ES2319218T3 - Derivados de alergenos de proteinas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para producir derivados de alérgenos de proteínas de tipo salvaje con actividad alergénica reducida, caracterizado por las siguientes etapas: - proporcionar un alérgeno de proteína de tipo salvaje con una actividad alergénica, - dividir dicho alérgeno de proteína de tipo salvaje en dos partes, teniendo dichas dos partes una actividad alergénica reducida o careciendo de actividad alergénica y - volver a unir dichos dos fragmentos en orientación inversa.
Description
Derivados de alérgenos de proteínas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para reducir la actividad alergénica de alérgenos de
proteínas de tipo salvaje, derivados de alérgenos nuevos y
estrategias para la vacunación contra la alergia.
La alergia es la alternancia específica
hereditaria o adquirida de la capacidad de reacción frente a
sustancias foráneas (es decir, no propias) que normalmente son
inocuas ("alérgenos"). La alergia está relacionada con
reacciones inflamatorias en los sistemas de órganos afectados (piel,
conjuntiva, nariz, faringe, mucosa bronquial, tracto
gastrointestinal), síntomas de enfermedades inmediatas, tales como
rinitis alérgica, conjuntivitis, dermatitis, choque anafiláctico y
asma, y manifestaciones de enfermedades crónicas, tales como las
reacciones de etapas tardías en asma y dermatitis atópica.
La alergia de Tipo I representa una enfermedad
de hipersensibilidad determinada genéticamente que afecta a
aproximadamente el 20% de la población mundial industrializada. El
sello patofisiológico de la alergia de Tipo I es la producción de
anticuerpos de inmunoglobulina E (IgE) contra antígenos inocuos de
otro tipo (alérgenos).
En la actualidad, la única forma causativa de
tratamiento de la alergia es una inmunoterapia específica de
alérgenos en la que las dosis de alérgenos en aumento se administran
al paciente con el fin de inducir apatías específicas de alérgenos.
Aunque diversos estudios han mostrado la eficacia clínica de la
inmunoterapia específica de alérgenos, los mecanismos subyacentes
no se comprenden en su totalidad.
La principal desventaja de la inmunoterapia
específica de alérgenos es la dependencia del uso de extractos de
alérgenos naturales que son difícil, si no imposible, de normalizar,
al menos a nivel de producción industrial. Tales extractos de
alérgenos naturales están constituidos por compuestos alergénicos y
no alergénicos diferentes y por este motivo es posible que ciertos
alérgenos no estén presentes en el extracto administrado o -incluso
peor- que los pacientes puedan desarrollar nuevas especificidades de
IgE a componentes en transcurso del tratamiento. Otra desventaja de
la terapia basada en extractos resulta del hecho de que la
administración de preparaciones de alérgenos biológicamente activos
pueden inducir efectos secundarios anafilácticos.
La aplicación de técnicas de biología molecular
en el campo de la caracterización de alérgenos ha permitido aislar
los ADNc que codifican todos los alérgenos medioambientales
relevantes y ha permitido la producción de alérgenos recombinantes.
El uso de tales alérgenos recombinantes ha hecho posible determinar
el perfil de reactividad del paciente individual tanto por
procedimientos de diagnóstico in vitro (es decir, detección
de anticuerpos IgE específicos de alérgenos en suero) como por
experimentación in vivo. En base a esta tecnología, parece
que es posible la posibilidad de desarrollar estrategias de vacunas
basadas en componentes nuevos contra la alergia, en especial contra
la alergia de Tipo I, que se ajustan al perfil de sensibilización
del paciente. Sin embargo, debido a la similitud de los alérgenos
recombinantes a sus homólogos naturales, los alérgenos
recombinantes también presentan actividad alergénica significativa.
Como los alérgenos recombinantes imitan estrechamente la actividad
alergénica de los alérgenos de tipo salvaje, también están presentes
para los alérgenos recombinantes todos los inconvenientes
relacionados con esta actividad alergénica en inmunoterapia que
aplica alérgenos naturales. Con el fin de mejorar la inmunoterapia,
es necesario reducir la actividad alergénica de los alérgenos
recombinantes de tal forma que la dosis de los alérgenos
administrados se puede aumentar con sólo un bajo riesgo de efectos
secundarios anafilácticos.
Se ha sugerido influir exclusivamente la
actividad de células T específicas de alérgenos por medio de la
administración de péptidos que contienen solamente epitopes de
células T. Los epitopes de células T representan péptidos pequeños
que resultan de la digestión proteolítica de alérgenos intactos por
medio de células que representan antígenos. Tales epitopes de
células T se pueden producir en forma de péptidos sintéticos. Los
análisis dirigidos hasta la fecha con epitopes de células T, sin
embargo, solamente han mostrado resultados escasos y baja eficacia.
Se han considerado diversas explicaciones para la baja eficacia de
la inmunoterapia basada en péptidos de células T: en primer lugar,
puede ser difícil administrar la dosis óptima para conseguir la
tolerancia en lugar de la activación de células T. En segundo
lugar, los péptidos pequeños de epitopes de células T tendrán una
semivida corta en el cuerpo. En tercer lugar, existe considerable
evidencia de que la producción de IgE en individuales atópicos
representa una respuesta inmune de memoria que no requiere nuevos
cambios de clase y asimismo no se puede controlar por medio de
citoquinas derivadas de células T. Las formas de terapia que están
basadas exclusivamente en la administración de epitopes de células T
pueden modular, por lo tanto, la actividad de células T específicas
de alérgenos, pero pueden tener poca influencia
sobre la producción de anticuerpos de IgE específicos de alérgenos por medio de células B de memoria cambiadas.
sobre la producción de anticuerpos de IgE específicos de alérgenos por medio de células B de memoria cambiadas.
Se ha sugerido adicionalmente producir derivados
o fragmentos de alérgenos hipoalergénicos por medio de tecnología
de ADN recombinante o síntesis de péptidos. Tales derivados o
fragmentos llevan epitopes de células T y pueden inducir
anticuerpos de IgG que compiten con el reconocimiento por IgE del
alérgeno nativo. Hace más de 20 años se demostró que la digestión
proteolítica de los alérgenos producía fragmentos pequeños de
alérgenos que en parte retenían su capacidad de unión a IgE pero no
provocaban reacciones tipo inmediatas. Aunque la proteólisis de
alérgenos es difícil de controlar y de normalizar, la biología
molecular ha abierto nuevas vías para la producción de haptenos de
unión a IgE. Se ha sugerido que tales haptenos de unión a IgE son
útiles para la inmunización activa con riesgos reducidos de efectos
anafilácticos y para la terapia pasiva para saturar la unión de
células efectoras a IgE antes del contacto del alérgeno y así
bloquear la liberación del mediador inducido por alérgenos.
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Otra sugestión fue producir versiones de
alérgenos hipoalergénicos por medio de la modificación por
ingeniería genética basada en la observación de que los alérgenos
pueden aparecer de forma natural en forma de isoformas que se
distinguen en solamente algunos residuos de aminoácidos y/o en
conformaciones con capacidad de unión a IgE baja. Por ejemplo, la
oligomerización del alérgeno principal del polen abedul, Bet v 1,
por medio de modificación por ingeniería genética proporcionó un
trímero recombinante con actividad alergénica enormemente reducida.
De manera alternativa, se ha sugerido que la introducción de
mutaciones puntuales lleva a cambios conformacionales en la
estructura del alérgeno y de ese modo interrumpe los epitopes de IgE
discontinuos o afecta de forma directa la capacidad de unión a IgE
(Valenta y col., Biol. Chem. 380 (1999),
815-824).
También se ha mostrado que la fragmentación del
alérgeno en algunas partes (por ejemplo en dos partes) lleva a una
pérdida casi completa de la capacidad de unión a IgE y actividad
alergénica del alérgeno debido a la pérdida de sus pliegues
similares a los natives (Vrtala y col. (J. Clin. Invest. 99 (1997),
1673-1681) para Bet v 1, Twardosz y col. (BBRC 239
(1997), 197-204) para Bet v 4, Hayek y col. (J.
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Zeiler y col. (J. Allergy Clin. Immunol.100 (1997),
721-727) para alérgenos de caspa bovina, Elfman
(Int. Arch. Allergy Immunol. 117 (1998), 167-173)
para Lep d2), Westritschnig (J. Immunol. 172 (2004),
5684-5692) para Phlp 7), ...). La fragmentación de
proteínas que contienen epitopes de IgE fundamentalmente
discontinuos/conformacionales lleva a una reducción sustancial de
la capacidad de unión a IgE del alérgeno. En base a este
conocimiento, en la técnica anterior se investigó si tales
fragmentos de alérgenos hipoalergénicos pueden inducir respuestas
inmunológicas protectoras in vivo. (Westritschnig y col.
(Curr. Opinion in Allergy and Clin. Immunol. 3 (2003),
495-500)).
En Vrtala S. y col. (Methods (2004) 32:
313-320) se describen las estrategias para convertir
alérgenos en moléculas hipoalergénicas. Estas estrategias implican
la producción de fragmentos de alérgenos, mutantes de alérgenos y
derivados de alérgenos modificados químicamente.
El documento EP 1 403 280 se refiere a vacunas
que comprenden una molécula hipoalergénica derivada del alérgeno de
polen de festuca roja PhI p 7.
En el artículo de Niederberger V. y col (PNAS
(2004) 101: 14677-14682) se describe el uso de
alérgenos modificados por ingeniería genética, en particular de
fragmentos de Bet v 1 recombinantes para vacunación.
En Valenta R. y col. (Science (1991) 253:
557-560) se desvela la identificación de un alérgeno
de polen de abedul que tiene una homología de secuencia elevada a
las profilinas. Los autores de este artículo descubrieron que los
anticuerpos de IgE de individuos alérgicos son capaces de unir la
profilina de abedul sí como la profilina humana.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar medios y procedimientos para una inmunoterapia de
alergia mejorada basada en el conocimiento arriba mencionado. Tales
procedimientos y medios deberían ser eficaces, en relación con un
bajo riesgo para el choque anafiláctico, fácilmente aplicables y
adaptados a las necesidades de un paciente individual y fácilmente
transformables en escalas industriales.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un procedimiento para producir derivados de alérgenos de proteínas
de tipo salvaje con actividad alergénica reducida, que se
caracteriza por las siguientes etapas:
- -
- proporcionar un alérgeno de proteína de tipo salvaje con una actividad alergénica,
- -
- dividir dicho alérgeno de proteína de tipo salvaje en dos partes, teniendo dichas dos partes una actividad alergénica reducida o careciendo de actividad alergénica y
- -
- volver a unir dichos dos fragmentos en orientación inversa.
El presente procedimiento está basado en el
hecho de que la fragmentación de proteínas que contienen epitopes de
IgE fundamentalmente discontinuos/conformacionales lleva a una
reducción sustancial de la capacidad de unión a IgE del alérgeno.
Sin embargo, los fragmentos de ciertos alérgenos eran mucho menos
inmunogénicos para inducir una respuesta de anticuerpo protectora
(Westritschnig y col., (2004)).
