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ES2318898T3 - Antigenos tumorales basados en el producto del gen wt1 supresor de tumor. - Google Patents

Antigenos tumorales basados en el producto del gen wt1 supresor de tumor. Download PDF

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ES2318898T3
ES2318898T3 ES99933205T ES99933205T ES2318898T3 ES 2318898 T3 ES2318898 T3 ES 2318898T3 ES 99933205 T ES99933205 T ES 99933205T ES 99933205 T ES99933205 T ES 99933205T ES 2318898 T3 ES2318898 T3 ES 2318898T3
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ES
Spain
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cells
baselineskip
peptide
tumor
seq
Prior art date
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ES99933205T
Other languages
English (en)
Inventor
Haruo Sugiyama
Yoshihiro Oka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
International Institute of Cancer Immunology Inc
Original Assignee
International Institute of Cancer Immunology Inc
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Publication date
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Abstract

Un péptido antigénico tumoral de la proteína WT1, en el que dicho péptido es uno cualquiera de los siguientes: D b 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 5) D b 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 7), y WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 8).

Description

Antígenos tumorales basados en el producto del gen WT1 supresor de tumor.
Campo técnico
La presente invención se refiere a antígenos tumorales basados en los productos de WT1, el gen supresor tumoral de tumor de Wilms. Los antígenos tumorales son útiles como vacunas anticancerosas contra tumores de la sangre tales como leucemia, síndromes mielodisplásicos, mieloma múltiple y linfoma maligno, o tumores sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinativas, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino y cáncer de ovario, así como todos los cánceres que expresan WT1.
Antecedentes de la técnica
Los mecanismos inmunitarios para rechazar material extraño comprenden generalmente: la inmunidad humoral que implica macrófagos que reconocen antígenos y funcionan como células presentadoras de antígeno, células T auxiliares que activan otras células T etc. reconociendo el antígeno presentado por dichos macrófagos y produciendo entonces diversas citocinas, células B que se diferencian en células productoras de anticuerpo mediante la acción de dichas linfocinas, etc., así como la inmunidad celular en la que las células T citotóxicas experimentan diferenciación en respuesta a la presentación de antígeno y atacan y destruyen las células diana.
Actualmente, la inmunidad cancerosa se considera principalmente que está derivada de la inmunidad celular en la cual participan las células T citotóxicas. En la inmunidad cancerosa implicada con células T citotóxicas, las células T precursoras, que reconocían antígeno tumoral presentado en forma de un complejo entre el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y el antígeno tumoral, se diferencian y propagan produciendo células T citotóxicas, que atacan y destruyen células tumorales. En ese momento, las células tumorales presentan, sobre la superficie de las mismas, el complejo de antígeno MHC de clase I y antígeno tumoral, al que están orientadas las células T citotóxicas (Cur. Opin. Immunol., 5: 709, 1993; Cur. Opin, Immunol, 5: 719, 1993; Cell, 82: 13, 1995; Immunol. Rev., 146: 167, 1995).
El antígeno tumoral anterior presentado por el antígeno MHC de clase I sobre la superficie de las células tumorales diana se considera que es un péptido compuesto por aproximadamente 8 a 12 aminoácidos producido después de que la proteína antigénica sintetizada en las células tumorales experimentara procesamiento por proteasas intracelulares (Cur. Opin. Immunol., 5: 709, 1993; Cur. Opin, Immunol., 5: 719, 1993; Cell, 82: 13, 1995; Immunol. Rev., 146: 167, 1995).
Actualmente, se están buscando proteínas antigénicas para diversos cánceres, pero se han demostrado pocas como antígenos específicos de cáncer.
Se aisló WT1, un gen supresor del tumor de Wilms (gen WT1), del cromosoma 11p13 como uno de los genes causantes del tumor de Wilms basándose en el análisis del síndrome WAGR que estaba complicado con tumor de Wilms, aniridia, anomalía urogenital, retardo mental, etc. (Gessler, M. et al., Nature, 343: 774-778 (1990)), y el ADN genómico es de aproximadamente 50 kDa y está compuesto por 10 exones, de los cuales el ADNc es de aproximadamente 3 kb. La secuencia aminoacídica deducida del ADNc es como se expone en la SEQ ID NO: 1 (Mol. Cell. Biol., 11: 1707, 1991).
