó.
El portaobjetos de vidrio se hizo reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente con 250 mg (1 milimol) de anhídrido ftálico en presencia de 2 ml de piridina anhidra y 61 mg de 4-dimetil amino piridina.
El producto se aclaró con dicloruro de metileno, alcohol etílico y éter, y después se secó. Los productos sobre el portaobjetos se hicieron reaccionar con 330 mg de diciclohexilcarbodiimida (DCC) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La solución se decantó y se reemplazó con una solución de 117 mg de 6-amino-1-hexanol en 2 ml de dicloruro de metileno y después se dejó a temperatura ambiente durante aproximadamente 8 horas.
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b. Síntesis de oligonucleótidos en un soporte sólido
El soporte sólido funcionalizado con amina se preparó para síntesis de oligonucleótidos por tratamiento con 400 mg de anhídrido succínico y 244 mg de 4-dimetil aminopiridina en 3 ml de piridina anhidra durante 18 horas a temperatura ambiente. El soporte sólido se trató con 2 ml de DMF que contenía 3 milimoles (330 mg) de DCC y 3 milimoles (420 mg) de p-nitrofenol a temperatura ambiente durante una noche. El portaobjetos se lavó con DMF, CH_{3}CN, CH_{2}Cl_{2}, y éter etílico. Una solución de 2 milimoles (234 mg) de H_{2}N(CH_{2})_{6}OH en 2 ml de DMF se hizo reaccionar con el portaobjetos durante una noche. El producto de esta reacción era un soporte -O(CH_{2})_{3}NHCO(CH_{2})_{2}
CONH(CH_{2})_{5}CH_{2}OH. El portaobjetos se lavó con DMF, CH_{3}CH, metanol y éter etílico.
El éster funcionalizado resultante de la preparación del soporte de vidrio se usó para la síntesis de una secuencia oligonucleotídica. Cada resto nucleosídico se añadió como una fosforamidita de acuerdo con procedimientos conocidos (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.725.677 y 5.198.540, y RE34.069, véase también Caruthers y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.415.732).
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5. Análisis de proteínas de las proteínas capturadas y comparación de muestras de proteínas complejas
Los lotes de anticuerpo purificado pueden 1) unirse directamente a una superficie sólida e incubarse con muestras de proteína, 2) incubarse con las muestras y posteriormente unirse a un soporte sólido sin usar el compuesto de captura, o 3) el compuesto de captura puede usarse para capturar su proteína correspondiente en una muestra y posteriormente separar las proteínas capturadas mediante hibridación de nucleótidos específica (Figura 14).
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IV. Se inmovilizan reactivos de captura de oligonucleótidos antisentido en localizaciones separadas y conocidas sobre una superficie sólida para generar una matriz de captura de anticuerpos 6. Preparación de superficies de matriz de captura
Se sintetizan oligonucleótidos aminados en posición 5' usando química de fosforamidita y se unen a ésteres de N-oxisuccinimida. Las secuencias oligonucleotídicas unidas son complementarias a los oligonucleótidos de separación de las moléculas de anticuerpo bifuncionales (Figura 13). Las proteínas se capturan mediante hibridación de ácido nucleico de su oligonucleótido de separación con la secuencia complementaria unida al oligonucleótido de superficie sólida.
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V. Los reactivos de captura de anticuerpos se añaden a la mezcla de proteínas total (etapa de reactividad). La mezcla de reacción se añade después a la matriz de superficie sólida en condiciones que permiten la hibridación de oligonucleótidos (etapa de separación) 7. Captura de compuesto de captura/proteína y separación
Los anticuerpos bifuncionales se incuban con la muestra de proteína en condiciones que permiten a los anticuerpos unirse a su antígeno correspondiente. La molécula de anticuerpo bifuncional con la proteína capturada se añade a la matriz de captura preparada con oligonucleótidos. En condiciones de hibridación de ADN convencionales que no desnaturalizan la unión de antígeno-anticuerpo, el anticuerpo bifuncional hibridará con su resto de ácido nucleico con el oligonucleótido complementario.
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VI. La proteína capturada se identifica usando espectrometría de masas de MALDI 8. Análisis de las proteínas de captura
Las proteínas unidas se analizan usando métodos de análisis de proteína convencionales tales como espectrometría de masas.
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Ejemplo 4 Síntesis de compuestos de captura de Proteínas basados en Tritilo (véase la Figura 15) A. Síntesis de 2-(4-bromofenil)-4,4-dimetil-1,3-oxazolina (1)
A ácido 4-bromo benzoico (50 g, 0,25 M) situado en un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con un condensador de reflujo se le añadieron 150 ml de cloruro de tionilo durante 8 horas. El exceso de cloruro de tionilo se retiró al vacío y el sólido blanco obtenido se disolvió en 100 ml de CH_{2}Cl_{2} seco y se mantuvo en un baño de hielo. A esta solución enfriada en hielo de cloruro de bromobenzoilo se le añadieron gota a gota 45 g de 2-amino-2-metilpropan-1-ol disueltos en otros 100 ml de CH_{2}Cl_{2} seco con agitación durante un periodo de 1 hora. El baño de hielo se retiró y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El sólido de color blanco precipitado se filtró y se lavó varias veces con CH_{2}Cl_{2} (4 x 100 ml). El CH_{2}Cl_{2} combinado se retiró en el evaporador rotatorio y el sólido obtenido se disolvió lentamente en 150 ml de cloruro de tionilo y se calentó a reflujo durante 3 horas. El exceso de SOCl_{2} se evaporó hasta un sexto de su volumen, se vertió en 500 ml de éter seco enfriado en un baño de hielo y se mantuvo en el frigorífico durante una noche. El éter se retiró y el clorhidrato precipitado se disolvió en 500 ml de agua fría. La solución acuosa se neutralizó cuidadosamente usando una solución al 20% de KOH en condiciones de refrigeración (baño de hielo) y el residuo oleoso de color pardo separado se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 x 200 ml) y se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. La retirada del disolvente dio 42 g (67%) de 2-(4-bromofenil)-4,4-dimetil-1,3-oxazolina en forma de un aceite de color amarillo. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta ppm: 1,36 (s, 6H), 4,08 (s, 2H), 7,52 (d, 2H), 7,79 (d, 2H). Masa: 254,3 (M^{+}).
