ES2317284T3 - Procedimientos para tratar cancer de colon con la neurotoxina botulinum. - Google Patents

Abstract

Uso de una neurotoxina botulinum, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer de colon administrando una neurotoxina botulinum a un colon, tratando así el cáncer de colon.

Description

Procedimientos para tratar cáncer de colon con la neurotoxina botulinum.

Antecedentes

La presente invención se refiere a procedimientos para tratar tejidos atípicos como tejidos hiperplásticos, quistes y neoplasmas (incluidos tumores y cánceres) y para prevenir el desarrollo o provocar la regresión o remisión de tejidos atípicos, quistes y neoplasmas. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos para tratar el cáncer de colon mediante la administración local de una toxina clostridial en el colon afectado o sus proximidades.

Es conocido que muchos tejidos hiperplásticos se pueden desarrollar, si no son tratados en forma de tejidos cancerosos, por ejemplo, (1) hiperplasia diferente, tejidos de mamas metaplásticos o atípicos se pueden desarrollar en forma de cánceres (véase, por ejemplo, Ellis I.O., et al., Tumors of the Breast, Capitulo 16 (páginas 865-930) de "Diagnostic Histopathology of Tumors", volumen 1, editado por Fletcher C. D. M., segunda edición, Churchill Livingstone (2000), adicionalmente expuesto con posterioridad, así como Fabian C. J. et al. Beyond tamoxifen new endpoints for breast cancer chemoprevention, new drugs for breast cancer prevention,. Ann NY Acad Sci 2001 Dec; 952:44-59); (2) tejidos intestinales hiperplásticos, como pólipos, se pueden transformar en carcinomas (véase, por ejemplo, Der, R. et al. Gastric Neoplasms, capitulo 5 (páginas 105-144) de Chandraspma, P., "Gastrointestinal Pathology", Appleton & Lange (1999) en particular las páginas 106-107; (3) hiperplasia oral y epitelial orofaríngea indica una lesión precancerosa. Sunaga H., et al Expression of granulocyte colony-stimulating factor receptor and platelet-derived endothelial cell growth factor in oral and oropharyngeal precancerous lesions. Anticancer Res 2001 Jul-Aug;21(4B):2901-6;(4) tejido hiperplástico endometrial es un tejido precanceroso. Sivridis E. et al., Prognostic aspects on endometrial hyperplasia and neoplasia, Virchows Arch 2001 Aug;439(2):118-26, y (5) hiperplasia de células de riñón y próstata ha sido documentada como un factor que conduce al desarrollo de células cancerosas. Van Poppel, H., et al., Precancerous lesions in the kidney Scand J Urol Nephrol Suppl 2000;(205):136-65.

Cánceres de mamas

Las mamas (de forma sinónima, las glándulas mamarias) de la hembra humana son glándulas sudoríparas altamente modificadas con la función especializada de proporcionar nutrientes al niño recién nacido. La mama consiste en un tejido glandular epitelial del tipo túbulo-alveolar, tejido conectivo fibroso (estroma) que rodea al tejido glandular y tejido adiposo interlobular. El suministro de nervios de la mama deriva de las ramificaciones anterior y lateral de los nervios intercostales cuarto a sexto que portan fibras eferentes sensoriales y simpatéticas. Las actividades secretoras del tejido glandular están controladas ampliamente por hormonas ováricas e hipofisarias en lugar de por fibras motoras eferentes. En la hembra, las mamas se desarrollan en la pubertad y se retraen en la menopausia. Durante el embarazo, los componentes secretores en la mama se expanden grandemente en su tamaño y número en la preparación para la lactancia. Cada mama consiste en 15-25 unidades glandulares independientes denominadas lóbulos mamarios, que consiste cada uno en una glándula compuesta tubulo-acinalar. Cada lóbulo lleva a un conducto galactófero que converge con otros en el pezón. Los lóbulos están incluidos en una masa de tejido adiposo que está subdividida por tabiques colagenosos. Un área especializada de la piel el halo, rodea la base del pezón. La mama se sitúa tras las fascias pectorales profundas, que a su vez están superpuestas al músculo pectoral y al músculo serratus
anterior.

El cáncer de mamas es el cáncer más común en mujeres (excluido el cáncer de piel y de pulmón) y en los Estados Unidos en 1999 más de 175.000 mujeres fueron diagnosticadas con cáncer de mamas y se estima que de este número, aproximadamente 43.300 morirán de la enfermedad. El cáncer de mamas mata aproximadamente a 40.000 mujeres cada año en los Estados Unidos. En los Estados Unidos el cáncer de mamas supone un 29% de todos los cánceres en mujeres. Se ha estimado que una mujer de cada ocho desarrollará cáncer de mamas en algún momento durante su vida. Aunque la detección precoz da lugar a tasas de curación más elevada, el cáncer de mamas continúa siendo la causa principal de muerte por cáncer de mujeres adultas por debajo de 54 años de edad y la segunda causa más común después de la edad de 54. Entre mujeres de todas las edades, el cáncer de mamas es el segundo solo después del cáncer de pulmón como la causa principal de muerte por cáncer en mujeres. Menos de 1% de todos los casos de cáncer de mamas se producen en hombres.

Los tumores benignos de mamas pueden incluir cambio fibroquístico, fibroadenoma y variantes, lesiones esclerosantes, papiloma (una estructura compuesta por núcleo fibrovasculares cubiertos por epitelio) y enfermedad proliferativa de las mamas. Los quistes se cree que surgen a partir de un proceso de involución lobular. Un quiste es un embolsamiento patológicamente dilatado recubierto por epitelio y que contiene fluido. Se reconocen dos formas principales de quistes de mamas, quistes recubiertos por una capa de epitelio y la forma más común de quiste que está recubierto con epitelio de tipo apocrino, que se parece al epitelio normal de las glándulas sudoríparas apocrinas. Los quistes se cree que surgen a partir de un proceso de involución lobular y son muy comunes, produciéndose en aproximadamente un 19% de la población general y son palpables en un 7%. El tratamiento es habitualmente por aspiración. Los quistes se pueden encontrar en aproximadamente un 77% de las mamas que portan cáncer (Ellis et al. página 866). La capa epitelial apocrina de un quiste de mamas puede mostrar hiperplasia. Adicionalmente, la metaplasia apocrina es un descubrimiento frecuente en la mama y generalmente está asociada con la formación de quistes. Además de ello, la metaplasia apocrina puede estar asociada con otras afecciones benignas de las gládulas mamarias no quísticas, que incluyen adenosis esclerosante (adenosis es un número aumentado o un aumento de los componentes glandulares), papilomas y fibroadenomas. De forma significativa, el cambio apocrino (atipia), que no es un trastorno inflamatorio, es considerado como una indicación de un tipo de tejido precanceroso que presenta para el paciente un riesgo significativamente aumentado de desarrollo posterior de carcinoma de mamas, como carcinoma apocrino o carcinoma medular. Finalmente, la hiperplasia epitelial hiperplasia ductal e hiperplasia lobular se consideran también como un estado de tejido de mamas precanceroso que conducirá a un riesgo de desarrollar cáncer de mamas. Ellis. I.O. et al, Tumors of the Breast, supra, en particular páginas 866-867, 881 y 884.

Por tanto, está claro que los cambios proliferativos o fibroquísticos benignos (enfermedad fibroquística), así como la hiperplasia han sido identificados como marcadores morfológicos de riesgo para el desarrollo de carcinoma de mamas. Rosen, P.R., Rosen's Breast Pathology, second edition, Lippincott Williams & Wilkins (2001), capitulo 10 ("Precancerous Breast Disease"), páginas 229-248, en particular páginas 231-232 y 236-239.

Las mutaciones génicas suponen aproximadamente un 5% del cáncer de mamas familiar. El síndrome de Li-Fraumeni es un síndrome hereditario raro asociado con una incidencia aumentada de neoplasmas de mamas, cerebro y adrenales, así como sarcomas, linfomas y leucemias. La causa de este síndrome se cree que está asociada con la mutación del gen p53, que es un gen supresor de tumores.

El cáncer de mamas puede ser caracterizado como una proliferación maligna de células epiteliales que recubren los conductos o lóbulos de la mama. Generalmente se cree que el cáncer de mamas es dependiente de hormonas, ya que las mujeres sin ovarios en funcionamiento y que nunca recibieron reposición de estrógenos aparentemente no desarrollan normalmente el cáncer de mamas. Los tumores malignos pueden surgir de cualquiera de las estructuras de las mamas. Los carcinomas ductales son los más comunes, seguidos de los carcinomas lobulares y enfermedades malignas que surgen de otros tejidos conectivos.

El carcinoma ductal invasivo (infiltrante) es el tipo de célula más común, que comprende 70% a 80% de todos los casos de cáncer de mamas. Los tumores se producen a través del intervalo de edad del carcinoma de mamas, siendo lo más común en mujeres en la mitad de sus años 50. Está caracterizado por un núcleo sólido, que habitualmente es duro y firme al ser palpado. Frecuentemente está presente un carcinoma ductal asociado in situ y se puede producir una necrosis de comedones tanto en zonas invasivas como en zonas de carcinoma intraductal. El carcinoma ductal invasivo comúnmente se extiende hasta los nódulos linfáticos regionales y presenta el pronóstico peor entre los diversos tipos de conductos. El grado nuclear e histológico han mostrado ser predictores de pronóstico eficaces.

El carcinoma ductal in situ (DCIS) consiste en células epiteliales malignas confinadas en los conductos mamarios, sin evidencia microscópica de invasión a través de la membrana de basamento en el tejido circundante. Según la diferenciación tumoral, el DCIS puede ser adicionalmente dividido en un grado bajo, intermedio y alto. Esta estratificación tiene implicaciones en el pronóstico. Hay cinco subtipos histológicos de DCIS a saber, comedón, pupilar, micropapilar, cribriforme y sólido. El subtipo de comedón presenta la probabilidad más elevada de un grado nuclear alto, microinvasión y sobreexpresión del oncogen her-2/neu. La anormalidad mamográfica más característica asociada con el DCIS está constituida por las "microcalcificaciones asociadas". Se han propuesto nuevos sistemas de clasificación que usan una combinación de arquitectura, grado nuclear y necrosis. El carcinoma lobular invasivo es relativamente poco común, comprendiendo solo un 5% a 10% de los tumores de mamas. Los carcinomas lobulares invasivos se caracterizan por una proporción más elevada de multicentricidad en la misma mama o la opuesta. Las lesiones tienden a tener márgenes mal definidos y ocasionalmente la única evidencia es un espesamiento o endurecimiento sutil. Los pacientes con carcinoma lobular infiltrante son especialmente propensos a tener un carcinoma bilateral. Por etapas, el carcinoma lobular invasivo tiene un pronóstico similar al carcinoma ductal infiltrante.

El carcinoma lobular in situ (LCIS) generalmente carece de indicios clínicos o mamográficos específicos y se produce más frecuentemente en mujeres pre-menopáusicas. Por definición, estas células cancerígenas están confinadas en los lóbulos mamarios sin invasión. El LCIS se caracteriza microscópicamente por una proliferación sólida de células pequeñas. Las células tienen una baja velocidad de proliferación, normalmente son positivas a receptores de estrógenos y raramente expresan el encogen her-2/neu. Como hay un riesgo descrito de bilateralismo en esta enfermedad algunos investigadores han recomendado un tratamiento mediante mastectomía simple bilateral con reconstrucción inmediata de la mama. Si se escoge una espera bajo observación, es obligatoria una observación de por vida ya que el riesgo aumentado de cáncer de mamas persiste de forma indefinida. El carcinoma tubular es conocido también como un carcinoma bien diferenciado. La frecuencia de metástasis de nódulos linfáticos axilares es de aproximadamente un 10%, inferior al del carcinoma ductal. El pronóstico es considerablemente mejor que para un carcinoma ductal invasivo. El carcinoma medular se caracteriza por una infiltración prominente de linfocitos. Los pacientes con carcinoma medular tienden a ser más jóvenes que los de otros tipos de cáncer de mamas. El pronóstico se cree también que es mejor que para un cáncer ductal invasivo.

El carcinoma de mamas inflamatorio se caracteriza por un edema difuso de la piel, enrojecimiento de la piel y las mamas y firmeza del tejido subyacente con una masa palpable. La manifestación clínica es debida principalmente a una embolización tumoral del tejido linfoide dérmico (canales linfáticos de la piel) con una congestión asociada de los vasos capilares superficiales. El cáncer de mamas inflamatoria presenta un pronóstico malo y es preferentemente tratado por extirpación.

La enfermedad de Paget del pezón es una forma rara de cáncer de mamas que se caracteriza clínicamente por cambios eccematoides del pezón. Se cree que la enfermedad de Paget representa el desplazamiento de células malignas desde conductos mamarios subyacentes en el pezón. El pronóstico de pacientes con enfermedad de Paget parece que es similar al de mujeres con otros tipos de carcinomas de mamas por etapas.

Los tumores de mamas benignos incluyen fibroadenoma, fibromas periductales (un tumor de tejidos conectivos), tumor epitelial intraductal, quistes de retención, lipomas (tumor graso), mastitis quística crónica y necrosis grasa. Lo más a menudo se producen durante el período reproductivo de la vida o justo después. A menudo son difíciles de distinguir de los tumores malignos y deben ser observados en cuanto a un cambio de tamaño o inclusión linfática, en cuyo caso el crecimiento debe ser cortado y examinado. Los mamogramas, ultrasonidos, termografía y aspiración de formas quísticas pueden ayudar al diagnóstico.

Un diagnóstico de cáncer de mamas se puede hacer mediante un examen patológico del tejido de la mama. Un bulto en la mama habitualmente requiere una biopsia incluso si el mamograma es descrito como normal. El tejido de la mama puede ser obtenido mediante biopsia de aspiración con aguja o biopsia quirúrgica. La aspiración con aguja se usa por los mismos facultativos para ayudar a diferenciar entre quistes y tumores sólidos. Los quistes desaparecen frecuentemente después de la aspiración y supresión de fluido. Los exámenes citológicos o patológicos del material retirado en la aspiración se pueden usar para identificar el cáncer. Los ultrasonidos pueden ayudar a determinar si el bulto es sólido o quístico. Se puede usar también MRI de mamas. La biopsia por extirpación, el procedimiento más comúnmente realizado, es usada cuando los bultos son pequeños. En estos casos se extirpa el tumor completo y un margen de tejido normal. Si el tumor es grande, se puede hacer una biopsia de incisión para suprimir una pequeña cantidad de tejido para un examen patológico. El tejido obtenido de una biopsia quirúrgica puede ser evaluado mediante sección congelada, que permite un diagnóstico en 30 minutos y puede estar seguida de una cirugía definitiva; pero la mayoría de los cirujanos esperan para una sección permanente, que dura aproximadamente 24-48 horas. Esta última aproximación permite que el paciente tenga tiempo de plantear opciones de tratamiento con el facultativo y es la aproximación más común.

La vía más común de extensión del cáncer de mamas es la de nódulos linfáticos axilares. Aproximadamente un 30-40% de los pacientes con cáncer de mamas tienen ya nódulos axilares positivos (afectados por la enfermedad) cuando el tumor es palpable. Cuantos más nódulos axilares estén involucrados, mayor es el riesgo de micrometástasis (células tumorales clínicamente indetectables) en cualquier otro lugar y de recaída o reaparición. Los sitios comunes de reaparición del cáncer de mamas son reapariciones locales en el sitio original en la mama o extensión distante a los huesos, hígado, pulmón y cerebro. Algunas complicaciones de la enfermedad metastático incluyen comprensión de la médula espinal, fracturas patológicas de los huesos, derrame pleural y obstrucción de los bronquios.

Los cánceres de mamas se dividen según el tipo de célula con tipos que varían con la incidencia, modelos de crecimiento y metástasis y supervivencia. El carcinoma ductal infiltrante es el tipo más común de cáncer de mamas, ascendiendo a aproximadamente un 70% de los tumores. Los cánceres de mamas inflamatorios raros (1-4% de los casos de cánceres de mamas) están asociados con los pronósticos peores. El carcinoma in situ (CIS) es un cáncer no invasivo que tiene un excelente pronóstico y puede ser detectado a menudo mediante mamografía cuando no es palpable nada significativo.

Las recomendaciones de tratamiento difieren dependiendo del tipo y la fase de la enfermedad en el momento del diagnóstico. La enfermedad de fase I o II es tratada generalmente mediante cirugía de conservación de mamas e irradiación o mastectomía radical modificada con o sin reconstrucción de la mama. La mastectomía y la irradiación son tratamientos locales y obviamente no afectarán a las células cancerígenas que ya han tenido metástasis. Se puede proporcionar también una quimioterapia adyuvante a pacientes con enfermedad en fase temprana que tienen un riesgo superior de desarrollar la enfermedad metastática. Para pacientes con receptores de estrógenos positivos, la quimioterapia adyuvante o tamoxifeno se consideran actualmente un tratamiento estándar. La función de la extirpación o supresión de los ovarios para pacientes positivos a ER pre-menopáusicas está bajo investigación clínica. Un nódulo linfático centinela es el primer nódulo linfático a lo largo de la trayectoria de drenaje linfático desde un tumor primario. Una biopsia de nódulos linfáticos centinela seguida de inyección de radio-isotopos (coloide de tecnecio- 99m azufre) y/o colorante azul vital alrededor del tumor primario o lecho tumoral lleva una menor morbilidad y coste que una disección axilar completa. La técnica sigue bajo investigación. Los pacientes con cánceres de mamas localmente avanzados (etapa III) tienen un pronóstico peor. Se puede conseguir un buen control local con una combinación de cirugía quimioterapia e irradiación. La quimioterapia es considerada porque los pacientes con fase III están en riesgo de desarrollar metástasis distantes. Las aproximaciones de tratamientos para pacientes con enfermedad localmente recurrente o metastática varían dependiendo del sitio y el alcance de la enfermedad. En muchos casos, se combinan terapias locales y sistémicas. Como los pacientes con enfermedad metastática raramente exhiben una repuesta duradera a los tratamientos estándar, los investigadores están evaluando el uso de regímenes de quimioterapia a dosis elevada seguida de trasplante de médula ósea autóloga (o reposición de células troncales).