A partir de los hechos de que el gen WT1 está altamente expresado en leucemia humana y de que el tratamiento de células leucémicas con oligómeros antisentido de WT1 da como resultado la supresión del crecimiento celular (publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) Nº 9-104627), se ha sugerido que el gen WT1 promueve el crecimiento de células leucémicas. Además, se ha encontrado que WT1 está altamente expresado en tumores sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células pulmonares, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino y cáncer de ovario (solicitud de patente japonesa (Tokugan) 9-191635), y se ha demostrado que el gen WT1 es un nuevo marcador tumoral en leucemia y tumores sólidos. Sin embargo, no se ha confirmado que los productos de expresión del gen WT1 sean antígenos específicos de tumor útiles como vacuna para el cáncer.
Compendio de la invención
Por tanto, la presente invención pretende confirmar la posibilidad de que el producto de expresión del gen WT1 sea un antígeno tumoral y proporcione un nuevo antígeno tumoral.
Después de una intensa investigación para resolver los problemas anteriores, los inventores de la presente invención han sintetizado polipéptidos que tienen de 7 a 30 aminoácidos contiguos que contienen al menos un aminoácido que se espera que funcione como aminoácido de anclaje en la unión con MHC de clase I y MHC de clase II de ratón y humano en la secuencia aminoacídica del producto de expresión del gen WT1, han confirmado que estos péptidos se unen a proteínas MHC y, cuando se unen al antígeno MHC de clase I, inducen células T citotóxicas y ejercen efectos citocidas sobre la célula diana, y han completado así la presente invención.
Por tanto, la presente invención proporciona un antígeno tumoral que comprende un producto de expresión de WT1 de ratón o una porción del mismo. Según una realización preferida, la presente invención proporciona un antígeno tumoral que comprende, como ingrediente activo, un péptido que tiene de 6 a 30 aminoácidos que contiene un aminoácido de anclaje necesario para la unión a las moléculas de MHC en la secuencia aminoacídica como se expone en la SEQ ID NO: 1, que corresponde al ADNc de WT1.
Además, la presente invención proporciona un antígeno tumoral que comprende, como ingrediente activo, un péptido que tiene de 7 a 30 aminoácidos que contiene un aminoácido de anclaje para unión a las moléculas de MHC en la secuencia aminoacídica como se expone en la SEQ ID NO: 2, que corresponde al ADNc de WT1 humano.
La presente invención proporciona también una vacuna para el cáncer que comprende el antígeno tumoral anterior.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una gráfica que muestra la relación de células CD4^{+} y CD8^{+} en citometría de flujo en células inmunizadas con el péptido D^{b} 126 y células no inmunizadas en el Ejemplo 1.
La Figura 2 es una gráfica que compara el efecto citocida de las células inmunizadas con el péptido D^{b} 126 sobre las células diana sometidas a pulsos con péptido D^{b} 126 y células diana no sometidas a pulsos en el Ejemplo 2.
La Figura 3 es una gráfica que tiene el mismo significado que en la Figura 2.
La Figura 4 es una gráfica en la que A representa el efecto citocida de CTL inducidos por el péptido D^{b} 126 en las células T2 sometidas a pulsos con el péptido D^{b} 126 en el Ejemplo 3, y B representa el efecto citocida de CTL inducidos por el péptido WH 187 en las células T2 sometidas a pulsos con el péptido WH 187 en el Ejemplo 3.
La Figura 5 es un diagrama que muestra el resultado del análisis FACS de los marcadores superficiales de CTL inducidos por el péptido D^{b} 126 (células CD19 y células CD3).
La Figura 6 es un diagrama similar a la Figura 5 con respecto a las células CD4 y las células CD8.
La Figura 7 es un diagrama similar a la Figura 5 con respecto a las células CD56.
La Figura 8 es un diagrama que muestra el resultado del análisis FACS de los marcadores superficiales de CTL inducidos por el péptido WH 187 (células CD19 y células CD3).
La Figura 9 es un diagrama similar a la Figura 8 con respecto a las células CD4 y las células CD8.
La Figura 10 es un diagrama similar a la Figura 8 con respecto a las células CD56.