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B. Síntesis de fenil-{3-[2-(tetrahidropiran-2-iloxi)-etoxi]-fenil}-metanona (2)
1. Método A
En un matraz de fondo redondo de dos bocas y de 100 ml que contenía 550 mg (8 mM) de NaOEt en 20 ml de DMF seca se añadió 3-hidroxi benzofenona (1 g, 5 mM) en una atmósfera de argón. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 min y se añadió gota a gota 2-bromoetoxi tetrahidropirano (1 g, 5 mM) disuelto en 5 ml de DMF seca. La mezcla de reacción se calentó a 60ºC durante una noche, se enfrió, se vertió en agua enfriada con hielo y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2 x 50 ml). El disolvente combinado se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se evaporó. El residuo en bruto obtenido se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando una mezcla de hexano/EtOAc (9:1) mixture como eluyente. Rendimiento: 680 mg (42%).
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2. Método B
A la mezcla agitada de 3-hidroxi benzofenona (1 g, 5 mM), K_{2}CO_{3} anhidro (3 g, 23 mM) y NaI (500 mg) en acetona seca (40 ml) se le añadió 2-bromoetoxitetrahidropirano (1 g, 5 mM) disuelto en 10 ml de acetona seca y se calentó a reflujo durante 20 h. El precipitado se filtró y se mezcló con la acetona (3 x 20 ml). El filtrado combinado se evaporó y el residuo de color amarillento obtenido se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando una mezcla de hexano/EtOAc (9:1) como eluyente. Rendimiento: 55-60%. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta ppm: 1,5-1,63 (m, 4H), 1,72 (m, 1 H), 1,82 (m, 1 H), 3,52 (m, 1 H), 3,8-3,9 (m, 2H), 4,07 (m, 1 H), 4,21 (m, 2H), 4,70 (t, 1 H), 7,15 (d, 1 H), 7,37 (m, 3H), (7,47 (t, 2H), 7,58 (t,1 H), 7,80(d,1 H). Masa: 327,2 (M^{+}), 349,3 (M+Na^{+}).
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C. Reacción de Grignard: Síntesis de 2-{4'-(3-(2-tetrahidropiran-2-iloxi)etoxi)fenil-4''-fenil)}-4,4-dimetil-1,3-oxazolina, 3
A un matraz de fondo redondo de dos bocas y de 100 ml equipado con un condensador de relujo se le añadieron limaduras de Mg activadas (720 mg, 30 mM), unos cristales de I_{2} y tamices moleculares (4 \ring{A}) en una atmósfera de argón. A esta mezcla se le añadieron 10 ml de THF. La mezcla se calentó a 50ºC y se añadieron 2-(4-bromofenil)-4,4-dimetil-1,3-oxazolina (6,5 g, 26 mM) disuelta en 15 ml de THF seca, una cantidad catalítica de CH_{3}I, RED-Al y CCl_{4} con agitación y se calentó a reflujo durante 3 horas. Después de esto, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se añadió fenil-{3-[2-(tetrahidropiran-2-iloxi)-etoxi]-fenil}-metanona (5,1 g, 15,6 mM) disuelta en 15 ml de THF seco, se calentó de nuevo a reflujo durante 3 horas, se enfrió y se añadieron 3 ml de agua. El disolvente se retiró en el evaporador rotatorio, se extrajo con CHCl_{3} (3 x 100 ml) y se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. El residuo obtenido después de la retirada del disolvente se separó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando hexano/EtOAc (7:3) como eluyente. La evaporación de la fracción de la columna produjo 2-{4'-(3-(2-tetrahidropiran-2-iloxi)etoxi)fenil-4''-fenil)}-4,4-dimetil-1,3-oxazolina (3) en forma de un sólido cristalino de color amarillo (1,4 g, al 18%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta ppm: 1,37 (s, 6H), 1,5-1,63 (m, 4H), 1,68 (m, 1 H), 1,80 (m, 1 H), 2,85 (s, 1H, -OH), 3,49 (m, 1 H), 3,75 (m, 1 H), 3,85 (m, 1 H),3,97 (m, 1 H), 4,09(m, 4H), 4,66 (t, 1 H), 6,80 (d, 1 H), 6,84 (d, 1 H), 6,88 (s,1H), 7,18-7,31 (m, 6H), 7,34 (d, 2H), 7,87 (d, 2H). Masa: 502,6 (M + 1), 524,5 (M+Na+).
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D. 4,4-Dimetil-2-[4-(fenil-[2-(tetrahidro-piran-2-iloxi)-etoxi]-{3-[2-(tetrahidro-piran-2-iloxi)-etoxi]-fenil}-metil)-fenil]-4,5-dihidrooxazol, 4
A la mezcla agitada de 2-{4'-(3-(2-tetrahidropiran-2-iloxi)etoxi)fenil-4''-fenil)}-4,4-dimetil-1,3-oxazolina (3, 200 mg, 0,4 mM) y NaH (100 mg, 4 mM) en 3 ml de DMF seca a t.a. se le añadió 2-(2-bromoetoxi)tetrahidro-2H-pirano (500 mg, 2,4 mM) y la reacción se dejó en agitación a t.a. durante 2 h. Después, la mezcla de reacción se vertió en agua enfriada con hielo, se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 x 20 ml) y se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. La evaporación del disolvente dio 4 en forma de un residuo oleoso de color amarillo y con rendimiento cuantitativo.
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E. Ácido 4-{(2-hidroxi-etoxi)-[3-(2-hidroxi-etoxi)-fenil]-fenil-metil}-benzoico, 5
Una solución de 4 (360 mg) en 3 ml de ácido acético acuoso al 80% se calentó a 75ºC durante 12 h. Después, la solución se evaporó y el residuo obtenido se calentó a reflujo con NaOH al 20%/EtOH (1:1, v/v, 3 ml) durante 2 h. El disolvente se retiró, al residuo se le añadieron 10 ml de agua enfriada con hielo y la solución acuosa se acidificó con HCI 1 N. El sólido precipitado de color amarillo se filtró, se lavó varias veces con agua y se secó a alto vacío. Rendimiento: 270 mg (100%, cuantitativo).
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F. 2,5-Dioxo-pirrolidin-1-il éster del ácido 4-{(2-hidroxi-etoxi)-[3-(2-hidroxi-etoxi)-fenil]-fenil-metil}-benzoico, 6
1. Método A
A una solución agitada del ácido de tritilo 5 (110 mg, 0,26 mM) y N-hidroxi succinimida (80 mg, 0,7 mM) en 1,4-dioxano seco (2 ml) se le añadió clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 105 mg, 5 mM) disuelto en 2 ml de agua. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a t.a., se extrajo con CHCl_{3} (3 x 10 ml) y se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. El sólido obtenido por evaporación del disolvente se purificó por fase TLC preparativa. Rendimiento: 5 mg.
