ES2319858T3 - Receptor cpg (cpg-r) y procedimientos relacionados con el mismo. - Google Patents
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Abstract
Uso de un polipéptido como receptor de CpG, en el que el polipéptido comprende un dominio de homología con Toll y se une a oligonucleótidos con CpG.
Description
Receptor CpG (CpG-R) y
procedimientos relacionados con el mismo.
Esta solicitud reivindica beneficio de prioridad
a tenor de 35 U.S.C. \NAK119
\euroa la solicitud número de serie 60/163.157 presentada el 2 de noviembre de 1999 y la solicitud número de serie 60/167.389 presentada el 24 de noviembre de 1999.
La presente invención está relacionada, en
general, con respuestas inmunitarias y con la identificación de una
proteína y una vía se señalización de una respuesta inmunitaria y,
específicamente, con la identificación de un receptor de CpG
(CpG-R).
El sistema inmunológico innato de los mamíferos
reconoce y responde a características moleculares típicos de
organismos patógenos. Varias porciones del patógeno, tales como las
proteínas de superficie, componentes concretos de la pared celular
y ciertas secuencias nucleotídicas, pueden ser reconocidas y
desencadenar una variedad de respuestas inmunitarias. Desde hace
tiempo se sabe que las células portan diversos receptores y
proteínas unidas a la membrana que reconocen estos elementos
extraños y desencadenan la cascada conocida como la respuesta
inmunitaria. Se conocen dos amplias clasificaciones o tipos de
respuestas; humoral, o inmunidad mediada por anticuerpos; e
inmunidad mediada por células. Ciertos patógenos o afecciones pueden
controlarse con eficacia mediante, principalmente, una reacción
mediada por anticuerpos, mientras que otras afecciones o patógenos
requieren una respuesta celular enérgica para mediar una defensa del
huésped.
Los adyuvantes son compuestos que son capaces de
potenciar la respuesta inmunitaria innata. Los adyuvantes pueden
potenciar la inmunidad tanto humoral como celular. Para algunas
afecciones o enfermedades, tales como, por ejemplo, las causadas
por el virus de la inmunodeficiencia humana o el virus de la
hepatitis C, es particularmente deseable aumentar la respuesta
inmunitaria innata mediada por células mediante la administración de
un adyuvante.
Se ha encontrado que las secuencias
dinucleotídicas CG no metiladas, que se encuentran habitualmente en
el ADN bacteriano pero no en el ADN de mamíferos, estimulan el
sistema inmunitario innato (revisado en Lipford y col. Trends
Microbiol, 1998, 6, 496-500, Carson y col., J. Exp.
Med., 1997, 186, 1621-2 y Krieg y col., Trenes
Microbiol., 1998, 6, 23-7). La exposición a
oligonucleótidos o motivos CG no metilados en el ADN natural o en
oligonucleótidos sintéticos activa directamente las células
presentadoras de antígenos (CPA), las células dendríticas y los
macrófagos (Jakob y col., J.Immunol., 1998, 161,
3042-9, Sparwasser y col., Eur., J. Immunol, 1998,
28, 2045-54, Sparwasser y col., Eur., J. Immunol,
1997, 27, 1671-9, Stacey y col., J. Immunol., 1996,
157, 2116-22 y Jacob y col., Int. Archives Allergy
Immunol., 1999, 118, 457-461) y las células B (Krieg
y col., Nature, 1995, 374, 546-9). Las células NK y
T también se activan mediante la exposición a los oligonucleótidos
que contienen motivos CpG, aunque algunos de estos efectos pueden
estar mediados indirectamente por las citocinas producidas por
otros tipos de células (Bendings y col., Eur. J. Immunol., 1999, 29,
1209-18, Sun y col., J. Exp. Med., 1998, 188,
2335-42 y Ballas y col., J. Immunol., 1996, 157,
1840-5).
La inclusión de oligonucleótidos que contienen
motivos CpG como adyuvantes en vacunas experimentales mediante
incorporación directa en el ADN plasmídico o mediante
co-administración de oligonucleótidos CpG sintéticos
con antígenos proteicos proporciona títulos de anticuerpos
incrementados, especialmente del subtipo de IgG2a. También se ha
demostrado que los oligonucleótidos que contienen motivos CpG son
potentes estimuladores de la actividad citolítica de células T,
que es característica de la respuesta inmunitaria mediada por
células (revisado en Brazolot-Millan y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15553-8, Davis y
col., J. Immunol., 1998, 160, 870-6, Davis Mt.
Sinai J. Med., 1999, 66, 84-90 y McCluskie y col.,
J. Immunol. 1998, 161, 4463-6). La capacidad de los
oligonucleótidos que contienen motivos CpG para inducir la
expresión de citocinas Th1, especialmente
interleucina-12 (IL-12) e
interferón-\gamma (IFN-\gammaI
probablemente sea responsable del fuerte sesgo hacia Th1 de la
respuesta inmunitaria observada cuando se usan oligonucleótidos que
contienen motivos CpG para adyuvar diversos antígenos,
principalmente de la hepatitis B. Se cree que la inmunidad mediada
por células de tipo Th1 es necesaria para la protección contra
muchas vacunas diana actualmente en estudio, tal como el virus de
la inmunodeficiencia humana mencionada en lo que antecede. Los
oligonucleótidos que contienen motivos CpG pueden también tener
aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de infecciones
microbianas, como se ha demostrado que el tratamiento con
oligonucleótidos CpG confiere protección contra patógenos tales como
Listeria y Leishmania incluso cuando se administra sin antígeno
acompañante (Zimmermann y col., J. Immunol., 1998, 160, 362730,
Lipford y col., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 3420-6 y
Walkery col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96.
6970-6975). Además, el tratamiento con
oligonucleótidos CpG protege a las células B inmaduras de la
apoptosis. Otra actividad de los oligonucleótidos CpG es alguna
secuencia y mutilación específica en que el CG no metilado con
purinas flanqueantes en 5' y pirimidinas flanqueantes en 3' tienen
el mayor efecto. El pre-tratamiento con
oligonucleótidos CpG tiene un efecto protector en modelos de asma
alérgico e inducido por LPS (Schwartz, J. Immunol., 163, 224 y Sur.
y col., J. Immunol., 162, 6284) y puede reducir la producción in
vitro de IgE por parte de las células mononucleares de sangre
periférica humanas de pacientes atópicos.
El mecanismo por el cual los oligonucleótidos
CpG interacciona con los receptores celulares e inician la
señalización intracelular es desconocido. El ADN que contiene
motivos de CpG, en el contexto de oligómeros o ADN plasmídico se
capta a través de una vía endocítica y se acumula en los endosomas
(Hacer y col., EMBO J., 1998, 17, 6230-40, Yi y
col., J. Immunol., 1998, 161, 4493-7, Yi y col., J.
Immunol., 1998, 160. 4755-61 y McFarlane y col., J.
Immunol., 1998, 160, 1122-31). Esta captación no
parece ser específica de secuencia, ya que puede existir
competición con ADN sin motivos CpG (Hacker y col., ant.).
Existen algunas pruebas de que las respuestas a oligonucleótidos
que contienen motivos CpG pueden requerir captación celular (Krieg.
y col., 1995, ant.) y acidificación endosómica, dado que la
cloroquina y otros bloqueantes de la maduración de los endosomas
pueden inhibir las respuestas celulares y moleculares a los
oligonucleótidos que contienen motivos CpG. El mecanismo exacto de
esta inhibición no está resuelto, como lo está la localización
subcelular de cualquier proteína relacionada con el oligonucleótido
con CpG, o el receptor putativo de CpG.
Aunque el mecanismo por el cual las células
reconocen los oligonucleótidos que contienen motivos CpG todavía no
se ha descrito, se sabe que los oligonucleótidos con CpG activan
mútiples vías de señalización intracelular en macrófagos y células
B. Específicamente, las MAP quinasas activadas por estrés, JNK y
p38, y sus factores de transcripción diana, AP-1 y
ATF2, se fosforilan en respuesta al tratamiento con oligonucleótidos
con CpG (Hacker y col., EMBO J., 1998, 6230-40 y Yi
y col., J. Immunol., 1998, 161, 4493-7). La vía que
conduce a la translocación nuclear de NF-\kappa,
que implica una cascada de cinasas que conducen a la fosforilación
y degradación de subunidades inhibidoras, la I\kappaBs (véase
Zandi y col., Mol. Cell. Biol., 1999, 19, 4547-51),
también se activa mediante oligonucleótidos que contienen motivos
CpG (Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 1240-5, y
Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 4755-61).
Se sabe que otros agentes inmunoestimuladores
tienen efectos similares. Los expertos en la técnica saben que el
monofosforilo lípido A (MPL) induce una respuesta de linfocitos Th1
(Ultrich y col., en Monophosphoryl Lipid A as an Adjuvant in
Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman,
Eds., 1995, pág. 495-523). En macrófagos, las vías
MAPK y NF-\kappaB son activadas por otros agentes,
principalmente la endotoxina bacteriana, le lipopolisacárido (LPS).