La Figura 11 es una gráfica que muestra el efecto de anticuerpo anti-HLA-A2.1 sobre la lisis específica de células T2 sometidas a pulsos con el péptido D^{b} 126 mediante CTL específicos de péptido D^{b} 126.
La Figura 12 es una gráfica que compara la actividad lítica de CTL específicos del péptido D^{b} 126 sobre las células diana que expresan o no expresan WT1. En la figura, a muestra el resultado obtenido cuando la relación E:T es de 7,5:1 y b muestra el resultado obtenido cuando la relación E:T es de 15:1.
La Figura 13 es una gráfica que compara la actividad lítica de CTL específicos del péptido D^{b} 126 sobre células tumorales (FBL3) que expresan inherentemente WT1 y células tumorales (RMA) que no expresan WT1.
La Figura 14 es una gráfica que compara la actividad lítica de CTL específicos del péptido D^{b} 126 sobre células que se han transformado con el gen WT1 y las mismas células que no se han transformado.
La Figura 15 es una gráfica que muestra el efecto del anticuerpo anti-H-2D^{b} sobre la citotoxicidad de CTL específicos del péptido D^{b} 126.
La Figura 16 es una gráfica que muestra el efecto inmunitario in vivo cuando se inmunizaban ratones con el péptido D^{b} 126 como vacuna.
La Figura 17 es una gráfica que muestra el efecto inmunitario cuando se administra un plásmido que expresa WT1 a ratones como vacuna de ADN.
La Figura 18 es una gráfica que muestra la ausencia de efecto inmunitario cuando se administra un plásmido que no expresa WT1.
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Mejor modo de llevar a cabo la invención
Según la presente invención, se seleccionaron K^{b} y D^{b} de MHC de clase I de ratón y A* 0201 de HLA humano como base para diseñar péptidos antigénicos tumorales, y se seleccionaron péptidos que se esperaba que tuvieran una alta afinidad con ellos.
Basándose en la descripción de Immunogenetics 41: 178-228 (1995), se espera que Phe y Tyr en la posición 5 y Leu y Met en la posición 8, etc., sean aminoácidos de anclaje para unión a K^{b}, y se espera que Asn en la posición 5 y Met e Ile en la posición 9, etc., sean aminoácidos de anclaje para unión a D^{b}.
Es también conocido que el tamaño del péptido antigénico tumoral presentado por MHC de clase I sobre la superficie de células tumorales es de aproximadamente 8 a 12. Por lo tanto, el péptido antigénico tumoral de la presente invención es un péptido que tiene de 7 a 30 aminoácidos contiguos que contiene un aminoácido de anclaje en la secuencia aminoacídica del producto de expresión del gen WT1 como se expone en la SEQ ID NO: 1. El número de aminoácidos es preferiblemente de 8 a 12, por ejemplo 8 ó 9.
Como realización específica de la presente invención, se usaron los siguientes péptidos que comprenden 8 aminoácidos:
K^{b} 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu (SEQ ID NO: 3), y
K^{b} 330 Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu (SEQ ID NO: 4) como péptidos de unión a K^{b} de MHC de clase I, y se usaron los siguientes péptidos que comprenden 9 aminoácidos:
D^{b} 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 5),
D^{b} 221 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met (SEQ ID NO: 6), y
D^{b} 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 7) como péptidos de unión a D^{b} de MHC de clase I. Los aminoácidos subrayados en las secuencias anteriores son aquellos aminoácidos que se espera que funcionen como anclajes.
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Se midió entonces entre estos péptidos, para K^{b} 45 y K^{b} 330, la actividad de unión con K^{b} de MHC de clase I, y para D^{b} 126, D^{b} 221 y D^{b} 235, se midió la actividad de unión con D^{b} de MHC de clase I usando la estirpe celular (RMA-S), que no expresa el péptido antigénico endógeno (vacío), y la estirpe celular (RMA-S) que expresa las moléculas K^{b} y D^{b}.
Por tanto, se cultivó RMA-S a 26ºC para efectuar una alta expresión de MHC de clase I, y se incubaron las células cultivadas con las disoluciones de los péptidos de ensayo a 37ºC durante 1 hora. Esto hace inestable la molécula de MHC, que no se une al péptido, conduciendo a su desaparición de la superficie celular y dejando moléculas de MHC de clase I solas que se unen al péptido. Usando entonces anticuerpo monoclonal marcado fluorescentemente que reconoce MHC de clase I (K^{b}, D^{b}), se tiñeron células RMA-S. Finalmente, se calculó la constante de disociación de la unión a partir de la cantidad media de fluorescencia por célula (Immunol. Lett., 47: 1, 1995).