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2. Método B
A una solución agitada del ácido de tritilo 5 (12 mg, 0,03 mM) en THF seco (4 ml) se le añadió diciclohexil carbodiimida (DDC, 10 mg, 0,05 mM). La mezcla de reacción se agitó durante 30 min a t.a., se añadieron N-hidroxi succinimida (11,5 mg, 0,1 mM) y una cantidad catalítica de DMAP y se dejó en agitación durante una noche. El disolvente se retiró en el evaporador rotatorio y el sólido obtenido se disolvió en éter seco. El DCU precipitado se filtró y el disolvente de éter se evaporó. El sólido en bruto obtenido se purificó mediante una placa de TLC preparativa. Rendimiento 7 mg (50%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta ppm : 2,90 (s, 4H), 3,92 (t, 4H), 4,02 (t, 4H), 6,83 (m, 2H), 7,25 (m, 3H), 7,34 (m, 4H), 7,50 (d, 2H), 8,0 (d, 2H).
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G. 4,4-Dimetil-2-[4-(fenil-(3-fenil-propoxi)-{3-[2-(tetrahidro-piran-2-iloxi)-etoxi]-fenil}-metil)-fenil]-4,5-dihidro-oxazol, 7
A la mezcla agitada de 2-{4'-(3-(2-tetrahidropiran-2-iloxi)etoxi)fenil-4''-fenil)}-4,4-dimetil-1,3-oxazolina (3, 300 mg, 0,6 mM) y NaH (100 mg, 4 mM) en 3 ml de DMF seca a t.a. se le añadió 3-bromo-1-fenilo propano (250 mg, 1,2 mM) y la reacción se dejó en agitación a t.a. durante 2 h. Después la mezcla de reacción se vertió en agua enfriada con hielo, se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 x 20 ml) y se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. La evaporación del disolvente dio 7 en forma de un residuo de color amarillo con rendimiento cuantitativo.
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H. Ácido 4-[[3-(2-Hidroxi-etoxi)-fenil]-fenil-(3-fenil-propoxi)-metil]-benzoico, 8
Una solución de 7 (550 mg) en 3 ml de ácido acético acuoso al 80% se calentó a 75ºC durante una noche. Después, la solución se evaporó y el residuo obtenido se calentó a reflujo con NaOH al 20%/EtOH (1:1, v/v, 3 ml) durante 2 h. El disolvente se retiró y al residuo se le añadieron 10 ml de agua enfriada con hielo y la solución acuosa se acidificó con HCI 1 N. Y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (60 ml) y se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. La evaporación del disolvente dio un sólido de color amarillo. Rendimiento: 485 mg (cuantitativo).
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I. 2,5-Dioxo-pirrolidin-1-il éster del ácido 4-[[3-(2-hidroxi-etoxi)-fenil]-fenil-(3-fenil-propoxi)-metil]-benzoico, 9
A una solución agitada del ácido de tritilo 8 (200 mg, 0,42 mM) en THF seco (6 ml) se le añadió diciclohexil carbodiimida (DDC, 206 mg, 1 mM). La mezcla de reacción se agitó durante 30 min a t.a., se añadieron N-hidroxi succinimida (70 mg, 0,6 mM) y una cantidad catalítica de DMAP y se dejó en agitación durante una noche. El disolvente se retiró en el evaporador rotatorio y el sólido obtenido se disolvió en éter seco. El DCU precipitado se filtró y el disolvente de éter se evaporó. El sólido en bruto obtenido se separó por cromatografía en columna usando CH_{2}Cl_{2}. Rendimiento: aproximadamente 120 mg. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta ppm: 1,70 (m, 2H), 1,9 (t, 2H), 2,9 (s, 4H), 3,5 (m, 2H), 3,9 (t, 2H), 4,0 (t, 2H), 6,85 (m, 4H), 7,25 (m, 4H), 7,32 (m, 5H), 7,51 (m, 3H), 8,09 (d, 2H).
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J. 1-{4-[[3-(2-Hidroxi-etoxi)-fenil]-fenil-(3-fenil-propoxi)-metil]-benzoil}-pirrol-2,5-diona, 10
A una solución agitada del ácido de tritilo 8 (280 mg, 0,42 mM) en THF seco (6 ml) se le añadió diciclohexil carbodiimida (DDC, 400 mg, 1,95 mM). La mezcla de reacción se agitó durante 30 min a t.a., se añadieron maleimida (100 mg, 1,1 mM) y una cantidad catalítica de DMAP y se dejó en agitación durante una noche. El disolvente se retiró en el evaporador rotatorio y el sólido obtenido se disolvió en éter seco. El DCU precipitado se filtró y el disolvente éter se evaporó. Parte del producto se purificó por TLC preparativa. Rendimiento: 12 mg. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta ppm: 1,78 (m, 2H), 1,95 (m 2H), 2,9 (s, 4H), 3,51 (m, 2H), 3,93 (t, 2H), 4,02 (t, 2H), 6,8 (m, 5H), 7,25 (m, 5H), 7,29 (m, 5H), 7,37 (m, 3H), 7,48 (d, 2H), Masa: 561,3 (M+).
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Ejemplo 5
Este ejemplo muestra la adición de una función de selectividad sobre un compuesto de captura que posee una función de reactividad de N-hidroxi succinimidil éster. Los compuestos con separación pueden prepararse usando un análogo apropiado del compuesto 11 que se muestra a continuación.
Procedimiento para la Reacción de Mitsunobu de Reactivos de Captura de Tritilo
25
A un vial de reacción se le añaden 1,1 equivalentes de trifenilfosfina y se disuelven en 1,0 ml de THF. A esta solución se le añaden 1,1 equivalentes de azidodicarboxilato de diisopropilo y se mezclan durante 5 minutos. Se añade un equivalente de 11 y se agita durante 5 minutos. Se añade nucleófilo (R_{1} - OH) y se agita durante una noche a 50ºC. Los productos se purifican por TLC preparativa.
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Ejemplo 6 Sincronización celular
Se sincronizaron células de cáncer de pulmón H460 y de cáncer de colon SW480 en Go/G1 con simvastatina y lovastatina (inhibidores de la HMG-CoA reductasa), que pueden enriquecer una población de células cancerosas en Go/G1. Las células detenidas en la fase G2/M se obtuvieron por tratamiento con nocodazol.
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Cultivo Celular y Reactivos
La línea celular SW480 se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), la línea celular H460 (ATCC Manassas, VA) se cultivó en RPMI 1640, mientras que la FK101 se cultivó en medio sin suero (SFM) con CO_{2} al 5% a 37ºC. Los medios de cultivo de células se suplementaron con suero bovino fetal al 10% (FBS), 1-glutamina 2 mM, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 U/ml).