El NF-\kappaB nuclear, a menudo en combinación con
otros factores de transcripción como AP-1, se
requiere para la inducción de la transcripción de muchos genes de
respuesta inmunitaria, incluidas las moléculas y citocinas
coestimuladoras (revisado en Baldwin, Annu. Rev. Immunol., 1996,
14, 649-83).
En ratones, las pruebas genéticas vinculan la
capacidad de respuesta inmunitaria a la endotoxina bacteriana con
un miembro de la familia de receptores Toll/IL-1, el
receptor de tipo Toll (TLR) 4. Los experimentos con TLR humanos
implican TLR3 y/o TLR4 en las respuestas a LPS (revisado en Qureshi
y col., Trenes un Genetics, 1999, 15, 291-294). Más
recientemente, también se ha demostrado que productos bacterianos
adicionales, incluidos el peptidoglicano y las lipoproteínas
micobacterianas, actúan a través de miembros de la familia del
receptor Toll (Yoshimura y col., J. Immunol., 1999, 163,
1-5, Brightbill y col., Science, 1999, 285,
732-736, Aliprantis y col., Science, 1999, 285,
736-739 y Hirschfeld y col., J. Immunol., 1999, 163,
2382-2386). Los receptores relacionados con Toll se
han conservado a lo largo de millones de años de evolución; en
insectos e incluso en plantas están asociados genéticamente con
respuestas a diversos patógenos, incluidas bacterias, hongos y al
menos un virus (revisado en Hoffmann y col., Science, 1999, 284,
1313-1318). No se sabe si los oligonucleótidos que
contienen motivos CpG actúan de forma similar a través de receptores
relacionados con Toll o su el receptor putativo de CpG podría
contener un dominio de homología con Toll (THD).
El documento WO 98/50547 describe ácidos
nucleicos que codifican nueve receptores humanos, designados
receptores de tipo tio DNAX 2-10 (DTLR
2-10), homólogos del receptor Toll de Drosophila y
el receptor de IL-1 humano.
Dada la potencial utilidad de estos
oligonucleótidos CpG como estimuladores de varias respuestas
inmunitarias, existe un considerable interés en el aislamiento,
caracterización y mecanismos de acciones de los
CpG-R y la vía de señalización. Por tanto, es un
objetivo de la invención caracterizar e identificar
CpG-R para diferenciarlo de otras proteínas o
receptores que puedan conducir a respuestas inmunitarias similares y
desarrollar procedimientos útiles que permitan el diseño de nuevos
ligandos de CpG-R que puedan conservar las proteínas
inmunoestimuladoras de los oligonucleótidos que contienen motivos
CpG, mientras que tienen propiedades farmacológicas más
deseables.
La presente invención se describe en las
reivindicaciones.
La figura 1A es un gráfico de barras que
representa la activación de NF-\kappa en
macrófagos RAW 264.7, en el que las células RAW 264.7 estaban
transfeccionadas con un gen indicador de luciferasa dirigido por
\kappaB y tratadas 24 horas después con interleucina 1
(IL-1; 20 ng/ml), MPL (1 \mug/ml), LPS (\mug/ml)
o un oligonucleótido fosforotioato con CpG (4 \muM) durante 6
horas.
La figura 1B es un gráfico que representa
activación de luciferasa \kappaB (\kappaB-Luc)
inducida por oligonucleótidos con CpG, en el que las células RAW
264.7 se transfeccionaron transitoriamente con un plásmido
indicador de luciferasa \kappaB y se trataron 24 horas más tarde
con la concentración indicada de oligonucleótido fosforotioato que
contiene el motivo CpG (0,25-8 \muM) o un
oligonucleótido control (4 \muM) durante 6 horas.
La figura 1C es un gráfico que representa la
cinética de la activación de la luciferasa \kappaB por los
oligonucleótidos con CpG o LPS, en la que las células RAW 264.7 se
transfeccionaron transitoriamente con \kappaB-Luc
y se trataron 24 horas después con un oligonucleótido que contiene
CpG (4 \muM, círculos vacíos) o LPS (1 \mug/ml; círculos
llenos).
El Gráfico de la Figura 2A muestra que un
mutante MyD88 dominante negativo (MyD88lpr) inhibe la
activación inducida por nucleótidos de la
\kappaB-Luciferasa, en el que las células RAW
264.7 se transfeccionaron con \kappaB-Luc (1
\mug) sola (barras negras) o con un plásmido que codifica
MyD88lpr en dos proporciones diferentes, 10:1 (barras
grises) o 1:1 (barras blancas).
La figura 2B es un gráfico de barras que
representa la activación de NF-\kappaB y la
inhibición por MyD88lpr es dependiente de secuencias CG no
metiladas, en las que macrófagos RAW 264.7 se transfeccionaron con
\kappaB-Luc
(1 \mug) sola (barras negras) o con \kappaB-Luc más MyD88lpr (barras blancas) (proporción con el plásmido de 1:1).
(1 \mug) sola (barras negras) o con \kappaB-Luc más MyD88lpr (barras blancas) (proporción con el plásmido de 1:1).
La figura 3A es un gráfico de barras que muestra
un ensayo representativo de luciferasa de células
NIH-3T3 transfeccionadas con plásmidos que
codifican constructos MyD88 dominantes negativos.
La figura 3B es un gráfico de barras que muestra
un ensayo representativo de luciferasa de células RAW 264.7
transfeccionadas con plásmidos que codifican constructos MyD88
dominantes negativos.
La figura 4 es un gráfico de barras que
representa la independencia un receptor de tipo Toll 4 (TLR4) para
las respuestas de APC al tratamiento con oligonucleótidos con CpG,
en el que se cultivaron células dendríticas derivadas de médula
ósea inmadura (BMDDC) de tipo salvaje (Balb/c; barras negras) y
ratones mutantes en TLR4 (C3H/HeJ; barras blancas) en
GM-CSF, como se ha descrito en lo que antecede
durante 6 días y después se trataron durante la noche con
oligonucleótidos con CpG (5 \muM), un oligonucleótido control (5
\mug) o LPS (1 \mug/ml) o se dejaron sin estimular.
La presente invención se basa en el sorprendente
descubrimiento de la identificación de un receptor de CpG
específico (CpG-R). Además se basa en el
sorprendente descubrimiento de que el CpG-R, o
complejo que contiene el mismo, contiene un THD. El descubrimiento
de la presencia de un THD dentro del receptor ha permitido analizar
la necesidad de receptores Toll conocidos para determinar las
respuestas de CpG y la posterior caracterización del
CpG-R. La presente invención está dirigida a, entre
otras cosas, un CpG-R que puede ser un polipéptido
sencillo, o un complejo de una pluralidad de polipéptidos, y
opcionalmente puede contener componentes adicionales tales como,
por ejemplo, polisacáridos, lípidos y similares. El
CpG-R, o complejo que lo contiene, comprende,
preferentemente, un THD
e interacciona con la proteína adaptadora MyD88. Además, el CpG-R puede unirse a oligonucleótidos con CpG.
e interacciona con la proteína adaptadora MyD88. Además, el CpG-R puede unirse a oligonucleótidos con CpG.
La práctica de la presente invención empleará, a
menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de
virología, inmunología, microbiología, biología molecular ý técnicas
de ADN recombinante dentro de la experiencia en la técnica. Tales
técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por
ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(2ª Edición, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I y II
(D. Glover, ed.); Methods In Enzimology (S. Colowick and N. Kaplan
eds., Academic Press, Inc.); Fundamental Virology, 2ª Edición, Vol.
I y II (B. N. Fields and D.M. Knipe, eds.); Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18 Edición (Easton, Pennsylvania: Mack
Publishing Company, 1990); Handbook of Experimental Immunology,
Vol. I-IV (D. M. Weir and C.C. Blackwell, eds.,
1986, Blackwell Scientific Publications): Handbook of Surface and
Colloidal Chemistry (Birdi, K. S., ed., CRC Press, 1997) y
Seymour/Charrares Polymer chemistry (4ª edición, Marcel Deber Inc.,
1996).