Con el presente procedimiento, se proporcionan
derivados de alérgenos de proteínas nuevos y definidos que combinan
las ventajas de los enfoques basados en epitopes de células B y
células T. Al mismo tiempo, las desventajas de vacunación con
fragmentos solamente o disposiciones sofisticadas de fragmentos
(tales como haptenos de unión a IgE e intercambio con tres o más
fragmentos) no están presentes para los derivados de alérgenos de la
presente invención.
De hecho, se podría mostrar con la presente
invención que los resultados óptimos se pueden obtener con la
estructura que, con respecto a la integridad de los elementos de la
estructura, se asemeja más estrechamente al alérgeno de tipo
salvaje (es decir, con todos los aminoácidos del alérgeno de tipo
salvaje), sin embargo, sin su actividad alergénica (o con una
actividad alergénica suficientemente reducida). Por supuesto, si
sólo se pierden (eliminan) unos pocos residuos de aminoácidos o se
añaden (insertan) en el transcurso de la generación de los
derivados de alérgenos o si las partes se combinan por medio de un
enlace en lugar de una combinación directa, todavía están presentes
las ventajas de acuerdo con la presente invención. Esta reducción o
anulación de la actividad alergénica se consigue por medio del
principio conocido y general de dividir el alérgeno en los
fragmentos definidos. Además de este principio general, la presente
invención vuelve a unir las dos partes del alérgeno obtenido en la
orientación inversa que lleva a derivados de alérgenos que contienen
esencialmente toda la información estructural relevante del
alérgeno (ya que la secuencia de aminoácidos está contenida en su
totalidad o casi en su totalidad en los derivados de alérgeno de
acuerdo con la presente
invención) pero sólo con actividad alergénica restante baja (o sin ella) en comparación con el alérgeno de tipo salvaje.
invención) pero sólo con actividad alergénica restante baja (o sin ella) en comparación con el alérgeno de tipo salvaje.
Estos derivados "cabeza a cola" de acuerdo
con la presente invención posibilitan una inmunoterapia adecuada,
individual y eficaz para los pacientes alérgicos que se puede
escalar fácilmente con etapas rutinarias. Los derivados de acuerdo
con la presente invención inducen anticuerpos de IgE protectores que
pueden bloquear la unión a IgE del paciente a los alérgenos de tipo
salvaje e inhibir la desgranulación del basófilo inducido por el
alérgeno.
El presente procedimiento es especialmente
adecuado para la tecnología de ADN recombinante. Una vez que el
derivado se ha construido por medio de la modificación por
ingeniería genética, se puede obtener fácilmente en cantidades
considerables por medio de la expresión transgénica a nivel
industrial en huéspedes adecuados. Los derivados de alérgenos de
acuerdo con la presente invención se pueden producir preferiblemente
en un huésped con capacidad de expresión elevada.
Los alérgenos preferidos que se tienen que
modificar por medio de la presente invención incluyen todos los
alérgenos de proteínas principales disponibles, por ejemplo, según
www.allergen.org/List.htm. Los grupos específicamente
preferidos de alérgenos de acuerdo con la presente invención
incluyen profilinas, en especial Phl p 12, alérgenos de abedul, en
especial Bet v 4, alérgenos de ácaros del polvo, en especial Der p2,
alérgenos de ácaros de almacenamiento, en especial Lep d 2,
alérgenos de festuca roja, en especial Phl p 7, y los alérgenos
enumerados en la tabla A.
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\vskip1.000000\baselineskip
Con la presente modificación de
separación/cabeza a cola se puede obtener una reducción
significativa en la actividad alergénica. Dependiendo del
procedimiento, esta actividad se puede extinguir en su mayor parte
del alérgeno de proteína de tipo salvaje. De acuerdo con una
realización preferida de la presente invención, la reducción en la
actividad alergénica se mide por medio de una reducción de la
inhibición de la capacidad de unión a IgE de al menos el 10%,
preferiblemente al menos el 20%, en especial al menos el 30%, en
comparación con el alérgeno de tipo salvaje. Se muestra un
procedimiento preferido en el apartado de ejemplo a
continuación.
Una forma alternativa, pero también preferida
para definir la reducción en la actividad alergénica usa la medida
de unión de IgE. La ausencia de unión de anticuerpos IgE de los
sueros de pacientes sensibles a alérgenos, a una transferencia de
puntos se considera una indicación de la reducción más
significativa. También este procedimiento se muestra en el apartado
de ejemplo a continuación.
Los derivados obtenidos de acuerdo con la
presente invención se pueden combinar fácilmente con un excipiente
farmacéuticamente aceptable y terminar en una preparación
farmacéutica.
Preferiblemente, los derivados se combinan con
un adyuvante de vacuna adecuado y se terminan en una preparación de
vacuna farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con una realización preferida, los
derivados de acuerdo con la presente invención se combinan con
otros alérgenos para proporcionar una vacuna de combinación. Tales
alérgenos son preferiblemente alérgenos de tipo salvaje,
especialmente una mezcla de alérgenos de tipo salvaje, alérgenos de
tipo salvaje recombinantes, derivados de alérgenos de proteínas de
tipo salvaje o mezclas de los mismos. Tales mezclas se pueden
realizar específicamente para las necesidades (perfil de alérgeno)
de un cierto paciente.
En una realización preferida, una preparación
farmacéutica como tal contiene adicionalmente un extracto de
alérgeno.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un derivado de alérgeno de un alérgeno de
proteína de tipo salvaje, teniendo dicho alérgeno de proteína de
tipo salvaje una secuencia de aminoácidos de 1 a Z, caracterizado
por que dicho derivado adyacentemente contiene -en orientación
N-terminal o C-terminal- los dos
fragmentos de alérgeno de tipo salvaje X a Z y 1 a X, teniendo
dichos dos alérgenos de tipo salvaje una actividad alergénica
reducida o ausencia de actividad alergénica.
Preferiblemente, el derivado de alérgeno de
acuerdo con la presente invención se caracteriza por que X a Z y 1
a X son al menos residuos de 30 aminoácidos de longitud,
preferiblemente al menos 50 residuos de aminoácidos, en especial al
menos 60 residuos de aminoácidos.
Todavía se prefiere más, si X a Z y 1 a X
difieren en longitud en el 50% o menos, preferiblemente en el 30% o
menos, en especial en el 20% o menos.
Los derivados de alérgenos específicamente
preferidos de acuerdo con la presente invención se seleccionan de
un alérgeno de tipo I, preferiblemente de un alérgeno de la tabla A,
más preferido del polen de la festuca roja (Phelum
pratense), en especial Ph1 p 12, polen del abedul (Betula
verrucosa), en especial Bet v 2 y Bet v 4, veneno contra la
chaqueta amarilla (Vespula vulgaris), veneno contra la avispa
de papel (Polistes annularis), polen de la Parietaria
judaica, polen del césped de centeno, alérgenos de los ácaros del
polvo, en especial Der p 2, etc.
Preferiblemente, los derivados de acuerdo con la
presente invención se proporcionan en forma de una composición de
alérgeno en la que no sólo está presente un alérgeno, si no dos o
más. Los presentes derivados también se pueden mezclar con
extractos de alérgeno que están suplementados por los derivados de
la presente invención para sustituir la ausencia de cantidades
suficientes de alérgenos específicos en los extractos naturales.
Las mezclas de alérgenos se necesitan específicamente en pacientes
que tienen reacciones alergénicas a no solamente un alérgeno. Por
lo tanto, se prefiere proporcionar los presentes derivados en forma
de combinación con alérgenos adicionales (otros) para proporcionar
una vacuna de combinación.
Por lo tanto, los derivados de alérgenos de
acuerdo con la presente invención se pueden combinar preferiblemente
con alérgenos de tipo salvaje para proporcionar una composición de
alérgenos, en especial una mezcla de alérgenos de tipo salvaje,
alérgenos de tipo salvaje recombinantes, derivados de alérgenos de
proteínas de tipo salvaje o mezclas de los mismos (cada uno del
mismo y/o diferente alérgeno y/o isoformas o mutantes de los mismos,
siempre que se proporcione una reducción total de la actividad
alergénica, en comparación con el alérgeno recombinante o proteína
de tipo salvaje en la preparación en su totalidad).
Preferiblemente, la presente preparación
contiene adicionalmente un extracto de alérgeno.
\newpage
El alérgeno o composición de alérgeno de acuerdo
con la presente invención preferiblemente contiene un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de un derivado de alérgeno de acuerdo con la presente
invención para la preparación de un medicamento de inmunoterapia
específico de alérgeno.
Todavía otro aspecto de la presente invención se
refiere al uso de un derivado de alérgeno o una composición de
alérgenos de acuerdo con la presente invención para la preparación
de un medicamento para la inmunización pasiva.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de un derivado de alérgeno o una composición de alérgenos de
acuerdo con la presente invención para la preparación de un
medicamento para la inmunización profiláctica.
Los derivados y composiciones de alérgenos de
acuerdo con la presente invención se pueden usar para la
inmunización profiláctica de individuos que lleva a una prevención
eficaz de la alergia. Como los derivados y composiciones de
alérgenos de acuerdo con la presente invención, como los derivados
del alérgeno Der p 2, muestran una respuesta inmune alérgica
reducida en comparación con el alérgeno de tipo salvaje, no llevan a
efectos secundarios no deseados. De manera ventajosa, un
medicamento como tal se puede administrar a niños de la edad de 1 a
3 años. Una vacunación como tal antes de que dicho niño se ponga en
contacto con alérgenos previene la formación de anticuerpos de IgE
específicos de alérgenos en dicho niño.
Preferiblemente, el medicamento contiene
adicionalmente otros ingredientes adecuados, tales como adyuvantes,
diluyentes, conservantes, etc.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención el medicamento comprende de 10 ng a 1 g,
preferiblemente de 100 ng a 10 mg, en especial de 0,5 \mug a 200
\mug de dicho derivado de alérgeno recombinante por dosis de
aplicación. Las formas preferidas de administración incluyen todas
las pautas de administración convencionales descritas y sugeridas
para la vacunación en general e inmunoterapia de alergia
específicamente (por vía oral, transdérmica, intravenosa,
intranasal, mucosa, etc). La presente invención incluye un
procedimiento para tratar y prevenir la alergia por medio de la
administración de una cantidad eficaz de las preparaciones
farmacéuticas de acuerdo con la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para producir un derivado de alérgeno de acuerdo
con la presente invención que se caracteriza por las siguientes
etapas:
- -
- proporcionar una molécula de ADN que codifica un derivado de alérgeno de acuerdo con la presente invención,
- -
- transformar una célula hospedadora con dicha molécula de ADN y
- -
- expresar dicho derivado en dicha célula hospedadora y aislar dicho derivado.
Preferiblemente, dicho huésped es un huésped con
elevada capacidad de expresión.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
un "huésped con capacidad de expresión elevada" es un huésped
que expresa una proteína de interés en una cantidad de al menos 10
mg/l de cultivo, preferiblemente de al menos 15 mg/l, más
preferiblemente de al menos 20 mg/l. Por supuesto, la capacidad de
expresión depende también del huésped seleccionado y el sistema de
expresión (por ejemplo, vector). Los huéspedes preferidos de acuerdo
con la presente invención son E. coli, Pichia pastoris,
Baciullus subtilis, células vegetales por ejemplo, derivadas
del tabaco), etc.
