ES2318137T3 - Activacion de ace2 para el tratamiento de enfermedades cardiacas, pulmonares y renales e hipertension. - Google Patents
Activacion de ace2 para el tratamiento de enfermedades cardiacas, pulmonares y renales e hipertension. Download PDFInfo
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Abstract
Un uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de ACE2 o ácido nucleico de ACE2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un estado disminuido de ACE2 seleccionado entre hipertensión, insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia cardíaca crónica, insuficiencia cardíaca aguda, infarto de miocardio, arteriosclerosis, insuficiencia renal o una enfermedad pulmonar en un mamífero, en el que la enfermedad pulmonar es enfermedad pulmonar obstructiva crónica, neumonía, asma, bronquitis crónica, enfisema pulmonar, fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar primaria, embolia pulmonar, sarcoidosis pulmonar, tuberculosis, edema pulmonar, ARDS o cáncer de pulmón.
Description
Activación de ACE2 para el tratamiento de
enfermedades cardíacas, pulmonares y renales e hipertensión.
La presente invención proporciona composiciones
y procedimientos para uso en el diagnóstico y tratamiento de
enfermedades cardíacas, pulmonares y renales, incluyendo
hipertensión, enfermedad cardíaca coronaria, insuficiencia cardíaca
y renal, edema pulmonar, y lesión pulmonar tal como en choque tóxico
o ventilación artificial.
La enfermedad cardiovascular será la mayor carga
social de cuidados sanitarios del siglo 21, y se predice que sea la
causa más común de muerte en todo el mundo en 2020. Un factor de
riesgo principal es de enfermedad cardíaca es la alta presión
sanguínea. La hipertensión es un carácter cuantitativo
multifactorial controlado tanto por factores genéticos como
ambientales. Mientras se conoce mucho acerca de los factores
ambientales que pueden contribuir a la alta presión sanguínea,
tales como la dieta y actividad física, se conoce menos sobre los
factores genéticos que son responsables de la predisposición a
enfermedades cardiovasculares. A pesar de la identificación de
varios loci de carácter cuantitativo genético supuestos (QTL)
asociados a la hipertensión en modelos animales, ninguno de estos
loci se han traducido en genes. De este modo, los mecanismos
moleculares y genéticos que subyacen a la hipertensión y otras
enfermedades cardiovasculares permanecen en gran medida
oscuros.
Un regulador crítico de la homeostasis de la
presión sanguínea es el sistema renina - angiotensina (RAS). La
protease renina escinde el angiotensinógeno en el péptido
angiotensina I (AngI) decamérico inactivo. La enzima de la enzima
conversora de angiotensina (ACE) después cataliza la escisión de
la AngI en la angiotensina II (AngII) octómera activa, que puede
contribuir a la hipertensión promoviendo la vasoconstricción
vascular del músculo liso y la reabsorción de sodio del túbulo
renal. Los ratones mutantes ACE muestran hipotensión espontánea,
infertilidad masculina parcial, y malformaciones renales. En los
seres humanos, un polimorfismo ACE se ha asociado a determinantes
de función renal y cardiovascular, y la inhibición farmacológica
de ACE y receptores de AngII son eficaces en la reducción de la
presión sanguínea la reducción de la presión sanguínea y enfermedad
renal. Además, la inhibición de ACE y los receptores de AngII tienen
efectos beneficiosos en la insuficiencia cardíaca.
Recientemente se ha identificado un homólogo de
ACE, denominado ACE2, que se expresa predominantemente en las
células endoteliales vasculares del riñón y corazón. De manera
interesante, dos homólogos de ACE también existen en las moscas. De
manera similar las funciones de ACE, ACE2 como una carboxipeptidasa,
que escinde un único resto de AngI, que genera
Ang1-9, y un único resto de AngII para generar
Ang1-7. Estos datos bioquímicos in vitro
sugieren que, ACE2 modula el RAS y de este modo juegan un papel en
la regulación de la presión sanguínea. Se conoce el papel in
vivo de ACE2 en el sistema cardiovascular y el RAS.
Oonoghue et al. (Circulation Research 87
(5): e1 - e9, 2000) describen la identificación de ACE2 a partir de
una genoteca de ADNc.
Yagil et al. (Hypertension 33 (1): 261 -
265, 1999) realizaron una selección genética de los loci
cromosómicos asociados a la hipertensión en ratas.
Acton et al. en la Patente de Estados
Unidos Nº 6.194.556 (documento WO 02/12471), describe el uso de ACE2
en la diagnosis y terapéutica de los estados asociados a ACE2. La
patente estableció que los niveles de expresión ACE2 se incrementan
con la hipertensión y de este modo los antagonistas o inhibidores
de ACE2 serían útiles en el tratamiento de un incremento de la
presión sanguínea o trastornos relacionados. La solicitud de patente
canadiense nº 2.372.387 proporciona ejemplos específicos de
inhibidores de ACE2 que, se pretende que sean útiles para el
tratamiento de enfermedad cardíaca enfermedad cardíaca, tal como
hipertensión. Esto de nuevo enfatiza la necesidad de inhibir, en
lugar de incrementar, la actividad de ACE2. Estas referencias, que
enseñan la necesidad de inhibir la actividad de ACE2, se basan
solamente en los datos experimentales in vitro. No
proporcionan datos in vivo, tales como los datos de mamíferos
inactivados, para caracterizar ACE2. Hasta la fecha, no se ha
aprobado ningún inhibidor de ACE2 como compuesto farmacéutico para
el tratamiento de hipertensión. Además, el papel in vivo de
ACE2 en el sistema cardiovascular y el RAS permanece en gran medida
desconocido. Permanece una necesidad de caracterizar la función de
ACE2 con el fin de sea capaz de diseñar ensayos de diagnóstico
apropiados y compuestos farmacéuticos para el tratamiento de
enfermedad cardíaca y renal.
La invención proporciona un nuevo paradigma para
la regulación del sistema renina - angiotensina y muestra un uso
completamente nuevo e inesperado de ACE2, en contraste a la
predicción basada en los datos in vitro (patente Acton) y
no esperada en la técnica anterior, como un regulador crítico
negativo del RAS requerido para la función cardiaca y control de la
presión sanguínea. La activación de ACE2 es crítica para el
tratamiento y prevención de enfermedad cardíaca, pulmonar y renal.
La invención muestra la primera vez que la administración de un
activador de ACE2 a un animal previene y trata la hipertensión y
enfermedad cardíaca y renal, y lesión pulmonar. El ámbito de la
presente invención se define en las reivindicaciones.
Las realizaciones preferidas de la invención se
describirán en relación a los dibujos que siguen:
Figura
1
a, alineación de proteína de ACE2 de
rata, de ratón y ser humano, con ACE de testículos humanos y de
ratón (T-ACE). Lo sombreado en negro indica la
identidad de aminoácidos y los lo sombreado en gris indica el grado
de similitud de aminoácidos. b, Estructura del dominio
esquemático de ACE y ACE2. Hay que observar que ACE2 solamente
contiene el dominio ACE con el sitio de unión de cinc de consenso
HEMGH. Los centros catalíticos se indican en negro, el péptido
señal se indica en gris y el dominio transmembrana en líneas
discontinuas. c, Patrones de Expresión de los genes de ACE2
de rata y ratón en tejidos adultos diferentes y días diferentes de
desarrollo embrionario (E7 = día embrionario 7). Hay que observar
que están presentes dos isoformas para ACE2 en ratones, pero no en
rato o ser humano (no mostrado), una característica similar a la
observada para ACE15. d, Resultados de mapa de híbrido de radiación
de ACE2 de rata, comparado con el mapa de QTL identificado en los
animales sensibles a sal ratas Sabra (SS-X), SHRSP
(BP3), y SHR (BB.Xs). Los nombres de los marcadores polimórficos
se indican a la izquierda del ideograma. Se muestran las
puntuaciones de LOD y los valores theta para los marcadores unidos
a ACE2. cR = centiRads.
Figura
2
a, análisis de transferencia Northern de
ARNm de ACE2 de riñones de ratas Sabra SBH/y y SBN/y. La sección
anterior muestra la representación de transferencias de Northern
con niveles de control de actina. El panel inferior muestra los
niveles relativos de mensaje de ace2 normalizado para los niveles de
actina. b, Análisis de transferencia de Western de los
nivel proteína de ACE2 de riñones de Sabra SBH/y y sus ratas control
SBN/y, así como SHR y SHRSP y sus ratas control WKY. La sección
superior muestra transferencias de Western representativas. Se
indica la presión sanguínea sistólica (BP) en mmHg para las
respectivas ratas Sabra. El panel inferior muestra los niveles de
proteína relativos de ACE2 corregidos para actina. Las barras
muestran los valores medios +/- ETM. * = p < 0,05, ** = p <
0,01. (n = 4, para todos los grupos).
Figura
3
a, Estrategia de dirección de genes. Se
muestra una parte del locus de tipo salvaje de ace2 murino
(parte superior). Los recuadros en negro indican exones. El vector
de dirección se diseñó para reemplazar el exón 9 que codifica el
dominio catalítico de unión a cinc con el módulo del gen de
resistencia a neomicina (neo) colocado en la orientación de sentido
contrario. Se usó la timidita quinasa (TK) para la selección
negativa. Las sondas flanqueantes de 3' y 5' usadas para los
análisis de Southern se indican con un recuadro de línea
discontinuo. b, análisis de transferencia Southern de células
ace+/y y ace-/y ES. Se digirió el ADN genómico
con EcoRI y se hibridizó con la sonda flanqueante de 3' y 5'
mostrada en (a). c, Análisis de transferencia de Western de
la proteína de expresión de ACE2 en los riñones de ratones
ace2+/y ace-/y. El anti-ACE2
Ab es reactivo con una región N-terminal a la
supresión. d, análisis de RT-PCR de la
expresión de ARNm de ACE en el corazón y riñones de ratones
ace2+/y y ace2-/y. Se muestran
diferentes ciclos de PCR para la amplificación lineal y los niveles
de ARNm de GAPDH como control.
Figura
4
a, Se muestran mediciones de la presión
sanguínea en ratones de 3 meses de edad ace2+/y (n =
8) y ace2-/y (n = 8) en la ausencia (paneles
izquierdos) o la presencia del bloqueador de ACE Captopril. Las
presiones sanguíneas se determinaron mediante el uso de los extremos
de cola y se muestran los valores medios +/- D E. Se administró
Captopril a los ratones durante 2 semanas antes de las mediciones de
presión sanguínea como se describe en los Procedimientos. Estas
presiones sanguíneas se confirmaron usando mediciones hemodinámicas
y de Langendorf invasivas (no mostradas). Las diferencias en los
ratones tanto los ratones tratados con captopril
ace2+/y como ace2-/y son
significativamente diferentes de de los grupos no tratados
respectivos (** p < 0,01). b, Las histologías de riñón
normales se observan en los ratones de 6 meses de edad
ace2+/y y ace2-/y. Las flechas indican
glomérulos.