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "CpG-R" se refiere a un receptor de
CpG, que puede ser un polipéptido sencillo o un complejo de una
pluralidad de polipéptidos, y puede, opcionalmente, contener
componentes adicionales tales como, por ejemplo, polisacáridos,
lípidos y similares. El CpG-R puede ser una
proteína implicada en la cascada de señalización de CpG o puede ser
un receptor para la unión de oligonucleótidos con CpG.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "actividad" se refiere a cualquier actividad, o
cascada de actividades, que se asocia con la unión o señalización
del oligonucleótido que contiene CpG, tales como los descritos en
lo que antecede.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
con el término "anticuerpo" se pretende, sin limitaciones,
hacer referencia a anticuerpos completos intactos, fragmentos Fab y
fragmentos F(ab)_{2} de los mismos, y anticuerpos
quiméricos.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
la frase "oligonucleótido que comprende al menos un motivo
CpG" u "oligonucleótido con CpG" se refiere a un
polinucleótido, preferentemente un oligonucleótido que comprende al
menos una secuencia dinucleotídica CG no metilada. Los
oligonucleótidos que comprenden al menos un motivo CpG pueden
comprender múltiples motivos de CpG.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
la frase "motivo de CpG" se refiere a una porción
dinucleotídica no metilada de un oligonucleótido que comprende un
nucleótido de citosina seguido por un nucleótido de guanosina. El
lugar de citosina también se puede usar
5-metilcitosina.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "homólogo" se refiere a secuencias de nucleótidos o
aminoácidos caracterizadas por una identidad de secuencia de al
menos aproximadamente un 70%, más preferentemente de al menos
aproximadamente un 80%, más preferentemente de al menos
aproximadamente un 90% y más preferentemente de al menos
aproximadamente un 95% con la totalidad de la secuencia de
nucleótidos o de aminoácidos que codifican el
CpG-R, o con al menos una porción de
CpG-R. Entre las secuencias aminoacídicas homólogas
se incluyen las secuencias de aminoácidos que codifican
sustituciones conservadoras de aminoácidos. La identidad de la
secuencia se puede determinar mediante, por ejemplo, el programa
Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix,
Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI)
utilizando los parámetros por defecto, que utiliza el algoritmo de
Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2,
482-489).
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "aproximadamente" significa \pm 10% del valor que
modifica.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "modula" significa un incremento o disminución de
la cantidad o efecto de una actividad o proteína concreta.
En la presente memoria descriptiva se describen
moléculas de ácido nucleico que comprenden nuevas secuencias de
nucleótidos que codifican CpG. Las moléculas de ácido nucleico son,
preferentemente, ARN o ADN, pero pueden contener monómeros tanto de
ARN como de ADN o monómeros del ácido nucleico del péptido. Las
moléculas de ácido nucleico pueden ser monocatenarias o
bicatenarias. Los monómeros de las moléculas de ácido nucleico
pueden estar unidos a través de enlaces fosfodiéster convencionales
o enlaces modificados, tales como, por ejemplo, enlaces de
fosforotioato, y similares. Además, los restos de azúcar de los
monómeros pueden modificarse mediante, por ejemplo, la adición de
sustituciones en 2' que ayudan a conferir resistencia a nucleasa y/o
captación celular. La molécula de ácido nucleico también puede
comprender una secuencia de nucleótidos complementaria a al menos
una porción de la secuencia nucleotídica que codifica
CpG-R. Preferentemente, la molécula de ácido
nucleico comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a
toda la secuencia, pero puede comprender una secuencia de
nucleótidos complementaria a una porción de toda la secuencia. La
molécula de ácido nucleico también puede comprender una secuencia
de nucleótidos homóloga a la secuencia de nucleótidos que codifica
el CpG-R, y puede tener una homología de al menos
aproximadamente un 70%, determinada como se ha mencionado en lo que
antecede, más preferentemente una homología de al menos
aproximadamente un 80%, más preferentemente una homología de al
menos aproximadamente un 90% y más preferentemente una homología de
al menos aproximadamente un 95% con la totalidad de la secuencia
que codifica CpG-R o con cualquier porción de la
misma.
Una amplia variedad de clonación alternativa y
de metodologías de amplificación in vitro son bien conocidas
para los expertos en la técnica. Ejemplos de estas técnicas se
encuentran en, por ejemplo. Berger y col., Guide to Molecular
Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press. Inc.,
San Diego, CA (Berger).
En la presente memoria descriptiva se usan
vectores para amplificar ADN o ARN codificador de
CpG-R con el fin de expresar ADN que codifica el
CpG-R. Entre los vectores preferidos se incluyen
plásmidos, fagos, cósmicos, epitomas, partículas virales o virus, y
Fragmentos de AFN integrables. Entre las partículas virales
preferidas se incluyen adenovirus, parvovirus, herpesvirus,
poxvirus, virus adenoasociados, Virus Semliki Forest, virus de
vaccinia y retrovirus. Entre los virus de expresión preferidos se
incluyen pcDNA3 (Invitrogen) y pSVL (Pharmacia Biotech), vectores
pGEM (Promega), vectores Pproex (LTI, Bethesda, MD), vectores
Bluescript (Stratagene), vectores pQE (Qiagen), pSE420 (Invitrogen)
y Pyes2 (Invitrogen).
Los vectores de expresión preferidos son
constructos de ADN replicables en los que una secuencia de ADN que
codifica CpG-R está operablemente conectada a
secuencias control adecuadas capaces de efectuar la expresión de
CpG-R en una célula u organismo huésped adecuado.
Las regiones de ADN están operablemente conectadas cuando están
colocados funcionalmente entre sí. Entre las secuencias control se
incluyen un promotor, un operador, una secuencia de unión al
ribosoma y secuencias de terminación de la
transcripción/traducción.
Los vectores preferidos contienen,
preferentemente, un promotor que es reconocido por el organismo
huésped. Las secuencias promotoras de la presente invención pueden
ser procarióticas, eucarióticas o víricas. Entre los ejemplos de
secuencias procarióticas adecuadas se incluyen promotores P_{R} y
P_{L} del bacteriófago lambda (The bacteriophage Lambda, Hershey,
A. D., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1973)
y Lambda II, Hendrix, R. W. Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold
Spring Harbor, NY (1980); los promotores trp, recA, del shock
térmico y lacZ de E. coli y el promotor temprano de SV40
(Benoist y col., Nature, 1981, 290, 304-310. Entre
los promotores adicionales se incluyen el virus del tumor mamario de
ratón, la repetición del extremo largo del virus de la
inmunodeficiencia humana, el virus maloney, el promotor temprano
inmediato del citomegalovirus, el virus de Epstein Barr, el virus
del sarcoma de rous, actina humana, miosina humana, hemoglobina
humana, creatina de músculo humano y metalotioneína humana. Además,
los vectores de expresión adecuados pueden incluir un marcador que
permita la selección de las células huésped transformadas. Los
vectores de expresión se pueden preparan mediante metodología
estándar.
Entre las células huésped para la expresión de
polipéptidos de la invención se incluyen procariotas, levaduras y
eucariotas. Entre las células procariotas adecuadas se incluyen
bacterias de los géneros Escherichia coli, Bacillus, Salmonella,
Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. Entre las
células eucarióticas adecuadas se incluyen células de insecto,
células HeLa, células de ovario de hámster chino (células CHO),
células de riñón de mono verde africano (células COS) y
fibroblastos 3T3 murinos. Entre las células de levadura adecuadas
se incluyen los géneros Saccharomyces, Pichia y
Kluveromyces. Los polipéptidos de la invención también se
pueden expresar usando un sistema de expresión en baculovirus
(Luckow y col., Bio/Technology, 1988, 6, 47, Baculovirus Expresión
Vectors: A Laboratory Manual, O'Rielly y col., (Eds.), W. H. Freeman
and Company, Nueva York, 1992 y la patente de EE.UU. Nº 4.879.236.
Además, el sistema de expresión completo en baculovirus MAXBACJ
(Invitrogen) puede, por ejemplo, usarse para la producción en
células de insecto. La propagación de tales células en un cultivo
celular es un procedimiento de rutina como se describe en, por
ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, eds.
(1973).
Un aspecto de la presente invención está
dirigido al uso de un polipéptido aislado codificado por una
molécula de ácido nucleico descrita en lo que antecede como un
receptor de CpG. En formas de realización preferidas de la
invención, el polipéptido aislado comprende una secuencia de
aminoácidos que codifica CpG-R. Como alternativa,
el polipéptido es un fragmento del polipéptido que codifica
CpG-r. Como alternativa, el polipéptido comprende
una secuencia de aminoácidos homóloga al CpG-R o un
fragmento del mismo. Un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene una identidad u homología de secuencia de al
menos un 70%, determinado como se ha mencionado en lo que antecede,
una identidad u homología de secuencia de al menos aproximadamente
un 80%, preferentemente una identidad u homología de secuencia de
aproximadamente un 90%, más preferentemente una identidad u
homología de secuencia de aproximadamente un 95% y más
preferentemente una identidad u homología de secuencia de
aproximadamente un 98% con el CpG-R, se contempla
como incluida en la presente invención. Un polipéptido homólogo
preferido comprende al menos una sustitución conservadora de
aminoácidos en comparación con el CpG-R nativo.