Por supuesto, los derivados de alérgenos de
acuerdo con la presente invención también se pueden producir por
medio de cualquier otro procedimiento adecuado, en especial síntesis
química o síntesis semi-química.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de un derivado de profilina que se puede obtener a partir de
una primera molécula de profilina de tipo salvaje por medio de un
procedimiento de acuerdo con la presente invención o un derivado de
alérgeno de una primera molécula de profilina de tipo salvaje de
acuerdo con la presente invención para la fabricación de un
medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades
alérgicas causadas por una segunda molécula de profilina de tipo
salvaje.
Resultó sorprendente que los anticuerpos
inducidos por y dirigidos a derivados de profilina de una primera
molécula de profilina de tipo salvaje de acuerdo con la presente
invención también se unen a otras moléculas de profilina de tipo
salvaje. Por lo tanto, dichos derivados se pueden emplear para el
tratamiento o prevención de una serie de enfermedades alérgicas.
Tales derivados de profilina se pueden usar en forma de vacunas de
amplio espectro que permiten inmunizar individuos con solamente una
o dos moléculas inmunogénicas. La profilina representa un alérgeno
que está expresado en todas las células eucarióticas y representa
así un pan-alérgeno que puede inducir alergias
inhalativas (por ejemplo, rinoconjuntivitis, asma) así como
síndromes de alergia oral después de la ingestión oral (prurito e
hinchazón de labios y la lengua) en pacientes sensibles.
Por ejemplo, el derivado Phl p 12 intercambiado,
MP12, induce anticuerpos de IgG después de la inmunización que
reconocen profilinas a partir de tanto pólenes como de alimentos
derivados de plantas. Los anticuerpos inducidos por MP 12 inhiben
IgE del suero de pacientes que se une a profilinas a partir de
pólenes y también a profilinas derivadas de alimentos derivados de
plantas. Así pues, el MP 12 así como otras moléculas de profilinas
intercambiadas son adecuadas para el tratamiento de sensibilización
cruzada de polen-alimento atribuible a la alergia a
profilinas.
De acuerdo con una realización preferida, dichas
primeras y dichas segundas moléculas de profilinas se seleccionan
del grupo que está constituido por Phl p 12, Bet v 2, Art v 4, Ana
c, Api g 4, Mus xp 1, Cor a 2, y Dau c 4.
En especial, estos alérgenos son adecuados para
usarse de acuerdo con la presente invención gracias a sus
similitudes estructurales. Sin embargo, es obvio que también se
pueden usar, por consiguiente, otros alérgenos que comparten
similitudes estructurales unas entre otras.
Dicha primera molécula de profilina es
preferiblemente Phl p 12 y dicha segunda molécula de profilina se
selecciona preferiblemente del grupo que está constituido por Bet v
2, Art v 4, Ana c, Api g 4, Mus xp 1, Cor a 2, y Dau c 4.
Los experimentos revelaron que especialmente los
derivados de Phl p 12 se pueden usar en forma de vacunas de amplio
espectro. Un derivado particular preferido está constituido por una
proteína de fusión, en la que los aminoácidos 1 a 77 del Phl p 12
de tipo salvaje se condensan en el extremo
N-terminal a los aminoácidos 78 a 131 (véase Fig.
1).
Los derivados de profilina Bet v 2, Art v 4, Ana
c, Api g 4, Mus xp 1, Cor a 2, y Dau c 4 como se desvela en la
presente memoria descriptiva y que se pueden obtener por medio de un
procedimiento de acuerdo con la presente invención se usan
preferiblemente para el tratamiento y/o prevención de
sensibilización al polen-alimento atribuible a la
alergia a la profilina.
La presente invención se describe adicionalmente
por medio de los siguientes ejemplos y las figuras de dibujos,
todavía sin estar restringida a los mismos.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática de la estructura primaria de MP 12 (un alérgeno Phl p 12
intercambiado de acuerdo con la presente invención) en comparación
con Phl p 12 de tipo salvaje;
La Figura 2 muestra espectros CD de Phl p 12 de
tipo salvaje y MP12. La elipticidad por residuo medio [\theta]
(eje y) de Phl p 12 y el derivado MP12 se muestra para un intervalo
de longitudes de onda (eje x);
La Figura 3 muestra tinción con Coomassie de un
SDS PAGE al 14% cargado con fracciones de MP12 recombinante que se
expuso a una columna de poliprolina. La banda M representa el
marcador de peso molecular, la banda 1 representa la fracción de
flujo, las bandas 2-4 las fracciones de lavado, las
bandas 5-6 las fracciones de elusión. Los pesos
moleculares (kDa) se indican en el margen izquierdo;
La Figura 4 muestra la reactividad a IgE de Phl
p 12 y MP12 punteados en nitrocelulosa. Las proteínas punteadas, así
como la albúmina de suero humano (HSA) a efectos de control
negativo, se expusieron a sueros de 24 pacientes alérgicos a Phl p
12 (bandas 1-24). La banda N representa suero de un
individuo de control no alérgico. Los anticuerpos unidos a IgE se
detectaron con anticuerpos de anti-IgE humanos;
La Figura 5 muestra la inducción de la
liberación de histamina por basófilos en dos pacientes alérgicos a
Phl p 12. Los granulocitos de pacientes se incubaron con varias
concentraciones (eje x) de Phl p 12 (cuadrados) y MP12 (círculos).
El porcentaje de histamina total liberada en el sobrenadante se
expone en el eje y;
La Figura 6 muestra la reactividad de antisueros
de conejo con profilinas de polen de festuca roja, abedul y
altamisa. Los antisueros de conejo activados contra Phl p 12
(rombos) y MP12 (cuadrados) se analizaron para detectar la
reactividad a Phl p 12 (A), Bet v 2 (B), y profilina de altamisa (C)
por medio de ELISA. Las diluciones de sueros se muestran en el eje
x, los valores OD correspondientes en el eje y. Los sueros
preinmunes correspondientes no exponen ninguna reactividad;
La Figura 7 muestra la inhibición de la
desgranulación de basófilos inducidos por rPhl p 12 por medio de
anti-rPhl p 12 (P12) y anti IgG inducido por MP12.
Los basófilos de rata se han cargado con IgE de ratón específico de
Phl p 12;
La Figura 8 muestra una representación
esquemática de la estructura primaria y generación de Der p 2
Híbrido (un alérgeno Der p 2 intercambiado de acuerdo con la
presente invención) en comparación con Der p 2 de tipo salvaje;
La Figura 9 muestra un SDS PAGE tintado con
Coomassie que contiene extractos de proteínas de BL21 (DE3) que
expresa rDer p 2 y derivados de rDer p 2 en forma de proteínas
marcadas his (bandas 1), rDer p 2 purificado, fragmentos de rDer p 2
y rDer p 2 híbrido (bandas 2) y un marcador molecular (bandas
M).
La Figura 10 muestra un análisis espectroscópico
de masas de rDer p 2 purificado y derivados de rDer p 2. Los ejes x
muestran las relaciones masa/carga y las intensidades de señal se
exponen en los ejes y como porcentajes de las señales más
intensas.
\newpage
La Figura 11 muestra espectros CD ultravioleta
lejano de Der p 2 purificado recombinante, fragmentos de rDer p 2 y
rDer p 2 híbrido. Los espectros de las proteínas se expresan como
elipticidades por residuo medio (eje y) a longitudes de onda
proporcionadas (eje x).
La Figura 12 muestra el reconocimiento por IgE
de Der p 2 recombinante y derivados de Der p 2 recombinante. Se
analizaron los sueros de 17 individuos alérgicos a los ácaros
(bandas 1-17), un individuo no alérgico (banda 18) y
tampón sin suero (banda 19), para detectar la reactividad a IgE con
Der p 2 recombinante transferido por puntos, fragmentos de rDer p 2,
rDer p 2 híbrido y BSA. Se detectó IgE unido con anticuerpos anti
IgE humano marcado 125I y se visualizaron por autorradiografía.
La Figura 13 muestra la activación de basófilos
por medio de Der p 2 recombinante y derivados de rDer p 2 como se
mide por expresión de CD203c. Las muestras de sangre de 10 pacientes
alérgicos a ácaros se expusieron a 10 \mug/ml de rDer p 2
recombinante, cada uno de los fragmentos de Der p 2, una mezcla de
los fragmentos, \alphaIgE o tampón. Se muestran los resultados de
tres pacientes representativos. La expresión de CD203c se determinó
por análisis FACS y se expone como Índice medio de fluorescencia
(abreviadamente en inglés MFI).
La Figura 14 muestra la activación de basófilos
por medio de Der p 2 recombinante y derivados de rDer p 2 como se
mide por expresión de CD203c. Las muestras de sangre de 10 pacientes
alérgicos a ácaros se expusieron a diversas conversaciones de rDer p
2 recombinante y rDer p 2 híbrido, algE o tampón (eje x). Se
muestran los resultados de seis pacientes representativos. La
expresión de CD203c se determinó por análisis FACS y se expone como
Índice de estimulación (abreviadamente en inglés SI).
La Figura 15 muestra la evolución de IgG_{1}
específico de Der p 2 inducido por inmunización de ratones con rDer
p 2 y derivados de rDer p 2. Se inmunizaron grupos de cinco ratones
cada uno con rDer p 2 purificado o derivados de rDer p 2 y se
determinaron los anticuerpos de IgG_{1} inducidos por medio de
ELISA. Los valores de densidad óptica (OD 405 nm) expuestos en el
eje y corresponden al nivel de anticuerpos de IgG_{1} en el suero
de ratón. Los resultados se muestran en forma de gráficos por
casillas en los que el 50% de los valores están dentro de las
casillas y los valores no extremos entre las barras. Las líneas
dentro de las casillas indican los valores medianos. Los círculos
blancos y estrellas indican los valores extremos y extremos de cada
grupo de ratones.
La Figura 16 muestra la baja actividad
alergénica in vivo de derivados de rDer p 2 visualizados por
medio de la liberación de \beta-hexosaminidasa de
células RBL. Se cargaron células con leucemia basófila de rata
(abreviadamente en inglés RBL) con suero de ratón obtenido antes
(Preinmunosuero) y después (inmunosuero) de la inmunización con
alérgeno rDer p 2 de tipo salvaje y derivados de rDer p 2. La
liberación de \beta-hexosaminidasa se indujo con
rDer p 2 y se expone como el porcentaje de liberación total de
\beta-hexosaminidasa (valores medios \pmSD para
los cinco sueros de cada grupo de ratones) (eje y).
La Figura 17 muestra la reactividad de antisuero
de conejo con profilinas de polen de festuca roja (Phl p 12), polen
de abedul (Bet v 2), polen de altamisa (Art v 4), anacardo (Ana c),
apio (Api g 4), plátano (Mus xp 1), avellana (Cor a 2), y zanahoria
(Dau c 4). El antisuero de conejo activado contra Phl p 12 (rombos)
y MP12 (cuadrados) se analizó para detectar la reactividad a dichas
profilinas por medio de ELISA. Las diluciones de suero se muestran
en el eje x, los valores OD correspondiente en el eje y. Los sueros
preinmunes correspondientes no mostraron ninguna reactividad.