La cirugía de conservación de las mamas consiste en la extirpación del tumor y una disección parcial de nódulos linfáticos axiliares (inferiores). Los términos "lumpectomía", "resección segmental", "tilectomía" y "mastectomía parcial" se usan frecuentemente para describir la cirugía local. La cirugía está seguida normalmente de una terapia de radiación para todos los pacientes con carcinoma invasivo y la mayoría de pacientes con carcinoma in situ. Estudios recientes de pacientes con tumores pequeños de hasta 5 cm de tamaño y sin evidencia de enfermedad multifocal o cáncer intraductal extensivo no muestran diferencias en la supervivencia entre la cirugía de conservación de las mamas seguida de terapia de radiación y la mastectomía radical modificada. La masectomía radical modificada es una supresión de la mama completa más una disección de nódulos axiliares. Las desventajas de una mesectomía radical modificada son de deformidad cosmética y la posibilidad potencial de problemas psicosociales que afectan a la imagen corporal y autoestima.

Hay muchas deficiencias e inconvenientes en las terapias actuales para afecciones benignas de mamas y cánceres de mamas. Así, la mastectomía radical modificada da lugar a la pérdida de una parte del cuerpo, una imagen corporal alterada, la necesidad de una prótesis, una cirugía reconstructiva opcional, tirantes de la pared torácica y necrosis cutánea adiposa. La mastectomía parcial da lugar a la disección de nódulos auxiliares e irradiación, fibrosis pectoral, hiperpigmentación, fracturas de costillas, edema pectoral, cambios en la sensibilidad de la piel, miositis y duración prolongada de terapia primaria. De hecho, la mastectomía tanto radical como parcial puede dar lugar a pérdida sensorial una necesidad de cuidados de las manos y los brazos y complicaciones post-operatorias que pueden incluir serosa, hematoma, infección de heridas, linfedema, debilidad de los brazos, dolor, riesgos psicológicos, movilidad dificultada de los brazos, lesión de los nervios y cansancio. Un serosa es la acumulación de fluido seroso o serosanguíneo en el espacio muerto de las fosas axiliares o la pared torácica. Los sarcomas pueden retrasar la curación y desarrollar infecciones. Los hematomas se producen cuando la sangre se acumula en el espacio intersticial y pueden ser aspirados cuando están licuados o ser reabsorbidos a lo largo del tiempo sin intervención.

La lesión de los nervios se puede producir a pesar de los esfuerzos quirúrgicos para evitar el trauma. Los pacientes pueden quejarse de sensaciones de dolor, hormigueo, estupor, pesadez o sensibilidad aumentada de la piel en el brazo o el pecho. Estas sensaciones cambian a lo largo del tiempo y habitualmente desaparecen durante un año o con posterioridad. Menos a menudo, se puede producir una atrofia muscular secundaria a la lesión de los nervios y dar lugar a una función disminuida de los brazos o los hombros.

Como las células cancerígenas de mamas clínicamente indetectables pueden permanecer a continuación de la extirpación local del cáncer se proporciona una terapia de radiación para un control local del tumor. La terapia de radiación se puede usar también de forma pre-operatoria para contraer tumores de mamas grandes y hacerlos más fácilmente extirpables. La terapia de radiación paliativa es comúnmente usada para aliviar el dolor de las metástasis óseas y para el tratamiento sintomático de las metástasis en otros sitios, como en el cerebro. El cansancio, reacciones cutáneas, cambios de sensación, color y texturas de la piel y la inflamación de las mamas son comunes durante el transcurso de la terapia de radiación de las mamas e inmediatamente a continuación.

La quimioterapia, terapia hormonal o una combinación de las dos puede ser usada para palear los efectos de la enfermedad metastática. Las recomendaciones para una quimioterapia adyuvante y/o terapia hormonal adyuvante son usadas habitualmente sobre el número de nódulos axiliares positivos, estado menospáusico, tamaño del tumor primario y el ensayo de receptores de estrógenos. Los fármacos quimioterapéuticos más comúnmente usados son agentes de alquilación, antimetabolitos, antibióticos antitumorales (herceptina) y alcaloides vinca. La manipulación hormonal se consigue principalmente a través de bloqueadores hormonales y de forma poco frecuente mediante la supresión quirúrgica de glándulas que producen hormonas sexuales (ooforectomía, adrenalectomía o hipofisectomía). El tamoxifeno, un anti-estrógeno, es el agente hormonal más ampliamente usado. Los agentes hormonales de segunda línea, como Femara y Arimidex, están disponibles actualmente para pacientes negativos a ER/PR y/o pacientes que fracasaron con el tamoxifeno. Desgraciadamente, la quimioterapia para el cáncer de mamas puede tener numerosos efectos secundarios perjudiciales que incluyen cansancio, aumento de peso, nauseas, vómitos, alopecia, perturbaciones del apetito y el sentido del gusto, neuropatías, diarreas, supresión de médula ósea, síntomas menopáusicos, pérdida del pelo y aumento de peso. Adicionalmente, el fármaco de elección de primera línea, tamoxifeno, puede aumentar el riesgo de cáncer de útero y coágulos de sangre.

Neuroblastomas

El neuroblastoma es uno de los tumores sólidos más comunes de la primera infancia habitualmente encontrado en bebés o niños jóvenes. Aproximadamente un 96% de los casos se producen antes de la edad de 10 años. El neuroblastoma supone aproximadamente un 15% de todas las muertes de cáncer en la infancia. La enfermedad se origina comúnmente en la médula supra-adrenal o en otros sitios del tejido nervioso simpatético. El sitio más común de aparición de un neuroblastoma es el abdomen (cerca de la glándula adrenal) pero se puede encontrar también en el pecho, cuello, pelvis u otros sitios. La mayoría de los pacientes de cáncer de neuroblastoma tienen una aparición ampliamente extendida en el diagnóstico. Los síntomas más comunes del neuroblastoma son el resultado de la presión por el tumor o dolor de huesos a partir de un cáncer que se ha extendido hasta los huesos. Los ojos saltones y los círculos oscuros alrededor de los ojos son comunes y están provocados por el cáncer que se extiende hasta la zona posterior a los ojos. Los neuroblastomas pueden comprimir la médula espinal, provocando parálisis. Ocasionalmente se encuentran fiebre, anemia y presión sanguínea elevada. Raramente, los niños pueden tener diarreas acuosas graves, movimientos musculares descoordinados o convulsivos o movimiento ocular incontrolable.

Leucemias

El adulto medio tiene aproximadamente cinco litros de sangre, cuyas funciones incluyen suministrar elementos esenciales, oxigenación y supresión de productos residuales. La sangre está compuesta por glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas y plasma. Los glóbulos blancos ayudan a luchar contra la infección. Las plaquetas sanguíneas están involucradas en la formación de coágulos para evitar la pérdida de sangre desde las heridas. Aproximadamente un 55% de la sangre es plasma, un líquido claro color pajizo que porta las células sanguíneas y plaquetas y transporta los nutrientes de la digestión y las hormonas desde las glándulas a través del cuerpo.

Como se ha establecido, los glóbulos blancos son responsables de un mecanismo de defensa. Hay dos tipos principales de glóbulos blancos los linfocitos y los monocitos. Hay dos tipos de linfocitos, linfocitos B (células B) involucrados en la generación de anticuerpos y linfocitos T (células T). Las células T se dividen adicionalmente en células T inflamatorias, que reclutan macrófagos y neutrófilos hasta el sito de infección u otro tejido dañado, linfocitos t citotóxicos, que destruyen las células infectadas por virus y células T helper, que aumentan la producción de anticuerpos por las células B.

La leucemia linfoblástica aguda (ALL) es la leucemia más común en niños. Es un cáncer de los glóbulos blancos, específicamente de los linfocitos. Las células de leucemia son células sanguíneas anormales que ya no funcionan normalmente. Por lo tanto, los glóbulos blancos con ALL no pueden ayudar a luchar contra las infecciones del cuerpo. Por esta razón, los niños con ALL a menudo contraen infecciones y tienen fiebres. Dependiendo del número de células anormales y de donde se localizan estas células, los pacientes con leucemia pueden tener un cierto número de síntomas. Los niños con ALL tienen a menudo cantidades bajas de glóbulos rojos sanos y plaquetas. Como consecuencia, no hay suficientes glóbulos rojos para portar el oxígeno a través del cuerpo. En este estado, denominado anemia, los pacientes pueden parecer pálidos y sentirse débiles y cansados. Cuando no hay suficientes plaquetas, los pacientes fácilmente tienen sangrías y forúnculos. Algunos de los síntomas comunes de la ALL incluyen: fiebre, cansancio, infecciones frecuentes, nódulos linfáticos, hígado o bazo inflamados o tiernos, palidez o tez blanquecina; facilidad de hemorragias o forúnculos; manchas rojas diminutas (denominadas petequias) debajo de la piel y/o dolor de huesos o articulaciones.

Cánceres de próstata

La próstata es parte del sistema reproductor masculino. Una próstata sana tiene aproximadamente el tamaño de una nuez y tiene una forma enroscada. Está colocada en la parte frontal del recto y debajo de la vejiga y envuelve a la uretra. La próstata es una glándula que produce parte del fluido seminal, que ayuda a portar el esperma como parte del semen durante la eyaculación. Una próstata aumentada comprimirá la uretra, provocando problemas urinarios al ralentizar o detener el flujo de orina desde la vejiga hasta el pene.

Más de un 70% de todos los cánceres de próstata son diagnosticados en hombres con más de 65 años. Aunque la etiología del cáncer de próstata es desconocida, los factores de riesgo incluyen el medio ambiente, aspectos genéticos y la historia familiar. Una información relativa a los familiares de primer grado (es decir, padres o hermanos) ha mostrado un aumento por encima de 2 a 11 veces en el riesgo de cáncer de próstata respecto a hombres que tienen un historial de esta enfermedad en su familia. Las tasas de mortalidad para el cáncer de próstata son más de dos veces mayores en hombres afroamericanos que en hombres caucásicos. Debido al riesgo adicional, es recomendado un control más temprano del cáncer de próstata para hombres afroamericanos. Según la entidad American Cancer Society, los hombres con 50 años y más, y los que tienen una edad por encima de los 45 que están en grupo de riesgo elevado, como los hombres afroamericanos y hombres con un historial familiar de cáncer de próstata, deben ser sometidos a un

\hbox{ensayo de sangre del antígeno específico de la próstata
(PSA)  y un examen rectal digital (DER) una vez al año.}

Los síntomas del cáncer de próstata incluyen comúnmente: problemas urinarios, incapacidad para orinar o dificultad para comenzar o detener el flujo de orina, la necesidad de orinar frecuentemente, especialmente por la noche, un flujo débil o interrumpido de orina, dolor o escozor durante la micción dificultad para tener una erección, sangre en la orina o el semen y dolor frecuente en la parte inferior de la espalda, las caderas y parte superior de los muslos.

Melanoma

La piel es el órgano más grande del cuerpo. Protege contra el calor, la luz solar, heridas e infecciones. Ayuda a regular la temperatura corporal, almacena agua y grasas y produce vitamina D. La piel tiene dos capas principales: la epidermis externa y la dermis interna. La epidermis está formada principalmente por células de tipo escamas lisas denominadas células escamosas. Las células redondas denominadas células basales se sitúan bajo las células escamosas en la epidermis. La parte inferior de la epidermis contiene también melanocitos. La dermis contienen vasos sanguíneos, vasos linfáticos, folículos pilosos y glándulas. Algunas de estas glándulas producen sudor, que ayuda a regular la temperatura corporal. Otras glándulas producen sebo, una sustancia aceitosa que ayuda a preservar la piel de la sequedad. El sudor y el sebo alcanzan la superficie de la piel a través de aberturas diminutas denominadas poros.

El melanoma es un cáncer de la piel. Se produce cuando los melanocitos (células pigmentadas) se hacen malignos. El melanoma es un tipo frecuentemente fatal de cáncer de la piel. Cada año en los Estados Unidos, más de 53.600 personas son diagnosticadas de melanoma. En algunas partes del mundo, especialmente entre los países occidentales, el melanoma se está haciendo más común cada año. Por ejemplo, en los Estados Unidos el porcentaje de personas que desarrollan melanoma se ha hecho más del doble en los últimos 30 años.

El melanoma es uno de los cánceres más comunes. Las posibilidades de desarrollarlo aumentan con la edad, pero esta enfermedad afecta a personas de todas las edades. Se puede producir en cualquier superficie de la piel. En los hombres el melanoma aparece a menudo en el tronco (la zona entre los hombros y las caderas) o la cabeza y el cuello. En las mujeres, se desarrolla a menudo en la parte inferior de las piernas. El melanoma es raro en personas de raza negra y otras con piel oscura. Cuando se desarrolla en personas con piel oscura, tiende a producirse bajo las uñas de los dedos de las manos o de los pies o en las palmas de las manos o las plantas de los pies. Cuando el melanoma se extiende, las células cancerígenas pueden mostrarse en las proximidades de los nódulos linfáticos. Se encuentran grupos de nódulos linfáticos por todo el cuerpo. Los nódulos linfáticos atrapan las bacterias, células cancerígenas u otras sustancias perjudiciales que pueden estar en el sistema linfático. Si el cáncer ha alcanzado los nódulos linfáticos, esto puede significar que las células cancerígenas se han extendido a otras partes del cuerpo como el hígado, los pulmones o el cerebro. A menudo, el primer indicio de melanoma es un cambio en el tamaño, la forma, el color o la textura de un lunar existente. La mayoría de los melanomas tienen una zona negra o azul-negra. El melanoma puede aparecer también como un nuevo lunar. Puede ser negra, anormal o "de apariencia fea".

Cánceres de colon y rectal

El cáncer de colón es el objeto de esta invención.

El colon y el recto son partes del sistema digestivo. Forman un tubo muscular largo denominado el intestino grueso. El colon es el primer metro o metro y medio del intestino grueso y el recto está constituido por los últimos 10 o 12,5 centímetros. La parte del colon que se une al recto es el colon sigmoide. La parte que se une al intestino delgado es el ciego. Los alimentos parcialmente digeridos entran en el colon desde el intestino delgado. El colon separa el agua y los nutrientes de los alimentos y almacena el resto como un residuo. El residuo pasa desde el colon al recto y seguidamente fuera del cuerpo a través del ano.

En los Estados Unidos, el cáncer colorrectal es el cuarto cáncer más común en hombres después del cáncer de piel, próstata y pulmón. Es también el cuarto cáncer más común en las mujeres después del cáncer de piel, pulmón y mamas. Los síntomas comunes del cáncer colorrectal incluyen: un cambio en los hábitos del intestino, diarreas, estreñimiento o la sensación de que el intestino no se ha vaciado completamente; sangre (roja brillante o muy oscura) en las heces; heces que son más estrechas de lo habitual; malestar abdominal general (dolores frecuentes por gases, dilatación saciedad y/o calambres); pérdida de peso sin razón conocida, cansancio permanente, nauseas y vómitos.

Tratamientos del cáncer y efectos secundarios

El tratamiento para un cáncer, como un cáncer de mamas neuroblastoma, leucemia, cáncer de próstata, melanoma o cáncer colorrectal, puede ser local o sistémico. Los tratamientos locales, como la cirugía y la radiación, afectan a las células cancerígenas en el tumor y en las zonas próximas al mismo. Los tratamientos sistémicos, como la quimioterapia, terapia hormonal y terapia biológica se desplazan a través de la corriente sanguínea, alcanzando las células cancerígenas en todo el cuerpo.

Puede ser difícil proteger las células sanas de los efectos perjudiciales del tratamiento del cáncer. Como el tratamiento deteriora las células y tejidos sanos, a menudo provoca efectos secundarios. Los efectos secundarios del tratamiento del cáncer dependen principalmente del tipo y el alcance del tratamiento. También, los efectos puede que no sean iguales para cada persona y pueden cambiar para una persona de un tratamiento al siguiente.

La cirugía es una terapia para suprimir el cáncer; el cirujano puede suprimir también algo del tejido circundante y nódulos linfáticos cerca del tumor. A veces la cirugía se hace sobre una base de pacientes externos o el paciente puede tener que permanecer en el hospital. Esta decisión depende principalmente de tipo de cirugía y del tipo de anestesia.

Los efectos secundarios de la cirugía dependen de muchos factores que incluyen el tamaño y ubicación del tumor, el tipo de operación y la salud general del paciente. Aunque los pacientes a menudo se sienten incómodos durante los primeros pocos días después de la cirugía, este dolor puede ser regulado con medicamentos. Es común también que los pacientes se sientan cansados o débiles durante un período después de la cirugía. La duración de este período necesario para recuperarse de una operación varía entre los pacientes.

La terapia de radiación (también denominada radioterapia) usa rayos de energía elevada para destruir células cancerígenas. Para algunos tipos de cáncer, la terapia de radiación puede ser usada en lugar de la cirugía como el tratamiento primario. La terapia de radiación puede ser proporcionada también antes de la cirugía (terapia neoadyuvante) para contraer un tumor de forma que sea más fácil de suprimir. En otros casos, la terapia de radiación se proporciona después de la cirugía (terapia adyuvante) para destruir cualesquiera células cancerígenas que puedan permanecer en la zona. La radiación puede ser usada sola o junto con otros tipos de tratamiento, para aliviar el dolor u otros problemas si el tumor no puede ser suprimido.