Como resultado, se obtuvo el siguiente resultado:
K^{b} 45 -4,5784838 (log)
K^{b} 330 -5,7617732
D^{b} 126 -6,2834968
D^{b} 221 -5,7545398
D^{b} 235 -6,1457624
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Como se manifiesta anteriormente en la presente memoria, ambos tienen una afinidad de unión de fuerte a moderada (valor de K_{d}) con K^{b} o D^{b}, y se usó en el siguiente experimento el péptido D^{b} 126 que tiene la afinidad de unión más alta.
También para seres humanos, basándose en la descripción de Immunogenetics 41: 178-228 (1995), se espera que Leu y Met en la posición 2 desde el extremo N y Val y Leu en la posición 9 desde el extremo N sean aminoácidos de anclaje para unión a HLA-A* 0201. Por tanto, se sintetizaron los dos siguientes péptidos que tienen 9 aminoácidos que satisfacen el requisito anterior en la secuencia aminoacídica de proteína WT1 humana (Mol. Cell. Biol., 11: 1707-1712, 1991) (SEQ ID NO: 2):
D^{b} 126; Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 5)
(igual que la secuencia de D^{b} 126 en ratón)
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WH 187; Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 8)
(se subrayan los aminoácidos de anclaje).
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Se midió la actividad de unión de los péptidos anteriores con HLA-A* 0201 del modo siguiente:
Se incubaron los péptidos anteriores y células T2 que tienen moléculas HLA-A* 0201 vacías (J. Immunol., 150: 1763, 1993; Blood, 88: 2450, 1996) a 37ºC durante 1 hora, y se tiñeron entonces las células T2 con anticuerpo monoclonal marcado fluorescentemente que reconoce HLA-A2.1 para calcular la constante de disociación de la unión basada en la cantidad media de fluorescencia por célula en el análisis FACS.
Actividad de unión
Péptido K_{d} (M)
D^{b} 126 1,89 x 10^{-6}
WH 187 7,61 x 10^{-6}
Los dos péptidos tienen una afinidad de unión de grado moderado o superior.
Usando los D^{b} 126 y WH 187 anteriores como péptido que puede combinar con moléculas de MHC de clase I humanas, se realizó el experimento descrito a continuación en la presente memoria.
La presente invención se refiere también a una vacuna para el cáncer que comprende el antígeno anterior como ingrediente activo. Esta vacuna puede usarse para la profilaxis o el tratamiento de tumores de la sangre tales como leucemia, síndromes mielodisplásicos, mieloma múltiple y linfoma maligno, o tumores sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinativas, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino y cáncer de ovario. La vacuna puede administrarse mediante administración oral o parenteral tal como administración intraperitoneal, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa y nasal.
Como método de administración de la vacuna de la presente invención, puede usarse un método en el que se recogen células mononucleares de sangre periférica del paciente, de la que se retiran las células dendríticas, y se someten a pulsos del péptido de la presente invención, que se devuelven después al paciente mediante administración subcutánea, etc.
Las vacunas pueden contener, además del péptido administrado como ingrediente activo anterior, portadores farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, coadyuvantes adecuados tales como un gel mineral como hidróxido de aluminio; un tensioactivo tal como lisolecitina, poliol Pluronic; polianiones; un péptido o una emulsión de aceite. Como alternativa, pueden usarse otros agregados que pueden mezclarse con liposomas o combinarse con polisacáridos y/o vacunas. La dosificación es generalmente de 0,1 \mug a 1 mg/kg al día.
En la presente invención, puede usarse también ADN que codifica la vacuna polipeptídica anterior como vacuna (vacuna de ADN). Por tanto, después de insertar un ácido nucleico que codifica WT1 o una porción del mismo, preferiblemente ADN, en un vector adecuado, preferiblemente un vector de expresión, se administra a un animal para producir inmunidad cancerosa. Se muestra un ejemplo específico en el ejemplo 9.