\vskip1.000000\baselineskip
En los ejemplos 1 a 5 se ilustran los principios
de la presente invención por medio de un alérgeno de profilina, la
profilina del polen de la festuca roja Phl p 12. Los ejemplos 6 a 11
se refieren al alérgeno principal del ácaro (Dermatophagoides
pteronyssinus), Der p 2. Los ejemplos 12 y 13 muestran la
reactividad cruzada de Phl p 12 con las profilinas de otras fuentes
distintas al polen de la festuca roja, demostrando en consecuencia
la adecuación para usar derivados de Phl p 12 en forma de vacunas
para enfermedades alérgicas causadas por otras profilinas.
\vskip1.000000\baselineskip
a) Generación, expresión y purificación de una
variante hipoalergénica de la profilina del polen de festuca roja,
Phl p 12.
La técnica de solapamiento por PCR se usó para
modificar por ingeniería genética un derivado de Phl p 12
intercambiado. La plantilla de PCR era el ADNc que codifica la
profilina del polen de festuca roja, Phl p 12, subclonada en el
vector de expresión pet17b. Los siguientes cebadores se usaron para
generar dos fragmentos por PCR que contienen las secuencias de
solapamiento así como los sitios de restricción Ndel y EcoRI y una
secuencia que codifica un residuo 6 x Histidina
C-terminal para la purificación de la proteína. Para
el fragmento 1 se usaron el cebador MDE-1:
5'CATATGAGGCCCGGCGCGGTCATC3' y el cebador MDE-2:
5'GTACGTCTGCCACGCCATCATGCCTTGTT
CAAC3', para el fragmento 2, se usaron el cebador MABC-1: 5'GTTGAACAAGGCATGATGTCGTG-GCAGACG3' y el cebador MABC-2: 5'GAATTCTTAATGGTGATGGTGATGGTGACCCT-GGATGACCATGTA3'. En la siguiente etapa, ambos productos de PCR obtenidos como se describe se usaron como plantillas para la reacción de PCR por solapamiento usando el cebador MDE-1 y MABC-2 para general el ADN que codifica el derivado Phl p 12 (es decir, MP12) (esquemáticamente representado en la Figura 1). El ADN que codifica MP-12 se clonó en el sistema de vector pBluscript (Stratagene) y la secuencia de ADN se confirmó por secuenciación de doble hebra (MWG Blotech, Alemania).
CAAC3', para el fragmento 2, se usaron el cebador MABC-1: 5'GTTGAACAAGGCATGATGTCGTG-GCAGACG3' y el cebador MABC-2: 5'GAATTCTTAATGGTGATGGTGATGGTGACCCT-GGATGACCATGTA3'. En la siguiente etapa, ambos productos de PCR obtenidos como se describe se usaron como plantillas para la reacción de PCR por solapamiento usando el cebador MDE-1 y MABC-2 para general el ADN que codifica el derivado Phl p 12 (es decir, MP12) (esquemáticamente representado en la Figura 1). El ADN que codifica MP-12 se clonó en el sistema de vector pBluscript (Stratagene) y la secuencia de ADN se confirmó por secuenciación de doble hebra (MWG Blotech, Alemania).
Para la purificación de la proteína, el ADNc que
codifica MP-12 tenía que subclonarse en un sistema
de vector de expresión pet117b usando las enzimas de restricción
Ndel y EcoRI y la secuencia de ADN se volvió a confirmar por
secuenciación de doble hebra (MWG Blotech).
Para la purificación de la proteína,
MP-12 se expresó en Escherichia coli BL21
(DE3) (Stratagene, East Kew, Australia) en cultivo líquido. Se
cultivó É. Coli a una OD_{600} de 0,4 en medio LB que
contiene 100 mg/de ampicilina. Se indujo la expresión de las
proteínas recombinantes por medio de la adición de
isopropil-b-tiogalactopiranosida
hasta una concentración final de 1 mM y el cultivo adicional durante
4 horas adicionales a 37ºC. Se recogieron las células de E.
coli de un cultivo de 500 ml por centrifugación, se volvieron a
suspender en tampón A (NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris 10 mM, Urea
8M, pH 7,5). Después de la centrifugación a 20.000 rpm, 30 min., el
sobrenadante se transfirió a una columna de agarosa
Ni-NTA (Quiagen, Hilden, Alemania) y la elución de
la proteína MP-12 marcada 6 x His se realizó usando
el tampón A con valores de pH decrecientes. La proteína eluyó a un
pH de 4,9 y se volvió a plegar posteriormente por diálisis etapa a
etapa contra tampón A, pH 7,5, que contiene Urea
6-0 M. La etapa final de la diálisis se realizó
contra solución salina tamponada con fosfato (PBS), en la que MP12
era soluble como se muestra por medio de los experimentos de
centrifugación.
La pureza de la proteína se confirmó por medio
de SDS PAGE y se realizó la cuantificación usando un kit Micro BCA
(Pierce, EE.UU.).
\vskip1.000000\baselineskip
Las medidas del dicroismo circular
(abreviadamente en inglés CD) se llevaron a cabo en un
espectropolarímetro Jasco J-715 usando una célula
con longitud de recorrido de 0,1 cm equilibrada a 20ºC. Los
espectros se registraron con una resolución de 0,5 nm a una
velocidad de exploración de 100 nm/min y resultaron de la
determinación del promedio de 3 exploraciones. Se corrigió la línea
basal de los espectros finales por medio de la sustracción de los
espectros MilliQ obtenidos bajo condiciones idénticas. Los
resultados se equiparon con el programa de estimación de la
estructura secundaria J-700.
Los resultados indican una cantidad considerable
de estructura secundaria del derivado. El espectro de Phl p 12 está
caracterizado con un mínimo a 218 nm y un máximo marcado por debajo
de 200 nm, mientras que el mínimo del derivado se desplaza una
longitud de onda más pequeña y el cruce de cero de la curva es
inferior está por debajo de 200 nm (Fig. 2). Estos resultados son
indicativos de una porción en aumento de una estructura secundaria
en espiral aleatoria dentro del derivado.
\vskip1.000000\baselineskip
La afinidad a la poliprolina es una
característica común a las profilinas de varios organismos. Se ha
demostrado que el derivado de Phl p 12 hipoalergénico, MP12, no se
une a la poliprolina y exhibe así propiedades bioquímicas
alteradas.
Aproximadamente 5 \mug de MP12 recombinante
purificado en PBS se sometió a una columna de agarosa activada con
CbBr cargada con poliprolina (Amersham Bioscience, Üppsala,
Suecia) equilibrada con PBS. Después de recoger el flujo, la
columna se lavó con 3 volúmenes (PBS) y la elución se realizó con
PBS 5 x 1 ml que contiene Urea 2 M ó 6 M, respectivamente.
Alícuotas de diez \mul del flujo, las fracciones de lavado y las
fracciones de elución se sometieron a una electroforesis en geles de
poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS PAGE) al 14% y las
proteínas se visualizaron por medio de tinción Coomassie (Fig. 3).
Los resultados indican una pérdida del sitio de unión a la
poliprolina debido a la reorganización de la estructura primaria de
Phl p 12.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de unión a IgE de MP12 recombinante
se comparó a la de Phl p 12 recombinante de tipo salvaje por medio
de análisis de transferencia de puntos usando sueros de 24 pacientes
sensibles a profilina (Fig. 4). Phl p 12 y MP12 así como albúmina
de suero humano (HSA) a efectos de control se puntearon sobre
nitrocelulosa y se sondearon con sueros de 24 pacientes sensibles a
profilina. Se detectaron los anticuerpos unidos a IgE usando
anticuerpos anti-IgE humanos marcados ^{125}I.
Todos los pacientes mostraron reactividad a IgE con Phl p 12 de
tipo salvaje, mientras que ninguno de los 24 pacientes reaccionaron
con MP12 o con la proteína de control HSA (Fig. 4).
Para cuantificar la reducción de la capacidad de
unión a IgE de MP12, se realizaron inhibiciones de fase fluida.
Para este fin se preincubó el suero de seis pacientes sensibles a
profilina con bien 10 \mug de Phl p 12 bien de MP12 y
subsiguientemente se incubó con Phl p 12 unido a placas de ELISA (5
\mug/ml). Los anticuerpos unidos a IgE se detectaron con un
anticuerpo anti-IgE humano marcado con fosfatasa
alcalina (Pharmingen). La inhibición de la unión a IgE se calculó
con la siguiente fórmula: % de inhibición = 100 x [(A – B) / A]; A
representando los valores OD obtenidos después de la incubación de
suero con BSA, B representando los valores OD después de la
incubación de suero con Phl p 12 o MP12, respectivamente.
La capacidad de MP12 para inhibir la unión de
IgE a Phl p 12 se muestra como el porcentaje de inhibición en la
Tabla 2, que varía entre el 20% y el 40% con inhibición media del
31,2% para MP12, mientras que la inhibición conseguida con Phl p 12
variaba entre el 76% y el 91% (media del 86%).
\vskip1.000000\baselineskip
Después, el Phl p 12 intercambiado se comparó
con Phl p 12 de tipo salvaje para detectar su capacidad para inducir
la liberación de histamina de basófilos de pacientes alérgicos a
profilina.
Los granulocitos se aislaron de las muestras de
sangre heparinizadas de pacientes alérgicos al polen de festuca
roja por medio de sedimentación en Dextrano. Después del
aislamiento, las células se incubaron con varias concentraciones de
Phl p 12, MP12 o, a efectos de control, con un anticuerpo
anti-IgE humano monoclonal (Immunotech, Marsella,
Francia). La histamina liberada en el sobrenadante se midió por
medio de radioinmunoensayo (Immunotech). La histamina total se
determinó después de la congelación/descongelación de las células.
Los resultados se expresan como valores medios de determinaciones
duplicadas, y representan el porcentaje de la histamina total.
Como se ilustra en la Fig. 5, Phl p 12 indujo la
liberación de histamina enérgica y dependiente de dosis en
basófilos de ambos pacientes, proporcionando una liberación de
histamina máxima en concentraciones entre
10^{-5}-10^{-4} \mug/ml, mientras que no se
observó liberación de histamina con MP12 en concentraciones de
hasta 10^{-2} \mug/ml indicando una reducción de más de 1000
veces de actividad alergénica. Además, la liberación de histamina
máxima de basófilos después de la adición de MP12 era
considerablemente inferior a la conseguida con Phl p 12 de tipo
salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de analizar, si la inmunización con
Phl p 12 intercambiado induce anticuerpos de ÏgG que
reaccionan con Phl p 12 de tipo salvaje y profilinas de otros
pólenes, se inmunizaron conejos tres veces con Phl p 12 o Mp12
usando adyuvantes completos e incompletos de Freund (200
\mug/inyección) (Charles River, Kisslegg, Alemania). Las muestras
de suero se obtuvieron en intervalos de cuatro semanas. Los sueros
se almacenaron a -20ºC hasta análisis.
La reactividad de los anticuerpos de IgE
inducidos por Phl p 12 y MP12 se estudio por medio de ELISA (Fig.