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Sincronización de Células
Se obtuvieron células H460 y SW480 enriquecidas en fase G_{1} después de la incubación con medio sin suero durante 48 horas, o tratamiento con U026, lovastatina o simvastatina. Las células en fase S se sincronizaron por incubación de las células con medio que no contenía suero durante 24 horas seguido de tratamiento con afidicolina (2 \mug/ml) durante 20 horas y liberación de las células de afidicolina durante 3 horas. Las células detenidas en la fase G2/M se obtuvieron por tratamiento con nocodazol (0,4-0,8 mg/ml) durante un periodo de 16-20 horas.
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Ejemplo 7 Síntesis de derivados de (4,4'-bisfenil-hidroximetil)benzoil maleimida
26
Procedimiento General: Una solución de ácido 4-(difenilhidroximetil)benzoico (0,04 mM) en 1 ml de SOCl_{2} se calentó a reflujo durante 1 h y el exceso de SOCl_{2} se retiró a alto vacío. A este residuo sólido de color amarillo obtenido se le añadió maleimida (0,045 mM) disuelta en THF seco recién destilado (1 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El disolvente se retiró y se añadió el alcohol correspondiente (ROH, exceso de 2-5 veces) disuelto en piridina seca (1 ml) con agitación. Después agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante una noche, la solución se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (5 x 3 ml) y se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. El residuo obtenido después de la evaporación del disolvente se separó por TLC preparativa (Gel de sílice, placa de 500 \mum), dando el producto 1 con un rendimiento del 50-60%. Los derivados de tritilo 1 se caracterizaron totalmente por ^{1}H RMN y por los datos espectrales de masas.
Ejemplo 8 Síntesis de Compuestos de Captura de Tritilo de Éster de Succinimidilo
Procedimiento 1
27
Se hizo reaccionar el ácido 4-(difenilhidroximetil)benzoico con 2 equivalentes de N-hidroxisuccinimida usando 1,2 equivalentes de diisopropil carbodiimida. El producto deseado se purificó por cromatografía sobre sílice ultrarrápida y se caracterizó por espectrometría de masas ESI.
28
Los 125 \mumoles del producto anterior se añadieron a 1,0 ml de cloruro de acetilo. Esta mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y se evaporó tres veces con tolueno para retirar el exceso de cloruro de acetilo. Se añadieron volúmenes iguales de la mezcla de reacción a los nucleófilos (véase a continuación) disueltos en piridina 1,0 M/THF. Estas mezclas de reacción se mezclaron a 60ºC durante 2 horas. Los productos resultantes se extrajeron en CHCl_{3} y HOAC al 10%. Los productos se purificaron por TLC Preparativa (Éter). Los productos purificados se caracterizaron por MS y RMN.
29 
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Procedimiento 2
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290 
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Se disuelven 1,64 mmoles de ácido 4-(difenilhidroximetil)benzoico en 5 ml cloruro de tionilo. Esta mezcla de reacción se calienta a 79ºC y se agita durante 75 minutos. El cloruro de tionilo se retira en una atmósfera de N_{2} (g). A esta mezcla de reacción secada se le añaden 1,3 equivalentes de N-hidroxisuccinimida disueltos en THF seco y se agita durante 1 hora. El disolvente THF se retira en una atmósfera de N_{2} (g). El producto se disuelve en piridina seca. Se añaden volúmenes iguales de esta solución a los nucleófilos disueltos en piridina (Véase a continuación). Los productos resultantes se extraen en CHCl_{3} y HOAC al 10%. Los productos se purifican por TLC preparativa (Éter). Los productos purificados se caracterizan por MS y RMN.
30 
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Ejemplo 9
Este ejemplo muestra ensayos de unión de captura ejemplares, los efectos de funciones de selectividad sobre la unión. Este ejemplo demuestra que el cambio de la selectividad puede alterar la reactividad del compuesto de captura proporcionando de este modo un medio para sondear estructuras de biomoléculas y para permitir la separación o reducción de diversidad usando las colecciones. En este ejemplo, el grupo núcleo de los compuestos de captura es un grupo tritilo y el grupo reactivo es succinimida, que interacciona con una amina primaria. El compuesto 1341 es un compuesto no selectivo que tiene un grupo de reactividad pero no un grupo de selectividad. El compuesto 1343 (véase la Figura 20) es ejemplar de dicho compuesto en el que el grupo de selectividad es -OH. Cuando el grupo de selectividad cambia, existe una diferencia en la reactividad sobre las proteínas diana (lisozima, citocromo C y ubiquitina).
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Lisozima
Tres compuestos de captura diferentes (designados HKC 1343, 1349, 1365; la estructura química de cada compuesto se enumera a continuación del nombre de compuesto) se hicieron reaccionar individualmente con lisozima (numero de Acceso POO698; Figura 20b). Los experimentos de captura se analizaron usando espectrometría de masas de MALDI-TOF. La unión se realizó en volúmenes de muestra de 20 \mul con una concentración de lisozima de 5 \muM en solución tampón HEPES 25 mM, pH 7,0. Los compuestos de captura basados en tritilo se añadieron a la solución de proteína a una concentración de 10 \muM. La reacción de unión se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se interrumpió usando 1 \mul de una solución base TRIZMA 100 mM.
La mezcla de unión compuesto de captura-proteína se ha preparado para espectrometría de masas por mezcla de una alícuota de 1 \mul de una reacción de unión con 1 \mul de ácido sinapínico a 10 mg/ml en acetonitrilo acuoso al 30%. La muestra se depositó como una mancha de 50 nl en la superficie de las placas diana de masa y se secó al aire antes del análisis espectrométrico de masas. Los resultados del análisis de espectrometría de masas, que se muestran en la Figura 20b, demuestran que la adición de grupos de selectividad a compuestos permite alteraciones en la especificidad de unión de compuestos de captura.
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Citocromo C
Cuatro compuestos de captura diferentes (designados HKC 1341, 1343, 1349, 1365; la estructura química de cada compuesto se enumera a continuación del nombre de Compuesto) se hicieron reaccionar individualmente con Citocromo b (número de Acceso: POOOO6, Figura 20c). Los experimentos de captura se analizaron usando Espectrometría de Masas de MALDI-TOF. La unión se realizó en volúmenes de muestra de 20 \mul con concentraciones de Citocromo C de 5 \muM en solución de tampón HEPES 25 mM, pH 7,0. Los compuestos de captura basados en tritilo se añadieron a la solución de proteína a una concentración de 10 \muM. La reacción de unión se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se interrumpió usando 1 \mul de una solución de base TRIZMA 100 mM. La mezcla de unión compuesto de captura-proteína se había preparado para análisis de espectrometría de masas por mezcla de una alícuota de 1 \mul de la reacción de unión con 1 \mul de ácido sinapínico a 10 mg/ml en acetonitrilo acuoso al 30%. La muestra se depositó como una mancha de 500 nl sobre la superficie de placas diana de masa y posteriormente se secó al aire antes de los análisis espectrométricos de masas. Los resultados del análisis de espectrometría de masas que se muestra en la Figura 20c demuestran que la adición de grupos de selectividad a compuestos permite alteraciones en la especificidad de unión de los compuestos de captura.