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Ejemplos
Los siguientes Ejemplos demostrarán entonces que el péptido de la presente invención es útil como antígeno tumoral o vacuna para el cáncer.
Ejemplo 1
Se inyectaron por vía intraperitoneal 100 \mug de péptido D^{b} 126, 200 \mug de lactato deshidrogenasa porcina y 0,5 ml de coadyuvante de Freund incompleto a ratones C57BL/6 dos veces por semana para tratamiento de inmunización. Una semana después del tratamiento de inmunización, se extrajo el bazo de ratón, del que se prepararon suspensiones de células esplénicas. Por otro lado, se incubaron las células esplénicas irradiadas de ratones singénicos sometidas a pulsos con péptido D^{b} 126 con una disolución que contenía 50 \mug/ml de péptido a 37ºC durante 30 minutos, que se usó como célula presentadora de antígeno.
Se cocultivaron las células esplénicas inmunizadas anteriores y las células esplénicas irradiadas durante 5 días para inducir o preparar células T citotóxicas. Por otro lado, se realizó un ensayo de mortalidad usando células EL-4 marcadas con europio (que expresan K^{b} y D^{b}) sometidas a pulsos con el péptido D^{b} 126 (incubadas a 37ºC durante 30 minutos con una disolución de péptido 100 \mug/ml) como célula diana en un método estándar con el siguiente procedimiento (Tabla 1).
Como resultado, cuando se usaron como diana células EL-4 sometidas a pulsos con D^{b} 126, se observaron efectos citocidas, pero cuando se usaron como diana células EL-4 no sometidas a pulsos con D^{b} 126, se observaron pocos efectos citocidas.
TABLA 1
1
Se tiñeron entonces las muestras de bazo que exhibían efectos citocidas significativos en el ensayo de mortalidad con anticuerpo anti-CD4 o anticuerpo anti-CD8 marcados fluorescentemente, que se sometieron entonces a citometría de flujo para analizar la expresión de CD4 y CD8.
Como resultado, como se muestra en la Figura 1, en las células esplénicas inmunizadas con el péptido D^{b} 126 hubo un aumento de las células CD8^{+} representadas por las células T citotóxicas y la relación de células CD8^{+} a células CD4^{+},representadas por las células T auxiliares, etc., aumentaba inversamente en comparación con las células esplénicas de control no inmunizadas.
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Ejemplo 2
Se prepararon de la siguiente manera células dendríticas (DC) derivadas de la médula ósea de ratones C57BL/6. Según el método estándar, se cultivaron las células de médula ósea en presencia de GM-CSF para preparar células dendríticas derivadas de médula ósea (J. Exp. Med. 182: 255, 1995).
Se incubaron las células dendríticas cultivadas durante 7 días, OVAII (ovoalbúmina II) 10 \muM y péptido D^{b} 126 1 \muM durante 3 horas y entonces se lavaron.
Se inyectaron entonces las células DC anteriores por vía intradérmica en las almohadillas de las patas traseras y delanteras de ratones C57BL/6, y el día 5 se retiraron los nódulos linfáticos para preparar suspensiones celulares. Por otro lado, se prepararon células B7.1-RMA-S (células RMA-S transfectadas con un gen que codifica B7.1, que es una molécula coestimulante) sometidas a pulsos con D^{b} 126 e irradiadas. Se mezclaron entonces la suspensión celular anterior derivada de nódulo linfático relevante y células B7.1-RMA-S y se cultivaron para reestimulación in vitro.
El día 5 después de la reestimulación in vitro, se realizó entonces un ensayo de mortalidad usando las células RMA-S marcadas con ^{51}Cr como diana. Cuando se usó 1/8 de los linfocitos totales recuperados el día 5 después de la reestimulación como célula efectora, se estableció la relación E/T como la más alta (1,0).
Como se muestra en las Figuras 2 y 3, las células efectoras derivadas de los nódulos linfáticos de ratones inmunizados con el péptido D^{b} 126 destruyeron las células diana sometidas a pulsos con dicho péptido, pero no destruyeron las células diana que no se sometieron a pulsos con dicho péptido.