6). Se cubrieron Phl p 12 así como las profilinas de abedul (Bet v
2) y artemisa sobre placas ELISA (5 \mug/ml) y se incubaron con
diluciones en serie de antisueros de conejo
(1:200-1: 64000). Se detectaron los anticuerpos de
conejo unidos con un antisuero de burro anti-conejo
marcado con peroxidasa diluida 1:1000 (Amersham Pharmacia
Biotech).
MP12 indujo una respuesta de anticuerpo
anti-Phl p 12 de IgG, que se podía comparar a la
inducida con Phl p 12 de tipo salvaje (Fig. 6A). Además, ambos, los
anticuerpos de IgG inducidos por Phl p 12 y MP12, reaccionaron de
forma cruzada con profilinas de abedul y artemisa (Fig. 6B, C).
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de IgG de conejo inducido por MP12
para inhibir la unión de IgE de pacientes alérgicos a Phl p 12 se
investigó por medio de un ensayo de competición ELISA. Las placas
ELISA (Nunc Maxisorp, Rosklide, Dinamarca) se cubrieron con Phl p
12 (1 \mug/ml) y se preincubaron bien con una dilución 1:250 de
cada uno de los antisueros anti-MP12 o bien el
antisuero Phl p 12 y, a efectos de control, con los sueros
preinmunes correspondientes. Después de lavar, las placas de
incubaron con suero diluido 1:3 de siete pacientes alérgicos al
polen de césped sensibles a Phl p 12 y se detectaron los anticuerpos
IgE unidos con un anticuerpo de rata anti-IgE
humano monoclonal (Phamingen, San Diego, CA), diluido 1:1000,
seguido de un antisuero de oveja anti-rata lg unido
a HRP diluido 1:2000 (Amersham). El porcentaje de inhibición de la
unión de IgE conseguido por medio de la preincubación con el
antisuero del anti-péptido o
anti-mutante se calculó como sigue: % de inhibición
de la unión de IgE = 100 - OD_{I} / OD_{P} X 100. OD_{I} y
OD_{P} representan las extinciones después de la preincubación
con los sueros inmunes de conejos y los sueros preinmunes
correspondientes, respectivamente. Como se muestra en la Tabla 3,
la inhibición de la unión de IgE de pacientes a Phl p 12 conseguida
con anticuerpos anti-Phl p 12 estaba entre el 30,2%
y el 66,7% (inhibición media al 49,8%). Asimismo, se observó una
considerable reducción de la reactividad de IgE anti Phl p 12, que
varía entre el 10,8% y el 27,6% (inhibición media al 20,8%) con
anticuerpos activados contra MP12 (Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las células RBL-2H3 se sembraron
en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (4 x 10^{4}
células/pocillo), se incubaron durante 24 horas a 37ºC usando
CO_{2} al 7%. La sensibilización pasiva se llevó a cabo con el
suero de ratón que contiene IgE reactivo con profilina a una
dilución final de 1:30 durante 2 horas. Los anticuerpos no unidos
se eliminaron por medio del lavado de la fase celular dos veces en
tampón de Tyroide (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl_{2} 0,5 mM,
CaCl_{2} 1,8 mM, NaH_{2}PO_{4} 0,4 mM,
D-glucosa 5,6 mM, NaHCO_{3} 12 mM, HEPES 10 mM y
BSA al 0,1% p/v, pH 7,2). Las células RBL, precargadas con IgE de
ratón específico de Phl p 12, se expusieron a rPhl p 12 (0,005
\mug/ml). Phl p 12 se preincubó en tampón de Tyrode con el 0%,
2%, 5%, 7,5% ó 10% v/v de antisuero de conejo de un conejo
inmunizado con Phl p 12, un conejo inmunizado con MP12 o el suero
preinmune correspondiente durante 2 horas a 37ºC.
Se añadió Phl p 12 preincubado a las células RBL
durante 30 minutos en una atmósfera humidificada a 37ºC y sus
sobrenadantes se analizaron para detectar la actividad de
\beta-hexosaminidasa por medio de la incubación
con
4-metilumbeliferil-N-acetil-\beta-D-glucosamida
80 \muM (Sigma-Aldrich, Viena, Austria) en tampón
citrato (0,1M, pH 4,5) durante 1 h a 37ºC. Se detuvo la reacción
por medio de la adición de tampón glicina 100 \mul (glicina 0,2M,
NaCl 0,2M, pH 10,7) y se midió la fluorescencia a \lambda_{ex}:
360/\lambda_{em}: 465 nm usando un lector de microplacas de
fluorescencia (Spectrafluor, Tecan, Austria). Los resultados se
reseñan como unidades de fluorescencia y porcentaje de
\beta-hexosaminidasa total liberada después de
lisis de células con Triton X-100 al 1%.
Como se ilustra en la Fig. 7, ambos, la
preincubación de Phl p 12 con concentraciones en aumento (2%-10%
v/v) de anticuerpos anti-MP12 de conejo y con
anticuerpos anti-Phl p 12 de conejo llevó a una
inhibición dependiente de dosis de la liberación del mediador
inducida por rPhl p 12 de RBL que se habían precargado con IgE de
ratón específico de Phl p 12. No se observó una desgranulación de
basófilos cuando el alérgeno se preincubó con las mismas
concentraciones de Ig preinmune.
\vskip1.000000\baselineskip
La alergia a los ácaros del polvo doméstico
(HDM) pertenece a la alergia más común de todo el mundo que afecta
a más del 50% de todos los pacientes alérgicos. Dermatophagoides
pteronyssinus se identificó como la fuente más importante de
alérgenos en el polvo doméstico en Europa.
Se han caracterizado veinte grupos de alérgenos
de ácaros hasta el momento, y los alérgenos del grupo 2 se han
identificado como los alérgenos de ácaros principales, contra los
que se sensibilizan más del 80% de los pacientes alérgicos a los
ácaros y principalmente se localizan en las heces de los ácaros. Los
alérgenos del grupo 2 se caracterizaron primero como alérgenos de
14.000-18.000 Da con una actividad de unión a IgE
elevada. El aislamiento y análisis de clones de ADNc que codifican
Der p 2 revelaron después que Der p 2 comprende un alérgeno con
residuos de 129 aminoácidos, un peso molecular de 14.000 Da y sin
sitios N-glicosilación. Los alérgenos del grupo 2
contienen tres enlaces disulfuros y están constituidos por dos hojas
\beta anti-paralelas. Los epitopes de células T
de Der p 2 se localizan en todas las regiones de la proteína y los
epitopes de IgE resultaron ser conformacionales.
Los estudios de inmunoterapia con extractos de
ácaros brutos han demostrado que los efectos secundarios sistémicos
peligrosos pueden tener lugar durante la inmunoterapia con extractos
de HDM (Akcakaya, N., y col. (2000) Ann Allergy Asthma Immunol 85:
317) así como la inducción de nuevas reactividades de IgE a mariscos
(van Ree, R., y col. (1996) Allergy 51: 108).
Para superar las desventajas de la inmunoterapia
basada en extractos, se han aplicado diversas estrategias para
desarrollar derivados de alérgenos hipoalergénicos. En el caso de
Der p 2, las variantes se desarrollaron con reactividad de IgE
reducida destruyendo enlaces disulfuros por mutagénesis dirigida al
sitio, destrozando los enlaces disulfuros a través de una deleción
N- y C-terminal, o introduciendo mutaciones. Sin
embargo, su actividad biológica es cuestionable.
En los siguientes ejemplos se produjeron dos
fragmentos recombinantes del alérgeno del grupo 2 de
Dermatophagoides pteronyssinus (Der p 2) que comprenden aa
1-53 y aa 54-129, para destruir
epitopes de células B conformacionales y para retener los epitopes
de células T principales. De forma adicional, se construyó una
molécula de Der p 2 híbrido recombinante (aa 54-129
+ 1-53), en la que los dos fragmentos r Der p 2 se
recombinaron en orden inverso por "splicing" por solapamiento
de la extensión de genes basado en PCR.
Se construyeron dos fragmentos recombinantes de
Der p 2 que comprenden los aminoácidos (aa) 1-53 y
aa 54-129 por amplificación por PCR como se describe
en el ejemplo 1 (véase la Fig. 8). Se generó una molécula de Der p 2
híbrido en orden inverso (aa 54-129 +
1-53) por "splicing" por solapamiento de la
extensión de genes basado en PCR. (Linhart y col., FASEB J.16
(2002), 1301-1303).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc que codifica Der p 2 marcados His,
fragmentos de Der p 2 (aa 1-53 y aa
54-129) y Der p 2 híbrido (aa 54-129
+ 1-53) se generó por medio de amplificación por PCR
usando cebadores (MWG, Ebersberg, Alemania), como se indica en la
Tabla 4 y se obtuvo un ADNc de Der p 2 por medio de transcripción
inversa de ARN de Der p 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se indican los cebadores de avance (F), inversos
(R) y de solapamiento. Los sitios EcoRI y Ndel están subrayados. Los
nucleótidos que codifican las marcas His se muestran en
negrita/cursiva.
Los cebadores 1 y 4 se usaron para la
amplificación del ADNc de rDer p 2, los cebadores 1 y 2 para el ADNc
que codifica el fragmento 1 de rDer p 2 (aa 1-53) y
los cebadores 3 y 4 para el ADNc del fragmento 2 de rDer p 2 (aa
54-129). Se generó el rDer p 2 híbrido por
"splicing" por solapamiento de la extensión de genes basado en
PCR usando los cebadores 2 y 3 y los dos cebadores de solapamiento 5
y 6. Los cebadores cadena arriba contenían in sitio Ndel y EcoRI y
los cebadores cadena abajo contenían un sitio EcoRI así como seis
codones His. Los productos de PCR se cortaron con Ndel/EcoRI, se
purificaron sobre gel y se subclonaron en los sitios Ndel/EcoRI del
plásmido pET17b. El procedimiento de cloruro de calcio se usó para
la transformación de los plásmidos en la cepa de E. coli
XL-1 Blue. El ADN de plásmido se aisló por medio del
kit NuceloBond AX-maxi-prep
(Macherey-Nagel, Alemania) y la secuencia de las
inserciones de ADNc se confirmaron por medio de secuenciación de
ambas hebras de ADN en un sistema de secuenciación automatizado
(MWG, Alemania).
Las proteínas recombinantes que contienen colas
de Hexahistidina C-terminal se expresaron en la cepa
de E. colo BL21 (DE3) en cultivo líquido por inducción con
isopropil-\beta-tiogalactopiranosida
(IPTG) 0,5 mM a una OD 600 de 1 durante 5 horas a 37ºC. Las células
se recogieron por centrifugación a 4.000 x g durante 15 minutos a
4ºC.
Los sedimentos bacterianos obtenidos a partir de
11 cultivos líquidos se volvieron a suspender en 10 ml de imidazol
25 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 0,1% v/v y se
trataron con lisozima 100 \mug durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Las células se lisaron por medio de 3 ciclos de
congelación/descongelación (-70ºC/+50ºC), el ADN se degradó por
incubación con DNasa I 1 \mug durante 10 minutos a temperatura
ambiente y los desechos celulares se retiraron por centrifugación a
10.000 x g durante 30 minutos a 4ºC. El fragmento 1 de rDer p 2 se
encontró en la fracción soluble y se purificó en condiciones nativas
sobre columnas de afinidad con resina de Ni-NTA
(QIAGEN, Alemania).