La terapia de radiación puede estar en cualquiera de dos formas: externa o interna. Algunos pacientes reciben ambas. La radiación externa procede de una máquina que dirige los rayos a una zona específica del cuerpo. Lo más a menudo, este tratamiento es proporcionado sobre una base de pacientes externos en un hospital o clínica. No queda radioactividad en el cuerpo después del tratamiento. Con la radiación interna (también denominada radiación de implante, radiación intersticial o braquiterapia), la radiación procede de un material radioactivo que está sellado en agujas, semillas, alambres o catéteres y es colocado directamente en el tumor o sus proximidades. El implante puede ser permanente o temporal. La cantidad de radiación en un implante permanente disminuye hasta un nivel seguro antes de que la persona salga del hospital. Con un implante temporal no queda radioactividad en el cuerpo después de que se retire el implante.

Los efectos secundarios de la terapia de radiación dependen de la dosis de tratamiento y de la parte del cuerpo que sea tratada. Los pacientes es probable que se sientan extremadamente cansados durante la terapia de radiación especialmente en las últimas semanas de tratamiento. A menudo es necesario un descanso extraordinario, pero los doctores habitualmente alientan a los pacientes para que intenten permanecer tan activos como puedan entre períodos de descanso. Con la radiación externa, puede haber un oscurecimiento o "bronceado" permanente de la piel en la zona tratada. Además, es común tener una pérdida temporal del pelo en la zona tratada y que la piel se ponga roja, seca tierna y con picor. La terapia de radiación puede provocar también una disminución en el número de glóbulos blancos; células que pueden ayudar a proteger el cuerpo contra una infección. Aunque la terapia de radiación puede provocar efectos secundarios, habitualmente estos pueden ser tratados o controlados. La mayoría de los efectos secundarios son temporales, pero algunos pueden ser persistentes o producirse meses o años después.

La quimioterapia es el uso de fármacos para destruir células cancerígenas. El doctor puede usar un fármaco o una combinación de fármacos. La quimioterapia puede ser el único tipo de tratamiento que necesite un paciente, o puede ser combinado con otras formas de tratamiento. La quimioterapia neoadyuvante se refiere a fármacos proporcionados antes de la cirugía para contraer un tumor; la quimioterapia adyuvante se refiere a fármacos proporcionados después de la cirugía para ayudar a evitar que reaparezca el cáncer. La quimioterapia puede ser usada también (sola o junto con otras formas de tratamiento) para aliviar los síntomas de la enfermedad.

La quimioterapia habitualmente es proporcionada en ciclos: un período de tratamiento (uno o más días cunado se proporciona un tratamiento) seguido de un período de recuperación (varios días o semanas), seguidamente otro período de tratamiento, etc. La mayoría de los fármacos anticancerígenos son proporcionados mediante inyección en vena (IV); algunos son inyectados en un músculo o bajo la piel y algunos son proporcionados por la boca.

A menudo, los pacientes que necesitan muchas dosis de quimioterapia IV reciben los fármacos a través de un catéter (un tubo fino y flexible) que permanece en su sitio hasta que se termina el tratamiento. Un extremo del catéter se coloca en una vena grande en el brazo o el pecho y el otro extremo permanece fuera del cuerpo. Los fármacos anticancerígenos son proporcionados a través del catéter. Los pacientes que tienen catéteres evitan la incomodidad de tener una aguja insertada en una vena para cada tratamiento.

A veces los fármacos anticancerígenos son proporcionados de otras formas. Por ejemplo, en una aproximación denominada quimioterapia intraperitoneal, los fármacos anticancerígenos son colocados directamente en el abdomen a través de un catéter. Para alcanzar las células cancerígenas en el sistema nervioso central (CNS), el paciente puede recibir una quimioterapia intratecal. En este tipo de tratamiento, los fármacos anticancerígenos entran en el fluido cerebroespinal a través de una aguja colocada en la médula espinal o un dispositivo colocado bajo el cuero cabelludo.

Habitualmente un paciente tienen la quimioterapia de forma de paciente externo (en el hospital, en la consulta del doctor o en casa). Sin embargo, dependiendo de los fármacos que se proporcionen, la dosis, el modo en que se proporcionen y la salud general del paciente, puede ser necesaria una estancia corta en el hospital.

Los efectos secundarios de la quimioterapia dependen principalmente de los fármacos y las dosis que reciba el paciente. Como con otros tipos de tratamiento, los efectos secundarios varían de una persona a otra. Generalmente, los fármacos anticancerígenos afectan a las células que se dividen rápidamente. Además de las células cancerígenas, éstas incluyen las células sanguíneas, que luchan contra una infección, ayudan a la coagulación de la sangre y portan oxígeno a todas las partes del cuerpo. Cuando las células sanguíneas se ven afectadas, los pacientes muy probablemente contraen infecciones, pueden tener fácilmente forúnculos o hemorragias y se pueden sentir inusualmente débiles y muy cansados. Las células que se dividen rápidamente en las raíces de los pelos y las células que recubren en tracto digestivo se pueden ver también afectadas. Como consecuencia, los efectos secundarios pueden incluir pérdida de pelo, escaso apetito, nausea y vómitos, diarrea o úlceras en la boca y los labios.

La pérdida del pelo es una preocupación principal para mucha gente con cáncer. Algunos fármacos anticancerígenos solo provocan que el pelo se haga más fino, mientras que otros dan lugar a una pérdida de todo el pelo del cuerpo. La mayoría de los efectos secundarios desaparecen gradualmente durante los períodos de recuperación entre tratamientos y el pelo vuelve a crecer después de que termine el tratamiento.

Algunos fármacos anticancerígenos pueden provocar efectos secundarios a largo plazo como pérdida de la fertilidad (la capacidad de tener hijos). La pérdida de fertilidad puede ser temporal o permanente, dependiendo de los fármacos usados y de la edad y el sexo del paciente. Los períodos menstruales de las mujeres pueden detenerse y pueden tener sofocos y sequedad vaginal. Los períodos es más probable que retornen en mujeres jóvenes.

La terapia hormonal es usada contra ciertos cánceres que dependen de las hormonas para su crecimiento. La terapia hormonal evita que las células cancerígenas consigan o usen las hormonas que necesitan. Este tratamiento puede incluir el uso de fármacos que detienen la producción de ciertas hormonas o que cambian el modo en que funcionan. Otro tipo de terapia hormonal es la cirugía para suprimir órganos (como los ovarios o los testículos) que producen hormonas.

La terapia hormonal puede provocar un cierto número de efectos secundarios. Los pacientes se pueden sentir cansados, tener retención de fluidos, ganar peso, sofocos, nauseas y vómitos, cambios del apetito y, en algunos casos, coágulos de sangre. En las mujeres, la terapia hormonal puede producir períodos menstruales interrumpidos y sequedad vaginal. La terapia hormonal en mujeres puede provocar también pérdida o aumento de la fertilidad; las mujeres que reciben terapia hormonal deben hablar con el doctor sobre la contracepción durante el tratamiento. En hombres, la terapia hormonal puede provocar impotencia, pérdida de deseo sexual o pérdida de fertilidad. Dependiendo del fármaco usado, estos cambios pueden ser temporales, de larga duración o permanentes.

La terapia biológica (también denominada inmunoterapia) ayuda a la capacidad natural del cuerpo (sistema inmune) a luchar contra la enfermedad o protege el cuerpo de algunos efectos secundarios del tratamiento del cáncer. Los anticuerpos monoclonales, interferón, interleucina-2 y factores estimuladores de colonias son algunos tipos de terapia biológica.

Los efectos secundarios provocados por la terapia biológica varían con el tratamiento específico. En general, estos tratamientos tienden a provocar síntomas de tipo gripal como escalofríos fiebre, dolores musculares, debilidad pérdida de apetito, nauseas, vómitos y diarrea. Los pacientes pueden tener también fácilmente hemorragias o forúnculos, aspereza en la piel o tener inflamaciones. Estos problemas pueden ser graves, pero pueden desaparecer después de que termine el tratamiento.

El trasplante de médula ósea (BMT) o el trasplante de células troncales periféricas (PSCT) pueden ser usados también en el tratamiento del cáncer. El trasplante puede ser antólogo (las células de la propia persona que fueron previamente guardadas), alógeno (células donadas por otra persona) o singénico (células donadas por un gemelo idéntico). Tanto el BMT como el PSCT proporcionan al paciente células troncales sanas (células muy inmaduras que maduran en forma de células sanguíneas). Estas sustituyen a las células troncales que han sido deterioradas o destruidas por las dosis muy elevadas de tratamiento de quimioterapia y/o radiación.

Los pacientes que han sido sometidos a BMT o PSCT se enfrentan a un riesgo aumentado de infección hemorragias y otros efectos secundarios debido a las elevadas dosis de quimioterapia y/o radiación que reciben. Los efectos secundarios más comunes asociados con el propio trasplante son nauseas y vómitos durante el trasplante y escalofríos y fiebre durante el primer día aproximadamente. Además, la enfermedad de injerto frente a hospedante (GVHD) se puede producir en pacientes que reciben médula ósea de un donante. En la GVHD, la médula donada (el injerto) reacciona contra los tejidos del paciente (del hospedante) (lo más a menudo el hígado, la piel y el tracto digestivo). La GVHD puede ser leve o muy grave. Se puede producir en cualquier momento después del trasplante (incluso años después). Se pueden proporcionar fármacos para reducir el riesgo de GVHD y para tratar el problema si se produce.

Algunas personas con cáncer encuentran dificultad para comer porque pierden el apetito. Además, los efectos secundarios comunes del tratamiento como nausea, vómitos o úlceras en la boca y los labios, pueden hacer difícil comer. A menudo, los alimentos tienen un sabor diferente. También, las personas que han sido tratadas de cáncer puede que no tengan ganas de comer cuando se sienten incomodas o cansadas.

Toxina botulinum

La bacteria anaeróbica gram-positiva Clostridium botulinum produce una potente neurotoxina polipéptida, toxina botulinum, que provoca una enfermedad neuroparalítica en seres humanos y animales, denominada botulismo. Las esporas de Clostridium botulinum se encuentran en la tierra y pueden crecer en recipientes inadecuadamente esterilizados y de alimentos herméticos de botes en el ámbito doméstico, que son la causa de muchos casos de botulismo. Los efectos del botulismo aparecen normalmente 18 a 36 horas después de comer alimentos infectados con cultivos o esporas de Clostridium botulinum. La toxina del botulismo puede pasar aparentemente sin atenuarse a través del recubrimiento de los intestinos y ataca las neuronas motoras periféricas. Los síntomas de intoxicación con toxina botulinum pueden progresar de dificultad para caminar tragar y hablar hasta parálisis de los músculos respiratorios y muerte.

El tipo A de la toxina botulinum es el agente biológico natural más letal conocido por el hombre. Aproximadamente 50 picogramos de toxina botulinum (complejo de neurotoxina purificada) de tipo A (disponible en la empresa Allergan Inc. De Irving, California, bajo la marca registrada BOTOX®) son una LD_{50} en ratones. Una unidad (U) de toxina botulinum se define como la LD_{50} tras una inyección intraperitoneal en ratones Swiss Webster hembras con un peso de 18-20 gramos cada uno. Han sido caracterizadas siete neurotoxinas de botulinum inmunológicamente distintas, teniendo éstas, respectivamente, los serotipos de neurotoxinas de botulinum A, B, C_{1}, D, E, F y G, cada uno de los cuales es distinguido por neutralización con anticuerpos de tipos específico. Los diferentes serotipos de toxina botulinum varían con la especie animal a la que afectan y con la gravedad y duración de la parálisis que provocan. Por ejemplo, se ha determinado, que el tipo A de toxina de botulinum es 500 veces más potente, medida mediante la velocidad de la parálisis producida en una rata que el tipo B de toxina de botulinum. Adicionalmente, el tipo B de toxina botulinum se ha determinado que es no tóxico en primates a una dosis de 480 U/kg que es aproximadamente 12 veces la LD_{50} en primates para el tipo A de toxina botulinum. La toxina botulinum se une aparentemente con una afinidad elevada a neuronas motoras colinérgicas y es translocada en la neurona y bloquea la liberación de
acetilcolina.

Las toxinas de botulinum han sido usadas en ajustes clínicos para el tratamiento de trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. El tipo A de toxina botulinum ha sido aprobado por la entidad U.S. Food and Drug Administration para el tratamiento de blefaroespasmo, estrabismo, espasmos hemifaciales y distonea cervical. Los serotipos de toxinas de botulinum que no son de tipo A tienen aparentemente una potencia inferior y/o una duración menor de actividad en comparación con el tipo A de toxina botulinum. Los efectos clínicos del tipo A de toxina de botulinum intramuscular periférico son observados habitualmente en una semana después de la inyección. La duración normal del alivio sintomático a partir de una única inyección intramuscular de tipo A de toxina botulinum tiene un promedio de aproximadamente tres meses.

Aunque todos los serotipos de toxinas botulinum aparentemente inhiben la liberación de la acetilcolina neurotransmisora en la unión neuromuscular, lo hacen aceptando a diferentes proteínas neurosecretoras y/o escindiendo estas proteínas en sitios diferentes. Por ejemplo, los tipos A y E de botulinum escinden ambos la proteína asociada sinaptosomal de 25 kiloDaltones (kD) (SNAP-25) pero dirigen a diana diferentes secuencias de aminoácidos en esta proteína. Los tipos B, D, F y G de toxina botulinum actúan sobre proteínas asociadas a vesículas (VAMP, también denominada sinaptobrevina) escindiendo cada serotipo la proteína en un sitio diferente. Finalmente, el tipo C_{1} de toxina botulinum se ha mostrado que escinde tanto sintaxina como SNAP-25. Estas diferencias en el mecanismo de acción pueden afectar a la potencia relativa y/o la duración de acción de diversos serotipos de toxina de botulinum.

El peso molecular de la molécula de proteína de toxina botulinum, para la totalidad de los siete serotipos de toxina botulinum conocidos es de aproximadamente 150 kD. De forma interesante, las toxinas botulinum se seleccionan por la bacteria clostridial como complejos que comprenden la molécula de proteína de toxina botulinum de 150 kD junto con proteínas no toxinas asociadas. Por tanto, el complejo de tipo A de toxina Botulinum puede ser producido por la bacteria clostridial en las formas de 900 kD, 500 kD y 300 kD. Los tipos B y C_{1} de toxina botulinum son producidos aparentemente solo en forma de complejo de 500 kD. El tipo D de toxina botulinum es producido en forma de complejos de 300 kD y 500 kD. Finalmente, los tipos E y F de toxina botulinum son producidos solamente en forma de complejos de aproximadamente 300 kD. Los complejos (es decir, con peso molecular mayor que aproximadamente 150 kD) se cree que contienen una proteína de hemaglutinina no toxina y proteína no hemaglutinina no toxina y no tóxica. Estas dos proteínas no toxinas (que junto con la molécula de toxina botulinum comprenden el complejo de neurotoxina relevante) pueden actuar para proporcionar estabilidad contra la desnaturalización para la molécula de toxina botulinum y protección contra los ácidos digestivos cuando la toxina es digerida. Adicionalmente, es posible que los complejos de toxinas botulinum mayores (con más de aproximadamente 150 kD de peso molecular) puedan dar lugar a una velocidad inferior de difusión de la toxina botulinum fuera del sitio de inyección intramuscular de un complejo de toxina botulinum.

Estudios in vitro han indicado que la toxina botulinum inhibe la liberación inducida por cationes de potasio tanto de acetilcolina como de norepinefrina de cultivos de células primarias de tejido del tronco encefálico. Adicionalmente, se ha informado que la toxina botulinum inhibe la liberación provocada tanto de glicina como de glutamina en cultivos primarios de neuronas de la médula espinal y que en preparaciones de sinaptosomas del cerebro la toxina de botulinum inhibe la liberación de cada uno de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina, norepinefrina, CGRP y
glutamato.

El tipo A de toxina botulinum puede ser obtenido estableciendo y haciendo crecer cultivos de Clostridium botulinum en un fermentador y recolectando y purificando seguidamente la mezcla fermentada de acuerdo con procedimientos conocidos. Todos los serotipos de toxina botulinum son inicialmente sintetizados como proteínas de cadena única inactivas que deben ser escindidas o recortadas por proteasas para hacerse neuroactivas. Las cepas bacterianas que constituyen los serotipo A y G de toxina botulinum poseen proteasas endógenas y serotipos A y G y, por lo tanto, pueden ser recuperadas a partir de cultivos bacterianos pero dominantemente en su forma activa. Por el contrario, los serotipo C_{1}, D y E de toxina botulinum son sintetizados por cepas no proteolíticas y, por lo tanto, normalmente están desactivados cuando son recuperados del cultivo. Los serotipos B y F son producidos por cepas tanto proteolíticas como no proteolíticas y, por lo tanto, pueden ser recuperados en la forma activa o inactiva. Sin embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo de tipo B de toxina botulinum solo escinden una parte de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas recortadas y sin recortar depende de la duración de la incubación y de la temperatura del cultivo. Por lo tanto, un cierto porcentaje de cualquier preparación, por ejemplo, de la toxina de tipo B de toxina botulinum es probable que sea inactivo, posiblemente teniendo en cuenta la potencia conocida significativamente inferior del tipo B de toxina botulinum en comparación con el tipo A de toxina botulinum. La presencia de moléculas inactivas de toxina botulinum en una preparación clínica contribuirá al contenido global de proteínas de la preparación, que está asociado con una antigenicidad aumentada sin contribuir a su eficacia clínica. Adicionalmente, es conocido que el tipo B de toxina botulinum, tras una inyección intramuscular tiene una duración inferior de la actividad y es también menos potente que el tipo A de toxina botulinum al mismo nivel de
dosis.