El análisis de la relación de células CD4^{+} y células CD8^{+} mediante citometría de flujo realizado como en el ejemplo 1 muestra que CD4:CD8 = 1:1,4 a 1,7 y que, en las células de ratón inmunizadas con el péptido D^{b} 126, aumentaban las células CD8^{+} y que se invertía la relación de células CD4^{+}:células CD8^{+} (aproximadamente 2:1 en las células de control) en las células inmunizadas con el péptido D^{b} 126 en comparación con las células de ratón no inmunizadas (de control).
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Ejemplo 3
Se cocultivaron células T2 (5 \times 10^{4}) que se irradiaron después de incubación durante 1 hora con el péptido D^{b} 126 o WH 187 (40 \mug/ml) y células mononucleares de sangre periférica (1 \times 10^{5}) de un ser humano sano que tenían HLA-A* 0201. Una semana después, se añadieron al sistema de cultivo anterior células T2 que se habían irradiado después de incubar durante 1 hora con el péptido (20 \mug/ml) para reestimulación. A partir del día siguiente, se añadió IL-2 humana (concentración final 100 JRU/ml) al cultivo.
Posteriormente, después de repetir 5 veces la estimulación con las células T2 que se habían irradiado después de someterse a pulsos con el péptido, se realizó un ensayo de mortalidad usando, como diana, las células T2 sometidas a pulsos con el péptido o las células T2 no sometidas a pulsos con el péptido. Se sometieron los marcadores de superficie de los CTL inducidos a análisis FACS.
Se realizó el ensayo de mortalidad según el método estándar, usando como diana las células T2 marcadas con europio sometidas a pulsos con el péptido.
Efector: la relación diana (relación E/T) es 10:1.
Tiempo de cocultivo: 3 horas.
Concentración del péptido en el cultivo: 5 \mug/ml.
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Se muestra el resultado en la Figura 4. En la Figura 4, A muestra el efecto citocida de CTL inducidos usando péptido D^{b} 126 sobre células T2 sometidas a pulsos con el péptido D^{b} 126, y B en la Figura 4 muestra el efecto citocida de CTL inducidos usando el péptido WH 187 sobre células T2 sometidas a pulsos con el péptido WH 187.
En cualquier caso, se observaron efectos citocidas más potentes en las células T2 sometidas a pulsos con el péptido.
Se muestran los resultados del análisis FACS en las Figuras 5 a 10. Las Figuras 5 a 7 muestran los resultados de CTL humanos inducidos con el péptido D^{b} 126, indicando que la mayoría de las células eran CD8-positivas. Las Figuras 8 a 10 muestran los resultados de CTL humanos inducidos con el péptido WH 187. Las células CD4 positivas y células CD8 positivas eran casi iguales en número.
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Ejemplo 4
Para ensayar la dependencia de MHC de la actividad citolítica de CTL específicos del péptido D^{b} 126, se usó anticuerpo monoclonal anti-HLA-A2.1 para bloquear la actividad citolítica de CTL sobre las células T2 sometidas a pulsos con el péptido. Se midió la citólisis específica de las células T2 sometidas a pulsos con el péptido D^{b} 126 en presencia o ausencia de anticuerpo monoclonal (BB7.2) que bloquea la molécula HLA-A2.1 a una relación E/T de 5:1.
Se muestra el resultado en la Figura 11. En la figura, el símbolo * representa el resultado obtenido usando anticuerpo monoclonal anti-H-2K^{b} en lugar de anticuerpo monoclonal anti-HLA-A2.1. Como puede observarse en la figura, la adición de 60 \mug/ml de anticuerpo monoclonal anti-HLA-A2.1 daba como resultado la reducción de la citotoxicidad a la de fondo de la citólisis de células T2. Un anticuerpo monoclonal no relacionado (anticuerpo monoclonal anti-H-2K^{b} Y3) con el mismo isotipo no tenía efectos sobre la lisis de células T2.
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Ejemplo 5
Se ensayó si los CTL específicos del péptido D^{b} 126 pueden destruir las células leucémicas positivas de HLA-A2.1 que expresan inherentemente WT1. Como célula diana, se usaron células TF1 (expresan WT-1, positivas de HLA-A2.1), células JY (no expresan WT-1, positivas de HLA-A2.1), y células Molt-4 (expresan WT1, negativas de HLA-A2.1) y se midió la citotoxicidad a una relación E:T de 7,5:1 (a) ó 15:1 (b).