Otros polipéptidos homólogos preferidos comprenden dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o hasta diez sustituciones
de aminoácidos conservadoras en comparación con el
CpG-R nativo. Los polipéptidos se pueden expresar
en células huésped como proteínas de fusión que pueden incluir
regiones de proteínas heterólogas. Los polipéptidos de la invención
también pueden incluir regiones de la misma proteína pero que
difieren del polipéptido natural en la secuencia. Además, un
polipéptido homólogo a CpG-R comprende los
polipéptidos que tienen una homología funcional de al menos
aproximadamente un 70%, una homología funcional de al menos
aproximadamente un 80%, preferentemente una homología funcional de
aproximadamente un 90%, más preferentemente una homología funcional
de aproximadamente un 95%, más preferentemente una homología
funcional de aproximadamente un 98% en comparación con
CpG-R. Por tanto, debe entenderse que la presente
invención incluye proteínas homólogas a, y que tienen esencialmente
al menos una propiedad biológica (homología funcional) que es
sustancialmente similar a una propiedad biológica de
CpG-R.
Los polipéptidos de la invención que codifican
CpG-R se pueden aislar mediante, por ejemplo
detección selectiva de bibliotecas de expresión recombinante o
bases de datos de secuencia, o similares, para detectar la capacidad
de fijar oligonucleótidos con CpG, para comprender un dominio THD y
para detectar la capacidad para interaccionar con la proteína
adaptadora MyD88. La proteína adaptadora MyD88 se requiere para la
señalización desde los receptores para productos, tales como
lipopolisacáridos y lipoproteínas, así como para
interleucina-1. Los polipéptidos de la presente
invención se proporcionan, preferentemente, en forma asilada, están,
preferentemente, sustancialmente purificados y más preferentemente
están purificados hasta homogeneidad. Preferentemente, las células
huésped se lisan y el polipéptido se recupera del lisado de las
células huésped. Como alternativa, el polipéptido se recupera
mediante purificación del medio de cultivo celular de las células
huésped, preferentemente sin lisar la célula huésped. Los
polipéptidos se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de
células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos,
incluida la precipitación en sulfato amónico o etanol,
cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en
hidroxilapatito y cromatografía en lectina.
Los polipéptidos de la invención se pueden usar
para generar anticuerpos contra los mismos y usar para detectar
compuestos que modulen la actividad de CpG-R u
oligonucleótidos con CpG. Preferentemente, el anticuerpo se une a
un epítopo con CpG-R. Los anticuerpos pueden ser
monoclonales o policlonales. Los hibridomas que producen
anticuerpos que se unen a los polipéptidos de la invención, y los
propios anticuerpos, son útiles en el aislamiento y purificación de
los polipéptidos. Además, los anticuerpos pueden ser inhibidores
específicos de la actividad de CpG-R- Los
anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos de la
invención se pueden usar para purificar la proteína de fuentes
naturales o a través de tecnología recombinante usando técnicas bien
conocidas y materiales de partida de fácil disponibilidad. Los
expertos en la técnica conocen procedimientos para preparar
anticuerpos. Para las técnicas de preparación de anticuerpos
monoclonales véase, por ejemplo, Stiles y col. (eds.), Basic and
Clinical Immunology (4ª ed.), Lange Medical Publications, Los Altos,
CA. La producción de anticuerpos, fragmentos Fab y fragmentos
F(ab)_{2} se describen en, por ejemplo, Harlow, E. y
D. Lane (1988) ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Otro aspecto de la presente invención está
dirigido a procedimientos de identificar compuestos que se unen a
moléculas de ácido nucleico o a polipéptidos que codifican
CpG-R, que comprende poner en contacto el
CpG-R, o una molécula de ácido nucleico que lo
contenga, con un compuesto, y determinar si el compuesto se une a
CpG-R, o una molécula de ácido nucleico que lo
codifique. La unión puede determinarse mediante ensayos de unión
que son bien conocidos para los expertos en la técnica, incluidos,
entre otros, ensayos de retardo en geles, transferencias de tipo
Western, ensayo de competición por radiomarcaje,
co-fraccionamiento mediante cromatografía,
co-precipitación, ELISA y similares, que se
describen en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular biology,
1999, John Wiley and Sons, NY. El polipéptido de
CpG-R o la molécula de ácido nucleico usada en tal
prueba puede estar libre en solución, fijado a dicho soporte sólido,
fijado a una superficie celular o localizado dentro de la
célula.
Otro aspecto de la presente invención está
dirigido a procedimientos de identificación de compuestos que
modulan la actividad de señalización de CpG-R, que
comprende poner en contacto el CpG-R con un
compuesto y determinar si el compuesto modifica la actividad de
CpG-R. La actividad en presencia del compuesto
problema se mide y compara con la actividad en ausencia del
compuesto problema. Cuando la actividad de la muestra que contiene
el compuesto problema es mayor que la actividad en la muestra que
carece del compuesto problema, el compuesto tendrá mayor actividad.
Cuando la actividad de la muestra que contiene el compuesto problema
es menor que la actividad en la muestra que carece del compuesto
problema, el compuesto tendrá actividad inhibida. El
CpG-R usado en tal prueba puede estar libre en
solución en presencia de sustratos adecuados, fijado en una
superficie celular o localizado dentro de una célula.
Los compuestos que se unen y/o modulan el
CpG-R tienen utilidad en, por ejemplo, adyuvantes de
vacunas que estimulan las respuestas inmunitarias mediadas por
células, antibacterianos (p. ej., protección de la infección por
Listeria), inmunoterapia tumoral, tratamiento de la alergia (p. ej.,
supresión de IgE en PBMC humanos, pasando de Th2 a Th1) y como
agentes antiinflamatorios (p. ej., para usar en fibrosis quística,
sepsis, enfermedad cardíaca, clamidia, enfermedad intestinal
inflamatoria, artritis y esclerosis múltiple).
La invención además se ilustra a través de los
ejemplos siguientes, que están destinados para aclarar la invención.
Los ejemplos anteriores están destinados a ilustrar la invención y
no deben interpretarse como limitantes de la invención de ningún
modo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se recogió médula ósea de ratones hembra de
6-12 semanas de edad de varios genotipos (C57B1/6,
Balb/c; Charles River, o C3H/HeJ, Jackson Labs.). Las células de
médula ósea se usaron frescas o se congelaron en suero bovino fetal
(FCS: Summit) que contiene 10% de dimetilsulfóxido y se almacenaron
a 80ºC. Los macrófagos de médula ósea (MOMO) se prepararon tal y
como se describe en Current Protocols in Immunology, supra.
Brevemente, las células de médula ósea frescas o congeladas se
cultivaron en RPMI, 10% de suero bovino fetal (FCS) inactivado con
calor
(30 minutos a 56ºC), L-glutamina 2 mM, estreptomicina 100 \mug/ml, 100 unidades/ml de penicilina, \beta-mercaptoetanol 50 \muM y 100 U/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF; R y D Systems). Tras 24 horas, las células no adherentes se retiraron a una nueva placa y el cultivo continuó durante 7 días para producir una monocapa de macrófagos. Las BMDDC no adherentes se produjeron mediante cultivo en el mismo medio suplementado con GM-CSF (200 U/ml; Preprotech) en lugar de M-CSF. La línea de células macrófagas de ratón RAW 264.7 (originalmente derivada de un ratón Balb/c) se obtuvo de la Colección Americana de cultivos Tipo (ATCC). Las células RAW 264.7 se cultivan en DMEM con 10% de FCS inactivado con calor, L-glutamina, estreptomicina, penicilina y piruvato sódico 1 \muM.
(30 minutos a 56ºC), L-glutamina 2 mM, estreptomicina 100 \mug/ml, 100 unidades/ml de penicilina, \beta-mercaptoetanol 50 \muM y 100 U/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF; R y D Systems). Tras 24 horas, las células no adherentes se retiraron a una nueva placa y el cultivo continuó durante 7 días para producir una monocapa de macrófagos. Las BMDDC no adherentes se produjeron mediante cultivo en el mismo medio suplementado con GM-CSF (200 U/ml; Preprotech) en lugar de M-CSF. La línea de células macrófagas de ratón RAW 264.7 (originalmente derivada de un ratón Balb/c) se obtuvo de la Colección Americana de cultivos Tipo (ATCC). Las células RAW 264.7 se cultivan en DMEM con 10% de FCS inactivado con calor, L-glutamina, estreptomicina, penicilina y piruvato sódico 1 \muM.