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HKC 1343
Uno de los compuestos de captura ejemplares (HKC 1343) se incubó con una mezcla de tres proteínas diferentes (Ubiquitina, [PO2248], citocromo C [P00006] y Lisozima [POO698] (véase, la Figura 20d). El experimento de captura se analizó usando Espectrometría de Masas de MALDI-TOF. Las reacciones de unión se realizaron en un volumen de muestra 20 \mul con las tres proteínas a concentraciones de 5 \muM en solución de tampón HEPES 25 mM pH 7,0. El compuesto de captura basado en tritilo se añadió a la solución de proteína a una concentración de 25 \muM. La reacción de unión se había incubado a temperatura ambiente durante 30 minutos y la reacción se interrumpió usando 1 \mul de una solución de base TRIZMA 100 mM. La mezcla de unión compuesto de captura-proteína se preparó para espectrometría de masas por medio de la mezcla de una alícuota de 1 \mul de la reacción de unión con 1 \mul de ácido sinapínico a 10 mg/ml en acetonitrilo acuoso al 30%. La muestra se depositó como una mancha de 500 nl sobre la superficie de placas diana de masas y se secó al aire antes del análisis del espectro de masas. Los resultados del análisis de espectrometría de masas que se muestran en la Figura 20d demuestran que mediante el análisis espectrofotométrico de masas puede identificarse una pluralidad de compuestos unidos a un solo agente de captura que es selectivo.
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HKC 1365
Otro de los compuestos de captura ejemplares (HKC 1365) se incubó con una mezcla de tres proteínas diferentes (Ubiquitina [PO2248], Citocromo C [POOOO6] y Lisozima [POO698]; (véase la Figura 20e)). El experimento de captura se analizó usando Espectrometría de Masas de MALDI-TOF. Las reacciones de unión se realizaron en un volumen de muestra 20 \mul con las tres proteínas a concentraciones de 5 \muM en solución tampón HEPES 25 mM pH 7,0. El compuesto de captura basado en tritilo se añadió a la solución de proteína a una concentración de 15 \muM. La reacción de unión se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se interrumpió usando 1 \mul de una solución de base TRIZMA 100 mM. La mezcla de unión compuesto de captura-proteína se preparó para espectrometría de masas por mezcla de una alícuota de 1 \mul de la reacción de unión con 1 \mul de ácido sinapínico a 10 mg/ml en acetonitrilo acuoso al 30%. La muestra se depositó como una mancha de 500 nl sobre la superficie de las placas diana de masas y se secó al aire antes de los análisis del espectro de masas. Los resultados del análisis de espectrometría de masas que se muestran en la Figura 20e demuestran que una pluralidad de compuestos unidos a un solo agente de captura que es selectivo pueden identificarse mediante análisis espectrométrico de masas.
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Reacción de citocromo C con un compuesto inespecífico
La Figura 20f muestra el espectro de masas para una reacción de evolución a lo largo del tiempo de citocromo C con un compuesto inespecífico (HKC 1341). El grupo reactivo de succinamida muestra especificidad y reactividad con las lisinas del citocromo C. El espectro superior no muestra modificaciones a tiempo cero, el espectro medio muestra 1-9 modificaciones que son el resultado de la unión de HKC 1341 después de 30 minutos y el espectro inferior muestra, después de 24 horas, 17 y 18 modificaciones que se corresponden con el número de lisinas (18) en el citocromo C.
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Ejemplo 10
Estos ejemplos muestran la selectividad del compuesto de captura haciendo reaccionar una mezcla de compuestos de captura y una mezcla de proteínas.
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Materiales
Tampón de reacción: HEPES 25 mM, pH 7,0
Proteínas: mezcla de ubiquitina, citocromo c y lisozima (la proporción molar es 1/5/6), la reserva de proteínas se prepara a 5 mg/ml (proteínas totales) en tampón de reacción.
Compuestos de captura: HKC 1343 y HKC 1365, la solución madre es 1 mM en acetonitrilo.
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Reacción de captura
Se prepara una dilución de proteína (mezcla) en el tampón de reacción a la concentración de 0,5, 2,5 y 3 \muM, para ubiquitina, citocromo C y lisozima, respectivamente. Se usan 19,5 \mul para una reacción de captura. Cada reacción se inicia por adición de 0,5 \mul de solución madre de compuesto 1 mM (final 25 \muM). La mezcla de reacción se incuba a temperatura ambiente durante 30 min antes de que la reacción se pare por adición de TRIZMA 5 mM.
Se realizan tres reacciones diferentes. Los primeros dos tubos contienen HKC 1343 y HKC 1365 individualmente y un tercero se inicia por adición de los compuestos HKC 1343 y 1365 (concentración final 25 \muM para cada compuesto). Después de la reacción, se mezcla 1 \mul de cada muestra con un volumen igual de matriz y se somete a análisis de MALDI. El significado estadístico de los resultados se asegura por triplicado de cada muestra reacción.
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<110> HK Pharmaceuticals, Inc.