Figura
5
a, Secciones teñidas H&E de corazones
aislados de ratones de 6 meses de edad ace2+/y y
ace2-/y. Los ventrículos izquierdos agrandados (LV) y
ventrículos derechos (RV) se observaron en los ratones
ace2-/y. Sin embargo, el tamaño global del corazón
era comparable entre ambos genotipos y no existía evidencia de
hipertrofia cardíaca, microscópicamente o en cardiomiocitos
aislados.
b, Cuantificación de las relaciones de
peso de corazón/cuerpo de los ratones de 6 meses de edad
ace2+/y (n= 8) y ace2-/y (n = 8) como
un indicador de hipertrofia cardíaca. Se debe observar que los pesos
del cuerpo, pesos del corazón, longitudes de la tibia, y las
relaciones de peso del corazón/longitud e la tibia no cambiaron
entre los grupos genéticos diferentes a todas las edades analizadas
(no mostrado). c, d, Existía una fibrosis intersticial en los
ratones ace2-/y. Una característica de sello para la
cardiopatía dilatada es la fibrosis intersticial. Sin embargo, la
fibrosis intersticial era comparable entre los corazones de
ratones ace2+/y (n = 8) y ace2-/y (n =
8). (c) muestra la tinción de PSR de corazones individuales. Hay
que observar que la fibrosis perivascular, teñido en rojo, tanto en
animales de tipo salvaje como mutantes. (d) cuantificación de
cambios fibróticos en el intersticio.
Figura
6
a, mediciones ecocardiográficas de
corazones en contracción en ratones ace2+/y de 6 meses
de edad y dos ace2-/y. Los máximos y valles indican
la sístole y diástole de los ritmos cardíacos individuales. Las
flechas indican la distancia entre la contracción sistólica (LVESD)
y la relajación sistólica (LVEDD), valores que determinan el
porcentaje de acortamiento (% FS). Hay que observar que el
incremento de las dimensiones diastólicas y sistólicas en los
ratones ace2-/y son indicativos de la dilatación
cardíaca. Los datos experimentales se pueden observar en la Tabla
1. b, Se observó el porcentaje de acortamiento fraccional y
velocidad de acortamiento circunferencial de fibra, dos parámetros
de sello para la contracción del corazón, en ratones de 6 meses de
edad ace2+/y (n = 8) y ace2-/y (n = 8) y
ratones de 6 meses de edad ace2+/- (n = 5) y ratones
hembra ace2-/- (n = 5). Se determinaron los valores
mediante ecocardiografía. Se muestran los valores medios +/-DE. *
p < 0,05 y ** p < 0,01 entre grupos genéticos. Loas datos
experimentales se pueden ver en la Tabla 1. c, Mediciones de
la presión sanguínea en ratones macho de 6 meses de edad
ace2+/y (n = 8) y ace2-/y (n = 8) y
ratones hembra de 6 meses de edad ace2+/- (n = 5) y
ratones hembra ace2-/- (n = 5). Se muestran los
valores medios +/- DE. Se confirmaron las presiones sanguíneas
usando las mediciones hemodinámicas invasivas como se puede observar
en la Tabla 2..* p < 0,05.
Figura 7. La regulación hacia arriba de los
marcadores de hipoxia e incremento de los niveles de la angiotensina
II en la ausencia de ACE2 a, b, análisis de transferencia de
Northern de BNIP3 y niveles de expresión de ARNm de
PAI-1, dos genes inducibles por hipoxia en ratones
macho de 6 meses de edad ace2+/y (n=5) y ratones
ace2-/y (n = 5). (a) muestra datos de transferencia de
Northern individuales (b) niveles relativos de BNIP3 y niveles de
ARNm de PAI- 1 normalizados para el control de gráfico. ** p <
0,01. c, los niveles de péptido de Angiotensina I (AngI) y
Angiotensina II (AngII) en el corazón y riñones de ratones macho de
camada ace2^{+/y} (n = 8) y ace2^{-/y} (n = 8).
Los niveles en tejido de AngI y AngII se determinaron mediante
radioiinmunoensayos.
Se muestran los niveles de péptido medios +/-
DE. ** p < 0,01.
Figura
8
a, Mediciones de presión sanguínea en
ratones macho de 6 meses de edad ace2^{+/y} (n = 8),
ace^{-/-} (n = 8), y ratones doble mutantes ace^{-/-}
ace2^{-/y} (n = 6). Se muestran los valores medios +/- DE.
Las Presiones sanguíneas se confirmaron usando mediciones
hemodinámicas invasivas. ** p<0.01 de mutante cuando se compara
con los ratones de tipo salvaje b, Porcentaje de
acortamiento fraccional y velocidad de acortamiento circunferencial
de fibra en ratones macho ace^{2+/y} (n = 8),
ace2^{-/y} (n = 8), ace^{-/-} (n = 8) y
ace^{-/-} ace2^{-/y} doble mutantes (n = 6) de la misma
camada. Se determinaron los valores mediante ecocardiografía. Se
muestran los valores medios +/- DE.
** p < 0,01 entre los grupos genéticos. Se
pueden observar los datos experimentales en la Tabla 3. c,
mediciones ecocardiográficas de las contracciones de corazón en los
ratones machos de 6 meses de edad ace2^{+/y},
ace2^{-/y}, ace^{-/-}, y ace^{-/-}
ace2^{-/y} doble mutante de la misma camada. Se analizaron
los ecocardiogramas y se marcaron como se describe en la Figura 6a.
Hay que observar que la ablación de ACE en un fondo nulo de
ace2 completamente rescata los defectos del corazón
contráctil observado en los ratones ace2^{-/y} mutantes
individuales.
Figura 9. Se calculó el porcentaje de cambio en
elastancia desde el comienzo con el tiempo. Se calculó la
elastancia del pulmón dividiendo la presión máxima traqueal por el
volumen.
Figura 10. a, ADN de ACE2 humano (SEQ ID NO:1).
b, polipéptido de ACE2 humano (SEQ ID NO:2).
Figura 11. a, ADN de ACE2 de ratón (SEQ
ID NO:3). b, polipéptido de ACE2 de ratón (SEQ ID NO:4)
Figura 12. Polimorfismos y secuencias de
nucleótidos ACE2.
La invención proporciona un nuevo paradigma para
la regulación del sistema RAS y muestra que ACE2 es un regulador
crítico negativo del RAS requerido para la función cardíaca y
función cardiovascular, función renal y lesión pulmonar. La
invención enseña por primera vez el uso de una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido de ACE2 o ácido nucleico
de ACE2. Para la preparación de un medicamento para el tratamiento
de un estado de disminución de ACE2 seleccionado entre
hipertensión, insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia
cardíaca crónica, insuficiencia cardíaca aguda, infarto de
miocardio, arteriosclerosis, insuficiencia renal o una enfermedad
pulmonar en un mamífero, en el que la enfermedad pulmonar es
enfermedad pulmonar obstructiva crónica, neumonía, asma, bronquitis
crónica, enfisema pulmonar, fibrosis cística, enfermedad pulmonar
intersticial, hipertensión pulmonar crítica, Embolia pulmonar,
sarcoidosis pulmonar, tuberculosis, edema pulmonar, ARDS o cáncer
de
pulmón.
pulmón.
Este resultado es completamente inesperado en
vista de las referencias de la técnica anterior, tal como la
Patente de Estados Unidos nº 6.194.556 y la Solicitud de Patente
Canadiense nº 2.372.387, descrita anteriormente, que enseña que la
actividad de ACE2 se debe inhibir con el fin de tratar enfermedad
cardíaca. De este modo es sorprendente que la enfermedad cardíaca
se trate realmente mediante la activación de la expresión de y/o
actividad de
ACE2.
ACE2.
La invención también incluye ensayos de
selección para detector un agonista de la actividad de ACE2, que
se puede usar para tratar las enfermedades mencionadas
anteriormente. Estos ensayos son in vitro o in
vivo. En una realización preferida la invención incluye un
ensayo de células huésped endotelial, de riñón, pulmón o corazón
para evaluar si un compuesto candidato es capaz de incrementar la
expresión o actividad de ACE2. Se cultivan las células en la
presencia de al menos un compuesto cuya habilidad para activar la
expresión o actividad se busca que se determine y las células se
miden para determinar un incremento en el nivel de expresión de
ACE2. Otro aspecto de la invención implica un ratón con inactivación
de ACE2 para identificar los compuestos que pueden superar los
efectos de la pérdida de ACE2. Los polipéptidos y moléculas
orgánicas se ensayan en estos ensayos. La invención incluye todos
los compuestos que se identifican con los procedimientos de
selección de la invención y que son adecuados para la administración
a animales en las composiciones farmacéuticas.
Como se ha mencionado anteriormente en el
presente documento, los presentes inventores han mostrado que la
expresión del gen ACE2 está regulado hacia abajo en la
hipertensión, enfermedad cardíaca y renal. De acuerdo con lo
anterior, la presente invención proporciona el uso de una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido de ACE2 o ácido nucleico
de ACE2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de
una disminución del estado de ACE2 seleccionado entre hipertensión,
insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia cardíaca crónica,
insuficiencia cardíaca aguda, infarto de miocardio,
arteriosclerosis, insuficiencia renal o una enfermedad pulmonar en
un mamífero, en el que la enfermedad pulmonar es enfermedad pulmonar
obstructiva crónica, neumonía, asma, bronquitis crónica, enfisema
pulmonar, fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial,
hipertensión pulmonar primaria, embolia pulmonar, sarcoidosis
pulmonar, tuberculosis, edema pulmonar, ARDS o cáncer de pulmón. La
cantidad terapéuticamente eficaz puede ser de moléculas de ácido
nucleico (incluyendo ACE2 o sus fragmentos), proteínas
(incluyendo Ace2 o sus fragmentos) o péptidos. Si o no el gen de
ACE2 se incrementa se puede determinar fácilmente por los expertos
en la técnica usando procedimientos conocidos incluyendo
transferencia de Western SDSPAGE, inmunoquímica,
RT-PCR, transferencia de Northern e hibridación
in situ.
El término "animal" como se usa en el
presente documento incluye todos los miembros del reino animal. Los
animales son preferiblemente seres humanos.
El término "cantidad eficaz" como se usa en
el presente documento significa una cantidad eficaz a dosificaciones
y durante períodos de tiempo necesarios para potenciar el nivel de
ACE2 El término "tratamiento o tratar" como se usa en el
presente documento significa un planteamiento para obtener
resultados beneficiosos o deseados, incluyendo los resultados
clínicos. Los resultados clínicos o beneficiosos deseados pueden
incluir, pero no se limitan a, alivio o mejora de de uno o más
síntomas o afecciones, disminución o extinción de la enfermedad,
estado patológico estabilizado (es decir no empeoramiento),
prevención de la extensión de la enfermedad, retraso o
ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación
del estado patológico, y remisión del estado patológico, y remisión
(bien parcial o total), bien detectable o indetectable.
"tratamiento" también puede significar prolongación de la
supervivencia comparado con la supervivencia esperada si no recibe
tratamiento.
En una realización, la expresión del gen de ACE2
se incrementa mediante la administración de un ácido nucleico que
comprende un gen de ACE2 o una parte del mismo.
En otra realización, la expresión del gen de
ACE2 se puede incrementar mediante la administración de un agente
que incrementa la expresión del gen de ACE2 incluyendo
cualesquiera agentes identificados usando los ensayos de selección
en esta solicitud.