Los cultivos celulares se trataron como se ha
indicado con los reactivos siguientes; K235 E. coli LPS, purificados
mediante filtración en gel (Sigma), monofosforilo lípido A de S.
minerota R595 (MPL; Riba Immunochem Research, Inc.), sonicados 10
minutos antes de la adición. Los oligonucleótidos con estructuras de
fosforotioato se sintetizaron mediante Oligos Etc (Wilsonville,
OR); secuencia de oligonucleótidos con CpG, tccatgacgttcctgacgtt
(SEC ID Nº 1); oligonucleótido control no-CpG
tccaggacttctctcaggtt (SEC ID Nº 2). También se usaron
interleucina-1\beta recombinante de ratón
(IL-1) (Endogen) e interleucina-18
(IL-18) (Biosource) para estimular las células
RAW264.7 en algunos experimentos. Otros oligonucleótidos con CpG
que se pueden usar en la presente invención incluyen, entre otros,
oligonucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos tales
como, por ejemplo, tccatgacgttcctgacgtt (SEC ID Nº 3),
ataatcgacgttcaagcaag (SEC ID Nº 4), ggggtcaacgttgagggggg (SEC ID Nº
5), tctcccagcgtgcgccat (SEC ID Nº 6), gagaacgctcgaccttcgat (SEC ID
Nº 7), tccatgtcgttcctgatgct (SEC ID Nº 8), tccatgacgttcctgatgct
(SEC ID Nº 9), gctagacgttagcgt (SEC ID Nº 10), atcgactctcgagcgttctc
(SEC ID Nº 11), gaaccttccatgctgttccg (SEC ID Nº 12),
gctagatgt
tagcgt (SEC ID Nº 13), tcaacgtt (SEC ID Nº 14), gcaacgtt (SEC ID Nº 15), tcgacgtc (SEC ID Nº 16), tcagcgct (SEC ID Nº 17), tcaacgct (SEC ID Nº 18), tcatcgat (SEC ID Nº 19), tcttcgaa (SEC ID Nº 20), tgactgtgaacgttcgagatga (SEC ID Nº 21), tgactgtgaacgttagcgatga (SEC ID Nº 22), tgactgtgaacgttagagcgga (SEC ID Nº 23), gttgcgcaacgttgtgccat (SEC ID Nº 24), atggcaacaacgttgcgcaaac (SEC ID Nº 25), cattggaaaacgttcttcgggg (SEC ID Nº 26), ccccgaagaacgttttccaatg (SEC ID Nº 27), attgacgtcaat (SEC ID Nº 28), ctttccattgacgtcaatgggt (SEC ID Nº 29) y tccatacgttcctgacgtt (SEC ID Nº 30).
tagcgt (SEC ID Nº 13), tcaacgtt (SEC ID Nº 14), gcaacgtt (SEC ID Nº 15), tcgacgtc (SEC ID Nº 16), tcagcgct (SEC ID Nº 17), tcaacgct (SEC ID Nº 18), tcatcgat (SEC ID Nº 19), tcttcgaa (SEC ID Nº 20), tgactgtgaacgttcgagatga (SEC ID Nº 21), tgactgtgaacgttagcgatga (SEC ID Nº 22), tgactgtgaacgttagagcgga (SEC ID Nº 23), gttgcgcaacgttgtgccat (SEC ID Nº 24), atggcaacaacgttgcgcaaac (SEC ID Nº 25), cattggaaaacgttcttcgggg (SEC ID Nº 26), ccccgaagaacgttttccaatg (SEC ID Nº 27), attgacgtcaat (SEC ID Nº 28), ctttccattgacgtcaatgggt (SEC ID Nº 29) y tccatacgttcctgacgtt (SEC ID Nº 30).
Tras la estimulación, los MOMO o las células RAW
264.7 se lisaron en 1% de Triton X-100, Tris 50
mM,
EDTA 62,5 mM (pH 8,0) con un cóctel de inhibidor de proteasa J completo (Boehringer Mannheim) (tampón de lisis Triton). Los lisados se hirvieron e tampón reductor de muestras, se separaron en geles de poliacrilamida 10% usando el sistema de electroforesis NuPAGEJ bis-tris (Novex). Las membranas de nitrocelulosa se sondaron con antibióticos contra I\kappaB-\alpha, I\kappaB-\alpha fosforilado (New England BioLabs) o anti-IL-18 (Santa Cruz Biotechnology) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se visualizaron con una quimioluminiscencia potenciada (Amersham). Ensayo con \kappaB-Luc.
EDTA 62,5 mM (pH 8,0) con un cóctel de inhibidor de proteasa J completo (Boehringer Mannheim) (tampón de lisis Triton). Los lisados se hirvieron e tampón reductor de muestras, se separaron en geles de poliacrilamida 10% usando el sistema de electroforesis NuPAGEJ bis-tris (Novex). Las membranas de nitrocelulosa se sondaron con antibióticos contra I\kappaB-\alpha, I\kappaB-\alpha fosforilado (New England BioLabs) o anti-IL-18 (Santa Cruz Biotechnology) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se visualizaron con una quimioluminiscencia potenciada (Amersham). Ensayo con \kappaB-Luc.
Las células RAW 264.7 se sembraron en placas de
6 pocillos (Corning) a una densidad de 3 x 10^{5} células por
pocillo, 24 horas antes de la transfección. Los plásmidos usados en
la transfección fueron
pNF-\kappaB-Luc (Clontech) y
pCR3.V64-Met-Flag-MyD88lpr
(amablemente proporcionado por surgen Tschopp; descrito en (Burns y
col., J. biol. Chem., 1998, 273, 12203-9). La
concentración total de ADN plasmídico se normalizó en toso los
pocillos mediante la adición del vector vacío (pCMVKm2, Chiron). Las
células se transfeccionaron con concentraciones indicadas de ADN en
Opti-MEM I (Gibco BRL) con 10 ml de LipofectAMINA
(Gibco BRL) por pocillo de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Las células se incubaron con la mezcla de transfección 3
horas a 37ºC, después, el medio de cultivo se sustituyó y las
células se dejaron recuperar durante la noche. Al día siguiente, las
células transfeccionadas se trataron en medio de cultivo a 37ºC, 5%
de CO_{2}, con oligonucleótidos fosforotioato, MPL, LPS o
citocinas a las concentraciones y los tiempos indicados. Las células
se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS)
fría y se lisaron con tampón de lisis indicador J (Promega). La
actividad luciferasa en los sobrenadantes del lisado se determinó
usando placas de Microlite 2 (Dynex) y un luminómetro ML 3000
(Dynatech), todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para la detección de la expresión de
FLAG-MyD88lpr, el precipitado insoluble de
las células RAW 264.7 transfeccionadas se resuspendió en tampón de
lisis Triton y se sonicó 10 minutos antes de la adición de tampón de
muestra y de ebullición. Tras la separación y transferencia a
nitrocelulosa, las membranas se sometieron a inmunotransferencia
usando anticuerpo FLAG M2 (Sigma).
Células BMDDC se trataron durante la noche con
adyuvantes según lo indicado, se lavaron, se resuspendieron en
PBS/FBS 2% frío con FcBlock (0,25 \mug/10^{6} células;
Pharmingen) y anticuerpos conjugados con FITC y con PE (1
\mug/10^{6} células) se añadieron 5 minutos después. Las células
se incubaron con anticuerpos en hielo 30 minutos, se lavaron y se
analizaron mediante citometría de flujo en un FACScan
(Becton-Dickinson). Sólo las células de los
cultivos de BMDDC fueron positivas para CD11c y al tener propiedades
de dispersión directa y lateral de células vivas se incluyeron en
el análisis. Los cambios en la expresión de CD86 se evaluaron sobre
la base de la fluorescencia media geométrica de la tinción de
CD86-FITC de las células CD11c vivas tratadas con
adyuvantes normalizan a la fluorescencia CD86-FITC
media geométrica de los cultivos de BMDCC sin tratar.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se compararon varias respuestas bioquímicas de
las células MOMO y células dendríticas de ratón y la línea de
células macrófagos de ratón RAW 264.7 a los oligonucleótidos que
contienen o carecen de motivos CpG. Como modelo de los efectos de
los motivos CpG dentro de los oligonucleótidos se usó un
oligonucleótido denominado 1826 (Chu y col., J. Exp. Med., 1997,
186, 1623-31), cuya actividad en ratones se ha
notificado extensamente en la literatura (Bachmaier y col.,
Science, 1999, 283, 1335-9). Los oligonucleótidos
con CpG y control eran, cada uno, icosámeros sintetizados con una
estructura de fosforotioato, que potencia la estabilidad del ADN
(Agrawal y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88,
7595-9).
Los macrófagos se diferenciaron de las células
de médula ósea de ratones C57B1/6 como se describe en el Ejemplo 1
y después se transfirieron a un medio bajo en suero carente de ;-CSF
durante 4 horas. Los lisados de prepararon a partir de células
tratadas durante 30 minutos con medio solo, un oligonucleótido con
CpG modificado con fosforotioato (1 \muM), un oligonucleótido
control sin secuencias CG (1 \muM) o MPL (100 ng/ml) y se realizó
la inmunotransferencia con un anticuerpo que reconoce ERK1 y ERK2
fosforilados. Los macrófagos RAW 264.7 se trataron de un modo
similar durante 15 minutos junto con un tratamiento adicional con
LSP (100 ng/ml) se sometieron a inmunotransferencia para ERK1 y
ERK2 fosforiladas. La inmunotransferencia de extractos de células
enteras de las CPA derivadas de médula ósea o células RAW 264.7
demostraron activación de múltiples vías de proteína cinasa
activada por mitógeno (MAPK), incluidas ERK1/2, JNK y p38, por los
oligonucleótidos con CpG. La fosforilación de ERK, JNK y/o el
sustrato de JNK c-jun y del sustrato de p38
MAPK ATF2 se observó en los tres tipos celulares en la hora
posterior a la estimulación con el oligonucleótido con CpG pero no
en las secuencias control que carecen de CpG (datos no mostrados).