Se ha informado que el tipo A de toxina botulinum ha sido usado en ajustes clínicos como sigue:

(1) aproximadamente 75-250 unidades BOTOX® por inyección intramuscular (músculos múltiples) para tratar distonia cervical;

(2) 5-10 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular para tratar líneas glabellares (surcos marrones) (5 unidades inyectadas por vía intramuscular en el músculo procero y 10 unidades inyectadas por vía intramuscular en cada músculo corrugador superciliar);

(3) aproximadamente 30-80 unidades de BOTOX® para tratar el estreñimiento mediante inyección intraesfincteriana en el músculo puborrectal;

(4) aproximadamente 1-5 unidades por músculo de BOTOX® inyectado por vía intramuscular para tratar blefaroespasmo inyectando en el muscular ocular orbicular pre-tarsiano lateral del párpado superior y en el ocular orbicular pre-tarsiano lateral del párpado inferior;

(5) para tratar estrabismo, los músculos extraoculares fueron inyectados por vía intramuscular con aproximadamente 1-5 unidades de BOTOX®, haciéndose variar la cantidad inyectada basada en el tamaño del músculo que va a ser inyectado y el alcance de la parálisis muscular deseada (es decir, la corrección de dioptrías deseada);

(6) para tratar espasticidad de las extremidades superiores a continuación de una apoplejía, mediante inyecciones de BOTOX® en cinco músculos flexores de las extremidades superiores diferentes, como sigue:

(a)

flexor de los dedos profundo: 7,5 U a 30 U

(b)

flexor de los dedos superficial: 7,5 U a 30 U

(c)

flexor cubital anterior: 10 U a 40 U

(d)

flexor cubital del carpo: 15 U a 60 U

(e)

bíceps: 50 u a 200 U. Cada uno de los cinco músculos indicados fue inyectado en la misma sesión de tratamiento, de forma que el paciente recibió de 90 U a 360 U de BOTOX® en el músculo flexor de las extremidades superiores mediante inyección intramuscular en cada sesión de tratamiento.

El éxito del tipo A de toxina botulinum para tratar una diversidad de estados clínicos ha conducido a un interés por otros serotipos de toxina botulinum. Se llevó a cabo un estudio de dos preparaciones de tipo A de botulinum disponible en el comercio (BOTOX®, y Dysport®) y preparaciones de tipo B y F de toxina botulinum (ambas obtenidas de la empresa Wako Chemicals, Japón) para determinar la eficacia de debilitación de músculos locales, la seguridad y la capacidad potencial antigénica. Las preparaciones de toxina botulinum se inyectaron en la cabeza del músculo gemelo derecho (0,5 a 200,0 unidades/kg) y la debilidad del músculo se valoró usando el ensayo de valoración de abducción digital (DAS) de ratones. Los valores de ED_{50} se calcularon a partir de curvas de respuesta a la dosis. A ratones adicionales se les proporcionaron inyecciones intramusculares para determinar las dosis de LD_{50}. El índice terapéutico se calculó como LD_{50}/ED_{50}. Grupos separados de ratones recibieron inyecciones en las extremidades delanteras de BOTOX® (5,0 a 10,0 unidades/kg) o tipo B de toxina botulinum (50,0 a 400,0 unidades/kg) y fueron ensayados en cuanto a la debilidad muscular y consumo aumentado de agua, siendo este último un modelo putativo para la sequedad de la boca. El potencial antigénico se valoró mediante inyecciones intramusculares mensuales en conejos (1,5 ó 6,5 ng/kg de tipo B de toxina botulinum o 0,15 ng/kg de BOTOX®). La debilidad máxima de los músculos y la duración estaban relacionadas con la dosis para todos los serotipos. El consumo de agua fue mayor en ratones inyectados con tipo B de toxina botulinum que con BOTOX®, aunque el tipo B de toxina botulinum era menos eficaz para debilitar los músculos. Después de cuatro meses de inyecciones, 2 de 4 (cuando fueron tratados 1,5 ng/kg) y 4 de 4 (cuando fueron tratados con 6,5 ng/kg) conejos desarrollaron anticuerpos contra el tipo B de toxina botulinum. En un estudio separado, 0 de 9 conejos tratados con BOTOX® mostraron anticuerpos contra tipo A de toxina botulinum. Los resultados del DAS indican potencias máximas relativas de tipo A de toxina botilum que son iguales al tipo B de toxina botulinum y siendo el tipo B de toxina botulinum mayor que el tipo B de toxina botulinum. Con respecto a la duración del efecto, el tipo A de toxina botulinum fue mayor que el tipo B de toxina botulinum y la duración del efecto del tipo B de toxina botulinum fue mayor que la del tipo F de toxina botulinum. Como se muestra mediante los valores de índices terapéuticos, las dos preparaciones comerciales de tipo A de toxina botulinum (BOTOX® y Dysport®) son diferentes. El comportamiento de consumo de agua aumentado observado a continuación de una inyección en las extremidades traseras de tipo B de toxina botulinum indica que cantidades clínicamente significativas de este serotipo entraron en la circulación sistémica de múridos. Los resultados indican también que con el fin de conseguir una eficacia comparable al tipo A de toxina botulinum, es necesario aumentar las dosis de los demás serotipos examinados. Una dosificación aumentada puede comprender una seguridad. Además de ello, en conejos, el tipo B era más antigénico que BOTOX®, probablemente debido al mayor contenido proteico inyectado para conseguir una dosis eficaz de tipo B de toxina botulinum.

Además de tener acciones farmacológicas en la ubicación periférica, las toxinas de botulinum pueden tener también efectos inhibidores en el sistema nervioso central. El trabajo de Weigand et al, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976; 292, 161-165, y Habermann, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281, 47-56 mostraron que la toxina botulinum es capaz de ascender hasta el área espinal mediante transporte retrogrado. Como tal, la toxina botulinum inyectada en una ubicación periférica, por ejemplo, por vía intramuscular, puede ser retrógradamente transportada a la médula espinal.

Un toxina botulinum ha sido propuesta también o ha sido usada también para tratar heridas de la piel, los huesos y tendones (patente de EE.UU. 6.447.787); dolor intratecal (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.113.915), diversos trastornos de nervios autónomos, incluidos trastornos de las glándulas sudoríparas (patente de EE.UU.
5.766.605); cefalea tensional (patente de EE.UU. 6.458.365); dolor de cefalea de migraña (patente EE.UU. 5.714.468); dolor post-operatorio y dolor visceral (patente de EE.UU. 6.464.986); crecimiento del pelo y retención del pelo (patente de EE.UU. 6.299.893); soriasis y dermatitis (patente de EE.UU. 5.670.484); músculos lesionados (patente de EE.UU. 6.423.319); diversos cánceres (véanse las patentes de EE.UU. 6.139.845 y 6.063.768), trastornos de los músculos lisos (patente de EE.UU. 5.437.291); síndromes de atropamiento de nervios (solicitud de patente de EE.UU. 2003 0224019); acné (documento WO 03/011333); inflamación neurogénica (patente de EE.UU. 6.063.768); trastornos otícos (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.265.379); trastornos pancreáticos (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 6.143.306 y 6.261.572); trastornos de la próstata, incluida hiperplasia prostática, cáncer de próstata e incontinencia urinaria (véanse, por ejemplo las patentes de EE.UU. 6.365.164 y 6.667.041 y la publicación de Doggweiler R., et al Botulinum toxin type A causes diffuse and highly selective atrophy of rat prostate, Neurourol Urodyn 1998;17(4):363).

La patente de EE.UU. nº 5.989.545 describe que una neurotoxina clostridial modificada o fragmento de la misma, preferentemente una toxina botulinum, químicamente conjugada o recombinante fusionada a un resto particular de dirección a diana puede ser usada para tratar el dolor mediante la administración del agente a la médula espinal. Adicionalmente, se ha expuesto que las toxinas de botulinum dirigidas a diana (es decir, con un resto de unión no nativo) pueden ser usadas para tratar diversos estados (véanse, por ejemplo, los documentos WO 96/33273; WO 99/17806; WO 98/07864; WO 00/57897; WO 01/21213; WO 00/10598).

Una toxina botulinum ha sido inyectada en el músculo pectoral para controlar l espasmo pectoral; véase, por ejemplo, la publicación de Senior M., Botox and the management of pectoral spasm after subpectoral implant insertion, Plastic and Recon Surg, Julio de 2000, 224-225. Los implantes de toxinas de liberación controlada son conocidos (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.306.423 y 6.312.708) como lo es la administración transdérmico de toxina botulinum (solicitud de patente de EE.UU. número de serie 10/194805).

Han sido descritos formulaciones estables líquidas y formulaciones puras de toxina de botulinum (véanse, por ejemplo, los documentos WO 00/15245 y WO 74703) así como la aplicación tópica de toxina botulinum (véase, por ejemplo, el documento DE 198 52 981).

Acetilcolina

Normalmente o en general, solo un único tipo de neurotransmisor de molécula pequeña es liberado por cada tipo de neurona en el sistema nervioso de los mamíferos. La acetilcolina neurotransmisora es secretada por neuronas en muchas zonas del cerebro, pero específicamente por las células piramidales grandes de la corteza motora, por diversas neuronas diferentes en los ganglios basales por las neuronas motoras que inervan los músculos del esqueleto, por las neuronas preganglionares del sistema nervioso autonómico (tanto simpatéticas como para simpatéticas) por las neuronas postganglionares del sistema nervioso parasimpatético y por algunas de las neuronas postganglionares del sistema nervioso simpatético. Esencialmente, solo las fibras nerviosas simpatéticas postganglionares para las glándulas sudoríparas, los músculos pilorectores y unos pocos vasos sanguíneos son colinérgicos y la mayoría de las neuronas postganglionares del sistema nervioso simpatético secretan la norepinefrina neurotransmisora. En la mayoría de los casos, la acetilcolina tiene un efecto excitador. Sin embargo, la acetilcolina se conoce que tiene efectos inhibidores en algunas de las terminaciones nerviosas parasimpatéticas periféricas, como la inhibición del corazón por los nervios vagales.

Las señales eferentes del sistema nervioso autonómico son transmitidas al cuerpo a través del sistema nervioso simpatético o el sistema nervioso parasimpatético. Las neuronas preganglionares del sistema nervioso simpatético se extienden desde estructuras celulares de neuronas simpatéticas pregalgionares ubicadas en el cuerno intermedio-lateral de la médula espinal. Las fibras nerviosas simpatéticas preganglionares, que se extienden desde la estructura celular, entran en sinapsis con neuronas postganglionares ubicadas en un ganglio simpatético paravertebral o en un ganglio prevertebral. Por tanto, como las neuronas preganglionares del sistema nervioso tanto simpátetico como parasimpatético son colinérgicas, la aplicación de acetilcolina a los ganglios excitará las neuronas post-ganglionares tanto simpatéticas como parasimpatéticas.

La acetilcolina activa dos tipos de receptores, receptores muscarínicos y nicotínicos. Los receptores muscarínicos se encuentran en todas las células efectoras estimuladas por las neuronas postglanglionares del sistema nervioso parasimpatético, así como en las estimuladas por la neuronas colinérgicas postanglionares del sistema nervioso simpatético. Los receptores nicotínicos se encuentran en las sinapsis entre las neuronas preganglionares y postganglionares tanto simpatéticas como parasimpatéticas. Los receptores nicotínicos están presentes también en muchas membranas de fibras musculares esqueléticas en la unión neuromuscular.

La acetilcolina es liberada de las neuronas colinérgicas cuando las vesículas intracelulares claras y pequeñas se fusionan con la membrana celular neuronal presináptica. Una amplia diversidad de células secretoras no neuronales, como la médula adrenal (así como la línea celular PC12) y las células de islotes pancreáticos liberan catecolaminas e insulina, respectivamente, desde vesículas grandes de núcleos densos. La línea celular PC12 es un clon de células feocromocitomas de ratas exclusivamente usadas como un modelo de cultivo de tejidos para estudios del desarrollo simpatoadrenal. La toxina botulinum inhibe la liberación de los dos tipos de compuestos de los dos tipos de células in vitro, permeabilizadas (como mediante electroporación) o mediante inyección directa de la toxina en la célula desnervada. La toxina botulinum se conoce también que bloquea la liberación de glutamato neurotransmisor desde cultivos de células de sinaptosomas corticales.

Distribución amplia del sustrato de toxina botulinum

Es conocido que una toxina botulinum puede desnervar células de músculos que dan lugar a una parálisis flácida debida a la inhibición presináptica de la liberación de acetilcolina a partir de neuronas en una unión neuromuscular. El dominio proteolítico de una toxina botulinum actúa tras una sustancia particular en el citosol de células dianas, escisión del sustrato que evita el acoplamiento de membranas y la exocitosis de vesículas secretoras que contienen acetilcolina. La ausencia de acetilcolina en la hendidura sináptica entre neuronas inerrantes y células musculares evita la estimulación de las células musculares y tiene lugar así la parálisis.

Las toxinas botulinum son proteasas intracelulares que actúan específicamente sobre una o más de tres proteínas diferentes que regulan el acoplamiento de acetilcolina a vesículas secretoras. Estos sustratos específicos para las toxinas botulinum son sinaptobrevina, sintaxina y/o SNAP-25. Según, por ejemplo, Duggan M.J., et al., A survey of botulinum neurotoxin substrate expression in cells, Mov Disorder 10(3);376:1995, y Blasi J., et al., Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature 365; 160-163:1993. Para los tipos B, D, F y G de toxina botulinum, el sustrato intracelular particular es sinaptobrevina. SNAP-25, sinaptobrevina y sintaxina son conocidos como SNARE (receptores de proteínas de unión a factor sensible de N-etilmaleimida soluble).

Significativamente, no solo los nervios inervan los músculos que contienen el sustrato para las toxinas botulinum: "La presencia de SNAP-25 en zonas presinápticas de numerosos subconjuntos neuronales y en líneas celulares de crestas neuronales sugieren que esta proteína ayuda a una importante función en tejidos neuronales". Oyler G.A. et al., Distribution and expression of SNAP-25 immunoreactivity in rat brain, rat PC-12 cells and human SMS-KCNR neuroblastoma cells, Brain Res Dev Brain Res 1992 Feb 21;65(2):133-146, 1992.

Adicionalmente, "la amplia aparición de las proteínas SNARE en células endocrinas sugiere que pueden servir también como marcadores generales de diagnóstico para tumores endocrinos...", Graff, L., et al. Expression of vesicular monoamine transporters, synaptosomal-associated protein 25 and syntaxin 1: a signature of human small cell lung carcinoma, Cancer Research 61, 2138-2144, 1 de Marzo de 2001, en la página 2138. por ejemplo, es conocido que la SNAP-25 está ampliamente distribuida en células neuroendocrinas (incluidas células cromafines, PC12, GH3 e insulinotas). Además de ello, la sinaptobrevina de sustrato de toxina botulinum se ha encontrado en fibroblastos y células mieloides (por ejemplo, células mastocitos). Duggan M., et al., supra.

De hecho, los SNARE ejercen una influencia o controlan la fusión de membranas de vesículas secretoras en la mayoría de las células secretoras, sino en todas. Andersson J., et al, Differential sorting of SNAP-25a and SNAP-25b proteins in neuroblastoma cells, Eur J. Cell Bio 79, 781-789:Nov 2000.

Por tanto, el sustrato para una toxina botulinum no está restringido a células neuronales que liberan la acetilcolina neurotransmisora. Por lo tanto, los sustratos de toxinas botulinum están "ubícuotamente involucrados en acontecimientos de fusión de membrana-membrana" y la evidencia apunta a "un mecanismo universal para los acontecimientos de fusión de membranas" es decir, para la asociación de vesículas secretoras con la pared celular) (Duggan 1995, supra).