Ya que un animal que sufre de la enfermedad,
trastorno o estado físico anormal se puede tratar mediante la
regulación hacia arriba de ACE2, la terapia génica para incrementar
la expresión de ACE2 es útil para modificar el
desarrollo/progresión de enfermedad pulmonar renal o pulmonar.
La invención incluye procedimientos y
composiciones para proporcionar la terapia génica de ACE2 para el
tratamiento de enfermedades, trastornos o estados físicos anormales
caracterizados por la disminución de la expresión de ACE2 o niveles
de la actividad del polipéptido de ACE2.
La invención incluye procedimientos y
composiciones para proporcionar una molécula de ácido nucleico que
codifica ACE2 o molécula de ácido nucleico equivalente a las
células de un animal de manera que la expresión de ACE2 en las
células proporciona la actividad biológica o fenotipo del
polipéptido de ACE2 a esas células. Se administran suficientes
cantidades de la molécula de ácido nucleico y se expresan a niveles
suficientes para proporcionar la actividad biológica o fenotipo del
polipéptido de ACE2 a las células. Por ejemplo, el procedimiento
puede preferiblemente implicar un procedimiento de distribución de
una molécula de ácido nucleico que codifica ACE2 a las células de
un animal que tiene enfermedad cardiovascular o renal, o pulmonar,
que comprende la administración al sujeto de un vector que
comprende ADN que codifica ACE2. El procedimiento también se puede
referir a un procedimiento para proporcionar un animal que tiene
enfermedad cardiovascular o renal, o pulmonar con el polipéptido
biológicamente activo de ACE2 mediante la administración de ADN que
codifica ACE2. El procedimiento se puede realizar in vivo o
ex vivo (por ejemplo, con células del tronco de corazón,
pulmón, endoteliales o de riñón, células progenitoras u otras
células que van a ser células transplantada). Se explican los
procedimientos y composiciones para administrar ACE2 (que se
incluyen en terapia) a célula aislada o un animal, por ejemplo, en
la Patente de Estados Unidos números 5.672.344, 5.645.829,
5.741.486, 5.656.465, 5.547.932, 5.529.774, 5.436.146, 5.399.346,
5.670.488, 5.240.84, 6.322.536, 6.306.830 y 6.071.890.
El procedimiento también se refiere a un
procedimiento para producir una reserva de de virus recombinante
mediante la producción de virus adecuado para terapia génica que
comprende el ADN que codifica ACE2. Este procedimiento
preferiblemente implica la transfección de células que permiten la
replicación de virus (conteniendo el virus la molécula de ácido
nucleico) y recoger el virus producido.
Los procedimientos y composiciones se pueden
usar in vivo o in vitro. La invención también incluye
composiciones (preferiblemente composiciones farmacéuticas para la
terapia génica). Las composiciones incluyen un vector que contiene
ACE2. El vehículo puede ser un vehículo farmacéutico o un
transformante de célula huésped que incluye el vector. Los
vectores conocidos en la técnica incluyen pero no se limitan a
retrovirus, adenovirus, virus asociado a adeno (AAV), vectores
herpes virus, tales como vectores de virus vaccinia, VIH y vectores
basados en lentivirus, o plásmidos. La invención también incluye
líneas celulares de empaquetamiento y auxiliares que se requieren
para producir el vector. Los procedimientos de producción del vector
y procedimientos de terapia génica que usan el vector y
procedimientos de la terapia génica que usan el vector también se
incluyen en la invención.
La invención también incluye una célula
transformada que contiene el vector y las secuencias de moléculas
de ácido nucleico de ACE2 recombinantes.
Las variantes de ACE2 se pueden usar en los
procedimientos de la invención. Los cambios que dan como resultado
la producción de de una secuencia de aminoácidos químicamente
similar equivalente están incluidas dentro del alcance de la
invención. Los polipéptidos que tienen identidad de secuencias con
el receptor de ACE2 se ensayan para asegurar que son adecuados
para el uso en el procedimiento de la invención. Se pueden producir
de manera natural variantes de polipéptidos de la invención, por
ejemplo, mediante mutación, o se pueden preparar, por ejemplo, con
técnicas de ingeniería genética de polipéptido tales como
mutagénesis dirigida al sitio, que se conocen bien en la técnica
para substitución de aminoácidos. Por ejemplo, un resto hidrófobo,
tal como glicina se puede sustituir por otro resto hidrófobo tal
como alanina. Un resto alanina puede estar sustituido con un resto
más hidrófobo tal como leucina, valina o isoleucina. Un aminoácido
cargado negativamente tal como ácido aspártico se puede sustituir
por ácido glutámico. Un aminoácido cargado positivamente tal como
lisina se puede sustituir por otro aminoácido cargado positivamente
tal como arginina.
Por lo tanto, la invención incluye polipéptidos
que tienen cambios o sustituciones conservadores en secuencias de
aminoácidos. Las sustituciones conservadoras insertan uno o más
aminoácidos, que tienen propiedades químicas similares que los
aminoácidos reemplazados. La invención incluye secuencias donde las
sustituciones conservadoras se hacen de manera que no destruyan la
actividad del compuesto.
Los polipéptidos que comprenden uno o más
d-aminoácidos se contemplan con la invención.
También se contemplan polipéptidos donde uno o más aminoácidos
están acetilados en el extremo N. Los expertos en la técnica
reconocen que está disponible una diversidad de técnicas para
construir miméticos de polipéptidos con la misma o similar
actividad del compuesto deseado pero con actividad más favorable que
el polipéptido con respecto a la solubilidad estabilidad, y/o
susceptibilidad a hidrólisis y proteolisis. Véase, por ejemplo,
Morgan y Gainor, Ann. Rep. Med. Chem., 24: 243 - 252 (1989). Los
ejemplos de miméticos de polipéptido se describen en la patente de
estados Unidos Nº 5.643.873. Otras patentes que describen cómo
preparar y usar miméticos se incluyen, por ejemplo en, 5.786.322,
5.767.075, 5.763.571, 5.753.226, 5.683.983, 5.677.280, 5.672.584,
5.668.110, 5.654.276, 5.643.873. Los miméticos de los polipéptidos
de la invención también se pueden preparar de acuerdo a otras
técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, tratando un
polipéptido de la invención con una agente que altera químicamente
un grupo lateral convirtiendo un grupo hidrógeno en otro grupo tal
como un grupo hidroxi o amino. Los miméticos preferiblemente
incluyen las secuencias que son o bien enteramente hechos de
aminoácidos o secuencias que son híbridos incluyendo los
aminoácidos y aminoácidos modificados u otras moléculas
orgánicas.
La invención también incluye híbridos y
polipéptidos, por ejemplo donde una secuencia de nucleótidos se
combina con una segunda secuencia.
La invención también incluye procedimientos de
uso de fragmentos de polipéptidos de ACE2 que se pueden usar para
conferir actividad del compuesto si los fragmentos retienen
actividad. La invención también incluye polipéptidos y fragmentos
de los polipéptidos de la invención que se pueden usar como una
herramienta de investigación para caracterizar el polipéptido o su
actividad. Tales polipéptidos preferiblemente constan de al menos 5
aminoácidos. En realizaciones preferidas, pueden constar de 6 a 10,
11 a 15, 16 a 25, 26 a 50, 51 a 75,76 a 100 ó 101 a 250 ó 250 a 500
aminoácidos. Los fragmentos pueden incluir secuencias con más
aminoácidos eliminados, por ejemplo, aminoácidos del extremo C en
una secuencia del compuesto.
La actividad de ACE2 aumenta o disminuye
llevando a cabo mutagénesis dirigida al sitio selectiva. Un plásmido
de ADN o vector de expresión que contiene la molécula de ácido
nucleico o una molécula de ácido nucleico que tiene identidad de
secuencia se usa preferiblemente para estos estudios usando el kit
de mutagénesis U.S.E. (Eliminación de sitio único) de Pharmacia
Biotech u otros kits de mutagénesis que están comercialmente
disponibles, o usando PCR. Una vez que se crea y confirma la
mutación mediante análisis de secuencia de ADN, el polipéptido
mutante se expresa usando u sistema de expresión y se controla su
actividad.
La invención también incluye procedimientos de
uso de polipéptidos que tienen identidad de secuencia al menos
aproximadamente: > 20%, > 25%, > 28%, > 30%, > 35%,
> 40%, > 50%, > 60%, > 70%, > 80% o > 90% más
preferiblemente al menos aproximadamente > 95%, > 99% o >
99,5%, a ACE2 humano o de ratón (o una secuencia parcial del
mismo). Las moléculas de polipéptido modificadas se describen más
adelante. Preferiblemente aproximadamente: 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 10, 10
a 25, 26 a 50 ó 51 a 100, o 101 a 250 nucleótidos o aminoácidos
están modifi-
cados.
cados.
Se calcula la identidad de acuerdo con conocidos
en la técnica. La identidad de secuencia se determina lo más
preferiblemente mediante la investigación avanzada del programa
BLAST versión 2.1 (parámetros como antes). BLAST es una serie de
programas que están disponibles en la línea
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. La investigación de BLAST
avanzada (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi?Jform=1) se
establece para los parámetros por defecto. (es decir, Matrix
BLOSUM62; Coste de existencia de hueco 11; Por coste de hueco de
residuo 1; relación Lambda 0,85 defecto).
Las referencias a investigaciones BLAST son:
Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J.
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protein coding regions by database similarity search". Nature
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266: 131 - 141; Altschul, S.F., Madden, T.L, Schäffer, A.A., Zhang,
J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST
and PSI-BLAST: a new generation of protein database
search programs". Ácido nucleicos Res. 25: 3389 - 3402; Zhang,
J. & Madden, T.L. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST
application for interactive or automated sequence analysis and
annotation". Genome Res. 7: 649 – 656.
Preferiblemente aproximadamente: 1, 2, 3, 4, 5,
6 a 10, 10 a 25, 26 a 50 ó 51 a 100, ó 101 a 250 nucleótidos o
aminoácidos están modificados. La invención incluye polipéptidos con
mutaciones que provocan un cambio de aminoácidos en una parte del
polipéptido implicado que proporciona la actividad de manera que la
mutación aumenta o disminuye la actividad del polipéptido.
Se seleccionan pequeñas moléculas orgánicas para
determinar si incrementan la expresión o actividad de ACE2. Los
fragmentos de polipéptidos de ACE2 así como los polipéptidos que
tienen identidad de secuencia con ACE2 también se ensayan para
determinar si incrementan la actividad de ACE2 en ensayos in
vitro e in vivo en líneas celulares. Los activadores se
dirigen preferiblemente hacia dominios específicos de ACE2 para
incrementar la activación de ACE2. Para lograr la especificidad,
los activadores deben dirigir las secuencias únicas de ACE2.