El rDer p 2, fragmento 2 de rDer p 2 y rDer p 2
híbrido se encontraron en el sedimento en la fracción corporal de
inclusión, que se solubilizó con urea 8M, NaH_{2}PO_{4} 100 mM,
Tris-Cl 10 mM, pH 8 durante 60 minutos a
temperatura ambiente. Los residuos insolubles se retiraron por
centrifugación (10.000 x g, 15 min., 4ºC) y rDer p 2, fragmento 2
de rDer p 2 y rDer p 2 híbrido se purificaron en condiciones de
desnaturalización sobre columnas de afinidad con resina de
Ni-NTA (QIAGEN).
Las fracciones, que contienen proteínas
recombinantes de más del 90% de pureza se dializaron contra
NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7 y las concentraciones de proteínas
finales se determinaron por Micro BCA Protein Assay Kit (Pierce,
EE.UU.).
La construcción de una molécula híbrida como se
describe anteriormente interrumpió al menos una de las dos hojas
\beta de Der p 2 y el enlace disulfuro entre C8 y C119 y de ese
modo los epitopes de IgE conformacionales de Der p 2 se destruyeron
y los epitopes de células T principales se conservaron. Los
derivados de rDer p 2 se sobre expresaron a medida que las bandas
visibles en E. coli proporcionaban una acumulación distinta
(Fig. 9, bandas 1). El fragmento 1 de rDer p 2 se encontraba en la
fracción soluble, mientras que las otras proteínas se acumulaban en
las fracciones corporales de inclusión insoluble pero se podían
solubilizar en urea. El rDer p 2 y el derivado de rDer p 2 se
purificaron por cromatografía de afinidad con níquel (Fig. 9,
bandas 2) proporcionando un cultivo de 20 a 30 mg de proteína/1
E. coli. Después de volver a plegar por diálisis, rDer p 2,
fragmento 1 de rDer p 2 y rDer p 2 híbrido permanecieron solubles en
tampones fisiológicos a concentraciones de 0,5 mg/ml a 1 mg/ml,
mientras que el fragmento 2 de rDer p 2 sólo permaneció soluble en
una concentración inferior a 0,1 mg/ml. El análisis de SDS PAGE
indicó una pureza de más del 90% de las proteínas, que migraron en
formas monoméricas y formas diméricas (Fig. 9, bandas 2).
Los espectros de masas por desorción mediante
láser se adquirieron en un modo lineal con un instrumento de tiempo
de vuelo Compact MALDI II (Kratos, U.K.; piCHEM, Austria). Las
muestras se disolvieron en acetonitrilo al 10%, ácido
trifluoracético al 0,1% y se usó el ácido
Alfa-ciano-4-hidroxi-cinámico
(disuelto en acetonitrilo al 60%, ácido trifluoracético al 0,1%) en
forma de una matriz. Para la preparación de la muestra, se depositó
una mezcla 1:1 de proteína y solución matriz sobre la diana y se
secó al aire.
El análisis de las cuatro proteínas por
espectrometría de masas MALDI-TOF reveló masas
moleculares de 15.072,9 Da, 6.806,7 Da, 9.216,3 Da y 15.001,8 Da
para rDer p 2, fragmento 1 de rDer p 2, fragmento 2 de rDer p 2 y
rDer p 2 híbrido, respectivamente, que son de conformidad con las
masas teóricas de las proteínas calculadas a partir de sus
secuencias de aminoácidos (Fig. 10).
Los espectros CD de las proteínas recombinantes
purificadas se registraron en un espectropolarímetro JASCO J715 que
se había calibrado en longitud de onda con vidrio de neodimio de
acuerdo con las indicaciones del fabricante. Se realizaron las
medidas CD con rDer p 2 y derivados de rDer p 2 (c = 0,1 mg/ml a 0,5
mg/ml) disueltos en agua doble destilada a temperatura ambiente. Se
usó una cubeta de cuarzo circular con una longitud de recorrido de
0,1 cm, y los espectros se registraron con resolución de 0,2 nm a
una velocidad de exploración de 50 nm/min. Se determinó el promedio
de la señal de los espectros por medio de la acumulación de al menos
tres exploraciones y los resultados se expresan como la elipticidad
de residuo media en una longitud de onda proporcionada.
El espectro CD ultravioleta lejano del Der p 2
purificado recombinante, muestra una banda negativa de 217 nm, que
indica una conformación de hoja \beta (Fig. 11). En
contraposición, los espectros CD de los derivados de rDer p 2
indican que estas proteínas no están principalmente plegadas. El
fragmento 1 de rDer p 2 muestra una conformación en hélice
aleatoria típica, identificada por medio de una banda negativa a
-200 nm. También el fragmento 2 de rDer p 2 muestra una
conformación en hélice aleatoria predominante, aunque la intensidad
de la señal era muy baja. El espectro de rDer p 2 híbrido absorbió
principalmente la conformación en hélice aleatoria con cantidades
pequeñas de estructuras en hoja \beta (Fig. 11). La destrucción de
la conformación tridimiensional se podría confirmar por medio de
análisis de dicroismo circular, mostrando una pérdida o reducción de
la estructura en hoja \beta en los derivados de rDer p 2 en
comparación con rDer p 2 de tipo salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron Der p 2 purificado recombinante,
los dos fragmentos de rDer p 2, fragmento 1 (aa
1-53) y fragmento 2 (aa 54-129) y
rDer p 2 híbrido para detectar la reactividad de IgE por medio de
ensayos de transferencia por puntos no desnaturalizantes. Se
puntearon dos microlitros de las proteínas purificadas (0,1 mg/ml)
y, a efectos de control, BSA sobre bandas de membrana de
nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Alemania). Las bandas de
nitrocelulosa que contienen las proteínas transferidas por puntos se
bloquearon en tampón A (Na_{2}HPO_{4} 40 mM, Na_{2}HPO_{4}
0,6 mM, pH 7,5, 0,5% [v/v] Tween 20, BSA al 0,5% [p/v], NaN_{3}
0,05% [p/v]) y se incubaron con suero de pacientes alérgicos a los
ácaros, suero de una persona no alérgica (diluciones 1:10) o tampón
A sin suero. Se detectaron los anticuerpos unidos a IgE con
anticuerpos de anti-IgE humanos marcados con 125I y
se visualizaron por autorradiografía.
La capacidad de unión a IgE del alérgeno rDer p
2 de tipo salvaje se comparó con los dos fragmentos de rDer p 2 y
rDer p 2 híbrido por medio de ensayos de transferencia por puntos no
desnaturalizantes. El suero de 17 individuos alérgicos a los ácaros
(bandas 1-17) mostraron reactividad de IgE variante
a rDer p 2 punteado con nitrocelulosa, mientras que no se pudo
detectar la reactividad de IgE al fragmento 1 de rDer p 2.
Solamente 3 sueros mostraron una unión muy débil
al fragmento 2 de rDer p 2 y 2 sueros reaccionaron con rDer p 2
híbrido (Fig. 12). El suero de una persona no alérgica así como
tampón sin suero no mostraron reactividad de IgE a rDer p 2 o a
derivados de rDer p 2 (Fig. 12 bandas 18, 19). No se encontró
reactividad de IgE a la proteína de control, BSA (Fig. 12). Como
consecuencia de la pérdida de la conformación y así pues los
epitopes de IgE conformacionales (véase el ejemplo 7), se podría
mostrar que los derivados de rDer p 2 han perdido casi
completamente su capacidad de unión a IgE en comparación con rDer p
2 de tipo salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron muestras de sangre heparinizada de
pacientes alérgicos. Las muestras de sangre (100 \mul) se
incubaron con varias concentraciones de rDer p 2, fragmentos de rDer
p 2, rDer p 2 híbrido, un anticuerpo anti-IgE
monoclonal (Immunotech, Marsella, Francia), o PBS durante 15 minutos
(37ºC). La expresión de CD 203c se determinó como se describe
(Hauswirth, A. W., y col. (2002) J Allergy Clin Immunol 110:
102.).
La regulación hacia arriba de CD 203c se ha
descrito como un marcador de sustitución para la activación de
basófilos inducida por alérgenos y la desgranulación (Hauswirth, A.
W., y col. (2002)). Por lo tanto, se comparó la actividad
alergénica de Der p 2 recombinante, fragmentos de rDer p 2 y rDer p
2 híbrido midiendo la regulación hacia arriba de CD 203c en
basófilos de pacientes alérgicos a los ácaros del polvo doméstico
(Fig. 13, 14). La Fig. 13 muestra resultados representativos de 3
pacientes. La incubación de basófilos con 10 \mug/ml de rDer p 2
de tipo salvaje reguló hacia arriba de forma significativa la
expresión de CD 203c en cada uno de los pacientes analizados,
mientras que no se obtuvo regulación hacia arriba con la misma
concentración de los fragmentos individuales o con una mezcla
equimolar de los dos fragmentos (Fig. 13). De forma adicional, los
basófilos de los mismos 10 pacientes se expusieron a concentraciones
diferentes (5 \mug/ml-0,32 ng/ml) de rDer p 2 y
rDer p 2 híbrido en etapas de dilución 1:5. La figura 14 muestra los
resultados de 6 pacientes representativos. La exposición de
basófilos con rDer p 2 híbrido resultó en una regulación hacia
arriba de la expresión CD 203c en concentraciones entre 40 ng/ml y
5.000 ng/ml, mientras que rDer p 2 de tipo salvaje indujo la
regulación hacia arriba de CD 203c todavía a concentraciones entre
8-200 ng/ml. En 8 de los 10 pacientes, el rDer p 2
híbrido tenía una capacidad reducida de más de diez veces para
activar basófilos en comparación con rDer p 2.
Los anticuerpos anti-IgE humanos
indujeron una regulación hacia arriba de la expresión CD 203c en los
basófilos de todos los pacientes, mientras que no se obtuvo
regulación hacia arriba con el tampón solo (Fig. 13 + 14).
La determinación de la expresión de CD 203c en
basófilos de pacientes alérgicos a los ácaros indica una actividad
biológica reducida de rDer p 2 híbrido en comparación con rDer p 2
de tipo salvaje y no se puede observar actividad biológica con los
fragmentos de rDer p 2. Además, los ensayos de activación de
basófilos usando células RBL indican que los anticuerpos de IgE
inducidos con los derivados eran menos anafilácticos. Estos
resultados indican que los derivados de rDer p 2 hipoalergénicos
inducirán menos efectos secundarios mediados por IgE que el
alérgeno Der p 2 de tipo salvaje cuando se usa para
inmunoterapia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron grupos de cinco ratones BALB/c
hembras de ocho semanas de edad con 5 \mug de proteínas
purificadas (rDer p 2, fragmento 1 de rDer p 2, fragmento 2 de rDer
p 2 o rDer p 2 híbrido), adsorbieron a 200 \mul de
AluGel-S (SERVA Electrophoresis, Alemania) por vía
subcutánea en el cuello en intervalos de 4 semanas durante un
periodo de 20 semanas. Se recogieron las muestras de sangre un día
antes de cada inmunización y se almacenaron a -20ºC.