\hskip1cm
Köster, Hubert 
\hskip1cm
Siddiqi, Suhaib 
\hskip1cm
Little, Daniel 
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<120> Compuestos de captura, colecciones de los mismos y métodos para analizar el proteoma y composiciones complejas
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<130> 24743-2305
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<140> No asignado todavía
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<141> Adjunto
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<150> 60/306.019
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<151> 16-07-2001
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<150> 60/314.123
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<151> 21-08-2001
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<150> 60/363.433
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<151> 11-03-2002
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<160> 149
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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
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<210> 1
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<211> 39
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 1
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31 
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<210> 2
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<211> 52
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 2
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32 
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<210> 3
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 3
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\hskip1cm
320 
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<210> 4
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 4
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33 
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<210> 5
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 5
\hskip1cm
34 
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<210> 6
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 6
\hskip1cm
35 
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<210> 7
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<220>
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<221> AMIDACIÓN
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<222> 14
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<221> MOD_RES
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<222> 1
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<223> Xaa es ácido piroglutámico
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<400> 7
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\hskip1cm
36 
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<210> 8
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<211> 37
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 8
37 
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<210> 9
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 9
\hskip1cm
38 
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<210> 10
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 10
\hskip1cm
39 
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<210> 11
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 11
\hskip1cm
40 
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<210> 12
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
41 
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<210> 13
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<211> 29
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> 1
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<223> Xaa es D-Phe
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<221> MOD_RES
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<222> 10
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<223> Nle
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<221> MOD_RES
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<222> 26
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<223> Nle
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<400> 13
42 
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<221> AMIDACIÓN
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<221> MOD_RES
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<210> 32
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<212> PRT
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
76 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
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\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Xaa es ácido piroglutámico
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<213> Homo Sapiens 
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<221> AMIDACIÓN
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<221> MOD_RES
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<223> Xaa es ácido piroglutámico
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
137 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\hskip1cm
138 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
139 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
140 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
141 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
142 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\hskip1cm
143 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
144 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\hskip1cm
145 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es ácido piroglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
146 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es ácido piroglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
147 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DUDOSO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1,5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es variable
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\hskip1cm
148 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\hskip1cm
149 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\hskip1cm
150 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\hskip1cm
151 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
152 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es ácido piroglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\hskip1cm
153 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
154 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
155 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
156 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
157 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\vskip1.000000\baselineskip
158 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
159 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
160 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\vskip1.000000\baselineskip
161 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
162 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\hskip1cm
163 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\hskip1cm
164 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es ácido piroglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\hskip1cm
165 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\hskip1cm
166 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> AMIDACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es ácido piroglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\hskip1cm
167 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\hskip1cm
168 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
169 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\hskip1cm
170 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
171 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\hskip1cm
172 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
173 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
174 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
175 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DUDOSO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es variable
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\hskip1cm
176 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\hskip1cm
177 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\hskip1cm
178

Claims (71)

1. Una colección de compuestos de captura, que comprende una pluralidad de compuestos de captura diferentes, donde cada compuesto de captura en la colección tiene la fórmula:
307
en la que:
\quad
m es un número entero que es de 1 a 100;
\quad
n es un número entero de 1 a 100;
\quad
la colección incluye al menos 10 compuestos de captura diferentes;
\quad
el resto X se selecciona para unirse covalentemente a biomoléculas;
\quad
el resto Y modula una o más de las propiedades de afinidad, propiedades estéricas y propiedades electrónicas del compuesto de captura aumentando de esta manera la selectividad de la unión mediante X de tal forma que el compuesto de captura se una a menos biomoléculas cuando el resto de selectividad Y está presente que en su ausencia;
\quad
el resto Q permite la separación o inmovilización de los compuestos de captura en la colección; y
\quad
el resto Z para presentar X, Y y Q;
\quad
Z es un derivado de tritilo para presentar los restos funcionales X, Y y Q; y
\quad
Z tiene la fórmula:
179
2. La colección de la reivindicación 1, en la que Q permite la separación por organización de los compuestos de captura en matrices sobre un soporte sólido uniéndose a la superficie o a una molécula sobre ellos.
3. La colección de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que incluye al menos cincuenta o al menos 100 compuestos de captura diferentes.
4. La colección de las reivindicaciones 1 - 3, en la que Q se selecciona para inmovilizar compuestos de captura en sitios direccionables sobre un soporte sólido.
5. Un soporte sólido, que comprende la colección de compuestos de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde los compuestos de captura de la colección se separan en sitios direccionables sobre el soporte.
6. La colección de la reivindicación 1, en la que los compuestos de captura componentes tienen la fórmula
308
7. La colección de la reivindicación 1, en la que:
\quad
Q se selecciona entre biotina, 6-His, BODIPY, un oligonucleótido, un péptido adhesivo, un ácido nucleico peptídico (PNA) y un péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
8. La colección de la reivindicación 1, en la que
\quad
Q es un oligonucleótido o análogo de oligonucleótido que incluye una porción monocatenaria de suficiente longitud "j" para formar un híbrido estable con una molécula de ácido nucleico monocatenaria complementaria de base o un análogo.
\vskip1.000000\baselineskip
9. La colección de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-8, en la que Q tiene la fórmula N^{1}_{s}-B_{r}N^{2}_{u}-, en la que:
\quad
N^{1}, B y N^{2} son oligonucleótidos o análogos de oligonucleótidos que comprenden los miembros s, i y u, respectivamente;
\quad
B es una región de permutaciones de secuencia que contiene al menos dos bases;
\quad
y la suma de s, i y u es al menos 5.
\vskip1.000000\baselineskip
10. La colección de la reivindicación 9, en la que la suma de s, i y u es de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50.
11. La colección de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en la que cada miembro de N^{1}, B y N^{2} se selecciona independientemente entre componentes básicos monoméricos de ácido desoxirribonucleico, ácido ribonucleico, ácido nucleico peptídico (PNA) y análogos de los mismos.
12. La colección de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-11, en la que Z es un grupo fotoescindible, escindible ácido, escindible alcalino, escindible de forma oxidativa o escindible de forma reductora.
13. La colección de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-12, en la que Z se escinde antes de o durante el análisis de la biomolécula.
14. La colección de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-13, en la que X se selecciona entre el grupo que consiste en un éster activo, un resto halo activo, un grupo funcional específico de cadena lateral de aminoácidos y un complejo de metal.
15. La colección de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-14, en la que X es un \alpha-halo éter, un grupo \alpha-halo carbonilo, maleimido, un complejo de oro, un complejo de mercurio, un epóxido o un isotiocianato.
16. La colección de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-14, en la que X es -C(=O)O-Ph-pNO_{2}, -C(=O)O-C_{6}F_{5}, -C(=O)-O-(N-succinimidilo), -OCH_{2}-I, -OCH_{2}-Br, -OCH_{2}-Cl, - C(O)CH_{2}I, -C(O)CH_{2}Br o -C(O)CH_{2}Cl.
17. La colección de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4 y 6-16, en la que los compuestos miembros de la colección comprenden un marcador modificador de masas.