La presente invención también incluye el
aislamiento de sustancias que incrementan la expresión de ACE2. En
particular se pueden aislar los ligandos o sustancias que se unir al
gen o proteína de ACE2. Se pueden ensayar muestras biológicas y
genotecas comercialmente disponibles para sustancias tales como
proteínas que se unen a un gen o proteína de ACE2. Por ejemplo, la
secuencia de aminoácidos de una proteína de ACE2 se puede usar para
sondar genotecas de péptidos mientras una secuencia de ácido
nucleico que codifica ACE2 se puede usar para sondar genotecas de
ácidos nucleicos. Además, los anticuerpos preparados para ACE2 se
pueden usar para aislar otros péptidos con afinidad para ACE2. Por
ejemplo, se pueden usar anticuerpos marcados se pueden usar para
sondar genotecas de despliegue en fago o muestras biológicas.
Las condiciones que permiten la formación de
complejos con una sustancia y un gen o proteína de ACE2 se pueden
seleccionar para que tengan relación con los factores tales como la
naturaleza y cantidades de la sustancia y el gen o proteína de
ACE2. El complejo sustancia - proteína o sustancia - gen, sustancia
libre o sustancia sin formar complejo se pueden aislar mediante
técnicas de aislamiento convencionales, por ejemplo, precipitación
con sales, cromatografía, electroforesis, filtración en gel,
fraccionamiento, absorción, electroforesis en gel de
poliacrilamida, aglutinación, o combinaciones de las mismas. Para
facilitar el ensayo de de los componentes, se pueden utilizar
anticuerpo contra ACE2 o la sustancia, o proteína marcada, o una
sustancia marcada. Los anticuerpos, proteínas, o sustancias se
pueden marcar, según sea apropiado, con una sustancia detectable
como se describe más adelante.
Una vez que se han aislado las parejas de unión
potenciales, se pueden diseñar procedimientos de selección para
determinar si las sustancias que se unen a los genes o proteínas de
ACE2 son útiles en los procedimientos de la presente invención
para potenciar la expresión de ACE2 sobre una célula y por lo tanto
útiles en el tratamiento de enfermedad.
Por lo tanto, la invención también proporciona
procedimientos para identificar sustancias que son capaces de
unirse a genes o proteínas de ACE2. En particular, los
procedimientos se pueden usar para identificar sustancias, que son
capaces de unirse y aumentar o potenciar la expresión de ACE2. De
acuerdo con lo anterior la invención proporciona un procedimiento
para seleccionar un compuesto que es un agonista de la actividad de
ACE2, que comprende:
- a.
- proporcionar: i) una preparación purificada que comprende ACE2, ii) un sustrato, y iii) un compuesto de ensayo;
- b.
- mezclar dicho ACE2 y dicho sustrato en condiciones tales que dicho ACE2 pueda actuar sobre dicho sustrato para producir un producto, en el que dicha mezcla se realiza en presencia y ausencia de dicho compuesto de ensayo; y
- c.
- medir directa o indirectamente la cantidad de dicho producto producido en la presencia o ausencia de dicho compuesto de ensayo, caracterizado porque dicho sustrato es angiotensina II.
Se puede usar cualquier sistema de ensayo o
procedimiento de ensayo que detecta interacciones
proteína-proteína incluyendo la
co-inmunoprecipitación, reticulación y
copurificación mediante gradientes o columnas cromatográficas. De
manera adicional, los estudios cristalográficos de rayos x se pueden
usar como un medio de evaluar las interacciones con sustancias y
moléculas. Por ejemplo, moléculas recombinantes purificadas en un
complejo de la invención cuando se cristaliza en una forma adecuada
son apropiados para la detección de interacciones
intra-moleculares mediante cristalografía de rayos
x. También se puede usar espectroscopía para detectar interacciones
y en particular, se puede usar instrumentación
Q-TOF. Se pueden ensayar muestras biológicas y
genotecas comercialmente disponibles para los péptidos de unión a
ACE2. Además, los anticuerpos preparados para el ACE2 se pueden
usar para aislar otros péptidos con afinidad de unión a ACE2. Por
ejemplo, se pueden usar anticuerpos marcados para sondar genotecas
de despliegue en fago o muestras biológicas. A este respecto los
péptidos se pueden usar para desarrollar un sistema de expresión
biológico. El uso de estos sistemas permite la producción de
grandes genotecas de secuencias de péptido al azar y la selección de
estas genotecas para las secuencias de péptidos que se unen a
proteínas particulares. Las genotecas se pueden producir mediante
clonación de ADN sintético que codifica secuencias de péptido al
azar en vectores de expresión adecuados (véase Christian et
al. 1992, J. Mol. Biol. 227: 711; Devlin et al., 1990
Science 249: 404; Cwirla et al. 1990, Proc. Natl. Acad, Sci.
USA, 87: 6378). También se pueden construir genotecas mediante la
síntesis concurrente de péptidos de superposición (véase Patente de
Estados Unidos Nº 4.708.871). Se ensayan activadores en modelos de
animales de hipertensión, enfermedad cardíaca o renal.
Se contempla un ensayo para evaluar si un
compuesto candidato es capaz de incrementar la expresión o actividad
de ACE2 mediante el cultivo de células (preferiblemente células
renales o cardíacas) en la presencia de al menos un compuesto cuya
capacidad para activar la expresión o actividad se pretende para
que se determine y después de esto controlar las células para
evaluar un incremento en el nivel de la expresión y/o actividad de
ACE2. La expresión y/o actividad de ACE2 indica que el compuesto
candidato es útil para tratar enfermedad cardíaca o renal e
hipertensión.
Un ensayo similar de selección se puede
realizar con los mamíferos conocidos en la técnica son propensos a
enfermedad cardíaca o enfermedad renal. El compuesto candidato se
administra al mamífero y se mide la expresión y/o actividad de
ACE2. El aumento de expresión y/o actividad de ACE2 indica que el
compuesto candidato es útil para tratar enfermedad cardíaca o
renal.
La determinación de un incremento en la
actividad de ACE2 preferiblemente implica la determinación de si
el compuesto incrementa la actividad proteolítica de ACE2
(incremento de la hidrólisis de sustratos). En una variación de la
invención, los ensayos de la invención se someten a la condición de
que el compuesto candidato no sea una sal de sodio - halógeno o
una sal de potasio - halógeno y el ensayo no se dirige a la
medición del efecto de incrementar la concentración de iones en la
proteolisis de ACE2.
Los procedimientos para producir ACE2 se
describen en el documento CA 2.372.387. un ejemplo de un ensayo
in vitro para la activación de ACE2 se muestra en Vickers
et al., Hydrolysis of biological péptidos by human
angiotensin-converting
enzyme-related carboxypeptidase. J Biol. Chem. 2002,
277(17): 14838. Otros ensayos (así como variaciones de los
ensayos anteriores) serán evidentes para la descripción de esta
invención y las técnicas tales como las descritas en las Patentes
de Estados Unidos números 5.851.788. 5.736.337 y 5.767.075.
Los activadores de la expresión y actividad de
ACE2 se combinan preferiblemente con otros componentes, tal como un
vehículo, en una composición farmacéutica. Estas composiciones se
pueden administrar a un animal, preferiblemente un ser humano, en
forma soluble para evitar o tratar hipertensión, insuficiencia
cardíaca congestiva, insuficiencia cardíaca crónica, insuficiencia
cardíaca aguda, infarto de miocardio, arteriosclerosis,
insuficiencia renal o una enfermedad pulmonar en un mamífero, en el
que la enfermedad pulmonar es enfermedad pulmonar obstructiva
crónica, neumonía, asma, bronquitis crónica, enfisema pulmonar,
fibrosis quística, enfermedad intersticial pulmonar, hipertensión
pulmonar primaria, embolia pulmonar, sarcoidosis pulmonar,
tuberculosis, edema pulmonar, ARDS o cáncer de pulmón. La
enfermedad renal incluye insuficiencia renal. Los activadores de
ACE2 son útiles para regular la presión sanguínea e hipertensión
arterial. La presión sanguínea normal tiene una presión sanguínea
diastólica menor que 85 mm Hg. La alta presión sanguínea normal
tiene una presión sanguínea diastólica entre 85 y 89 mm Hg. La
hipertensión suave corresponde a una presión de sangre diastólica
entre 90 - 104 mm Hg. La hipertensión moderada tienen hasta una
presión sanguínea diastólica entre 105 y 114 mm Hg. La hipertensión
grave tiene una presión sanguínea diastólica mayor que 115 mm Hg. La
presión sanguínea anormal también se determina a partir de la
presión sanguínea sistólica (cuando la presión diastólica en menor
que 90 mmHg). La presión sanguínea normal tiene una presión
sanguínea sistólica de menos de 140 mm Hg. La hipertensión
sistólica límite muestra una presión sistólica sanguínea entre 140 y
159 mm Hg. La hipertensión sistólica aislada tiene una presión
sanguínea sistólica mayor que 160 mm Hg. (Cecil: Essentials of
Medicine, Tercera edición por Andreoli et al. W.B. Saunders
Company (1993)). Hipertensión se diagnostica en un adulto mayor de
18 años de edad si la media de dos o más mediciones de presión
sanguínea durante al menos dos visitas es 90 mm Hg o mayor
diastólica o 140 mm Hg sistólica. Los niños y mujeres embarazadas
tienen una presión sanguínea menor, así una presión sanguínea por
encima de 120/80 (es decir, 120 mm Hg de presión sanguínea
sistólica/80 mm Hg de presión sanguínea diastólica) indica
hipertensión.
hipertensión.
Las composiciones farmacéuticas se puede
administrar a seres humanos o animales mediante una diversidad de
procedimientos que incluyen, pero no se limitan a la administración
tópica, administración oral, administración por aerosol,
instilación intratraqueal, inyección intraperitoneal, e inyección
intravenosa. Las dosificaciones a administrar dependen de las
necesidades del paciente, sobre el efecto deseado y de la vía de
administración elegida. Los polipéptidos se pueden introducir en
las células usando vehículos de administración de in vivo
tales como pero sin exclusión a liposomas.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
preparar mediante procedimientos conocidos para la preparación de
composiciones farmacéuticamente aceptables que se pueden administrar
a pacientes, de manera que una cantidad eficaz de la molécula de
ácido nucleico o polipéptido se combina en una mezcla con un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados se
describen, por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences
(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,
Easton, Pa., Estados Unidos).
En esta base, las composiciones farmacéuticas
pueden incluir un compuesto o sustancia activo, tal como una
molécula de ácido nucleico o polipéptido, en asociación con uno o
más vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, y contenidos
en soluciones tamponadas con un pH adecuado isoosmótico con los
fluidos biológicos. Los procedimientos de combinación de las
moléculas activas con los vehículos o combinación de ellos con
diluyentes son bien conocidos por los expertos en la técnica. La
composición puede incluir un agente de dirección para el transporte
del compuesto activo a sitios específicos dentro del tejido.
Los vectores de expresión son útiles para
proporcionar altos niveles de expresión de ACE2. Los cultivos de
células transformadas con las moléculas de ácido nucleico son
útiles como herramientas de investigación, particularmente para los
estudios de los estados disminución de ACE2. Se incluyen vectores
selectivos para las células cardíacas y células de riñón
preferiblemente células endoteliales que normalmente constituyen
ACE2. Los ejemplos de vectores para las células cardiacas y renales
se describen, por ejemplo, en Rosengart et al. Patente de
Estados Unidos nº 6.322.536; March et al. Patente de Estados
Unidos nº 6.224.584; Hammond et al. Patente de Estados
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Se usan cultivos celulares, preferiblemente
cultivos de células cardíacas y renales y cultivos celulares
endoteliales, en la sobreexpresión e investigación de acuerdo con
numerosas técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, una línea
celular (o bien una célula inmortalizada o un cultivo de células
primarias) se pueden transfectar con un vector que contiene una
molécula de ácido nucleico de ACE2 (o molécula que tiene identidad
de secuencia) para medir los niveles de expresión de la molécula de
ácido nucleico y la actividad de la molécula de ácido nucleico y
polipéptido. Las células también son útiles para identificar los
compuestos que se unen a y activan el polipéptido.