Se cubrieron placas ELISA (Greiner, Austria) con
rDer p 2 diluido en PBS (c = 5 \mug/ml) durante toda una noche a
4ºC. Las placas se lavaron dos veces con PBST (PBS; Tween 20 al
0,05% v/v) y se bloquearon con tampón de bloqueo (PBST; BSA al 1%
p/v) durante 3 horas a temperatura ambiente. El suero de los ratones
se diluyó 1:1000 para la medida de IgG1 específico de Der p 2 en
PBST; se añadió BSA p/v al 0,5% y 100 \mul de esta solución por
pocillo durante toda la noche a 4ºC.
Las placas se lavaron 5 veces con PBST y los
anticuerpos unidos a IgG1 se detectaron con un anticuerpo IgG1 de
rata anti-ratón monoclonal (BD Pharmigen, EE.UU.),
seguido de la adición de anticuerpos IgG de cabra
anti-rata marcados con peroxidasa de rábano picante
(Amersham Bioscience, Suecia) como se describe (Vrtala, S., y col.
(1996) J Allergy Clin Immunol 98: 913).
Los niveles de IgG_{1} específicos de Der p 2
se determinaron en muestras de suero obtenidas de ratones después
de la inmunización con rDer p 2 y derivados de rDer p 2 (Fig. 15).
rDer p 2 así como los derivados de rDer p 2 eran inmunogénicos e
indujeron respuestas de IgG_{1} en los ratones después de la
segunda inmunización (semana 8) (Fig. 15). Después de la segunda
inmunización las respuestas de IgG_{1} inducidas con el fragmento
1 de rDer p 2 y rDer p 2 híbrido eran incluso superiores que las
inducidas con rDer p 2 (Fig. 15). Después de la última
inmunización, las respuestas de IgG_{1} inducidas con los
derivados de rDer p 2 eran comparables a las inducidas con la
molécula rDer p 2 de tipo salvaje (Fig. 15).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cubrieron placas ELISA (Greiner, Austria) con
rDer p 2 purificado 100 \mul, diluido con PBS hasta una
concentración de 5 \mug/ml, durante toda una noche a 4ºC. Después
de lavar las placas dos veces con PBST y bloquear con tampón de
bloqueo (PBST; BSA al 1% p/v) durante 3 horas a temperatura
ambiente, las placas se incubaron durante toda la noche a 4ºC con
antisueros de anti-rDer p 2, fragmento 1 de
anti-rDer p 2, fragmento 2 de
anti-rDer p 2 o anti-rDer p 2
híbrido o los sueros preinmunes correspondientes. Los antisueros de
ratón se diluyeron 1:20 y se diluyeron los antisueros de conejo
1:100 en PBST; BSA al 0,5% p/v. Después de lavar, las placas se
incubaron con sueros diluidos 1:10 de pacientes alérgicos a los
ácaros durante toda una noche a 4ºC y los anticuerpos humanos
unidos a IgE se detectaron con anticuerpos anti-IgE
de cabra humanos unidos por HRP (KPL, EE.UU.) diluidos en PBST
1:2500; BSA al 0,5% p/v como se ha descrito (44, 45). El porcentaje
de inhibición de la unión a IgE se calculó como sigue: 100-(ODs/ODp)
x 100, donde ODs y ODp representan los coeficientes de extinción
después de la preincubación con el suero inmune y el suero
preinmune, respectivamente.
Los anticuerpos IgG1 de ratón inducidos por la
inmunización con rDer p 2 y los derivados de rDer p 2 se
investigaron para detectar su capacidad para inhibir la unión de IgE
de pacientes alérgicos a los ácaros a rDer p 2 en experimentos de
competición ELISA.
El porcentaje de inhibición de la unión de IgE
de pacientes alérgicos a rDer p 2 de tipo salvaje por medio de
anticuerpos IgG de ratón se muestra en las Tablas 5 y 6.
La inhibición obtenida con los anticuerpos
anti-rDer p2 de ratón estaba entre el 61% y el 87%
(media del 75%), mientras que los anticuerpos de
anti-rDer p 2 híbrido de ratón, anticuerpos del
fragmento 1 de anti-Der p 2 y anticuerpos del
fragmento 2 de rDer p 2 inhibieron la unión de IgE de suero a rDer
p 2 de tipo salvaje entre el 47% y el 76% (media del 62%), entre el
48% y el 66% (media del 54%) y entre el 24% y el 52% (media del
41%), respectivamente (Tabla 5).
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En experimentos adicionales, los conejos se
inmunizaron con rDer p 2 purificado y los tres derivados de rDer p
2. La capacidad del antisuero de conejo para inhibir la unión de IgE
de pacientes alérgicos a los ácaros a rDer p 2 también se analizó
por medio de ensayos de inhibición por ELISA con un resultado
similar al obtenido para los sueros de ratón (Tabla 6). Los
anticuerpos anti-Der p 2 de conejo inhibieron la
unión de IgE de pacientes a rDer p 2 entre el 47% y el 89% (media
del 66%), mientras que los anticuerpos de anti-rDer
p 2 híbrido inhibieron la unión de IgE humano entre el 20% y el 86%
(media del 59%). La inhibición obtenida con los anticuerpos del
fragmento 1 de anti-rDer p 2 de conejo estaba entre
el 26% y el 70% (media del 52%) y la inhibición con los anticuerpos
del fragmento 2 de anti-rDer p 2 de conejo estaba
entre el 32% y el 54% (media del 42%). Usando una mezcla de los
anticuerpos del anti-fragmento 1 y el
anti-fragmento 2, la inhibición de la unión de IgE
de pacientes a rDer p 2 de tipo salvaje se aumentó ligeramente sólo
hasta una media del 55% (Tabla 6).
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La inmunización de ratones mostró la
inmunogenicidad de todos los tres derivados de rDer p 2 por medio de
su capacidad para inducir respuestas de anticuerpos IgG. La unión
de IgE de pacientes alérgicos a los ácaros a Der p 2 se inhibió por
medio de anticuerpos de IgG inducidos con cada uno de los derivados
de rDer p 2 pero los anticuerpos de IgG inducidos por rDer p 2
híbrido indicó una capacidad inhibitoria mejor en comparación con
los anticuerpos de IgG inducidos con los dos fragmentos individuales
e incluso con una mezcla de los anticuerpos IgG inducidos por los
fragmentos 1 y 2. Estos resultados son de importancia, ya que los
anticuerpos de bloqueo mostraron desempeñar una función principal
en SIT con alérgenos recombinantes.
Los anticuerpos de anti-Der p 2
y derivados de anti-Der p 2 inducidos por medio de
la inmunización de la unión de IgE de pacientes alérgicos a los
ácaros a rDer p 2 como se muestra en un ensayo de inhibición por
ELISA.
Der p 2 híbrido induce los anticuerpos de
bloqueo en el presente modelo de ratón; la inmunogenicidad se
aumenta de forma significativa por medio del intercambio de
fragmentos.
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Las células con leucemia basófila de rata (RBL)
(sublínea RBL-2H3) se sembraron en placas ELISA
(Nunc, Dinamarca) (100 \mul: células 4 x 104) en medio de cultivo
(RPMI 1649100 ml, FCS al 10%, L-Glutamine 4 mM,
Piruvato de sodio 2 mM, HEPES 10 mM,
2-Mercaptoetanol 100 mM, Pen/Strep al 1%) durante
toda una noche a 37ºC, CO_{2} al 5%.
Las células se cargaron con 2 \mul de suero
obtenido de ratones inmunizados con rDer p 2, fragmento 1 de rDer p
2, fragmento 2 de rDer p 2 y rDer p 2 híbrido durante 2 horas a
37ºC, se lavaron dos veces con 200 \mul de tampón Tyrode/BSA
(NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 0,5 mM MgCl_{2}, CaCl_{2} 1,8 mM,
NaH_{2}PO_{4} 0,4 mM, D-glucosa 5,6 mM,
NaHCO_{3} 12 mM, ácido
N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico
(HEPES) 10 mM, albúmina de suero bovino al 0,1%, pH 7,2)
(Sigma-Aldrich, Austria) y se estimularon con Der p
2 (c = 0,3 \mug/ml). La liberación total de
\beta-hexosaminidasa se indujo por medio de la
adición de Triton X-100 10 ml al 10% v/v (Merck,
Alemania).
Para medir la liberación de
\beta-hexosaminidasa, se incubó 50 \mul de una
solución del ensayo
(4-metilumbeliferil-N-acetil-p-D-glucosaminida
80 \muM en tampón de citrato 0,1M, pH 4,5) con 50 \mul de
sobrenadante durante 1 hora a 37ºC, CO_{2} al 5%.
La reacción se detuvo por medio de la adición de
tampón glicina 100 \mul (glicina 0,2M, NaCl 0,2M, pH 10,7) y se
midió la fluorescencia en \lambdaex: 360nm \lambdaem: 465nm
usando un lector de microplacas de fluorescencia (Dynatech MR 7000,
Dynatech Laboratories, EE.UU.). Los resultados se muestran como
porcentajes medios de la liberación total de
\beta-hexosaminidasa.
Para investigar si la vacunación con derivados
de rDer p 2 induce respuestas inmunes alérgicas al alérgeno Der p 2
de tipo salvaje, los ratones se inmunizaron con rDer p 2, fragmento
1 de rDer p 2, fragmento 2 de rDer p 2 y rDer p 2 híbrido,
respectivamente. Después, las muestras de suero de los ratones se
usaron para cargar células RBL para cuantificar la respuesta inmune
alergénica al alérgeno rDer p 2 de tipo salvaje por medio de
experimentos de desgranulación de RBL. La liberación obtenida con el
alérgeno rDer p 2 de tipo salvaje en RBL cargadas con anticuerpos
de ratón del fragmento 1 de anti-rDer p 2, fragmento
2 de anti-rDer p 2 y anti-rDer p 2
híbrido estaba entre el 0% y el 16,6% (media del 6,4%), entre el
0,2% y el 28,6% (media del 13,2%) y entre el 4,7% y el 37,1% (media
del 18,3%), mientras que las RBL, cargadas con anticuerpos
anti-rDer p 2 de tipo salvaje liberados entre el 35%
y el 39% (media del 37%) después de la estimulación con rDer p 2 de
tipo salvaje (Fig. 16).
Con el fin de analizar si los anticuerpos
inducidos después de la inmunización con MP 12 reconocen profilinas
de pólenes así como de alimentos derivados de plantas, se llevaron a
cabo experimentos por ELISA.
Las profilinas del polen de festuca roja (Phl p
12), polen de abedul (Bet v 2), polen de artemisa (Art v 4) y de
diferentes alimentos vegetales (anacardo (Ana c ), apio (Api g 4),
plátano (Mus xp 1), avellana (Cor a 2), y zanahoria (Dau c 4)) se
cubrieron sobre placas ELISA (5 mg/ml) y se incubaron con diluciones
en serie de antisuero de conejo (1:2000-1:64000).