Por tanto, el sustrato intracelular para la toxina botulinum tiene una distribución ubicuota en células secretoras tanto neuronales como no neuronales. Esto está claramente ilustrado por el descubrimiento de la presencia de SNAP-25 (una proteína asociada sinaptosomal de 25 kiloDaltones y sustrato para al menos el tipo A de toxina botulinum) en al menos:

(1) el páncreas (Sadoul K., et al., SNAP-25 is expressed in islets of Langerhans and is involved in insulin release, J. Cell Biology 128;1019-1029:1995);

(2) la hipófisis (Dayanithi G., et al. Release of vasopressin from isolated permeabilized neurosecretory nerve terminals is blocked by the light chain of botulinum A toxin, Neuroscience 1990;39(3):711-5);

(3) la médula adrenal (Lawrence G., et al. Distinct exocytotic responses of intact and permeabilised chromaffin cells after cleavage of the 25-kDa synaptosomal associated protein (SNAP-25) or synaptobrevin by botulinum toxin A or B, Eur J. Biochem 236;877-886:1996);

(4) células gástricas (Hohne-Zell B., et al., Functional importance of synaptobrevin and SNAP-25 during exocytosis of histamine by rat gastric enterochromaffin-like cells, Endocrinology 138;5518-5526:1997);

(5) tumores pulmonares (Graff, L., et al. Expression of vesicular monoamine transporters, synaptosomal-associated protein 25 and syntaxin 1: a signature of human small cell lung carcinoma, Cancer Research 61, 2138-2144, 1 de marzo de 2001 (los carcinomas de pulmón de células pequeñas (SCLC) contienen SNAP-25);

(6) tumores intestinales, Maksymowych A., et al., Binding and transcytosis of botulinum neurotoxin by polarized human colon carcinoma cells, J of Bio. Chem, 273 (34); 21950-21957: 1998 (la toxina botulinum es internalizada por las células de colon humanas);

(7) tumores pancreáticos, Huang, X., et al., Truncated SNAP-25 (1-197), como la neurotoxina A de botulinum, puede inhibir la secreción de insulina a partir de células de insulinoma HIT-T15, Mol. Endo. 12(7); 1060-1070:1998 ("...functional SNAP-25 proteins are required for insulin secretion...", ibid. at page 1060). Véase también Boyd R., et al., The effect of botulinum neurotoxins on the release of insulin from the insulinoma cell lines HIT-15 and RINm5F, J. Bio Chem. 270(31); 18216-18218:1995, y; Cukan M., et al., Expression of SNAP-23 and SNAP-25 in the pancreatic acinar tumor cell line AR42J, Molec Biol Cell 20(suppl); 398a, no. 2305:1999 ("la SNAP-25 es una proteína SNARE que media en los acontecimientos exocitócicos en sistemas neuronales y endocrinos");

(8) tumores de la pituitaria así como en células normales de la pituitaria, Majo G., et al., Immunocytochemical analysis of the synaptic proteins SNAP-25 and Rab3A in human pituitary adenomas. Overexpression of SNAP-25 in the mammososmatotroph lineages, J. Pathol 1997 Dec; 183(4):440-446;

(9) neuroblastomas, Goodall, A., et al., Occurrence of two types of secretory vesicles in the human neuroblastoma SH-SY5Y, J. of Neurochem 68;1542-1552:1997. Véase también Oyler, G.A, Distribution and expression of SNAP-25 immunoreactivity in rat brain, rat PC-12 cells and human SMS--KCNR neuroblastoma cells, Dev. Brain Res. 65 (1992); 133-146. Debe apreciarse Goodal (1992) describe solamente la identificación in vitro de ciertas proteínas de asociación a vesículas en una única línea celular de neuroblastomas;

(10) células de riñón (Shukla A., et al., SNAP-25 associated Hrs-2 protein colocalizes with AQP2 in rat kidney collecting duct principal cells, Am J Physiol Renal Physiol 2001 Sep;281(3):F546-56 (SNAP-25 está involucrada en la "exocitosis regulada" de células de riñón), y;

(11) células normales de pulmón (Zimmerman U.J., et al., Proteolysis of synaptobrevin, syntaxin, and SNAP-25 in alveolar epithelial type II cells, IUBMB Life 1999 Oct; 48(4): 453-8) y;

(12) todas las células de ovarios (Grosse J., et al., Synaptosome associated protein of 25 kilodaltons in oocytes and steroid producing cells of rat and human ovary: molecular analysis and regulation by gonadotropins, Biol Reprod 2000 Aug; 63(2): 643-50 (SNAP-25 encontrada "en todos los oocitos y en células esteroidógenas, incluidas células granulosas (GC) de folículos antrales grandes y células luteales").

Tejidos de glándulas mamarias colinérgicas

Las células de diversas glándulas mamarias hiperplásticas y neoplásticas están influenciadas por mecanismos colinérgicos. Por tanto, se ha descubierto que hay un "mecanismo colinérgico en la actividad de células alveolares". Balakina G.B., et al., Localization of choline cetyltransferase in the alveolar portion of the mammary gland of the white mouse, Arkh Anat Gistol Embriol 1986 Apr;90(4):73-7. Adicionalmente, hay una influencia colinérgica sobre la displasia mamaria (fibroquistes) y tejidos de carcinoma mamario (Dorosevich A.E., et al., Autonomic nerve endings and their cell microenvironment as one of the integral parts of the stromal component in breast dysplasia and cancer, Arkh Patol 1994 Nov-Dec;56(6):49-53) así como "una estimulación colinérgica directa de células de músculos lisos" en las arterias mamarias (Pesic S., et al., Acetylcholine-induced contractions in the porcine internal mammary artery; possible role of muscarinic receptors, Zentralbl Veterinarmed A 1999 Oct; 46(8): 509-15).

Significativamente, un aumento de la acetilcolina debido a una inhibición de colinesterasa ha estado implicado en un aumento de la proliferación de células mamarias por el desarrollo de carcinomas mamarios. Cabello G., et al, A rat mammary tumor model induced by the organophosphorous pesticides parathion and malathion, possibly through acetylcholinesterase inhibition, Environ Health Perspect 2001 May; 109(5):471-9. Por tanto, una disminución de la proliferación de células de cáncer de mamas parece que está mediada por un mecanismo colinérgico. Panagiotou S., "Opioid agonists modify breast cancer cell proliferation by blocking cells to the G2/M phase of the cycle: involvement of cytoskeletal elements", J Cell Biochem 1 de Mayo de 1999;73(2):204-11.

Médula adrenal

Las glándulas adrenales o suprarrenales son estructuras pequeñas en forma triangular ubicadas en la parte superior de los riñones. Cada glándula adrenal comprende una corteza adrenal o parte externa y una médula adrenal o parte interna. La corteza rodea e incluye la médula.

La corteza adrenal secreta la hormonas cortisol y aldosterona. El cortisol es producido durante tiempos de estrés, regula el uso del azúcar y es esencial para el mantenimiento de una presión normal de la sangre. La aldosterona es uno de los principales reguladores del equilibrio de sal, potasio y agua. Si son suprimidas ambas glándulas adrenales es obligatoria una terapia de reposición de cortisol y aldosterona.

La médula adrenal secreta la adrenalina de catecilaminas (sinónimo de epinefrina) y noradrenalina (sinónimo de de norepinefrina). Estas hormonas son importantes para la regulación normal de una diversidad de funciones corporales, que incluyen la reacción al estrés, cuanto provocan un aumento de la presión sanguínea, la capacidad de bombeo del corazón y el nivel de azúcar en la sangre. La supresión de la médula adrenal da lugar a poca o ninguna deficiencia hormonal porque otras glándulas en el cuerpo pueden compensar. Por el contrario, la producción excesiva de catecolamina puede ser una amenaza para la vida.

En un macho adulto normal, aproximadamente un 85% de la catecolamina total producida por la médula adrenal es adrenalina, y el 15% restante es noradrenalina. Hay aproximadamente 1,6 mg de catecolamina presente por gramo de tejido de médula. La mayor parte de la noradrenalina que se encuentra en la sangre y la orina procede no de la médula adrenal, sino de las terminaciones nerviosas simpatéticas postganglionares. Si la glándula adrenal recientemente seccionada es colocada en fijadores que contienen dicromato de potasio, la médula se vuelve marrón y esto se denomina la reacción cromafínica, denominada así para sugerir la afinidad del tejido de médula adrenal por las sales de cromo. Por tanto, las células de la médula adrenal se denominan a menudo células cromafínicas. Las células cromafínicas existen también fuera de la médula adrenal, pero habitualmente solo secretan noradrenalina, no adrenalina.

La médula adrenal puede ser considerada un ganglio simpatético inervado por fibras nerviosas colinérgicas preganglionar. Estas fibras nerviosas liberan acetilcolina que provoca la secreción de catecolaminas (principalmente adrenalina) mediante un procedimiento de exocitosis a partir de las células cromafínicas de la médula adrenal. La médula adrenal normal es inervada por el nervio esplácnico, una ramificación colinérgica preganglionar del sistema nervioso simpatético. La actividad de la médula adrenal está casi completamente bajo este control nervioso colinérgico.

Tumores de células cromafínicas

Las células cromafínicas (incluidas las células cromafínicas de la médula adrenal) y las células ganglionares simpatéticas tienen mucho en común ya que son derivadas ambas de un ancestro embriónico común, el simpatagonio de la cresta neural, como se muestra en diagrama a continuación. Los ejemplos de los tipos de neoplasmas que pueden surgir de cada uno de estos tipos de células se muestran entre paréntesis. Cada uno de los tipos de células mostrados pueden secretar potencialmente catecolaminas.

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Aunque la mayoría de los neoplasmas de células cromafínicas se producen en la médula adrenal, son conocidos tumores de células cromafínicas de ubicación ectópica y múltiple, que se producen lo más comúnmente en niños.

1. Paragangliomas

Un paraganglio (sinónimo a estructura cromafínica) se puede encontrar en el corazón, cerca de la aorta, en el riñón, hígado, gónadas y otros lugares y está comprendido por células cromafínicas que se originan aparentemente en células de crestas neurales y que se han desplazado hasta una asociación próxima con células ganglionares del sistema nervioso autonómico. Un paraganglioma es un neoplasma comprendido por células cromafínicas derivadas de un paraganglio. Un paraganglioma de estructura carótida se denomina un paraganglioma carotido, mientras que un paraganglioma de la médula adrenal se denomina feocromocitoma o un cromafinoma.

La estructura carótida es observada a menudo como una estructura redonda de color rojizo-marrón a castaño que se encuentra en las adventicias de la arteria carótida común. Puede estar colocada en la pared posteromediana del vaso en su bifurcación y está unida mediante el ligamento de Mayer a través del cual discurren los vasos de alimentación desde la carótida externa. Una estructura carótida normal mide 3-5 mm de diámetro. La inervación aferente parece que está proporcionada a través del nervio glosofaríngeo (el noveno nervio craneal). El nervio glosofaríngeo suministra fibras motoras a las fibras secretomotoras parasimpatéticas estilofaríngeas hasta la glándula carótida y fibras sensoriales hasta, entre otros, la cavidad timpánica, superficie interior del paladar blando y amígdalas. Histiológicamente, la estructura carótida incluye células de tipo I (principales) con citoplasma copioso y núcleos grandes redondos u ovales. El citoplasma contiene gránulos de núcleos densos que aparentemente almacenan y liberan catecolaminas. La estructura carótida normal es responsable de detectar cambios en la composición de la sangre arterial.

Los paragangliomas carótidos son tumores raros en general pero son la forma más común de paraganglioma del cráneo y el cuello. El tratamiento de elección para la mayoría de los paragangliomas de estructuras carótidas es la extirpación quirúrgica. Sin embargo, debido a su ubicación en las proximidades de importantes vasos y nervios, hay un riesgo real de morbilidad (principalmente déficit de nervios craneales X- XII y lesiones vasculares) y mortalidad, que es estimada en 3-9%. El tamaño del tumor es importante porque los mayores que 5 cm de diámetro tienen una incidencia considerablemente superior de complicaciones. Se proporcionan bloqueadores adrenérgicos alfa y beta perioperatorios (si el paraganglioma carótido está secretando catecolaminas) o menos preferentemente una embolización angiográfica preoperatorio. La radioterapia, sola o conjuntamente con cirugía, es una segunda consideración y un sector de alguna controversia. Desgraciadamente, debido a la ubicación y/o el tamaño, los paragangliomas, incluidos los paragangliomas carótidos, pueden ser inoperables.

2. Feocromocitomas

Los feocromocitomas se producen en la médula adrenal y provocan síntomas clínicos relacionados con una producción excesiva de catecolamina, que incluye presión sanguínea elevada repentina (hipertensión), cefalea, taquicardias, sudoración excesiva mientras se está en reposo, desarrollo de síntomas después de levantarse repentinamente desde una posición acostada y ataques de ansiedad. La toma de imágenes abdominales y la recogida de orina durante 24 horas en cuanto a catecolaminas son habitualmente suficientes para un diagnóstico. El bloqueo de catecolaminas con fenoxibenzamina y metirosina generalmente mejora los síntomas y es necesario evitar una crisis de hipertensión durante la cirugía, la terapia actual de elección. El tratamiento estándar es una adrenalectomía laparoscópica, aunque a menudo se usa una adrenalectomía parcial para las formas familiares de feocromocitoma. Los feocromocitomas malignos (cancerosos) son tumores raros.

Los feocromocitomas se estima que están presentes en aproximadamente un 0,3% de pacientes que experimentan una evaluación en cuanto a causas secundarias de hipertensión. Los feocromocitomas pueden ser mortales si no diagnosticados o si son inapropiadamente tratados. Una serie de autopsias sugiere que muchos feocromocitomas no son clínicamente sospechados y que el tumor sin diagnosticar está claramente asociado con consecuencias mortales.

El progreso de los cambios en la médula adrenal puede ser a partir de una médula adrenal hasta una hiperplasia medular adrenal (un aumento generalizado del número y tamaño de células de la médula adrenal sin el desarrollo específico de un tumor) hasta un tumor de la médula adrenal (feocromocitoma).

El tratamiento de un feocromocitoma es la extirpación quirúrgica de una o las dos glándulas adrenales. La necesidad o no de extirpar las dos glándulas adrenales dependerá del alcance de la enfermedad. Los pacientes a los que se les ha extirpado ambas glándulas adrenales deben tomar diariamente una reposición de Cortisol y aldosterona. El cortisol puede ser sustituido por hidrocortisona, cortisona o prednisona y se debe tomar diariamente. La aldosterona puede ser sustituida por fludocortisona diaria oral (Florineftm). Son necesarias cantidades aumentadas de reposición de hidrocortisona o prednisona por estos pacientes durante períodos de estrés, que incluye fiebre, catarro, gripe, procedimiento quirúrgico o anestesia.

3. Tumores glomulosos

Los tumores glomulosos (un tipo de paraganglioma) son neoplasmas generalmente benignos, que surgen también a partir de tejidos neuroectodérmicos, que se encuentran en diversas partes del cuerpo. Los tumores glomulosos son los tumores benignos más comunes que surgen en el hueso temporal y menos de un cinco por ciento de ellos se hacen malignos y producen metástasis. Los tumores glomulosos surgen de estructuras glomulosas distribuidas a lo largo de los nervios parasimpatéticos en la base del esqueleto, tórax y cuello. Normalmente hay tres estructuras glomulosas en cada oído. Las estructuras glomulosas habitualmente están acompañadas de nervio de Jacobsen (CN IX) o Arnold (CN X) o en las adventicias del bulbo yugular. Sin embargo, la ubicación física es habitualmente la mucosa del promontorio (glomus tympanicums) o el bulbo yugular (glomus jugulare).

La incidencia de los tumores yugulares glomulosos es de aproximadamente 1:1.300.000 de la población y el punto más sorprendente de epidemiología es la incidencia predominante sobre mujeres, siendo la relación de incidencia de mujeres:hombres de al menos 4:1. Los tumores secretores de catecolamina (es decir, funcionales) se producen en aproximadamente 1% a 3% de los casos.

Los tumores glomulosos tienen la capacidad potencial de secretar catecolaminas, análogamente a la médula adrenal que surge también a partir de tejidos de crestas neurales y puede secretar también catecolaminas. La contrapartida neoplástica de un tumor glomulosos en la médula adrenal es el feocromocitoma y los tumores glomulosos han sido denominados feocromocitoma extra-adrenal. Los tumores glomulosos secretores de catecolamina pueden provocar arritmias, transpiración excesiva, cefalea, nauseas y palidez.

Los tumores glomulosos pueden surgir en zonas diferentes de la base del cráneo. Cuando están confinados en el espacio medio del oído, se denominan glomus tympanicum. Cuando surgen en la zona del foramen yugular, independientemente de su alcance, se denominan yugular glomuloso. Cuando surgen en el cuello, extendiéndose hacia el foramen yugular, se denominan vagal glomulosos. Cuando surgen en la zona de la bifurcación carótida, se denominan tumores de estructuras carótidas. Otros sitios conocidos de tumores glomulosos incluyen la laringe, órbita ocular, nariz y arco aórtico.

Los tumores yugulares glomulosos son los tumores más comunes del oído medio. Estos tumores tienden a ser muy vasculares y están alimentados por ramificaciones de la arteria carótida externa. Los síntomas de un tumor yugular glomulosos incluyen pérdida de audición con zumbido pulsátil en el oído, mareos y a veces dolor de oídos. El paciente puede tener una pérdida de audición debida posiblemente al bloqueo del oído medio, pero puede haber también una pérdida de audición debida a una lesión nerviosa a partir de la masa tumoral. Las parálisis de los nervios craneales correspondientes a los nervios que controlan la acción de tragar, ensanchamiento, encogimiento de hombros y movimientos de la lengua pueden ser todos parte de la presentación de tumores yugulares glomulosos. Cuando la membrana timpánica es examinada, a menudo se puede observar una masa pulsátil rojo/azul. Los síntomas son insidiosos al comienzo. Debido a la ubicación y la naturaleza vascular de los tumores, la queja más común es un tinnitus pulsátil. Se cree que el tinnitus es secundario a un golpeo mecánico en el ombligo en la mayoría de los casos. Otros síntomas comunes son taponamientos de los oídos y pérdida de audición (conductiva).

La terapia actual para un tumor glomuloso que secreta catecolamina es la irradiación/extirpación quirúrgica, precedida de la administración de bloqueadores alfa y beta. El tratamiento para los tumores yugulares glomulosos incluye la administración de bloqueadores alfa y beta. La terapia con rayos X puede ser usada para mejorar los síntomas incluso si persiste la masa. Es posible también embolizar el tumor con materiales que bloqueen su suministro de sangre, sin embargo, este procedimiento tiene problemas asociados que provocan la inflamación del tumor, que puede comprimir el tronco encefálico y el cerebelo así como liberar las catecolaminas de las células que mueren cuando pierden su suministro de sangre. La cirugía se puede llevar a cabo sobre tumores pequeños cuando están apropiadamente ubicados. Las complicaciones de una cirugía para un tumor yugular glomulosos consiste en una pérdida persistente de fluido cerebroespinal desde el oído y también la parálisis de uno de los nervios craneales que controla el movimiento de la cara, sensación o audición.

Incluso aunque la cirugía puede ser satisfactoria para tumores yugulares glomulosos, resulta algo problemática porque tiene una tasa elevada de recurrencia y puede requerir múltiples operaciones. La extirpación quirúrgica conlleva el riesgo de morbilidad debida principalmente a déficit de nervios craneales yatrogénicos y pérdidas de CSF. La falta de conservación de los nervios craneales es probablemente la objeción más significativa a una intervención quirúrgica, debido a la morbilidad asociada de déficit de nervios craneales inferiores. La radioterapia tiene también complicaciones graves, que incluyen osteorradinecrosis del hueso temporal, necrosis cerebral, insuficiencia pituitaria-hipotalámica y enfermedades malignas secundarias. Otras complicaciones post-operatorias incluyen pérdidas de CSF, síndromes de aspiración, meningitis, neumonía e infecciones de heridas.