Estos resultados indican una rápida activación de las vías de JNK y
p38 por los oligonucleótidos con CpG. El resultado positivo para la
activación de ERK1/2 MAPK en células RAE 264.7 y MOMO contrasta con
las observaciones en otra línea de células macrófagos de ratón,
J774, donde la fosforilación de ERK no se detectó en células
tratadas con oligonucleótidos con CpG.
El estado de la vía NF-\kappaB
en MOMO y células RAW 264.7 tratadas con un panel de adyuvantes,
incluidos los oligonucleótidos con CpG y control, también se
analizaron. Las células MOMO se trataron durante 15, horas con LPS
(1 \mug/ml), MPL (1 \mug/ml), un oligonucleótido con CpG
modificado con fosforotioato (4 \muM) o un oligonucleótido
fosforotioato control (sin CpG; 4 \muM). Se prepararon lisados de
células enteras y se sometieron a inmunotransferencia para detectar
I\kappaB\alpha, como se ha descrito en lo que antecede. Se
observó degradación de la proteína inhibidora de
NF-\kappaB I\kappaB\alpha en 1,5 horas en
células MOMO tratadas con LPS, MPL o el oligonucleótido con CpG,
pero no con el oligonucleótido control (datos no mostrados).
Los lisados también se prepararon a partir de
células RAW 264.7 no tratadas o células tratadas con un
oligonucleótido fosforotioato con CpG (4 \muM) durante 5, 10, 20
y 60 minutos, asó como un oligonucleótido control que carece de
motivos CpG durante 60 minutos. A continuación, los lisados se
resolvieron mediante electroforesis y se sometieron a
inmunotransferencia con antisueros frente a I\kappaB\alpha
fosforilado y a I\kappaB\alpha total. La fosforilación y
degradación de I\kappaB\alpha en células RAW 264.7 mostraron
activación específica similar por un oligonucleótido con CpG. Esta
activación se detectó a nivel de la fosforilación de
I\kappaB\alpha en 10 minutos desde la adición del
oligonucleótido con CpG y la degradación de I\kappaB\alpha fue
notable a los 20 minutos. Aunque I\kappaB\alpha se resintetizó
en células RAW 264.7 tratadas con oligonucleótido con CpG en una
hora, mucho del I\kappaB\alpha se fosforiló, lo que sugiere una
diana continuada para la degradación rápida (datos no
mostrados).
Para evaluar directamente la transcripción
dependiente de \kappaB inducida por oligonucleótido con CpG o
tratamiento con MPL, los macrófagos RAW 264.7 se transfeccionaron
con un plásmido indicador inducible con
NF-\kappab que codifica la luciferasa bajo el
control de múltiples copias del potenciador de la cadena ligera
kappa (\kappaB-Luc) y al día siguiente se trataron
con adyuvantes o citocinas. En particular, las células RAW 264.7 se
transfeccionaron con un gen indicador de luciferasa dirigido por
\kappaB y se trataron 24 horas más tarde con IL-1
(20 ng/ml), MPL (1 \mug/ml), LPS (1 \mug/ml) o un
oligonucleótido fosforotioato con CpG (4 \muM) durante 6 horas.
La actividad luciferasa en los lisados celulares se cuantificó
mediante luminometría y los resultados se normalizaron hasta la
señal de luciferasa en células transfeccionadas sin tratar. Como se
muestra en la Figura 1A, la adición del oligonucleótido con CpG a
las células RAW 264.7 indujo expresión de luciferasa dependiente de
\kappab hasta un nivel similar al inducido por MPL o LPS. La
activación del gen indicador \kappaB por el oligonucleótido con
CpG fue ligeramente más débil que la observada en respuesta a MPL o
LPS, Ambos potentes activadores de NF-\kappaB en
macrófagos. La IL-1 fue un mal activador de
\kappaB-Luc en células RAW 264.7 (Figura 1A),
como también lo fue la IL-8 (datos no
mostrados).
Los efectos del oligonucleótido con CpG sobre la
expresión de luciferasa dependiente de \kappaB dependían de la
dosis y del tiempo (véanse las Figuras 1B y 1C). Con respecto a la
figura 1B, las células RAW 264.7 transfeccionadas transitoriamente
con un plásmido indicador de luciferasa-\kappaB se
trataron 24 horas después con concentraciones de oligonucleótido
fosforotioato con CpG variables de 0,25-8 \muM o
un oligonucleótido control (4 \muM) durante 6 horas. La
activación se detectó a concentraciones de oligonucleótido con CpG
tan bajas como de 0,25 \muM (Figura 1B), pero no a la
concentración más baja analizada (0,05 \muM) (datos no
mostrados). Los datos mostrados en la figura 1B son la actividad
media de luciferasa en los lisados de pocillos por duplicado
normalizados hasta los niveles de luciferasa en lisados de pocillos
transfeccionados sin tratar en la misma placa de cultivo tisular de
6 pocillos. La activación del gen indicador por el tratamiento con
oligonucleótido con CpG fue máxima a 8 \muM (Figura 1B) y no se
potenció más a una dosis de 10 \muM (datos no mostrados). Con
respecto a la Figura 1C, las células RAW 264.7 transfeccionadas
transitoriamente con \kappaB-Luc y se trataron 24
horas más tarde con un oligonucleótido que contiene CpG (4 \muM;
círculos vacíos) o LPS (1 \mug/ml; círculos llenos). Los
resultados mostrados en la Figura 1C son la media de los pocillos
duplicados normalizados a los pocillos transfeccionados sin tratar.
La exposición de células RAW 264.7 transfeccionadas con
\kappaB-Luc a una concentración similar del
oligonucleótido control que carece de los motivos CpG no indujo un
incremento de la expresión de luciferasa (Figuras 1B y 1C). La
expresión de luciferasa dependiente de \kappaB en macrófagos RAW
264.7 mostró una cinética similar en las células tratadas con un
oligonucleótido con CpG o con LSP (Figura 1C); ambos tratamientos
indujeron una respuesta rápida (incremento mayor a dos veces en 2
horas) que alcanzó una meseta a las 4-6 horas.
Estos resultados demuestran que la activación de
la vía NF-\kappaB por oligonucleótidos con CpG en
células RAW 264.7 es específica, rápida y dependiente de la dosis.
Un efecto indirecto de los oligonucleótidos con CpG mediado por
citocinas es improbable a la luz de la cinética muy rápida de la
señalización. La adición de sobrenadantes de células RAW 264.7
tratadas con oligonucleótido con CpG a macrófagos RAW 264.7
transfeccionados con \kappaB-Luc indujo poca
expresión de luciferasa (menos de dos veces a 4 horas), lo que
confirma que los motivos CpG tienen un efecto directo sobre la
transcripción de \kappaB-Luc-.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
A la luz del papel de los receptores Toll en
respuesta a una variedad de estructuras derivadas de bacterias,
incluidos LPS, peptidoglucano y lipoproteínas, se cree que un
receptor relacionado con Toll está implicado en la señalización en
respuesta a oligonucleótidos que contienen secuencias de CpG no
metiladas, que también son características de patogénicos no
propios. En este punto, las células RAW 264.7 se
co-transfeccionaron con el plásmido de
luciferasa-\kappaB y un vector de expresión que
codifica una forma dominante negativa de MyD88, una proteína
adaptadora requerida para la señalización por miembros de de la
familia de receptores Toll/IL-1. El MyD88 dominante
negativo usado en estos experimentos, MyD88lpr, tiene un
dominio de homología con Toll intacto, pero contiene una mutación
puntual en el dominio de muerte (DD). Una mutación similar en el
dominio de muerte de Fas en el ratón lpr anula la
señalización de Fas, probablemente mediante la alteración de la
conformación del dominio de muerte, lo que bloquea la asociación con
moléculas de señalización en dirección 3'. Cabe esperar que la
sobreexpresión de MyD88lpr en células RAE 264.7 interrumpa la
señalización dependiente de MyD88 mediante competición con MyD88
endógeno para la asociación con proteínas que contienen dominios de
homología con Toll. Este efecto del MyD88lpr es específico de
proteínas relacionadas con Toll, dado que la mutación en el dominio
de muerte debería evitar la asociación con componentes de
señalización en dirección 3' que podrían compartirse con otros
activadores de NF-\kappaB.