Los anticuerpos de conejo unidos se detectaron con un antisuero de
burro anti-conejo marcado con POX.
MP 12 indujo una respuesta de anticuerpo IgG que
se podía comparar con la inducida con Phl p 12 de tipo salvaje
(Fig. 17). Ambos, los anticuerpos IgG inducidos por MP12 y Phl p 12
reaccionaron de forma cruzada con profilinas de pólenes (césped,
árboles, maleza) y profilinas de alimentos derivados de plantas
(Fig. 17).
La capacidad de IgG de conejo inducido por MP12
para inhibir la unión de IgE de pacientes alérgicos a Phl p 12, a
profilinas de pólenes distintos y a profilinas derivadas de
alimentos vegetales se investigó por medio de experimentos de
competición ELISA.
Se cubrieron placas ELISA (Nunc Maxisorp,
Dinamarca) con profilinas de festuca roja (rPhl p 12), polen de
abedul (rBet v 2), zanahoria (rDau c 4), avellana (rCor a 2),
plátano (rMus xp 1) y anacardo (rAna c 1) y se preincubaron con una
dilución 1:50 del antisuero anti-Phl p 12, el
antisuero anti-MP12 y, a efectos de control, con
los sueros preinmunes correspondientes. Después de lavar, las placas
se incubaron con sueros diluidos 1:3 de ocho pacientes
sensibilizados a las profilinas y los anticuerpos de IgE unidos se
detectaron con un antisuero anti-IgE de cabra humano
marcado con HRP (KPL, EE.UU.), diluido 1: 2500. El porcentaje de
inhibición de la unión de IgE conseguida por medio de la
preincubación con los antisueros anti-Phl p 12 y
anti-MP12 se calculó como sigue: % de inhibición de
la unión de IgE = 100-ODI/ODP x 100. ODI y ODP
representan las extinciones después de la preincubación con los
sueros inmunes de conejos y los sueros preinmunes correspondientes,
respectivamente (Tabla 7).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La inhibición media de la unión de IgE a
profilinas de polen de festuca roja conseguida con anticuerpos
inducidos por Phl p 12 y anticuerpos inducidos por MP 12 se podía
comparar con el 83,8% y el 72,3%, respectivamente (Tabla 7). La
unión de IgE a la profilina de polen de abedul, Bet v 2, se inhibió
aún más fuerte con anticuerpos específicos de MP 12 (inhibición
media al 74,5%) que con anticuerpos inducidos por Phl p 12
(inhibición media al 64,8%). La unión de IgE a profilinas de
alimentos vegetales se inhibió con ambos antisueros a un grado muy
similar (Cor a 2: inhibición media al 62,3% con
anti-Phl p 12-IgG, 58,1% con
anti-MP 12-IgG; Dau c 4: inhibición
media al 73,3% con anti-Phl p
12-IgG, 74,6% con anti-MP
12-IgG; Ana c 1: inhibición media al 56,8% con
anti-Phl p 12-IgG, 53,6% con
anti-MP 12-IgG). Solamente la unión
de IgE a profilina de plátano, Mus xp 1, se inhibió menos con
anti-Mp 12-IgG (36,1%) que con IgG
inducido por anti-Phl p 12 (71,4%) (Tabla 7).
La profilina representa un alérgeno que está
expresado en todas las células eucarióticas y representa así un
pan-alérgeno que puede inducir alergias inhalativas
(por ejemplo, rinoconjuntivitis, asma) así como síndromes de
alergia oral después de la ingestión oral (prurito e hinchazón de
labios y la lengua) en pacientes sensibles.
El derivado Phl p 12 intercambiado, MP12, induce
anticuerpos de IgG después de la inmunización que reconocen
profilinas a partir tanto de pólenes como de alimentos derivados de
plantas. Los anticuerpos inducidos por MP 12 inhiben IgE del suero
de pacientes que se une a profilinas a partir de pólenes y también a
profilinas derivadas de alimentos vegetales. Así pues, el MP 12 es
adecuado para el tratamiento de sensibilización cruzada de
polen-alimento atribuible a la alergia a
profilinas.
Claims (29)
1. Procedimiento para producir derivados de
alérgenos de proteínas de tipo salvaje con actividad alergénica
reducida, caracterizado por las siguientes etapas:
- -
- proporcionar un alérgeno de proteína de tipo salvaje con una actividad alergénica,
- -
- dividir dicho alérgeno de proteína de tipo salvaje en dos partes, teniendo dichas dos partes una actividad alergénica reducida o careciendo de actividad alergénica y
- -
- volver a unir dichos dos fragmentos en orientación inversa.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado por que dicho derivado está
producido en huésped en forma de una proteína recombinante, en
especial con un huésped con capacidad de expresión elevada.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado por que dicho alérgeno de
tipo salvaje se selecciona del grupo de profilinas, en especial Phl
p 12, alérgenos de abedul, en especial Bet v 4, alérgenos de ácaros
del polvo, en especial Der p 2, alérgenos de ácaros de
almacenamiento, en especial Lep d 2, alérgenos de festuca roja, en
especial Phl p 7.
4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la
reducción en la actividad alergénica se mide por medio de una
reducción de la inhibición de la capacidad de unión de IgE de al
menos el 10%, preferiblemente al menos el 20%, especialmente al
menos el 30%, en comparación con el alérgeno de tipo salvaje.
5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la
reducción en la actividad alergénica se mide por medio de la
ausencia de la unión de anticuerpos de IgE de sueros de pacientes
sensibles a los alérgenos a una transferencia por puntos de dicho
derivado.
6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dichos
derivados se combinan con un excipiente farmacéuticamente aceptable
y se terminan en una preparación farmacéutica.
7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que dichos
derivados se combinan con un adyuvante de vacuna adecuado y se
terminan en una preparación de vacuna farmacéuticamente
aceptable.
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, caracterizado por que dichos derivados se
combinan con alérgenos adicionales para proporcionar una vacuna de
combinación.
9. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, caracterizado por que dicho alérgeno es un
alérgeno de tipo salvaje, en especial una mezcla de alérgenos de
tipo salvaje, alérgenos de tipo salvaje recombinantes, derivados de
alérgenos de proteínas de tipo salvaje o mezclas de los mismos.
10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado por que dicha
preparación contiene adicionalmente un extracto de alérgeno.
11. Derivado de alérgeno de un alérgeno de
proteína de tipo salvaje, teniendo dicho alérgeno de proteína de
tipo salvaje una secuencia de aminoácidos de 1 a Z,
caracterizado por que dicho derivado adyacentemente contiene
-en orientación N-terminal o
C-terminal- los dos fragmentos de alérgeno de tipo
salvaje X a Z y 1 a X, teniendo dichos dos alérgenos de tipo salvaje
una actividad alergénica reducida o ausencia de actividad
alergénica.
12. Derivado de alérgeno de acuerdo con la
reivindicación 11, caracterizado por que X a Z y 1 a X son al
menos residuos de 30 aminoácidos de longitud, preferiblemente al
menos 50 residuos de aminoácidos, en especial al menos 60 residuos
de aminoácidos.
13. Derivado de alérgeno de acuerdo con la
reivindicación 11 ó 12, caracterizado por que X a Z y 1 a X
difieren en longitud en el 50% o menos, preferiblemente en el 30% o
menos, en especial en el 20% o menos.
14. Derivado de alérgeno de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado por
que dicho alérgeno de tipo salvaje se selecciona de un alérgeno de
tipo I, preferiblemente de un alérgeno de la tabla A, más preferido
un alérgeno del polen de la festuca roja (Phelum pratense),
en especial Phl p 12, polen del abedul (Betula verrucosa), en
especial Bet v 4, veneno contra la chaqueta amarilla (Vespula
vulgaris), veneno contra la avispa de papel (Polistes
annularis), polen de la Parietaria judaica, polen del césped de
centeno, alérgenos de los ácaros del polvo, en especial Der p 2, o
mezclas de los mismos.
\newpage
15. Composición de alérgeno que comprende un
derivado de alérgeno de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14 y alérgenos adicionales, preferiblemente
alérgenos de tipo salvaje, en especial una mezcla de alérgenos de
tipo salvaje, alérgenos de tipo salvaje recombinantes, derivados de
alérgenos de proteínas de tipo salvaje o mezclas de los mismos.
16. Composición de alérgeno de acuerdo con la
reivindicación 15, caracterizada por que dicha composición
contiene adicionalmente un extracto de alérgeno.
17. Composición de alérgeno de acuerdo con las
reivindicaciones 15 a 16, caracterizada por que contiene un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
18. Uso de un derivado de alérgeno o una
composición de alérgeno de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 17 para la preparación de un medicamento de
inmunoterapia específico de alérgeno.
19. Uso de un derivado de alérgeno o una
composición de alérgeno de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 17 para la preparación de un medicamento para
la inmunización pasiva.
20. Uso de un derivado de alérgeno o una
composición de alérgeno de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 17 para la preparación de un medicamento para
la inmunización profiláctica.
21. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 20, caracterizado por que dicho
medicamento contiene adicionalmente adyuvantes, diluyentes,
conservantes o mezclas de los mismos.
22. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 21, caracterizado por que comprende de
10 ng a 1 g, preferiblemente de 100 ng a 10 mg, en especial de 0,5
\mug a 200 \mug de dicho derivado de alérgeno recombinante.
23. Procedimiento para producir un derivado de
alérgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a
17, caracterizado por las siguientes etapas:
- -
- proporcionar una molécula de ADN que codifica un derivado de alérgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17,
- -
- transformar una célula hospedadora con dicha molécula de ADN y
- -
- expresar dicho derivado en dicha célula hospedadora y aislar dicho derivado.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 23, caracterizado por que dicho huésped es un
huésped con capacidad de expresión elevada.
25. Procedimiento para producir un derivado de
alérgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a
17, caracterizado por que está producido por síntesis
química.
26. Uso de un derivado de profilina que se puede
obtener a partir de una primera molécula de profilina de tipo
salvaje por medio de un procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 10 ó 23 a 25 o un derivado de alérgeno
de una primera molécula de profilina de tipo salvaje de acuerdo con
las reivindicaciones 11 a 14 para la fabricación de un medicamento
para la prevención o el tratamiento de enfermedades alérgicas
causadas por una segunda molécula de profilina de tipo salvaje.
27. Uso de acuerdo con la reivindicación 26,
caracterizado por que dicha primera y dicha segunda molécula
de profilina se seleccionan del grupo que está constituido por Phl p
12, Bet v 2, Art v 4, Ana c, Api g 4, Mus xp 1, Cor a 2, y Dau c
4.
28. Uso de acuerdo con la reivindicación 26,
caracterizado por que dicha primera molécula de profilina es
Phl p 12 y dicha segunda molécula de profilina se selecciona del
grupo que está constituido por Bet v 2, Art v 4, Ana c, Api g 4, Mus
xp 1, Cor a 2, y Dau c 4.
29. Uso de acuerdo con la reivindicación 27 ó 28
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o
prevención de sensibilización cruzada de
polen-alimento atribuible a la alergia a
profilinas.
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