La medición de la expresión o actividad de ACE2
también se usa en: i) diagnosis de enfermedad cardíaca o renal,
enfermedad pulmonar y/o hipertensión ii) identificación de pacientes
en riesgo de desarrollar tal enfermedad antes del desarrollo de la
enfermedad iii) medir la respuesta terapéutica en pacientes que
tienen enfermedad cardíaca tal como enfermedad cardíaca coronaria,
insuficiencia cardíaca crónica, o enfermedad renal y/o hipertensión
y/o lesión pulmonar iv). Medir el éxito de las estrategias
preventivas de enfermedad experimental en tales pacientes en
riesgo. La invención incluye un procedimiento para determinar los
niveles de ACE2 en un animal que comprende las siguientes etapas:
(a) preparar una muestra de corazón o de riñón o de pulmón de un
espécimen recogido del animal; (b) ensayar la presencia de ACE2 en
la muestra; y (c) correlacionar la presencia de niveles de ACE2 en
la muestra con la presencia (o riesgo) de enfermedad tal como
enfermedad cardíaca o renal o pulmonar en el animal. Los niveles de
ACE2 por debajo de lo normal o por debajo de la actividad de ACE2
indican la presencia de riesgo o enfermedad.
El número de nucleótidos de los polimorfismos
que controlan la expresión génica de ACE2, como se ha descrito en
el gráfico anterior y en la Figura 11, se puede determinar
fácilmente por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, un polinucleótido de la invención
se puede convertir en una sonda mediante marcado en el extremo
usando digoxigenina-11-deoxiuridina
trifosfato. Tales sondas se pueden detectar inmunológicamente usando
fragmentos de antidigoxigenina F (ab) de oveja policlonal
conjugados a fosfato alcalino y tetrazolio azul nitro con
5-bromo-4-cloro-3-indoil
fosfato como sustrato cromogénico.
ACE2 se mapea en un QTL asociado a la
hipertensión en tres modelos de ratas de alta presión sanguínea y
niveles de ACE2 se reducen en todas las rezas de ratas
hipertensivas. En ratones, la inactivación genética de ACE2 que
usa recombinación homóloga da como resultado un incremento de los
niveles del péptido de AngII en tejidos, regulación hacia arriba de
genes de hipoxia en la disfunción cardíaca, y cardíaca severa.
La ablación de la expresión de ACE sobre un
antecedente deficiente de ace2 completamente abolía el
fenotipo de insuficiente cardíaca de los ratones con inactivación
única a ace2. Estos datos proporcionan un nuevo paradigma
para la regulación del RAS e identificar ACE2 como un regulador
negativo de RAS que controla la función cardíaca.
La mayoría de las enfermedades cardiovasculares
son caracteres cuantitativos multifactoriales controlados por
factores tanto genéticas como ambientales. Un factor principal para
la enfermedad cardiovascular es el RAS. En contraste a ACE que se
expresa de manera ubicua, el ACE2 recientemente identificado muestra
la expresión específica de tejido. ACE2 regula los niveles
endógenos de AngII, compitiendo con ACE por su sustrato de AngI y/o
mediante la escisión de AngII para generar Ang1-7.
Antes de esta invención, no se conocía nada sobre el papel in
vivo de ACE2 en el sistema cardiovascular. ACE2 regula los
niveles endógenos de AngII. También funciona como un regulador
negativo del RAS.
En tres razas de rata diferentes que desarrollan
hipertensión espontánea o inducida por dieta y enfermedad
cardiovascular, ACE2 se mapea dentro de un QTL definido en el
cromosoma X. En todas estas razas de ratas susceptibles a
hipertensión, los niveles de ARNm y de proteína de ACE2 están
regulados hacia abajo. El locus SS-X identificado
en el análisis de QTL en ratas Sabra también se identifican como un
locus que confiere resistencia a la carga de sal. La reducción en
ACE2 in en la raza sensible a la sal y la ausencia de cualquier
alteración en su expresión en la raza resistente muestra que ACE2
confiere resistencia a los cambios de presión sanguínea inducidos
por la dieta.
La posición del mapa y expresión reducida
muestra que ACE2 es el gen que contribuye a QTL hipertenso sobre
el cromosoma X. Además, el incremento de la expresión de AngI y
AngII en ratones sin ace2 confirman que ACE2 es un regulador
del sistema RAS in vivo. Sin embargo, la pérdida de ACE2
en nuestros ratones no dieron como resultado ningún cambio directo
en la presión sanguínea incluso cuando la función de ACE estaba
bloqueada. Los cambios de la presión sanguínea solamente se producen
cuando la disfunción cardíaca extrema estaba presente en los
ratones mayos de mayor edad. Los factores genéticos que contribuyen
a la hipertensión ellos mismos no alteran la presión sanguínea. En
su lugar, estos QTL definen los determinantes individuales de la
presión sanguínea, que de acuerdo con otros polimorfismos genéticos
promueven el cambio en la presión sanguínea. Los inventores han
identificado la asociación de los polimorfismos ACE2 con alta
presión sanguínea en la población humana. De manera importante, los
datos de los inventores muestran que ACE2 funciona como un
regulador negativo del aumento de la presión
sanguínea.
sanguínea.
De manera inesperada, la perdida de ACE2 en
ratones da como resultado una disfunción profunda contráctil que
conduce a una reducción intensa de la presión sanguínea sistémica en
los ratones de mayor edad. De manera importante, esta disfunción
cardíaca está completamente invertida mediante la rotura de ACE que
sugiere que un producto catalítico de ACE desencadena una
alteración contráctil en la ausencia de ACE2. ya que estos defectos
de contracción se pueden producir en la ausencia de hipertrofia o
cualesquiera cambios detectables en la presión sanguínea, los datos
de los investigadores también proporcionan prueba genética de que el
fenotipo de la enfermedad cardíaca regulado por RAS puede no estar
relacionado de manera genética con sus efectos sobre la presión
sanguínea e hipertrofia cardíaca.
Los inhibidores de ACE y bloqueadores del
receptor de AngII se ha mostrado que tienen un papel cardioprotecor
en la insuficiencia cardíaca en seres humanos, implicando de este
modo AngII en la enfermedad cardíaca. La abolición completa de la
disfunción cardíaca en el doble mutante ace/ace2 de
los investigadores muestra que el RAS controla directamente la
función cardíaca y que ACE2 es un regulador negativo crítico que
antagoniza el RAS e insuficiencia cardíaca. Los experimentos de los
investigadores sobre experimentos de rescate genéticos indican de
una manera notable que es de hecho un producto de ACE que dirige la
insuficiencia cardíaca, es decir, el incremento en AngII observado
en los corazones de ratones sin ace2 es causante de la
disfunción cardíaca. Necesita determinarse si la inhibición
farmacológica del receptor de AngII rescata los fenotipos
cardíacos de ratones mutantes de ace2. De manera interesante,
o los resultados de los investigadores en moscas muestran que una
mutación del elemento P asociada al homólogo de ACE, ACER, da como
resultado un defecto grave y letal de morfogénesis del corazón
(datos no mostrados) que muestran que las funciones de ACE/ACE2 en
el corazón se han conservado a lo largo de la evolución.
El defecto en los corazones mutantes de
ace2 se caracteriza por la disfunción contráctil grave y
regulación hacia arriba de los genes regulados por hipoxia con
solamente ligera remodelación en los ratones de mayor edad, sin
hipertrofia y sin evidencia de pérdida de miocitos. Estos parámetros
fenotípicos y moleculares de corazones con insuficiencia en
ratones mutantes de ace2 son diferentes de hipertrofia y
cardiomiopatía dilatada. Bastante más intrigante, los corazones de
mutantes ace2 se parecen a la atrofia e hibernación
cardíaca encontrado en los casos humanos de enfermedad arterial
coronaria y en los casos de cirugía de desviación. En estas
enfermedades humanas y en modelos animales de atrofia/hibernación
cardíaca, condiciones hipóxicas crónicas conducen a cambios
compensatorios en el metabolismo de miocitos, regulación hacia
arriba de los genes inducidos por hipoxia, y función cardíaca
reducida. Ya que ACE2 se expresa en el endotelio vascular, y no
miocitos cardíacos, es probable que los efectos de ACE2 se confinen
a la vasculatura. Por ejemplo, incrementos locales en AngII podrían
conducir a la vasoconstricción que da como resultado hipoperfusión e
hipoxia. También se ha mostrado que AngII provoca disfunción
endotelial mediante la inducción de estrés oxidativo. Los mecanismos
por los que se la pérdida de ACE2 puede dar como resultado la
regulación hacia arriba de los genes inducibles por hipoxia
necesita determinarse. De manera importante, los datos de los
investigadores muestran que los polimorfismos de ACE2 provocan la
patología de enfermedad cardíaca coronaria en seres humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
La hipertensión y la mayoría de las enfermedades
cardiovasculares son multifactoriales por naturaleza y patogénesis
de la enfermedad está influenciada por múltiples loci de
susceptibilidad genética. En diversos modelos de ratas
recombinantes, se han identificado QTL múltiples para hipertensión.
Ya que ACE2 se mapea en el cromosoma X en seres humanos y un QTL se
ha mapeado para el cromosoma X en varios modelos de ratas de
hipertensión sin ningún gen candidato atribuido a él todavía, ACE2
puede ser un gen candidato para este QTL. Para facilitar el
mapeado cromosómico de ACE2 de ratas, se clonó el ADNc de ACE2 de
rata de longitud completa mediante la selección de una genoteca de
ADNc de rión de rata. ACE2 de rata es altamente homólogo con ACE2
humano y tiene un 32% de identidad y es un 42% similar a ACE humano
y de ratón (Fig. 1a). ACE2 de tipo humano, el gen de rata está
constituido por un único dominio de ACE con un sitio de unión a cinc
conservado, un péptido de señal y un dominio de transmembrana
(Fig. 1b). Similar al ser humano, ACE2 en ratón y rata se expresa
de manera predominante en riñón y corazón, con una expresión débil
en pulmón e hígado (Fig. 1c).
El mapeado del híbrido de radiación mostró que
el gen ACE2 de rata se mapea en el cromosoma X con puntuaciones de
LOD significativas para los marcadores DXRat9,
DXWox14, DXWox15 y DXRat42, colocando ace2
entre DXRat9 y DXRat42 (Fig. 1d). El mapeado
comparativo mostró que la posición del mapa de ace2 se
solapa con un intervalo QTL para la hipertensión identificado en
ratas sensibles as la sal Sabra encontrado entre los marcadores
DXMgh12 y DXRat8 (SS-X).