Por lo tanto, lo que se necesita es una extirpación no quirúrgica eficaz, un procedimiento terapéutico que no sea de radioterapia para un tratamiento eficaz de diversos cánceres que incluyen cánceres de glándulas mamarias, cánceres del sistema nervios central, cánceres de células sanguíneas, cánceres gastrointestinales (como cánceres de colon o rectal), cánceres de piel y cánceres de próstata.

A partir del documento WO 2004/071525 se conoce el uso de toxinas botulinum o sus fragmentos para el tratamiento de glándulas mamarias, especialmente cáncer de mamas y próstata mientras que el documento WO 2002/074327 se refiere análogamente a dicho uso para cáncer de mamas y próstata así como cáncer de páncreas y endometrial.

El documento WO A 2001/41790 se refiere a dicho uso para un neoplasma funcional, es decir, paraganglioma y el documento US B1 6.565.870 a dicho mismo uso para un cáncer de huesos. Ninguno de los documentos de la técnica anterior se refiere al uso de toxina botulinum para el tratamiento de cáncer de colon.

Dibujos

La figura 1 (parcialmente solo para referencia) muestra gráficamente un efecto in vitro de un tipo A de toxina botulinum (BOTOX) sobre nueve líneas o tipos de células cancerígenas diferentes. El eje X en la figura 1 representa la concentración de BOTOX en unidades/mililitro (U/ml) que se aplicó a nueve tipos diferentes de células cancerígenas. El eje Y en la figura 1 representa el porcentaje de inhibición de división celular para los nueve tipos diferentes de células cancerígenas a los que se aplicaron las concentraciones variables del eje X de BOTOX.

Las figuras 2-10 son 9 gráficos separados para cada uno de los 9 diferentes tipos de células cancerígenas mostrados en la figura 1 con el fin de exponer más claramente lo que se muestra en la figura 1. Los ejes X e Y de las figuras 2-10 representan las mismas U/ml y % de inhibición que se mostraban en la figura 1.

La figura 2 (para referencia) muestra un efecto in vitro de un tipo A de toxina botulinum sobre células de cáncer ductal de mamas metastáticas para tejido abdominal (línea celular ZR-75). El eje X representa la concentración de BOTOX en U/ml y el eje Y representa el porcentaje de de inhibición de división celular.

La figura 3 (para referencia) muestra un efecto in vitro de tipo A de toxina botulinum sobre células de cáncer ductal de mamas metastáticas para tejido de pulmón (línea celular T-47D). El eje X representa la concentración de BOTOX en U/ml y el Eje Y representa el porcentaje de inhibición de división celular.

La Figura 4 (para referencia) muestra un efecto in vitro de un tipo A de toxina botulinum sobre células cancerígenas de neuroblastoma metastáticas para médula ósea (línea celular SK-N-SH). El eje X representa la concentración de BOTOX en U/ml y el eje Y representa el porcentaje de inhibición de división celular.

La Figura 5 (para referencia) muestra un efecto in vitro de tipo A de toxina botulinum sobre células cancerígenas de leucemia de células T (línea celular Jurkat). El eje X representa la concentración de BOTOX en U/ml y el eje Y representa el porcentaje de inhibición de división celular.

La Figura 6 (para referencia) muestra un efecto in vitro de un tipo A de toxina botulinum sobre células cancerígenas de neuroblastoma metastáticas para tejido abdominal (línea celular IMR-32). El eje X representa la concentración de BOTOX en U/ml y el eje Y representa el porcentaje de inhibición de división celular.

La Figura 7 (para referencia) muestra un efecto in vitro de un tipo A de toxina botulinum sobre células cancerígenas de neuroblastoma metastáticas para una zona supra-orbital (línea celular SK-N-MC). El eje X representa la concentración de BOTOX en U/ml y el eje Y representa el porcentaje de inhibición de la división celular.

La Figura 8 (para referencia) muestra un efecto in vitro de un tipo A de toxina botulinum sobre células de cáncer colorrectal (línea celular SKCO-1). El eje X representa la concentración de BOTOX en U/ml y el eje Y representa el porcentaje de inhibición de división celular.

La Figura 9 (para referencia) muestra un efecto in vitro de un tipo A de toxina botulinum sobre células cancerígenas de melanoma amelanótico (línea celular M14). El eje X representa la concentración de BOTOX en U/ml y el eje Y representa el porcentaje de inhibición de división celular.

La Figura 10 (para referencia) muestra un efecto in vitro de un tipo A de toxina botulinum sobre células de cáncer de próstata (línea celular LNCAP). El eje X representa la concentración de BOTOX en U/ml y el eje Y representa el porcentaje de inhibición de división celular.

Sumario

La presente invención resuelve esta necesidad y proporciona un procedimiento terapéutico eficaz que no es de radioterapia y no es una extirpación quirúrgica para tratar diversos tejidos precancerosos así como cancerosos. Por tanto, la presente invención incluye procedimientos para tratar tejidos atípicos, es decir, cánceres de colon y para prevenir el desarrollo o provocar la regresión remisión de dichos tejidos atípicos. En particular, la presente invención incluye procedimientos para tratar cánceres de colon mediante la administración local de una toxina botulinum en las proximidades del tejido afectado o en el mismo.

Una realización de la presente invención es un uso de una neurotoxina botulinum en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer de colon administrando una neurotoxina botulinum a un colon, tratando así el cáncer de colon.

Preferentemente, la toxina botulinum es administrada en una cantidad entre aproximadamente 10^{-2} U/kg y aproximadamente 200 U/kg. Más preferentemente, la toxina botulinum es administrada en una cantidad entre aproximadamente 10^{-1} U/kg y aproximadamente 35 U/kg. La toxina botulinum se selecciona entre el grupo que consiste en tipos A, B, C, D, E, F y G de toxinas botulinum y la toxina botulinum preferida es tipo A de toxina botulinum.

Una realización más detallada de la presente invención es un uso de tipo A de neurotoxina botulinum en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer de colon mediante la administración local de entre 10-2 U/kg y aproximadamente 200 U/kg de tipo A de neurotoxina botulinum a un colon o las proximidades de un tejido de colon precanceroso, provocando así una reducción del tamaño y/o la actividad de un tejido de colon hiperplástico, hipertónico o neoplástico.

Una realización de la presente invención es un procedimiento para tratar un cáncer de colon, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar una neurotoxina botulinum a un colon. Preferentemente, la toxina botulinum es administrada en una cantidad entre aproximadamente 10^{-2} U/kg y aproximadamente 200 U/kg. Más preferentemente, la toxina botulinum es administrada en una cantidad entre aproximadamente 10^{-1} U/kg y aproximadamente 35 U/kg. La toxina botulinum se selecciona entre el grupo que consiste en tipos A, B, C, D, E, F y G de toxinas botulinum y la toxina botulinum preferida es tipo A de toxina botulinum.

Una realización detallada de la presente invención es un procedimiento para tratar un cáncer de colon, comprendiendo el procedimiento la etapa de una administración local de entre 10^{-2} U/kg y aproximadamente 200 U/kg de tipo A de toxina botulinum a un colon o a las proximidades de un tejido de colon precanceroso provocando así una reducción en el tamaño y/o actividad de un tejido de colon hiperplástico, hipertónico o neoplástico.

La toxina botulinum puede ser una toxina botulinum modificada, es decir, la toxina botulinum puede tener al menos uno de sus aminoácidos suprimido, modificado o sustituido, en comparación con una toxina botulinum nativa. Por tanto, la toxina botulinum puede ser una toxina botulinum producida recombinante o un derivado o fragmento de la misma.

Las siguientes definiciones se aplican en la presente memoria descriptiva.

El término "tratar", "tratando" o "tratamiento" significa una reducción o resolución o prevención de una enfermedad, trastorno o estado, como un cáncer o para favorecer la curación de un tejido lesionado o deteriorado.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa el nivel, cantidad o concentración de un agente (es decir, un ingrediente farmacéutico activo como una toxina botulinum) necesario para tratar una enfermedad, trastorno o estado o para reducir o prevenir un trastorno o estado de enfermedad sin provocar efectos secundarios negativos o adversos significativos al tejido tratado.

"Administración local" significa la inyección directa de la neurotoxina como una toxina botulinum en la zona local del tejido diana o a la misma.

Descripción

La presente invención se basa en el descubrimiento de que los tejidos hiperplásticos, hipertónicos, quísticos y/o neoplásticos pueden ser tratados con una toxina clostridial para reducir o eliminar así el estado de hiperplasia, hipertonia, quístico y/o neoplástico. Por lo tanto, la presente invención es aplicable al tratamiento de estados que incluyen cánceres colorrectales.

Por tanto, los tejidos dianas colinérgicamente inervados pueden ser tratados mediante la administración local de una toxina botulinum. Mediante administración local se quiere indicar que la toxina botulinum es administrada directamente en o en las proximidades del tejido diana (es decir, un tejido de colon). La administración local incluye la inyección de la toxina botulinum directamente en el tejido afectado. Los tejidos de colon no cancerosos (benignos), precancerosos, cancerosos (malignos) hiperplásticos y/o hipertónicos pueden ser tratados mediante un procedimiento dentro del ámbito de la presente invención. La hiperplasia nodular o difusa que precede al desarrollo de un tumor de colon puede ser tratada mediante el presente procedimiento.

La vía de referencia de administración y la cantidad de toxina botulinum administrada pueden variar ampliamente según el trastorno particular de glándulas mamarias que esté siendo tratado y diversas variables del paciente que incluyen el tamaño, peso, edad, gravedad de la enfermedad y respuesta a la terapia. El procedimiento para determinar la vía apropiada de administración y la dosificación se determinan generalmente sobre una base de caso por caso por el facultativo encargado. Estas determinaciones son rutinarias para un experto ordinario en la técnica (véase, por ejemplo, Harrinson's Principles of Internal Medicine (1997), editado por Anthony Fauci et al., 14^{th} edition, publicado por McGraw Hill). El tratamiento se lleva a cabo de forma que se evite sustancialmente la entrada de la toxina en la circulación sistémica (es decir, mediante el uso de una inyección subcutánea o intramuscular en oposición a una administración intravenosa).

La dosificación específica apropiada para una administración se determina fácilmente por un experto ordinario en la técnica según los factores anteriormente descritos. La dosificación puede depender también del tamaño del tumor que va a ser tratado denervado y de la preparación comercial de la toxina. Adicionalmente, las estimaciones para las dosificaciones apropiadas en seres humanos pueden ser extrapoladas a partir de determinaciones de las cantidades de botulinum requeridas para una denervación eficaz de otros tejidos no neoplásticos. Por tanto, la cantidad de botulinum A que va a ser inyectada es proporcional a la masa y el nivel de actividad del tejido de mamas que va a ser tratado. Generalmente, se pueden administrar entre aproximadamente 0,01 y 2000 unidades por kg de peso del paciente de una toxina botulinum como tipo A de toxina botulinum, para realizar eficazmente una atrofia del tejido diana inducida por la toxina tras la administración de la neurotoxina en las proximidades del tejido diana de mamas o al mismo. Menos de aproximadamente 0,01 U/kg de toxina botulinum no tienen un efecto terapéutico significativo mientras que más de aproximadamente 2000 U/kg o 35 U/kg de toxina botulinum B o A, respectivamente, se aproximan a una dosis tóxica de la toxina botulinum especificada. La colocación cuidadosa de la aguja de inyección y un volumen bajo de neurotoxina usada evita que aparezcan sistemáticamente cantidades significas de toxina botulinum. Un intervalo de dosis más preferido es de aproximadamente 0,01 U/kg a aproximadamente 25 U/kg de toxina botulinum como la formulada como BOTOX®. La cantidad real de U/kg de toxina botulinum que va a ser administrada depende de factores como el alcance (masa) y el nivel de actividad del tejido de mamas hiperplástico que va a ser tratado y de la vía de administración escogida. El tipo A de toxina botulinum es un serotipo preferido de toxina botulinum para ser usado en los procedimientos de la presente invención.

El sitio principal de acción de la toxina botulinum es la unión neuromuscular en la que la toxina se une rápidamente y evita la liberación de acetilcolina. Por tanto, aunque es conocido que las toxinas botulinum tienen una afinidad de unión conocida por neuronas motoras periféricas, presinápticas colinérgicas, se ha descubierto que las toxinas botulinum se pueden unir también a una diversidad de tejidos de mamas precancerosos y translocarlos, en los que la toxina seguidamente actúa, de la manera conocida, como una endoproteasa sobre su respectiva proteína de asociación de vasos-membranas secretoras.

Preferentemente, una toxina botulinum usada para poner en práctica un procedimiento dentro del ámbito de la presente invención es una toxina botulinum, como una de las toxinas botulinum de serotipos A, B, C, D, E, F o G. Preferentemente, la toxina botulinum usada es tipo A de toxina botulinum, debido a su elevada potencia en seres humanos, fácil disponibilidad y uso conocido para el tratamiento de trastornos de músculos esqueléticos y lisos cuando son administradas localmente mediante inyección intramuscular.

Una vía de referencia para la administración de una neurotoxina según la presente invención descrita para tratar un tejido de mamas precanceroso puede ser seleccionada basada en criterios como las características de solubilidad de la toxina neurotoxina escogida así como en la cantidad de la neurotoxina que va a ser administrada. La cantidad de la neurotoxina administrada puede variar ampliamente según el trastorno particular que esté siendo tratado, su gravedad y otras diversas variables del paciente que incluyen el tamaño, peso, edad y respuesta a la terapia. Por ejemplo, el alcance del tejido de mamas precanceroso influenciado se cree es proporcional al volumen de neurotoxina inyectada, mientras que la cantidad de la denervación, para la mayoría de los intervalos de dosis, se cree que es proporcional a la concentración de neurotoxina inyectada. Los procedimientos para determinar la vía de administración apropiada y la dosificación se determinan generalmente sobre una base de caso por caso por el facultativo encargado. Estas determinaciones son rutinarias para un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Harrinson's Principles of Internal Medicine (1997), editado por Anthony Fauci et al., 14^{th} edition, publicado por McGrw Hill).

La presente invención incluye dentro de su alcance el uso de cualquier toxina botulinum que tenga una larga duración de efecto terapéutico cuando es localmente aplicada a un tejido de mamas precanceroso de un paciente. Por ejemplo, las toxinas botulinum constituidas por clortridium botulinum pueden ser usadas o adaptadas para ser usadas en los procedimientos de la presente invención. Adicionalmente, la totalidad de los serotipos A, B, C, D, E, F y G de botulinum pueden ser ventajosamente usados en la práctica de la presente invención, aunque el tipo A es el serotipo más preferido, como se explico anteriormente. La práctica de la presente invención puede proporcionar una atrofia de tejidos dianas y la remisión durante 27 meses o más en seres humanos.

Es conocido que la liberación de catecolamina de células de médula adrenal permeabilizada puede ser inhibida por una toxina botulinum. Adicionalmente, es conocido que la liberación de insulina de células secretoras de insulina permeabilizadas (como por electroporación) puede ser inhibida por una toxina botulinum. Cuando lo son in vitro, las membranas celulares de estas células no nerviosas pueden ser permeabilizadas para ayudar a la introducción de una toxina botulinum en el citosol de la célula debido a la falta de receptores de la superficie celular para una toxina botulinum. Por tanto, el tipo B de toxina botulinum aparentemente inhibe la secreción de insulina escindiendo la sinaptobrevina presente en la línea celular secretora de insulina HIT-15. Boyd R.S. et al The Effect of Botulinum Neurotoxin-B On Insulin Release From a Beta Cell, Mov Disord 10(3):376(1995). El inventor supone que una toxina botulinum puede bloquear la liberación de cualquier exocitosis mediada por vesículas de cualquier tipo de célula secretora (es decir, neuronal, glandular, secretora o coafínica) en la medida en que la cadena ligera de la toxina botulinum sea translocada en el medio intracelular. Por ejemplo, la proteína intracelular SNAP-25 está ampliamente distribuida en células secretoras tanto neuronales como no neuronales y el tipo A de toxina botulinum es una endopéptidasa para la que el sustrato específico es SNAP-25. Por tanto, aunque las neuronas colinérgicas tienen una elevada afinidad aceptora para las toxinas botulinum y del tétanos (y, por lo tanto, son más sensibles que otras neuronas y otras células a la inhibición de la exocitosis mediada por vesículas de compuestos secretores), cuando la concentración de toxina es elevada, las neuronas simpáteticas no colinérgicas, células cromáfinicas y otros tipos de células pueden absorber una toxina botulinum y mostrar una exocitosis reducida.

Además de ello, un procedimiento dentro del ámbito de la presente invención puede proporcionar una función mejorada al paciente. "Función mejorada al paciente" se puede definir como una mejora medida por factores como un dolor reducido, tiempo pasado en cama reducido, estancia externa aumentada, actitud más sana, estilo de vida más variado y/o curación permitida mediante un tono muscular normal. La función mejorada al paciente es sinónimo de calidad de vida mejorada (QOL). La QOL puede ser valorada usando, por ejemplo, los procedimientos conocidos de valoración de seguimiento de la salud SF-12 o SF-36. El SF-36 valora la salud física y mental del paciente en los ocho dominios de funcionamiento físico, limitaciones de funciones debidas a problemas físicos, funcionamiento social, dolor corporal, salud mental general, limitaciones de funciones debidas a problemas emocionales, vitalidad y percepciones de la salud general. Las valoraciones obtenidas pueden ser comparadas con valores publicados aplicables para diversas poblaciones generales y de pacientes.

En su realización más preferida, la presente invención se pone en práctica mediante una inyección directa en el tejido diana o la zona local del tejido diana de tipo A de toxina botulinum. Se ha informado que en la unión neuroglandular, el efecto de denervación química de una toxina botulinum, como tipo A de toxina botulinum, tiene una duración de la acción considerablemente mayor, es decir, de 27 meses frente a 3 meses.