La transfección de las células RAW 264.7 con el
plásmido que codifica MyD88lpr marcado con FLAG tuvo como
resultado a expresión de una proteína del tamaño previsto,
determinado mediante inmunotransferencia con un anticuerpo
anti-FLAG (datos no mostrados). Sobre la figura 2A,
las células RAW 264.7 se transfeccionaron después con
\kappaB-Luc (1 \mug) solo (barras negras) o con
un plásmido que codifica MyD88lpr a dos proporciones
diferentes, 10:1 (barras grises) o 1:1 (barras blancas). La
concentración total de ADN plasmídico se normalizó en todos los
pocillos mediante la adición de un vector vacío. Veinticuatro horas
después de la transfección, las células se trataron con
oligonucleótido con CpG (4 \muM), un oligonucleótido control que
carece de motivos CpG (4 \muM), MPL (1 \mug/ml) o LPS (1
\mug/ml). Los resultados mostrados son la media \pm la
desviación estándar de los pocillos por duplicado normalizados a
valores medios de controles transfeccionados sin estimular
(columnas no tratadas) y son representativos de los resultados
obtenidos en múltiples experimentos. En las células RAW 264.7 que
expresan MyD88lpr dominante negativo se inhibió la actividad
luciferasa dependiente de \kappaB inducida por el tratamiento con
oligonucleótido con CpG, MPL o LPS el control positivo (Figura 2A).
El grado de inhibición de la actividad luciferasa por MyD88
dominante negativo dependió de la cantidad de
MyD88lpr/plásmido usado en la transfección (Figura 2A) y el
nivel resultante de expresión de MyD88lpr (datos no
mostrados). Un efecto indirecto de los oligonucleótidos de CpG
mediados por la expresión inducida de IL-18 o
IL-1, cuyos receptores requieren MyD88 para la
transducción de señal, puede justificar estos resultados. No
obstante, además de los resultados negativos obtenidos cuando los
macrófagos RAW 264.7 se trataron con IL-18
recombinante (véase en lo que antecede), no se detectó
IL-18 activa en los extractos celulares de RAW
264.7 o los sobrenadantes, mediante inmunotransferencia o ELISA,
respectivamente (datos no mostrados).
Se examinó la dependencia de la activación de la
\kappaB-luciferasa y la inhibición de Myd88lpr del
estado de metilación y la secuencia dinucleotídica de CG en el
oligonucleótido con CpG. Se añadieron oligonucleótidos control con
GC que sustituyen a secuencias CG (oligo GC) o sintetizados con
metil-C en lugar de C(metilCG) a las células
264.7 transfeccionadas con \kappaB-luc sola o con
MyD88lpr. Con respecto a la figura 2B, los macrófagos RAW
264.7 se transfeccionaron con \kappaB-luc sola
(barras negras) o con \kappaB-luc más
MyD88lpr (barras blancas) (proporción con el plásmido 1:1);
la concentración de ADN total se mantuvo constante mediante la
adición del plásmido vector vacío. Las células transfeccionadas se
trataron al día siguiente durante 6 horas con oligonucleótidos (4
\muM) que contienen motivos CG no metilados, oligonucleótido
similar con GC (GC= sin mutilar o con motivos CG (mCG) metilados
sustituyendo a los motivos CpG, o una secuencia no relacionada (no
CpG) que carece de motivos CG. Los resultados mostrados son la media
\pm la desviación estándar de los pocillos por duplicado
normalizados a valores medios de controles transfeccionados sin
estimular (columnas "no tratadas") y son representativos de
los resultados obtenidos en dos experimentos. Como se muestra en la
Figura 2B, la mutilación de las secuencias CG o su sustitución con
GC anularon casi toda la activación de
\kappaB-Luc por los oligonucleótidos. La actividad
luciferasa basal en células tratadas con oligonucleótidos que
carecen de motivos CpG no se inhibió mediante la expresión de
MyD88lpr. Estos resultados sugieren que el receptor dependiente de
MyD88 activado por el oligonucleótido con CpG tiene la especificidad
prevista para las secuencias CG no metiladas destinadas a imitar el
ADN bacteriano.
En otro grupo de experimentos, tres constructos
de MyD88 que carecen de la capacidad para translucir señales se
amplificaron mediante PCR y se colocaron bajo el control
constitutivo del promotor de CMV (vector pCMV-FLAG,
Sigma Aldrich). El primer constructo, MyD88lpr, contiene una
mutación puntual F56N en el dominio de muerte. El segundo
constructo, MyD88-ADD, carece del dominio de muerte
completamente. El tercer constructo, MyD88-THD,
carece del dominio de muerte y del dominio intermedio. El ADN se
transfeccionó a células RAW 264.7 o a células
NIH-3T3 embrionarias murinas usando un reactivo
lipídico catiónico. Se co-transfeccionó un plásmido
indicador de luciferasa. Poseer un promotor dependiente de
\kappaB0 en dirección 5', la transcripción de la luciferasa
dependía de la liberación de NF-\kappaB, que es
uno de los acontecimientos finales en la vía de señalización de
Toll. A continuación, las células se estimularon con
oligonucleótidos con CpG y varias citocinas control. La expresión
de la luciferasa se analizó en un luminómetro para determinar si la
proteína MyD88 mutante había afectado a la señalización de CpG. Los
resultados del análisis de restricción y de secuenciación
confirmaron la presencia de los constructos de MyD88 (datos no
mostrados). El MyD88 dominante negativo bloquea de forma específica
y selectiva la señalización en respuesta a la estimulación de los
oligonucleótidos con CpG (Figuras 3A y 3B). Los constructos no
afectaron a la señalización a través de la vía independiente de
MYD88 TNF (control negativo), pero sí inhibieron la señalización
por LPS dependiente de MyD88 y la señalización por
IL-1 (Figura 3A). El dominio TIR de MyD88 solo fue
suficiente para bloquear la señalización.
Estos resultados demuestran que se requiere la
función MyD88 para la activación completa de
NF-\kappaB por los oligonucleótidos con cpu y
MPL. Dado que todos los receptores conocidos que requieren MyD88
comparten una característica estructural común, THD, este hallazgo
también ha implicado que un componente del receptor putativo de CpG
tiene un THD. La presencia de un receptor con un THD y la
implicación de los componentes de la vía Toll en la señalización
inducida por motivos CpG es algo nuevo.
Este resultado proporciona una primera
información sobre las probables características estructurales de un
componente del receptor de CpG. Los expertos en la técnica
reconocerán que conociendo que la respuesta inmunitaria a los
oligonucleótidos que contienen motivos cpu no metilados está mediada
por un receptor que contiene YHD proporciona nuevos abordajes de la
identificación de los genes correspondientes. Se puede investigar la
dependencia de la metilación y la fina especificad de secuencia de
los efectos dependientes de MyD88 de los oligonucleótidos con CpG,
así como la relevancia de estos hallazgos para otros activadores a
base de nucleótidos de las CPA.
Un procedimiento preferido de determinar la
secuencia polipeptídica del CpG-R es analizar si los
TLR podrían ser probables candidatos. Un requisito de TLR4 para
respuestas a LPS en ratón se ha demostrado usando las cepas no
respondedoras a endotoxina C3H/HeJ que tienen una mutación puntual
en TLR4 y ratones C57B1/10ScCr y C57B1/10ScNCr, que no expresan
TLR4 (Vogel y col., J. Immunol., 1999, 162, 5666-70,
Qureshi y col., J. Exp. Med., 1999, 189, 615-25,
Chow y col., J. Biol. Chem., 1999, 274, 10689-92,
Hocino y col., J. Immunol., 1999, 162. 3749-52 y
Poltorak y col., Science, 1998, 282, 2085-8).
Para evaluar el papel de TLR4 en las respuestas
de las CPA a oligonucleótidos con APC y MPL in vitro, se
cultivaron BMDDC de ratones respondedores a LPS (Balb/c) y ratones
C3H/HeJ durante a noche con estos adyuvantes y se analizó la
regulación por incremento de los marcadores de activación/maduración
de CD. La expresión de CD86 en la superficie celular se cuantificó
mediante citometría de flujo. El CD86 es un gen diana de
NF-\kappaB regulado por incremento en células
dendríticas y macrófagos activadas, que potencia su capacidad para
activar las células T específicas de antígeno. Con respecto a la
Figura 4, las células BMDDC de ratones salvajes (Balb/c; barras
negras) y mutantes de TLR4 (C3H/HeJ; barras blancas) se cultivaron
en GM-CSF, como se ha descrito en lo que antecede,
durante 6 días y después se trataron durante la noche con
oligonucleótido con cpu (5 \muM), un oligonucleótido control (5
\muM) o LPS (1 \mug/ml) o se dejaron sin estimular. La expresión
en la superficie celular de CD86 en células vivas positivas para
Cd11c se analizó mediante citometría de flujo. Los resultados
mostrados son la fluorescencia media geométrica (FM) de BMDDC
tratadas con adyuvantes normalizada a una FM de BMDDC sin tratar
del mismo cultivo y son representativos de los resultados obtenidos
en tres experimentos. Como se muestra en la Figura 4, las BMDDC
salvajes tratadas con oligonucleótidos con CpG, LPS mostraron un
incremento en la expresión de CD86 en la superficie celular. En
BMDDC mutantes en TLR4 no se observó ningún cambio en la expresión
de CD86 en células tratadas con MPL o LPS, mientras que se observó
un incremento en la expresión de CD86 similar al observado en las
BMDDC salvajes en los cultivos tratados con el oligonucleótido con
CpG (Figura 4 y datos no mostrados). Por tanto, se requiere TLR4
para la activación de las CPS un vitro por LPS y MPL, pero no con
oligonucleótidos con CpG.