Además, la región de ace2 cromosómica se mapea en el
intervalo B P3 QTL definido en ratas espontáneamente hipertensas
propensas a apoplejía (SHRSP), y un BB.Xs QTL hipertenso
previamente identificado sobre el cromosoma X de ratas hipertensas
espontáneas (SHR) mediante análisis congénico (Fig. 1d). De este
modo, ACE2 se mapea en un QTL sobre el cromosoma X de rata
identificado en tres modelos separados de hipertensión espontánea e
inducida por la dieta.
Ya que el riñón es un sitio principal de
regulación de la presión sanguínea, se determinaron los niveles de
expresión de ACE2 en los riñones de tres razas de ratas hipertensas.
Los niveles de ARNm de ACE2 se midieron inicialmente en los
riñones de las ratas hipertensas sensibles a sal Sabra (SBH/y) y
ratas Sabra normotensas (SBN/y) de control resistentes a sal. La
carga de sal (con sal DOCA) no tenía efecto sobre la expresión de
ARNm de ACE2 en ratas SBN/y normotensas. De manera intrigante, en
las ratas SBH/y, la carga de sal y el desarrollo de hipertensión
estaban asociados a una reducción significativa de la expresión de
ARNm de ACE2 cuando se compara con las ratas SBN/y normotensas
(Fig. 2a). Hay que hacer notar que el ARNm de ACE2 también era
menor en la dieta regular de alimentación de SBH/y cuando se
compara con los controles SBN/y alimentados con una dieta similar.
Este último hallazgo es consistente con la diferencia de 10 - 20
mmHg en la presión sanguínea observada entre ratas SBH/y y SBN/y
alimentadas con dieta normal.
Para medir los niveles de proteína de ACE2, se
generó un antisuero de conejo específico de ACE2 (aa206 - aa225 de
ACE2 de ratón), que reacciona de manera cruzada con ACE2 tanto de
ratón como humano (no mostrado). En línea con la expresión de ERNm
de ACE2 disminuida, la expresión de proteína de ACE2 se redujo de
manera notable en los animales SBH/y que se alimentaron con dieta
normal (Fig. 2b). El incremento en la presión sanguínea de ratas
SBH/y después de una dieta de 4 semanas de sal DOCA correlacionada
además disminuyó la expresión de proteína de ACE2 (Fig. 2b). la
carga de sal no desencadenó un incremento en la presión sanguínea ni
alteraba la expresión de ACE2 en ratas de control SBN/y
resistentes a sal (Fig. 2b). Los niveles de proteína de ACE2
también disminuyeron de manera significativa en los riñones de
animales SHRSP y SHR espontáneamente hipertensos cuando se compara
con sus controles WKY (Fig. 2b). Además, los niveles de ARNm de ACE2
en ratas SHRSP y SHR hipertensas (no mostrado). La clonación y
secuenciación de la región codificante de ACE2 en las razas de ratas
hipertensas no reveló ningún cambio de secuencias, indicando que la
reducción de la expresión de ACE2 probablemente se produce a
partir de polimorfismos que controlan la expresión del gen de ACE2.
La posición del mapa y expresión reducida de ACE2 en tres razas
diferentes de ratas indican que ace2 es un gen candidato
fuerte para este QTL hipertenso sobre el cromosoma X. Además, la
expresión reducida de ACE2 en las tres razas de ratas hipertensas
sugirieron que esta enzima funciona como un regulador negativo.
Para validar la candidatura de ACE2 como un QTL
y para ensayar si ACE2 tiene de hecho, un papel esencial en la
fisiología cardiovascular y la patogénesis de enfermedades
cardiovasculares, se clonó el gen ACE2 de ratón (Fig. 1a). Similar
a y ACE2 humano, ACE2 murino también se mapea para el cromosoma X
(no mostrado contiene un único dominio de ACE (Fig. 1b), y de
manera predominante se expresa en riñones y corazón tl (Fig. 1c).
De manera interesante, los investigadores observaron dos isoformas
para ACE2 en ratón en todos los tejidos positivos. La
sobreexpresión de ACE2 murino en COS mostró que ACE2 escinde AngI en
Ang1-9 (no mostrado) indicando que ACE2 murino
tiene la misma especificidad bioquímica que ACE2 humano. Para
determinar el papel in vivo de ACE2, el gen ace2 en
ratón se interrumpió reemplazando el exón 9 con el gen de
resistencia a neomicina suprimiendo de manera eficaz el dominio
catalítico de unión a cinc Procedimientos y Fig. 3a). Se usaron dos
líneas de células ES mutadas en el locus ace2 para generar
ratones quiméricos, que se retrocruzaron con C57BL/6 para obtener
la transmisión germinal. Ambas líneas de ratón mostraron fenotipos
idénticos. La transmisión de la mutación de ace2 se
confirmó mediante análisis de transferencia de Southern (Fig. 3b).
la mutación nula de ace2 se verificó mediante la ausencia de
transcripciones de ARNm de ACE2 y análisis de transferencia
de Northern (no mostrado) y de Western (Fig. 3c). La expresión de
ARNm de ACE en los riñones y corazones no se alteró en ratones
mutantes ace2
(Fig. 3d).
(Fig. 3d).
Ya que el gen ACE2 se mapea en el cromosona X,
toda la prole de machos eran o bien no mutantes
(ace2^{-/y}) o de tipo salvaje para ACE2
(ace2^{+/y}) mientras que las hembras eran o bien de tipo
salvaje (ace2^{+/+}), heterocigóticos
(ace2^{+/-}), u homocigóticas (ace2^{-/-}) para la
mutación ace2. Se debe observar que en todos los
experimentos descritos más adelante, hembras ace2^{+/-} se
comportaron de manera similar a las hembras ace2^{+/+} y
los machos ace2^{+/y} indican que no existe un efecto
aparente de de heterocigosis de ace2. Los ratones sin ACE2
no nacieron con la frecuencia de las leyes de Mendel esperada,
aparecieron sanos, y no mostraron ninguna alteración detectable
global en todos los órganos analizados. Además, al contrario que
los ratones macho ace^{-/-} que muestran una fertilidad
significativamente reducida, tanto los machos como las hembras sin
ace2 son fértiles.
Se ha mostrado previamente que los ratones
mutantes ace2 muestran reducción de presión sanguínea y
patología renal. Por lo tanto, se ensayó primero si la la pérdida
de la expresión de ACE2 afecta a la homeostasis de la presión
sanguínea y/o desarrolló o función renal. De manera intrigante, la
pérdida de ACE2 no dio como resultado la reducción de la presión
sanguínea en ratones machos de 3 meses de edad ace2^{-/y}
(Fig. 4a) o hembras ace2^{-/-} (no mostrado) cuando se
compara con sus hermanos de camada de control. Ya que fue posible
que ACE puede compensar la pérdida de ACE2, los inventores
trataron ratones deficientes en ace2 con captopril que
bloquea ACE pero no la función ACE2. Sin embargo, la inhibición
in vivo de ACE con captopril redujo la presión sanguínea de
ratones macho ace^{-/y} a un grado similar como se observó
en los hermanos de camada de tipo salvaje tratados con captopril
(Fig. 4a). De este modo, incluso en un escenario de inhibición de
ACE, la pérdida de ACE2 no tiene efecto directo evidente sobre la
homeostasis de presión sanguínea en este antecedente de ratón
definido. Basándose en los datos de los investigadores de RAS QTL,
los investigadores retrocruzaron sus ratones mutantes con otros
antecedentes de ratón para mostrar el papel de ACE2 en el
control de presión sanguínea similar a los antecedentes genéticos
en seres humanos.
Ya que ACE2 se expresa en gran medida en los
riñones, los inventores examinaron la morfología y función renal.
Todos los ratones de 3 meses y 6 meses de edad machos
ace2^{-/y} y hembras ace2^{-/-} mostraron
morfología renal normal y ningún cambio aparente en cualesquiera
ultraestructuras de riñón (Fig. 4b). Las estructuras celulares y
renales normales del sistema ductal y los glomérulos también se
confirmaron usando morfometría de sección en serie.
Los riñones de ratones deficientes en
ace2 machos y los hermanos de cama de la misma edad se
examinaron usando microscopía óptica (tinción con PAS) y
electrónica (TEM) a los 3 y 12 meses de edad. La gravedad de
esclerosis para cada glomérulo se clasificaron entre 0 y 4+ de una
manera ciega como sigue: 0 representa sin lesión, 1+ esclerosis de
< 25% del glomérulo, mientras 2+, 3+, y 4+ representan esclerosis
de 25 a 50%, 50 a 75%, y > 75% del glomérulo, respectivamente. A
los 3 meses de edad, no existía evidencia de cambios patológicos
en los riñones de los ratones deficientes en ace2. Sin
embargo a los 12 meses de edad, la microscopía óptica reveló un
incremento de esclerosis/lesión glomerular: 1,45 \pm 0,2 vs 0,25
\pm 0,06; n = 6; p < 0.01. La microscopía electrónica mostró
un aumento en la deposición de fibrilas de colágeno en el mesangio
renal y una membrana basal engrosada. La exposición crónica a
niveles elevados de AngII conduce a hipoxia y estrés oxidante en
los riñones de ratones deficientes en ace2. El análisis de
transferencia de Western reveló una expresión aumentada de
factor-1alfa (HIF1-\alpha)
inducible por hipoxia y factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF) en los riñones de los ratones deficientes en ace2. La
medición de productos de peroxidación de lípidos mostró un grado
aumentado de estrés oxidante en los ratones deficientes en
ace2 a los 6 meses de edad: hexanal (1001 \pm 161 vs 115
\pm13 nmol/g; n = 5; p < 0,01) y malondialdehído (48 \pm 6,4
vs 24,3 \pm 2,8 nmol/g; n = 5; p < 0,01).
Estos resultados muestran que la pérdida de ACE2
conduce a una señalización de angiotensina II potenciada de una
manera específica de tejido que por último media en los efectos
perjudiciales en los riñones de los ratones deficientes de
ace2. La disminución de la expresión de ACE2 juega un papel
patológico importante en la enfermedad renal.
La inhibición farmacológica de ACE o receptores
AngII sugirió un papel RAS en la regulación de la función cardíaca
e hipertrofia cardíaca. Sin embargo, ni los ratones sin ace
ni angiotensinógeno desarrollaron ninguna enfermedad
cardíaca manifiesta. Ya que ACE2 se expresa en gran medida en la
vasculatura del corazón, se analizaron los corazones de ratones
deficientes en ace2. Los corazones de ratones mutantes de
ace2 muestran una ligero ad wall adelgazamiento de la pared
del ventrículo izquierdo y un incremento de las dimensiones de la
cámara (Fig. 5a). El adelgazamiento de la pared ventricular
izquierda anterior (AW) e incremento de la dimensión diastólica del
extremo del ventrículo izquierdo (LVEDD) en corazones deficientes en
ace2 también se puede observar mediante ecocardiografía
(Tabla 1). Estos cambios estructurales se observan principalmente
en ratones macho de 6 meses de edad. Sin embargo, las relaciones de
peso corporal corazón eran comparables entre ratones de 3 meses de
edad (no mostrado) y de 6 meses de edad ace2^{-/y} y
ace2^{+/y} (Fig. 5a,b). La ecocardiografía también mostró
que la masa del ventrículo izquierdo (LVM) y relaciones de
LVM/peso corporal eran normales (Tabla 1). Los cambios estructurales
y bioquímicos característicos de la cardiomiopatía dilatada no se
observaron ya que no existía indicación de fibrosis cardíaca
intersticial (Fig. 5c,d) ni cambios prototípicos en ANF, BNP,
\alpha- MHC, b-MHC, y la expresión del gen de
actina del músculo esquelético (no mostrado). Además, los
cardiomiocitos individuales de ratones sin ACE2 no mostraron
evidencia de hipertrofia y no se observó ninguna evidencia de
apoptosis de cardiomiocitos alterada en ratones sin ACE2 como se
detectó mediante la tinción de TUNEL (no mostrado). De este modo, a
pesar de la suave dilatación de los corazones en los ratones sin
ACE2 de 6 meses de edad, no había evidencia de hipertrofia cardíaca
o cardiomiopatía dilatada.