La presente invención incluye en su ámbito: el uso de (a) complejo de toxina botulinum así como toxina botulinum pura obtenida o tratada mediante cultivo bacteriano, extracción, concentración, conservación, liofilización y/o reconstitución de toxinas y (b) toxina botulinum modificada o recombinante, que es toxina botulinum que tiene uno o más aminoácidos o secuencias de aminoácidos deliberadamente suprimidas, modificadas o sustituidas mediante procedimientos químicos/bioquímicos conocidos de modificación de aminoácidos o mediante el uso de tecnologías recombinantes conocidas de vectores de células hospedantes/recombinantes, así como derivados o fragmentos de toxinas botulinum así preparadas, e incluyen toxinas botulinum con uno o más restos de dirección a diana unidos para tipos de células cromafínicas y neoplasmas, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer de colon.

Las toxinas botulinum para ser usadas según la presente invención pueden ser almacenadas en forma liofilizada o secadas a vacío en recipientes bajo una presión de vacío. Antes de la liofilización, la toxina botulinum puede ser combinada con excipientes, estabilizantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables, como albúmina. El material liofilizado o secado a vacío puede ser resconstituido con solución salina o agua.

En cada uno de los siguiente ejemplos, la cantidad específica de toxina botulinum administrada depende de una diversidad de factores que deben ser sopesados y considerados dentro del criterio del facultativo encargado y, en cada uno de los ejemplos, la inclusión de cantidades insignificantes de toxina botulinum sistemáticamente no tuvo efectos secundarios significativos. Las unidades de toxina botulinum inyectada por kilogramo (U/kg) a continuación son por kg de peso total del paciente. Por ejemplo, 3 U/kg para un paciente de 70 kg supone una inyección de 210 unidades de la toxina botulinum.

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Ejemplos

Los ejemplos siguientes proporcionan a los expertos en la técnica los procedimientos preferidos para llevar a cabo la presente invención.

En cada uno de los ejemplos, la cantidad específica de toxina botulinum (como BOTOX®) administrada depende de una diversidad de factores que deben ser sopesados y considerados dentro del criterio del facultativo encargado y, en cada uno de los ejemplos, pueden aparecer cantidades insignificantes de toxina botulinum sistemáticamente sin un efecto perjudicial significativo.

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Ejemplo 1

(Solo para referencia)

Uso de una toxina botulinum para tratar trastornos precancerosos de glándulas mamarias 1. Tratamiento de quistes

Una mujer de 46 años de edad presenta una enfermedad quística crónica en mamas que por lo demás son normales. Aparece un cambio fibroquístico como una mezcla de un cierto número de entidades benignas con una masa total de 1,2 cm de diámetro y que contiene zonas de tejido fibro-graso firme y múltiples quistes de tamaño variable. Una investigación por ultrasonidos y formación de imágenes pone de manifiesto la formación de quistes y microcalcificación. Un examen histológico pone de manifiesto la presencia de atipia apocrina (tanto hiperplasia como metaplasia) y, por lo tanto, se determina que el paciente está en riesgo de desarrollar un carcinoma apocrino o carcinoma medular.

La aspiración con aguja fina (FNA) de mamas palpables ha sido usada desde 1930 para examinar la citopatología de células de mamas en el diagnóstico de cáncer. La aspiración con agujas finas estereotácticas así como la aspiración con agujas finas guiada por ultrasonidos y mamográfica ha sido usada también para lesiones no palpables. La estereorradiografía se puede hacer una instalación de mamografía estándar y placas de compresión, para permitir una colocación precisa de la aguja fina a lo largo de las coordenadas x e y hasta dentro de 1 mm de la lesión. La guía por ultrasonidos es muy útil para determinar se la lesión es puramente quística, mixta o sólida. Normalmente, se usa una aguja de calibre 22. Se usa la misma metodología usada para la FNA para inyectar una toxina botulinum en un tejido diana. Por tanto, para la inyección, la aguja se puede unir a una jeringuilla con o sin un mango especial que permita una fijación con una mano. La piel es frotada con un antiséptico. La masa mamaria es sujetada y la piel que la cubre es retirada hasta una posición favorable para que el operario inserte la aguja con su otra mano. La aguja es insertada en la masa y el émbolo de la jeringuilla que contiene una solución de toxina botulinum es impulsado hacia delante mientras que la aguja avanza en una línea recta a través de la lesión. Alternativamente, para un efecto terapéutico prolongado, se puede insertar un implante de liberación controlada por vía subcutánea y/o se puede inyectar una suspensión de microesferas que contengan botulinum, como se exponen en las patentes de EE.UU. números 6.306.423 y 6.312.708.

Se lleva a cabo la administración local (inyección) de 10 unidades a 100 unidades de tipo A de toxina botulinum, como BOTOX®, en la masa del quiste. Después de 28 días, el quiste se ha contraído sustancialmente (el diámetro del quiste se reduce en al menos un 80%) y permanece así durante los siguientes 2 a 24 meses. Alternativamente, puede ser administrada un tipo B, C, D, E, F o G de toxina botulinum, con la cantidad dosificada ajustada para reflejar la potencia diferente en comparación con la toxina de tipo A. Por tanto, por ejemplo, como el tipo B de toxina botulinum se conoce que es aproximadamente 50 veces menos potente que el tipo A de toxina botulinum, se administran localmente de 500 a 5.000 unidades de toxina de tipo B.

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2. Tratamiento de adenosis esclerosante (solo para referencia)

Se examina una mujer post-menopáusica de 59 años de edad con una queja de dolor de mamas. Una mamografía pone de manifiesto una lesión proliferativa desde la unidad lobular del conducto Terminal y que comprende una masa clínicamente palpable de 1,3 cm de diámetro sin coloración específica. La masa está mal definida y hay algo de dolor blandura. Histológicamente, la configuración normal de un grupo de lóbulos es distorsiona por una proliferación desordenada de células acini y estromales intralobulares. Se lleva a cabo la administración local (inyección) de 10 unidades a 100 unidades de tipo A de toxina botulinum como BOTOX® en la masa. En los 28 días posteriores, la masa se ha contraído sustancialmente (diámetro reducido en al menos 80%) y continúa así durante los siguientes 2 a 24 meses. Alternativamente, el tipo B, C, D, E, F o G de toxina botulinum puede ser administrado, siendo ajustada la cantidad dosificada para reflejar la potencia diferente en comparación con la toxina de tipo A. Por tanto, por ejemplo, como el tipo B de toxina botulinum se conoce que es aproximadamente 50 veces menos potente que el tipo A de toxina botulinum, pueden ser administradas de 500 a 5.000 unidades de toxina de tipo B.

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3. Tratamiento de papilomas ductales (solo para referencia)

Se examina una mujer de 50 años de edad con un historial de aparición de manchas sanguíneas en un pezón. Aunque no hay masa palpable, se pone de manifiesto un neoplasma benigno del epitelio ductal de la mama. Se lleva a cabo la administración local de 10 unidades a 100 unidades de tipo A de toxina botulinum, como BOTOX®. En los 28 días posteriores la aparición se resolvió y la paciente permanece libre de síntomas durante los siguientes 2 a 24 meses. Alternativamente, puede ser administrado un tipo B, C, D, E, F o G de toxina botulinum con la cantidad dosificada ajustada para reflejar la potencia diferente en comparación con la toxina de tipo A. Por tanto, por ejemplo, como el tipo B de toxina botulinum se conoce que es aproximadamente 50 veces menos potente que el tipo A de toxina botulinum, se pueden administrar localmente de 500 a 5.000 unidades de toxina de tipo B.

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4. Tratamiento de fibroadenomas (solo para referencia)

Una mujer de 36 años de edad presenta un bulto en el pecho. Un examen clínico, formación de imágenes (mamografía) y citología por aspiración con aguja fina pone de manifiesto una masa elástica, indolora, bien definida, móvil y firme de 1,5 cm de diámetro. Como la lesión es benigna, se le ofrece a la paciente una inyección local de toxina botulinum como una alternativa a la extirpación y se obtiene un consentimiento informado. Se lleva a cabo la administración local en el bulto de 10 unidades a 100 unidades de tipo A de toxina botulinum, como BOTOX®. En los 28 días posteriores la masa se ha contraído sustancialmente (diámetro reducido en al menos 80%) y permanece así durante los siguientes 2 a 24 meses. Alternativamente, puede ser administrado un tipo B, C, D, E, F o G de toxina botulinum, con la cantidad dosificada ajustada para reflejar la potencia diferente en comparación con la toxina de tipo A. Por tanto, por ejemplo, como el tipo B de toxina botulinum se conoce que es aproximadamente 50 veces menos potente que el tipo A de toxina botulinum, se pueden administrar localmente de 500 a 5.000 unidades de toxina de tipo
B.

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5. Tratamiento de adenosis ductal cerrada (solo para referencia)

Una mujer de 54 años de edad con un historial de ingestión de cafeína (4-6 tazas de café al día durante aproximadamente los últimos 10 años) tiene una alternación columnar de lóbulos determinada como zonas mal definidas de formación de microquistes con unidades lobulares de conductos terminales individuales que muestran alteración o reposición de la capa epitelial luminar normal, mediante una capa única de células epiteliales columnares más altas con núcleos basalmente colocados y morros apicales citoplásmicos. Se lleva a cabo la adiministración local en el bulto de 10 unidades a 100 unidades de tipo A de toxina botulinum, como BOTOX®. En los 28 días posteriores la adenosis se había resuelto y continuó así durante los siguientes 2 a 24 meses. Alternativamente, el tipo B, C, D, E, F o G de toxina botulinum puede ser administrado, con la cantidad dosificada ajustada para reflejar la diferente potencia en comparación con la toxina de tipo A. Por tanto, por ejemplo, como el tipo B de toxina botulinum se conoce que es de aproximadamente 50 veces menos potente que el tipo A de toxina botulinum, se pueden administrar localmente de 500 a 5.000 unidades de toxina de tipo B.

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6. Tratamiento de enfermedad ploriferativa de las mamas (solo para referencia)

La histología sobre una muestra de biopsia de una mujer de 64 años de edad pone de manifiesto una hiperplasia epitelial (proliferativa con atipia) que se muestra por un aumento en el número de células por encima de la bicapa normal de células epiteliales luminales normales y células mioepiteliales. Se lleva a cabo la administración local en el bulto de 10 unidades a 100 unidades de tipo A de toxina botulinum, como BOTOX®. En los 28 días posteriores una biopsia seguida de un examen histológico determina que el paciente está exento de atipia y permanece así durante al menos los siguientes 2 a 24 meses. Alternativamente, se puede administrado un tipo B, C, D, E, F o G de toxina botulinum, con la cantidad de dosificación ajustada para reflejar la diferente potencia en comparación con la toxina de tipo A. Por tanto, por ejemplo, como el tipo B de toxina botulinum se conoce que es aproximadamente 50 veces menos potente que el tipo A de toxina botulinum, se pueden administrar localmente de 500 a 5.000 unidades de toxina de tipo B.

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Ejemplo 2

(Solo para referencia)

Tratamiento de tejidos hipertónicos o hiperplásticos con una toxina botulinum

La administración local de una tosina botulinum directamente a un tejido diana hipertónico o hiperplástico o en sus proximidades se puede realizar mediante diversos procedimientos. Como se expuso anteriormente un tejido diana dérmico o subdérmico, como un tejido de mamas, puede ser tratado mediante inyección directa o mediante la colocación de un implante de toxina. Los sitios viscerales, como un neuroblastoma visceral, pueden ser también fácilmente accedidos. Por ejemplo, es bien conocida una endoscopia para fines de diagnóstico y terapéuticos.

(1) Las técnicas endoscópicas pancreáticas terapéuticas incluyen esfinterotomía pancreática, estrechamiento, dilatación, aplicación espirales, seudoquístico y colangiopancreatografía retrograda endoscópica (ERCP) que permite la visualización y el tratamiento del sistema ductal pancreático-biliar. Un endoscopio usado para la terapia pancreática puede ser modificado para permitir su uso para una inyección directa de una neurotoxina, como toxina botulinum, directamente en el tejido pancreático. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.674.205. El endoscopio es desplazado desde la orofaringe a través del estómago, duodeno y finalmente al conducto pancreático, llevándose a cabo previamente una descompresión del conducto (por ejemplo, mediante dilatación o estrechamiento) si es necesario, para permitir el alojamiento del endoscopio en el conducto. Una vez colocado así, se puede extender la punta de una aguja hueca desde el endoscopio en el interior del tejido pancreático y a través de dicha aguja se puede inyectar la neurotoxina en el tejido pancreático.

Si el conducto pancreático no es accesible o no se descomprime, se puede usar también una aguja percutánea, guiada por formación de imágenes (es decir, por ultrasonidos o tomografía por ordenador) para una inyección transabdominal de una neurotoxina directamente en el tejido pancreático. Por tanto, la aspiración con aguja percutánea para una biopsia pancreática es una técnica conocida y la aspiración puede ser invertida para realizar la inyección de la toxina deseada. Por tanto, un insulinoma o tejido pancreático hipertónico o hiperplástico puede ser tratado mediante la administración local de 1 a 500 unidades de toxina botulinum en el tejido diana pancreático. Puede ser análogamente tratado un tejido diana de pulmón neoplástico o hiperplástico, intestinal o de ovarios.

(2) Pituitaria

Se pueden usar procedimientos estereotácticos para una administración intracraneal precisa de neurotoxina en forma acuosa o como un implante para tratar un tejido diana hiperplástico o de hipotálamo o de pituitaria. Un neuroblastoma craneal es tratado también de esta manera. Por tanto, la administración intracraneal de toxina botulinum se puede llevar a cabo como sigue.

Se puede llevar a cabo una exploración MRI preliminar del paciente para obtener la longitud de la línea de la comisura anterior- comisura posterior y su orientación a puntos de referencia óseos externos. La base del marco puede ser seguidamente alineada al plano de la línea de comisura anterior-comisura posterior. Se usa la guía CT y se puede complementar con una ventriculografía. La comisura posterior puede ser visualizada en cortes CT de 2 mm y usada como un punto de referencia.

La corroboración fisiológica de la localización de tejidos dianas se puede hacer mediante el uso de estimulación a frecuencia elevada y baja a través de un electrodo que acompaña a la jeringuilla de aguja larga usada o es incorporado en la misma. Se puede usar un electrodo termistor de 1,6 mm de diámetro con una punta expuesta de 2 mm (Radionics, Burlington, Massachussets). Con la estimulación a frecuencia elevada del electrodo (75 Hz) se pueden provocar respuestas parastáticas en el antebrazo y la mano a 0,5-1,0 V usando un generador de lesiones Radionics (modelo de generador de lesiones de radiofrecuencia Radionics modelo RFG3AV). A la frecuencia baja (5 Hz) la activación o interrupción del temblor en miembro afectado se produjo a 2-3 V. Con los procedimientos de la presente invención, el electrodo no es usado para crear una lesión. A continuación de la confirmación de la localización del tejido diana, puede ser inyectada una neurotoxina, provocando así una hipotalamectomía química reversible. Una inyección típica es el número deseado de unidades (es decir, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 unidades de complejo de tipo A de toxina botulinum en aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 0,1 ml de agua o solución salina). Se puede usar un volumen de inyección bajo para minimizar la difusión de toxina fuera de la diana. Normalmente, el factor de liberación hipotalámico o efecto de inhibición de liberación de hormona pituitaria se puede esperar que desaparezca en aproximadamente 2-4 meses. Por tanto, se puede usar un formato de neurotoxina alternativo, neurotoxina incorporada en un implante polímero, para proporcionar una liberación continua y controlada de una cantidad terapéutica de la toxina en el lugar deseado durante un período prolongado (es decir, de aproximadamente 1 año a aproximadamente 6 años), evitando así la necesidad de inyecciones repetidas de toxinas.

Se pueden usar diversos procedimientos para una inyección estereotácticamente guiada de una neurotoxina a diversas dianas intracraneales, como el núcleo arciforme (AN) para el tratamiento de acromegalia. Por tanto, se puede usar un procedimiento de resonancia magnética estereotáctica (MRI) que se basa en imágenes pesadas de T1 en tres dimensiones (3D) para una planificación quirúrgica e imágenes pesadas en T2 multiplanares para una visualización directa del AN acopladas con un registro electrofisiológico y guía de inyecciones para una inyección de AN. Véase, por ejemplo, Bejjani, B.P. et al., Bilateral Subthalamic Stimulation for Parkinson's Disease by Using Three-Dimensional Stereotactic Magnetic Resonance Imaging and Electrophysiological Guidance, J. Neurosurg 92(4);615-25:2.000. Las coordenadas del centro del AN se pueden determinar con referencia a la línea de comisura anterior-comisura posterior del paciente y un atlas cerebral.

Se puede realizar simultáneamente una verificación electrofisiológica a través de diversas trayectorias para definir la diana funcional exactamente. La trayectoria central, que es dirigida a la diana predeterminada usando formación de imágenes MRI, se puede seleccionar para una inyección de neurotoxina. No son esperadas complicaciones
quirúrgicas.

La metodología de neurocirugía funcional basada en un atlas asistida por ordenador se puede usar para inyectar exacta y precisamente la neurotoxina o implante deseado o un implante de liberación controlada de neurotoxina. Estas metodologías permiten la exposición tridimensional y la manipulación en tiempo real de estructuras hipotalámicas. La planificación neroquirúrgica con atlas del cerebro múltiples previamente registrados de forma mutua en las tres orientaciones ortogonales es, por lo tanto posible y permite una exactitud aumentada de la definición de la diana para la inyección o implantación de neurotoxinas, un tiempo reducido del procedimiento quirúrgico mediante la disminución del número de trayectorias y facilita la planificación de trayectorias más sofisticadas. Véase, por ejemplo, Nowinski W.L. et al., Computer-Aided Stereotactic Functional Neurosurgery Enhanced by the Use of the Multiple Brain Atlas Database, IEEE Trans Med Imaging 19(1);62-69:2000. Por tanto, un tumor pituitario o tejido pituitario hipertónico o hiperplástico puede ser tratado mediante la administración local de 1 a 500 unidades de toxina botulinum al tejido diana de pituitaria.