Se muestra el resultado en la Figura 12. Los CTL específicos del péptido D^{b} 126 exhibían una citotoxicidad significativa por la célula leucémica TF1 positiva de HLA-A2.1 que expresa inherentemente WT1, pero exhibían una citólisis a nivel de fondo por células Molt-4 (que expresan WT1, negativas de HLA-A2.1) o células JY (que no expresan WT1, positivas de HLA-A2.1).
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Ejemplo 6
Se ensayó si los CTL específicos del péptido D^{b} 126 pueden reconocer células tumorales que expresan inherentemente WT1 y pueden causar citólisis de las mismas. Se midió la lisis específica a la relación E/T mostrada en las Figuras 13 y 14 para células tumorales (FLB3) que expresan WT1 y células tumorales (RMA) que no expresan WT1 (Figura 13) o para células C1498 transfectadas con el gen WT1 o células C1498 no transfectadas con el gen WT1 (Figura 14).
Como se muestra en la Figura 13, los CTL específicos del péptido D^{b} 126 causaron lisis de células FBL3 que expresan inherentemente WT1 pero no de células RMA que no expresan WT1. Como se muestra en la Figura 14, los CTL específicos del péptido D^{b} 126 destruyeron adicionalmente las células C1498 transfectadas con el gen WT1 de ratón, en comparación con las células C1498 originales que no expresan WT1. Esto confirmó que la molécula a la que se orientan los CTL para muerte celular es el péptido WT1 mismo. Estos resultados sugieren que los CTL específicos del péptido D^{b} 126 pueden reconocer al péptido D^{b} 126 o péptidos relacionados, que se han producido naturalmente mediante el procesamiento intracelular de la proteína WT1 y se presentaban en moléculas H-2D^{b} de células que expresan WT1.
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Ejemplo 7
Para ensayar si la actividad citolítica de CTL es dependiente de MHC, se realizó la medida en presencia de un anticuerpo contra la molécula H-2 de clase I. Por tanto, se midió la actividad citolítica de CTL específicos del péptido D^{b} 126 frente a células RMA-S sometidas a pulsos con el péptido D^{b} 126 en presencia de un anticuerpo monoclonal de título ajustado contra H-2K^{b} (28.13.3S), H-2D^{b} (28.11.5S) o H-2L^{d} (MA143). Como anticuerpo monoclonal de control, se usó un anticuerpo monoclonal que tiene el mismo isotipo.
Se muestra el resultado en la Figura 15. Dependiendo de las concentraciones aumentadas de anticuerpo contra H-2D^{b}, se suprimió la actividad lítica de CTL contra células RMA-S sometidas a pulsos con el péptido D^{b} 126, mientras que los anticuerpos contra H-2K^{b} o H-2L^{d} no suprimían la actividad lítica de CTL. Estos resultados indican que los CTL exhiben la actividad de citólisis de manera dependiente de H-2D^{b}.
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Ejemplo 8
Se ensayó si puede desencadenarse la inmunidad tumoral in vivo mediante la inmunización activa con el péptido D^{b} 126. Usando células esplénicas activadas con LPS (línea continua en la Figura 16) sometidas a pulsos con el péptido D^{b} 126, células esplénicas activadas con LPS sólo (línea sombreada) o disolución salina tamponada con fosfato (PBS) sólo (línea quebrada), se inmunizaron ratones una vez por semana. Después de inmunización durante 3 semanas, se administraron por vía intraperitoneal 3 x 10^{7} células leucémicas FBL3.
Se muestra el resultado en la Figura 16. Los ratones inmunizados con el péptido D^{b} 126 superaron la exposición a tumor y sobrevivieron, mientras que los ratones no inmunizados y los ratones inmunizados con las células esplénicas activadas con LPS no pudieron rechazar la exposición a tumor y murieron. Tanto en los ratones inmunizados como no inmunizados, se observó la presencia de ascitis tres días después de la inyección intraperitoneal anterior de células tumorales. Las ascitis siguieron aumentando en los ratones no inmunizados y eventualmente los ratones murieron. En los ratones inmunizados, por otro lado, las ascitis empezaron a reducirse gradualmente después de ella, y los ratones rechazaron completamente la exposición a tumor y sobrevivieron. En los ratones no inmunizados, se observó ocasionalmente una regresión natural. Se espera que la regresión sea debida a la inducción natural de CTL específicos de virus de la leucemia Friend (las células de leucemia FBL3 se transforman con este virus) debido a que dicha inducción de CTL se ha observado ocasionalmente en ratones C57BL/6.