De manera interesante, la determinación de la
función cardíaca mediante ecocardiografía reveló que todos los
ratones macho ace2^{-/y} y hembras ace2^{-/-}
muestran una insuficiencia cardíaca contráctil grave como se
determina por el acortamiento fraccional disminuido (FS), y la
velocidad disminuida de acortamiento de fibras diferencial (Tabla
1 y Fig. 6a,b). La disminución en la función se encontró que era más
grave en los ratones machos y hembras de 6 meses de edad cuando se
compara con los ratones de la misma edad de 3 meses de edad, que
sugiere una progresión en el fenotipo (Tabla 1). Consistente con la
disminución de la contracción cardíaca, los ratones de 6 meses de
edad ace^{2-/y} mostraron una presión sanguínea reducida
(Fig. 6c), una característica no encontrada en hembras de la misma
edad ace2^{-/-} y machos de 3 meses de edad, sugiriendo
que la reducción en la presión sanguínea puede ser el resultado de
la disfunción cardíaca grave y no un efecto directo de la pérdida
de ACE2 sobre la presión sanguínea sistémica. Estos resultados
sorprendentes muestran que ACE2 es un regulador negativo crítico
de la contracción del corazón.
Para confirmar los defectos ecocardiográficos en
la función cardíaca, las mediciones hemodinámicas invasivas se
realizaron en ratones sin ace2. De manera importante, las
mediciones hemodinámicas mostraron que dP/dT-max y
dP/dTmin se redujeron de manera notable en los ratones mutantes
ace2 (Tabla 2), indicando alteración grave de la función
cardíaca contráctil. La pérdida de ACE2 también dio como resultado
una disminución significativa en las presiones ventriculares y
aórticas consistentes con las reducciones observados en la
contracción cardíaca (Tabla 2). De manera notable, los datos
establecen que los defectos en la contracción cardíaca de los
ratones mutantes de ace2 se produce en la ausencia de
cualquier hipertrofia cardíaca manifiesta y puede estar no acoplada
genéticamente con las alteraciones de la presión sanguínea.
La disfunción contráctil grave de y dilatación
suave en la ausencia de hipertrofia o fibrosis cardíaca en ratones
sin ace2 se parece a la atrofia e hibernación cardíaca en
modelos de seres humanos y de animales. La atrofia e hibernación
cardíaca son respuestas adaptativas a la hipoxia crónica tal como
enfermedad arterial coronaria o después de la cirugía de
desviación. Ya que ACE2 se expresa en gran medida en las células
endoteliales vasculares pero la contracción se controla por los
cardiomiocitos, se especuló la pérdida de ACE2 puede dar como
resultado hipoxia cardíaca. Por lo tanto los cambios en los niveles
de expresión de los genes inducibles por hipoxia tales como BNIP325
y PAI-1 se analizaron mediante transferencia de
Northern. En los corazones de ratones sin ace2, la
expresión de ARNm de BNIP3 y PAI-1 se regularon
hacia arriba de manera notable cuando se compara con los hermanos
de camada de tipo salvaje (Fig. 7a). De este modo, la pérdida de
ACE2 da como resultado la inducción de un perfil de expresión de
gen regulado por hipoxia.
Ya que las funciones de ACE2 como una
carboxipeptidasa, que se escinde en un único resto de AngI, para
generar Ang1-9, y un único resto forma AngII para
generar Ang1-7, se propuso la hipótesis que ACE2
puede funcionar como un regulador negativo del RAS compitiendo con
ACE para el sustrato AngI y/o que escinde e inactiva AngII. Si es
correcto, la pérdida de ACE2 debe incrementar los niveles AngII
in vivo. Usando los radioinmunoensayos, los niveles de AngII
se encontraron de hecho que estaban incrementados de manera
significativa en los riñones y corazones de ratones mutantes de
ace2 (Fig. 7b). Además, un incremento en AngI se observó
también en la (Fig. 7b) consistente con AngI que es un sustrato de
la acción de ACE2 in vivo. No se encontraron diferencias en
los niveles de ARNm de ACE en los corazones y riñones de ratones
mutantes de ace2 cuando se compara con los controles que
indican que el incremento de los niveles en los tejidos de AngII no
se debían a un incremento de la expresión de ACE (Fig. 3d). Estos
datos muestran que ACE2 funciona como un regulador negativo del RAS
y que controla los niveles endógenos de AngII.
Si el fenotipo en los corazones de ratones
mutantes ace2 era debido al incremento en los niveles de
AngII, la ablación genética de ACE en combinación con la
interrupción de ACE2 puede servir para reducir los niveles de AngII
rescate del fenotipo observado en los ratones mutantes de ACE2. para
ensayar esta idea, se generaron los ratones doble mutantes
ace/ace2. Estos ratones doble mutantes nacieron a la
relación mendeliana esperada y parecían sanos. La presión sanguínea
(Fig. 8a) y los defectos renales (no mostrado) en los ratones sin
doble ace-ace2 eran similares a la de los
ratones de una sola mutación ace. No se estableció la
fertilidad de los ratones doble mutante ace- ace2 no se
estableció. De este modo, la pérdida de ACE y ACE2 no provoca
ninguna enfermedad aparente además de la observada en ratones de una
sola mutación ace.
Ya que la función cardíaca de los ratones con
inactivación de ACE no se había reseñado anteriormente se
analizaron primero los parámetros cardíacos en estos ratones. En
los ratones ace^{-/-}, los corazones son histológicamente
normales (no mostrado) y no se pudo detectar ningún defecto en la
función cardíaca ningún defecto a los 6 meses de edad (Fig. 8b,c).
De manera importante, la ablación de la expresión de ACE sobre un
antecedente mutante ace2 abolía completamente el fenotipo de
insuficiencia de ratones inactivados una sola vez ace2 (Fig.
8b,c). Además, usando ecocardiografía, todas las funciones cardíacas
de los ratones doble mutantes de la misma edad de 6 meses de edad
ace-ace2 eran comparables con la de sus
hermanos de camada de una sola mutación y de tipo salvaje
ace (Tabla 1). El reestablecimiento de las funciones
cardíacas se produjo en los ratones doble mutantes
ace-ace2 tanto machos como hembras. Estos
datos genéticos muestran que la expresión de ACE se requiere y es
necesaria para desencadenar la insuficiencia cardíaca contráctil en
la ausencia de ACE2. De manera importante, no existe ninguna
diferencia en la presión sanguínea entre los ratones ace e
inactivados ace/ace2 (Fig. 8a), implicando además que
la reducción de la presión sanguínea en ratones macho de mayor edad
ace2 se debe a la disminución dramática en la función
cardíaca.
El síndrome de insuficiencia respiratoria de
adultos (ARDS) es una forma grave de lesión pulmonar aguda y tiene
unas tasas de mortalidad de 40 - 70% incluso cuando está disponible
el cuidado intensivo. Trauma, sepsis grave (infección sistémica),
neumonía difusa y choque son las causas más principales de ARDS, y
entre ellas la lesión pulmonar inducida por ácido es una de las
causas más comunes. Los mecanismos potenciales que provocan la
lesión pulmonar asociada a aspiración incluyen daño inducido por
HCl a la membrana alveolar - capilar, y adhesión, activación y
secuestro de neutrófilos polinucleares (PMN), que da como
resultado edema pulmonar y el deterioro de intercambio de gas. El
tratamiento para ARDS consta de ventilación mecánica y continuación
del tratamiento de la enfermedad o lesión inductora. El tratamiento
soporte que usa fármacos novedosos que protegen el pulmón del daño
de la membrana alveolar capilar adicional conservaría la función
pulmonar de los pacientes de ARDS con el fin de tratar la
precipitación de enfermedad o lesión, que conduce a una disminución
en la tasa de mortalidad de ARDS.
Ya que ACE2 se expresa en pulmones, los
inventores ha determinado si la pérdida de ACE2 tiene algún papel
en las lesiones pulmonares agudas. La Figura 9 muestra los cambios
en la elasticidad de los pulmones (EL) en ratones tratados con HCl
y de control durante un período de 3 horas. Después de la
administración de HCl, los ratones de tipo salvaje sobrevivieron
más de 4 horas, mientras los ratones con inactivación de ACE2
murieron en 2 - 3 horas. El reflejo de la diferencia de ratones
sobrevivientes, con inactivación de ACE2 mostró una respuesta
severa significativamente en la elasticidad de los de los pulmones
que los ratones de tipo salvaje. De este modo, los ratones
inactivados mostraron una respuesta severa más significativa en la
elasticidad de los pulmones que los ratones de tipo salvaje. De
este modo, ACE2 juega un papel significativo en la protección de
los pulmones de la lesión aguda inducida por ácido. De este modo,
la potenciación de la función y/o expresión de ACE2 es una diana
novedosa y no anticipada para el tratamiento de ARDS y enfermedad
pulmonar.
Se clonó ACE2 murino a partir de una base de
datos de propiedad de EST. Usando una sonda ACE2 de ratón, los
investigadores seleccionaron después un ADNc de riñón de rata
(invitrogen) para obtener un ADNc de rata de longitud completa
como se determina mediante la secuenciación de ADN. Para el mapeado
cromosómico, se usó una sonda cromosómica específica de ADNc de
ACE2 de rata para seleccionar una genoteca PAC de rata
(RPCI- 31, Research Genetics), identificando dos clones positivos
(6M6 y 125K9).
Las secuencias de extreme de estos clones se
determinaron y se diseñaron cebadores específicos de ratas (mc2L:
5'- TCAATTTACTGCTGAGGGGG-3', mc2R:
5'-GAGGGATAACCCAGTGCAAA- 3') para determinar la
posición en el mapa cromosómico de ACE2 en rata mediante
selección de un panel híbrido de radiación (RH07.5, Research
Genetics). Se obtuvieron ratas SHR y control WKY de Harlan y se
mantuvieron en las instalaciones de animales del Instituto de Cáncer
de Ontario de acuerdo con las directrices institucionales. Los
tejidos de ratas SHRSP fueron proporcionados amablemente por el Dr.
Detlev Ganten, Alemania. Ratas Sabra resistentes a sal y sensibles a
sal se desarrollaron y se mantuvieron en la instalación de animales
del Centro Médico de Barzilai de la Universidad de
Ben-Gurion, Israel. El tratamiento de sal Doca era
como se ha descrito anteriormente.