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Ejemplo 3

Uso de una toxina botulinum para tratar diversos cánceres Introducción

Se llevo a cabo un experimento para determinar un efecto anticancerígeno de una toxina botulinum sobre diversos cánceres diferentes. El experimento se llevo a cabo usando el ensayo Oncotech EDR® (Oncotech, Inc., Tustin, California). Este ensayo se puede usar para valorar la actividad anticancerígena de un agente determinada mediante una capacidad medida (si la hay) de un agente para detener la división y crecimiento de células cancerígenas. Por tanto, el ensayo Oncotech EDR® es un ensayo de resistencia de fármacos in vitro usado para medir la resistencia in vitro de diversas líneas celulares cancerígenas al agente que está siendo estudiado.

El ensayo Oncotech EDR® utiliza células cancerígenas y expone las células cancerígenas a compuestos quimioterapéuticos (es decir, agentes) cancerígenos potenciales particulares en cultivo. Durante el período de cultivo, se añade timidita radioactiva. La timidita tritiada pasa fácilmente a través de la membrana de la célula cancerígena y se convierte de una manera por etapas en ^{3}H-dTMP mediante timidilatoquinasa y nucleósido difosfatoquinasa. La dTMP tritiada es seguidamente incorporada en DNA usando la fase S del ciclo celular. Las células afectadas por los fármacos anticancerígenos no se dividen, o se dividen más lentamente y, por lo tanto, incorporan cantidades menores de la timidita radioactiva. Por el contrario, las células que continúan dividiéndose e incorporan timidita radioactiva después del tratamiento son resistentes a ese fármaco. Midiendo la cantidad de radioactividad en una muestra, el ensayo puede determinar la resistencia relativa de un cáncer a un agente particular. Seguidamente se aplica un algoritmo a los datos experimentales para determinar la probabilidad de que un paciente responda al agente ensayado en el
ensayo.

En este experimento se usaron 9 tipos diferentes de células cancerígenas para mostrar los efectos de una toxina botulinum sobre la división celular de cada uno de los nueve tipos diferentes de células. Estas líneas celulares representan seis tipo diferentes de cáncer, neuroblastoma, leucemia linfoblástica aguda, cáncer de próstata, cáncer de mamas, cáncer de piel y cáncer de colon. Este experimento determinó que una toxina botulinum puede inhibir la división celular de un cierto número de tipos diferentes de células cancerígenas.

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Procedimientos y materiales 1. Líneas celulares cancerígenas

Se usaron en este estudio 8 líneas de células cancerígenas diferentes obtenidas de la entidad American Type Culture Collection (ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108) y una línea celular de la universidad de California, los Angeles. Los nueve estudios de tipos de células cancerígenas fueron: 1) IMR-32, una línea celular de neuroblastoma de una masa abdominal derivada de un macho caucasiano de 13 meses de edad; 2) Jurkat, una línea celular de leucemia de células T derivada de la sangre periférica de un macho de 14 años de edad; 3) LNCAP, una línea celular de carcinoma de próstata que es metastática del nódulo linfático supraclavicular izquierdo; 4) SK-CO-1, una línea celular de adenocarcinoma colorrectal que es metastática para los ascitos derivados de un macho caucasiano de 65 años de edad; 5) SK-N-MC, una línea celular de neuroblastoma que es metastático para el área supra-orbital derivada de una hembra caucasiana de 14 años de edad; 6) SK-N-SH, una línea celular de neuroblastoma que es metastático para médula ósea derivada de una hembra de 4 años de edad; 7) T-47D, una línea celular de carcinoma ductal de mamas que es metastático para la efusión pleural derivada de una hembra de 54 años de edad; 8) ZR-75, una línea celular de carcinoma ductal de mamas que es metastático para los ascitos derivados de una hembra caucasiana de 63 años de edad y 9) M14, una línea celular de melanoma amelanótico proporcionada por la Universidad de California, Los Angeles.

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2. Artículos del ensayo

La solución de trabajo de BOTOX® (210 U/ml) se preparó reconstituyendo 100 U con 0,475 ml de solución salina al 0,9% esterilizada sin conservar usando una jeringuilla de calibre 21 o 22, suavemente agitada y almacenada entre 2ºC y 8ºC en un refrigerador en condiciones seguras durante hasta 4 horas. Se usó siempre BOTOX® dentro de las 4 horas de la reconstitución. Se usaron siete (7) viales de plasbúmina (lote nº 684X022). Cada vial de plasbúmina (albúmina humana) contenía 50 ml de albúmina al 25%, USP. La solución de trabajo de albúmina (1,05 mg/ml) se preparó para hacer coincidir la cantidad de albúmina presente en BOTOX® a cada concentración. La concentración en almacenamiento de plasbúmina (12,5 g/50 ml o 0,25 g/ml) se diluyó hasta 1,05 mg/ml en solución salina esterilizada sin conservar al 0,9%.

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3. Titulación de los artículos del ensayo

Las concentraciones ensayadas para determinar la IC50 aproximada variaron en el intervalo de 0,001 U/ml a 20 U/ml para BOTOX® y de 0,000005 mg/ml a 0,1 mg/ml para albúmina. Las soluciones de trabajo preparadas fueron diluidas 1:21 (50 \mul de fármaco en 1 ml de medios + células) en el pocillo excepto para 20 u/ml de BOTOX® y 0,1 mg/ml de albúmina, en la que se usó una dilución de 1:10 (100 \mul de compuesto en 0,9 ml de medios + células).

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4. Preparación de la línea celular

El ensayo EDR se realizó de acuerdo con los procedimientos operatorios estándar de Oncotech. Se descongelaron líneas celulares congeladas en DMSO de forma que mantuvieran la viabilidad. Se evaluaron células tumorales en cuanto a la viabilidad usando exclusión de azul de Trípano y en cuanto a la densidad de las células tumorales usando preparaciones de citospina antes de disponerlas en placas en agar blando en presencia de BOTOX® o albúmina. Las diluciones de las células viables se prepararon en medio de cultivo de tejidos EDR para dar lugar a aproximadamente 2-10 x 10^{4} células por pocillo.

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5. Testigos

Se analizó una dosis citotóxica de cisplatino por duplicado como un testigo positivo y las células sin tratar sirvieron como una referencia y testigo negativo. Si los recuentos por minuto (CPM) a partir del testigo positivo fueron mayores que 30% del testigo sin tratar, el análisis se rechazó. Se dispuso en placa un pocillo testigo con la mitad de células sin tratar, con la mitad de la densidad celular para que sirviera de testigo para una disposición sobre placas. Si el porcentaje de crecimiento del testigo de la mitad de las células era mayor que 85% o el crecimiento de los testigos negativos sin tratar, la placa fue clasificada como sobrecrecida y no fue incluida en el análisis. Se prepararon duplicados de cada fármaco y cada testigo y se calculó la medida de los valores para los cálculos.

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6. Ensayo EDR®

Se cultivaron células tumorales en placas de agrupaciones de 24 pocillos. En primer lugar, se preparó una capa inferior de agar en cada pocillo de la placa de cultivo pipeteando 0,5 ml de medio de cultivo de tejidos EDR que contenía 0,4% de agarosa purificada de bajo punto de fusión en cada pocillo. La agarosa se dejó sedimentar brevemente con el fin de que endureciera. Seguidamente, se añadieron 50 \mul de 21 X de la concentración apropiada de BOTOX® o solución de trabajo de albúmina a cada pocillo (excepto para 20 U/ml de BOTOX® y 0,1 mg/ml de albúmina cuando se añadieron 100 \mul de 21 X a cada pocillo). Las células tumorales preparadas según la sección 2c se pusieron en suspensión en medio de cultivo de tejido EDR que contenía 0,2% de azarosa. La suspensión celular se mezcló, se añadieron partes alícuotas de 0,5 ml de células tumorales puesta en suspensión en medio de cultivo de tejido EDR con 0,2% de agarosa sobre la capa superior de cada posillo y las placas se dejaron sin perturbar a 4ºC para que la agarosa sedimentara. Seguidamente las placas se colocaron en un conjunto incubador a 37ºC con 5% de CO_{2}. Las placas se incubaron durante 72 horas después de lo cual se añadieron a cada pocillo 100 \mul de medio de cultivo de tejido EDR que contenía 5,0 \muCi de ^{3}H-timidina. Seguidamente las placas se devolvieron al incubador durante 48 horas adicionales. Al final del período de incubación, las membranas de las células tumorales fueron disgregadas añadiendo 0,5 ml de agua desionizada a cada pocillo y calentando a 95ºC. Se recogió DNA celular en un papel de filtro Reeve Angel 934AH usando un recolector de células automático Brandel. Se añadió fluido de centelleo Cytoscint a un vial de centelleo líquido con el papel de filtro y los viales se taparon herméticamente. Los viales se analizaron seguidamente en un contador de centelleo Beckman LS-6500 y se registraron los recuentos por minuto (CPM) para
^{3}H.

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7. Interpretación de resultados

Se registraron recuentos de timidina tritiada para pocillos por duplicado para cada muestra tratada y los pocillos se incubaron con una dosis citotóxica de cisplatino (20 X CP) y dos muestras testigos sin tratar. Se calculó el porcentaje de inhibición dividiendo la media de los recuentos corregidos a partir de las muestras tratadas por los recuentos medios corregidos de la muestra testigo sin tratar. Para algunas líneas celulares, se analizaron dos testigos negativos. En el caso de que el segundo testigo fuera menos de un 10% del primer testigo, se usó el segundo testigo para calcular el porcentaje de inhibición.

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8. Análisis de datos

Se calcularon medias y desviaciones típicas de los datos usando el programa Microsoft Excel 2000 (9.0.2720). La función "=media (...)" se usó para calcular la media, "= STDEV (...)" se usó para calcular la desviación típica y "= TTEST (...)" se usó para calcular un ensayo t de dos muestras y dos colas con igual varianza.

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Resultados Análisis de titulación

Se ensayó BOTOX® sobre un intervalo de concentraciones de 0,001 U/ml a 20 U/ml para determinar la IC50 aproximada sobre nueve líneas celulares de cáncer. El cambio en la concentración unitaria de BOTOX® se representa gráficamente en la figura 1.

Este experimento mostró que concentraciones diferentes de toxina botulinum fueron capaces de inhibir la división celular en al menos nueve líneas celulares de cáncer. En particular, las células de cáncer ductal de mamas metastático al tejido abdominal, células de cáncer ductal de mamas metastático a tejido pulmonar y neuroblastoma metastático a médula ósea mostraron una inhibición de 28%, 25% y 20% en la inhibición de la proliferación de células cancerígenas, respectivamente, a concentraciones particulares de toxina botulinum.

Como se muestra en la figura 1, BOTOX inhibió la división celular en la totalidad de las nueve líneas celulares de cáncer diferentes. Un análisis de respuesta a la dosis mostró que la inhibición máxima se producía lo más frecuentemente a 0,1 U/ml de BOTOX. Además, 0,1 U/ml de BOTOX fue una dosis que provocó una respuesta en cada tipo de célula cancerígena ensayada.

Como se muestra en la figura 2, BOTOX inhibió la división celular en células ductales de mamas metastáticas al tejido abdominal. La respuesta primaria a BOTOX se produjo a 0,1 U/ml, dando lugar a una inhibición de 27,7% de la división celular. Se produjo una respuesta secundaria a 5 U/ml de BOTOX que provocó un 15,9% de inhibición de la división celular.

Como se muestra en la figura 3, BOTOX inhibió la división celular en células de carcinoma ductal de mamas metastáticas a tejido pulmonar. Se produjo una inhibición pico de 25,3% a 0,1 U/ml de BOTOX.

Como se muestra en la figura 4, BOTOX inhibió la división celular en células de neuroblastoma metastáticas a médula ósea. BOTOX inhibió la división celular en cada dosis ensayada. Dos respuestas picos de 20,4% y 19,6% de inhibición se produjeron a 1 y 0,01 U/ml de BOTOX, respectivamente.

Como se muestra en la figura 5, BOTOX inhibió la división celular en leucemia de células T derivadas de sangre periférica. Se produjo una inhibición pico de 17,9% a 2,5 U/ml de BOTOX con una disminución dependiente de la dosis en el efecto con concentraciones decrecientes de BOTOX.

Como se muestra en la figura 6, BOTOX inhibió la división celular en células de neuroblastoma derivadas de tejido abdominal. BOTOX inhibió la división celular a cada concentración ensayada con una inhibición pico de 15,0% a 0,001 U/ml.

Como se muestra en la Fig. 7, BOTOX inhibió la división celular en células de neuroblastoma metastáticas para el área supra-orbital. La inhibición máxima de 14,7% se observó a 0,1 U/ml de BOTOX.

Como se muestra en la figura 8, BOTOX fue eficaz para inhibir la división celular en células de cáncer colorrectal metastáticas para tejido abdominal. Hubo una inhibición pico única de 12,4% a 0,1 U/ml de BOTOX.

Como se muestra en la figura 9, BOTOX inhibió la división celular en células de melanoma amelatónicas. Se produjo una inhibición pico de 9,8% a 1 U/ml de BOTOX con una disminución dependiente de la dosis en el efecto con concentraciones decrecientes de BOTOX posteriormente.

Como se muestra en la figura 10, BOTOX fue eficaz para inhibir la división celular en células de próstata metastáticas para el nódulo linfático supraclavicular izquierdo. Hubo una inhibición pico única de aproximadamente 6,1% a 0,1 U/ml de BOTOX.

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Conclusión

Este experimento comparó el efecto de BOTOX® sobre nueve líneas celulares de cánceres diferentes usando el ensayo Oncotech EDR®. Las células tumorales fueron evaluadas en cuanto a viabilidad y densidad celular antes de disponerlas en placas en agar blando en presencia de BOTOX®. Las células se incubaron durante 72 horas, se sometieron a impulsos con timidina tritiada seguidos de una incubación adicional de 48 horas antes de ser recolectadas y cuantificar la incorporación de timidina tritiada. El porcentaje de inhibición del crecimiento se calculó comparando pocillos tratados con BOTOX® con un número igual de células testigos tratadas con medios. Este experimento mostró una inhibición a varias concentraciones produciéndose una inhibición pico lo más frecuentemente a 0,1 U/ml de BOTOX. Los niveles más elevados de inhibición se produjeron en las células de carcinoma ductal de mamas, que mostró 28% y 25% de inhibición de la división celular. Un examen de la respuesta a la dosis de BOTOX® analizada sobre la totalidad de nueve líneas celulares de cáncer puso de manifiesto que las líneas celulares individuales mostraron una sensibilidad diferenciada a BOTOX®, con un porcentaje de inhibición del crecimiento elevado de 28%.

Los procedimientos según la invención, descritos en el presente documento tienen muchas ventajas, que incluyen las siguiente:

(1) la invención hace innecesaria la cirugía para un tratamiento eficaz de cánceres de colon,

(2) los efectos de los fármacos sistémicos pueden ser evitados mediante la aplicación local directa de una toxina botulinum, según la presente invención,

(3) los efectos de mejora de la presente invención pueden persistir durante dos años o más a partir de una administración local única de toxina botulinum, como se expone en la presente memoria descriptiva.

Aunque la presente invención ha sido descrita en detalle con respecto a ciertos procedimientos preferidos, son posibles otras realizaciones, versiones y modificaciones. Por ejemplo, una amplia diversidad de toxinas botulinum puede ser eficazmente usada en los procedimientos de la presente invención. Adicionalmente, la presente invención incluye procedimientos de administración local en los que son administradas de forma concurrente o consecutiva dos o más toxinas botulinum. Por ejemplo, puede ser administrado tipo A de toxina botulinum hasta que se desarrolle una pérdida de respuesta clínica o anticuerpos neutralizantes, seguida de la administración de tipo E de toxina botulinum. Alternativamente, puede ser localmente administrada una combinación de dos cualesquiera o más de los serotipos A-G de botulinum para controlar la aparición y duración del resultado terapéutico deseado. Además de ello, pueden ser administrados compuestos que no son neurotoxinas antes, de forma concurrente o con posterioridad a la administración de la neurotoxina para demostrar un efecto adyuvante como una aparición mejorada o más rápida de la denervación antes de que la toxina botulinum comience a ejercer su efecto terapéutico.

La invención incluye dentro de su ámbito el uso de toxina botulinum, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de colon mediante la administración local de la toxina botulinum.

Claims (6)

1. Uso de una neurotoxina botulinum, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer de colon administrando una neurotoxina botulinum a un colon, tratando así el cáncer de colon.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que la neurotoxina botulinum es administrada en una cantidad entre aproximadamente 10^{-2} U/kg y aproximadamente 200 U/kg.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que la neurotoxina botulinum es administrada en una cantidad entre aproximadamente 10^{-1} U/kg y aproximadamente 35 U/kg.

4. El uso de la reivindicación 1, en el que la neurotoxina botulinum se selecciona entre el grupo que consiste en tipos A, B, C, D, E, F y G de toxinas botulinum.

5. El uso de la reivindicación 1, en el que la neurotoxina botulinum es neurotoxina botulinum tipo A.

6. Uso de una neurotoxina botulinum tipo A, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer de colon mediante la administración local de entre 10^{-2} U/kg y aproximadamente 200 U/kg de tipo A de neurotoxina botulinum a un colon o las proximidades de un tejido de colon precanceroso, provocando así una reducción del tamaño y/o actividad de un tejido de colon hiperplástico, hipertónico o neoplástico.