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Ejemplo 9 Vacuna de ADN
Se inyectaron por vía intramuscular 100 \mug de ADN de plásmido que expresa WT1 (plásmido que expresa continuamente WT1 que se preparó ligando el fragmento Sau 3AI de ADNc de WT1 de ratón (Molecular and Cellular Biology, vol. 11, nº 3, pág. 1707-1712 (1991), columna izquierda de la página 1709) al promotor CMV-IE) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92: 11105-11109 (1995)) a ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad cada 10 días durante un total de tres veces. 10 días después de la última inyección intramuscular, se retiraron los bazos de ratón para preparar células esplénicas. Después de cocultivar las células esplénicas y las células mWT1C1498 (irradiadas con 40 Gy de radiación) que expresan WT1 a 37ºC durante 6 días, se realizó un ensayo de mortalidad (marcado con europio) usando C1498 (PM5G-mWT1) que expresaba WT1 y C1498 (PM5G) que no expresa WT1 como células diana. Como se usa en la presente memoria, C1498 es una estirpe celular de leucemia mielogénica de ratón que no expresa WT1.
Se indujeron células T citotóxicas (CTL) que destruyen células C1498 (PM5G-mWT1) que expresan WT1 pero no destruyen células C1498 (PM5G) que no expresan WT1.
Se muestra el resultado en la Figura 17.
Como control, se realizó un experimento similar al anterior en el que se inyectaba por vía intramuscular el plásmido que no expresa WT1 (no contiene ADNc de WT1) a ratones en lugar de plásmido que expresa WT1. Como en el experimento anterior, se retiraron las células esplénicas. Después de estimulación in vitro con células C1498 (PM5G-mWT1) que expresan WT1, se realizó un ensayo de mortalidad.
Como se muestra en la Figura 18, no se indujeron CTL específicos de WT1 mediante inyección intramuscular de ADN de plásmido de control que no tiene ADNc de WT1.
Los resultados anteriores demostraron que el péptido de la presente invención funciona de hecho como antígeno tumoral y que inducía el crecimiento de células T citotóxicas (células T tóxicas para células tumorales) contra células tumorales. Por lo tanto, el péptido antigénico tumoral de la presente invención es útil como vacuna para el cáncer para leucemia y tumores sólidos que están acompañados por una expresión aumentada del gen WT1.
<110>
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<120> Antígeno canceroso basado en el gen supresor tumoral WT1
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<130> 983279
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<160> 8
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<210> 1
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<211> 449
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<212> PRT
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<213> Ratón
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<400> 1
2
3 
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<210> 2
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<211> 449
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<212> PRT
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<213> Humano
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<400> 2
4
5 
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<210> 3
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido sintético
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<400> 3
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\hskip1cm
6 
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<210> 4
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido sintético
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<400> 4
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\hskip1cm
7 
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<210> 5
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido sintético
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<400> 5
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\hskip1cm
8 
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<210> 6
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido sintético
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<400> 6
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\hskip1cm
9 
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<210> 7
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido sintético
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<400> 7
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\hskip1cm
10 
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<210> 8
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido sintético
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<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
11

Claims (5)

1. Un péptido antigénico tumoral de la proteína WT1, en el que dicho péptido es uno cualquiera de los siguientes:
D^{b} 126
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 5)
D^{b} 235
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 7), y
WH 187
Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 8).
\vskip1.000000\baselineskip
2. El péptido antigénico tumoral según la reivindicación 1, en el que dicho péptido es
D^{b} 126
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 5) ó
WH 187
Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 8).
\vskip1.000000\baselineskip
3. Una vacuna para el cáncer que comprende como ingrediente activo un péptido antigénico tumoral según la reivindicación 1 ó 2.
4. Uso de un péptido antigénico tumoral según la reivindicación 1 ó 2 para la preparación de una composición farmacéutica para vacunación contra el cáncer.
5. El péptido antigénico tumoral según la reivindicación 1 ó 2 para uso como una vacuna para el cáncer.
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