Análisis de Expresión. Se preparó el ARN
total a partir de riñones de rata que usa agente de trire. 20 mg
de ARN se resolvió sobre un gel de formamida al 0,8%. Se transfirió
a membrana de nylon (Amersham), y se sondó con una sonda de ADNc
de ACE2 parcial de rata (9-1). La sonda de acción
\beta -y transferencias de Northern de tejidos múltiples se
compraron en Clontech. Para el análisis de western, se
homogeneizaron los riñones en tampón de lisis (50 mM
Tris-HCl, pH 7,4, 20 mM EDTA, y 1%
triton-X 100) complementado con "cóctel
inhibidor" de proteasa completo (Roche) y 1 mM Na_{3}VO_{4}-
100 mg de proteína se resolvió mediante SDS-PAGE
sobre ges de 8% tris-glicina. Se obtuvo ACE2
inmuno-suero a partir de conejos inmunizados con un
péptido específico de ratón de ACE2 DYEAEGADGYNYNRNQLIED. El suero
se purificó por afinidad con el péptido de inmunización que usa el
kit unido a sulfo (Pierce). Se usó un anticuerpo comercialmente
disponible de \beta como control de carga (Santa Cruz).
Generación de ratones mutantes ACE2. Un
vector de dirección (brazo corto de 559 pares de bases, y un brazo
largo de 8,1 kilobase) se construyó usando el vector pKO
ScramblerNTKV-1907 (Stratagene). Una parte de los
nucleótidos que contiene ADN genómico de ace2 que contiene
+1069 a +1299 se reemplazó con el módulo de resistencia a neomicina
en la orientación de sentido contrario. La construcción de dirección
se sometió a electroporación en las células E14K ES, y la
selección para clones ES recombinantes homólogos positivos se
realizó mediante transferencia de Southern de ADN genómico digerido
con EcoRI -se hibridó a las sondas flanqueantes 5' y 3'. Se
inyectaron dos líneas celulares independientes ace^{-/y} ES
en blastocitos derivados de C57BU6 para generar ratones
quiméricos, que se retrocruzaron con ratones C57BU6. Dos líneas
celulares ES proporcionaron transmisión de línea germinal
independiente. Los datos reseñados en este manuscrito son
consistentes con las dos líneas mutantes de ratón. La ablación de la
expresión de ACE2 se confirmó mediante RTPCR, análisis de
transferencia Northern, y Western. Solamente los ratones hermanos de
camada se usaron para todos los experimentos. La histología de
todos los tejidos, ensayos de apoptosis, serología de sangre, y
morfometrías de riñón eran como se ha descrito ^{31}. Los ratones
mutantes de ACE completos se han descrito previamente ^{8} y se
obtuvieron de los Laboratorios Jackson. Se mantuvieron los ratones
en las instalaciones de animales del Ontario Cancer Institute de
acuerdo con las directrices institucionales.
Morfometría del corazón, ecocardiografía,
hemodinámica y mediciones de la presión sanguínea. Para la
morfometría de corazón, se perfundieron los corazones con formalina
al 10% a 60 mmHg y posteriormente se incrustaron en parafina. Se
determinó la fibrosis intersticial de miocardio mediante la
morfometría cuantitativa que usa el análisis de imagen asistida por
ordenador con sustracción de color que usa el kit Image Processing
Tool version 2.5 acoplado al software Photoshop 6.0. Se usaron las
secciones teñidas con rojo Picro-Sirius para
calcular fibrosis intersticial como la relación de las áreas con
tinción PSR positiva comparado con el campo visual completo. Las
determinaciones ecocardiográficas se realizaron como se describe
^{32} usando hermanos de camada de tipo salvaje y mutantes. Se
anestesiaron los ratones con isoflourano/oxígeno y se examinaron
mediante ecocardiografía transtorácica usando un Acuson® Sequoia
C256 equipado con un transductor lineal 15MHz. FS se calculó como:
FS = [(EDD - ESD)/EDD]*100.
Vcfc se calculó como el tiempo de FS/expulsión
corregido para el tiempo cardíaco. Las mediciones hemodinámicas se
realizaron como se ha descrito. En resumen se anestesiaron los
ratones, y la arteria carótida derecha se aisló con un catéter 1.4
French Millar (Millar Inc., Houston) conectado a un amplificador
(TCP-500, Millar Inc.). Después de la inserción del
catéter en la arteria carótida, se introdujo el catéter en la aorta
y después en el ventrículo izquierdo para registrar las presiones
aórticas y ventriculares. Los parámetros medidos y analizados eran
ritmo cardíaco, presión aórtica, presión ventricular izquierda
(LV), presión y sistólica, presión diastólica LV, y los primeros
máximos y mínimos derivados de la presión LV (+dP/dtmax y dP/dtmax,
respectivamente). La medición de la presión sanguínea extremo de
cola se realizaron usando un sistema de análisis de Presión
sanguínea Usitech BP- 2000 fabricado por Visitech Systems (Apex,
NC). Para tratamiento de captopril, se suplementó en el agua de
bebida con 400 mg/l de captopril (Sigma) durante dos semanas antes
de la medición de la presión sanguínea.
Niveles de péptido de angiotensina en
tejidos. Se homogeneizaron corazones y riñones sobre hielo sobre
hielo en etanol al 80%/0,1 N HCl que contiene los inhibidores de
peptidasa descrito anteriormente que incluye fluoruro de
fenilmetilsulfonilo (PMSF, 100 mM). Se centrifugaron los homogenatos
de proteína a 30.000 g durante 20 minutos, se decantaron los
sobrenadantes, y se acidificaron con 1% (v/v) de ácido
heptafluorobutírico (HFBA, Pierce, Rockford, IL). Se concentró el
sobrenadante hasta 5 ml sobre una centrífuga de vacío Savant
(Savant, Farmingdale, NY) y los extractos concentrados se
aplicaron a Sep-Paks activado, se lavaron con
0,1% HFBA, y se fluyeron con 5 ml de metanol al 80%/0,1% de HFBA. Se
realizó el análisis de radioinmunoensayo del contenido en péptido
de angiotensina en los extractos de los tejidos de corazón y riñón.
Los límites de detección para los RIAs Ang II y Ang I eran 0,5
fmol/tubo y Ang I 5 fmol/tubo, respectivamente.
Modelo de lesión de pulmón aguda. Se
usaron en este estudio ratones con inactivación de ACE2 y sus
hermanos de camada (8 - 12 semanas de edad).Un minuto antes de la
exposición de aspiración, se administraron dos inhalaciones
profundas (3 veces por volumen) para hacer convencional la
historia de volumen y se realizaron mediciones como datos
iniciales. Los ratones anestesiados y ventilados mecánicamente
recibían inyección intratraqueal de 2 ml/kg HCl (pH = 1,5),
seguido de un bolo de aire. En el grupo control, los ratones
recibieron inyección de solución salina o ninguna inyección. En
todos los grupos, se realizaron mediciones a intervalos de 30
minutos durante 3 horas. Para determinar fisiológicamente la lesión
pulmonar, se evaluó la elasticidad pulmonar (EL; una recíproca
conformidad de pulmón) midiendo la presión prevista traqueal, flujo,
y volumen. EL se calculó dividiendo la presión prevista traqueal
por el volumen. Los cambios en EL reflejan alteraciones en el
parénquima de pulmón y entumecimiento de los
pulmones.
pulmones.
La presente invención se ha descrito en detalle
con referencia particular las realizaciones particulares. Por
ejemplo, cuando la solicitud se refiere a proteínas, es evidente que
se pueden a menudo usar los péptidos y polipéptidos. Del mismo modo
cuando se describe un gen en la solicitud, es evidente que se pueden
usar a menudo las moléculas de ácido nucleico o fragmentos de
gen.
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Claims (10)
1. Un uso de una cantidad terapéuticamente
eficaz de un polipéptido de ACE2 o ácido nucleico de ACE2 para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de un estado
disminuido de ACE2 seleccionado entre hipertensión, insuficiencia
cardíaca congestiva, insuficiencia cardíaca crónica, insuficiencia
cardíaca aguda, infarto de miocardio, arteriosclerosis,
insuficiencia renal o una enfermedad pulmonar en un mamífero, en el
que la enfermedad pulmonar es enfermedad pulmonar obstructiva
crónica, neumonía, asma, bronquitis crónica, enfisema pulmonar,
fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión
pulmonar primaria, embolia pulmonar, sarcoidosis pulmonar,
tuberculosis, edema pulmonar, ARDS o cáncer de pulmón.
2. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que el mamífero es un ser humano.
3. Un uso de una cantidad eficaz de un transgen
que codifica ACE2 para la preparación de un medicamento para una
terapia génica para un estado disminuido de ACE2 seleccionado entre
hipertensión, insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia
cardíaca crónica, insuficiencia cardíaca aguda, infarto de
miocardio, arteriosclerosis, insuficiencia renal o una enfermedad
pulmonar en un paciente, en el que la enfermedad pulmonar es
enfermedad pulmonar obstructiva crónica, neumonía, asma, bronquitis
crónica, enfisema pulmonar, fibrosis quística, enfermedad pulmonar
intersticial, hipertensión pulmonar primaria, embolia pulmonar,
sarcoidosis pulmonar, tuberculosis, edema pulmonar, ARDS o cáncer
de pulmón.
4. Un uso de acuerdo con la reivindicación 3, en
el que el órgano afectado enfermo es el corazón o riñón o pulmón o
vasos sanguíneos.
5. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 3 ó 4, en el que el transgen de ACE2 se prepara en
un vector de terapia génica.
6. El uso de reivindicación 5, en el que el
vector de terapia génica comprende un vector viral.
7. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, en el que el paciente es un ser humano.
8. Un procedimiento de selección de un compuesto
que es un agonista de la actividad de ACE2, que comprende:
a. proporcionar: i) una preparación purificada
que comprende ACE2, ii) un sustrato, y iii) un compuesto de
ensayo;
b. mezclar dicho ACE2 y dicho sustrato en
condiciones tales que dicho ACE2 pueda actuar sobre dicho sustrato
para producir un producto, en el que dicha mezcla se realiza en
presencia y ausencia de dicho compuesto de ensayo; y
c. medir directa o indirectamente la cantidad de
dicho producto producido en la presencia o ausencia de dicho
compuesto de ensayo, caracterizado porque dicho sustrato es
angiotensina II.
9. El procedimiento de la reivindicación en el
que dicho producto comprende AngI-7.
10. El uso de un polipéptido de ACE2 o ácido
nucleico de ACE2 para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de hipertensión, insuficiencia cardíaca congestiva,
insuficiencia cardíaca crónica, insuficiencia cardíaca aguda,
infarto de miocardio, arteriosclerosis, insuficiencia renal o una
enfermedad pulmonar en un mamífero, en el que la enfermedad
pulmonar es enfermedad pulmonar obstructiva crónica, neumonía, asma,
bronquitis crónica, enfisema pulmonar, fibrosis quística,
enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar primaria,
embolia pulmonar, sarcoidosis pulmonar, tuberculosis, edema
pulmonar, ARDS o cáncer de pulmón.
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