18. La colección de la reivindicación 17, en la que el marcador modificador de masas se selecciona entre (i)-(vii) como se muestra a continuación:
(i)
el marcador modificador de masas tiene la fórmula -X^{1}R^{10-,} en la que:
\quad
X^{1} es un grupo divalente seleccionado entre -O-, -O-C(O)-(CH_{2})_{y}-C(O)O-, -NH-C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-(CH_{2})_{y}-C(O)O-, -NH-C(S)-NH-, -O-P(O-alquil)-O-, -O-SO_{2}-O-, -O-C(O)-CH_{2}-S-, -S-, -NH- y
180
\quad
y
\quad
R^{10} es un grupo divalente seleccionado entre -(CH_{2}CH_{2}O)_{z}-CH_{2}CH_{2}O-, -(CH_{2}CH_{2}O)_{2}-CH_{2}CH_{2}O-alquileno, alquileno, alquenileno, alquinileno, arileno, heteroarileno, -(CH_{2})_{z}-CH_{2}-O-, -(CH_{2})_{z}-CH_{2}-O-alquileno, -(CH_{2}CH_{2}NH)_{Z}-CH_{2}CH_{2}NH-, -CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}O-, -Si(R^{12})(R^{13})-, -CHF- y -CF_{2}-; donde y es un número entero de 1 a 20; z es un número entero de 0 a 200; y cada uno de R^{12} y R^{13} se selecciona independientemente entre alquilo, arilo y aralquilo; o
(ii)
el marcador modificador de masas es -S-S-;
(iii)
el marcador modificador de masas es -S-;
(iv)
el marcador modificador de masas es -(NH-(CH_{2})_{y}-NH-C(O)-(CH_{2})_{y}-C(O))_{z}-NH-(CH_{2})_{y}-NH-C(O)-(CH_{2})_{y}- C(O)O-, donde y y z se seleccionan como en (i);
(v)
el marcador modificador de masas es -(NH-(CH_{2})_{y}-C(O))_{z}-NH-(CH_{2})_{y}-C(O)O-, donde y y z se seleccionan como en (i);
(vi)
el marcador modificador de masas es -(NH-CH(R^{11})-C(O))_{z}-NH-CH(R^{11})-C(O)O-, donde R^{11} es la cadena lateral de un \alpha-aminoácido que se encuentra en la naturaleza y z se selecciona como en (i); o
(vii)
el marcador modificador de masas es -(O-(CH_{2})_{y}-C(O))_{z}-NH-(CH_{2})_{y}-C(O)O-, donde y y z se seleccionan como en (i).
\vskip1.000000\baselineskip
19. La colección de cualquiera de las reivindicaciones 14 y 6-18, que comprende adicionalmente biomoléculas unidas covalentemente al resto X de uno o más compuestos de captura en la colección.
20. La colección de la reivindicación 19, en la que las biomoléculas comprenden proteínas.
21. La colección de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-20, en la que los compuestos de captura comprenden adicionalmente un grupo de solubilidad W que influencia las propiedades de solubilidad del compuesto de captura.
22. La colección de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-21, en la que la función de selectividad Y se selecciona entre las indicadas en las Figuras 17a-17hhhh y/o la función de reactividad X se selecciona entre las indicadas en las Figuras 16a-b.
23. La colección de la reivindicación 1, en la que Y se selecciona entre un ligando de receptor, un sustrato enzimático, un inhibidor enzimático, un análogo de estado de transición, un péptido adhesivo, un péptido mimético y una estatina.
24. La colección de la reivindicación 1, en la que Y es un ligando peptídico seleccionado entre los ligandos peptídicos indicados en este documento como SEC ID Nº: 1 a SEC ID Nº: 149.
25. La colección de la reivindicación 1, en la que X es un grupo fotorreactivo.
26. La colección de la reivindicación 1, en la que cada compuesto de captura en la colección comprende el mismo resto X pero difiere en el resto Y.
27. La colección de la reivindicación 1, en la que las biomoléculas de captura comprenden proteínas.
28. Una composición, que comprende una colección de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 9-18, en la que cada Q es un oligonucleótido, y los compuestos de captura se hibridan con una pluralidad de oligonucleótidos o análogos de los mismos que son complementarios a cada Q.
29. La composición de la reivindicación 28, en la que los oligonucleótidos o análogos de los mismos que son complementarios a Q se inmovilizan sobre un soporte sólido como en una matriz.
30. Un método para el análisis de biomoléculas, que comprende:
a)
hacer reaccionar una composición de muestra que comprende una biomolécula con un colección de compuestos de captura de cualquiera de las reivindicaciones 1-27, para formar una primera mezcla de complejos compuesto de captura-biomolécula; y
b)
identificar o detectar biomoléculas unidas.
\newpage
31. El método de la reivindicación 30, en el que los compuestos de captura en la colección comprenden adicionalmente un grupo de solubilidad W que influencia las propiedades de solubilidad del compuesto de captura.
32. El método de la reivindicación 30 o la reivindicación 31, en el que las biomoléculas son proteínas.
33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-32, en el que:
\quad
los compuestos de captura están en una matriz direccionable; y
\quad
cada locus de la matriz contiene un compuesto de captura diferente.
\vskip1.000000\baselineskip
34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-32, en el que la identificación comprende análisis espectrométrico de masas de las biomoléculas unidas.
35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-34, en el que la identificación y la detección comprenden además análisis espectrométrico de masas, y el método comprende adicionalmente:
\quad
tratamiento químico o enzimático de los complejos biomolécula-compuesto de captura para retirar o escindir porciones de los mismos antes del análisis espectrométrico de masas.
\vskip1.000000\baselineskip
36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-35, en el que:
\quad
la identificación y la detección comprenden análisis espectrométrico de masas; y
\quad
las biomoléculas unidas a los compuestos de captura se tratan con una proteasa antes del análisis espectrométrico de masas.
\vskip1.000000\baselineskip
37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-36, en el que cada compuesto de captura en la colección comprende el mismo resto X pero difiere en el resto Y.
38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-37, en el que cada compuesto de captura en la colección comprende restos Y y Q diferentes.
39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-38, en el que cada compuesto de captura en la colección comprende restos X e Y diferentes.
40. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-39, en el que:
\quad
cada función de separación Q es un oligonucleótido que incluye una porción monocatenaria de longitud "j" para hibridarse con un oligonucleótido complementario, donde j es al menos 5 bases; y el método comprende además:
\quad
hibridar los compuestos de captura con un conjunto de oligonucleótidos complementarios, que se unen a un soporte sólido, donde la hibridación se realiza antes o después de la etapa de contacto, inmovilizando de esta manera los compuestos de captura o los complejos compuesto de captura-biomolécula sobre el soporte sólido.
\vskip1.000000\baselineskip
41. El método de la reivindicación 40, en el que los oligonucleótidos o análogos de oligonucleótidos monocatenarios que son complementarios al resto Q sobre los compuestos de captura se inmovilizan sobre un soporte sólido.
42. El método de la reivindicación 40 o la reivindicación 41, en el que los oligonucleótidos o análogos de oligonucleótidos monocatenarios que son complementarios al resto Q comprenden una matriz direccionable.
43. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-42, en el que la colección comprende al menos 10, 50, 100, 500 ó 1000 compuestos de captura diferentes.
44. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-43, en el que la etapa de contacto se realiza en un medio acuoso y las biomoléculas son hidrófilas.
45. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-43, en el que la etapa de contacto se realiza en un medio hidrófobo y las biomoléculas son hidrófobas.
46. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-45, en el que la identificación o la detección se realiza por análisis espectrométrico de masas de las biomoléculas unidas a compuestos de captura.
47. El método de la reivindicación 46, en el que el formato espectrométrico de masas es espectrometría de masas de desorción láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF).
\vskip1.000000\baselineskip
48. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-47, en el que:
\quad
la función de separación Q permite organizar los compuestos en una matriz sobre un soporte sólido; y
\quad
el método comprende adicionalmente organizar los compuestos de captura en una matriz sobre un soporte sólido antes, durante o después de la etapa de contacto, donde:
\quad
los complejos biomolécula-compuesto de captura resultantes están en puntos discretos sobre un soporte sólido.
\vskip1.000000\baselineskip
49. El método de la reivindicación 48, en el que la identificación y la detección de las biomoléculas unidas se realizan por análisis espectrométrico de masas, que comprende:
(i)
adición de matriz a los complejos biomolécula-compuesto de captura; y
(ii)
espectrometría de masas de desorción láser asistida por matriz punto por punto-tiempo de vuelo (MALDI-TOF).
\vskip1.000000\baselineskip
50. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-49, en el que el análisis espectrométrico de masas de las biomoléculas unidas comprende:
(i)
adición de matriz a las biomoléculas unidas a compuestos de captura; y
(ii)
espectrometría de masas de desorción láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) de las biomoléculas unidas a compuestos de captura.
\vskip1.000000\baselineskip
51. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-50, en el que la composición de muestra que comprende una biomolécula es un lisado celular.
52. El método de la reivindicación 51, en el que las células a partir de las cuales se produce el lisado están sincronizadas o congeladas en un estado metabólico.
53. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-52, en el que el análisis es espectrometría de masas de tiempo de vuelo ortogonal (O-TOF).
54. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-52, en el que el análisis es espectrometría de masas por electropulverización (ES).
55. El método de la reivindicación 30, en el que:
\quad
las biomoléculas son una proteína; y
\quad
la etapa de contacto se realiza en condiciones en las que las interacciones del resto Y de los compuestos de captura con proteína en la composición se controlan cinéticamente.
\vskip1.000000\baselineskip
56. Un método para separar confórmeros de proteínas, que comprende:
\quad
poner en contacto una composición de muestra que comprende una biomolécula con una colección de compuestos de captura de cualquiera de las reivindicaciones 1-27;
\quad
separar los miembros de la colección; e
\quad
identificar las proteínas unidas de la mezcla, por lo que cada confórmero tiene una especificidad de unión diferente para miembros de la colección
\vskip1.000000\baselineskip
57. El método de la reivindicación 56, en el que la identificación se realiza por espectrometría de masas.
58. El método de la reivindicación 56 o la reivindicación 57, en el que al menos un confórmero está asociado con una enfermedad.
59. Un método para reducir la diversidad de una mezcla compleja de biomoléculas, que comprende:
\quad
poner en contacto la mezcla con una colección de compuestos de captura de cualquiera de las reivindicaciones 1-27 para formar biomoléculas unidas a compuestos de captura; y después de la puesta en contacto,
\quad
separar las biomoléculas unidas a compuestos de captura.
\vskip1.000000\baselineskip
60. Un método para la identificación de biomoléculas específicas de fenotipo, que comprende:
\quad
células de separación de un sujeto individual de acuerdo con un fenotipo predeterminado para producir al menos dos conjuntos de células separados;
\quad
poner en contacto mezclas de biomoléculas de cada conjunto de células separadas con una colección de compuestos de captura de cualquiera de las reivindicaciones 1-27; y
\quad
comparar los patrones de unión de biomoléculas de cada conjunto unidas a compuestos de captura para identificar las biomoléculas que difieren para cada conjunto, identificando de esta manera biomoléculas específicas de fenotipo.
\vskip1.000000\baselineskip
61. El método de la reivindicación 60, en el que las células se sincronizan o congelan en un estado metabólico antes de separarse y/o después de separarse.
62. El método de la reivindicación 60 o la reivindicación 61, en el que las biomoléculas comprenden proteínas.
63. El método de cualquiera de las reivindicaciones 60-62, en el que las biomoléculas unidas se identifican por espectrometría de masas.
64. El método de cualquiera de las reivindicaciones 60-63, en el que los fenotipos son fenotipos de enfermedad y de salud.
65. El método de la reivindicación 64, en el que el fenotipo de enfermedad es un tumor y el fenotipo de salud no es un tumor.
66. El método de la reivindicación 30, en el que cada uno de los compuestos de captura tiene un primer marcador modificador de masas; comprendiendo el método adicionalmente:
\quad
antes de la etapa b), hacer reaccionar una segunda mezcla de biomoléculas con una segunda colección de compuestos de captura de cualquiera de las reivindicaciones 1-27, para formar una segunda mezcla de complejos compuesto de captura-biomolécula, donde los compuestos que comprende la segunda mezcla de complejos compuesto de captura-biomolécula tienen (i) ningún marcador modificador de masas; o (ii) un segundo marcador modificador de masas;
\quad
reunir la primera y segunda mezclas para producir una tercera mezcla de los mismos; y la identificación o detección se realizan por:
\quad
separación de los complejos compuesto de captura-biomolécula marcados de forma diferente en la tercera mezcla de acuerdo con el resto Q para producir una matriz de complejos separados; y
\quad
analizar los complejos en cada locus.
\vskip1.000000\baselineskip
67. El método de la reivindicación 66, en el que las biomoléculas son proteínas.
68. La colección de la reivindicación 1, en la que X se selecciona entre los grupos indicados en las Figuras 16a-b.
69. La colección de la reivindicación 1, en la que Y se selecciona entre los grupos indicados en las Figuras 17a-17hhhh.
70. La colección de la reivindicación 1, en la que X se selecciona entre el grupo que consiste en un éster activo, un resto halo activo, un grupo funcional específico de cadena lateral de aminoácidos y un complejo metálico.
71. La colección de la reivindicación 70, en la que X es
\quad
-C(=O)O-Ph-pNO_{2}, -C(=O)O-C_{6}F_{5}, -C(=O)-O-(N-succinimidilo), -OCH_{2}-I-OCH_{2}-Br, OCH_{2}-Cl, -C(O)CH_{2}I, -C(O) CH_{2}Br o -C(O)CH_{2}Cl.
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