Se pueden llevar a cabo otros experimentos
similares al anterior para analizar otros receptores de tipo Toll
conocidos con el fin de caracterizar mejor la naturaleza precisa del
CpG-R. Esto se puede llevar a cabo en cualquier
línea celular comparable que tenga TLR intactos conocidos y
mutaciones que conviertan dichos receptores en no funcionales. La
identificación de las células con un receptor que es activado por
CpG cuando está intacto pero no se activa cuando el receptor es
defectivo destacará exactamente qué TLR y qué THD concreto está
presente.
Asimismo, los expertos en la técnica reconocerán
que los resultados descritos en la presente memoria descriptiva
también proporcionan abordajes útiles para desarrollar compuestos
que puedan servir como agonistas o antagonistas de la señalización
celular mediada por receptores que requieren la proteína adaptadora
MyD88 para sus vías de señalización. Los compuestos se pueden
incubar con células y analizar para ver si se ha efectuado la
cascada de acontecimientos que siguen a la activación de CpG. A
continuación, las células se pueden transfeccionar con el gen
MyD88lpr. Se habrá demostrado que los compuestos que producen
el efecto en los controles sin el gen MyD88lpr, pero que no
lo hacen cuando en gen MyD88lpr se expresa activan la
señalización intracelular a través de vías que requieren la
proteína adaptadora MyD88.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se pueden utilizar numerosos procedimientos
diferentes para identificad el componente de CpG-R
relacionado con Toll. En primer lugar, un experto en la técnica
puede examinar la capacidad de que receptores de tipo Toll
conocidos y nuevos confieren capacidad de respuesta a los
oligonucleótidos con CpG sobre células no respondedoras. En segundo
lugar. Un experto en la técnica puede usar MYD88 para purificar las
proteínas que interaccionan activadas específicamente por los
oligonucleótidos con cpu y no por otros ligandos del receptor Toll
(p. ej., LPS) o para aislar el ADNc correspondiente usando el
sistema de dos híbridos en levaduras.
Los receptores de tipo Toll de ratón
(TLR1-6) poseen homólogos humanos estrechamente
relacionados. En bases de datos públicas se dispone de secuencias
completas o parciales para los genes de ratón. Los vectores de
expresión que codifican los TLR se pueden transfeccionar en una
línea celular no respondedora a CpG (p. ej., NIH3T3) junto con un
gen indicador activado por oligonucleótidos con CpG (p. ej.,
\kappaB-luciferasa). Si alguno de los TIR
cotransfeccionados confiere capacidad de respuesta a los
oligonucleótidos con CpG, ello se verá reflejado en la expresión
del gen indicador tras tratamiento con oligonucleótidos con cpu.
Se puede usar un abordaje similar para analizar
la implicación de cualquier componente de CpG-R
candidato en la señalización de CpG, incluidos los TLR nuevos.
Abordajes a la identificación y clonación de nuevos receptores
relacionados con Toll incluyen genómica, detección selectiva en
bases de datos de secuencias, PCR degenerada, el sistema de dos
híbridos en levadura y detección selectiva en bibliotecas mediante
hibridación. Dado que los oligonucleótidos con CpG activos se
describen mejor en roedores, no en primates, se prefiere trabajar
en el sistema de ratones para identificar el componente de CpG
relacionado con Toll y después aislar un homólogo humano usando,
por ejemplo, PCR.
MyD88lpr, que contiene un dominio de
homología con Toll intacto y una única mutación puntual inactivante
en el dominio de muerte, se puede expresar como proteína
recombinante en bacterias o en células eucarióticas. La proteína
recombinante se puede usar como reactivo de afinidad para aislar y
purificar proteínas de interacción de las células tratadas con
oligonucleótidos con CpG (p. ej., RAW 264.7). La unión de moléculas
efectoras en dirección 3' en la vía de señalización del TLR (p.
ej., IRAK, TRAF6) deberá minimizarse o eliminarse mediante la
mutación "lpr" en el dominio de muerte. Por tanto, La
unión a proteína(s) específicamente a MyD88lpr serán
aquéllas que interaccionan con el THD y/o la región que une el THD
al dominio de muerte- Dado que los dominios de homología con Toll
se asocian a través de interacción homotípica, se espera que el
componente de CpG-R que contiene un THD se una al
THD de MyD88. Una vez que el cpu-R putativo se ha
purificado por afinidad en MyD88, el ADNc correspondiente se puede
aislar mediante procedimientos estándar, tales como, por ejemplo,
análisis peptídico y PCR.
De igual forma, MyD88lpr se puede usar
como cebo en el sistema de dos híbridos en levaduras para aislar
los ADNc que codifican proteínas de interacción. La relevancia de
estos ADNc para la señalización inducida por oligonucleótidos con
CpG se puede analizar como se ha descrito en lo que antecede.
<110> MacKichan, Mary Lee
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Receptor de CpG
(CpG-R) y procedimientos relacionados con el
mismo
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CHIR-0276
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<160> 30
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<210> 1
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido con CpG
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<400> 1
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido con CpG
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido con CpG
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido con CpG
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido con CpG
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido con CpG
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido con CpG
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
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\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
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<210> 12
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<211> 20 bases
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<223> Descripción de la secuencia
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<223> Descripción de la secuencia
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido con CpG
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artificial: oligonucleótido con CpG
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido con CpG
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<223> Descripción de la secuencia
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<211> 8 bases
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<213> Secuencia artificial
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artificial: oligonucleótido con CpG
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<210> 21
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<211> 22 bases
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<223> Descripción de la secuencia
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\hfill22
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<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptgactgtgaa cgttagcgat ga
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido con CpG
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<400> 23
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\hskip-.1em\dddseqskiptgactgtgaa cgttagagcg ga
\hfill22
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<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22 bases
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido con CpG
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<400> 24
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\hskip-.1em\dddseqskipgtttgcgcaa cgttgttgcc at
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22 bases
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\hskip-.1em\dddseqskipatggcaacaa cgttgcgcaa ac
\hfill22
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<210> 26
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\hfill22
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\hskip-.1em\dddseqskipccccgaagaa cgttttccaa tg
\hfill22
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<210> 28
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<223> Descripción de la secuencia
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<210> 29
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido con CpG
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<400> 29
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\hfill22
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: olígonucleótido con CpG
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<400> 30
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\hskip-.1em\dddseqskiptccatacgtt cctgacgtt
\hfill19
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Claims (15)
1. Uso de un polipéptido como receptor de CpG,
en el que el polipéptido comprende un dominio de homología con Toll
y se une a oligonucleótidos con CpG.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que el
polipéptido puede interaccionar con la proteína MyD88.
3. El uso de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el polipéptido es un receptor de tipo
Toll (TLR).
4. Un anticuerpo que se une a un epítopo sobre
un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende un dominio de
homología Toll y se une a los oligonucleótidos con CpG y en el que
el anticuerpo bloquea la unión de cpu a dicho polipéptido, para
usar como medicamento.
5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en el
que el polipéptido puede interaccionar con la proteína MyD88.
6. El anticuerpo de la reivindicación 4 o la
reivindicación 5, en el que el polipéptido es un receptor de tipo
Toll (TLR).
7. Uso de un anticuerpo que se une a un epítopo
sobre un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende un
dominio de homología Toll y que se une a los oligonucleótidos con
CpG, para bloquear la unión de CpG a dicho polipéptido.
8. Uso de la reivindicación 7, en el que el
polipéptido puede interaccionar con la proteína MyD88.
9. Uso de la reivindicación 7 o la
reivindicación 8, en el que el polipéptido es un receptor de tipo
Toll (TLR).
10. Un procedimiento para identificar un
compuesto que se une o modula una actividad del receptor de CpG, que
comprende un dominio de homología tio y que se une a
oligonucleótidos con CpG, que comprende: poner en contacto dicho
receptor, o células que expresan dicho receptor, con un compuesto; y
determinar si dicho compuesto se une o modula la capacidad de dicho
receptor para unirse a oligonucleótidos con CpG.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que el polipéptido puede interaccionar con la proteína MyD88.
12. El procedimiento de la reivindicación 10 o
la reivindicación 11, en el que el polipéptido es un receptor de
tipo Toll (TLR).
13. Un complejo receptor/ligando, en el que el
receptor es un polipéptido que comprende un dominio de homología
Toll y se une a oligonucleótidos con CpG y el ligando es
oligonucleótido con cpu.
14. El complejo de la reivindicación 13, en el
que el polipéptido puede interaccionar con la proteína MyD88.
15. El complejo de la reivindicación 13 o la
reivindicación 14, en el que el polipéptido es un receptor de tipo
Toll (TLR).
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